CN103087929B - 内生真菌菌株s22及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种野生稻内生的真菌菌株的突变体S22，以及突变体S22在植物生长调节和/或促生上的用途，属于微生物及微生物应用领域。具体而言，本发明公开了一种内生真菌菌株S22，为稻链状瓶霉（Harpophora oryzae）R5-6-1-S22，其保藏号为：CCTCC NO: M 2012315。该内生真菌菌株S22的用途为：用于促进植物生长；植物包括水稻或大麦。
Description
技术领域
本发明涉及一种野生稻内生的真菌菌株的突变体S22，以及其在植物生长调节和/或促生上的用途，属于微生物及微生物应用领域。
背景技术
内生真菌（endophytic fungi）即至少生活史的一部分能侵染定殖在健康植物组织中，宿主无明显病症的一类真菌（Petrini，1991；Wilson，1995），与菌根真菌只存在于植物根系不同，内生真菌在植株的地下和地上部分的任何组织器官都能存在（Faeth & Fagan, 2002）。内生真菌通常与寄主植物形成互惠共生关系，一方面内生真菌从寄主植物中获取生长所需的养分，另一方面内生真菌可以促进植物生长，增强寄主植物的抗生物和非生物胁迫的能力。目前研究较多的是根瘤共生体和菌根共生体，内生真菌与植物的共生体是高等植物与微生物共生关系的又一种表现形式。内生真菌与植物的互作研究已日益受到研究者的关注，并成为内生真菌研究领域的国际热点。
内生真菌—植物共生是双方相互适应的结果，两者处在一种动态平衡中。在内生真菌一植物共生互作中，内生真菌和植物的基因表达谱发生明显的变化，而且其表达谱依赖于所接种的内生真菌种类；基因表达的改变表明内生真菌和植物之间存在着信息的交流（Bailey etal., 2006）。
活性氧（reactive oxygen species, ROS）是植物和微生物互作中一种非常重要的信号传导机制。NADPH氧化酶（NADPH oxidase, Nox）将NADPH的电子转移到电子受体上，导致活性氧的形成。随着Nox家族成员的发现，认识到活性氧的产生过程是一个普遍存在的控制各种分化过程的信号途径，其中包括细胞的繁殖、凋亡、激素反应、程序化死亡、根毛生长、孢子萌发等过程。在系统性种子垂直传播的麦角菌类内生真菌羊茅香柱菌（Epichlo? festucae）和多年生黑麦草（Lolium perenne）的共生关系中，内生真菌菌丝呈高度局限性生长模式，定殖在寄主植物地上部分的细胞间隙中，沿平行于叶轴的方向生长，几乎不分枝。羊茅香柱菌NoxA突变体与寄主植物形成敌对互作关系，突变体在植物体内生物量显著增加，菌丝形态发生变化，并呈辐射状生长；接种突变体的植株丧失顶端优势、生长严重钝化、早熟衰老，最后死亡。另一个Nox基因—NoxB对羊茅香柱菌的定殖和共生关系的建立没有影响。当Nox复合体（包括NoxA、NoxR和RacA）产生的活性氧紊乱时，共生互作关系瓦解，植物与内生真菌的关系将会由互惠共生变为敌对。因此，内生真菌NoxA产生的活性氧对其在植物体内的生长与生物量的变化具有调节作用，并对共生关系的维持起到至关重要的作用。（Tanaka et al., 2006; Eaton et al., 2011）。
另外，许多微生物能利用非核糖体肽合成酶（Nonribosomal peptide synthetase， NRPS）合成结构复杂、种类繁多的生物活性肽，被用作抗生素、免疫抑制剂、抗癌和抗病毒因子、铁载体及生物表面活性剂等。在黑麦草内生真菌中克隆到一个编码NRPS的基因sidN，该基因参与合成铁载体；sidN的突变体导致不能正常合成铁载体，内生真菌分泌铁载体能力的缺失改变了共生体铁离子的动态平衡，导致细胞间隙游离铁离子增加，通过芬顿反应（Fenton reaction）引起活性氧水平的增加，最终共生关系由互惠性向拮抗性转化，导致植物的病变坏死（Eaton et al., 2011）。
另一个重要的信号转导途径是由环境胁迫引起的促分裂素原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinases, MAP激酶，MAPK）途径。MAPK途径对许多致病真菌的毒力具有重要的作用。羊茅香柱菌sakA基因编码MAPK，并在植物-内生真菌共生关系中展现出必不可少的作用。sakA基因的缺失决定真菌与寄主植物之间的互作关系由共生变为致病。将sakA缺失突变体接种到植物上，植物表现出顶端优势的丧失、早熟衰老以及植株发展过程中的巨大变化，包括分蘖基部类似鳞茎结构的形成与花青素的丧失（Eaton et al., 2008）。
内生真菌还通过诱导寄主植物产生诱导抗性，从而提高植物抗生物（病原菌、食草动物等）和非生物（盐、干旱、高温等）胁迫的能力。病程相关基因非表达子1（Nonexpressor of pathogenesis-related genes 1, NPR1）是系统获得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）途径中的关键调控基因，其功能定位在SAR信号转导级联反应中的水杨酸（salicylic acid, SA）积累和随后的SAR基因表达之间。NPR1基因最早从模式植物拟南芥中克隆得到。NPR1本身没有抑菌活性，但它能诱发植物体内的多种防卫反应，且对病原菌没有严格的种属专一性。印度梨形孢（Piriformospora indica）诱导拟南芥的系统抗性需要茉莉酸信号传递及在细胞质中的NPR1。
植物—内生真菌共生体是继豆科植物—根瘤共生体、菌根共生体后发现的高等植物与微生物共生关系的又一种表现形式。但从研究的深度和广度来看，与豆科植物—根瘤共生体、菌根共生体相比，植物—内生真菌共生体的研究才刚处于基础探索阶段。目前植物—内生真菌的互作研究已日益受到研究者的关注，并成为内生真菌研究领域的国际热点。
内生真菌—寄主植物共生是双方相互适应的结果，两者处在一种动态平衡中。在印度梨形孢与拟南芥共生体系中，拟南芥根部细胞内质网中存在的β-葡萄糖苷酶（PYK10）能限制内生真菌印度梨形孢的侵入定殖，从而抑制过强的防御反应，有利于两者的互惠共生（Sherameti et al., 2008b）；在印度梨形孢与大麦共生体系中，内生真菌侵染根系后能削弱HvBI-1基因的表达，HvBI-1基因的过表达反而能限制菌丝的侵染强度。HvBI-1基因在真核生物中很保守，能抑制细胞程序性死亡，这表明内生真菌菌丝在寄主体内的生长和繁殖需要植物组织细胞一定程度的死亡（Deshmukh etal., 2006），最终两者达到平衡状态。另外在植物—病原真菌互作研究中，已经发现病原真菌菌丝的程序性死亡（programmed celldeath）或自噬（autophagy）对于其成功侵染组织是必需的（Veneault-Fourrey et al., 2006），但在内生真菌-植物互作中，内生真菌中是否也存在着类似的反应机制到目前为止还没有涉及。
植物根瘤菌(RN)与菌根真菌(AM)共生体系是植物-内生菌共生体系中普遍存在且最为突出的模式体系，为研究植物-暗色有隔内生真菌互作的分子机制提供基础模型。在豆科植物白脉根和苜蓿共生体中发现了大量共生必须的基因。目前已从各种共生突变体中克隆得到26个基因，这些基因参与根瘤菌的识别、早期的共生信号级联反应、根部侵染与定殖、根瘤的形成以及固氮调节。这些发现为更好地了解植物-暗色有隔内生真菌共生的分子机制和进化提供重要的线索（Johnson etal., 2008）。CSP(common symbiosis pathway公共共生途径)普遍存在于共生系统中。Ca离子信号途径是建立内共生体系的重要途径。CSP参与Ca离子信号的编码与解码，从而影响AM共生体系的建立。目前，有7个基因SYMRK、CASTOR、POLLUX、NUP133、NUP85、CCaMK和CYCLOPS已经被报道为CSP基因。目前已证实水稻有三个CSP直系同源基因:OsCASTOR、OsPOLLUX 和 OsCCaMK。其中，OsPOLLUX 和 OsCCaMK是水稻AM共生体必不可少的调控因子。在AM和RN共生系统中，OsCASTOR和OsCCaMK是维持CSP功能的分子基础。SYMRK和富含亮氨酸的重复区域（LRR）共同编码蛋白激酶（Johnson et al., 2008）。另外，SYMRK还可以通过激活由磷酸化调控的蛋白激酶参与Ca离子信号的形成，调节共生系统中的信号传导。OsCASTOR与OsPOLLUX是跨膜通道蛋白（Deshmukh et al., 2006），在共生体中对信号转导也发挥作用。在信号途径初期，许多定位在细胞核上的蛋白，比如核孔蛋白NUP85、NUP133，参与Ca离子信号诱导因子的运输与定位。
CCaMK(钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶)可能是Ca离子信号的解码器，影响菌根真菌的侵染。CYCLOPS/IPD3也是Ca离子信号途径的下游调控蛋白，与CCaMK协同作用。当CCaMK引起磷酸化时，CYCLOPS激活Ca离子信号途径下游基因，从而使菌根真菌和根瘤菌成功侵染寄主。研究证明，水稻拥有所有CSP直系同源基因。其中，水稻OsCASTOR、OsCCaMK、OsCYCLOPS、OsPOLLUX和OsCCaMK在水稻AM共生体中也起到至关重要的调控作用。用SYMRK/DMI2激酶筛选互作因子，结果从苜蓿中得到HMGR1，从白脉根中得到SIP。HMGR1编码甲瓦龙酸酯合成酶，而该酶参与异戊二烯化合物的合成。因此，HMGR1被认为参与根瘤菌的侵染与根瘤的形成。SIP是一类新的具有ARID(AT-rich domain)的DNA结合蛋白，专门结合NIN的启动子。在GRAS区域，翻译因子NSP1和NSP2在豆科植物RN共生体中是必须和专化的。除NSP1和NSP2外，翻译因子NIN，对根瘤菌侵染根表皮以及根皮层根瘤的形成有重要作用。在水稻中也找到了与NSP1、NSP2同源的OsNSP1、OsNSP2。在共生表型丧失的白脉根（模式豆科植物）NSP1-2缺失的突变体中，水稻OsNSP1、OsNSP2能够完全修复RN共生表型的缺失。CASTOR、POLLUX、CCaMK 和CYCLOPS在水稻中仍能找到同源物，在进化上相当保守并且在共生关系中具有无可替代的作用。许多编码GRAS蛋白的基因在AM共生体中上调。90年代初期，根瘤菌共生信号分子（NFs,Nod facters）的发现具有重大突破性，为随后更好地阐述Nod基因功能提供基础。NF受体拥有相同的结构，该结构是由胞外赖氨酸感应区域（LysM）的单通道跨膜区和胞内激酶区域共同组成。
LysM参与肽聚糖或类似结构分子的绑定，例如几丁质低聚糖。在LysM功能缺失的突变体中，植物对根瘤菌和NFs的侵入不产生任何反应(Hiroshi et al.,2010)。在白脉根中，NFR1和NFR5形成受体复合体，对根瘤菌分泌的NFs具有专化识别性。由于NFR5胞内区域缺少激酶活性，所以在将胞内信号传导给信号途径下游的过程中NFR1起到至关重要的作用。而且NFR1的激酶活性在激活下游共生信号途径中必不可少(T. Nakagawa, unpublished result)。全基因组序列分析表明：LysM-RK（LysM receptor-like kinases）基因家族可以通过基因串联和部分复制呈现多元化。这样就增加了由多个LysM-RK基因组成的复合体调节NF的感应和胞内信号传导的可能性，而不仅仅局限于NFR1和NFR5复合体。所以寄主植物识别NFs的确切机制有待进一步研究。目前,在水稻基因组中发现了6个LysM-RK基因。拟南芥中存在的几丁质受体CERK1，能够引起植物先天免疫力对抗真菌病原菌。CERK1也属于LysM-RK，尤其是在胞内激酶区域方面，CERK1与NFR1有高度相似性。基于结构上的相似性，NFR1也具有短暂激活抗性相关基因的作用(T.Nakagawa,unpublished results)。白脉根中来自根瘤菌的共生信号分子的感应是由两个LysM 激酶NFR1和NFR5调节的。这两个激酶在根瘤菌的侵染与根瘤的形成过程中必不可少。在内生羊茅香柱菌与寄主植物多年生黑麦草共生体中，菌丝呈高度局限性生长模式，定殖在寄主植物地上部分的细胞间隙中，沿平行于叶轴的方向生长，几乎不分枝。这种严格控制内生菌生长的现象说明寄主与共生体之间存在信号传导。
在共生体中，内生真菌在促进植物的生长和生物量提高的过程中，激素类物质起到非常重要的作用。其中，一类由植物根部分泌的新型内源植物激素-独角金萌发素内酯(Strigolactones)，可以促进真菌的代谢、分枝和孢子的萌发，改变真菌的生理机能和线粒体活性。同样地，真菌也释放信号分子，引起植物根部的共生专化型反应。植物根部的β-葡萄糖苷酸酶报告基因在真菌菌丝接近时被激活。微生物(例如内生真菌、内生细菌、根瘤菌等)通过诱导植物激素的产生或干扰植物激素合成途径，促进植物的生长和生物量的增加。尤其是细菌ACC脱羧酶通过调节植物体内的乙烯水平从而干涉寄主植物的生理功能。TAKAKAZU（2010）等从栽培稻茎部分离得到内生细菌，固氮螺菌Azospirillum sp.。通过对该细菌全基因组核苷酸序列分析，发现了2个激素相关基因。acdS基因，编码ACC脱羧酶。acdR基因，调节acdS的表达。固氮螺菌产生ACC脱羧酶，降低植物体内的乙烯含量，促进植物的生长，减弱环境胁迫的信号。acdS在以前的研究中从未报道过。
通过研究内生真菌突变体的功能，从而寻找相关关键基因，对研究内生真菌与植物的共生体系具有重大意义。水稻是我国最重要的粮食植物，内生真菌与水稻的共生体系，内生真菌突变体对水稻的致病力的研究，能够开发具有相应抗病性防御机制生物制剂，对提高栽培水稻生长，增加生物量，提高其在逆境中的生存能力方面的研究与利用具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种内生真菌的突变体菌株S22及其用途。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种内生真菌菌株S22，为稻链状瓶霉（Harpophora oryzae）R5-6-1-S22，其保藏号为：CCTCC NO:M 2012315。
本发明还同时提供了上述内生真菌菌株S22的用途：用于促进植物生长（对植物有促生作用）。
作为本发明的内生真菌菌株S22的用途的改进：植物为水稻或大麦。
本发明的内生真菌菌株S22为Harpophora oryzae R5-6-1-S22，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国 武汉 武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2012315，保藏时间2012年8月27日。
菌株Harpophora oryzae R5-6-1-S22来源于水稻的内生真菌稻镰状瓶霉的突变体，属于真菌界，子囊菌门，粪壳纲，有丝分裂真菌巨座壳科，瓶霉属。该菌株对植物有促生作用。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1：菌株（稻镰状瓶霉突变体菌株）Harpophora oryzae R5-6-1-SS1在CM培养基上25℃暗培养5d后的菌落形态；与野生型R5-6-1相比，R5-6-1-SS1气生菌丝更为稠密，菌落深灰色，菌落边缘不整齐并呈辐射状延伸，黑色素沉淀也明显增加。
图2：菌株Harpophora oryzae R5-6-1-SS1对水稻的致死作用：对照组1为空白对照，即没有接种的水稻苗，对照组2为接种R5-6-1的水稻苗，处理组为接种Harpophora oryzae R5-6-1-SS1的水稻苗。接种R5-6-1-SS1的处理组植株地上部组织枯萎死亡，而对照组1和2的植株长势良好；
图3：荧光显微镜下观察Harpophora oryzae R5-6-1-SS1在根部的定殖情况及对根系生长发育的影响；
A代表根毛区荧光显微镜图，
B代表根毛区光学显微镜图，
C代表根毛区横切面；
图4：Harpophora oryzae R5-6-1-SS1侵染大麦致病性实验；
图5：显微镜下观察接种Harpophora oryzae R5-6-1-SS1的大麦叶片的侵染定殖情况；
图6：显微镜下观察接种Harpophora oryzae R5-6-1-SS1的大麦叶片横切面的侵染定殖情况；
图7：菌株Harpophora oryzae R5-6-1-S22在CM培养基上25℃暗培养5d后的菌落形态；与野生型菌株R5-6-1相比，气生菌丝更为稀少，菌落白色，菌落边缘整齐并呈辐射状延伸，黑色素沉淀也明显减少，几乎没有；
图8：稻镰状瓶霉突变体菌株Harpophora oryzae R5-6-1-S22对水稻的促生作用：对照组1为空白对照，即没有接种的水稻苗，对照组2为接种R5-6-1的水稻苗，处理组为接种Harpophora oryzae R5-6-1-S22的水稻苗，结果显示处理组植株地上部组织生长旺盛，叶片宽度增加，叶绿素含量增加，比对照组1和2的植株长势好。
图9：荧光显微镜下观察Harpophora oryzae R5-6-1-S22在根部的定殖情况及对根系生长发育的影响；
A代表根毛区荧光显微镜图，
B代表根毛区光学显微镜图，
C代表根毛区横切面；
图10：菌株Harpophora oryzae R5-6-1-RR19在CM培养基上的菌落形态。
图11：稻镰状瓶霉突变体菌株Harpophora oryzae R5-6-1-RR19对水稻的致死作用：对照组1为空白对照，即没有接种的水稻苗，对照组2为接种R5-6-1的水稻苗，处理组为接种Harpophora oryzae R5-6-1-RR19的水稻苗。
图12：荧光显微镜下观察Harpophora oryzae R5-6-1-RR19在根部的定殖情况及对根系生长发育的影响；
A代表根毛区荧光显微镜图，
B代表根毛区光学显微镜图，
C代表根毛区横切面；
图13：Harpophora oryzae R5-6-1-RR19侵染大麦致病性实验；
图14：显微镜下观察Harpophora oryzae R5-6-1-RR19的侵染定殖情况；
A代表大麦叶片横切面的荧光显微镜图，
B代表侵染大麦叶片后的荧光显微镜图；
图15；菌株Harpophora oryzae R5-6-1-RR21在CM培养基上的菌落形态；
图16：稻镰状瓶霉突变体菌株Harpophora oryzae R5-6-1-RR21对水稻的致死作用：对照组1为空白对照，即没有接种的水稻苗，对照组2为接种R5-6-1的水稻苗，处理组为接种Harpophora oryzae R5-6-1-RR21的水稻苗。
图17：荧光显微镜下观察Harpophora oryzae R5-6-1-RR21在根部的定殖情况及对根系生长发育的影响；
图18：Harpophora oryzae R5-6-1-RR21侵染大麦致病性实验；
图19：显微镜下观察Harpophora oryzae R5-6-1-RR21的侵染定殖情况。
A代表大麦叶片横切面的荧光显微镜图，
B代表侵染大麦叶片后的荧光显微镜图。
具体实施方式
参照上述附图，对本发明的具体实施方式进行详细说明。
备注说明：下述所有的培养基使用前均需要按照常规方式进行高温高压的灭菌处理（121℃、0.24 MPa、20分钟）。
实施例1、内生真菌突变体菌株的获得：
野生型稻镰状瓶霉菌株编号为R5-6-1，分离自2007年野生稻根系。R5-6-1菌株保存在荷兰国际真菌保藏中心（编号：CBS125863）和中国普通微生物保藏中心（编号：CGMCC 2737）。
农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株AGL1及质粒pCAMBIA1300等常规物均为本实验室保存。农杆菌一般在28℃黑暗培养，生长的基本培养基为LB液体培养基，在4％的甘油中-70℃下保存。
CM（Complete Medium）培养基：20× Nitrate salts 50ml，1000×Trace Elements 1ml，D-glucose （葡萄糖）10g，Peptone （蛋白胨）2g，Yeast extract （酵母提取物）1g，Casamino acid （酪蛋白氨基酸）1g，1000×Vitamin solution 1ml，用1mol/L NaOH调pH值至6.5，加蒸馏水至1L。
CM固体培养基为上述CM（Complete Medium）培养基的基础上加入琼脂粉12g。
20× Nitrate salts（1000ml）的配置：NaNO3 120g，KCl 10.4g，MgSO4. 7H2O 10.4g，KH2PO4 30.4g，水定容至1L。
1000×Trace Elements（100ml）的配置：ZnSO4. 7H2O 2.2g，H3BO3 1.1g，MnCl2. 4H2O 0.5g，FeSO4. 7H2O 0.5g，CoCl2. 6H2O 0.17g，CuSO4. 5H2O 0.16g，Na2MoO4. 5H2O 0.15g，Na4EDTA 5g，水定容至100ml。
1000×Vitamin solution（100ml）的配置：Biotin 0.01g，Pyridoxin 0.01g，Thiamine 0.01g，Riboflavin 0.01g，PABA (p-aminobenzonic acid) 0.01g，Nicotinic acid 0.01g，水定容至100ml。
水琼脂培养基：蒸馏水加1.5%琼脂粉（即琼脂粉与蒸馏水的质量比为1.5：98.5）, 高压灭菌，用于单孢分离。
DCM（Defined Complex Medium）培养基: 用于转化子SUR抗性筛选，Yeast nitrogen base without amino acids(Difco) 1.7g，Asparagines 2g，NH4NO3 1g ，Glucose 10g，定容至1L，用Na2HPO4调pH至6.0。
LB液体培养基（Luria-Bertani）：Tryptone （胰蛋白胨）10g、Yeast extract （酵母提取物）5g、NaCl （氯化钠）10g，加去离子水至1000ml，用NaOH溶液调至pH7.5，高压灭菌。
LB固体培养基：Tryptone （胰蛋白胨）10g、Yeast extract （酵母提取物）5g、NaCl （氯化钠）10g、琼脂粉12g，加去离子水至1000ml，用NaOH溶液调至pH7.5，高压灭菌。
农杆菌诱导培养基AIM配方：0.8 ml 1.25 K-Phosphate-bufferpH 4.8 ( 用KH2PO4和K2HPO4配制)，20 ml MN-buffer (30 g/l MgSO4·7H2O, 15 g/l NaCl，1L H2O2)，1 ml 1% CaCl2·2H2O (w/v)，10 ml 0.01 % FeSO4 (w/v)，5 ml sporeelements (100 mg/l ZnSO4·7H2O, 100 mg/l CuSO4·5H2O,100 mg/l H3BO3, 100 mg/l Na2MoO4·2H2O，1L H2O2)（过滤灭菌），2.5 ml 20% NH4NO3 (w/v)，10 ml 50% glycerol(v/v)，40 ml 1 M MES pH 5.5 (用NaOH溶液调pH值)，20%glucose (w/v): 液体培养基中加10 ml，固体培养基加5 ml，加水至1L，固体培养基加1.5%琼脂粉，(200 mM AS-用二甲基亚砜DMSO配制)。
上述所有的培养基均需要进行高温高压的灭菌处理（121℃、0.24 MPa、20分钟）。
在实验室条件下，按照农杆菌AGL1的冻融法转化方法即可获得本发明的内生真菌突变体菌株，即稻镰状瓶霉突变体菌株。具体如下：
首先，农杆菌感受态制备：将构建好的荧光融合蛋白表达载体pKD6-GFP以及pKD5-RED（Li et al. 2012）通过冻融法转化到农杆菌菌株AGL1。
将农杆菌菌株在LB平板上活化，然后转到5mL LB液体培养基中28℃振荡过夜培养；转移2mL此培养液到装有50mL LB液体培养基的三角瓶中28℃振荡培养至OD600 0.5～1.0；冰上放置停止生长，4℃3000g离心5min；沉淀用1mL预冷的20 mM CaCl2溶液悬浮，分装到预冷却的Eppendorf离心管中，每管0.1mL；
加1μg 的载体（荧光融合蛋白表达载体pKD6-GFP或pKD5-RED）质粒DNA到上述离心管中，液氮中冷冻；37℃水浴5min解冻；加入1mLLB液体培养基，28℃轻摇培养2-4h；将培养好的菌液涂于含有卡那霉素（含50 μg/ml）的LB平板上，正面放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，28℃培养2-4d。
其次，稻镰状瓶霉的T-DNA转化：从上述培养的LB平板(含50 μg/ml卡那霉素)上挑选农杆菌单菌落接种于5ml LB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)，200rpm/min，28℃过夜培养；第二天将200-400 μl培养液转移到5ml含50μg/ml卡那霉素的诱导液体培养基（AIM）中，OD值约0.15，28℃培养5~6个小时使OD600达到0.5~0.6；用10ml灭菌蒸馏水从培养大约10天的CM平板上洗下稻镰状瓶霉野生型分生孢子，三层擦镜纸过滤后用血球计数板计数，并用无菌水稀释孢子浓度为106个/ml；取100 μl培养好的农杆菌AGL-1（含载体）菌液和100μl稀释好的稻镰状瓶霉分生孢子悬浮液混合，混合液（200 μl）均匀涂于AIM平板上的硝酸纤维素膜表面，AIM平板含200 μM 乙酰丁香酮（AS，acetosyringone）或不含AS作为对照，22℃共培养48小时；然后将硝酸纤维素膜转移到含氯嘧磺隆与抗生素的DCM选择平板上，选择性培养基中含300 μg/ml氯嘧磺隆（SUR）、400 μg/ml 头孢霉素（cefotaxime）、60 μg/ml 链霉素（streptomycin），将平皿置于28℃下培养到转化子出现。
本发明一共获得转化子87个，将其中4个（与野生型稻镰状瓶霉菌株编号为R5-6-1明显不同）进行保藏，具体如下：
菌株编号为Harpophora oryzae R5-6-1-SS1, 保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国 武汉 武汉大学 ，保藏编号：CCTCC NO:M 2012314，保藏时间2012年8月27日。
菌株编号为Harpophora oryzae R5-6-1-S22，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国 武汉 武汉大学 ，保藏编号：CCTCC NO:M 2012315，保藏时间2012年8月27日。
菌株编号为Harpophora oryzae R5-6-1-RR19, 保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国 武汉 武汉大学 ，保藏编号：CCTCC NO:M 2012312，保藏时间2012年8月27日。
菌株编号为Harpophora oryzae R5-6-1-RR21, 保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国 武汉 武汉大学 ，保藏编号：CCTCC NO:M 2012313，保藏时间2012年8月27日。
实施例2、稻镰状瓶霉突变体菌株Harpophora oryzae R5-6-1-SS1（CCTCC NO:M 2012314）的形态观察：
在CM培养基上观察该突变体菌株的菌落形态、颜色、生长速率、产孢量和黑色素沉淀。
观察结果（图1）显示：突变体菌株Harpophora oryzae R5-6-1-SS1在CM培养基上25℃暗培养5d后，菌落直径分别为5.8cm、5.5cm。与野生型菌株相比，气生菌丝更为稠密，菌落深灰色，菌落边缘不整齐并呈辐射状延伸，产孢量极显著提高，为3.92×109/皿，黑色素沉淀也明显增加。
实施例3、稻镰状瓶霉突变体菌株Harpophora oryzae R5-6-1-SS1（CCTCC NO:M 2012314）对水稻的致死作用：
MS培养基（1L）：硝酸钾 1900mg/L，硝酸铵 1650 mg/L，硫酸镁370 mg/L，磷酸二氢钾 170 mg/L，氯化钙 440 mg/L，硫酸锰22.3 mg/L，硫酸锌 8.6 mg/L，硼酸 6.2 mg/L，碘化钾 0.83mg/L，钼酸钠 0.25 mg/L，硫酸铜0.025 mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸亚铁27.8 mg/L，Na2EDTA37.3 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，盐酸硫胺素0.1 mg/L，盐酸吡哆醇0.5 mg/L，烟酸0.5 mg/L，肌醇100 mg/L，30g蔗糖，琼脂粉8g， H2O定容至1L；pH值5.8。
水稻种子（CO39）去壳，用75% 乙醇浸泡5 min，随后将种子放置在三角瓶中用1%的NaClO溶液表面消毒8-10 min（充分摇匀），最后用无菌水清洗多次后备用。将上述种子均匀平铺在预先准备的MS平板上，完毕后用Parafilm封口膜封住平皿，在25℃恒温培养箱培养（16h光照/8h 黑暗）。5天后将相对生长一致的无菌萌发种子移入1/2 MS（Murashige and Skoog 基本培养基）培养基的平板中（13cm×13cm），每板5棵苗，同时接入3块预先培养的R5-6-1-SS1菌饼（直径：0.5cm）。对照组1为不含菌株的CM琼脂块，对照组2为含R5-6-1菌株的CM琼脂块。设5个重复。共培养30天后，观察水稻苗的长势。
肉眼观察水稻苗的长势（图2），发现：接种Harpophora oryzae R5-6-1-SS1的处理组植株地上部组织枯萎死亡，而对照组1和2的植株长势良好。
荧光显微镜下观察Harpophora oryzae R5-6-1-SS1在根部的定殖情况及对根系生长发育的影响：观察结果（图3）发现：突变体菌丝集中分布于根毛区，尤其是根毛基部，菌丝密集，菌丝生物量多，且菌丝由皮层进入内皮层，最终侵染定殖于根系中柱细胞及维管组织。同时，被定殖的根部根毛弯曲变形，发育受限，长度变短，并出现暗褐色的病斑。与野生型菌株只定殖于表皮与皮层的空间限制性定殖模式相比，致病型菌株能够侵染定殖根部的维管组织，呈非限制性的激增型生长。
实施例4、稻镰状瓶霉突变体菌株Harpophora oryzaeR5-6-1-SS1（CCTCC NO:M 2012314）对大麦叶片的侵染致病性：
大麦（ZJ-8）光/暗育苗6d，剪取表面无损的第一片叶，用于接种试验。25℃，在CM固体培养基上暗培养稻镰状瓶霉野生型R5-6-1及突变体菌株R5-6-1-SS1，10天后用0.8cm口径的打孔器打取菌饼，将菌饼接种于离体的大麦叶片上，每片叶3个菌饼，3个重复，25℃，12/12h光/暗保湿培养，4d后观察并记录发病情况，试验重复3次。
结果（图4）发现：R5-6-1-SS1对大麦叶片造成严重的危害，具有非常强的致病性，接种处产生面积较大的扩散性黑色病斑，而且病斑会快速沿着叶脉扩散至周围的健康区域，病斑中央区域逐渐腐烂，并存在着大量的菌丝；相比之下，野生型菌株并未形成病斑，无侵染致病性。
用显微镜检测接种过的大麦叶片，观察菌株的侵染定殖情况。结果发现：R5-6-1-SS1可以在叶片表面形成大量的深褐色的附着胞（图5），附着胞继而形成侵染菌丝直接侵染寄主的表皮及皮下细胞，最终定殖在叶脉的维管组织中，通过叶脉扩散至周边部位，被定殖的叶片细胞及维管束细胞死亡（图6）。
实施例5、稻镰状瓶霉突变体菌株Harpophora oryzaeR5-6-1-S22（CCTCC NO:M 2012315）的形态观察：
在CM培养基上观察突变体菌株的菌落形态、颜色、生长速率、产孢量和黑色素沉淀。观察结果（图7）显示：突变体菌株在CM培养基上25℃暗培养5d后，菌落直径分别为2.8cm、2.5cm。与野生型菌株相比，气生菌丝更为稀少，菌落白色，菌落边缘整齐并呈辐射状延伸，产孢量极显著提高，为3.34×109/皿，黑色素沉淀也明显减少，几乎没有。
实施例6、稻镰状瓶霉突变体菌株Harpophora oryzaeR5-6-1-S22（CCTCC NO:M 2012315）对水稻的促生作用：
方法参照实施例3。
5天后将相对生长一致的无菌萌发种子移入1/2 MS（Murashige andSkoog 基本培养基）培养基的平板中（13cm×13cm），每板5棵苗，同时接入3块预先培养的R5-6-1-S22菌饼（直径：0.5cm），对照组1为不含菌株的CM琼脂块，对照组2为含野生型R5-6-1菌株的CM琼脂块。设5个重复。共培养30天后，观察水稻苗的长势。
肉眼观察水稻苗的长势（图8），发现：接种Harpophora oryzaeR5-6-1-S22的处理组植株地上部组织生长旺盛，相对于对照组1，叶片宽度增加了39.7%，叶绿素含量增加了88.2%，相比于对照组2，叶片宽度增加了10.5%，叶绿素含量增加了28%。说明：Harpophora oryzaeR5-6-1-S22比野生型菌株的促生作用更为显著。
荧光显微镜下观察Harpophora oryzaeR5-6-1-S22在根部的定殖情况及对根系生长发育的影响：观察结果（图9）发现：菌丝主要均匀地分布定殖在根系表面，根毛区略多，促进根毛的生长，无致病性。绝大部分的菌丝聚集在根围附近，只定殖于表皮层及外皮层，不侵染内皮层和中柱细胞。Harpophora oryzaeR5-6-1-S22只限于根际周围及跟表皮和外表皮层的定殖模式，以及促进寄主生长的特性，其更类似于土壤中的菌根真菌和豆科植物的固氮类真菌，围绕在根际周围促进根系的营养吸收，增加吸收面积，从而利于植物的生长。
实施例7、稻镰状瓶霉突变体菌株Harpophora oryzae R5-6-1-RR19（ CCTCC NO:M 2012312）的形态观察：
在CM培养基上观察突变体菌株的菌落形态、颜色、生长速率、产孢量和黑色素沉淀。
观察结果（图10）显示：突变体菌株Harpophora oryzae R5-6-1-RR19在CM培养基上25℃暗培养5d后，菌落直径分别为4.5cm、4.3cm。与野生型菌株相比，气生菌丝更为稠密，菌落深灰色，菌落边缘不整齐并呈辐射状延伸，产孢量极显著提高，为3.94×109/皿，黑色素沉淀也明显增加。
实施例8、稻镰状瓶霉突变体菌株Harpophora oryzaeR5-6-1-RR19（CCTCC NO:M 2012312）对水稻的致死作用：
方法参照实施例3。
5天后将相对生长一致的无菌萌发种子移入1/2 MS（Murashige andSkoog 基本培养基）培养基的平板中（13cm×13cm），每板5棵苗，同时接入3块预先培养的R5-6-1-RR19菌饼（直径：0.5cm），对照组1为不含菌株的CM琼脂块，对照组2为含R5-6-1菌株的CM琼脂块。设5个重复。共培养30天后，观察水稻苗的长势。
肉眼观察水稻苗的长势（图11），发现：接种Harpophora oryzaeR5-6-1-RR19的处理组植株地上部组织枯萎死亡，而对照组1和2的植株长势良好。
荧光显微镜下观察Harpophora oryzae R5-6-1-RR19在根部的定殖情况及对根系生长发育的影响：观察结果（图12）发现：突变体菌丝集中分布于根毛区，尤其是根毛基部，菌丝密集，菌丝生物量多，且菌丝由皮层进入内皮层，最终侵染定殖于根系中柱细胞及维管组织。同时，被定殖的根部根毛弯曲变形，发育受限，长度变短，并出现暗褐色的病斑。与野生型菌株只定殖于表皮与皮层的空间限制性定殖模式相比，致病型菌株能够侵染定殖根部的维管组织，呈非限制性的激增型生长。
实施例9、稻镰状瓶霉突变体菌株Harpophora oryzae R5-6-1-RR19（ CCTCC NO:M 2012312）对大麦叶片的侵染致病性：
大麦（ZJ-8）光/暗育苗6d，剪取表面磨损的第一片叶，用于接种试验。25℃，在CM固体培养基上暗培养稻镰状瓶霉野生型R5-6-1及突变体菌株Harpophora oryzae R5-6-1-RR19，10天后用0.8cm口径的打孔器打取菌饼，将菌饼接种于离体的大麦叶片上，每片叶3个菌饼，3个重复，25℃，12/12h光/暗保湿培养，4d后观察并记录发病情况，试验重复3次。
结果（图13）发现：Harpophora oryzae R5-6-1-RR19对大麦叶片造成严重的危害，具有非常强的致病性，接种处产生面积较大的扩散性黑色病斑，而且病斑会快速沿着叶脉扩散至周围的健康区域，病斑中央区域逐渐腐烂，并存在着大量的菌丝；相比之下，野生型菌株并未形成病斑，无侵染致病性。
用显微镜检测接种过的大麦叶片，观察菌株的侵染定殖情况。结果发现：Harpophora oryzae R5-6-1-RR19菌丝直接从叶片伤口处侵染表皮及皮下细胞，最终定殖在叶脉的维管组织中，通过叶脉扩散至周边部位，被定殖的叶片细胞及维管束细胞死亡（图14）。
实施例10、稻镰状瓶霉突变体菌株Harpophora oryzae R5-6-1-RR21（ CCTCC NO:M 2012313）的形态观察：
在CM培养基上观察突变体菌株的菌落形态、颜色、生长速率、产孢量和黑色素沉淀。
观察结果（图15）显示：Harpophora oryzae R5-6-1-RR21突变体菌株在CM培养基上25℃暗培养5d后，菌落直径分别为5.4cm、5.4cm。与野生型菌株相比，气生菌丝略微稠密，菌落灰白色，菌落边缘整齐并呈辐射状匍匐状延伸，产孢量为3.25×109/皿，黑色素沉淀也明显减少。
实施例11、稻镰状瓶霉突变体菌株Harpophora oryzae R5-6-1-RR21（ CCTCC NO:M 2012313）对水稻的致死作用：
方法参照实施例3。
5天后将相对生长一致的无菌萌发种子移入1/2 MS（Murashige andSkoog 基本培养基）培养基的平板中（13cm×13cm），每板5棵苗，同时接入3块预先培养的R5-6-1-RR21菌饼（直径：0.5cm），对照组1为不含菌株的CM琼脂块，对照组2为含R5-6-1菌株的CM琼脂块。设5个重复。共培养30天后，观察水稻苗的长势。
肉眼观察水稻苗的长势（图16），发现：接种Harpophora oryzaeR5-6-1-RR21的处理组植株地上部组织枯萎死亡，而对照组1和2的植株长势良好。
荧光显微镜下观察Harpophora oryzaeR5-6-1-RR21在根部的定殖情况及对根系生长发育的影响：观察结果（图17）发现：突变体菌丝由皮层进入内皮层，最终侵染定殖于根系中柱细胞及维管组织。与野生型菌株只定殖于表皮与皮层的空间限制性定殖模式相比，致病型菌株能够侵染定殖根部的维管组织，呈非限制性的激增型生长。
实施例12、稻镰状瓶霉突变体菌株Harpophora oryzae R5-6-1-RR21（ CCTCC NO:M 2012313）对大麦叶片的侵染致病性：
大麦（ZJ-8）光/暗育苗6d，剪取表面磨损的第一片叶，用于接种试验。25℃，在CM固体培养基上暗培养稻镰状瓶霉野生型R5-6-1及突变体菌株R5-6-1-RR21，10天后用0.8cm口径的打孔器打取菌饼，将菌饼接种于离体的大麦叶片上，每片叶3个菌饼，3个重复，25℃，12/12h光/暗保湿培养，4d后观察并记录发病情况，试验重复3次。
结果（图18）发现：Harpophora oryzae R5-6-1-RR21对大麦叶片造成较为严重的危害，具有较强的致病性，接种处产生面积较大的扩散性黑色病斑，而且病斑会快速沿着叶脉扩散至周围的健康区域，病斑中央区域逐渐腐烂，并存在着大量的菌丝；相比之下，野生型菌株并未形成病斑，无侵染致病性。
用显微镜检测接种过的大麦叶片，观察菌株的侵染定殖情况。结果发现：Harpophora oryzae R5-6-1-RR21菌丝直接侵染寄主的表皮及皮下细胞，最终定殖在叶脉的维管组织中，通过叶脉扩散至周边部位，被定殖的叶片细胞及维管束细胞死亡（图19）。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1.内生真菌菌株S22，其特征在于：为稻链状瓶霉（Harpophora oryzae）R5-6-1-S22，其保藏号为：CCTCC NO: M 2012315。
2.如权利要求1所述的内生真菌菌株S22的用途，其特征在于：用于促进植物生长。
3.根据权利要求2所述的内生真菌菌株S22的用途，其特征在于：所述植物为水稻或大麦。
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