CN102747090B

CN102747090B - 水稻抗病基因OsLYP4及其应用

Info

Publication number: CN102747090B
Application number: CN201210226260.1A
Authority: CN
Inventors: 王宏斌; 刘兵; 敖英; 王金发
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2012-07-02
Filing date: 2012-07-02
Publication date: 2014-06-11
Anticipated expiration: 2032-07-02
Also published as: CN102747090A

Abstract

本发明公开了水稻抗病基因OsLYP4及其应用。OsLYP4基因位于9号染色体上，基因座位号为LOC_Os09g27890（MSU登陆号），对应的RAP登陆号为Os09g0452200。其全长基因组序列约为3597bp，包括5个外显子，4个内含子。其cDNA全长1206bp，编码401个氨基酸。OsLYP4编码的蛋白质序列如SEQIDNO：3所示，存在有LysM（Lysinmotif）结构域。本发明方法利用反转录PCR技术从水稻中克隆到了一个含LysM结构域蛋白的基因OsLYP4，证实OsLYP4参与了水稻对病原菌及真菌的防御反应，是一种重要的参与水稻天然免疫反应的抗病基因。该基因有望应用于水稻抗病品种的培育。

Description

水稻抗病基因OsLYP4及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种水稻抗病基因及其应用，特别涉及水稻抗病基因OsLYP4及其应用。

背景技术

植物在自然界中受到微生物等病原体侵袭，可在细胞水平上启动快速的早期防御机制，即天然免疫反应（innate immune）(Iriti and Faoro, 2007 . Iriti, M., and Faoro, F. Review of innate and specific immunity in plants and animals. Mycopathologia., 2007, 164, 57-64)。天然免疫反应是植物针对病原侵袭产生的基础防御反应，主要过程包括：对病原相关分子模式（pathogen associated molecular pattern, PAMP），即病原体细胞表面成分的识别（主要涉及PAMPs与PAMP受体）；将入侵信号由胞外向胞内传递，启动宿主细胞信号传导；进而影响下游抗病基因的表达，最终对病原产生防御(Boller and He, 2009 Boller, T., and He, S.Y. Innate immunity in plants: an arms race between pattern recognition receptors in plants and effectors in microbial pathogens. Science , 2009, 324, 742-744; Cui et al., 2009 Cui, H., Xiang, T., and Zhou, J.M. Plant immunity: a lesson from pathogenic bacterial effector proteins. Cell Microbiol., 2009, 11, 1453-1461)。

植物PAMPs主要包括脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）、肽聚糖（peptidoglycan, PGN）、鞭毛蛋白（flagellin，flg22）、延伸因子EF-Tu、真菌细胞壁成分（几丁质/壳聚糖寡糖）等(Gust et al., 2007 Gust, A.A., Biswas, R., Lenz, H.D., Rauhut, T., Ranf, S., Kemmerling, B., Gotz, F., Glawischnig, E., Lee, J., Felix, G., and Nurnberger, T. Bacteria-derived peptidoglycans constitute pathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity in Arabidopsis. J Biol Chem., 2007, 282, 32338-32348; Zipfel and Robatzek, 2010 Zipfel, C., and Robatzek, S. Pathogen-associated molecular pattern-triggered immunity: veni, vidi...? Plant Physiol, 2010, 154, 551-554)。当这类物质作用于植物细胞表面，可被相应的受体分子感应，并通过下游信号传导途径，引发细胞内一系列免疫应答(Kishi-Kaboshi et al., 2010 Kishi-Kaboshi, M., Okada, K., Kurimoto, L., Murakami, S., Umezawa, T., Shibuya, N., Yamane, H., Miyao, A., Takatsuji, H., Takahashi, A., and Hirochika, H. A rice fungal MAMP-responsive MAPK cascade regulates metabolic flow to antimicrobial metabolite synthesis. Plant J ., 2010, 63, 599-612)。因此，对外源PAMP的感应与识别是植物天然免疫反应的重要起始步骤，对植物细胞中感应PAMP的受体分子及其作用机制进行研究，是植物免疫反应系统研究的重要方面(Kishimoto et al., 2010 Kishimoto, K., Kouzai, Y., Kaku, H., Shibuya, N., Minami, E., and Nishizawa, Y. Perception of the chitin oligosaccharides contributes to disease resistance to blast fungus Magnaporthe oryzae in rice. Plant J ., 2010, 64, 343-354)。

PAMP受体多属于跨膜激酶受体，如flg22受体FLS2、EF-Tu受体EFR，它们可以识别病原菌表面分子，通过激活自身激酶活性，将引起胞内的信号传递。此外，在真菌PAMP受体的研究中，还发现一些LysM蛋白参与了几丁质类PAMP的识别反应过程（Kaku et al., 2006 Kaku, H., Nishizawa, Y., Ishii-Minami, N., Akimoto-Tomiyama, C., Dohmae, N., Takio, K., Minami, E., and Shibuya, N. Plant cells recognize chitin fragments for defense signaling through a plasma membrane receptor. Proc Natl Acad Sci U S A , 2006, 103, 11086-11091; Miya et al., 2007 Miya, A., Albert, P., Shinya, T., Desaki, Y., Ichimura, K., Shirasu, K., Narusaka, Y., Kawakami, N., Kaku, H., and Shibuya, N. CERK1, a LysM receptor kinase, is essential for chitin elicitor signaling in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A , 2007, 104, 19613-19618）。LysM蛋白，即含有LysM（lysin motif）结构域的蛋白质。LysM结构域是肽聚糖（peptidoglycan, PGN）结合结构域，最早发现于细菌中的肽聚糖裂解酶中，其功能是识别细菌细胞壁中的肽聚糖成分。LysM蛋白广泛存在于古细菌之外的各物种(Buist et al., 2008 Buist, G., Steen, A., Kok, J., and Kuipers, O.P. LysM, a widely distributed protein motif for binding to (peptido)glycans. Mol Microbiol ., 2008, 68, 838-847)。LysM蛋白的功能可能涉及植物病原防御反应，细菌中LysM蛋白主要是对细菌肽聚糖进行识别与结合，但植物中LysM蛋白主要识别结合的PAMP为真菌细胞壁成分——几丁质及其寡糖分子(de Jonge et al., 2010 de Jonge, R., van Esse, H.P., Kombrink, A., Shinya, T., Desaki, Y., Bours, R., van der Krol, S., Shibuya, N., Joosten, M.H., and Thomma, B.P. Conserved fungal LysM effector Ecp6 prevents chitin-triggered immunity in plants. Science , 2010, 329, 953-955; Iizasa et al., 2010 Iizasa, E., Mitsutomi, M., and Nagano, Y. Direct binding of a plant LysM receptor-like kinase, LysM RLK1/CERK1, to chitin in vitro. J Biol Chem., 2010, 285, 2996-3004)。近年研究发现植物蛋白的LysM结构域还可识别结合其他PAMP成分（如细菌肽聚糖）。

水稻（Oryza sativa L.）是极为重要的粮食作物，也是重要的单子叶模式植物，细菌与真菌导致的病害严重制约水稻的产量，因此研究水稻与病原菌的相互作用及水稻感应病原菌入侵的机理，对于水稻功能基因组学及水稻育种都具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水稻抗病基因及其应用。

本发明的再一个目的在于提供一种抗病水稻的培育方法。

本发明所采取的技术方案是：

OsLYP4基因位于9号染色体上，基因座位号为LOC_Os09g27890（MSU登陆号），对应的RAP登陆号为Os09g0452200。其全长基因组序列约为3597bp，包括5个外显子，4个内含子。其cDNA全长1206 bp，编码401个氨基酸。

OsLYP4编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：3所示，存在有LysM（Lysin motif）结构域。

一种培育抗病水稻品种的方法，包括将水稻抗病基因OsLYP4或其cDNA转入水稻基因组中，并使其过表达；或将水稻抗病基因OsLYP4或其cDNA转入载体中，使用载体转染水稻细胞，并使水稻抗病基因OsLYP4或其cDNA过表达。

本发明的有益效果是：

本发明方法利用反转录PCR技术从水稻中克隆到了一个含lysin motif (LysM)结构域蛋白的基因OsLYP4，证实OsLYP4参与了水稻对病原菌及真菌的防御反应，是一种重要的参与水稻天然免疫反应的抗病基因。

本发明方法利用转基因技术，获得OsLYP4的RNA干涉及过表达转基因水稻，发现OsLYP4基因的功能缺失可导致水稻对致病菌（水稻白叶枯病菌（Xoo-gd4）、细菌性条斑病菌（Xoc-gdIV）、水稻稻瘟病株MZ-A）抵抗力的下降，而OsLYP4过表达转基因水稻则表现出明显抗性。

附图说明

图1是OsLYP4基因对稻白叶枯病抗性的影响图；

图2是OsLYP4基因对细菌性条斑病菌（Xoc-gdIV）抗性的影响图；

图3是OsLYP4基因对水稻稻瘟病株MZ-A抗性的影响图。

具体实施方式

下面结合试验，进一步说明本发明。

培养基和营养液：

LB培养基*

10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，调节pH至7.0，定溶至1 L，在1.034×10⁵Pa高压下蒸气灭菌20 min，加入1.5%的琼脂粉即为LB固体培养基，室温保存。

培养基

5 g蛋白胨，1 g酵母提取物，5 g牛肉浸膏，5 g蔗糖，0.24 g无水硫酸镁，调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1 L，加1.5%的琼脂粉可制成固体培养基。

培养基

含有NH₄NO₃（1650 mg/L），KNO₃（1900 mg/L），CaCl₂·2H₂O（440 mg/L），MgSO₄·7H₂O（370 mg/L），KH₂PO₄（170 mg/L），KI（0.83 mg/L），H₃BO₃（6.2 mg/L），MnSO₄·4H₂O（22.3 mg/L），ZnSO₄·7H₂O（8.6 mg/L），Na₂MoO₄·2H₂O（0.25 mg/L），CuSO₄·5H₂O（0.025 mg/L），CoCl₂·6H₂O（0.025 mg/L），Na₂EDTA·2H₂O（37.3 mg/L），FeSO₄·7H₂O（27.8 mg/L），肌醇（100 mg/L），烟酸（0.5 mg/L），盐酸吡哆辛（0.5 mg/L），盐酸硫胺素（0.1 mg/L），甘氨酸（2 mg/L），蔗糖（30%），用NaOH调pH至5.8，加入组培用琼脂粉（8 g/L）即可制成固体MS培养基。1/2 MS培养基除蔗糖含量不减半外，其余成分均为原来的一半。

’s营养液

四水硝酸钙945 mg，硝酸钾 506 mg，硝酸铵80 mg，磷酸二氢钾136 mg，硫酸镁493 mg，铁盐溶液2.5 mL，微量元素液5 mL，溶于800 mL水中，调节pH至6.0后定容至1 L。

培养基： AA 盐， AA 核苷酸，MS 维生素，500 mg/L水解酪氨酸，68.5 g/L 蔗糖，36 g/L葡萄糖，100 μM 乙酰丁香酮，pH 5.2

AA盐（mg/L）：

AA大量：

KCl 2950，MgSO₄·7H₂O 246，NaH₂PO₄·2H₂O 169.7， FeSO₄·7H₂O 27.8，Na₂EDTA 37.3，CaCl₂·2H₂O 150

B₅微量：

MnSO₄·H₂O 10，ZnSO₄·7H₂O 2.0，H₃BO₃ 3.0，KI 0.75；

MS维生素（mg/L）：Gly 2，VitB₅ 0.5，VitB₆ 0.5，VitB₁ 0.1，Inositol 100

AA核苷酸（mg/L）：Gln 876，Asp 266，Arg 174，Gly 5.5，过滤除菌。

水稻总RNA的提取：

取水稻原种日本晴，按常规方法培育得到其愈伤组织，愈伤组织在陶瓷研钵中用液氮冷冻并研磨成粉状，转入塑料离心管，并按照每0.1g材料加入1mL提取试剂的比例加入Trizol试剂（Invitrogen公司产RNA专用提取试剂），混合均匀；再按照每0.1g材料加入200uL 氯仿的比例加入氯仿，混合均匀，10 000g，4℃离心15m，弃去中间层及下层有机相，收集上层水相转到新的离心管内；加入600uL 异丙醇，混合均匀，室温静置20m；10 000g，4℃离心15m，收集沉淀，待异丙醇挥发后溶于无RNA酶的超纯水中，-80℃冻存。

OsLYP4基因的克隆：

1．第一链cDNA的合成

(1) 取出-80℃保存的水稻愈伤组织总RNA 3 μL，加入2 μL的Oligo (dT)₁₆(10 mM)，混匀后置于70℃中水浴5 min；

(2) 冰上放置5 min后，于冰上向EP管中先后加入dNTP Mixture (10 mM) 2μL、5×RT Buffer 4 μL、Rnase抑制剂 1 μL(10 U/μL)、Rnase-free ddH₂O 8 μL、ReverTra Ace 1 μL；

(3) 将EP管置于PCR仪中，按30℃ 10 min，42℃ 60 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min程序后瞬时离心，反转录得到第一链的单链cDNA，于-20℃冰箱保存。

． cDNA为模板的RT-PCR

设计如下两条引物：

OsLYP4-RT-F：5’-ACTAAGCTTATGCCACCACCCTTGCTCCTCCTC-3’ （SEQ ID NO：4）（下划线标记部分为Hind III序列）；

OsLYP4-RT-R：5’-AGTTCTAGATTACCACAGCAGGTTGCCGACGAG-3’ （SEQ ID NO：5）（下划线标记部分为Xba I序列）。

PCR反应体系为：cDNA模板2 μL、引物RT-F 0.5 μL、引物RT-R 0.5 μL、dNTP 2 μL、10×PCR buffer 2.5 μL、H₂O 18 μL、TaKaRa LA Taq酶 0.25 μL。

扩增条件为：94℃ 变性 5 min；94℃ 30 s， 62℃ 30 s，72℃ 80 s 28个循环；72℃延伸10 min，得到全长的OsLYP4 cDNA ，4 ℃保存。

．OsLYP4过表达载体的构建

以原种日本晴cDNA为模板，PCR得到的DNA片段先连接至pMD 18-T 载体中，送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。本实验室利用pBluescript载体构建了pRiActin中间载体，在此基础上将测序正确的OsLYP4基因的编码序列连接入pRiActin载体后，将经鉴定正确的OsLYP4过表达目的基因片段克隆用Kpn I和 Stu I双酶切；双元载体pCAMBI1301分别用Kpn I和Pml I双酶切，回收并纯化。将回收得到的过表达基因片段用T₄ DNA连接酶连接入双元载体pCAMBIA1301的相应位点中，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，同时将双元载体pCAMBI1301酶切回收后的产物也转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，作为对照；挑选阳性克隆提取质粒DNA，进行酶切鉴定，最后得到在水稻Act1启动子驱动下的OsLYP4过表达载体：pCAT-OsLYP4。

．OsLYP4- RNAi表达载体的构建

根据OsLYP4基因全长cDNA序列，选取靠近3’端非翻译区的432 bp为干涉区段。

扩增干涉区段序列的引物：

P_i-F1：5’-TCTAAGCTTCGAAGGAGGCGTCATG-3’（SEQ ID NO：6）（下划线标记部分为Hind III序列）；

P_i-R1：5’- ATACTGCAGTGTGGGTGCCCTAAAA-3’ （SEQ ID NO：7）（下划线标记部分为Pst I序列）；

P_i-F2：5’-TCTACGCGTCGAAGGAGGCGTCATG-3’ （SEQ ID NO：8）（下划线标记部分为Mlu I序列）；

P_i-R2：5’-ATAGTCGACTGTGGGTGCCCTAAAA-3’ （SEQ ID NO:9）（下划线标记部分为Sal I序列）。

以原种日本晴的cDNA为模板，PCR扩增得到目的片段并经测序鉴定正确后并按正确的方向连接入连入pRiActin中间载体，然后用Kpn I和 Stu I进行双酶切；双元载体pCAMBI1301分别用Kpn I和Pml I双酶切，回收并纯化。将回收得到的含目的基因的双酶切产物用T₄ DNA连接酶连接入双元载体pCAMBIA1301的相应位点中，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，同时将双元载体pCAMBI1301酶切回收后的产物也转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，作为对照；挑选阳性克隆提取质粒DNA，进行酶切鉴定，最后得到在水稻Actin启动子驱动下的OsLYP4- RNAi表达载体：pCAT-OsLYP4i。

．电激法转化农杆菌

(1) 从-80℃冰箱取出农杆菌EHA105感受态细胞，置于冰上解冻；

(2) 取1 μL pCAT-OsLYP4i质粒或pCAT-OsLYP4质粒于1.5 mL的离心管，将其与0.1 cm的电极杯一起置于冰上预冷；

(3) 将40~100 μL的感受态细胞转移至1.5 mL的离心管，小心混匀，冰上放置10min；

(4) 打开电转仪，调至Manual，调电压2.0 KV；

(5) 将此混合物移至预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯的底部使混合物进入电极杯的底部；

(6) 将电极杯推入电转仪，按Pulse键，听到蜂鸣生声后，向电极杯中加入600 μL的YEB培养基，重悬细胞后，转移至1.5 mL的离心管；

(7) 放置摇床28℃复苏4 h后涂板，28℃培养16h，得到转化有pCAT-OsLYP4i质粒或pCAT-OsLYP4质粒的农杆菌。

6．水稻愈伤组织的诱导、侵染、共培养、筛选及分化

（1）愈伤组织诱导

去颖壳，进行表面消毒处理：先用75%酒精浸泡30-45sec，不时摇晃，无菌水洗3次，20%的次氯酸钠（V/V，有效氯成分为1.04%）浸泡30min，不时摇晃，水洗5次以上。用无菌滤纸吸干水分，转入盾片诱导培养基，于25℃进行暗培养，每2～3周继代一次。

（2）愈伤组织的预培养

从继代2～3次的愈伤组织中挑选颜色鲜艳、淡黄、颗粒状、新鲜的胚性愈伤组织接种于新鲜的继代培养基上培养约4d，即可用于农杆菌感染。这时可适当干燥1d，提高转化效率。

（3）农杆菌的活化、悬浮

于YEB培养基（含100ug/L Sm+50ug/L Km）上划线培养，28℃，暗培养2～3d，取单菌落涂布于加有相同抗生素的YEB培养基上，28℃，暗培养2～3d，刮取农杆菌悬浮于AAM液体培养基中，使OD_600nm为0.3～0.4,放置或摇床摇动培养2～3h 即可用于愈伤组织的侵染。

（4）愈伤组织的侵染与共培养

选取生长良好的愈伤颗粒放入AAM农杆菌悬浮液中，侵染20min，期间摇动几次，取出愈伤组织，用干的无菌滤纸吸去过多菌液，将愈伤组织接到加有一张滤纸的共培养基上。25℃，暗培养2～3d。

（5）抗性愈伤组织的筛选

取出共培养后的愈伤组织放入带滤纸的无菌培养皿中干燥处理2～3d，大概去水分20%，再转入筛选培养基上进行筛选培养基上进行筛选培养。筛选2次，每次2～3周。

（6）抗性愈伤的预分化、分化及幼苗的生根壮苗

生长旺盛的愈伤在预分化培养基于26℃光照培养2～３周，然后转移到分化培养基上培养至分化出苗。

7．检测转基因水稻对白叶枯病的抗性

以OsLYP4的过表达及RNA干涉转基因水稻（中花11）为材料，以野生型水稻及空载体转基因水稻作为对照，在生长至5叶期时进行水稻白叶枯病菌（Xoo-gd4）感染实验，采用剪叶法（Chen et al., 2003）。侵染9天后，统计从叶尖开始病变的叶片长度占叶片总长的比例，作为病理指标，并计算单位叶片内活菌数。结果显示OsLYP4基因的功能缺失可导致水稻对两种致病菌抵抗力的下降，相比于水稻原种（WT）及对照组（CK），表现为接种相同时间内，病斑发展迅速，面积显著增加（图1A-B），对叶片组织进行菌体计数，OsLYP4的干涉转基因水稻均表现出单位叶片内活菌数量增多（图1C），而OsLYP4过表达转基因则表现出明显抗性。

8．检测转基因水稻对细条病的抗性

以OsLYP4的过表达及RNA干涉转基因水稻（中花11）为材料，在生长至5叶期时进行细菌性条斑病菌（Xoc-gd

）感染实验，采用喷雾法（Chen et al., 2003）。侵染9天后，统计单位叶片内的病斑面积以及单位叶片内活菌数。统计结果显示OsLYP4基因的功能缺失可导致水稻对两种致病菌抵抗力的下降，表现为接种相同时间内，病斑发展迅速，面积显著增加（图2A-B），对叶片组织进行菌体计数，OsLYP4的干涉转基因水稻均表现出单位叶片内活菌数量增多（图2C），而OsLYP4过表达转基因则表现出明显抗性。

．检测转基因水稻对真菌稻瘟病的抗性

以OsLYP4的过表达及RNA干涉转基因水稻（中花11）为材料，进行水稻稻瘟病株MZ-A喷雾感染实验，10天后统计结果。OsLYP4基因的功能缺失可导致水稻对稻瘟病抵抗力的下降，表现为接种相同时间内，单位叶片上病斑形成数目显著增多（图3A-B），病斑形成数目显著增多（图3C），而OsLYP4过表达转基因则表现出抗性，而OsLYP4过表达转基因则表现出抗性。

<110> 中山大学

<120> 水稻抗病基因OsLYP4及其应用

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3597

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 1

atgtgatccc aggtctgcag ttctgcacag ccgaacacaa gatccaaaac cccccgcacg 60

ctttccaaag caaagcactc tctcgacatc gccccactcc aggtcaacag tctccactct 120

cactggctcg cagtcgcaca cactcccacg cctccgcgct cccgaccacc gtcgccatca 180

tcatgccacc acccttgctc ctcctcctcc tcctcgccgc cgccgccgcc gccgtcgcgc 240

ccgcgcggtc caagtcgacg ctggagtcct gctcctcttc caccgcctgc ccagcgctgc 300

tctcctacac gctctacgcc gacctcaagc tcgccgagct ggccgcgctc ttctccgccg 360

acccgctcgc catcctcgcc gccaactcca tcgacttcgc cgtcccggac cccgccgacc 420

gcatcctccc cgcggggctc ccgctccgcg tgcccgtccc ctgcgcctgc tccgacggca 480

tccgcagggt caccaccgtg cgctacgttg cgcgcccggg cgacacgctc gcctccgtcg 540

cctcctccgt ctacggcggc ctcaccaccc cggactggat cagcgactcc aacggcatcc 600

tcggcgccaa gcccgacgcc gccgtcgacg ccgggacgac tctgttcgtg ccgctgcact 660

gcgcctgctt cggcggcgtc gacaacggcc tccccgcggt gtacctcacg tacgtcgccg 720

ggaaggggga caccgtcgcc gcagtcgcgc agaggtaccg gaccacggcc accgacctca 780

tgagcgtcaa cgacatggcc acccccgagc tcgccgccgg tgacatcatc gtcgtcccgc 840

tgccaggtga gcccttttct agcttcaatt catagcttct tcttggatct ggtagttttt 900

ggttttgttg ctttgtgcta ccgagatgta ttgcgtggtt cgttggtaat tagatccatg 960

gccatgggtg gttaaccgac aaatttggtt ggtaatttta ctccatactc agtaagaagt 1020

agcagtagga gtactatact gacagtaatg tgattagtct agtgtgtcct tggtaattta 1080

gtgcaatgca gtaaccgcac tggccacaag ccttgctact gcgagcatga gatttactcc 1140

gaattctgga tacgggcatg tgcagatttg tagtactaga atgcgtctaa tccgatccta 1200

agttgctata ttttgggacg gagggagtat ctagctttga tatcagaaag gccatgttta 1260

gttcctatgc aaaaactttt tatcctgtca tatcgaatat ttagacatat acatggagaa 1320

ttaaatatag ataaaaaaac taattacaca gattgcgtgt aattgtgaga tgaatctttt 1380

aagcctaatt gcgctatgat ttgataatgt ggtgctacag taaatatgtg ctaatgatga 1440

attaattagg cttaataaat ttgtctcgca gtttacaggc ggaatctata atttattttt 1500

ttattagatt acgtttaata ctttaagtct atgtccatat atccgatgta acacgccaaa 1560

acttttcatc ctgtaactaa acagggccaa aatgcttcaa gattcgtgag gtgaaacatg 1620

agtgccagca atgcagcgca tcactgcttg tctgctcaaa ttgtttacta gtgccagttc 1680

ggatgctctg tttgtgtatc tgcacgtact ggcgctctca gctttaaaat aaaagggtcc 1740

atgcatgaaa ctttaccttt ccactgctcc ttttgatcat ttgctgtcaa ttaagctgac 1800

acccaagaaa aggagatgaa aaaaaaggtg tagcatgcag cacgattgca cgacataaat 1860

ttgacaatta agaatgttca acacaaactt agagagactt taatttcact attgtgagaa 1920

agaaagtgtt gtgtcgtttt ctctgttgtg aatagctgaa aggtcttcta gagttcttaa 1980

gtgcgatcca tgtgtgatgc attgaaaaaa ttaacgattt tcatttgtgc acatagattc 2040

agcactgaaa agctgtgctg ttttcctgtt tcctaaaagg aggttggtaa acaaactaaa 2100

cactctgctc tgagtttcta gaccgaattg tagttccgat aatttctgaa gggaagtggc 2160

caaaagtttc aatcccctcc atacccagat gttctgtcag atcacggaca aacaggattc 2220

tatcataatt aatcagtggc cactacaata gccagtacct agctacagtt agtacatgat 2280

tggtccattt cgtcctcgtc gtcactgtta tccctatacc gttttctgct tcatttatct 2340

cacatgcaat taatcatgac ggagtaccat tttttttctc tcgaacatgc agcgtgcaca 2400

tcatcattcc cggcgttcac ggcggactac ggcctggcgg tggcgaacgg gacctacgca 2460

gttactgcca accggtgtgt ccagtgcagc tgtggcccag gcaacttgga gtaggcaccg 2520

atcgatttca ccctcccatc ttcaatctgc tccagatctt acgcgaaccg agagatttct 2580

ctcctgtttc tgacgctgcc gttgcccgtt gctttgcttg cttttgctct gctgttgcag 2640

cctgttctgc gtgccggcgc cgctcgccga ctcgacgtgc tccagcatgc agtgcgccaa 2700

cagcagcatg atgctcggca acttcactct cctcatgacc agctccggct gcagcgtcac 2760

gtcctgcagc tacggcggat tcgtgaacgg cacaattctc accacgtaat tgatcagctt 2820

tttttttttt gtgtgtgtgt gtgtcccaaa tccatctcgc attttgctat tcagaaaccg 2880

ttgtctcacc gtagcgatac attttgtgca tctttcaggt taaccacagc actcaagcct 2940

caatgcccag gtataaaatt cgtgctcaat tatgtctcag ttcaccattt ctgccttgaa 3000

aaaccgagac tttatgcagc tcttgctttt cgtgcaggtc cgcatcagta tcctccgctg 3060

attccgccgc cgacgtcgtc cttcttcgag acgtacctcg gcccttcgcc gacgccgatg 3120

gcatccgaag gaggcgtcat ggccggcatg gcgccgacga gcaccccggc ggcgagctcc 3180

ggccctcctc cggccggccg gcacgtcgtc ggcgacgttc ttggggcgtt cgctctctgc 3240

ctcgtcggca acctgctgtg gtaacagagc ggctctcgcc gttgatgcta cataattttg 3300

tacagaagct gtggccggct gtgtttttgt cgggcagcgt cgggttgtgc ccaatttttg 3360

ttgcgttcat tcgatttgtc tgccactcac tcctgtggaa tggcaaacac aattacagaa 3420

gcgcagatct ctccagcgcg gctgtaatgg tcctgaattc ctgatgctat tgagaatgtg 3480

agtaccgagt agtgtgcttt ttatcgacgc tttttactgt accttctact actgatatgc 3540

tttttagggc acccacaatg gttatttata aactctctac aggagattca tatcagc 3597

<210> 2

<211> 1206

<212> DNA

<213> 水稻

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1203)

<400> 2

atg cca cca ccc ttg ctc ctc ctc ctc ctc ctc gcc gcc gcc gcc gcc 48

Met Pro Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Ala Ala

1 5 10 15

gcc gtc gcg ccc gcg cgg tcc aag tcg acg ctg gag tcc tgc tcc tct 96

Ala Val Ala Pro Ala Arg Ser Lys Ser Thr Leu Glu Ser Cys Ser Ser

20 25 30

tcc acc gcc tgc cca gcg ctg ctc tcc tac acg ctc tac gcc gac ctc 144

Ser Thr Ala Cys Pro Ala Leu Leu Ser Tyr Thr Leu Tyr Ala Asp Leu

35 40 45

aag ctc gcc gag ctg gcc gcg ctc ttc tcc gcc gac ccg ctc gcc atc 192

Lys Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Phe Ser Ala Asp Pro Leu Ala Ile

50 55 60

ctc gcc gcc aac tcc atc gac ttc gcc gtc ccg gac ccc gcc gac cgc 240

Leu Ala Ala Asn Ser Ile Asp Phe Ala Val Pro Asp Pro Ala Asp Arg

65 70 75 80

atc ctc ccc gcg ggg ctc ccg ctc cgc gtg ccc gtc ccc tgc gcc tgc 288

Ile Leu Pro Ala Gly Leu Pro Leu Arg Val Pro Val Pro Cys Ala Cys

85 90 95

tcc gac ggc atc cgc agg gtc acc acc gtg cgc tac gtt gcg cgc ccg 336

Ser Asp Gly Ile Arg Arg Val Thr Thr Val Arg Tyr Val Ala Arg Pro

100 105 110

ggc gac acg ctc gcc tcc gtc gcc tcc tcc gtc tac ggc ggc ctc acc 384

Gly Asp Thr Leu Ala Ser Val Ala Ser Ser Val Tyr Gly Gly Leu Thr

115 120 125

acc ccg gac tgg atc agc gac tcc aac ggc atc ctc ggc gcc aag ccc 432

Thr Pro Asp Trp Ile Ser Asp Ser Asn Gly Ile Leu Gly Ala Lys Pro

130 135 140

gac gcc gcc gtc gac gcc ggg acg act ctg ttc gtg ccg ctg cac tgc 480

Asp Ala Ala Val Asp Ala Gly Thr Thr Leu Phe Val Pro Leu His Cys

145 150 155 160

gcc tgc ttc ggc ggc gtc gac aac ggc ctc ccc gcg gtg tac ctc acg 528

Ala Cys Phe Gly Gly Val Asp Asn Gly Leu Pro Ala Val Tyr Leu Thr

165 170 175

tac gtc gcc ggg aag ggg gac acc gtc gcc gca gtc gcg cag agg tac 576

Tyr Val Ala Gly Lys Gly Asp Thr Val Ala Ala Val Ala Gln Arg Tyr

180 185 190

cgg acc acg gcc acc gac ctc atg agc gtc aac gac atg gcc acc ccc 624

Arg Thr Thr Ala Thr Asp Leu Met Ser Val Asn Asp Met Ala Thr Pro

195 200 205

gag ctc gcc gcc ggt gac atc atc gtc gtc ccg ctg cca gcg tgc aca 672

Glu Leu Ala Ala Gly Asp Ile Ile Val Val Pro Leu Pro Ala Cys Thr

210 215 220

tca tca ttc ccg gcg ttc acg gcg gac tac ggc ctg gcg gtg gcg aac 720

Ser Ser Phe Pro Ala Phe Thr Ala Asp Tyr Gly Leu Ala Val Ala Asn

225 230 235 240

ggg acc tac gca gtt act gcc aac cgg tgt gtc cag tgc agc tgt ggc 768

Gly Thr Tyr Ala Val Thr Ala Asn Arg Cys Val Gln Cys Ser Cys Gly

245 250 255

cca ggc aac ttg gac ctg ttc tgc gtg ccg gcg ccg ctc gcc gac tcg 816

Pro Gly Asn Leu Asp Leu Phe Cys Val Pro Ala Pro Leu Ala Asp Ser

260 265 270

acg tgc tcc agc atg cag tgc gcc aac agc agc atg atg ctc ggc aac 864

Thr Cys Ser Ser Met Gln Cys Ala Asn Ser Ser Met Met Leu Gly Asn

275 280 285

ttc act ctc ctc atg acc agc tcc ggc tgc agc gtc acg tcc tgc agc 912

Phe Thr Leu Leu Met Thr Ser Ser Gly Cys Ser Val Thr Ser Cys Ser

290 295 300

tac ggc gga ttc gtg aac ggc aca att ctc acc acg tta acc aca gca 960

Tyr Gly Gly Phe Val Asn Gly Thr Ile Leu Thr Thr Leu Thr Thr Ala

305 310 315 320

ctc aag cct caa tgc cca ggt ccg cat cag tat cct ccg ctg att ccg 1008

Leu Lys Pro Gln Cys Pro Gly Pro His Gln Tyr Pro Pro Leu Ile Pro

325 330 335

ccg ccg acg tcg tcc ttc ttc gag acg tac ctc ggc cct tcg ccg acg 1056

Pro Pro Thr Ser Ser Phe Phe Glu Thr Tyr Leu Gly Pro Ser Pro Thr

340 345 350

ccg atg gca tcc gaa gga ggc gtc atg gcc ggc atg gcg ccg acg agc 1104

Pro Met Ala Ser Glu Gly Gly Val Met Ala Gly Met Ala Pro Thr Ser

355 360 365

acc ccg gcg gcg agc tcc ggc cct cct ccg gcc ggc cgg cac gtc gtc 1152

Thr Pro Ala Ala Ser Ser Gly Pro Pro Pro Ala Gly Arg His Val Val

370 375 380

ggc gac gtt ctt ggg gcg ttc gct ctc tgc ctc gtc ggc aac ctg ctg 1200

Gly Asp Val Leu Gly Ala Phe Ala Leu Cys Leu Val Gly Asn Leu Leu

385 390 395 400

tgg taa 1206

Trp

<210> 3

<211> 401

<212> PRT

<213> 水稻

<400> 3

Met Pro Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Ala Ala

1 5 10 15

Ala Val Ala Pro Ala Arg Ser Lys Ser Thr Leu Glu Ser Cys Ser Ser

20 25 30

Ser Thr Ala Cys Pro Ala Leu Leu Ser Tyr Thr Leu Tyr Ala Asp Leu

35 40 45

Lys Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Phe Ser Ala Asp Pro Leu Ala Ile

50 55 60

Leu Ala Ala Asn Ser Ile Asp Phe Ala Val Pro Asp Pro Ala Asp Arg

65 70 75 80

Ile Leu Pro Ala Gly Leu Pro Leu Arg Val Pro Val Pro Cys Ala Cys

85 90 95

Ser Asp Gly Ile Arg Arg Val Thr Thr Val Arg Tyr Val Ala Arg Pro

100 105 110

Gly Asp Thr Leu Ala Ser Val Ala Ser Ser Val Tyr Gly Gly Leu Thr

115 120 125

Thr Pro Asp Trp Ile Ser Asp Ser Asn Gly Ile Leu Gly Ala Lys Pro

130 135 140

Asp Ala Ala Val Asp Ala Gly Thr Thr Leu Phe Val Pro Leu His Cys

145 150 155 160

Ala Cys Phe Gly Gly Val Asp Asn Gly Leu Pro Ala Val Tyr Leu Thr

165 170 175

Tyr Val Ala Gly Lys Gly Asp Thr Val Ala Ala Val Ala Gln Arg Tyr

180 185 190

Arg Thr Thr Ala Thr Asp Leu Met Ser Val Asn Asp Met Ala Thr Pro

195 200 205

Glu Leu Ala Ala Gly Asp Ile Ile Val Val Pro Leu Pro Ala Cys Thr

210 215 220

Ser Ser Phe Pro Ala Phe Thr Ala Asp Tyr Gly Leu Ala Val Ala Asn

225 230 235 240

Gly Thr Tyr Ala Val Thr Ala Asn Arg Cys Val Gln Cys Ser Cys Gly

245 250 255

Pro Gly Asn Leu Asp Leu Phe Cys Val Pro Ala Pro Leu Ala Asp Ser

260 265 270

Thr Cys Ser Ser Met Gln Cys Ala Asn Ser Ser Met Met Leu Gly Asn

275 280 285

Phe Thr Leu Leu Met Thr Ser Ser Gly Cys Ser Val Thr Ser Cys Ser

290 295 300

Tyr Gly Gly Phe Val Asn Gly Thr Ile Leu Thr Thr Leu Thr Thr Ala

305 310 315 320

Leu Lys Pro Gln Cys Pro Gly Pro His Gln Tyr Pro Pro Leu Ile Pro

325 330 335

Pro Pro Thr Ser Ser Phe Phe Glu Thr Tyr Leu Gly Pro Ser Pro Thr

340 345 350

Pro Met Ala Ser Glu Gly Gly Val Met Ala Gly Met Ala Pro Thr Ser

355 360 365

Thr Pro Ala Ala Ser Ser Gly Pro Pro Pro Ala Gly Arg His Val Val

370 375 380

Gly Asp Val Leu Gly Ala Phe Ala Leu Cys Leu Val Gly Asn Leu Leu

385 390 395 400

Trp

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 4

actaagctta tgccaccacc cttgctcctc ctc 33

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 5

agttctagat taccacagca ggttgccgac gag 33

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 6

tctaagcttc gaaggaggcg tcatg 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 7

atactgcagt gtgggtgccc taaaa 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 8

tctacgcgtc gaaggaggcg tcatg 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 9

tctacgcgtc gaaggaggcg tcatg 25

Claims

1.水稻抗病基因OsLYP4或其cDNA在培育抗病水稻中的应用，其中，抗病水稻为抗水稻白叶枯病、水稻细条病、水稻真菌稻瘟病水稻中的至少一种，水稻抗病基因OsLYP4的序列如SEQ ID NO：1所示，其cDNA序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种培育抗病水稻品种的方法，包括将水稻抗病基因OsLYP4或其cDNA转入水稻基因组中，并使其过表达；或将水稻抗病基因OsLYP4或其cDNA转入载体中，使用载体转染水稻细胞，并使水稻抗病基因OsLYP4或其cDNA过表达，其中，抗病水稻为抗水稻白叶枯病、水稻细条病、水稻真菌稻瘟病水稻中的至少一种，水稻抗病基因OsLYP4的序列如SEQ ID NO：1所示，其cDNA序列如SEQ ID NO：2所示。