MXPA02000781A - Genes dnd/canales ionicos de compuerta de nucleotidos ciclicos de arabidopsis thaliana; reguladores de la resistencia a enfermedades en las plantas y muerte celular. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a la respuesta de muerte celular conocida como la respuesta hipersensitiva (HR) como una caracteristica central de la resistencia a enfermedades de las plantas gen-por-gen. Las plantas tambien se defienden contra patogenos via respuestas de defensa de amplio espectro mutigenicamente controladas, tales como aquellas moduladas por el acido salicilico. El sitio DND (Defensa, No Muerte), de Arabidopsis thaliana regula la extension de la resistencia a enfermedades de amplio espectro contra un amplio rango de patogenos virales, bacterianos, oomicetos y fungicos. Las plantas que carecen de una copia funcional del gen DND1 o 2, son defectivas en la muerte de celulas HR pero presentan resistencia a enfermedades gen-por-gen exitosa. Las plantas que carecen de una copia funcional del gen DND1 o 2, tambien presentan un fenotipo de resistencia a enfermedades de amplio espectro incrementado. Los productos del gen DND1 y 2 son identicos a los ANDcs previamente conocidos llamados At:CNGC2 y 1 respectivamente, que codifican proteinas de canales ionicos de compuerta de nucleotidos ciclicos. La identificacion de los genes CNGC/ DND como regulardores de la resistencia a enfermedades y muerte de celulas hospederas y la disponibilidad de la informacion de la secuencia del gen CNGC/DND, proporciona nuevas posibilidades para controlar una amplia variedad de enfermedades de plantas.

Description

GENES DND/CANA ES IÓNICOS DE COMPUERTA DE NUCLEOTIDOS CÍCLICOS DE ARABIDOPSIS THALIANA; REGULADORES DE LA RESISTENCIA A ENFERMEDADES EN LAS PLANTAS Y MUERTE CELULAR ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a la fisiología de plantas, en particular, genes de plantas, llamados genes de canales iónicos de compuerta de nucleótidos cíclicos o genes DND (Defensa, No Muerte) , como reguladores para las enfermedades de las plantas y métodos para controlar las enfermedades en las plantas. Numerosas enfermedades de las plantas han plagado a la raza humana desde el principio de los tiempos. Han causados los mayores rompimientos económicos, pérdidas substanciales de cultivos a cultivadores individuales, hambrunas y aún, rompimiento de culturas completas. Las enfermedades de las plantas se estima causan en exceso nueve billones de dólares Estadounidenses en pérdidas en las pre-cosechas de plantas de cultivos cultivados cada año . Los cultivadores actualmente controlan las enfermedades de las plantas con una combinación de selección de germoplasma (plantas genéticas), prácticas de cultivo de REF . : 134778 plantas adaptadas, y tratamientos de pesticidas exógenos. Todas las tres estrategias están ampliamente en uso. Sin embargo, para un número dado de cultivos y enfermedades, las medidas de control pueden solamente ser parcialmente efectivas, o no proporcionables, o no pueden estar disponibles en todos. En algunos casos, los cultivadores completamente evitan la cultivación de especies de plantas costosas y cambian a la cultivación de otras especies debido a problemas de enfermedades. La resistencia gen-por-gen, es una forma de resistencia a enfermedades de las plantas que es explotada ampliamente por los productores de plantas para las plantas cultivada [Mclntosh, R.A. et al., (1995) Whea t Rusts : An Atlas of Resistance Genes Com onwealth Scientific and Industrial Research Oranization, Australia y Kluwer, Dordrecht, The Netherlands; Crute. I.R. et al., (1996) Plant Cell 8: 1747-1755; Agrios, G.N. (1997) Plant Pa thol ogy (Academic, San Diego); Bent, A.F (1996) Plant Cell 8: 1757-1771] . El nombre "gen-por-gen", denota la dependencia de esta resistencia en especificidad igualada entre un gen de resistencia a enfermedades de la planta y un gen avirulencia de patógeno [Flor, H.H. (1941) Phytopa thology 32: 653-669]. En un proceso que es reminiscente de las interacciones anticuerpo-antigeno de mamífero, estos genes controlan las interacciones ligando-receptor que activan las respuestas de defensa del complejo [Bent, (1996) supra; Alfano, J.R. et al., (1996) Plant Cell 8: 1683-1698; Hammond-Kosack, K. E. et al. (1996) Plant Cell 8: 17773-1791]. Hay miles de genes de resistencia que median el reconocimiento de cepas fúngicas, de bacteria, virales, o de nemátodos patógenos. La respuesta de defensa fuerte que es provocada después de una interacción gen-por-gen, incluye la sintesis de enzimas antimicrobianas y metabolitos, generación de moléculas de señalización que activan la defensa en células vecinas y refuerzan las paredes de las células de plantas que circulan el sitio de infección [Bent, (1996) supra; Hammond-Kosack, (1996) supra; Dangl, J. L. et al. (1996) Plant Cell 8:1793-1807]. Una de las características más prominentes de la defensa gen-por-gen es la muerte de células de plantas infectadas dentro de unas horas después del contacto inicial con el patógeno, un proceso conocido como la respuesta hipersensitiva (RH) [Stakman, E.C., (1915) J. Agri e . Resd. 4:193-199; Goodman, R. N. et al. (1994) The Hypersensi tive Reaction in Plants to Pathogens : A Resistance Phenomenon (Am. Phytopathol. Soc, St. Paul)]. La muerte de células RH es una respuesta de muerte celular programada que ?¿. l -i .i. I acompaña las características de los procesos de muerte celular apoptótica que ocurren en otros organismos metazoarios [Dangl, (1996) supra]. Aunque la muerte de células de RH es un sello de la resistencia a las 5 enfermedades gen-por gen, la importancia relativa de la muerte celular en esta forma de resistencia a enfermedad no es clara y puede variar dependiendo de las especies de patógenos objetivos [Hammond-Kosack, (1996) supra; Dangl, (1996) supra; Stakman, (1915) supra; Goodman, (1994) supra] . 10 Las respuestas múltiples a las defensas de las plantas son activadas en respuesta a la infección del patógeno [Bent, A. F. Et al., (1999) Advances in Agronomy 66: 251-298; Dixon, R.A. et al. (1990) Adv. Genet . 28:165-234; Ryals; J.L. et al. (1996) Plan t Cell 8:1809-1819; Ha mond- 15 Kosack (1996) supra]. Mientras los sistemas gen-por-gen, controlan la activación temprana y fuerte de las defensas de las plantas después del reconocimiento de la invasión del patógeno, muchas de las mismas defensas de las plantas son activadas más gradualmente o a una menor extensión en otras 20 formas de resistencia a enfermedades. Aún, las plantas susceptibles a enfermedades activan una amplia variedad de defensas, disminuyendo de manera apreciable el progreso de la enfermedad [Delaney, T. P. et al. (1994) Science 266: 1247- 1250; Glazebrook, J. et al. (1996) Geneti cs 143:973-982]. Aunque algunas respuestas de defensa son particularmente efectivas contra los patógenos específicos, muchas especies de plantas inducen defensas multifactoriales que son en cierto modo genéricas. Estas respuestas de defensa general o "de amplio Espectro", son a menudo efectivas contra una variedad de plantas de patógenos virales, bacterianos y fúngicos [Bent, (1999) supra; Dixon, (1999) supra; Ryals, (1996) supra] . El ácido salicilico ha mostrado ser una clase de mediador endógeno que promueve la expresión de una diversa serie de defensas de plantas [Delaney, (1996) supra; Gaffney, T. et al (1993) Sci ence 261:754-756]. El ácido salicilico puede ser requerido para la resistencia efectiva gen-por-gen, para otras respuestas de defensas localizadas, y para resistencia adquirida sistémica (RAS) [Ryals, (1996) supra]. Otras trayectorias de defensa se han identificado que son aparentemente independientes del ácido salicilico, tal como muchas respuestas de defensas dependientes del ácido jasmónico [Pennickx, I.A. et al. (1996) Plant Cell 8:1809- 1819] . Las trayectorias de defensa controladas mutigénicamente, forman barreras importantes para la infección, y los esfuerzos de los productores de plantas son frecuentemente dedicados al mejoramiento de estos tipos de resistencia "cuantitativa" [Agrios (1997) supra] . Yu et al. [Yu et al. (1998) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 95:7819-7824; Yu et al. (2000) Mol . Plant-Microbe Interactions 13:277-286] , identificó dos mutantes de 5 Arabidopsis, dndl , y dnd.2 , que no desarrollan la respuesta RH a patógenos P. syringae avirulentos. Estos mutantes dnd presentan restricción gen-por-gen de crecimiento de patógenos en la ausencia de muerte de células de RH extensivas y también presentan un fenotipo de resistencia adquirida 10 sistémica constitutivo. Esta inducción constitutiva de resistencia adquirida sistémica puede substituirse por la muerte de células de RH en la potenciación de la respuesta de defensa gen-por-gen más fuerte. Los avances en la biología molecular y la 15 ingeniería genética, ahora hacen factible adaptar cultivos importantes a patógenos mejor manejados y reducir las pérdidas a las enfermedades de las plantas. Muchas de las especies de cultivos principales pueden rutinariamente ser transformadas y regeneradas [Christou, (1996) Trends Plant 20 Sci . 1:423-431]. Sin embargo, este tipo de ingeniería genética requiere un conocimiento del proceso molecular involucrado . Para proporcionar una base para desarrollar medios más eficientes para controlar las enfermedades de las plantas, la presente invención describe una clase de genes de plantas ejemplificados por dos genes de Arabidopsi s llamados DND (Defensa, No Muerte) 1 y 2, los cuales se descubrieron 5 aqui para codificar proteinas antiguamente identificada en la literatura como canales iónicos de compuerta de nucleótidos cíclicos putativos {ADNsc de AtCNGC2 y AtCNGCl , respectivamente) [Kohier, C. et al (1999) Plant J. 18:97-104; Kohier, C. et al. (1998); Plant Physiol . 116:1604; Leng et 10 al. (1999) Plant Physiol 121:753-761]. Por lo tanto, los términos "DND1 " y "DND2" como se usa aqui, están propuestos por ser sinónimos con AtCNGC2 y AtCNGCl , respectivamente. Se nota, sin embargo, que en este trabajo previo por otros en AtCNGC2 y AtCNGCl , no se hizo asociación con la resistencia a 15 las enfermedades de las plantas, muerte celular o fenotipos de plantas completas relacionadas. Los genes AtCNGC/DND, , regulan la resistencia a la enfermedad, es decir, formas modificadas de estos genes causan resistencia incrementada contra un amplio rango de patógenos virales, bacterianos y 20 fúngicos en la ausencia de la muerte celular. Por lo tanto, la manipulación de estos genes u otros genes relacionados, permite la generación de plantas con resistencia a padecimientos mejorados.

Míe^ tm .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN El objeto de la invención es proporcionar métodos de mejoramiento de resistencia a enfermedades en las plantas. Un segundo objeto de la invención es proporcionar métodos 5 para el control de la muerte celular en plantas. Los genes de plantas DND (Defensa, No Muerte) 1 y 2 de Arabidopsi s thaliana descritos aqui, regulan la resistencia a enfermedades de amplio espectro y muerte celular en plantas. Las secuencias que codifican nucleótidos de los genes DND 1 10 y 1 de la presente invención, son idénticas a las moléculas de AD?c conocidas previamente, que codifican proteinas que funcionan como canales iónicos de compuerta de nucleótidos cíclicos 1 {AtCNGC2) y 1 {AtCNGCl ) , respectivamente. Tales canales iónicos de compuerta de nucleótidos cíclicos son 15 ubicuitos en plantas, de manera general. Las plantas que no expresan genes AtCNGC/DND debido a una mutación, presentan resistencia elevada contra un amplio rango de patógenos virales, bacterianos y fúngicos, y también presentan una disminución en la respuesta de muerte de células de RH a 20 patógenos avirulentos y una disminución en la muerte celular inducida por al toxina Fumonisina Bl . Por lo tanto, esta invención describe varios métodos para el mejoramiento de la resistencia a la enfermedad, modificando el gene o producto ----•^^^^^- . -¿. ? ? i del gen AtCNGC2/DNDl o AtCNGCl / DND2 , o genes o productos de genes en otras plantas que portan similitud estructural o funcional substancial al gen o producto del gen AtCNGC2/DNDl o AtCNGCl / DND2. Los medios de modificación incluyen, pero no 5 se limitan a regulación descendente transcripcional o transduccional, mutaciones incluyendo sustitución, supresión o inserción del nucleótido, inactivación del gen o producto del gen, e inhibición química del producto del gen. Estos genes pueden también ser regulados descendentemente o 10 inactivados por tecnología antisentido, supresión de la hebra sentido, silenciamiento del gen inducido por virus, ARN de doble hebra y otros métodos de inactivación conocidos en la técnica. La invención además incluye una planta modificada o 15 transformada genéticamente, tejido de planta o semilla de planta elaborada por el método descrito. La invención describe métodos para identificación de otros genes de resistencia a las enfermedades relacionadas con AÍCNGC2/DND1 o AtCNGCl / DND2 r u homólogos de los mismos 20 funcionales o estructurales. Los genes relacionados AtCNGC2/DNDl o AtCNGCl /DND2 , o productos del gen u homólogos de los mismos asi identificados, pueden ser modificados como se describe aqui, para mejorar la resistencia a enfermedades. ->*«->He***»-Estos genes y producto del gen pueden ser usados en una selección para identificar inhibidores para incrementar la resistencia a las enfermedades en las plantas. La invención también proporciona el uso de marcadores genéticos para el mejoramiento a la resistencia a la enfermedad de la planta via las prácticas prevalecientes de cultivadores de plantas. Los marcadores genéticos son identificados debido a su similitud a o proximidad genética cercana a AtCNGC2/DNDl o AtCNGCl/DND2 o su proximidad a homólogos de AtCNGC2/DNDl o AtCNGCl / DND2. La identificación de los genes CNGC/DND como reguladores de la resistencia a enfermedades, proporciona medios adicionales para identificar otras moléculas las cuales interactúan con ellas en la exhibición de la resistencia a las enfermedades. Estos incluyen genes efectores o proteinas o químicos los cuales interactúan con un gen CNGC/DND o producto de gen u homólogo. Los métodos descritos en la invención para proporcionar resistencia a enfermedades en las plantas, pueden también ser usados para controlar la muerte celular inducida por la enfermedad. En consecuencia, la invención incluye: Un método para controlar la muerte celular en plantas por regulación descendente, mutación o inactivación de un gen CNGC/DND o producto de gen de la planta.

Específicamente, tal método puede incluir la inactivación de un gen AtCNGC/DND usando un ADN sentido o antisentido a CNGC/DND apropiado. En consecuencia, la invención incluye moléculas de ADN antisentido de genes DND1 o DND2 o genes similares a partir de otras especies de plantas. La invención además incluye plantas, tejidos de plantas o semillas modificadas genéticamente o transformadas, elaboradas por el método descrito, o transformadas para expresar el ADN sentido o antisentido. En otro aspecto, la invención proporciona un método para el mejoramiento de la resistencia del patógeno de una planta por regulación descendente, mutación o inactivación de un canal iónico interrumpido de nucleótido cíclico, gen o producto de gen o un homólogo del miso de la planta. De manera similar, la invención proporciona plantas, tejidos de plantas o semillas modificadas genéticamente o transformadas, elaboradas por el método descrito. La invención además proporciona un método de identificación de un gen de resistencia a enfermedades seleccionando un gen de canal iónico interrumpido de nucleótido cíclico, que incluye genes AtCNGC2/DND2 y AtCNGCl /DND 2.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A-1D muestran los defectos de muerte de células de RH en un mutante dndl . Los niveles de las plantas { dndl ) mutantes dndl y originales de tipo silvestre (Col) se inocularon con una alta dosis (2 x 108 cfu/ml) de P. syringae pv. glycinia Rct 4 p V288 (Psg avrRP2't) estimuladas con RH, avirulento, o la cepa de control no virulenta, isogénica P. syringae pv. glycinia Clase 4 pVSP61 (Psg) . A las 24 horas post-inoculación, se cosecharon las hojas, fijaron y examinaron por células muertas autoflorescentes usando un microscopio fluorescente. La Figura ÍC muestra el margen de una zona inoculada, que revela la muerte de células confluentes en respuesta a la bacteria solamente en el lado de la hoja (inoculado) . Las Figs. 2A-2B ilustran el crecimiento de la bacteria dentro de las hojas de las plantas. La Figura 2A muestra las lineas de Arabidopsis Col (Col-0 tipo silvestre, RPS2/RPS2; DND1/DND1 ) , rps2 (Col-2 rps2-201/rps2-201 ; DND1 /DND1 ) , y dndl (Col-0 y RPS2/RPS2, dndl/dndl ) , inoculadas con P. syringae pv. toma to DC3000 pV288 { avrRPt2+ ) . La Figura 2 muestra las lineas de Arabidopsi s Col-0 y dndl inoculadas con Psyringae pv. toma to DC 3000 isogénicas, que difieren por la presencia (pAvrRpml, símbolos llenos) o ausencia (pVSP61, i.^ símbolos abiertos), de un gen avirulencia avrRpml llevado en el plásmido pVSPßl. Ambas lineas de plantas son del genotipo RRM1/RPM1 . Todos los puntos de datos son medias + SD. Las Figuras 3A-3C muestran la expresión del gen relacionado con la patogénesis, monitoreados por análisis de manchado ARN de plantas de tipo silvestre Col-0 (Col) y mutantes (dndl ) dndl/dndl Col-0. La Figura 3A ilustra la expresión de ß-glucanasa 72 horas después del tratamiento de las hojas con 10 mM de MgCl2 que no contiene patógeno (0), la cepa de control no avirulenta P. syringae pv. toma to DC3000 pV288 { vir) , o la cepa P. syringae pv. toma to DC3000 pV288 { avr) que expresa avrRp2 isogénica. La Figura 3B ilustra la expresión PR-1 24 horas después del tratamiento como en la Figura 3a. La Figura 3C muestra la cuantificación fosforimager de la expresión PR-1 del manchado mostrado en la Figura 3B, normalizada a nivel del ARNm ß-ATPast constitutivo. Los resultados similares se obtuvieron en experimentos múltiples. La Figura 4A-B muestra los niveles de compuestos de ácido salicilico y ácido salicilico conjugado con glucósidos en las plantas Col-0 y Col-0 dndl -ldndl -1 o Col-0 dnd2-l /dnd2-l mutantes. -j.^..l Las Figuras 5A-5B ilustran que las plantas mutantes dndl y dnd2 muestran más resistencia a la muerte celular inducida por Fumonisina Bl (un inhibidor de la sintasa ceramida) comparada con la Arabi dopsi s del tipo silvestre. La 5 Figura 5A es una curva de respuesta de dosis de Fumonisina Bl generada usando plantas de control (Col) y mutantes dndl . La Figura 5B muestra la respuesta retardada de plantas mutantes dnd2 después del tratamiento con Fusmonisina comparado con la Arabi dopsi s de tipo silvestre. El eje X en ambas gráficas 10 indica la severidad de la necrosis proporcionada en una escala 0-5 (0 = sin lesiones, 5 = necrosis completa) . La Figura 6/1-6/4, muestran las secuencias de nucleótidos de la región genómica que contiene el gen AtCNGC2/DNDl , 5,897 nucleótidos en longitud. Las 15 características notables son como siguen: nt 1632; extremo 5' del ADNc AtCNGC2/DNDl , nt 1663; codón iniciador putativo ATG, nt 1716; extremo de exon 1 del gen AtCNGC2/DNDl , nt 2088- 2763; exon 2, nt 2928-3143; exon 3, nt 3333-3652; exon 4, nt 3747-3863; exon 5, nt 3953-4192; exon 6, nt 4275-4363; exon 20 7, nt 4478; extremo 3' de ADNc AtCNGC2/DNDl , nt 4987 y codón de detención putativo TAA. El mutante dndl descrito en la invención contiene mutación en el punto G hasta A creando un codón de detención en la posición 3101 nt como se precede. Las secuencias mostradas ^^^H|||| aquí son idénticas a aquellas de la SEC ID NO: 1. La Figura 7 muestra la secuencia de aminoácido (SEC ID NO: 3) de la proteína codificada por el gen DND1 . La Figura 8 muestra la secuencia de nucleótido de ADNc de AtCNGC2/DNDl (SEC ID NO: 2). La Figura 9 ilustra los resultados de los estudios de complementación. Los tres cósmidos complementarios derivados de BAC3H2 (1A8, 1H2 e 1H3), son demostrados por barras sólidas. Las barras interrumpidas representan cósmidos que fallan para complementar el fenotipo enano dndl . Los datos numéricos son el número de plantas complementadas en tamaño del número total de plantas T2 examinadas para cada cósmido. La Figura 10 muestra las respuestas de plantas T2 Col-0 dndl /dndl transformadas con cósmidos 1A8 e 1H2. Las plantas T2 segregaron 3:1 (tipo silvestre: enano) por tamaño. Las plantas de ambos tipos fueron inoculadas con Psg R4 avrRpt2 o con Psg R4 (no avr) . La RH se registró 24 horas post-inoculación. El grado de RH se escaló desde 0 (sin RH) hasta 5 (varias RH) respectivamente. Para plantas de estatura enana, se sometieron a pruebas 7, 3 y 4 plantas para dndl , 1A8 e 1H2 respectivamente. El número indica el promedio de tres hojas por planta { avr) y una hoja por planta (no avr) para la planta de tamaño del tipo silvestre. Los registros de plantas enanas representan el promedio de al menos seis hopas inoculadas {avr) o tres hojas (no avr) . La Figura 11 muestra el crecimiento de P. syringae pv. tomato (pst) DC3000 virulento en plantas Col-0 dndl/dnal transformadas con el cósmido 1H3. Plantas T2 de seis semanas de edad segregando 3:1 (tipo silvestre : enano) de tamaño, se inocularon con Pst DC3000 sin gen avr. El crecimiento bacteriano se sometió a muestras 0, 2 y 4 días posterior a la inoculación de plantas T2 de tamaño de tipo silvestre, así como también los controles Co-0 y dndl . Para plantas T2 de estatura enana, el crecimiento bacteriano se sometió a muestras solamente a los 3 días posteriores a la inoculación (demostrado por la X) . La Figura 12 muestra los cosmidos y subclones complementarios. Los cósmidos complementarios son representados por las barras sólidas. Los subclones complementarios son representados por barras moteadas y son demostrados inmediatamente arriba de su cosmido original. Los cósmidos y subclones que fallan al complemento están representados por las barras blancas. Los subclones se generaron usando EcoRI y/o Xbal, excepto donde se notaron. Las Figuras 13/1-13/3, muestran la secuencia de nucleotidos de la región que contiene el gen de Arabidopsi s DND2 (AtCNGCl ) (SEC ID NO: 4) . LA Figura 14 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de DND2 {AtCNGCl ) (SEC ID NO: 5). 5 La Figura 15 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen DND2 {AtCNGCl ) (SEC ID NO: 6) . La Figura 16 muestra los resultados de los estudios de complementación del fenotipo de tamaño roseta pequeña dnd2 10 por la transformación con el fragmento de ADN genómico de Arabidopsi s mostrado en la Figura 13 (SEC ID N0:14), codificando a AtCNGCl/ DND2. El "Col + vector" representa las plantas de tipo silvestre transformadas con el vector solamente, "dnd2 + vector" representa las plantas mutantes 15 dnd2 transformadas con el vector solamente, y "dnd2 + AtCNGCl" representan las plantas mutantes dnd transformadas con un vector que contiene el fragmento de ADN genómico de Arabidopsis mostrado en la Figura 13 (SEC ID NO:14), que codifica AtCNGCl /DND2. 20 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se usa en la presente invención, los siguientes términos son definidos como sigue: El término "regulación descendente", como se usa aquí, se refiere a un método general de reducción del nivel de los productos del gen (ARN o proteína) . Así, la regulación descendente de un gen puede ser alcanzada ya sea transcripcionalmente o transduccionalmente. Por ejemplo, una molécula antisentido puede ser introducida en una célula o tejido para regular descendentemente el gen a partir del cual la molécula antisentido se deriva. El término "mutación" como se usa aqui se refiere a una modificación de la secuencia de nucleótido natural de una molécula de ácido nucleico elaborado suprimiendo, substituyendo o agregando nucleótido (s) , de manera tal que la proteína codificada por el ácido nucleico modificado se altera. Las proteínas resultantes frecuentemente presentan funcionalidad alterada. El término "molécula antisentido" como se usa aquí, está propuesto para significar una molécula de ácido nucleico de hebra única que consiste de los nucleótidos complementarios de una molécula sentido. La molécula sentido en general se refiere a la hebra de ADN o ARN la cual tiene la secuencia de ARNm que codifica a la proteína. El término "resistencia a la enfermedad" o "resistencia al patógeno" como se usa aqui, se refiere a cualquier proceso por el cual una respuesta de planta al ataque de patógenos funciona para incrementar la habilidad de la planta para sobrevivir y/o mantener la productividad debido a tal ataque. "Resistencia mejorada" en una variedad de planta significa que el daño asociado con el ataque del patógeno en tal variedad es reducido cuando se compara con una variedad de control, medida por un criterio reconocido en la técnica. La última meta de la resistencia mejorada es proporcionar un rendimiento de cultivos superior, en promedio, de la variedad que tiene resistencia mejorada, comparada con el control. Puesto que los rendimientos de cultivos requieren ensayos de campo consumidores de tiempo, se han contemplado varias pruebas de laboratorio para medir la resistencia en plantas individuales, tales pruebas se reconocen en la técnica como predictivas del rendimiento mejorado en la presencia del patógeno. Estas pruebas incluyen pero no se limitan a, medición del crecimiento del patógeno en la planta infectada, mediciones de la extensión de la necrosis, muerta de células de plantas e hipersensibilidad a la respuesta. Tales mediciones son generalmente preferidas debido a que pueden ser conducidas bajo condiciones controladas, nivel de patógeno controlado, distribución de introducción del patógeno, temperatura, humedad y similares. En un ejemplo especifico descrito aquí, la resistencia a la enfermedad es medida como restricción del crecimiento del patógeno, es decir, el crecimiento de un patógeno inoculado (es decir, P. syringae pv. tomato) , fue mucho menor en el mutante dnd comparado con el tipo silvestre. Así, cuando una planta es modificada para presentar resistencia mejorada a la enfermedad, o resistencia mejorada al patógeno de conformidad con los métodos descrito aquí, se entenderá que la restricción al crecimiento similar a un patógeno dado, finalmente podrá resultar en el daño reducido a la planta y rendimiento superior de cultivos. El término "gen" se refiere a una molécula de ácido desoxinucleico que codifica una proteína o péptido después de la transcripción y traducción. Así, "producto de gen" como se usa aquí, se refiere a ya sea una molécula de ARN o proteina la cual es generada por la expresión de un gen dado. "Gen DND" como se usa aquí, está propuesto para significar cualquier gen que tiene homología estructural a DND1 , DND2 u otros genes cuyos productos podrán parecerse estrechamente a aquellos de un gen de canal iónico interrumpido de nucleótido cíclico mutado o intacto y que cuando se regula descendentemente, se muta o inactiva, causa :!... i. i resistencia mejorada o rasgos de muerte celular mejorada como se describe en la presente invención. En consecuencia, se incluye no solamente el gen AtCNGC2/DNDl o AtCNGCl /DND2 de Arabidopsis, si no también aquellos genes correspondientes o relacionados de otras especies de plantas la cuales tienen homología estructural o funcional con el gen AtCNGC2/DNDl o AtCNGCl/DND2 descrito aquí. Se entenderá en la técnica que estructuras variantes del AtCNGC2/DNDl o AtCNGCl/DND2 pueden existir en otras plantas y que tales variantes pueden ser identificadas, como se describe aquí, por homología estructural, por homología funcional, o por similitud del fenotipo en análisis genéticos o por combinación de los antes mencionados . El significado de un "homólogo" como se usa en la presente invención, está propuesto para incluir cualquier gen o producto de gen el cual tiene una similitud estructural o funcional al gen o producto de gen en punto. En consecuencia, un homólogo estructural del gen CNGC/DND es definido como uno que se hibridiza con el ADN o ADNc genómico de AtCNGC2/DNDl (SEC ID NO: 2) o CNGC1/DND2 (SEC ID NO: 5) de Arabidopsis a un nivel aqui definido de rigurosidad de condiciones de hibridación, a baja rigurosidad, preferiblemente a rigurosidad media o más preferiblemente a alta rigurosidad. - ...... i -< j .«i Una segunda e igualmente válida definición de "homólogo", es un gen por el cual la secuencia de aminoácido derivada de un producto de traducción porta similitud significante con los canales iónicos de compuerta de nucleótidos cíclicos 5 previamente caracterizados, incluyendo el sello de los seis dominios de la transmembrana, un dominio de poro entre el quinto y el sexto dominio de la transmembrana, y un dominio de interacción de nucleótido cíclico citoplásmico [Zagotta y Siegelbaum (1996) Ann . Rev. Neurosci . 19:235-263; Kohier, et 10 al. (1999) supra]. Como una tercera e igualmente válida definición de "homólogo", un homólogo funcional de un producto de gen DND es una proteina de canal iónico interrumpido de nucleótido cíclico que puede potencialmente funcionar o puede ser causado por mutación, regulación 15 descendente o inhibición química para funcionar como un regulador de resistencia a la enfermedad o un regulador de muerte celular. Un homólogo funcional del producto de gen CNGC/DND es uno el cual potencialmente funciona después de la modificación como un regulador de resistencia a la enfermedad 20 y/o muerte celular. La presente invención describe dos genes de plantas, DND1 y DND2 de Arabidopsis thaliana como reguladores de resistencia a la enfermedad y muerte celular. Los homocigotos de plantas para el gen DND1 0 DND2 mutado, pueden presentar resistencia incrementada a la enfermedad en la ausencia de la muerte celular. Por lo tanto, la manipulación del gen DND1 o DND2 ofrece nuevas posibilidades de control de varias enfermedades de plantas. Para dirigir la relación entre la muerte de células de RH, transducción de la señal de defensa mediada por el gen de resistencia, y la restricción actual del crecimiento de patógenos, los mutantes de Arabidopsi s thaliana que fueron deficientes en RH se aislaron y caracterizaron. Una población M2 de la línea Col-0 de Arabidopsis, la cual expresa el gen de resistencia RPS2, se seleccionó inoculando plantas con una cepa del patógeno bacteriano de plantas P. syringae pv. glycinia , que expresa el gen arivulencia avrRP2 complementario a RPS2 [Kunkel, B. N., et al. (1993) Plant Cell 5:868-876]. Un titulador extremadamente alto de patógeno, 2 x 108 cfu/ml, se usó de manera que las plantas que se sometieron a RH de tipo silvestre podrán presentar colapso visible de tejido de hojas. Dos de los mutantes aislados a partir de este selección se llamaron dndl y dnd2. Estos mutantes presentaron varios fenotipo similares; ambos son recesivos al tipo silvestres, plantas mutantes homocigotas muestran una *fc*&, *- -.¿ £- ¡ reducción en la extensión de la muerte celular en respuesta a un P. syringae, y enanismo. Debido a que los mutantes dndl y dnd2 se analizaron en una manera similar y se encontraron que presentan fenotipos mutantes similares, la siguiente descripción se toma ampliamente a partir del análisis de mutante dndl . Sin embargo, es fácilmente entendido por una persona experta en la técnica, que estos métodos son fácilmente aplicables al análisis de mutantes dnd2. El mutante dndl se recuperó de esta selección como una linea que presenta tamaño de roseta reducido y un claro fenotipo RH". Las lineas de progenie derivadas del mutante dndl fallan al producir una RH no solamente cuando se inoculan con patógeno que expresan avrRpt2 sino también en respuesta a P. syringae que expresa genes avirulencia avrRpml o avrB (Kunkel, (1993) supra; Bisgrove, S.R. et al. (1994) Plant Cell 6: 927-933] . Dos genes de resistencia separados {RPS2 y RPM1 ) controlan la responsabilidad a estos tres genes avirulencia separados. En consecuencia, se predice que la linea dndl se interrumpe en un componente común de la respuesta de defensa de la planta que es llevada por las trayectorias de transducción de señal gen-por-gen inicialmente distintos. Para confirmar la ausencia de muerte celular hipersensitiva en respuesta a patógenos avirulentos en el mutante dndl , se usó el microscopio fluorescente para monitorear las células dentro del tejido de las hojas inoculadas [Klement, Z. et a. (1990) en Methods in Phytobacteriology, eds. Klement, Z., Rudolph, K. & Sands, D.C. (H. StilIman, Budapest), pp. 469-473]. Las células de plantas que se someten a la RH presentan un incremento marcado en la fluorescencia debido principalmente a la producción y liberación de compuestos fenólicos después de la muerte celular.' En experimentos de "tituladores bajos", P. syringae pv. glycinia que expresan avrRP2 se introdujeron en tejido mesófilo de hojas a una concentración de *5 x 10J cfu/ml, una dosis a la cual una mayoria de células de plantas no están inicialmente en contacto con el patógeno. Como se esperaba, las hojas de la línea parental del tipo silvestre infectada a esta dosis con P. syringae que expresa avrRP2 contiene numerosas células autofluorescentes aisladas. En contraste, se presente varios cuantos foci o sitios autofluorescentes en las hojas dndl inoculadas con la misma cepa avirulenta. Las hojas dndl preferentemente parecen hojas uninoculadas u hojas inoculadas con el control P. syringae no avirulento. Cuando las hojas de la linea Co-0 original se inocularon con un titulador extremadamente alto de P. syringae avirulento (2 x 108 cfu/ml) , se observó el colapso confluente esperado de las células hospederas (Fig. 1) [Kunkel, (1993) supra; Yu, G. L. et al. (1993) Mol Plant . Microbe Interact 6:434-443]. Sin embargo, aún en esta dosis alta de patógeno, muy poca muerte celular anterior que se observa en los controles negativos se detectó en plantas dndl (Fig. 1). Los experimentos separados que usaron Teñido Evans para teñir células muertas o que están muriendo dando resultados similares. El método de ensayo autofluorescente se prefiere debido a su mayor claridad y preparación de tejido menos laboriosa. Con el ensayo de autoflorescencia, la ausencia de muerte de células de RH en plantas dndl se observó en experimentos múltiples, incluyendo experimentos que usaron tituladores bacterianos iniciales tal altos como 2 x 109 cfu/ml. Un ligero incremento en la muerte celular se observó en *5-8% las hojas dndl inoculadas con 2 x 108 cfu/ml de P. syringae avirulento, pero solamente en áreas aisladas que representan una fracción del tejido inoculado. La muerte celular en estas áreas pequeñas fue irregular preferiblemente confluente, y parches pequeños similares de muerte celular podrán ser observados a un frecuencia baja en plantas Col-0 de control inoculadas con la cepa P. syringae * ' 3a^ ^^ no avirulenta. No podrá detectarse estimulación de muerte celular por P. syringae avirulento en la vasta mayoría de las hojas dndl inoculadas. Para determinar si la ausencia de RH en el mutante dndl de Arabidopsis está asociado con la resistencia comprometida a enfermedades, el crecimiento de P. syringae pv. toma to dentro de las plantas, se monitoreo cuantitativamente con el tiempo [ halen, M. Et al. (1991) Plant Cell 3:49-59]. Las cepas patogénicas que expresan un gen avirulencia son virulentas en plantas que no expresan el gen de resistencia apropiado, pero su crecimiento se reduce severamente en plantas las cuales poseen el gen de resistencia apropiado. La Figura 2A muestra el crecimiento de P. syringae pv. toma to que expresa avrRpt2 en Col-0 {RPS2/RPS2) de Arabodipsis tipo silvestre, en una línea Col-0 carente del RPS2 funcional { rps2-201 /rps2-201 ) , y en el mutante dndl Col-0. Debido a la ausencia de la RH, el dndl fue muy similar al tipo silvestre en restricción exitosa del crecimiento de P. syringae que expresa avrRP2. También se observó fuerte avirulencia y restricción dependiente del gen de resistencia del crecimiento del patógeno, en experimentos cuantitativos con P. syringae que expresa avrRpml , avrRps4, o avrB (Fig. 2B) . Estos resultados demuestran que la muerte de células de RH extensivas, no es siempre requerida por la resistencia al gen/resistencia a la enfermedad de la planta dependiente del gen avirulencia. Habiendo establecido que las plantas dndl son resistentes a P. syringae avirulento debido a la ausencia de la RH, se examinó la respuesta del mutante dndl al P. syringae virulento. La Figura 2B muestra el crecimiento de la cepa de P. syringae pv. tomato DC3000 (pVSPdl) en Col-0 de tipo silvestre y en plantas Col-0 dndl / dndl (símbolos abiertos) . Esta cepa no provoca la resistencia gen-por-gen en plantas del genotipo Col-0 [Kunkel, (1993) supra; Whalen, (1991) supra], todavía las poblaciones de hojas de estas cepas de patógeno se redujeron 10 a 100 veces en experimentos con el mutante dndl . Se obtuvieron resultados similares en experimentos múltiples y en estudios con la cepa 4326 virulenta de P. syringae pv. maculicola . Las plantas dndl expresan un nivel de resistencia al P. syringae virulento que es típico de plantas que presentan una resistencia adquirida sistémica, resistencia sistémica inducida, u otras formas de resistencia a enfermedades independientes del gen de resistencia [Ryals, J. L. et al. (1996) Plant Cell 8:1809-1819; Pieterse, C. M. et al. (1996) Mol . Plant -Microbe In teract 8:1225-1237]. Este fenotipo de resistencia de amplio espectro co-segregado con los otros fenotipos mutantes dndl , en todos los casos se sometió a prueba. Se nota importante que la Figura 2B también muestra que el crecimiento de las poblaciones de P. syringae que 5 expresan avrRpml (símbolos cerrados) , se restringió a una extensión mucho mayor que creció de la cepa de patógeno virulento. Una reducción de 1,000 hasta 10,000 veces de crecimiento de patógeno, se observó si las cepas P. syringae DC300 o 4326 virulentas, de otro modo expresaron genes 10 avirulencia avrRpml o avrRpt2 (Fig. 2B) . Estos experimentos demuestran que la resistencia gen-por-gen puede ser inducida sobre y arriba de la resistencia independiente del gen de resistencia más débil en plantas dndl . Para experimentar la extensión de la resistencia de 15 nivel más bajo a patógenos virulentos en el mutante dndl , se inocularon plantas con cepas virulentas de otras especies de patógenos (Lee, J. M. Et al. (1996) Mol . Plant Mi crobe- Interact . 9:729-735; Bent, A., et al. (1992) Mol . Plan- Microbe Interact 5:372-378; Parker, J.E. et al. (1993) Mol . 20 Plant -Mi crobe Interact 6:216-224; Parker, J. E. et al. (1997) Plant Cell 9: 879-894]. El virus de manchado de anillo del Tabaco se esparció sistémicamente en solamente 9% de las plantas dndl opuestas al 71% de Col-0 tipo silvestre. ^^^g^gáj|?| Xanthomonas campestris pv. campestris y X. c. pv. raphani (bacteria) , solamente producen amarillamiento blando en dndl en lugar de las lesiones necróticas producidas en Col-0. Peronospora parasí tica (oomiceto) produce tres veces unas cuantas esporas en dndl contrario a Col-0 [3.0 + 2.2 vs . 10.7 + 3.1 media + SE si (esporas x lo-3) por hoja)]. La microscopía de hojas infectadas con P. parasí ti ca virulento confirmó que la restricción del crecimiento del micelio no se asoció con RH como la necrosis de la célula huésped o autofluorescente. A los 3 dias postinoculación, el micelio de la cepa Noco2 de P. parasí ti ca virulenta, típicamente ha formado haustorios en 2-10 células hospederas en plantas dndl , mientras en las plantas Col-0 de tipo silvestre, las plantas tienen un micelio tipico ramificado extensivamente y forman haustorios en 15-30 células hospederas. El crecimiento significantemente reducido en Erysiphe orontii (hongos) , en plantas dndl también se ha observado. Se ha observado previamente en un número de contextos de resistencia de amplio espectro constitutivamente elevado, tal como en mutantes de Arabidopsi s cpr r cim, lsd, y adc [Dangl, (1996) supra], en líneas de tabaco híbridos derivadas de cruzas entre especies de Nicotiana disparada [Ahí Goy, et al. (1992) Physiol . Mol . Plant . Pa thol . 41:11-21], y en plantas que expresan resistencia adquirida sistémica en respuesta a la infección o tratamiento del patógeno previo con ácido salicílico o mímicos del ácido salicílico sintético [Ryals, (1996) supra] . La resistencia elevada a menudo está asociada con la expresión incrementada de genes relacionados con la patogénesis (PR) [Ryals, (1996), supra] , y la examinación de plantas dndl uninoculadas reveló expresión constitutivamente incrementada de los genes ß-glucanasa y PR-1 de PR (Figs. 3A y 3B) [Cao, H. et al. (1994) Plant Cell 6:1583-1592; Ausubel, F.M. et al. (1997) Current Protocols In Molecular Bi ol ogy (Wiley, New York) ] . Aunque las plantas infectadas por P. syringae pv. toma to virulentas presentan niveles elevados de ß-glucanasa o ARNm PR-1, la inoculación de dndl o Col-0 tipo silvestre con P. syringae avirulento que expresan avrRp2 causan una elevación aún mayor en ARNm PR-1 (Fig. 3C) (25, 33) . Se obtuvieron resultados similares o más pronunciados con cuatro distinta series de ARN preparada, manchado, y sometido a sondas en experimentos completamente separados. Estos resultados demuestran, al nivel de la expresión de gen, que la transducción de la señal gen-por-gen y la activación de respuesta de defensa son funcionales en plantas dndl y son inducibles sobre y arriba de la resistencia constitutiva de amplio espectro.

La expresión incrementada del gen RR y la resistencia de amplio espectro, pueden ser inducidas por niveles elevados de compuestos de ácido salicílico endógenos o aplicados [Ryals, 1996) supra] . Observamos niveles constitutivamente elevados de tanto ácido salicílico libre como salicilatos conjugados con glucósidos en plantas dndl (Figura 4). Aunque el salicilato está probablemente siendo un mediador principal de la resistencia fortalecida en plantas dndl , el mecanismo por el cual la mutación dndl causa elevación del salicilato permanece para ser descubierta. Las plantas mutantes que presentan resistencia a la enfermedad gen-por-gen son muerte de células de RH, no son comunes. Sin embargo, otros mutantes de Arabidopsi s que presentan resistencia constitutivamente elevada han sido aislados, tales como mutantes cpr , cim, lsd y acd [Dangl, (1996) supra; Bowling, S.A. et al. (1007) Plant Cell 9:1573-1584; Bowling, S.A. et al. (1994) Plant Cell 6:1845-1857; Lawton, K. et al. (1993) en Mechani sm of Defense Responses in Plants . Eds. Fritig, B & Legrand, M. (Kluwer, Dordrecht, The Netherlands), pp. 422-432]. En consecuencia, las plantas dndl se compararon con un número de estas líneas. En contraste con los mutantes acd e lsd, no se observó fenotipo mímico de lesión en mutantes dndl cuando el tejido de la hoja a partir de plantas uninoculadas se inspeccionó por el ojo descubierto, por microscopio autofluorescente como se describe en Yu, (1993) supra, o después del teñido con azul de triptofano como se describe en Parker, J.E., et al. (1993) Plant J. 4:821-831. Las pruebas de complementación genética demostraron que el dndl es un locus o sitio separado de los dos sitios o loci cpr publicados, CPP1 y CPP5 (véase sección de Ejemplos) . Además, el mutante dndl aparentemente no se parece a muchos de los otros mutantes cpr o cim no publicados, debido a que el mutante dndl no presenta rasgos observados en análisis preliminares de aquellos mutantes tales como la conducta dominante o semi-dominante, muy baja fertilidad, glabros, o forma de hoja deformada. En particular, los mutantes cpr y cim descritos previamente, no presentan el fenotipo dnd de la defensa del gen-por gen sin muerte de células de RH. El mutante dndl presenta un fenotipo enano, como se observa en Arabidopsis cpr, cim, y otros mutantes de expresión PR constitutiva, pero las plantas dndl de otro modo, parecen normales en su crecimiento y desarrollo. Los mutantes dnd se examinaron para determinar si son también resistentes a otros inductores de muerte celular. Como se muestra en la Figura 5A-5B y experimentos adicionales, ambos mutantes dndl y dnd2 presentan respuesta retardada elevada y sensibilidad reducida a la muerte de células inducidas por Fumonisina Bl comparada con la Arabidopsis de tipo silvestre, indicando que los mutantes dnd pueden tener más supresión general de muerte celular programada. La Fumonisina B es un inhibidor conocido de la sintasa ceramida la cual induce la apoptósis en organismos diversos . Para determinar las bases genéticas del fenotipo dndl , el análisis de segregación y los estudios de formación de mapas del gen se llevaron a cabo. Las cruzas de dndl al Col-0 de tipo silvestre y ecotipos No-O, proporcionaron individuos Fl que presentan el fenotipo RH1" de tipo silvestre, demostrando la naturaleza recesiva del fenotipo mutante. F2 de una cruza Col-0 x dndl , segregó 24:7 por RH+; RH"; F2 de una cruza No-0 x dndl segregó 154:55, y F2 de una cruza dndl x No-0 recíproca segregó 132:5. Estos datos son consistentes con una relación 3:1 (para pruebas x~, P = 0.59, 0.66 y 0.90 respectivamente), indicando que un locus o sitio mutante único controla los fenotipos observados. El fenotipo de tamaño reducido de roseta también fue recesivo, y absolutamente co-segregado con el fenotipo RH" en estos y todas las otras plantas analizadas con F2. El símbolo del gen ? ? » i t- DND1 se seleccionó para este locus o sitio, reflejando el fenotipo mutante de Defensa sin muerte de células de RH. El microsatélite y marcadores genéticos de secuencia polimórfica amplificados claros, se usaron para formar mapas de locus o sitios mutados. No se detectó enlace excepto para los marcadores para el brazo superior del cromosoma 5. La formación de mapas de estructura fina con 536 individuos F2 de cruzas No-0 dndl proporcionan solamente seis cromosomas recombinantes entre dndl y CHSl. Estos experimentos colocaron DND1 dentro del intervalo *1.6-cM entre CHSl, y ng a 106 y 11 cromosomas recombinantes diferentes entres dndl y CHSl. Estos experimentos coloca a DND1 dentro del intervalo «1.6-Cm entre CHSl y ng 106 en el brazo superior del Cromosoma 5 de Arabidopsis . Esta ubicación define una posición de mapa que no se ha asociado previamente con los genes relacionados con la defensa. Los datos de formación de mapas genéticos sugieren que el sitio DND1 reside al norte y cierra el marcador pCIT1243 en la parte superior del cromosoma 5 de Arabidopsis . Para aislar el clon para el gen DND1 , cuatro BACs contiguos (8M21, 3H2, 22L1 y 23BL17) se generaron, los cuales se usaron subsecuentemente para generar una biblioteca cósmida redundante. Las técnicas detalladas para crear bibliotecas cósmidas, BACs, y el uso de RFLPs son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar en Ausubel (1997) . Una vez que un número pequeño de cósmidos son identificados para medir la región del locus o sitio de DND1 , cada clon se sometió a prueba por su capacidad para funcionalmente complementar la mutación dndl . Esto se abarcó por la transformación de plantas dndl mutantes con cada uno de los cósmidos vía transformación mediada por Agrobacteri um y seleccionando transformantes para la reversión a las características de tipo silvestre. Para simplificar este proceso, los transformantes putativos se seleccionaron inicialmente solamente en base al tamaño. Debido a que todos los fenotipos conocidos de mutantes dndl parecen estar estrechamente ligados, la complementación del tamaño enano se consideró representar la complementación genética del sitio DND1. En general, las plantas dndl presentan una velocidad de transformación significantemente baja, con relación al Col-0 de tipo silvestre. (~ .001% de transformantes por número total de semillas sometidas a prueba comparada con ~.2-.5% para Col-0) . Los transformantes se plantaron en el suelo después de 2-3 semanas analizadas por tamaño. Las plantas TI de los tres cósmidos (1A8, 1H2, y 1H3) presentaron tamaño similar a aquel de los controles de tipo silvestre y se traslaparon en la misma región de BAC 3H2 (véase Figura 9) . En resumen, la complementación de datos delimita la ubicación del sitio DND1 y demuestra que el gen codificado en la región es responsable para la pérdida de la función, es decir, enanismo, en las plantas dndl . Para confirmar la complementación genética el locus o sitio DND1 además, se realizaron los ensayos de RH y curvas de crecimiento bacteriano en plantas T2 a partir de tres cósmidos de complementación de tamaño para verificar la reversión a las respuestas de la defensa de tipo silvestre. Debido a que las plantas transformadas con Agrobacteri um son típicamente hemicigotas para el transgen, no fue sorprendente observar plantas T2 a partir de cada uno de los cósmidos que segregan poblaciones T2 que contienen plantas dndl complementadas por el transgen cósmido, así como también plantas dndl mutantes no complementadas. Como se esperaba, las plantas T2 de tamaño de tipo silvestre, presentan respuestas de defensa similares a aquellas de Col-0, mientras las plantas T2 de estatura enana, presentan respuestas de defensa comparables con aquellas de las plantas dndl . El fenotipo comercial de dndl es la ausencia de una RH mientras se cambia con el Psg avirulento. Sin embargo, las plantas dndl transformadas con el cósmido 1A8 ó 1H2, que fueron del tamaño de tipo silvestre, presentaron una respuesta RH fuerte a Psg R4 { avrRPt2t) (Fig. 19) . Contrariamente, las plantas enanas T2 fueron defectivas en la muerte de las células de RH indicando que estas plantas dndl no contienen una complementación de transgen cósmido (Fig.10) . Otra respuesta de defensa caracteristica de la mutación dndl es la resistencia elevada a patógenos virulentos. Plantas T2 transformadas con el cósmido 1H3 que fueron de tipo silvestre en tamaño, fueron susceptibles a Pst DC3000 (es decir, sus respuestas reflejaron aquellas de Col-Oí . Como se muestra en la Figura 11, un análisis de crecimiento de tres dias de plantas T2 enanas, proporcionó datos que indican que estas plantas retienen características de resistencia elevadas de la mutación dndl . Así estas plantas no contienen un transgen de cósmido de complementación . Una serie subclonación y pruebas subsecuentes funcionales como se describen anteriormente, proporcionaron los subclones y datos de complementación resumidos en la Figura 12. Se nota en particular que la región genérica que codifica a DND1 fue estrechamente delineada por la complementación exitosa con los subclones 18B y 27.1, y por ^a*^?^^6^^jß^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^j^J^^^^ la falla para complementar con 56.2 o 61.1. La sublconación también proporcionó un clon (17.1) de 5.2 kb en longitud. Una búsqueda BLAST de nucleótido con datos de secuencia parcial generados a partir del clon, proporcionaron una igualación 5 perfecta de 470 pb al ARNm de AtCNGC2 del canal de cationes de compuerta de nucleótidos cíclicos de Arabidopsi s thaliana . (Acceso ATY 1628) . Este ADNc se obtuvo por selección de una base de datos EST de Arabidopsis con el dominio de enlace de nucleótido cíclico de un canal iónico de mamífero [Kohier et 10 al. (1998) The Plant Journal 18 (1):97-104]. Tiene una estructura lector abierta de 2178 pb que codifica una proteína de 726 aminoácidos marcada por un dominio de enlace de nucleótido cíclico en el C-término, un sitio de enlace de calmodulina putativo, y regiones hidrófobas al N-término 15 (Figs. 6 y 7) . El secuenciamiento del ADN genómico que mide el ADNC de AtCNGC2 reveló que el DND1 {AtCNGC2) es un gen de 3327 pb compuesto de 8 exones (Fig. 6) . La clonación y secuenciamiento subsecuente identificó la naturaleza de la mutación dndl por ser una transición G a A creando un codón 20 de detención prematuro al aminoácido 120 (Fig. 6) . El dnd2 mutante se analizó de manera similar de conformidad con el procedimiento establecido para la caracterización de los mutantes dndl como se describe aquí y ¿a¿aa=Í¡ÍÉlMSI¿atje iiÉ¡i,i ¡ ... .. i . .. ...^ .. . im ±,¿.,, - .,„ . ..^.r^. ,... . ..8. . . «,.* ¿ .i„t.i encuentra por ser similar al mutante dndl en muchos aspectos; los datos fenotípicos de plantas completas para dndl fueron representativos de datos similares colectados para plantas dndl . La mutación dnd2 fue recesiva al tipo silvestre, y 5 plantas mutantes dnd2/dnd2 homocigotas presentaron una reducción extrema en la extensión de la muerte de células de RH en respuesta a un P. syringae avirulento. Las plantas mutantes dnd2 también presentaron un hábito de crecimiento de planta enana (de tamaño más pequeño) , niveles 10 constitutivamente elevados de ácido salicilico libre y conjugado en los tejidos de las hojas, y un fenotipo de defensa de amplio espectro constitutivo que se asemeja a plantas inducidas por resistencia adquirida sistémica. Los fenotipos de plantas mutantes dnd2 se cosegregan como un 15 locus o sitio Mendeliano único en la progenie F2 de cruzas al tipos silvestre. Sin embargo, se nota que las plantas dnd2 que no difieren de las plantas dndl en un sentido fenotipico; tienden a llegar a ser cloróticas o amarillentas en las puntas de las hojas y márgenes laterales distales de hojas en 20 un tiempo cuando la mayoría de las hojas de Arabidopsis de tipo silvestre o Arabidopsis dndl no muestran este amarillamiento . Mientras el DND1 forma mapas en los brazos superiores del cromosoma 5 de Arabidopsis, DND2 forma mapas en los brazos inferiores de tal cromosoma 5. El gen DND2 forma mapas al intervalo genético flanqueados por los marcadores genéticos que detectan polimorfismo ngal29 y LFY3, basados en PCR disponibles (www.arabidopsis.org.). Además la formación de mapas genéticos del sitio o locus DND2 usando familias F3 e individuos F2 a partir de una cruza de dnd2-l /dnd2-l Col-1 al ecotipo No-0 ha refinado el sitio DND2 al intervalo genérico entre g4130 y K19P17. Este corresponde a un tamaño genético de aproximadamente 2.5 centiMorgans, medido por seis clones BAC traslapantes, cubriendo aproximadamente 400 kb del genoma de Arabidopsi s . Se notó que el genoma de Arabidopsis dentro de este intervalo ha sido recientemente secuenciado, anotado, y liberado al Genbank o Banco de Genes. Un estudio de los genes codificados dentro de este intervalo reveló un canal iónico de compuerta de nucleótido cíclico putativo (CNGC) que codifica un gen, llamado AtCNGCl (Kohier y Neuhaus 1998, supra) . Los cebadores de RCP, se designaron para amplificar el segmento del ADN genómico de tipo silvestre Col-0 del ecotipo de Arabidopsi s mostrado en la Fig. 13 y SEC ID NO: 14. Las secuencias cebadoras fueron: MHF813.9X (SEC ID N0:7), 5'-ATCCGCTCGAGTGATTGGTTTCGTCTTGTCC-3' y MFH819.9B (SEC ID NO: 8), 5'-TTCGCGGATCCTATGCACTGTGCCTGTGTGA-3' . El ADN del producto resultante de PCR midió la secuencia de codificación AtCNGCl completa (véase Figura 14 y SEC ID NO: 5), así también como aproximadamente 2kb de ADN corriente arriba (región promotora putativa) y aproximadamente 0.5 kb de ADN corriente abajo (región terminadora putativa) . La polimerasa de ADN de alta fidelidad (polimerasa Taq, Stratagene Co. La Jolla, CA) , se usó en la reacción en cadena de la polimerasa junto con los cebadores y plantillas anteriores para generar el producto esperado. Este producto se clonó en el vector del plásmido competente de transformación de planta/Agro¿acteriuín PCLD04541 [Jones, J.D.G. et al. (1992) Transgeni c Research 1:285-297]. Los productos resultantes (de tres reacciones PCR independientes), llamadas pACol-01-la, pSCol-07-23a, y pZCol-08-27c, se movieron en Agrobacteri um tumefaci ens y se usaron para transformar genéticamente plantas dnd2-l / dnd2-l de Col-0 de Arabidopsis, usando el método "inmersión floral" [Clough y Bent (1998) Plant J. 16:735-743]). Los transformantes putativos se identificaron por selección en placas de canamicina usando métodos estándares. Estos transformantes putativos fueron entonces transplantados al suelo mientras todavía son muy jóvenes (aproximadamente diez días de edad) . Después de crecer por unas cuantas semanas adicionales, llegó a ser aparente que todos los tres constructos de plásmidos, las plantas imitantes dnd2 transformadas han sido fenotípicamente complementadas y parecidas al tipo silvestre en lugar de dnd2. Como en la clonación posicional exitosa de DND1 , esto fue inicialmente determinado por la observación del tamaño de planta [Clough et al. (2000) Proc . Nati . Acad. Sci . (USA) en press]. Las plantas dnd2 de control transformadas con el vector pCLD04541 que no contiene ADN que mide el AtCNGCl , no presentaron complementación fenotipica (véase Fig. 16) . En resumen, los genes DND1 y DND2 descubiertos inicialmente por sus características fenotípicas, es decir, resistencia incrementada a la enfermedad y supresión de la muerte de células de RH, ambos codifican productos de proteínas con clara similitud a los canales iónicos de compuerta de nucleótido cíclico de mamífero y otros metazoarios [Kohier y Neuhaus (199) supra; Kohier et al. (1999) Plant J. 18: 97-104; Leng et al. (1999) Plant Physiol. 121:753-761. Los ADNcs derivados de estos locis o sitios, han sido estudiados por otros grupos. Recientes estudios por Leng et al, demuestran que el producto de AtCNGC2 es en verdad un canal iónico funcional que es interrumpido por nucleótidos cíclicos. Sin embargo, la presente invención es la primera descripción que hace la conexión critica entre los genes de canales iónicos de compuerta de nucleótidos cíclicos y la resistencia a la enfermedad/supresión de las funciones de la muerte celular de los genes DND mutados. En consecuencia, esta invención proporciona métodos de elaboración de plantas resistentes a enfermedades manipulando ya sea un gen DND (o producto de gen) o un gen de canal iónico de compuerta de nucleótido cíclico (o producto de gen) . El descubrimiento de genes AtCNGC2/DNDl y AtCNGCl / DND2 , como reguladores de la resistencia a enfermedades junto con su biodisponibilidad de la información de secuencia genómica, hace posible que la resistencia a enfermedades de la planta o muerte de células puedan ser manipuladas por la tecnología de ADN recombinante bien conocida en la técnica. Por ejemplo, un experto en la técnica puede usar las secuencias de nucleótidos de los genes AtCNGC/DND descritos aquí para aislar genes relacionados en otras plantas. Los genes DND1 y 2 portan aproximadamente 46% de identidad de secuencia al nivel de nucleótido en la región codificante. Es probable que un homólogo funcional o estructural de los genes AtCNGC2/DNDl y AtCNGCl/DND2, podrá portar homología de secuencia similar. Una vez identificados, estos genes pueden ser empleados para mejorar la resistencia a enfermedades. La proteína CNGC/DND o un homólogo de la misma, pueden ser modificados por substitución de residuos de aminoácidos, supresiones, adiciones, y similares. Los mutantes generados pueden presentar fenotipos diversos además de los grados variantes de resistencia al patógeno. Un mutante (o mutantes) que presentan una resistencia incrementada a la enfermedad sin una estatura enana pueden ser aislados. Los métodos para la mutagénesis y alteraciones de secuencias de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Kunkel, T. (1985) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 82:488-492; Kunkel et al., (1987) Methods in Enzymol . 154:367-382. Alternativamente, la resistencia a enfermedades puede incrementarse por la inactivación o regulación descendente del gen CNGC/DND o un homólogo del mismo. La secuencia genómica de DND1 mostrada en la Figura 6, contiene aproximadamente 1.6 kb de la secuencia de flanqueo 5' además de los intrones y exones, y aproximadamente 700 nucleótidos de la región de flanqueo 3' . La secuencia genómica DND2 mostrada en la Figura 13 contiene aproximadamente 2kb de una secuencia de flanqueo de 5' , y aproximadamente 0.5 kb de una secuencia de flanqueo 3' además de la secuencia de codificación para AtCNGCl . Las secuencias de flanqueo que circundan el gen contienen de manera general varias secuencias regulatorias las cuales controlan la expresión del gen, ya sea transcripcionalmente o transduccionalmente. Por lo tanto, la expresión del gen AtCNGC2/DNDl o AtCNGCl/DND2 puede ser regulada descendentemente o inactivada ya sea transcripcionalmente o transduccionalmente. De manera similar, un experto en la técnica pude suministrar cualquier molécula antisentido basada en las secuencias mostradas aquí, incluyendo los sitios de empalme (es decir, conjunción intrón-extrón) , para inactivar o regular descendentemente el gen CNGC/DND. La supresión de hebra sentido, silenciamiento del gen inducido por virus, ARN de doble hebra y otros métodos de inactivación también son aplicables [Hamilton y Baulcombe (1999) Sci ence 286:950-952; Somerville, C. et a. (1999) Sci ence 285:380-383; Jorgensen, et al. Patente Estadounidense No. 5,283,184]. Las secuencias de flanqueo que contienen elementos regulatorios para la transcripción pueden también ser usadas para identificar composiciones las cuales inhiben la expresión del gen CNGC/DND. Los genes DNDJ y DND2 son altamente relacionados como evidencia por la homología de secuencia ("46% de identidad al nivel del nucleótido) . Kohier et al (1999) reporta una familia de gen de 6 C?GCs putativos en .. - ,* .* t.i Arabidopsis thaliana, los cuales portan homología estructural significante. Un experto en la técnica puede fácilmente utilizar las secuencias de nucleótidos que codifican a los genes DND1 y DND2 proporcionados aqui para aislar los genes potenciales adicionales de resistencia a enfermedades. Las secuencias de nucleótidos que codifican al ?tCNGC2/DNDl y AtCNGCl /D?D2 , pueden ser utilizadas para aislar genes homólogos a partir de otras plantas que incluyen sorgo, Brassica, trigo, tabaco, algodón, avena, girasol, calabacita, alfalfa, soya, sorgo, etc. Las secuencias codificantes de otras plantas pueden ser aisladas de conformidad con las técnicas bien conocidas basadas en su homología de secuencia a las secuencias codificantes AtCNGC2/DNDl o AtCNGCl/ DND2 expuestas aquí en las SEC ID ?Os : 2 y 5. En estas técnicas, todo o parte de la secuencia codificante conocida es usada como una sonda la cual hibridiza de manera selectiva a otras secuencias codificantes de resistencia a enfermedades presentes en bibliotecas de AD?c o genómicas a partir de un organismo seleccionado, o secuencia genómica o secuencias codificantes, son usadas para designar cebadores PCR para el mismo propósito. Alternativamente, los genes homólogos pueden ser identificados a partir de las bases de datos de secuencias genómicas o EST usando secuencias de ADNc o genómico de AtCNGC2/DNDl o AtCNGCl/ DND2. De manera similar, la búsqueda puede utilizar la secuencia de aminoácido derivada o gen AtCNGC2/DNDl o AtCNGCl/DND2 completo o subdominios de los 5 mismos. Los métodos para la búsqueda de manera similar se pueden encontrar en Brenner, S. y Lewitter, F. Editores (1998) Trends Guide to Bioinformatics . , Elsevier Science Ltd., S. y U.K. La identificación de AtCNGC2/DNDl o AtCNGCl/ DND2 y sus homólogos en otras plantas, puede 10 facilitar la identificación de genes efectores que interactúan con AtCNGC2/DNDl o AtCNGCl / DND2 o su gen homólogo o producto de gen; o la identificación de los químicos efectores u otras intervenciones que alteran la función AtCNGC2/DNDl o AtCNGCl / DND2 en una forma deseable. Un 15 protocolo detallado para estos experimentos incluyen la selección por hibridación de bibliotecas de ADN plaqueadas se puede encontrar en Sambrook et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Ausubel, F. M. et a., (1997) "Current Protocols in Molecular Biology" Wiley, 20 New York. Por ejemplo, la hibridación de tales secuencias se puede llevar a cabo bajo condiciones de rigurosidad reducida, rigurosidad media o aún condiciones de rigurosidad alta (por ejemplo, condiciones representadas por una rigurosidad de lavado de 35-40% de formamida con solución Denhardt 5x, 0.5% de DSD y 1 x SSPE a 37 °C; las condiciones representadas por una rigurosidad de lavado de 40-45% de Formamida con solución Denhart 5x, 0.5 SDS y lx SSPE a 42 °C; y condiciones representadas por una rigurosidad de lavado de Formamida al 50% con solución Denhart 5x, SDS y 1 x SSPE a 42°C, respectivament) , a ADN que codifica los genes de resistencia a enfermedades descritos aquí en un ensayo de hibridación estándar. La mutación de un gen de canal iónico de compuerta de nucleótido cíclico en plantas preferentemente Arabidopsi s, puede ser usado en un programa de cultivación de plantas convencionales para introducir un fenotipo dnd en una variedad de lo mejor o élite. Tales mutaciones pueden ser identificadas como se describe aquí para Arabidopsis . La cultivación se facilita identificando uno o más marcadores enlazados al gen DND. Tales marcadores pueden incluir marcadores convencionales o marcadores moleculares tales como marcadores RFLP o SSR. Por ejemplo, los marcadores SSR (repetición de secuencia simple) han sido formadsres de mapas para el genoma de soya completo y son disponibles públicamente de la USDA (véase -,&.fe , Í http:Soybase.agron.aistate.edu) o de Research Genetics Inc., Hunstville, AL. Los métodos formadores de mapas convencionales son usados para identificar uno o más marcadores SSR ligados al sitio DND. Los marcadores 5 moleculares similares son disponibles para la mayoria de los cultivos agronómicos. Por cultivación convencional, un alelo mutante de DND adecuado, puede ser introgresado en una línea de soya comercial deseada, siguiendo un marcador SSR ligado apropiado durante el cruzamiento y recruzamiento como se 10 conoce en la técnica. El mismo proceso resumido anteriormente puede ser usado, con marcadores apropiados, para la cruza de mutaciones DND en otras variedades de plantas. Los métodos de la presente invención son métodos conocidos en la técnica y pueden ser usados para transformar 15 cualquier planta. En esta manera, se pueden obtener las plantas genéticamente modificadas, células de plantas, tejidos de plantas, semillas, y similares. Los protocolos de transformación pueden variar dependiendo del tipo de planta o la célula de planta, es decir, monocotiledónea o 20 dicotiledónea, objetivo para la transformación. Los métodos adecuados para la transformación de células de plantas incluyen microinyección [Crossway et al. (1986) Bi otechniques 4:320-334]; electroporación [Riggs et al. Proc . Na ti . Acad.

Sci . USA 83:5602-5606]; transformación mediada por Agrobacteri um [Hinchee et al., Biotechnol ogy 6:915-921]-, transferencia directa de gen [Paszowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722] ; y aceleración de partículas balísticas [véase 5 por ejemplo, Sanford et al., Patente Estadounidense 4,945,050; y McCabe et al. (1988; Biotechnol ogy 6:923-926]. También véase Wissinger et al. (1988) Annual Rev. Genet . 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou et al. (1988) Plant 10 Physiol . 87:671-674 (soya); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soya); Datta et al. (1990) Bi otechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA. 85:4305-4309 (maiz); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); Klein et al. (1988) 15 Plant Physi ol . 91:440-444 (maíz); Fromm et al. (1990) Bi otechnol ogy 8:833-839; y Tomes et al. "Direct DNA transfer into intact plant cells via microprojectile bombardment" In Gamborg and Philips (Eds.) Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, Springer-Verlag, Berlin (1995); 20 Hooydaas-Van Slogteren & Hooykaas (1984) Na ture (Londres), 311:763-764; Bytebier et al. (1987) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA. 84:5345-5349 (liliaceae); De Wet et al. (1985) Jn The Experimen tal Manipulati on of Ovul e Tissues, ed. G.P. Chapman et al., pp. 197-209; Long an. NY (polen); Kaeppler et al (1990) Plant Cell Reports 9:415-418; y Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl . Genet . 84:560-566 (transformación mediada por whisker) ; D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annal s of Botany 75:407-412 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz vía Agrobacteri um tumefaciens) ; todas de las cuales están incorporadas aquí por referencia. Las células las cuales se han transformado pueden estar creciendo en plantas de conformidad con las vías convencionales. Véase por ejemplo, Mcormick et al (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas pueden entonces hacerse crecer, y ya sea polinizarse con la misma cepa transformada o cepas diferentes, y el híbrido resultante que tiene las características fenotípicas identificadas. Dos o más generaciones pueden hacerse crecer para asegurar que la característica fenotípica sujeta sea establemente mantenida y heredada y después las semillas cosechadas para asegurar el fenotipo deseado o que otra propiedad se ha alcanzado. La regeneración eficiente de plantas a partir de células individuales o protoplastos es esencial en la manipulación genética de plantas usando varias tecnologías de ^t.?,i transferencia de genes. Los protocolos detallados para tales procedimientos se pueden encontrar en las siguientes referencias: Li, H.Q. et al., (1996) Na t . Biotechnol . 14 (6) :736-740; Ghosh Biswas. G.C. et al. (1994) J. Biotechnol . 32(1):1-10; Datta, S. K. et al. (1992) Plant . Mol . Biol . 20(4) :619-629; y Lorz, H. et al. (1979) Planta Med. 36(1) :21-29. Como se nota claramente, las secuencias de nucleótidos de la invención pueden ser utilizadas para proteger plantas de enfermedades, particularmente aquellas causadas por patógenos de plantas. Los patógenos de la invención incluyen pero no se limitan a, virus o viroides, bacterias, hongos, y similares. Los ejemplos específicos de estos patógenos incluyen pero no se limitan a, los patógenos listados en la Tabla I. La identificación de genes DND1 y DND2 como genes de canales de compuerta de nucleótidos cíclicos en Arabidopsis ofrece medios adicionales para identificar composiciones las cuales pueden incrementar la resistencia a enfermedades en plantas. Los cultivos de tejidos de plantas y las células de plantas recombinantes que contienen las proteinas y secuencias de nucleótidos del gen CNGC/DND, o células transgénicas de otras especies tales como Escheri cha coli o Saccharomyces cerevisae o Xenopus laevis que expresan la proteína CNGC/DND o la proteina CNGC/DND purificada, pueden ser usadas en un ensayo para seleccionar composiciones las cuales inhiben la función de la proteína de canal de compuerta de nucleótido cíclico. Tal ensayo es empleado como una selección general para identificar composiciones las cuales inhiben la actividad de la proteína AtCNGC2/DNDl o AtCNGCl/DND2. El protocolo de ensayo detallado para la medición de la actividad del canal se puede encontrar en Leng et al. (1999) Plant Physiol . 121:753-761. Una composición que resulta en menos actividad de canal después de la adición al ensayo, comparada con aquella del control, es definida como un inhibidor. Si tal composición se encuentra, podrá ser útil incrementar la resistencia a las enfermedades en plantas. Como se discutió, los genes de la invención pueden ser manipulados para incrementar la resistencia a enfermedades y/o muerte celular en plantas. En esta manera, la expresión o actividad del AtCNGC2/DNDl (o AtCNGCl / DND2) u otros genes de resistencia a las enfermedades pueden ser alterados. Tales medios para la alteración del gen incluyen co-supresión, antisentido, mutagénesis, alteración de la localización sub-celular de la proteína, etc. En algunos ejemplo, puede ser benéfico expresar el gen a partir de un promotor inducible, particularmente a partir de un promotor mducible por patógeno o de un promotor específico de estado de crecimiento o específico de tejido, o por forma inducida por rocío químico (véase U.S. 5,689,042, U.S. 6,008,436, U.S. 5,589,622, y U.S. 5,789,214). Tales promotores incluyen aquellos de proteinas relacionadas con patogénesis (proteína PR) , las cuales son inducidas después de la infección por un patógeno; por ejemplo, Proteínas PR, proteínas SAR, beta-1, 3-glucanasa, quitinasa, etc. Véase por ejemplo, Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pa thol . 89:245-254; Uknes et al. (1992) The Plant Cell 4:645-656; y Van Loon (1985) Plant Mol . Virol . 4:111-116. Las plantas homocigotas para la mutación dndl o dnd2 , presentan supresión substancial de muerte celular de "respuesta hipersensitiva" (RH) , una forma de muerte celular localizada asociada con la resistencia a la enfermedad en plantas "gen por gen" y también asociada con algunos ejemplos de necrosis inducida por patógeno como parte de un daño de enfermedad o susceptibilidad. Esta muerte celular es benéfica a la planta en algunos ejemplos pero es deteriorante en otros. La muerte celular de plantas puede ser parcialmente o completamente controlada por modificaciones similares del gen AtCNGC2/DNDl o AtCNGCl / DND2 u homólogo del mismo como se describe en la presente invención.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proporcionan para propósitos ilustrativos, y no están propuestos para limitar el ámbito de la invención como se reivindica aquí. Cualquier variación en los artículos ejemplificados los cuales ocurren para el experto artesano, están propuestos para caer dentro del ámbito de la presente invención.

Ejemplo 1. Inoculación con P. syringae . Los mutantes originales y su progenie son sometidos a prueba para la RH por inoculación en pipeta de hojas individuales con P. syringae pv. glycinia Clase 4p V288 { asvrRp2+) o Clase 4 p VSP61 (sin gen avr) a ~2 x 108 unidades formadoras de colonias (cfu) /ml (19,20). Se usaron cepas adicionales de P. syringae para probar la RH gen-por-gen inducido por P. syringae pv. glycinia Clase 4 pAvrRpml (avrRpml+) y Clase 4 pVBOl { avrB+ ) [Kunkel, (1993) supra; Bisgrove, (1994) supra] . Los controles positivos y negativos de Arabidopsi s incluyen el uso de mutantes de Col-0 tipo silvestre, rps-201/rps2-201 de Col-0, y rpm/rpml de Col-0 ( "rps3-l " ) [Kunkel, (1993) supra; Bisogrove, (1994) supra].

Para experimentos de crecimiento bacteriano y para estudios de la expresión de gen, cepas P. syringae pv. tomato DC3000 y cepas de P. syringae pv. maculicola 4326, se usaron con los plásmidos anteriores o con pKec218 (avrRps44) [Hinsch, M. et 5 al. (1996) Mol . Plant -Microbe Interac . 9:55-61]. Las determinaciones cuantitativas del crecimiento bacteriano en hojas se realizó por plaqueo de dilución de tejido de hojas homogeneizados en medio selectivo, como se describe en Whalen, (1991) supra. 10 Ejemplo 2. Selección de Mutantes y Cruzas. Las semillas Col-0 del ecotipo de Arabidopsi s thaliana se mutagenizaron con metansulfonato de etilo; se obtuvieron poblaciones M2 a partir de Semillas Lehle (Round, 15 Rock, TX) . Para probar la activación de RH, P. syringae pv. glycinia Clase 4p V288 { asvrRp2") , a una concentración de «2 x 108 cfu/ml en 10 mM de MgCl2, se introduce por infiltración a vacío en el tejido de mesófilo de hoja de plántulas «11,000 M2. Las hojas se observaron 24 y 40 horas después de la 20 infiltración, y las plantas con hojas reducidas, retardadas o sin hojas colapsadas, se salvaron por análisis adicional. Líneas de interés potencial se cruzaron con el padre Col-0 de tipo silvestre para iniciar el recruzamiento con el ecotipo No-0 para iniciar la formación de mapas genéticos. Para pruebas de complementación, plantas dnd/dndl de Col-0 se cruzaron a mutantes cprl y cpr5 homocigotos, los cuales presentan un tamaño de roseta reducido [Bowling, S.A. et al. 1997) Plant Cell 9:1573-1584; Cao, (1994). La dominancia/recesividad y complementación genética se dedujeron por observación de que todas las plantas Fl fueron de tipo cieno en apariencia y presentaron el RH después de la inoculación P. syringae pv. glycinia Clase 4p V288.

Ejemplo 3. Microscopio. Para monitorear la muerte de células de RH al nivel celular, se usó la infiltración de pipeta para introducir P. syringae pv. glycinia Clase 4p V288 { asvrRp+) o Clase 4p VSP61 (sin gen avr) en 40-=70% del espacio mesófilo de hojas individuales, a concentraciones bacteriales indicadas. Las hojas se removieron de plantas después de 24 horas, fijadas en formaldehido al 2%, ácido acético al 5%, y 40% de etanol por 30 minutos, y después se clarearon de manera secuencial en etanol al 50% y etanol al 95% [Yu, (1993) supra]. Las células del parénquima de las hojas entonces se examinaron por autoflorescencia asociada a la RH usando microscopio fluorescente con una serie de filtro de fluoresceína (Ex 495 -^-^»^iw»j,. + 20 nm, Em > 505 nm [Klement, (1990) supra] . Alternativamente, el Manchado Evans (Sigma) , se infiltró en las hojas como una solución acuosa al 1%, 22-26 horas después de la inoculación del patógeno [Klement, (1990) supra] . 5 Después de al menos 10 minutos de teñido, las hojas se removieron de las plantas, una porción de la epidermis se raspó nuevamente y las hojas se enjuagaron en H20, montado en H20, y observado por luz de microscopio. Las áreas de las hojas dañadas por manipulación física no fueron consistentes 10 cuando se evaluó la proporción de células muertas y vivas.

Ejemplo 4. Formación de mapas genéticos. Poblaciones F2 de una cruza de dndl/dndl de No-0 x Col-0 se usaron para la formación de mapas. El fenotipo de RH 15 se valoró visualmente 24 horas y 48 horas después de la inoculación en pipeta de hojas con P. syringae pv. glycinia Clase 4p V288 { asvrRp+) resuspendida a *1 x 108 cfu/ml en 10 mM de MgCl2. Las lineas informativas F2 se sometieron a pruebas nuevamente por RH en familias F3 autoalimentadas. La 20 secuencia polimórfica amplificada escindida a base de PCR y los marcadores microsatélites se usaron como se describe en Bell, C. J. et al. (1994) Genomics 19:137-144; y Konieczny, A. et al. (1993) Plant J. 4:403-410; una serie de 17 marcadores quemiden todos los cinco cromosomas de Arabidopsis se usaron para análisis de enlace inicial.

Ejemplo 5. Inoculaciones con Otros Patógenos. La cepa de grape de virus de espora de anillo del tabaco, se aplicó a las plantas, y la multiplicación del virus se monitoreó usando ELISA, como se describe en Lee, (1996) supra. cepas de Xanthomonas campestris pv. campestris [Parker, J.E. et ak. (1993) Mol . Plant -Microbe Interact . 6:216-224] se aplicaron a una concentración de «1 x 107 cfu/ml y se monitorearon como se describe en Parker, (1993) supra. Se aplicó Noco2 aislado de Peronospora parasí tica y se monitoreo como se describe en Parker, J. E. et al. (1997) Trends Biochem. Sci . 22:291-296. Para todos los experimentos, el ecotipo Col-0 de Arabidopsis sirvió como un control susceptible para la multiplicación del patógeno y virulencia.

Ejemplo 6. Estudios de Expresión de Gen. Cepas P. syringae pv. toma to DC3000 (pV288) o DC3000 (pVSP61) se introdujeron en el mesófilo de la hoja de plantas intactas por infiltración a vacío (como anteriormente), típicamente a una dosis de 5 x 104 cfu/ml. El ARN total se extrajo del material de hoja y cantidades . m. ?. ?.J. . m Am* i? ^^^^^^^ - * -í t .Í iguales de ARN a partir de cada muestra se separaron en geles de agarosa-formaldehido, mancharon, e hibridizaron con sonda 32P-radioetiquetada esencialmente como se describe en Ausubel, (1997) supra. Las sondas de AD? fueron de Cao et al. [Cao, (1994) supra] . La hibridación se cuantifico usando un sistema formador de imágenes fosfor de almacenamiento de conformidad con las instrucciones del fabricante (Molecular Dymamics) .

Las señales para PR-1 o ß-glucanasa en cada línea se normalizó a la señal de control ß-ATPasa para tal línea para corregir las ligeras diferencias en la carga de gel, y las señales normalizadas entonces se dividieron por la señal para la muestra de Col-1/sin patógeno para establecer una escala relativa.

Ejemplo 7. Determinaciones de Acido Salicílico. Se realizaron determinaciones de ácido salicílico como se describe en Uknes, S. et al. (1993) Mol . Plant -Microbe Interac : 6:696-698 en el material de hoja a partir de plantas no inoculadas de 6 semanas de edad.

Ejemplo 8. Complementación funcional del fenotipo dndl . Igualación Tri-parental : Para transformar los cósmidos en Arabidopsis para los estudios de complementación, los cósmidos se colocaron en Agrobacteri um. Los miembros de la biblioteca cósmido se transfirieron a la cepa de Agrobacteri um tumefaciens GV3101 vía una igualación tri-parental. Los cultivos líquidos se prepararon para cada uno de los padres: GV3101 (pMP90) , cepa de E. coli HB101 que contiene el plásmido auxiliador de igualación pRK2013, y el donador XL-1 de E. coli que porta el cósmido. Los cultivos se motearon en medio LBA (sin antibióticos) de manera que una proporción aproximada 5:1:1 de recipiente, auxiliador, y donador se alcanzaron dentro de un único manchado para cada cósmido. Estos manchados de igualación se hicieron crecer durante la noche a 28 °C. Al siguiente días cada manchado de igualación se re-alteraron en medio LB bajo en sal (10 g de tpptona, 5 g de extracto de levadura, y 5 g de NaCl/litro) + tetraciclina (2.5 µg/ml) + rifampicina (100 µg/ml) + gentamicina (50 µg/ml) y se hicieron crecer a 28°C por dos días. Las colonias se perforaron de estas placas y se re-alteraron en LBA bajo en sal (1.5% ágar) que contiene rifampicina (100 µg/ml) y canamicina (25 µg/ml) para seleccionar las colonias de Agrobacteri um que contienen un vector cósmido. Transformación de Arabidopsis: plantas dndl mutantes se transformaron con clones de cósmidos que albergan Agrobacteri um vía el método de inmersión floral (Clough y Bent, 1998) . Los cultivos bacterianos (150 ml) de cada cósmido se hicieron crecer a 28°C en LB bajo en sal + canamicina (25 µg/ml), centrifugado a 6,000 rpm por 15 minutos. La bacteria se resuspendió en 5% de sucrosa perforada con 0.05% de tensioactivo Silwet L—77 (Osi Specialities, Inc.). Las plantas mutantes dndl se hicieron crecer en macetas de 3.5 pulgadas con suelo amontonado sujetado con tul bajo 8-15 horas de luz en el invernadero hasta que presentaron los retoños primarios. Las plantas se sumergieron en la solución de Agrobacteri um por 2-5 segundos, y después se colocaron bajo un domo durante la noche. En este tiempo, las plantas se movieron a 15 horas de luz. Las semillas se cosecharon 3-5 semanas después, una vez que las silicuas fueron cafés y uniformemente secas. Después de 2-3 días de secado adicional en tubos micro-centrífugos de 1.5 ml en el banco del laboratorio, las semillas se esterilizaron por ya sea esterilización en fase de vapor o líquida como se describe (Apéndice 4) . Las semillas esterilizadas se re-suspendieron en agarosa al .1% estéril y se plaquearon en placas de selección de canamicina (50 µg/ml) . Típicamente -3000 semillas se plaquearon por placas de cajas de petri 150 x 15 mm. Después de 7-10 días de crecimiento bajo 24 horas de •A.**-,» * é-luz, las plántulas resistentes a la canamicina con hojas verdes y sistemas de raíces bien establecidos, se consideraron transformantes putativos y se transplantaron al suelo para análisis posterior. Debido a que los mutantes dnd son ~100x más recalcitrantes a la transformación que el tipo silvestre, varias placas de semillas (algunas veces 5-10) , se seleccionaron para obtener unos cuantos transformantes putativos . Después los transformantes putativos se obtuvieron y transplantaron al suelo, se hicieron crecer por unas 3-4 semanas adicionales en una cámara de crecimiento bajo 8 horas de luz. En este tiempo, los tamaños de los transformantes individuales se compararon con aquellos de un control Col-0 de tipo silvestre (linea A21, un transformante de control de vector que es de tamaño del tipo silvestre y resistente a la canamicina) , que fueron seleccionados de manera similar en palcas de canamicina y transplantados al suelo. Los cósmidos putativamente de complementación se identificaron basados en el tamaño y se dejaron para semillas auto y T2 se cosecharon de estas plantas para análisis adicional. Curvas de Crecimiento Bacteriano: Además de afectar el tamaño de la planta, la mutación dndl también afectó el crecimiento del patógeno y la habilidad para producir una RH a^j^i^^^^^^^j ¿j aH^js en respuesta a un patógeno avirulento. Para verificar que los cósmidos de complementación del fenotipo enano de dnd actualmente complementan el sitio dndl , la reversión de estos otros fenotipos característicos de dndl también se examinó en 5 estas plantas. Las curvas de crecimiento se realizaron en plantas T2 transformadas con un cósmido de complementación, así también como en controles Col-0 y dndl . Las plantas se infiltraron a vacio con un P. s . pv. toma to DC3000 (Pst CD3000) que llevan ya sea avrRP2 (pV288) o sin gen avr 10 solamente vector) . Aproximadamente 5 x 104 cfu/ml de bacteria se usaron para cada inoculación (O.D.60o + .005) . Este nivel de patógeno efectivamente imita los niveles bajos de patógenos que ocurren durante las infecciones naturales . Para cada muestra, dos discos de hojas se tomaron de cada una de 15 las dos plantas, por triplicado, usando una barrena de corcho #1. Así, para cada combinación de planta/patógeno, 12 discos de hojas se sometieron a muestras por puntos de tiempo. Las muestras se colectaron a 0, 2 y 4 días post-inoculación (o justo a los 3 días) . Los discos de las hojas se cosecharon en 20 tubos micro-centrífugos de 1.5 ml con 200 µl 10 mM de MgCl2, molido con un mortero y diluido de manera serial en NYGA (5g de Bacto-peptona, 3 g de extracto de levadura, 20 ml de glicerol y 15 g de ágar/litro) + rifampicina (100 µg/ml) + cicl heximida (50 µg/ml) , después se hizo crecer por dos días a 28°C. Las colonias se contaron y los datos se analizaron usando Manchado Sigma (Jandel Scientific, CO) . Ensayo de RH: Se realizaron ensayos de RH en T2 a partir de dos cósmidos de complementación, además a los controles Col-0 y dndl . La inoculación con niveles altos de P. syringae Clase 4 (Psg R4) (obtenidas de N. T. Keen, Univ. De California-Riverside) que lleva avrRpt2 induce el RH (colapso de hojas visibles) en reacciones incompatibles. Las plantas se inocularon con 2 x 108 cfu/ml (O.D.60o =2) de bacteria con una jeringa y se registraron por colapso de hojas visibles por 24 horas después de la inoculación. La severidad de RH se proporcionó en una escala 0-5 (0 = sin colapso, 5= colapso total) . Para cada planta, se inocularon tres hojas con Psg R4 (pV288) (con un gen avr) y una hoja se inoculó con Psg R4 (pVSPdl) (sin gen avr) .

Ejemplo 9. Modificación de Plantas de Soya para incrementar la Resistencia a la Enfermedad y/o Muerte Celular Reducida. Como un ejemplo de un uso de la presente invención, plantas de soya pueden ser diseñadas genéticamente para presentar resistencia al padecimiento y/o muerte celular reducida después de la infección por un patógeno. Una AK^a.*, * S A-A & secuencia de ADN de soya que codifica un canal iónico de compuerta nucleótido cíclico homólogo a una de las secuencias de ADN descritas aquí, se puede obtener a partir de la información y materiales disponibles en la técnica, sin experimentación indebida. La información actualmente disponible en las bases de datos de la secuencia genómica incluye secuencias EST ADN para ADNsc aisladas de soya. Recientemente, un clon EST (Acceso Banco de Genes AW 781088) se identificó como un CNGC putativo de soya. De manera similar, clones múltiples EST se han identificado por codificar proteínas CNGC putativas de otras especies de plantas que incluyen lotus japónico, tomate, algodón y melón. Usando métodos asistidos por computadora, un experto en la técnica puede derivar una secuencia de aminoácido probable por un ADNc dado. Un investigador puede fácilmente identificar dentro de la base de datos de la secuencia una secuencia de ADN de soya que codifica un dominio de enlace de nucleótido cíclico u otras porciones de secuencias de aminoácido derivadas características de los canales iónicos de compuerta de nucleótidos cíclicos. La secuencia de ADN completa para tal ADNc, o para la región correspondiente del ADN genómico de soya, es entonces determinada, para completar la identificación de las secuencias como un gen de canal -- 'tijÜÉÉt to«>» Í.^.C, .,..— - . .. ü i * í rí? iónico de compuerta de nucleótido cíclico/DND. Un cásete de expresión es construido para la expresión inducida por el patógeno de un gen antisentido o sentido. Para este propósito, muchos genes inducidos por patógenos pueden servir como la fuente de un promotor adecuado. Por ejemplo, la región promotora del gen PR-1 de soya inducido por patógeno [Acceso a GenBank AF136636, véase también Ryals et al. (1996) Plant Cell 8:1809-1819; Raymond et al. (2000) Plant Cell 12:707-720] u otro promotor inducido por la infección es fusionado a un segmento pequeño (25-100 pb) , medio (101-500 pb) o grande (501 pb a longitud completa del gen) del gen DND de soya, en la orientación sentido o antisentido con relación al promotor [Hamilton y Baulcombe (1999) supra; Jorgensen, et al. Patente Estadounidense 5,283,184; y Bridges et al., U.S. 5,073,676]. Esto es seguido por un termmador transcripcional estándar tal como la región terminadora 3' de sintasa nopalina de Agrobacteri um tumefaciens . Usando métodos bien conocidos por aquellos artesanos expertos, el promotor PR-1/DND antisentido/ADN terminador nos o promotor PR-l /DND sentido/constructo de AD? terminador nos, es colocado en un vector adecuado para la transformación mediada por Agrobacteri um de soya, y después usado para la transformación de una variedad de soya agrícolamente adecuada. Los l íi . t- ? . . t ¡.r¿ . í, . i . X-.-.-r.: . transformantes se identificaron por el uso de un gen marcador co-transformado, usando ya sea un marcador seleccionable tal como resistencia a la canamicina, o un marcador seleccionable tal como GUS. Los transformantes se regeneraron siguiendo las técnicas conocidas en el arte, para producir plantas maduras. Las líneas de soya transgénicas productivas fértiles que llevan estos constructos de ADN son con ello, creadas e identificadas. Las plantas se sometieron a prueba por su expresión inducible por patógeno del promotor PR-l/DND antisentido/AD? terminador nos o promotor PR-l/DND sentido/constructo de AD? terminador nos. Las plantas pueden ser además, sometidas a prueba por silenciamiento transcripcional o transduccional de la expresión de D?D de soya endógeno/gen de canal iónico de compuerta de nucleótido cíclico. El silenciamiento puede lograrse solamente en tejidos infectados, o puede lograrse sistemáticamente a través de muchas de las plantas, y puede lograrse debido a una variedad de mecanismos moleculares. La resistencia puede ocurrir localmente al sitio de la infección, o puede extenderse sistémicamente a muchas otras porciones de la planta infectada, y puede lograrse debido a una variedad de mecanismos moleculares. Se nota que, manteniendo con la epidemiología de muchas enfermedades de plantas, las infecciones iniciales ocurren frecuentemente a un número limitado de sitios en la planta, así que la inducción de la resistencia a un estado temprano después de la infección puede reducir la expansión de la infección a otros sitios en la planta infectada y puede también reducir la expansión del patógeno a otras plantas. Como un segundo ejemplo de la presente invención, las plantas de soya son diseñadas genéticamente para presentar marcada resistencia a las enfermedades y/o reducir la muerte celular inducida por el tratamiento con un químico de inducción. Un DND de soya/gen de canal iónico de compuerta de nucleótido cíclico puede ser identificado por los métodos descritos en los párrafos previos o por otros métodos discutidos aquí. Los constructos de ADN son creados conteniendo un promotor químicamente inducible tal como aquellos descritos por Ryals et al. Patente Norteamericana 5,789,214 fusionado a un segmento pequeño (25-100 pb) , medio (101-500 pb) , o grande (501 pb a longitud de gen completo) del gen DND de soya, en la orientación sentido o antisentido con relación al promotor [Hamilton y Baulcombbe (1999) supra; (Jorgesen, et al. Patente Estadounidense 5,283,184; Bridges, et al. Supra]. Esto es seguido por un terminador transcripcional estándar tal como la región terminadora 3' de -'***• sintasa nopalina de Agrobacteri um tumefaci ens . Usando métodos bien conocidos por aquellos artesanos expertos, el promotor/DND antisentido/AD? terminador nos o el promotor/DND sentido/constructo AD? terminador nos es colocado en un 5 vector adecuado para la transformación biolística o mediada por Agrobacteri um de soya, y después usado para transformar una variedad de soya agrícolamente adecuada. La identificación y regeneración de los transformantes es llevada a cabo como se describe previamente. Las líneas de 10 soya transgénicas productivas fértiles que llevan este constructo de AD? son con ello creadas e identificadas. Las plantas se sometieron a pruebas para la expresión químicamente inducible del promotor/DND antisentido/D?A terminador nos o el promotor/DND sentido/constructo de AD? 15 terminador nos. Las plantas pueden además ser sometidas a prueba por silenciamiento transcripcional o transduccional de expresión del D?D de soya endógeno/gen de canal iónico de compuerta de nucleótido cíclico. El silenciamiento puede lograrse solamente en tejidos infectados, o puede lograrse 20 sistemáticamente a través de muchas de las plantas, y puede lograrse debido a una variedad de mecanismos moleculares. La resistencia a patógenos o muerte de células inducidas por patógenos puede ser ensayada en plantas transgénicas. La resistencia puede ocurrir localmente al sitio de la infección, o puede extenderse sistémicamente a muchas otras porciones de la planta infectada, y puede lograrse debido a una variedad de mecanismos moleculares. Se nota que, 5 manteniendo con la epidemiología de muchas enfermedades de plantas, las infecciones iniciales ocurren frecuentemente a un número limitado de sitios en la planta en un campo dado, asi que la inducción de la resistencia a un estado temprano después de la infección puede reducir la expansión de la 10 infección a otros sitios en la planta infectada y puede también reducir la expansión del patógeno a otras plantas. La inducción de la resistencia en plantas por tratamiento químico previo a la infección puede reducir la susceptibilidad a la enfermedad de plantas en riesgo previo a 15 la ocurrencia de las infecciones. Las técnicas y agentes para la introducción y selección por la presencia de ADN heterólogo en las células de plantas y/ tejidos son bien conocidos. Los marcadores genéticos permitidos para la selección de ADN heterólogo en 20 células de plantas son bien conocidos, por ejemplo, los genes que llevan la resistencia a un antibiótico tal como canamicina, higromicina, gentamicina o bleomicina. El marcador permitido para la selección de células de plantas rr.mmrJj tíímÍ ááimiim? Lmi, t ^ ,j ¿,,..t feafcj» , , . i .fe-jw» . _ . „..-. „.. . m Um. X¡ ... m*m - . - ? . 0? ~¡ l ,* l t»* i exitosamente transformadas que crecen en un medio que contiene el antibiótico apropiado debido a que llevarán el gen de resistencia correspondiente. En muchos casos el ADN heterólogo el cual es insertado en células de plantas, 5 contienen un gen el cual codifica un marcador seleccionable tal como un marcador resistente al antibiótico, pero no es mandatorio. Un marcador resistente al fármaco, ejemplar, es el gen cuya expresión resulta en la resistencia a la canamicina, es decir, el gen quimérico contiene el promotor 10 sintasa nopalina, fosfotransferasa II de neomicina Tn5 y la región no traducida 2' de sintetasa nopalina descrita por Rogers et al., Methods for Plant Molecular Biology, A. Weissbach y H. Weissbach, eds., Academic Press, Inc., San Diego, CA (1988) . 15 Las técnicas para diseñar genéticamente células de plantas y/o tejidos con un cásete de expresión que comprende un promotor inducible o promotor quimérico fusionado a una secuencia codificante heterólogo, incluyen posiblemente un constructo de ADN antisentido y/o un constructo de ADN 20 designado para provocar un silenciamiento del gen mediado por ARN de doble hebra, seguido por una secuencia de terminación de transcripción son introducidos en la célula o tejido de la planta por transformación mediada por Agrobacteri um, ¿flSiaaiBiaMaajafiÉa _¡:. i. _. ,t „ .fc ¿¡j^, , tjbuvat?.. . ...^ . , . , .. . .*.^. ^_ .. -«,.* > . i t . t electroporación, microinyección, bombardeo de partículas u otras técnicas conocidas en el arte. El cásete de expresión ventajosamente además contiene un marcador que permite la selección del ADN heterólogo en la célula de la planta, por ejemplo, un gen que lleva resistencia a un antibiótico tal como canamicina, higromicina, gentamicina o bleomicina. Un constructo de ADN que lleva un gen que se puede expresar en plantas u otro ADN de interés, puede ser insertado en el genoma de una planta por un método adecuado. Tales métodos pueden involucrar, por ejemplo, el uso de liposomas, electroporación, difusión, bombardeo de partículas, microinyección, pistola de gen, químicos que incrementan la absorción de ADN libre, por ejemplo coprecipitación de fosfato de calcio, vectores virales y otras técnicas practicadas en el arte. Los vectores de transformación adecuados de plantas incluyen aquellos derivados de un plásmido Ti de Agrobacteri um tumefaci ens, tal como aquellos descritos por Herrera-Estrella (1983), Bevan (1983), Klee (1985) y Publicación EPO 120,516 (Shilperoort et al) . Además de los vectores de transformación de plantas derivados de Ti o plásmidos que inducen en la raíz (Ri) de Agrobacteri um, pueden ser usados métodos alternativos para insertar los constructos de ADN de esta invención en las células de plantas. La selección de vector en el cual el ADN de interés está operativamente ligado depende directamente, como es bien conocido en la técnica, en las propiedades funcionales deseadas, por ejemplo, replicación, expresión de la proteína y las células hospederas a ser transformadas, estas son limitaciones inherentes en el arte de construcción de moléculas de ADN recombinantes. El vector deseablemente incluye un replicón procariótico, es decir, una secuencia de ADN que tiene la habilidad para dirigir la replicación autónoma y mantener la molécula de ADN recombinante extra-cromosomalmente cuando se introduce en una célula hospedera procariótica, tal como una célula hospedera bacteriana. Tales replicones son bien conocidos en la técnica. Además, las modalidades preferidas que incluyen un replicón procariótico también incluyen un gen cuya expresión confiere una ventaja selectiva, tal como resistencia al fármaco, a la célula hospedera bacteriana cuando se introduce en aquellas células transformadas . Los genes de resistencia al fármaco bacteriano típicos, son aquellos que confieren resistencia a la ampicilina o tetraciclina, entre otros agentes selectivos. El gen de fosfotransferasa de neomicina tiene la ventaja que es expresado en células eucarióticas así como también procarióticas . Aquellos vectores que incluyen un replicón procariótico también incluyen típicamente sitios de restricción convenientes para la inserción de una molécula de ADN recombinante de la presente invención. Típico de tales plásmidos de vectores son pUC8, pUC9, pBR322 y pBR239 disponibles de Laboratorios BioRad (Richmond, CA) y pPL, pK, y K223 disponible de Pharmacia (Piscataway, NJ) , y pBLUESCRIPT y pBS disponible de Stratagene (La Jolla, CA) . Un vector de la presente invención puede también ser un vector de fago Lambda que incluye aquellos vectores Lambda descritos en Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición, maniatis et al., eds., Cold Spring Harbor Press (1989) y los vectores ZAP lambda disponibles de Stratagene (La Jolla, CA) . Otros vectores ejemplares incluyen pCMU [Nilsson et al. (1989) Cell 58:707]. Otros vectores apropiados pueden también ser sintetizados, de conformidad con los métodos conocidos; por ejemplo, vectores pCMU/Kb y pCMUII usados en varias aplicaciones aquí son modificaciones de Pcmuiv [ ilsson, (1989) supra] . Los vectores de expresión típicos capaces de expresar una secuencia de ácido nucleico recombinante en células de plantas y capaces de dirigir la integración estable dentro de las células de plantas hospederas incluyen vectores derivados del plásmido que induce el tumor (Ti) de Agrobacteri um tumefaci ens descritos por Rogers et al. (1987) Meth . in Enzymol . 153:253-277, y varios otros sistemas vectores de expresión conocidos por funcionar en plantas. Véase por ejemplo, Verma et al., No. WO87/00551; Cocking y Davey (1987) Sci ence 236:1259-1262. Una planta transgénica puede ser producida por cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo pero no limitado al transferencia de ADN mediada por Agrobacteri um tumefacíens, preferiblemente con un vector ADN-T desarmado, electroporación, transferencia de ADN directo, y bombardeo de partículas [Véase Davey et al. (1989) Plant Mol . Biol . 13:275; Walden y Schell (1990) Eur. J. Bi ochem . 192:563; Joersbo y Burnstedt (1991) Physiol . Plant . 81:256; Potrykus (1991) Annu . Rev. Plant Physi ol . Plant Mol . Bi ol . 42:205; Gasser y Fraley (1989) Science 244:1293; Leemans (1993) Bio/Technol ogy 11:522; Beck et al. (1993) Bi o/Technology 11:1524; Koziel et al. (1993) Bio/Technology 11:194, Vasil et al. (1993) Bi o/Technol ogy 11:1553 y Gelvin, S.B. (1999) Curr. Opin . Bi otech . 9:227-232]. Las técnicas son bien conocidas or el arte para la introducción del ADN en monocotiledóneas así como también dicotiledóneas, como son las técnicas para la cultivación de tales tejidos de plantas y regeneración de aquellos tejidos. Muchos de los procedimientos empelados para la 5 práctica de la presente invención, si o no están descritos aquí en detalle, son bien conocidos por aquellos expertos en el arte de biología molecular de plantas. Las técnicas estándares para la clonación, aislamiento de ADN, amplificación y purificación, para reacciones enzimáticas que 10 involucran ligada de ADN, polimerasa de ADN, endonucleasas de restricción y similares, y varias técnicas de separación, son aquellas conocidas y comúnmente empleadas por aquellos expertos en la técnica. Un número de técnicas estándares son descritos en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, 15 Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Wu (ed. ) (1993) Meth. Enzymol. 218, Part I: Wu (ed.) (1979) Meth Enzymol. 68; Wu et al. (eds) (1983) Meth. Enzymol. 100 y 101; 20 Grossman y Moldave (eds.) Meth. Enzymol. 65; Miller (ed. ) (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Oíd y Primrose (1981) Principies of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif y Wensink (1982) Practical Methods in Molecular Biology; Glover (ed.) (1985) DNA Cloning Vol. I y II, IRL Press, Oxford, UK; Hames y Higgins (eds.) (1985) Nucelic Acid Hibridization, IRL Press, 5 Oxford, UK; y Setlow y Hollaender (1979) Genetic Engineering Principies and Methods Vols. 1-4, Plenum Press, New York, Kaufman (1987) en Genetic Engineering Principies and Methods, J.K. Setlow, ed., Plenum Press, NY, pp. 155-198; Fitchen et al. (1993) Annu. Rev. Microbiol. 47:739-764; Tolstoshev et 10 al. (1993) en Genomic Research in Molecular Medicine and Virology, Academic Press; Ausubel, F.M. et al. (1997) "Current Protocols in Molecular Biology" Wiley, New York. Las abreviaciones y nomenclatura cuando se emplean, son pensadas estándares en el campo y comúnmente usadas en revistas 15 profesionales tales como aquellas citados aquí. Todas las referencias citadas en la presente solicitud están incorporadas en su totalidad aquí por referencia a la extensión y no son inconsistentes con estas.

- -" -*•**»*"*—«-*- TABLA I Patógenos específicos para los cultivos principales: SoYa: : Phytophthora megasperma fsp. glycinia, Macrophomina pnaseo±ma. Rhizoczonia solani, ?cleroziziia scleroziorum, Fusa.ri.x3m oxyspcrum, ßiaporzhe phaeeolorum var. sojas (Phomopsis sojas), Diapsrzks phaeeoiorum var. caulivcra, Sclsrozium rolfsii, Cercospora kikuckii, Cercospcra sojina, Percnospcra maucishurica, Coliezozrichum ?emazium. (Coliszozickum zr ncazum) , -oryv.espcra cassiiccla, ?epzcria clvcines, hylloszicza soj iz la, Alzsmaria alzemaza, Pseudomonas syringae p.v. lycinea, Xanzhczncnas campeszris p.v. phaseoli , Micro sphaera dif rusa, Fusarium semi t ec cío?.. Phialophora gregaza, virus del mosaico de la soya, Glomerslla glycir.es , virus del moteado de anillo del Tabaco, virus del rayado del Tabaco, Phakopscra pachyrhi?í, Pyzhium aphanidsrzn zum, Pyzhiu ulzi um, Pyzhium ?ebaryanur., Virus del marchitamiento moteado del tomate, Kez rcdera glycir.es Fusarium eolani; Canela: Albugo candida, Ai cerparis brassicae, Lepzoephasria acuians, Rhizoczonia sclani, Sclerozinia ecierazicrum, Mycosphaerella brassiccola, Pyzhium ulzistm, Peronospcra parasizica, F earium rossum, Alzamaria alzernaza; AH=.lf a : Clavibazer michiganese subsp. insidiosum, Pyzhium ulzimua, Pyzhium irresuiare, Pyzhium¡ splendsns, Pyzhiusr: debaryanum, Pyzhium aphapidermazum; Phytophthcra- mesasperma, Peronospora zrifoliorum, Pho a rn.edicagz.xis var. me?icagir.is , Cercosoora nedicaginis , Pseudope?iza zr.edics.gin i s , Lepzozrcchila medica inis, Fue riu oxyepcrum, PTiizoczoriia sclani, üromycss szria ue , Collezozrichu zri olii Clase 1 y clase 2, Lspzosphaerulina briosiana, St mphylium betryosum, Stagcnospcra melilozi, Sclerozinia zrifoliorum. Vlrus del mosaico de la alfalfa Ver-icillium albo-zzr m, X?Lnzkomonas campeszris p.v. alfalfas, Aphanomyces - euzeiches, Sze phylium herbaru , Sce phylium alfalfae; hsaz : Pseudomonas syringae p.v. azrofaciens, Urocyszis acropyri, Xanzhoznonas campestris p.v. zranslucene, seuacmcnae eyringae p.v. syringae, Alzsmaria alzernaza, Cladcsporium hsrbarum, Fusarium gramine&rum, Fusariup avenaceum, Fusarium culr.orum, Usz iagc trizici, Ascochyza zrizici. Cephalosporium gramzneum, Ccllozezrichum graminiccia, Eryszphs graminie f.sp. zrizici, Puccinia graminie f.sp. zrizici, Puccinia recóndita f .spJ zrzzzcz, Puccinia szpiformis, Pyrsnophora zritici-repenzie. Sepzzria nodorum, Sepzoria znzicz, Se zcria avenae.. Peeu?ocercosporella herpc richcides, Fñizoczonia eclani, Rhizoczcnia cereaiis , Gaaupazmcmycss graminis var. zrizici, Pyzhium aphanider azum, Pyzhium arrhenomanes , Pychi m -.:! zi um, Bipolar zs sorokinzana. Virus de enanismo amarillento de cebada Virus del Mosaico del Bromo, Virus del Mosaico del Trigo que Nace del suelo, Virus del Mosaico del Rayado del Trigo, Virus del Rayado de la Espiga de Trigo, Virus del Estriado de Trigo Americano, Claviceps purpures. Tillezia zrizici, 10 Tilletia laevis, Usziiagc zrizici, Tilletia indica, Rhizoctonia solani, Pyzhium arrhenomannes , Pythium gra icola, Pyzhium aphani?er azu , Virus de llanos altos Virus del Estriado de Trigo Europeo; Girasol: Plasmophora r.alszedii, ?clerozinia sclerczzcrum, Áster amarillos, sepzcria helianzhi , Phomopsis hslzanzhi , A.lze naria helzanzhi , Alternaría zinniae, ?ozryzis cin rea, Pho a macdonaidiz, Macrophomina phaseoiina, ?rysiphe cichoracearum, Rhizopus oryzae, Rhizopus arrhizus, Rhizopus stoionifer, Puccinia 15 helianzhi, Verticillzum dahliae, ?rwinia carozovorum DV. carozovora, Cephalosporium acremonium, Phytophthora cryptogea, Albugo zragopcgonie ,- Maíz: Fusarium ponilifcrme var. subgluzinans, ?rvinza stewarzii , Fuearium monilif rme, Gibberella zeae (Fuearium graminearum) , Stenocarpslia avdi (Diplodia maydis) , Pyzhiux irreguiare, Pythium debaryanup, Pythium graminicoia, Pythium eplendens, Pythium ulzimum, Pyzhium anhani?ermazuirt, Aepergillus flavus. 3ipolaris mavdis 20 0, T (Cocbliobolus hezeros rophus ) , Helminzhospcrium carbonum I, II ? III (Cochliobolus carbonum , Exserohilu?r> zurcicum I, II ? III, Helminzhospcrium pediceilazum, Physoderma maydis, Phylloszicta maydis, Kabaziella zeae, Col zczrzchu graminzcola , Cercoepcrs. zeae-maydis, Cercospcra sorghz, Ustilago maydis, Puccznia scrgh . Puccznia polysora, Macrophomina phaseolma, Peniciilium oxalicum, Nigrospora oryzae, Cla?ospo u herbarum, Curvularia. lunaza, Cuz-'s iarza znaequalz . Curvularza pallescene, Clavzbacter zchiganense subsp. nebraskens , Trichoderma virz?e, Virus del Mosaico Enano de Maíz A & B, Virus del Mosaico del Rayado del Trigo, Virus Ensaño Clorótico del Maíz, Ciaviceps sorghi, Pseudonoma.5 avenas, ?rwz za chrysanzhe z pv. zea, ?zrwinia corczovora, Ccmstuzzz spzroplasma, Diplodza pacrospora , Sclerophthora macroepora, Peronosclerospora sorghi, Perones clerospora phzlippzr.ensis , Peronoscl rospcra maydis, Peronoeclerospora saccharz, Spacelotheca reiliana, Physopslla zeae, Cephaiosporzum mayáis, Caphaiospcrium acremonzum, Virus del Moteado Clorótico del Maíz, Virus de llanos Superiores, Virus del Mosaico del Maíz, Virus del Rayado Fino de Maíz, Virus del Rayado de Maíz, Virus del Descortezamiento de Maíz, Virus Enano Piloso del Maíz; Sorgo: ?xserohzlu zurcicum, Collezozrzchum gra znicola (Gio erella raminzcola) , Cercospora eorgh , Gloeocercoepora sorghi. Ase chy za s orgh ir.a, Pseudomcnas syrzn ae p.v. syringa e , Xanzhomonas campeszrzs p.v. hol z ela, Peeudcmonas andropogonze , Puccinza purpurea, Macropho zna phaseolina, Perconza czrcznaza, Fusarzum pior.ilifcrme, Aizernaria aJTtemate, ?ipclaris sorghicola, ?ielmznzhosporzum sorghicola, Curvularza lunaza, Pho a insidiosa, Peeud monas avenae (Pseudomonas alooprec pizans) , Ramuizspcra ecrghz, Ramulispora sorgh coia, Phyilachura saccharz, Sporisoriu reilianu (Sphacelozheca reilzana) , Sphacelozheca cruenza, Sporzsorzu sorshz. Sugarcans mcsaic H, Maize Dwarf Mosaic Virus A & 3, Claviceps sorghz , Rhizoczonza solanz, Acremonium szriczu , Sclerophzhona acrospora, Peronosclerospora sorghi, Peroncsclerospora pkilippzneneie, Sclersspora gra micola, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporu , Pythzum arrheno anee , Pyzhium gramznicola, etc. . lfeAtü.

ISTADO DE SECUENCIA <110> Benc F. , Andrew Yu, I-Ching Clougii J., Steven Fengler A. , Kevan Smath, Jr. K., Roger <120> GENES DND/CANA ES IÓNICOS DE COMPUERTA DE NUCLEOTIDOS CÍCLICOS DE ARABIDOPSIS THALIANA; REGULADORES DE LA RESISTENCIA A ENFERMEDADES EN LAS PLANTAS Y MUERTE CELULAR <130> 60-00WO <140> No asignado <141> 2000-07-24 <150> 60/145,310 c!51> 1999-07-23 <1S0> 8 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 5897 <212> ADN <213> Axaiidopsis ch líana <220> <22l> m?sc_feature <222> (1) .. (5897) <223 > Fragmento genómico de Arabidopsis thahana que contiene el gen DND1 <400> 1 gaattcgcct tgcgtaccct actggcggac gggtataaat aaggaacaga aagtctcggg 60 aaaaagggga cgttctccgg gacctggaga gaggacagca caagtcagct cgcccagatc 120 acccagttcg cccagaagag ccagctcacc gacagaagac agctcgtcga gagaagtcgc 180 ctcgtcaaga tcatccagct cgeccagaag agtcagctca tcgacacaag tcggctcgtc 240 gagagaagtc cgcccaccga agatcatcca gcpcgcccag aagagccagc tcaccagaac 300 caccagctcg aaacagcatc gcctcgtagc gccctcaact argcrcccag ttcgcaacaa 360 gcctttcagc ccgccgactg tccggcttca agttcagctc gtggattaga gactgactct 420 tcacctcccc cagagactca cccgtacttg tttaattcgc gcactaacag tcctctacta 480 cacgcaatat tagaatgagt ttgaacaaag ctactcacct accataccca tttattcatc 540 tgcactgtat ccttagttat ttactccaac aaacgetgaa ctctacccaa cccaaaaata 600 aacaaataga aatttgtgtt cgatgtgtgc ggtccgctga tatcggtcgt cactcgaatt 660 att aatgcat giatggat tgtatgactg acaaattttt ggaaacttca ctgccasgta 720 cgtgtgtact acatacgacc acaaaagtgc aeeetatcat atacatcagt aaactaactg 78C taggtaattt ctttatttta aaaagcgtaa gcaataatga aaattgaaaa aatgagagta 840 ttatgctgca aaaaaacatt atagtaaccg gagtatcccc gtatctgcaa ccaacaaagg 900 cttaattacg agatcaggct ggtcgtatgt ccccgttgtt atatcatagg gatatggcgt 960 acgtcaacat gcatteaatc cgtaataaaa acacatatac aacaagtacc aactgacggc 1020 aaacaaaaca cagtatataa caaacacata Caccaataac cgagtcaaac acacctatca 1080 gtaaatgtta atgacaacga caaaaatcac tatcatgaaa atctgttatt tgcacaaata 1140 atgaatgttt gacaaaaaaa agcacaatta acgaacaata tcaaacgaca acatgcctaa 1200 10 accgcacact cactaaaaca tcttctactg tacccataga gttagaatta tgacatcttc 1260 ctatataaag caagtaaatt tgcaaactta tctaaaagtt caatgatfcaa acgtaaagaa 1320 attacactta aaatgatggg tccattttaa cgtagcaatc ctcatgatct gtacggaacc 1380 caatttgttc aatgcctatt tgtgggccgt tttgccaagc aagccaccac atctctcaga 1440 cacttgacag etcatcatct cccccctgtc aatcccggtc cggtttctga tttagttcga 1500 tcttcgattt tagttattaa accggaatct cccctaacaa ataaaccgaa tcctactaag 1560 15 agacgtacgt atcacacaca aatcttgcgg ctttgcctct ctatacaaat cacccctctc 1620 tctcccaatc actccctgca aattttcttc tctccctctc ccatggtggt tcccctattt 1680 caatcatgcc ctctcacccc aacttcatcc tcaggttttt ataccacaca attcccattt 1740 tttttcacac ctacattcgt tcattaatgg tgccttcacg ctaaaacact cccgaattct 1800 gaatatgtat ttcgtgccct ctgccgctta cccagaggcc acaagcttta cccgagactg 1860 attatttetc cccgagaaac acttttcccg gaaaattcac tcgtctcctg aaecgctcta 1920 Cagctaacaa gtcaccatgc aattcctcat aatctcgctc gagtatgcga aatcgttcat 198C 20 ctagcaacga aatcgatttt cataattgtg Cactatataa cgaatgtgag atgattctga 2040 atgatttttg gcgatagact gctaattcct gattacaatt tgaatatccc aggcggattg 2100 gaccgttttc cgataagttc cgtcgacaaa cgactgggac cgatgaaaac agtaaccccc 2160 aaatcaacgg tggagatccg agcagcagcg gcagcgacga gacgccggtg ctaagctccg 2220 tcgagtgtta cgctcgcaca caagtaggcg tcccagctct ccactcaacc agctgcgatc 2280 aagctcacgc gccggagtgg cgtgcccccg ccggctcttc tctagttccg atccaggaag 2340 gatctgtccc caacccagcc cgaaccagat tccgacgtct caaaggtccg ttcggtgaag 2400 ttctcgatcc taggagcaag cgcgtgcaga gatggaaccg cgcgttgctt ctagctcgtg 2460 ggatggcttt agcggtggat ccgeccetct tctacgcgct ttccatcggc cgaactaccg 2520 gaccggcgtg tctttacatg gatggtgcgt tcgccgcggc ggtcacggtg ctccgcacgt 2580 gtctcgacgc tgttcatcct tggcacgtgt ggcttcaatt cagactggcc tacgtctcga 2640 gagagccget tgtcgctggt tgtgggaagc tcgtttggga cccacgcscc atcgcgtctc 2700 actacgcacg ctctcccacc ggctcccggt ttgatgttat cgtcatcctc cctgtccctc 2760 aggtgaattt tcagaacaac cttccaacta ttccaatatt atgaaattaa ccccaaacct 2820 tccactacta tcaacaaagc ccatatccac act gaaagt gtcaeccgct gacgaatcat 2880 1 0 gacttgagat gcagataaga tgtgaacttt gtgtttttgc ttgtttgcag gcagtgtttt 2940 ggttagttgt gccgaaactg ataagagaag agaaggttaa gctgataatg acgattccgc 3000 tgctaatatt cttgttccag ttcctcccca agatttatca ctgcatctgt ttgatgagaa 3060 ggatgcagaa ggtcactggt tacatctttg gaactatttg gtggggtttt gctcttaatc 3120 tcatcgcata tttcaccgct ectcatgraa gtcctctcaa gctagatatt gtatttctgc 31B0 ccgaatacaa tgtcctgcaa caataggtta tattcaggtc ctaaaacaaa tgcaatataa 3240 •i c caaatcccat gtgcacacat atagcactac taaggtctgc cc aagacat gaaaccaaag 3300 tctgttgttt atggaaactc tggcggtccc aggtcgccgg gggatgccgg tatgttctcg 3360 caacacagcg tgttgcttct tgcataagac aacaatgtat gagaaccggg aactgcaatc 3420 tgagtccggc ccgcaaasaa gaggtctgtt accaacctgt gtcaccgaca agcacagttg 3480 gatatccatg cttatccgga aaccccacca gtgcggtcaa taagcccatg cgcttagact 3540 ccaacggacc attccgatat ggcatccacc gctgggcacc tccagtcatc cccagcaact 3600 ctcccgcggc caagatcctc accccacct cccggggccc aatsactctc aggtaattgc 3660 20 tttgtt ctg agcccaaggt ttacatctcg gaCataaaaa aattccctga ttgacatact 3720 gaacctgttc cgggggtcgc gtctracagc acacttgcga atgatcctga gcccacaagc 3780 aactggcccg aggttatttt cagtatagtt atggttctaa gcggctcgtt acttttcacg 3840 ctgttgatag gaaacattca ggtaaactat gcaagaatac gtcttttc a tgatattgtg 3900 ttttcatgga acgtaagatt ttaaaaagct etccacttta caatattteg aaggtgtttt 3960 tgcacgcggt aatggcgaaa aaaaggaaaa cgcagatacg .gcgeagggat atggaatggc 4020 ggatgaaacg eaggcagtta ccttcccggt caagacagag sgttaggcga tttgagcggc 4080 agagatggaa tgccttgggt ggtgaagacg agccagaact CatacacgaC ttgcctccgg 4140 gccctcgaag agatatcaaa cgatatcttt gctccgatct cattaacaag gtactaggaa 4200 gcagacttta tacaatcttg ttaagacttg tgaaagcagt aagtgttaag tctccgacat 4260 gttcgatctt tctcaggcgc cattgttcag gggcatggac gacttgatcc tcgacaacat 4320 Ctgcgatcgg gccaagcctc gagtcttctc taaagacgaa aaggtactca tcccateatt 4380 tstaaaaatt tacatttcca atatttcgct tcggcttcgg tttaagagtt tacttgaaga 4440 gtaaaatctg aggttcttcg attccgttga ccgccacaga tcatccgtga aggagatcct 4500 gtacagagaa tgatattcat catgcgcgga cgagtcaaac gtacacagag cctaagcaaa 4560 ggcgtcctag ccactagtac actagaacca ggcggttact tgggcgacga gctactctca 4620 cggcgcctac gtcgcccgtt tctggaccgt ctccccccct cctcagcaac atttgtcCgc 46B0 ctagaaaaca tcgaggcatt ctccctcgga tccgaagatc ttaggtacat taccgaccac 4740 ttccgttata aattcgcgaa cgagcggccc aagcggaccg caagatacca Ctcctcaaac 4800 cggaggacgt sggcagcggt aaatattcag atggcgtggc gccggcgtag gaaaagaacc 4860 cgtggtgaaa acatcggcgg tccgatgagt cctgtgtcsg agaatagcat tgaaggcaac 4920 agtgaacgcc ggttacttca gtatgcagct atgtccatgt ccattcgacc gcatgatcac 4980 cccgaacaac aataaaaagt tccaatttta taccggtcca aataatcgtg tgtccaccgt 5040 tcctcctcaa ttgcccacct ttacttcttt aaaaaacctc tctttggaac gatacttcaa SlOO cctctcacgg Ctaagttcaa agtagacttt ttgagcaaca aaatcttgga ggagctcatc 5160 cttggcaact ccctattttt cattttctat tagcagcaaa agcaattgtc ttaacaagca 5220 taaacgacgt cgttagtaag tacgacgttc gcatatatcc tatatagact ttttgtccaa S280 gctcaggact tgccaaagct cgctcagaga ctccaaaaga gtccataaac aaaaacctac 5340 tcccagaaag ttcttccaaa cccctcgcca tggttcctct ctcctcccgc gaaceccagc 5400 ttttctaaat tcaactatac tttaaattgc caagtccaaa ctctttcgcc tccgattcat 5460 cggcaataca agtttaagaa aaaaaattct tatattcatc ccecaaaecg agteccgagt 5520 gtctgatttg attcgtaaaa tcaatggcga cgagcaaacc tcaaagatcg ccggcCgaaa 5580 ttgaggatat aatcctccgg aagatatttt atgeaaccct aacggaatca accgattccg 5640 atcctcgtat tgtttacttg gagatgacgg ccgctgagat tctcagcgaa ggtaaagagc 5700 ttttgcttcc tcgtgattcg acggagagag ttctcataga tcgtctctcc ggcgactttt 5760 ccgacgccga accgcctcec ccgtatttaa tcggttgcca ccgtcgcgct tacgacgaat 5820 cgaagaaaat ccagtcgatg aaggataaga atctgagatc ggagatggag atcgtcacta S880 aacaagcgaa gaagctt 5897 <210> 2 <211?. 2398 <212> ADN c213 Arabxdopsis tha.li.ana <220> <221> CDS <222 > (54) .. (2234) <400> 2 ctccctgcaa attcctcccc tccctctccc atggtggttc ctctatttca ate atg 56 Met i ccc tet cae ccc aac tte acc tte agg tgg att gga ctg ttt tec gat 104 Pro Ser His Pro Aßn Phe lie Phe Arg Trp lie Gly Leu Phe Ser Asp 5 10 15 aag tte cgt cga ca aeg act ggg ate gac gaa aac agt aac ctc caá 152 Lys Phe Arg Arg Gln Thr Thr Gly lie Asp Glu Asn Ser Asn Leu Gln 20 25 30 ate aac ggt g a gat teg age age age ggc age gat gag aeg ccg gtg 200 lie Asn Gly Gly Asp Ser Ser Ser Ser Gly Ser Asp Glu Thr Pro Val 35 40 45 cta age tec gtc gag tgt tac gct cgc acá caá gta ggc gcc cea gct 248 Leu Ser Ser Val Glu Cys Tyr Ala Cys Thr Gln Val Gly Val Pro Ala 50 55 60 65 tte cat tea act age tgc gat caá gct cae gcg ccg gag tgg cgt gcc 296 Phe His Ser Thr Ser Cys Asp Gln Ala His Ala Pro Glu Trp Arg Ala 70 75 80 tec gcc ggc tce ccc c a gtc ccg ate cag gaa gga tet gtc ect aac 344 Ser Ala Gly Ser Ser Leu Val Pro lie Gln Glu Gly Ser Val Pro Asn 85 90 9S cea gcc cga acc aga tte cga cgt ctc aaa ggt ccg tee ggt gaa gtt 392 Pro Ala Arg Thr Arg "Phe Arg -Arg Leu Lys Gly Pro Phe Gly Glu Val 100 105 no ctc gat ect agg age aag cgc gtg cag aga tgg aac ege geg ttg ctt 440 Leu Asp Pro Arg Ser Lys Arg Val Gln Arg Trp Asn Arg Ala Leu Leu 115 120 125 tta gct cgt ggg aeg gct tta gcg gtg gat ccg ctc tte tte tac gcg 488 Leu Ala Arg Gly Met Ala Leu Ala Val Asp Pro Leu Phe Phe Tyr Ala 130 135 140 145 ctc Ccc a c ggc cga act acc gga ccg gcg tgc ctt tac atg gat ggt 536 Leu Ser lie Gly Arg Thr Thr Gly Pro Ala Cys Leu Tyr Met Asp Gly 150 155 160 gcg tte gcc gcg gtg gtc aeg gtg ctc cgc aeg tgt ctc gat gct gtt 584 Ala Phe Ala Ala Val Val Thr Val Leu Arg Thr Cys Leu Asp Ala Val 165 170 175 cat ctt tgg cae gtg tgg ctc caá tte aga ctg gcc tac gcc teg aga 632 HÍS Leu Trp His Val Trp Leu Gln Phe Arg Leu Ala Tyr Val Ser Arg 180 185 190 gag teg ect gcc gtc ggt tgt ggg aag ccc gtt tgg gat cea cgc gec 680 10 Glu Ser Leu Val Val Gly Cys Gly Lys Leu Val Trp Asp Pro Arg Ala 195 200 205 ate gcg tet cae tac gea cgc tet ctc act ggc tte tgg ttt gat gtt 728 He Ala Ser His Tyr Ala Arg Ser Leu Thr Gly Phe Trp Phe Asp Val 210 215 220 225 ate gcc ate ctc ect gtc ect cag gea gtg ttt tgg tea gtc gcg ccg 776 lie Val lie Leu Pro Val Pro Gln Ala Val Phe Trp Leu Val Val Pro 230 235 240 aaa ccg ata aga gaa gag aag gct aag ccg ata atg aeg att ctg ctg 824 Lys Leu lie Arg Glu Glu Lys Val Lys Leu lie Mee Thr He Leu Leu 15 245 250 255 cta ata ctc ttg tec eag tte ctc ccc aag att tat cae tgc ate tgt 872 Leu He Phe Leu Phe Gln Phe Leu Pro Lys lie Tyr His Cys He Cys 260 265 270 ctg atg aga agg atg cag aag gtc act ggt cae att ctt gga act att 920 Leu Met Axg Arg Mee Gln Lys Val Thr Gly Tyr He Phe Gly Thr He 275 280 285 cgg tgg ggt ttt gct ctt aat ctc acc gea tat tec ate gct tet cat 968 Trp Trp Gly Phe Ala Leu Asn Leu He Ala Tyr Phe He Ala Ser His 290 295 300 305 20 gtt gct ggg ga tgt egg tac gct etc gea ata cag cgc gtt gct tet 1016 Val Ala Gly Gly Cys Trp Tyr Val Leu Ala He Gln Arg Val Ala Ser 310 315 320 tgc acá aga ca caá cgt atg aga acc ggg aac cgc aat ccg agt ctg 1064 Cys He Arg Gln Gln Cys Mßt Arg Thr Gly Asn Cys Asn Leu Ser Leu 325 330 335 ¡^^^ ll^j gce tgc aaa gaa gag gtc cgt tac caá ttt gtg tea ccg ac age acá 1112 Ala Cys Lys Glu Glu Val Cys Tyr Gln Phe Val Ser Pro Thr Ser Thr 340 345 350 gtt gga tat cea tgc tta tet gga aac ctc acc agt gtg gtc aac aag 1160 Val Gly Tyr Pro Cys Leu Ser Gly Asn Leu Thr Ser Val Val Asn Lys 355 360 365 ccc atg tgc tta gac tet aac gga cea tte cga tat ggt ate tac cgt 1208 Pro Met Cys Leu Asp Ser Asn Gly Pro Phe Arg Tyr Gly He Tyr Arg 370 375 380 385 tgg gea ctt cea gtc ate tec age aac ccc ctt gcg gct aag acc ctt 1256 Trp Ala Leu Pro Val He Ser Ser Asn Ser Leu Ala Val Lys He Leu 390 395 400 tac ccc ate tte tgg ggc cta atg act cec age acá ece gcg aat gae 1304 Tyr Pro He Phe Trp Gly Leu Met Thr Leu Ser Thr Phe Ala Asn Asp 405 410 415 ctt gag ccc ac age aac tgg ctc gag gtt att tte agt ata gtc atg 1352 Leu Glu Pro Thr Ser Asn Trp Leu Glu Val He Phe Ser He Val Mee 420 425 430 gtt cta agt gge ttg tta ctt tte aeg ctg ttg ata gga aac att cag 1400 Val Leu Ser Gly Leu Leu Leu Phe Thr Leu Leu He Gly Asn He Gln 435 440 445 gcg tet ttg cat gcg gea atg gcg aaa aaa agg aaa atg cag ata cgg 1448 Val Phe Leu His Ala Val Met Ala Lys Lys Arg Lys Met Gln He Arg 450 455 460 465 tgt agg gat atg gaa tgg tgg atg aaa cgt agg cag tta ect tec cgg 1496 Cys Arg Asp Met Glu Trp Trp Met Lys Arg Arg Gln Leu Pro Ser Arg 470 475 480 tta aga cag agg gtc agg cga ttt gag cgg cag aga tgg aat gcc ttg 1544 Leu Arg Gln Arg Val Arg Arg Phe Glu Arg Gln Arg Trp Asn Ala Leu 485 490 495 ggt gge. gaa gac gag cta gaa ctt ata cat gat ttg ect ccg ggt ctt 1592 Gly Gly Glu Asp Glu Leu Glu Leu He His Asp Leu Pro Pro Gly Leu 500 505 510 cga aga gat ate aaa cga tat ctt tgc tte gat ctc att aac aag gtg 1640 Arg Arg Asp He Lys Arg Tyr Leu Cys Phe Asp Leu He Asn Lys Val 515 520 525 cea ttg tte agg ggc atg gac gac ttg ate ctc gac aac aet tgc gac 16B8 Pro Leu Phe Arg Gly Mee Asp Asp Leu He Leu Asp Asn He Cys Asp 530 535 540 545 cgg gee aag ect cga gtc tte tet aaa gae gaa aag ate ate ege gaa 1736 Arg Ala Lys Pro Arg al Phe Ser Lys Asp Glu Lys He He Arg Glu 550 555 560 gga gat ect gta cag aga atg ata tte ate atg cgt gga cga gtc aaa 1784 Gly A=p Pro Val Gln Arg Met He Phe He Met Arg Gly Arg Val Lys 565 570 575 cgt ata cag age cta age aaa gge gcc cta gcc act agt acá cta gaa 1832 Arg He Gln Ser Leu Ser Lys Gly Val Leu Ala Thr Ser Thr Leu Glu 580 58S 590 cea ggc ggt tac ttg ggc gac gag cta ctc tea tgg tgc cta cgt cgc 1880 Pro Gly Gly Tyr Leu Gly Asp Glu Leu Leu Ser Trp Cys Leu Arg Arg 595 600 605 ccg ctc ctg gac cgt ctt ccc ect tec tea gea ac ttt gtc tgc cta 1928 Pro Phe Leu Asp Arg Leu Pro Pro Ser Ser Ala Thr Phe Val Cys Leu 610 €15 620 625 gaa aac ate gag gea tte tec ctc gga tec gaa gat ctt agg tac att 1976 Glu Asn He Glu Ala Phe Ser Leu Gly Ser Glu Asp Leu Arg Tyr He 630 635 640 acc gat cat tte cgt tat aaa tte gcg aac gag cgg ctc aag cgg acc 2024 Thr Asp His Phe Arg Tyr Lys Phe Ala Asn Glu Arg Leu Lys Arg Thr 64S 650 655 gea aga tac tac tec tea aae tgg agg aeg egg gea gcg gta aat att 2072 Ala Arg Tyr Tyr Ser Ser Asn Trp Arg Thr Trp Ala Ala Val Asn He 660 665 S70 cag atg gcg tgg cgc cgg cgt agg aaa aga acc cgt ggt gaa aac ate 2120 Glp Met Ala Trp Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr Arg Gly Glu Asn He 675 6B0 685 ggc ggt ccg atg agt ect gtg teg gag aat age att gaa ggt aac agt 2168 Gly Gly Ser Met Ser Pro Val Ser Glu Asn Ser He Glu Gly Asn Ser 690 695 700 705 gaa cgc cgg tta ctt cag tat gea gct atg tte aeg tec ate cga ccg 2216 Glu Arg Arg Leu Leu Gln Tyr Ala ?la Met Phe Met Ser He Arg Pro 710 715 720 cae gat cat ccc gaa taa taataaaaag teccaaeete atatcggtcc 2264 725 aaataactgc gtgttcattg ttccccceca aecgcceacc Cttacttctc taaaaaatct 2324 ttctcggaat gatacttcaa cctcttacgg ttaagttcaa agtagatttt tegageaaca 2384 aaatcetgga ggag 2398 <210> 3 <211> 726 <212> PRT <2l3> Arabr opsis thaiiana <400> 3 ^g^^i^^i^fc**^^^^^^^^^ Met Pro Ser His Pro Asn Phe He Phe Arg Trp He Gly Leu Phe Ser 1 5 10 15 Asp Lys Phe Arg Arg Gln Thr Thr Gly He A=p Glu A=n Ser A=n Leu 20 25 30 Gln He Asn Gly Gly Asp Ser Ser Ser Ser Gly Ser Asp Glu Thr Pro 35 40 45 Val Leu Ser Ser Val Glu Cys Tyr Ala Cys Thr Gln Val Gly Val Pro 50 55 60 Ala Phe His Ser Thr Ser Cys A=p Gln Ala His Ala Pro Glu Trp Arg 65 70 7S 80 Ala Ser Ala Gly Ser Ser Leu Val Pro He Gln Glu Gly Ser Val Pro 85 90 95 Asn Pro Ala Arg Thr Arg Phe Arg Arg Leu Lys Gly Pro Phe Gly slu 100 105 110 Val Leu Asp Pro Arg Ser Lys Arg Val Gln Arg Trp Asn Arg Ala Leu 115 120 125 Leu Leu Ala Arg Gly Met Ala Leu Ala Val Asp Pro Leu Phe Phe Tyr 130 135 140 Ala Leu Ser He Gly Arg Thr Thr Gly Pro Ala Cys Leu Tyr Met Asp 145 150 155 160 Gly Ala -Phe Ala Ala Val Val Thr Val Leu Arg Thr Cys Leu Asp Ala 165 170 175 Val His Leu Trp His Val Trp Leu Gln Phe Arg Leu Ala Tyr Val Ser 180 185 190 Arg Glu Ser Leu Val Val Gly Cys Gly Lys Leu Val Trp A=p Pro Arg 195 200 205 Ala He Ala Ser His Tyr Ala Arg Ser Leu Thr Gly Phe Trp Phe Asp 210 215 220 Val xle Val He Leu Pro Val Pro Gln Ala Val Phe Trp Leu Val Val 225 230 235 240 Prc Lys Leu He Arg Glu Glu Lys Val Lys Leu He Met Thr He Leu 245 250 255 Leu Leu He Phe Leu Phe Gln Phe Leu Pro Lys He Tyr His Cys He 260 265 270 Cys Leu Met Arg Arg Met Gln Lya Val Thr Gly Tyr He -Phe Gly Thr 275 280 285 He Trp Trp Gly Phe Ala Leu Asn Leu He Ala Tyr Phe He Ala Ser 290 295 300 HÍS Val Ala Gly Gly Cys Trp Tyr Val Leu Ala He Gln Arg Val Ala 305 310 315 320 Ser Cys He Arg Gln Gln Cys Met Arg Thr Gly Asn Cys Asn Leu Ser 325 330 335 Leu Ala Cys Lys Glu Glu Val Cys Tyr Gln Phe Val Ser Pro Thr Ser 340 345 350 Thr Val Gly Tyr Pro Cys Leu Ser Gly Asn Leu Thr Ser Val Val Asn 355 360 365 Lys Pro Mee Cys Leu Asp Ser Asn Gly Pro Phe Arg Tyr Gly He Tyr 370 375 380 Arg Trp Ala Leu Pro Val He Ser Ser Asn Ser Leu Ala Val Lys He 385 390 39S 400 10 Leu Tyr Pro He Phe Trp Gly Leu Mee Thr Leu Ser Thr Phe Ala Asn 405 410 415 Asp Leu Glu Pro Thr Ser Asn Trp Leu Glu Val He Phe Ser He Val 420 425 430 Met Val Leu Ser Gly Leu Leu Leu Phe Thr Leu Leu He Gly Asn He 435 440 445 Gln Val Phe Leu HAS Ala Val Met Ala Lys Lys Arg Lys Met Gln He 450 455 460 Arg Cys Arg Asp Met Glu Trp Trp Met Lys Arg Arg Gln Leu Pro Ser 15 465 470 475 480 Arg Leu Arg Gln Arg Val Arg Arg Phe Glu Arg Gln Arg Trp Asn Ala 485 490 495 Leu Gly Gly Glu Asp Glu Leu Glu Leu He His A=p Leu Pro Pro Gly 500 505 510 Leu Arg Arg Asp He Lys Arg Tyr Leu Cys Phe Asp Leu He Asn Lys 515 520 525 Val Pro Leu Phe Arg Gly Met Asp Asp Leu He Leu Asp Asn He Cys 20 530 535 540 Asp Arg Ala Lys Pro Arg Val Phe Ser Lys Asp Glu Lys He He Arg 545 550 S55 560 Glu Gly Asp Pro Val Gln Arg Met He Phe He Met Arg Gly Arg Val 565 570 575 tiS üfrl- í-M-M-Mi Lys Arg He Gln Ser Leu Ser Lys Gly Val Leu Ala Thr Ser Thr Leu 580 585 590 Glu Pro Gly Gly Tyr Leu Gly Asp Glu Leu Leu Ser Trp Cys Leu Arg 595 600 605 Arg Pro Phe Leu Asp Arg Leu Pro Pro Ser Ser Ala Thr Phe Val Cys 610 615 620 Leu Glu Asn He Glu Ala Phe Ser Leu Gly Ser Glu Asp Leu Arg Tyr 625 630 635 640 He Thr A=p His Phe Arg Tyr Lys Phe Ala Asn Glu Arg Leu Lys Arg 645 650 655 Thr Ala Arg Tyr Tyr Ser Ser Asp Trp Arg Thr Trp Ala Ala Val Asn 660 665 670 He Gln Met Ala Trp Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr Arg Gly Glu Asn 675 630 685 He Gly Gly Ser Met Ser Pro Val Ser Glu Asn Ser He Glu Gly Asn 690 695 700 Ser Glu Arg Arg Leu Leu Gln Tyr Ala Jila Met Phe Met Ser He Arg 705 710 715 720 Pro His Asp His Leu Glu 725 <210> 4 <211> 5996 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <22C> <22l> ?ru.sc_feacure <222 > ( 1 ) . . ( 5996 ) <223 > Fragmento genómico de Arabidopsis que contiene el gen DND2 <400> 4 acgcactgtg cccgcgtgac taatgggtac cccagcgcca teeggaageg agaccgtaat 60 accagtaaca ggaaaagtct caccaaacae tgccaaatca gaacaaacat gactactagc 120 cccactgtca actatecaag catcatgagg caaaatggaa tataatgacg aaagacaatg 180 atgttgaaat gtgaaagaat gattttcata tcgtaaacct gctgagggaa attcaataga 240 aacattacca gctgtagaag tagttgccae agctccaega tcagcgacgg cagctgatgg 300 aaagggagct gactgccccg gaacatgaag atgagtactg agttgttgta ttaaagaatg 360 ¿ * . ?..&.?¿mJt .^ * ?. -.&. í.t.. gacttgatcc gtcgtaaaaa gactgagatc aagacttgat gcagtcattg caggaggcgg 420 aatataagga gtagaeccea tgactgcatt agcaacagca ttatgtcatt teecaetcaa 480 atcegaagaa gagaaagata ctcttaeaaa tgtctttctc cCgtgataat tttacgggtg 540 ggaagatggt tgactttgac tcataecgtc catattcaaa ggtcttgata geeegaaccc 600 gatgttaaea gtaccetacc cgtataaaca attaaataag agttgacaat gtttagacaa 660 atttggatta tgaagtagta acaatgacaa aatcttgaga ctggtctcca aacccgacag 720 ctaggaacct cccteggcat tcataagaca acgtacaatc agggacacga tacggtcaac 780 ggcctceate agcacccaat eatcageacc aaccaaacca tcaattgagt aatataatag 840 aegttcaaac ttaactttaa acttaacggt ctaaatttgt ggagaacaaa atttggtaaa 900 aatgagaaga taaagaggaa gaggacacgt gggctggttc gtggttgatc gacaagtact 960 cacgggctat atctttaact tatcatcctt ttattcctaa caaaagaaat ttggtggaga 1020 taaatttaac catggtcatg gttttagtag ctacaaatgc aaatgtgacc ttcttttetc 1080 gxctgcgttt gcaagtttga aatttttggt gctgaegaaa aaaagaagag aegatgtttc 1140 accattttct tctttgttct ttgatcaaag gatgtttcac caacataaga aaagaaaaca 1200 tgtcatgaag gagetaggac taacagtttg aaaatactta agaactcaaa tgttaaaaag 1260 gctcatacce eeeccccaaa ttatgtcatc tccttctata atctaaatca ttcgtgatte 1320 aacataaaac taaatattaa gtaaccttac ccaaatctat gaaatcgatt taccatatac 1380 acgattttaa aaaggataca agcggaaatg aaaccgtgca ttgaaaeaCa cgaacaaaaa 1440 gccegagete aegaaaeeeg acaecatctc atcaacaega aacttcgacg tattacaaag 1500 acaaaaatca aacctacaaa aatagagaac aatagtcagc tacagaattt aagtttgcca 1560 cgaaaacgat acatcattat gaagttcttg taegcccaaa cattgacatc agttaatgtc 1620 ttcgactgta ataaagaaat gcctcgatta aceccgcaac cacgecccct tttgtcagca 1680 aattctaatc caceacatgc ecaagtegat ttgatcccat aaccaaacaa catatatatg 1740 gaacgtatat aaaaaaaatc taagcaatct aaaaaaatta actataatat atgctataaa 1800 aaaaattata ggaaactttg ctaaatggca taaacagtta tttcaattaa gcacatggaa 1860 ttgtcaaaaa ateatcatta tttttttaaa aatacatgat cgactcttet ttctegcgcg 1920 eaaacaaaca cacgattgac aaaaaaaaaa cacacgattg ataaagatat ttctttcaac 1980 atctatggat gagaggatca ggaaatgtag cattatttta ctcttgaaaa ctacatatat 2040 tattgttgtg agccegcgaa -ttctgtaatc ttecaacata ttcgcccact aaaaaactga 2100 caactcaatt cagaacatat ttttctacta aaaggtgaag ccaaaaactc aatttaaaaa 2160 agatttcgta cttaatagtc aaagttaaat ttggtccgaa atctttttga agtatcaaag 222C actgcaaagg tataactgtc tttttggaat aaetttaaaa aaattaacaa aaaeagtgaa 2280 acaaaattta agaaaatcga agaaaaaaat gataaaatag caaaagtttg tgactctcgt 2340 ggaaacccct tccccgtcct ccctgtcctc tgataaaggc ttcactttca tcattcaatc 2400 tcttcetcet ccttccccet caccactccc tctcectctc caatttette attttatcag 2460 cttcccctct tctttagttt ccgggtcact tcagtttcgc tctttccgag gaaaaacaaa 2520 acaaagattt gatttttctt tttggtgggt ttaaacageg aeeccttctt ttgccctttt 2580 attggttctt attgttcccc tcaaaagtct acaggacege cggaagcaaa cacacttgtc 2640 catgttcggt ctgattttrt acctcaaaca agtttcttcc cttttttttg ctgtctagtc 2700 gaattgcgtt tttgacaceg gaaagttttg aaatttgagt tegatcetta ctgaaatcga 2760 aattgttgaa ttgaattgaa gtttgctgaa tcagggteat gaaettccct ctaattggtg 2820 aagaagacac atgaagcagt gaaatctctg tttgtatcga atettatcag tcccaaacta 2880 tgaattcccg acaagagaag ttcgtaaggt cagtgttcca gatttgtctc aetgaattct 2940 aagecgcgaa gcttaattcg attettette actttctcgg atcaggtttc aagattggaa 3000 gtcggataag actcccCccg acgtggaata tcccggtaaa aaegagatte aaactggaat 3060 attecagaga acaataagee caatctccga caagttetac agaagctttg aatcaagetc 3120 tgcaaggatc aaactactca aaagatetta caagtcctac tctttcaaag aagctgtttc 3180 aaaagggaet ggctctactc acaaaactct tgacccacaa ggaccttttc etcagagatg 3240 gaacaagatc ttcgtcttag cttgtatcat cgctgtcccg cctgaccctt tgttcttcta 3300 egtgcctatc atcgatgatg ctaagaaatg tcttggtatt gacaagaaaa tggaaacaac 3360 agcaagcgtt tcgcgctctc tcactgatgr tttttatgee cttcaeatca ttttccagtc 3420 ccgcactggc tttategetc cttcgtctcg tgteteeggg agaggtgctc ttgetgagga 3480 caagcgagag ategetaaac gctactcgcc cecacacccc ataattgaca ttcttgctgt 3540 tcttccgctt ccgcaggtga ttcaetgatt ggtttegtee gcacetccaa ateattaget 3600 tgattctecg agtaatgtga gcaaccgtge cttccctcag atggtgattt cgataaecae 3660 cccacatatg agaggttcac cgtctttgaa caegaagaat atgttgaagt ttattgtttt 3720 í&rí? .i J.i-tlJM. ... tL?. ctcccaaeat ataccgaggt etataagaat atacccgctc tacaaggaag teacaagaac 3780 etcaggcata ctcactgaga eagcttggge tggagctgct ttcaatetct tcctctacat 3840 gcttgctagt catgtgagtg ccaaactggt cctaactgtc ccaaccette tagteccaga 3900 gtttagatat ataatacttt tggtcaatac ctgcaaatgt gtaggtgttc ggtgctttct 3960 ggtatteget ctcaatcgaa cgcgaaacgg cgtgctggaa acaagcttgt gagaggaata 4020 accctccgtg cacetcgaag ttgttgtact gtgacectga aactgcagga ggcaaegett 4080 tcctcaatga gtcttgtccg attcagacac caaacacaac actcttcgac ttegggatat 4140 tccttgacgc acttcaatcc ggtgtagtgg aatctcaaga tttccctcaa aagtttttet 4200 actgtttctg gtggggtctg cagaacctca ggtattgaga atttatcagc aaaatttcct 4260 ccgcetccta tgaagaaaag CCtcaacacc aageectegc atcttcgctc tgtttecgtg 4320 atccagetcg ctcggtcaga aecttaaaac aagtacatat atttgggaaa tctgtttcgc 4380 ggtgttcatt tetactgcgg ggctggtttt gctctccttc tCgattggaa atatgcaggt 4440 tagtctcatc tcatctaata tgecatagtg tttgcgaaac cgatcactta ctgcttttct 4500 tttaaatggc agacgtacct gcaacccact accacgagat tggaggagat gagggtaaag 4560 agaagagacg cagaacaatg gacgtcacac egtttgctac ctgagaactt gagaaaaaga 4620 atccggcgat acgagcagta caaatggcaa gagacaagag gegctgacga agagaatctt 4680 cccagcaatc etcccaaaga tcttagacgc gacateaaac gtcatctctg tctcgccctt 4740 ctcatgcggg taaagaagaa atcatctccc ceceeeaccc gaettctcat ttactgtcaa 4800 catcactcgt aaccgcatct tgtttttgtc ggctccaggc ccccacgttt gagaaaatgg 4860 acgaacagct tcttgatgcg ctccgegacc gcetgcaace tgegeeaeac acagaggaaa 4920 gctacatagt aagagaagga gatecggtag acgaaaegct cttcataatg cgcgggaagc 4980 ttctaacaac cacaacaaac ggcggaagaa ccggtttttt aaatcccgag tatcttggag 5040 ccggtgattt ctgtggtgag gagcttttaa cccgggctet agacccacac tcatcctcaa 5100 accecccaac cCcaacaaga accgctcgag ctctcacgga agtegaagce cecgcactta 5160 aagccgatga cctcaaattc gtggctecee agtecagacg cctccacagc aaacagccaa 5220 gacatacttt caggtactac tcacaacaac ggaagactcg ggccgcttgc ctcatacaag 52ß0 cegcttggag aagatacatt aagaagaaac tcgaagagtc tcttaaagaa gaagagaatc 5340 ggecgcagga tgctttggct aaagaagctt gtggaagttc cccaagcctc ggtgctacaa 5400 L.± j a i * tatacgcatc acggtttgct gcaaatatct tgcgcacaat acgtaggagc ggatcagtaa 5460 ggaaaccaag gatgccggaa cgaatgccac ctatgctacc tcagaaacca gcagagccag 55 O attteaacag tgacgattaa ttaactagca tatatgtata tgaaagattt tattgcgaac 5580 catagagcca atatataaat ataagtcttt ctataaagga gcaaacccag agacacaaag 5640 cctecaatga tttattaccc ctctccaaga gccctacaaa gtttgatatg agggacacgg 5700 tagagccaaa cagaagtcaa gaagccagaa gcgaagctac ctctctccgc aggaatgtgg 5760 gcaaagcaaa tgcggcectg egcacccgtt ttagtaaaaa gatagatcag gattttgctt 5820 taagttaatc taaaacagta aatgaggaag tcatagttgt gttaaactta catcagaget 58B0 atagaacttc aattctctcc tatgggtcat cgcaccgtct agtetctcaa Cagggetgat 5940 CgggCCCCcg aagccaacag ecggtccCCc agtagagcac aagacgaaac caatca 5996 <210> 5 <211> 2547 <212> DNA <213> AraJsidopsis thaiiana <220> <221> CDS <2 2s (305) .. (2455) <400> 5 ctctctctct ccaatccctt cattttatca gcttccectc ttccttagtt tctgggtcac 60 ttcagtttcg ctctttccga ggaaaaacaa aacaaagatt tgatttcccc cectggtggg 120 ttcaaacage gaettcttct tttgcccttt taccggttct tattgttctc ctcaaaagtc 180 tacaggatcg tcggaagcaa acacacctgc ceatgttcgg gctatgaatt tccctctaat 240 tggtgaagaa gacacatgaa gcagtgaaac ctctgtctgt aeegaaecte attagtctca 300 aact atg aat tte cga caá gag aag ccc gta agg ett caá gac egg aag 349 Met Asn Phe Arg G n Glu Lys Phe Val Arg Phe Gln Asp Trp Lys 1 5 10 ÍS teg gac aag aec tec tec gac gtg gaa tat tec ggc aaa aac gag att 397 Ser Asp Lys Thr Ser Ser A=p Val Glu Tyr Ser Gly Lys Asn Glu He 20 25 30 caá act gga ata tte cag aga ac ata age tea ate ecc gac aag ttt 445 Gln Thr Gly He Phe Gln Arg Thr He Ser Ser He Ser Asp Lys Phe 35 40 45 tac aga age ttt gaa tea age tee gea agg ate aaa cta tte aaa aga 493 Tyr Arg Ser Phe Glu Ser Ser Ser Ala Arg He Lys Leu Phe Lys Arg 50 55 60 tet tac aag tet tac tce ttt aaa gaa gct gtt tea aaa ggg att ggt 541 Ser Tyr Lys Ser Tyr Ser Phe Lys Glu Ala Val Ser Lys Gly He Gly 65 70 75 tet act cae aaa aee cee gac cea caá gga ect ttt ect cag aga tgg 589 Ser Thr His Lys He Leu Asp Pro Gln Gly Pro Phe Leu Gln Arg Trp 80 85 90 95 aac aag ate eee gtt tta gct tgt -ate acc gct gtc teg ctt gac ect 637 Asn Lys He Phe Val Leu Ala Cys He He Ala Val Ser Leu Asp Pro 100 105 110 ttg tte tec tac gtg ect ate ate gat gat gct aag aaa tgt ctt ggt 685 Leu Phe Phe Tyr Val Pro He He Asp Asp Ala Lys Lys Cys Leu Gly 115 120 125 att gac aag aaa atg gaa acá acá gea age gtt ttg cgc tet tte act 733 He A=p Lys Lys Met Glu He Thr Ala Ser Val Leu Arg Ser Phe Thr 130 135 140 gat gtt ttt tat gcc ctt cae ate act ctc cag tte cgc acc ggc ttt 781 Asp Val Phe Tyr Val Leu His He He Phe Gln Phe Arg Thr Gly Phe 145 150 155 ate gct ect teg tet cgt gtt ttt ggg aga ggt gtt ctt gtt gag gac 829 He Ala Pro Ser Ser Arg Val Phe Gly Arg Gly Val Leu Val Glu Asp 160 165 170 17S aag cga gag ate gct aaa cgt cae eeg rec cea cae tec ata att gac 877 Lys Arg Glu He Ala Lys Arg Tyr Leu Ser Ser His Pha He He Asp 180 185 190 att cet gcc gtt cet ccg ctt ccg cag atg geg ate ctg aea aec att 925 He Leu Ala Val Leu Pro Leu Pro Gln Met Val He Leu He He He 195 200 205 cea cae aeg aga ggt tea teg tet ttg aac aeg aag aat atg ttg aag 973 Pro His Met Arg Gly Ser Ser Ser Leu Asn Thr Lys Asn Met Leu Lys 210 215 220 ttt ate gct ccc Ctc ca tat ata ccg agg tte ata aga ata tac ceg 1021 Phe He Val Phe Phe Gin Tyr He Pro Arg Phe He Arg He Tyr Pro 225 230 235 ctc tac aag gaa gtc ac aga acc cea ggc aea ccc acc gag acá gee 1069 Leu Tyr Lys Glu Val Thr Arg Thr Ser Gly He Leu Thr Glu Thr Ala 240 245 250 255 tgg gct gga gct gcc tte aat ctc tte ctc tac atg ctt gct agt cat 1117 Trp Ala Gly Ala Ala Phe Asn Leu Phe Leu Tyr Met Leu Ala Ser His 260 265 270 gtg ttt ggt gct tte tgg tat ttg tte tea ate gaa cgc gaa aeg gtg 1165 Val Phe Gly Ala Phe Trp Tyr Leu Phe Ser He Glu Arg Glu Thr Val 275 280 285 . ¡ t cgc tgg aaa caá gct tgt gag agg aac aac cce ccg egc aee teg aag 1213 Cys Trp Lys Glp Ala Cys Glu Arg Asn Asn Pro Pro Cys He Ser Lys 290 295 300 eeg ttg tac ege gac cce gaa act gea gga ggc aae gct eec ctc aae 1261 Leu Leu Tyr Cys Asp Pro Glu Thr Ala Gly Gly Asn Ala Phe Leu Asn 305 310 315 gag tet tgt ccg att cag acá cea aac acá acá ctc tte gac cte ggg 1309 Glu Ser Cys Pro He Gln Thr Pro Asn Thr Thr Leu Phe Asp Phe Gly 320 325 330 335 ata tte cte gac gea cet caá tec gge gta gtg gaa tec ca gat tte 1357 He Phe Leu Asp Ala Leu Gln Ser Gly Val Val Glu Ser Gln Asp Phe 340 345 350 cce caá aag ecc ttt tac tgt tte tgg tgg ggt ctg cag aac ctc agt 1405 Pro Gin Lys Phe Phe Tyr Cys Phe Trp Trp Gly Leu Gln Asn Leu Ser 355 360 365 teg ctc sgt cag aac ctt aaa ac agt acá tat ace tgg gaa ate tgt 1453 Ser Leu Gly Gln Asn Leu Lys Thr Ser Thr Tyr He Trp Glu He Cys 370 375 380 tte gcg gtg tte att tet att gcg ggg ctg gtt ttg tte tec tte ttg 1501 Phe Ala Val Phe He Ser He Ala Gly Leu Val Leu Phe Ser Phe Leu 385 390 395 att gga aat atg cag aeg tat ctg ca tec act acc aeg aga ttg gag 1549 He Gly Asn Met Gln Thr Tyr Leu Gln Ser Thr Thr Thr Arg Leu Glu 400 405 410 415 gag aeg agg gta aag aga aga gac gea gaa ca tgg atg tea cae cgt 1597 Glu Met Arg Val Lys Arg Arg Asp Ala Glu Gln Trp Met Ser His Arg 420 425 430 Ctg cta cce gag aac ttg aga aaa aga ate cgg cga tac gag cag tac 1645 Leu Leu Pro Glu Asr. Leu Arg Lys Arg He Arg Arg Tyr Glu Gln Tyr 435 440 445 aaa tgg caá gag acá aga ggt gtt gac gaa gag aat ctt ctt agt aat 1693 Lys Trp Gln Glu Thr Arg Gly Val Asp Glu Glu Asn Leu Leu Ser Asn 450 455 460 ctt ccc aaa gat ctc aga cgc gac ate aaa cgc cae ctc Cgt ctc gcc 1741 Leu Pro Lys Asp Leu Arg Arg Asp He Lys Arg His Leu Cys Leu Ala 465 470 475 ctt ctc atg cgg gtc ccc atg ttt gag aaa atg gac gaa cag ctt ect 1789 Leu Leu Met Arg Val Pro Met Phe Glu Lys Met Asp sla Gln Leu Leu 480 485 490 495 gat gcg ctc tge gac cgc eeg caá cce gcg tta tac acá gag gaa age 1837 Asp Ala Leu -Cys Asp Arg Leu Gln Pro Val Leu Tyr Thr Glu Glu Ser 500 SOS 510 tac ata gta aga gaa gga gat ccg gta gac gaa atg ctc tte ata atg 1885 Tyr He Val Arg Glu Gly Asp Pro Val Asp Glu Met Leu Phe He "Met 515 520 525 ege ggg aag ctt cta acá ate acá ac aac ggt gga aga acc ggt tte 1933 Arg Gly Lys Leu Leu Thr He Thr Thr Asn Gly Gly Arg Thr Gly Phe 530 535 540 tta aat tec gag tat ctt gga gcc ggt gat tte tgt ggt gag gag ctc 1981 5 Leu Asn Ser Glu Tyr Leu Gly Ala Gly Asp Phe Cys Gly Glu Glu Leu 545 550 555 tta acc tgg gcc tta gac cea cae cea tec cea aac etc cea ato tea 2029 Leu Thr Trp Ala Leu Asp Pro His Ser Ser Ser Asn Leu Pro He Ser 560 565 570 575 acá aga act gee cga gct etc aeg gaa gee gaa gce etc gea ctt aaa 2077 Thr Arg Thr Val Arg Ala Leu Met Glu Val Glu Ala Phe Ala Leu Lys 580 585 590 gct gat gac ctc aaa tte gtg gct tec cag tte aga cgt cet cae age 2125 1 o Ala Asp Asp Leu Lys Phe al Ala Ser Gln Phe Arg Arg Leu Hxs Ser 595 S00 605 aaa cag cta aga eat act Ctc agg tac tac tea caá ca tgg aag aet 2173 Lys Gln Leu Arg Kis Thr Phe Arg Tyr Tyr Ser Gln Gln Trp Lys Thr 610 615 620 egg gcc gct tgc tte ata ca gcc gct tgg aga aga tac att aag aag 2221 Trp Ala Ala Cys Phe He Gln Ala Ala Trp Arg Arg Tyr He Lye Lys 625 630 635 aaa ctc gaa gag tet ctt aaa caá gaa gag aat cgg ttg cag gat gct 2269 Lys Leu Glu Glu Ser Leu Lys Glu Glu Glu Asn Arg Leu Gln Asp Ala 15 640 645 650 655 ttg gct aaa gaa gct ege gga agt ccc cea age ctc ggt gct acá ata 2317 Leu Ala Lys Glu Ala Cys Gly Ser Ser Pro Ser Leu Gly Ala Thr He 660 665 670 tac gea tea cgg ttt gct gea aat ate ttg cgc ac ata cgt agg age 2365 Tyr Ala Ser Arg Phe Ala Ala Asn He Leu Arg Thr He Arg Arg Ser 675 680 685 gga tea gta agg aaa cea agg atg ccg gaa cga atg cea ccc atg cta 2413 Gly Ser Val Arg Lys Pro Arg Met Pro Glu Arg Met Pro Pro Met Leu 20 690 695 700 ctt cag aaa cea gea gag cea gat tte aac agt gat gat taa 2455 Leu Gln Lys Pro Ala Glu Pro Asp Phe Asn Ser Asp Asp 705 710 715 ttaattagea tatatgtata tgaaagaete caccgcgaac caeagageca aeatataaat 2515 ataagtcttt ttataaaaaa aaaaaaaaaa aa 2547 ÉHtó¡ÉÉ»<¡Bi¡a¿i---- .«-^-s- • «210> 6 <211> 716 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 6 Met Asn Phe Arg Gln Glu Lys Phe Val Arg Phe Gln Asp Trp Lys Ser 1 5 10 15 Asp Lys Thr Ser Ser A=p Val Glu Tyr Ser Gly Lys Asn Glu He Glp 20 25 30 Thr Gly He Phe Gln Arg Thr He Ser Ser He Ser A=p Lys Phe Tyr 35 40 45 Arg Ser Phe Glu Ser Ser Ser Ala Arg He Lys Leu Phe Lys Arg Ser 50 55 60 Tyr Lys Ser Tyr Ser Phe Lys Glu Ala Val Ser Lys Gly He Gly Ser 65 70 75 80 Thr His Lys He Leu Asp Pro Gln Gly Pro Phe Leu Gln Arg Trp Asn 85 90 95 Lys He Phe Val Leu Ala Cys He He Ala Val Ser Leu Asp Pro Leu 100 IOS 110 Phe Phe Tyr Val Pro He He Asp Asp Ala Lys Lys Cys Leu Gly He 115 120 125 Asp Lys Lys Met Glu He Thr Ala Ser Val Leu Arg Ser Phe Thr Aßp 130 135 140 al Phe Tyr Val Leu His He He Phe Gln Phe Arg Thr Gly Phe He 145 150 155 160 Ala Pro Ser Ser Arg Val Phe Gly Arg Gly Val Leu Val Glu Asp Lys 165 170 175 Arg Glu He Ala Lys Arg Tyr Leu Ser Ser His Phe He He Asp He 180 185 190 Leu Ala Val Leu Pro Leu Pro Gln Met Val He Leu He He He Pro 195 200 205 Hls Met rg Giy s«r Ser Ser kßu 1¡í3n tilr Lys A=n Met Leu Lys Phe 210 215 220 He Val Phe Phe Gln Tyr He Pro Arg Phe He Arg He Tyr Pro Leu 225 230 235 240 Tyr Lys Glu Val Thr Arg Thr Ser Gly He Leu Thr Glu Thr Ala Trp 245 250 255 Ala Gly Ala Ala Phe Asn Leu Phe Leu Tyr Met Leu Ala Ser His Val 260 265 270 Phe Gly Ala Phe Trp Tyr Leu Phe Ser He Glu Arg Glu Thr Val Cys 275 280 285 Trp Lys Gln Ala Cys Glu Arg Asn Asn Pro Pro Cys He Ser Lys Leu 290 295 300 Leu Tyr Cys Asp Pro Glu Thr Ala Gly Gly A=n Ala Phe Leu Asn Glu 305 310 315 320 Ser Cys Pro He Gln Thr Pro Asn Thr Thr Leu Phe Asp Phe Gly He 325 330 335 Phe Leu Asp Ala Leu Gln Ser Gly Val Val Glu Ser Gln Asp Phe Pro 340 345 350 Glr. Lys Phe Phe Tyr Cys Phe Trp Trp Gly Leu Gln Asn Leu Ser Ser 355 360 355 Leu Gly Gln Asn Leu Lys Thr Ser Thr Tyr He Trp Glu He Cys Phe 370 375 380 Ala Val Phe He Ser He Ala Gly Leu Val Leu Phe Ser Phe Leu He 385 390 395 400 Gly Asn Mee Gln Thr Tyr Leu Gln Ser Thr Thr Thr Arg Leu Glu Glu 405 410 415 Met Arg Val Lys Arg Arg Asp Ala Glu Gln Trp Met Ser His Arg Leu 420 42S 430 Leu Pro Glu Asn Leu Arg Lys Arg He Arg Arg Tyr Glu Gln Tyr Lys 435 440 445 Trp Gln Glu Thr Arg Gly Val Asp Glu Glu Asn Leu Leu Ser Asn Leu 450 455 460 Pro Lys Asp Leu Arg Arg Asp He Lys Arg His Leu Cys Leu Ala Leu 465 470 475 480 Leu Mee Arg Val Pro Met Phe Glu Lys Met Asp Glu Gln Leu Leu Asp 485 490 495 Ala Leu Cys Asp Arg Leu Gln Pro Val Leu Tyr Thr Glu Glu Ser Tyr 500 505 510 He Val Arg Glu Gly Asp Pro Val Asp Glu Met Leu Phe He Met Arg 515 520 525 Gly Lys Leu Leu Thr He Thr Thr A=n Gly Gly Arg Thr Gly Phe Leu 530 535 540 Asn Ser Glu Tyr Leu Gly Ala Gly Asp Phe Cys Gly Glu Glu Leu Leu 545 550 555 560 Thr Trp Ala Leu Asp Pro His Ser Ser Ser A=n Leu Pro He Ser Thr 565 570 575 Arg Thr Val Arg Ala Leu Mee Glu Val Glu Ala Phe Ala Leu Lys Ala 580 585 590 Asp Asp Leu Lys Phe Val Ala Ser Gln Phe Arg Arg Leu Hxs Ser Lys 535 600 605 Gln Leu Arg Hxs Thr Phe Arg Tyr Tyr Ser Glr. Gln Trp Lys Thr Trp 610 615 620 Ala Ala Cys Phe He Gln Ala Ala Trp Arg Arg Tyr He Lys Lys Lys 625 630 635 640 Leu Glu Glu Ser Leu Lys Glu Glu Glu Asn Arg Leu Gln Asp Ala Leu 645 650 655 Ala Lys Glu Ala Cys Gly Ser Ser Pro Ser Leu Gly Ala Thr He Tyr 660 665 670 Ala Ser Arg Phe Ala Ala Asn He Leu Arg Thr He Arg Arg Ser Gly 675 680 685 Ser Val Arg Lys Pro Arg Met Pro Glu Arg Met Pro Pro Met Leu Leu 690 695 700 Gln Lys Pro Ala Glu Pro Asp Phe Asn Ser Asp Asp 705 710 715 <210> 7 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cehador Oligonucieotido <400> 7 atccgcccga gtgaccggce ccgccccgtc c 31 <210> 8 <211> 31 <212> ADN <223 > Secuencia Artificial c220> <223 > Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador Oligonucleotido <400 > 8 ttcgcggatc ctatgcaccg cgcctgtgtg a 31 Í..áfe*l.¿¿.«i..Ja-j.

Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención. -gAt J. ¡

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para el mejoramiento de la resistencia a enfermedades en una planta caracterizado por la regulación descendente, mutación o inactivación de un gen o producto de gen DND de canal iónico de compuerta de nucleótido cíclico { CNGC) . 2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha enfermedad es un resultado de un patógeno de planta. 3. El método de la reivindicación 2, caracterizado porque dicho patógeno de planta se selecciona del grupo que consiste de virus, bacterias y hongos. 4. El método de la reivindicación 3, caracterizado porque dicho patógeno es un virus seleccionado del grupo de nepovirus que incluye el virus del moteado de anillo del Tabaco . 5. El método de la reivindicación 3, caracterizado porque dicho patógeno es una bacteria gram-negativa, incluyendo la bacteria del género Pseudomonas o Xanthorionas, incluyendo Pseudomonas syringae pv. toma to y Xanthomonas campestris pv. campestris . 6. El método de la reivindicación 3, caracterizado porque dicho patógeno es un ascomycete funcus; incluyendo hongos del género Erysiphe, incluyendo Eryshiphe oron tii . 7. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es homólogo a la SEC ID NO : 2. 8. El método de la reivindicación 7, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es uno que hibridiza con la SEC ID NO: 2 bajo condiciones de rigurosidad bajas. 9. El método de la reivindicación 7, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es uno que hibridiza con la SEC ID NO: 2 bajo condiciones de rigurosidad media. 10. El método de la reivindicación 7, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es uno que hibridiza con la SEC ID NO: 2 bajo condiciones de rigurosidad alta. 11. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es homólogo a la SEC ID NO: 5. 12. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es uno que hibridiza con la SEC ID NO: 5 bajo condiciones de rigurosidad ba as . ±g.c¿mt:^- ? m,<,. ¡ n 13. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es uno que hibridiza con la SEC ID NO: 5 bajo condiciones de rigurosidad media. 14. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es uno que hibridiza con la SEC ID NO: 5 bajo condiciones de rigurosidad alta. 15. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha regulación o inactivación descendente se alcanza por la expresión de una molécula sentido o antisentido CNGC o DND en dicha planta. 16. El método de la reivindicación 15, caracterizado porque dicha molécula sentido o antisentido CNGC o DND es expresada bajo el control de un promotor inducible . 17. El método de la reivindicación 16, caracterizado porque el promotor inducible es un promotor inducible por patógeno. 18. Una planta o tejido de planta o semilla transformada, caracterizada porque se modifica de conformidad con el método de la reivindicación 1. ámé.??má,? ' ^xJt-l-^t ilUMme.r- 19. Una planta o tejido de planta o semilla transformada, caracterizada porque comprende una molécula antisentido CNGC o DND . 20. Una planta o tejido de planta o semilla 5 transformada, caracterizada porque comprende una molécula sentido CNGC o DND. 21. Un método para el mejoramiento de la resistencia a enfermedades en una planta, caracterizado porque se administra un inhibidor de la actividad CNGC en 10 dicha planta. 22. Un método caracterizado porque es para controlar la muerte celular en una planta por la regulación descendente, mutación o inactivación de un gen o producto de gen CNGC o DND . 15 23. El método de la reivindicación 22, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es homólogo a la SEC ID NO: 2. 24. El método de la reivindicación 23, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es uno que hibridiza con la SEC ID NO: 2 bajo 20 condiciones de rigurosidad bajas. 25. El método de la reivindicación 23, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es uno que hibndiza con la SEC ID NO: 2 bajo condiciones de rigurosidad tmWé slíitím É m??A^^?já^ ^... media . 26. El método de la reivindicación 23, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es uno que hibridiza con la SEC ID NO: 2 bajo condiciones de rigurosidad 5 alta. 27. El método de la reivindicación 22, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es homólogo a la SEC ID NO: 5. 28. El método de la reivindicación 27, 10 caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es uno que hibridiza con la SEC ID NO: 5 bajo condiciones de rigurosidad baj as . 29. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es uno que 15 hibridiza con la SEC ID NO: 5 bajo condiciones de rigurosidad media . 30. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es uno que hibridiza con la SEC ID O : 5 bajo condiciones de rigurosidad 20 alta. 31 . El método de la reivindicación 22 , caracteri zado porque dicha regulación o inactivación descendente se logra usando una molécula sentido o antisentido CNGC o DND . 32 El método de la reivindicación 31, caracterizado porque dicha molécula sentido o antisentidc es expresada bajo el control de un promotor inducible. 33. El método de la reivindicación 32, caracterizado porque el promotor inducible es un promotor inducible por patógeno. 34. Un método caracterizado porque es para reducir la respuesta a la hipersensibilidad en respuesta a un ataque de patógeno en una planta por la regulación descendente, mutación o inactivación de un gen o producto de gen de canal iónico de compuerta de nucleótido cíclico CNGC o DND. 35. El método de la reivindicación 34, caracterizado porque dicho patógeno de planta se selecciona del grupo que consiste de virus, bacterias y hongos. 36. El método de la reivindicación 35, caracterizado porque dicho patógeno es un virus seleccionado del grupo de nepovirus que incluye el virus del moteado de anillo del Tabaco. 37 El método de la reivindicación 35, caracterizado porque dicho patógeno es una bacteria gram-negativa, incluyendo la bacteria del género Pseudomonas o Xan thori onas, incluyendo Pseudomonas syri ngae pv. toma to y .íl?ailULá Xanthomonas campestris pv. campestris . 38. El método de la reivindicación 35, caracterizado porque dicho patógeno es un ascomycete funcus, ; incluyendo hongos del género Erysiphe, incluyendo Eryshiphe orontii . 39. El método de la reivindicación 34, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es homólogo a la SEC ID NO: 2. 40. El método de la reivindicación 39, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es uno que hibridiza con la SEC ID NO: 2 bajo condiciones de rigurosidad bajas . 41. El método de la reivindicación 39, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es uno que hibridiza con la SEC ID NO: 2 bajo condiciones de rigurosidad media. 42. El método de la reivindicación 39, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es uno que hibridiza con la SEC ID NO: 2 bajo condiciones de rigurosidad alta. 43. El método de la reivindicación 34, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es homólogo a la SEC ID NO: 5. 44. El método de la reivindicación 43, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es uno que hibridiza con la SEC ID NO: 5 bajo condiciones de rigurosidad bajas. 45. El método de la reivindicación 43, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es uno que hibridiza con la SEC ID NO: 5 bajo condiciones de rigurosidad media. 46. El método de la reivindicación 43, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es uno que hibridiza con la SEC ID NO: 5 bajo condiciones de rigurosidad alta . 47. El método de la reivindicación 34, caracterizado porque dicha regulación descendente o inactivación se alcanza por la expresión de una molécula sentido o antisentido CNGC o DND en dicha planta. 48. El método de la reivindicación 47, caracterizado porque dicha molécula sentido o antisentido es expresada bajo el control de un promotor inducible. 49. El método de la reivindicación 47, caracterizado porque el promotor inducible es un promotor inducible por patógeno. 50. Un método para identificación de un gen de resistencia a la enfermedad en una planta, caracterizado porque se selecciona por un gen CNGC o DND. 51. El método de la reivindicación 50, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es AtCNGC2/DNDl como se da en la SEC ID NO: 2. 52. El método de la reivindicación 50, caracterizado porque dicho gen CNGC o DND es AtCNGC2/DNDl como se da en la SEC ID NO: 5. l«i*AÍJ.?.?fat.t- <**^^> .. - «HÍ> n- 1* - . ~ • i —- -- - *— " -*-« ¡ a-a «-*>*»# *•' RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la respuesta de muerte celular conocida como la respuesta hipersensitiva (HR) como una caracteristica central de la resistencia a enfermedades de las plantas gen-por-gen. Las plantas también se defienden contra patógenos via respuestas de defensa de amplio espectro utigénicamente controladas, tales como aquellas moduladas por el ácido salicilico. El sitio DND (Defensa, No Muerte) , de Arabidopsis thaliana regula la extensión de la resistencia a enfermedades de amplio espectro contra un amplio rango de patógenos virales, bacterianos, oomicetos y fúngicos. Las plantas que carecen de una copia funcional del gen DND1 ó 2, son defectivas en la muerte de células HR pero presentan resistencia a enfermedades gen-por-gen exitosa. Las plantas que carecen de una copia funcional del gen DND1 ó 2, también presentan un fenotipo de resistencia a enfermedades de amplio espectro incrementado. Los productos del gen DND1 y 2 son idénticos a los ANDcs previamente conocidos llamados AtCNGC2 y 1 respectivamente, que codifican proteinas de canales iónicos de compuerta de nucleótidos cíclicos. La identificación de los genes CNGC/ DND como regulardores de la resistencia a enfermedades y muerte de células hospederas y la disponibilidad de la 01 fm información de la secuencia del gen CNGC/DND, proporciona nuevas posibilidades para controlar una amplia variedad de enfermedades de plantas . 02/ t ., ..» .£.. i ti-.Ja