JP2003505076A

JP2003505076A - Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａサイクリックヌクレオチドゲートイオンチャネル／ＤＮＤ遺伝子；植物の病害抵抗性および細胞死の調節因子

Info

Publication number: JP2003505076A
Application number: JP2001512865A
Authority: JP
Inventors: アンドリューエフ．ベント，; イ−チンユ，; スティーブンジェイ．クロフ，; ケビンエイ．フェングラー，; ロジャーケイ．ジュニアスミス，
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 1999-07-23
Filing date: 2000-07-24
Publication date: 2003-02-12
Also published as: AU6373300A; MXPA02000781A; WO2001007596A1; EP1196553A1; CA2378107A1

Abstract

(57)【要約】過敏感応答（ＨＲ）として公知の細胞死応答は、遺伝子対遺伝子の植物病害抵抗性の中心的特徴である。植物はまた、多重遺伝子的に制御される広範なスペクトルの防御応答（例えば、サリチル酸によって調節される防御応答）を通して、病原体に対して防御する。ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａのＤＮＤ（防御、不死）遺伝子座は、広範なウイルス、細菌、卵菌類および真菌の病原体に対する広範なスペクトルの病害抵抗性程度を調節する。ＤＮＤ１または２遺伝子の機能的コピーを欠く植物は、ＨＲ細胞死を欠損するが、首尾良い遺伝子対遺伝子病害抵抗性を示す。ＤＮＤ１または２遺伝子の機能的コピーを欠く植物はまた、広範なスペクトルの病害抵抗性表現型の増強を示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願の引用）本願は、１９９９年７月２３日付け出願の米国仮特許出願第６０／１４５，３
１０号からの優先権を主張する。

【０００２】（連邦政府研究支援の承認）米国政府は、米国国立衛生研究所助成金番号１−５−３３３４９および米国農
務省助成金番号１−５−２８６２９によって与えられた研究支援に基づき、本発
明において一定の権利を有する。

【０００３】（発明の背景）本発明は、植物病理学に関し、特に、植物病害に対する調節因子としてのサイ
クリックヌクレオチドゲートイオンチャネル遺伝子またはＤＮＤ（防御、不死（
Ｄｅｆｅｎｓｅ、ＮｏＤｅａｔｈ））遺伝子と称される植物遺伝子、および植
物病害を防除する方法に関する。

【０００４】多数の植物病害が、時の始まりから人類を悩ませてきた。多数の病害は、重大
な経済崩壊、個々の栽培者への実質的な作物損失、飢饉、そして分化全体の崩壊
さえも引き起こしてきた。植物病害は、各年、栽培作物植物の９０億米ドルを超
える収穫前損失を引き起こすと推定される。

【０００５】栽培者は現在、生殖質の選択（植物遺伝学）、適応性の植物栽培慣行、および
外因性殺虫剤処理の組み合わせによって植物病害を防除している。３つすべての
ストラテジーが、広範に使用されている。しかし、所定の作物および病害につい
ては、防除手段は、部分的にのみ有効であり得るか、もしくは入手可能であり得
ないか、または全く利用可能であり得ない。いくつかの場合では、栽培者は、病
害の問題が理由で、価値ある植物種の栽培を完全に避け、そして他の種の栽培へ
と移行する。

【０００６】遺伝子対遺伝子（Ｇｅｎｅ−ｆｏｒ−Ｇｅｎｅ）抵抗性は、作物植物について
の植物育種家によって広範に利用される植物病害抵抗性の形態である［ＭｃＩｎ
ｔｏｓｈ，Ｒ．Ａ．ら，（１９９５）ＷｈｅａｔＲｕｓｔｓ：ＡｎＡｔｌａ
ｓｏｆＲｅｓｉｓｔａｎｃｅＧｅｎｅｓＣｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈＳ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃａｎｄＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＲｅｓｅａｒｃｈＯｒ
ｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ，ａｎｄＫｌｕｗｅｒ，Ｄｏｒｄ
ｒｅｃｈｔ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；Ｃｒｕｔｅ，Ｉ．Ｒ．ら（１９
９６）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ８：１７４７−１７５５；Ａｇｒｉｏｓ，Ｇ．Ｎ
．（１９９７）ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ）；Ｂｅｎｔ，Ａ．Ｆ．（１９９６）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ８：１
７５７−１７７１］。名称「遺伝子対遺伝子」は、この抵抗性が、植物の病害抵
抗性遺伝子と病原体の非病原性遺伝子との間での一致した特異性に依存すること
を示す［Ｆｌｏｒ，Ｈ．Ｈ．（１９４１）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ３
２：６５３−６６９］。哺乳動物の抗体−抗原相互作用を思わせるプロセスにお
いて、これらの遺伝子は、複雑な防御応答を活性化するレセプター−リガンド相
互作用を制御する［Ｂｅｎｔ，（１９９６）前出；Ａｌｆａｎｏ，Ｊ．Ｒ．ら（
１９９６）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ８：１６８３−１６９８；Ｈａｍｍｏｎｄ−
Ｋｏｓａｃｋ，Ｋ．Ｅ．ら（１９９６）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ８：１７７３−
１７９１］。

【０００７】特定の真菌、細菌、ウイルス、または線虫の病原体株の認識を媒介する、数千
個もの抵抗性遺伝子が存在する。遺伝子対遺伝子相互作用後に誘発される強力な
防御応答としては、抗菌性の酵素および代謝産物の合成、隣接した細胞において
防御を活性化するシグナル伝達分子の生成、ならびに感染部位を取り囲む植物細
胞壁の強化が挙げられる［Ｂｅｎｔ，（１９９６）前出；Ｈａｍｍｏｎｄ−Ｋｏ
ｓａｃｋ，（１９９６）前出；Ｄａｎｇｌ，Ｊ．Ｌ．ら（１９９６）Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ８：１７９３−１８０７］。遺伝子対遺伝子防御の最も顕著な特徴
の１つは、病原体との最初の接触後数時間以内での感染した植物細胞の死（過敏
感応答（ＨＲ）として公知のプロセス）である［Ｓｔａｋｍａｎ，Ｅ．Ｃ．，（
１９１５）Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｒｅｓｄ．４：１９３−１９９；Ｇｏｏｄｍａｎ，
Ｒ．Ｎ．ら（１９９４）ＴｈｅＨｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅＲｅａｃｔｉ
ｏｎｉｎＰｌａｎｔｓｔｏＰａｔｈｏｇｅｎｓ：ＡＲｅｓｉｓｔａｎ
ｃｅＰｈｅｎｏｍｅｎｏｎ（Ａｍ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．Ｓｏｃ．，Ｓｔ
．Ｐａｕｌ）］。ＨＲ細胞死は、他の後生生物において生じるアポトーシス細胞
死プロセスの特徴を有する、プログラム細胞死応答である［Ｄａｎｇｌ，（１９
９６）前出］。ＨＲ細胞死は、遺伝子対遺伝子病害抵抗性の特質であるが、この
形態の病害抵抗性における細胞死の相対的重要性は不明であり、そして標的の病
原体種に大いに依存し得る［Ｈａｍｍｏｎｄ−Ｋｏｓａｃｋ，（１９９６）前出
；Ｄａｎｇｌ，（１９９６）前出；Ｓｔａｋｍａｎ，（１９１５）前出；Ｇｏｏ
ｄｍａｎ，（１９９４）前出］。

【０００８】複数の植物防御応答が、病原体感染に応答して活性化される［Ｂｅｎｔ，Ａ．
Ｆ．ら，（１９９９）ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＡｇｒｏｎｏｍｙ６６：２５
１−２９８；Ｄｉｘｏｎ，Ｒ．Ａ．ら（１９９０）Ａｄｖ．Ｇｅｎｅｔ．２８：
１６５−２３４；Ｒｙａｌｓ，Ｊ．Ｌ．ら（１９９６）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ
８：１８０９−１８１９；Ｈａｍｍｏｎｄ−Ｋｏｓａｃｋ（１９９６）前出］。
遺伝子対遺伝子系は、侵入する病原体の認識後に、植物防御の早期でかつ強力な
活性化を制御するが、同じ植物防御の多くは、より緩徐に活性化されるか、また
は他の形態の病害抵抗性においてより低い程度に活性化される。病害感受性の植
物でさえ、広範な種々の防御を活性化し、病害の進行をかなり遅らせる［Ｄｅｌ
ａｎｅｙ，Ｔ．Ｐ．ら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６：１２４７−１２５
０；Ｇｌａｚｅｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９９６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１４３：９
７３−９８２］。いくつかの防御応答は、特定の病原体に対して特に有効である
が、多くの植物種は、幾分一般的である多因性の防御を誘導する。これらの一般
的または「広スペクトル」な防御応答は、しばしば、広範な種々のウイルス、細
菌、および真菌の病原体に対して有効である［Ｂｅｎｔ，（１９９９）前出；Ｄ
ｉｘｏｎ，（１９９９）前出；Ｒｙａｌｓ，（１９９６）前出］。サリチル酸は
、植物防御の多様なセットの発現を促進する、重要な内因性メディエーターであ
ることが示されている［Ｄｅｌａｎｅｙ，（１９９６）前出；Ｇａｆｆｎｅｙ，
Ｔ．ら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１：７５４−７５６］。サリチル酸は
、有効な遺伝子対遺伝子抵抗性のために、他の局所的な防御応答のために、そし
て全身獲得抵抗性（ＳＡＲ）のために、必要とされ得る［Ｒｙａｌｓ，（１９９
６）前出］。明らかにサリチル酸とは独立した、他の防御経路（例えば、多くの
ジャスモン酸依存性防御応答）が同定されている［Ｐｅｎｎｉｎｃｋｘ，Ｉ．Ａ
．ら（１９９６）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ８：１８０９−１８１９］。多重遺伝
子的に制御される防御経路は、感染に対して重要な障壁を形成し、そして植物を
育種する試みは、しばしば、これらの「量的」な型の抵抗性の改良に精力を注い
でいる［Ａｇｒｉｏｓ，（１９９７）前出］。

【０００９】Ｙｕら［Ｙｕら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９５：７８１９−７８２４；Ｙｕら（２０００）Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃ
ｒｏｂｅＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ１３：２７７−２８６］は、非病原性Ｐ
．ｓｙｒｉｎｇａｅ病原体へのＨＲ応答を発生しない、２つのＡｒａｂｉｄｏｐ
ｓｉｓ変異体（ｄｎｄ１およびｄｎｄ２）を同定した。これらのｄｎｄ変異体は
、広範なＨＲ細胞死の非存在下において、遺伝子対遺伝子での病原体増殖の制限
を示し、そしてまた、構成的な全身獲得抵抗性表現型を示した。この全身獲得抵
抗性の構成的誘導は、より強力な遺伝子対遺伝子防御応答を増強するにおいて、
ＨＲ細胞死に代用し得る。

【００１０】分子生物学および遺伝子工学における進歩は、現在、重要な作物を、より良好
に病原体に対処するように仕立てることを可能にし、そして植物病害に対する損
失を減少させた。多くの主要作物種が、慣用的に形質転換され得、そして再生さ
れ得る［Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，（１９９６）ＴｒｅｎｄｓＰｌａｎｔＳｃｉ．
１：４２３−４３１］。しかし、この型の遺伝子工学は、関与する分子プロセス
の見識を必要とする。

【００１１】植物において病害を防除するためのより効率的な手段を開発するための基礎を
提供するために、本発明は、ＤＮＤ（防御、不死）１および２と称される、２つ
のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ遺伝子（これらは、推定サイクリックヌクレオチドゲ
ートイオンチャネルとして以前に文献において同定されていたタンパク質をコー
ドすることが、本明細書中で発見された；それぞれ、ＡｔＣＮＧＣ２およびＡｔ
ＣＮＧＣ１のｃＤＮＡ）によって例示される、植物遺伝子のクラスを記載する［
Ｋｏｈｌｅｒ，Ｃ．ら（１９９９）ＰｌａｎｔＪ．１８：９７−１０４；Ｋｏ
ｈｌｅｒ，Ｃ．ら（１９９８）；ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１１６：１６０
４；Ｌｅｎｇら（１９９９）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ１２１：７５３−７
６１］。従って、用語「ＤＮＤ１」および「ＤＮＤ２」は、本明細書中で使用さ
れる場合、それぞれ、ＡｔＣＮＧＣ２およびＡｔＣＮＧＣ１と同義であることが
意図される。しかし、他者によるＡｔＣＮＧＣ２およびＡｔＣＮＧＣ１に関する
この以前の研究においては、植物病害抵抗性とも、細胞死とも、関連する植物全
体の表現型とも、何ら関連付けがなされていなかったことに留意のこと。このＡ
ｔＣＮＧＣ／ＤＮＤ遺伝子は、病害抵抗性を調節する（すなわち、これらの遺伝
子の改変形態は、細胞死の非存在下において、広範なウイルス、細菌、および真
菌の病原体に対して増強された抵抗性をもたらす）。従って、これらの遺伝子お
よび他の関連の遺伝子の操作によって、改良された病害抵抗性を有する植物の作
製が可能となる。

【００１２】（発明の要旨）本発明の目的は、植物において病害抵抗性を改良する方法を提供することであ
る。本発明の第２の目的は、植物において細胞死を制御する方法を提供すること
である。本明細書中に記載されるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａの
植物遺伝子であるＤＮＤ（防御、不死）１および２は、植物において、広範なス
ペクトルの病害抵抗性および細胞死を調節する。本発明のＤＮＤ１遺伝子および
ＤＮＤ２遺伝子のヌクレオチドコード配列は、それぞれ、サイクリックヌクレオ
チドゲートイオンチャネル２（ＡｔＣＮＧＣ２）および１（ＡｔＣＮＧＣ１）と
して機能するタンパク質をコードする、以前に公知であったｃＤＮＡ分子と同一
である。このようなサイクリックヌクレオチドゲートイオンチャネルは、一般的
に、植物において遍在する。変異に起因してＡｔＣＮＧＣ／ＤＮＤ遺伝子を発現
しない植物は、広範なウイルス、細菌、および真菌の病原体に対する抵抗性の上
昇を示し、そしてまた、非病原性病原体に応答したＨＲ細胞死の減少、およびフ
モニシン（Ｆｕｍｏｎｉｓｉｎ）Ｂ１毒素によって誘導される細胞死の減少を示
す。従って、本発明は、ＡｔＣＮＧＣ２／ＤＮＤ１もしくはＡｔＣＮＧＣ１／Ｄ
ＮＤ２の遺伝子もしくは遺伝子産物、またはＡｔＣＮＧＣ２／ＤＮＤ１もしくは
ＡｔＣＮＧＣ１／ＤＮＤ２の遺伝子もしくは遺伝子産物と実質的な構造的類似性
もしくは機能的類似性を共有する、他の植物の遺伝子もしくは遺伝子産物を改変
することによって、病害抵抗性を改良する種々の方法を開示する。この改変の意
味には、転写または翻訳のダウンレギュレーション、変異（ヌクレオチドの置換
、欠失または挿入を含む）、遺伝子または遺伝子産物の不活性化、および遺伝子
産物の化学的阻害が含まれるが、これらに限定されない。これらの遺伝子はまた
、アンチセンス技術、センス鎖抑制（ｓｅｎｓｅ−ｓｔｒａｎｄｓｕｐｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ）、ウイルス誘導性ジーンサイレンシング、二本鎖ＲＮＡ、および当
該分野において公知の他の不活性化方法によって、ダウンレギュレートされ得る
か、または不活性化され得る。

【００１３】本発明はさらに、記載の方法によって作製される、形質転換または遺伝的に改
変された、植物、植物組織、または種子を含む。

【００１４】本発明は、他のＡｔＣＮＧＣ２／ＤＮＤ１関連病害抵抗性遺伝子もしくはＡｔ
ＣＮＧＣ１／ＤＮＤ２関連病害抵抗性遺伝子、またはそれらの構造的ホモログも
しくは機能的ホモログを同定する方法を開示する。このように同定されたＡｔＣ
ＮＧＣ２／ＤＮＤ１関連遺伝子もしくはＡｔＣＮＧＣ１／ＤＮＤ２関連遺伝子、
またはホモログ、あるいはそれらの遺伝子産物は、本明細書中に記載されるよう
に改変されて、病害抵抗性を改良され得る。これらの遺伝子および遺伝子産物を
、スクリーニングにおいて使用し、植物において病害抵抗性を増強するためのイ
ンヒビターを同定し得る。

【００１５】本発明はまた、植物育種の実施を首尾良く行うことを介して植物の病害抵抗性
を改良するための遺伝マーカーの使用を提供する。この遺伝マーカーは、ＡｔＣ
ＮＧＣ２／ＤＮＤ１もしくはＡｔＣＮＧＣ１／ＤＮＤ２に対するその類似性もし
くは密接した遺伝的近接性、またはＡｔＣＮＧＣ２／ＤＮＤ１もしくはＡｔＣＮ
ＧＣ１／ＤＮＤ２のホモログに対するその近接性が理由で同定される。

【００１６】病害抵抗性調節因子としてのＣＮＧＣ／ＤＮＤ遺伝子の同定によって、病害抵
抗性を示す際に病害抵抗性調節因子と相互作用する他の分子を同定するためのさ
らなる手段が提供される。この相互作用する他の分子としては、ＣＮＧＣ／ＤＮ
Ｄ遺伝子または遺伝子産物またはホモログと相互作用する、エフェクター遺伝子
またはタンパク質または化学薬品が挙げられる。

【００１７】本発明において開示される、植物における病害抵抗性を改良するための方法を
また使用して、病害で誘導される細胞死を制御し得る。従って、本発明は以下を
含む：植物のＣＮＧＣ／ＤＮＤ遺伝子または遺伝子産物を、ダウンレギュレーシ
ョンするか、変異させるか、または不活性化することによって、植物における細
胞死を制御する方法。詳細には、このような方法は、適切なＣＮＧＣ／ＤＮＤの
アンチセンスＤＮＡまたはセンスＤＮＡを使用して、ＣＮＧＣ／ＤＮＤ遺伝子を
不活性化する工程を包含し得る。従って、本発明は、ＤＮＤ１遺伝子もしくはＤ
ＮＤ２遺伝子、または他の植物種由来の類似した遺伝子のアンチセンスＤＮＡ分
子を含む。本発明はさらに、記載される方法によって作製されたか、または記載
されるアンチセンスＤＮＡもしくはセンスＤＮＡを発現するように形質転換され
た、形質転換または遺伝子改変された植物、植物組織または種子を含む。

【００１８】別の局面では、本発明は、植物のサイクリックヌクレオチドゲートイオンチャ
ネル遺伝子もしくは遺伝子産物、またはそれらのホモログを、ダウンレギュレー
ションするか、変異させるか、または不活性化することによって、植物の病原抵
抗性を改良する方法を提供する。同様に、本発明は、記載される方法によって作
製された、形質転換または遺伝子改変された植物、植物組織または種子を提供す
る。

【００１９】本発明はさらに、サイクリックヌクレオチドゲートイオンチャネル遺伝子（Ａ
ｔＣＮＧＣ２／ＤＮＤ１遺伝子およびＡｔＣＮＧＣ１／ＤＮＤ２遺伝子を含む）
についてスクリーニングすることによって、病害抵抗性遺伝子を同定する方法を
提供する。

【００２０】（発明の詳細な説明）本明細書中で使用される場合、以下の用語は、以下の通りに規定される：用語「ダウンレギュレーション」は、本明細書中で使用される場合、遺伝子産
物（ＲＮＡまたはタンパク質）のレベルを減少させる一般的方法をいう。従って
、遺伝子のダウンレギュレーションは、転写的または翻訳的のいずれかにより達
成され得る。例えば、アンチセンス分子が細胞または組織中に導入されて、アン
チセンス分子が由来する遺伝子をダウンレギュレーションし得る。

【００２１】用語「変異体」は、本明細書中で使用される場合、改変された核酸によってコ
ードされるタンパク質が変更されるような様式で、ヌクレオチドを欠失、置換、
または付加することによって作製された、核酸分子の天然のヌクレオチド配列の
改変体をいう。結果として生じるタンパク質は、しばしば、変更された機能を示
す。

【００２２】用語「アンチセンス分子」は、本明細書中で使用される場合、センス分子の相
補的ヌクレオチドからなる一本鎖核酸分子を意味することが意図される。センス
分子は、一般的に、タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列を有する、ＤＮＡまた
はＲＮＡの鎖をいう。

【００２３】用語「病害抵抗性」または「病原体抵抗性」は、本明細書中で使用される場合
、植物が、病原体の攻撃機能に応答して、その病原体の攻撃にも関わらず生存お
よび／または生産性を維持するその植物の能力を増強する、任意のプロセスをい
う。

【００２４】植物品種における「改良された抵抗性」は、当該分野で認められている判定基
準によって測定された場合に、その品種における病原体の攻撃に関連した損傷が
、コントロール品種と比較して減少されることを意味する。改良された抵抗性の
究極の目標は、コントロールと比較して、改良された抵抗性を有する品種から、
平均してより高い収量を与えることである。作物収量は、時間浪費的な圃場試行
を必要とするので、種々の研究室試験が、個々の植物における抵抗性を測定する
ために考案されており、このような試験は、病原体の存在下における改良された
収量の予測として、当該分野で認められている。これらの試験としては、感染植
物における病原体増殖の測定、壊死程度の測定、植物細胞死の測定、および過敏
感応答の測定が挙げられるが、これらに限定されない。このような測定は、制御
された条件、制御された病原体レベル、病原体導入のタイミング、温度、湿度な
どの下で実施され得るので、このような測定が一般的に好ましい。本明細書中に
記載される特定の実施形態では、病原体抵抗性は、病原体増殖の制限として測定
される（すなわち、接種された病原体（すなわち、Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ
．ｔｏｍａｔｏ）の増殖が、野生型と比較してｄｎｄ変異体において、より少な
い）。従って、本明細書中に記載される方法に従い、改良された病害抵抗性また
は改良された病原体抵抗性を示すように植物が改変される場合、所定の病原体に
対する同様の増殖制限により、究極的には、植物に対する損傷の減少、およびよ
り高い作物収量が生じることが理解される。

【００２５】用語「遺伝子」は、転写および翻訳に際して、タンパク質またはペプチドをコ
ードするデオキシ核酸分子をいう。従って、「遺伝子産物」は、本明細書中で使
用される場合、所定の遺伝子の発現によって生成されるＲＮＡ分子またはタンパ
ク質のいずれかをいう。

【００２６】「ＤＮＤ遺伝子」は、本明細書中で使用される場合、ＤＮＤ１、ＤＮＤ２、ま
たは他の遺伝子に対する構造的相同性を有する任意の遺伝子であって、その産物
が、インタクトなサイクリックヌクレオチドゲートイオンチャネル遺伝子または
変異したサイクリックヌクレオチドゲートイオンチャネル遺伝子の産物と密接に
類似し、そしてダウンレギュレーション、変異、または不活性化された場合に、
本発明に記載されるような改良された抵抗性または改良された細胞死特性を引き
起こす、遺伝子を意味することが意図される。従って、これには、Ａｒａｂｉｄ
ｏｐｓｉｓのＡｔＣＮＧＣ２／ＤＮＤ１遺伝子またはＡｔＣＮＧＣ１／ＤＮＤ２
遺伝子のみならず、本明細書中に開示されるＡｔＣＮＧＣ２／ＤＮＤ１遺伝子ま
たはＡｔＣＮＧＣ１／ＤＮＤ２遺伝子と構造的または機能的な相同性を有する他
の植物種の対応遺伝子または関連遺伝子をも含む。ＡｔＣＮＧＣ２／ＤＮＤ１ま
たはＡｔＣＮＧＣ１／ＤＮＤ２の改変体構造物が他の植物において存在し得るこ
と、そしてこのような改変体が、本明細書中に記載されるように、構造的相同性
によって、機能的相同性によって、もしくは遺伝分析における表現型の類似性に
よって、または前述の任意の組合せによって、同定され得ることが当該分野にお
いて理解される。

【００２７】「ホモログ」の意味は、本発明で使用される場合、遺伝子または遺伝子産物に
対して適切に、構造的または機能的な類似性を有する、任意の遺伝子または遺伝
子産物を含むことが意図される。従って、ＣＮＧＣ／ＤＮＤ遺伝子の構造的ホモ
ログは、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＡｔＣＮＧＣ２／ＤＮＤ１（配列番号２）ま
たはＣＮＧＣ１／ＤＮＤ２（配列番号５）のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡと、本
明細書中に規定されるレベルのハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシ
ーで、低いストリンジェンシーで、好ましくは、中程度のストリンジェンシーで
、またはより好ましくは、高いストリンジェンシーでハイブリダイズするものと
して規定される。２番目であり、かつ等しく正当な「ホモログ」の規定は、誘導
される翻訳産物のアミノ酸配列が、以前に特徴付けられたサイクリックヌクレオ
チドゲートイオンチャネル（顕著な６つの膜貫通ドメイン、第５膜貫通ドメイン
と第６膜貫通ドメインとの間の孔ドメイン（ｐｏｒｅｄｏｍａｉｎ）、および
細胞質サイクリックヌクレオチド相互作用ドメイン［ＺａｇｏｔｔａおよびＳｉ
ｅｇｅｌｂａｕｍ（１９９６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：２３
５−２６３；Ｋｏｈｌｅｒら（１９９９）前出］を含む）に対する有意な類似性
を有する遺伝子である。３番目であり、かつ等しく正当な「ホモログ」の規定と
して、ＤＮＤ遺伝子産物の機能的ホモログは、潜在的に機能し得るか、または病
害抵抗性調節因子または細胞死の調節因子としての機能に対する変異、ダウンレ
ギュレーション、または化学的阻害によって引き起こされ得る、サイクリックヌ
クレオチドゲートイオンチャネルタンパク質である。ＣＮＧＣ／ＤＮＤ遺伝子産
物の機能的ホモログは、改変に際して、病害抵抗性および／または細胞死の調節
因子として潜在的に機能するものである。

【００２８】本発明は、病害抵抗性および細胞死の調節因子として、２つの植物遺伝子、Ａ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａのＤＮＤ１およびＤＮＤ２を開示する
。変異したＤＮＤ１遺伝子またはＤＮＤ２遺伝子についてホモ接合性の植物は、
細胞死の不在下において、増強された病害抵抗性を示す。従って、ＤＮＤ１遺伝
子またはＤＮＤ２遺伝子の操作によって、種々の植物病害を防除する新たな可能
性が提供される。

【００２９】ＨＲ細胞死と、抵抗性遺伝子媒介防御シグナル伝達と、実際の病原体増殖制限
との間の関係に取り組むために、ＨＲを欠損するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈ
ａｌｉａｎａの変異体を単離し、そして特徴付けた。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
Ｃｏｌ−０株の変異誘発Ｍ₂集団（これは、ＲＰＳ２抵抗性遺伝子を発現する）
を、ＲＰＳ２相補的非病原性遺伝子ａｖｒＲＰ２［Ｋｕｎｋｅｌ，Ｂ．Ｎ．ら（
１９９３）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ５：８６５−８７５］を発現する細菌性の植
物病原体Ｐ．ｓｙｒｉｎｇｅｐｖ．ｇｌｙｃｉｎｉａ株を植物に接種すること
によってスクリーニングした。野生型ＨＲを受ける植物が、可視的な葉組織の崩
壊を示すように、極めて高力価の病原体（２×１０⁸ｃｆｕ／ｍｌ）を使用した
。

【００３０】このスクリーニングから単離された２つの変異体を、ｄｎｄ１およびｄｎｄ２
と呼んだ。これらの変異体は、いくつかの類似した表現型を示した；両方とも、
野生型に対して劣性であり、ホモ接合性の変異体植物は、非病原性Ｐ．ｓｙｒｉ
ｎｇｅに応答する細胞死程度の極度な減少を示し、そして矮性である。ｄｎｄ１
変異体およびｄｎｄ２変異体は、類似の様式において分析され、そして類似の変
異体表現型を示すことが見出されたので、以下の説明は、主に、ｄｎｄ１変異体
分析から抜粋される。しかし、これらの方法が、ｄｎｄ２変異体分析に対して容
易に適用可能であることは、当業者に容易に理解される。

【００３１】ｄｎｄ１変異体を、減少したロゼットサイズおよび明白なＨＲ^-表現型を示す
系統として、このスクリーニングから回収した。このｄｎｄ１変異体に由来する
後代系統は、ａｖｒＲｐｔ２を発現する病原体を接種された場合のみならず、非
病原性遺伝子であるａｖｒＲｐｍｌまたはａｖｒＢ（Ｋｕｎｋｅｌ，（１９９３
）前出；Ｂｉｓｇｒｏｖｅ，Ｓ．Ｒ．ら（１９９４）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ６
：９２７−９３３］を発現するＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅに対する応答においても、
ＨＲを生じることに失敗した。２つの別々の抵抗性遺伝子（ＲＰＳ２およびＲＰ
Ｍ１）は、これら３つの別々の非病原性遺伝子に対する応答性を制御する。従っ
て、ｄｎｄ１系統は、元々は異なる遺伝子対遺伝子シグナル伝達経路によって共
有される植物防御応答の共通の要素において破壊されていると推測される。

【００３２】ｄｎｄ１変異体における非病原性病原体に応答した過敏感細胞死の欠損を確認
するために、蛍光顕微鏡検査を使用して、接種した葉組織における細胞をモニタ
ーした［Ｋｌｅｍｅｎｔ，Ｚ．ら（１９９０）、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＰｈｙ
ｔｏｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、Ｋｌｅｍｅｎｔ，Ｚ．、Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｋ．
およびＳａｎｄｓ，Ｄ．Ｃ．編（Ｈ．Ｓｔｉｌｌｍａｎ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ）、
４６９−４７３頁］。ＨＲを受ける植物細胞は、細胞死に際してのフェノール化
合物の生成および放出に主に起因して、蛍光の著しい増加を示す。「低力価」実
験では、ａｖｒＲＰ２を発現するＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ．ｇｌｙｃｉｎｉ
ａを、約５×１０⁵ｃｆｕ／ｍｌの濃度（大半の植物細胞が、最初に病原体と接
触しない用量）で葉肉組織内に導入した。予期されたように、この用量で、ａｖ
ｒＲＰ２を発現するＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅに感染した野生型の親系統由来の葉は
、多数の隔離された自己蛍光細胞を含んだ。対照的に、同じ非病原性株を接種さ
れたｄｎｄ１葉では、ごくわずかの自己蛍光病巣が存在した。代わりに、ｄｎｄ
１葉は、接種されていない葉または非非病原性Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅコントロー
ルを接種された葉に類似した。

【００３３】親のＣｏｌ−０系統の葉に、極めて高力価の非病原性Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ（
２×１０⁸ｃｆｕ／ｍｌ）を接種した場合、予期された宿主細胞のコンフルエン
トな崩壊が観察された（図１）［Ｋｕｎｋｅｌ（１９９３）前出；Ｙｕ，Ｇ．−
Ｌ．ら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−ＭｉｃｒｏｂｅＩｎｔｅｒａｃｔ
６：４３４−４４３］。しかし、この高い病原体用量でさえ、ネガティブコント
ロールにおいて見られた上記の非常に少数の細胞死が、ｄｎｄ１植物において検
出された（図１）。死滅細胞または死滅しつつある細胞を染色するためにエバン
スブルーを使用した別の実験は、同様の結果を与えた。自己蛍光アッセイ方法は
、明瞭性がより優れていること、および困難な組織操作がより少ないことが理由
で好ましい。自己蛍光アッセイでは、ｄｎｄ１植物におけるＨＲ細胞死の欠損が
、複数の実験（２×１０⁹ｃｆｕ／ｍｌ程度に高い、初期細菌力価を用いた実験
を含む）において観察された。細胞死のわずかな増加が、２×１０⁸ｃｆｕ／ｍ
ｌの非病原性Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅを接種したｄｎｄ１葉の約５〜８％において
観察されたが、これは、接種組織の一部分を表す隔離された領域においてのみで
あった。これらの小さな領域における細胞死は、コンフルエントではなく、まだ
らであり、そして同様の細胞死の小斑は、非非病原性Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ株を
接種したコントロールＣｏｌ−０植物において、より低い頻度で観察され得た。
非病原性Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅによる細胞死の刺激は、大多数の接種ｄｎｄ１葉
においては検出され得なかった。

【００３４】Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｄｎｄ１変異体におけるＨＲの欠損が、病害抵抗性
の損失と相関するか否かを決定するために、植物におけるＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅ
ｐｖ．ｔｏｍａｔｏの増殖を、経時的に定量的にモニターした［Ｗｈａｌｅｎ
，Ｍ．ら（１９９１）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ３：４９−５９］。非病原性遺伝
子を発現する病原性株は、対応する抵抗性遺伝子を発現しない植物においては病
原性であるが、その増殖は、適切な抵抗性遺伝子を有する植物においては、著し
く減少される。図２Ａは、野生型ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＣｏｌ−０（ＲＰＳ
２／ＲＰＳ２）、機能的ＲＰＳ２を欠損するＣｏｌ−０株（ｒｐｓ２−２０１／
ｒｐｓ２−２０１）、およびＣｏｌ−０ｄｎｄ１変異体における、ａｖｒＲｐ
ｔ２を発現するＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ．ｔｏｍａｔｏの増殖を示す。ＨＲ
の欠損にも関わらず、ｄｎｄ１は、ａｖｒＲＰ２を発現するＰ．ｓｙｒｉｎｇａ
ｅの増殖を首尾良く制限するにおいて、野生型と非常に類似した。病原体増殖の
強力な非病原性および抵抗性遺伝子依存性の制限は、ａｖｒＲｐｍ１、ａｖｒＲ
ｐｓ４、またはａｖｒＢを発現するＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅを用いた定量的実験に
おいてもまた観察された（図２Ｂ）。これらの結果は、広範なＨＲ細胞死が、抵
抗性遺伝子／非病原性遺伝子依存性の植物病害抵抗性に常に必要とされるわけで
はないことを示す。

【００３５】ｄｎｄ１植物が、ＨＲの欠損にも関わらず、非病原性Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅに
対して抵抗性であることが確立されたので、病原性Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅに対す
るｄｎｄ１変異体の応答を試験した。図２Ｂは、野生型Ｃｏｌ−０植物およびＣ
ｏｌ−０ｄｎｄ１／ｄｎｄ１植物（白記号）における、病原性Ｐ．ｓｙｒｉｎ
ｇａｅｐｖ．ｔｏｍａｔｏＤＣ３０００株（ｐＶＳＰ６１）の増殖を示す。
この株は、Ｃｏｌ−０遺伝子型の植物において、遺伝子対遺伝子抵抗性を誘発し
ない［Ｋｕｎｋｅｌ（１９９３）前出；Ｗｈａｌｅｎ（１９９１）前出］が、こ
の病原体株の葉集団は、ｄｎｄ１変異体での実験において、１／１０〜１／１０
０に減少された。類似の結果が、複数の研究および病原性Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ
ｐｖ．ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ４３２６株での研究において得られた。ｄｎｄ
１植物は、病原性Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅに対する一定レベルの抵抗性を示した。
これは、全身獲得抵抗性、誘導性全身抵抗性、または他の形態の抵抗性遺伝子非
依存的病害抵抗性を示す植物に典型的である［Ｒｙａｌｓ，Ｊ．Ｌ．ら（１９９
６）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ８：１８０９−１８１９；Ｐｉｅｔｅｒｓｅ，Ｃ．
Ｍ．ら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−ＭｉｃｒｏｂｅＩｎｔｅｒａｃｔ
８：１２２５−１２３７］。この広範なスペクトルの抵抗性表現型は、試験され
たすべての場合において、他のｄｎｄ１変異体の表現型と同時分離した。

【００３６】留意すべきに重要なことには、図２Ｂはまた、ａｖｒＲｐｍ１を発現しないＰ
．ｓｙｒｉｎｇａｅ（黒記号）の集団の増殖が、病原性病原体株の増殖よりもは
るかに高い程度に制限されることを示した。他の病原性Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ
ＤＣ３００株または４３２６株が、非病原性遺伝子であるａｖｒＲｐｍ１または
ａｖｒＲｐｔ２を発現した場合、病原体増殖の１／１，０００〜１／１０，００
０の減少が観察された（図２Ｂ）。これらの実験によって、遺伝子対遺伝子抵抗
性が、ｄｎｄ１植物において、より弱い抵抗性遺伝子非依存的抵抗性に加えて誘
導され得ることが実証された。

【００３７】ｄｎｄ１変異体における、病原性病原体に対するより低いレベルの抵抗性の程
度を試験するために、植物に、他の病原体種の病原性株を接種した（Ｌｅｅ，Ｊ
．−Ｍ．ら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−ＭｉｃｒｏｂｅＩｎｔｅｒａｃ
ｔ．９：７２９−７３５；Ｂｅｎｔ，Ａ．ら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−
ＭｉｃｒｏｂｅＩｎｔｅｒａｃｔ５：３７２−３７８；Ｐａｒｋｅｒ，Ｊ．
Ｅ．ら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−ＭｉｃｒｏｂｅＩｎｔｅｒａｃｔ
６：２１６−２２４；Ｐａｒｋｅｒ，Ｊ．Ｅ．ら（１９９７）ＰｌａｎｔＣｅ
ｌｌ９：８７９−８９４］。タバコ輪点ウイルスは、野生型Ｃｏｌ−０につい
ての７１％とは対照的に、わずか９％のｄｎｄ１植物において全身的に伝播した
。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉ
ｓおよびＸ．ｃ．ｐｖ．ｒａｐｈａｎｉ（細菌）は、Ｃｏｌ−０において生成さ
れた壊死病斑ではなく、ｄｎｄ１において中程度の黄化を生ずるのみであった。
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａ（卵菌類）は、Ｃｏｌ−０とは
対照的に、ｄｎｄ１において、１／３倍の少ない胞子を生成した［３．０±２．
２対１０．７±３，１平均±ＳＥ（１葉あたり（胞子×１０³）の場合）
］。病原性Ｐ．ｐａｒａｓｉｔｉｃａに感染した葉の顕微鏡検査によって、菌糸
増殖の制限が、ＨＲ様の宿主細胞壊死または自己蛍光とは関係しないことが確認
された。接種の３日後、病原性Ｐ．ｐａｒａｓｉｔｉｃａＮｏｃｏ２株の菌糸
は、代表的に、ｄｎｄ１植物の２〜１０個の宿主細胞において吸器を形成したが
、野生型Ｃｏｌ−０植物では、代表的な菌糸は広範に分枝し、そして１５〜３０
個の宿主細胞において吸器を形成した。ｄｎｄ１植物におけるＥｒｙｓｉｐｈｅ
ｏｒｏｎｔｉｉ（真菌）の増殖の有意な減少もまた観察された。

【００３８】構成的に上昇した広範なスペクトルの抵抗性が、多くの状況において（例えば
、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのｃｐｒ，ｃｉｍ，ｌｓｄ，およびａｃｄ変異体［Ｄ
ａｎｇｌ（１９９６）前出］において、異種Ｎｉｃｏｔｉａｎａ種間の交雑に由
来するハイブリッドタバコ系統［ＡｈｌＧｏｙら（１９９２）Ｐｈｙｓｉｏｌ
．Ｍｏｌ．ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌ．４１：１１−２１］において、および、
先の病原体感染またはサリチル酸もしくは合成サリチル酸模擬体での処理に応答
して全身獲得抵抗性を発現する植物［Ｒｙａｌｓ（１９９６）前出］において）
、以前に観察されている。抵抗性の上昇は、しばしば、感染特異的（ＰＲ）遺伝
子の発現増加と関係し［Ｒｙａｌｓ（１９９６）前出］、そして接種していない
ｄｎｄ１植物の試験によって、ＰＲ遺伝子であるβ−グルカナーゼおよびＰＲ−
１の構成的な発現増加が明らかとなった（図３Ａおよび３Ｂ）［Ｃａｏ，Ｈ．ら
（１９９４）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ６：１５８３−１５９２；Ａｕｓｕｂｅｌ
，Ｆ．Ｍ．ら（１９９７）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓＩｎＭｏｌ
ｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ）］。病原性Ｐ
．ｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ．ｔｏｍａｔｏによって感染された植物は、β−グル
カナーゼまたはＰＲ−１のｍＲＮＡレベルの上昇を示したが、ａｖｒＲｐ２を発
現する非病原性Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅでのｄｎｄ１または野生型Ｃｏｌ−０の接
種によって、ＰＲ−１ｍＲＮＡのさらにより高い上昇を引き起こした（図３Ｃ
）（２５，３３）。類似の結果またはより明白な結果が、完全に別個の実験にお
いて調製され、ブロットされ、そして探索された４つの異なるＲＮＡセットで得
られた。これらの結果は、遺伝子発現のレベルで、遺伝子対遺伝子シグナル伝達
および防御応答の活性化が、ｄｎｄ１植物において機能し、そして構成的な広域
スペクトルの抵抗性に加えて誘導可能であることを実証する。

【００３９】増強されたＰＲ遺伝子発現および広域スペクトルの抵抗性は、内因性または適
用されたサリチル酸化合物レベルの上昇によって誘導され得る［Ｒｙａｌｓ，１
９９６）前出］。本発明者らは、ｄｎｄ１植物において、遊離サリチル酸および
グルコシド結合体化サリチル酸塩の両方の構成的なレベル上昇を観察した（図４
）。サリチル酸塩は、ｄｎｄ１植物において高められた抵抗性の主要なメディエ
ーターである可能性があるが、ｄｎｄ１変異が、サリチル酸塩の上昇を引き起こ
す機構は、依然として発見されていない。

【００４０】ＨＲ細胞死を伴わずに遺伝子対遺伝子病害抵抗性を示す植物変異体は、一般的
ではない。しかし、構成的に上昇した抵抗性を示す、他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓ変異体が単離されている（例えば、ｃｐｒ，ｃｉｍ，ｌｓｄ，およびａｃｄ変
異体［Ｄａｎｇｌ（１９９６）前出；Ｂｏｗｌｉｎｇ，Ｓ．Ａ．ら（１９９７）
ＰｌａｎｔＣｅｌｌ９：１５７３−１５８４；Ｂｏｗｌｉｎｇ，Ｓ．Ａ．ら
（１９９４）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ６：１８４５−１８５７；Ｌａｗｔｏｎ，
Ｋ．ら（１９９３），ＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＤｅｆｅｎｃｅＲｅｓｐ
ｏｎｓｅｓｉｎＰｌａｎｔｓ．Ｆｒｉｔｉｇ，Ｂ．およびＬｅｇｒａｎｄ，
Ｍ．編（Ｋｌｕｗｅｒ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
），４２２−４３２頁］）。従って、ｄｎｄ１植物を、多くのこれらの系統と比
較した。ａｃｄおよびｌｓｄ変異体とは対照的に、ｄｎｄ１変異体では、接種し
ていない植物由来の葉組織を、裸眼によって、Ｙｕ（１９９３）前出に記載され
たような自己蛍光顕微鏡検査によって、またはＰａｒｋｅｒ，Ｊ．Ｅ．ら（１９
９３）ＰｌａｎｔＪ．４：８２１−８３１に記載のようなトリパンブルー染色
後に検査した場合、損傷に似た表現型は観察されなかった。遺伝的補完性（ｇｅ
ｎｅｔｉｃｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）試験によって、ｄｎｄ１は、２
つの公開されたｃｐｒ遺伝子座であるＣＰＲ１およびＣＰＲ５とは別個の遺伝子
座であることが示された（実施例節を参照のこと）。さらに、ｄｎｄ１変異体は
、明らかに、多くの他の非公開ｃｐｒまたはｃｉｍ変異体とは類似していない。
なぜなら、ｄｎｄ１変異体は、これらの変異体の予備的分析において観察された
特性（例えば、優性または半優性の挙動、非常に低い稔性、無毛、またはねじれ
た葉形状）を示さないからである。特に、以前に記載されたｃｐｒおよびｃｉｍ
変異体は、ＨＲ細胞死を伴わない遺伝子対遺伝子防御のｄｎｄ表現型を示さない
。ｄｎｄ１変異体は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのｃｐｒ、ｃｉｍおよび他の構成
的ＰＲ発現変異体において観察されたような矮性表現型を示すが、ｄｎｄ１植物
は、他の点では、その生長および発育において正常であるように見える。

【００４１】ｄｎｄ変異体を試験して、ｄｎｄ変異体がまた、他の細胞死誘導物質に対して
抵抗性であるか否かを決定した。図５Ａ〜５Ｂおよびさらなる実験によって示さ
れたように、ｄｎｄ１変異体およびｄｎｄ２変異体の両方とも、野生型Ａｒａｂ
ｉｄｏｐｓｉｓと比較して、フモニシンＢ１誘導性細胞死に対する応答の遅延、
および感受性の減少を示した。このことは、ｄｎｄ変異体が、より一般的な、プ
ログラム細胞死の抑制を有し得ることを示す。フモニシンＢ１は、セラミドシン
ターゼの公知のインヒビターであり、これは、多様な生物体においてアポトーシ
スを誘導する。

【００４２】ｄｎｄ１表現型の遺伝的基礎を決定するために、分離分析および遺伝子マッピ
ング研究を行った。野生型Ｃｏｌ−０およびＮｏ−０生態型へのｄｎｄ１の交雑
によって、Ｆ１個体を得た。このＦ１個体は、野生型のＨＲ⁺表現型を示し、変
異体表現型の劣性性質を実証する。Ｃｏｌ−０×ｄｎｄ１交雑のＦ２は、ＨＲ⁺
：ＨＲ^-について２４：７に分離し、Ｎｏ−０×ｄｎｄ１交雑のＦ２は、１５４
：５５に分離し、そして相反性ｄｎｄ１×Ｎｏ−０交雑のＦ２は、１３２：４５
に分離した。これらのデータは、３：１比率と一致し（χ²検定について、それ
ぞれ、Ｐ＝０．５９、０．６６および０．９０）、このことは、単一の変異遺伝
子座が、観察された表現型を制御することを示す。減少したロゼットサイズの表
現型もまた劣性であり、そして分析されたこれらおよびすべてのＦ２植物におい
て、ＨＲ^-表現型と完全に同時分離した。遺伝子記号ＤＮＤ１を、この遺伝子座
に対して選択し、ＨＲ細胞死を伴わない防御（ＤｅｆｅｎｓｅｗｉｔｈＮｏ
ＨＲｃｅｌｌＤｅａｔｈ）の変異表現型を反映する。ＰＣＲに基づくマイ
クロサテライトおよび明白に増幅される多型性配列遺伝マーカーを使用して、こ
の変異遺伝子座をマッピングした。第５染色体の上腕についてのマーカー以外に
、連鎖は検出されなかった。Ｎｏ−０ｄｎｄ１交雑由来の５３６個のＦ２個体
を用いた微細構造（ｆｉｎｅ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）マッピングは、ｄｎｄ１と
ＣＨＳ１との間で、わずか６つの組換え染色体しか生じさせなかった。これらの
実験により、ＤＮＤ１は、ＣＨＳ１と、ｄｎｄ１とＣＨＳ１との間のｎｇａ１
０６と異なる１１の組換え染色体との間の約１．６ｃＭ区画内に配置された。こ
れらの実験により、ＤＮＤ１は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの第５染色体の上腕上
のＣＨＳ１とｎｇａ１０６との間の約１．６Ｃｍ区画内に配置された。この位
置は、防御関連遺伝子と以前は関連付けられていなかったマップ位置を規定する
。

【００４３】遺伝マッピングデータは、ＤＮＤ１遺伝子座が、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの第
５染色体の上部にあるマーカーｐＣＩＴ１２４３に対して北（ｎｏｒｔｈ）に密
接して存在することを示唆する。ＤＮＤ１遺伝子についてのクローンを単離する
ために、４つの近接したＢＡＣ（８Ｍ２１，３Ｈ２，２２Ｌ１および２３Ｂ１７
）を作製し、これを引き続いて、重複性コスミドライブラリーを作製するために
使用した。ＢＡＣ、コスミドライブラリーを作製するための詳細な技術、および
ＲＦＬＰを使用するための技術は、当該分野において周知であり、そしてＡｕｓ
ｕｂｅｌ（１９９７）において見出され得る。一旦、少数のコスミドが、ＤＮＤ
１遺伝子座領域にわたるように同定されると、各クローンを、ｄｎｄ１変異体を
機能的に補完する能力について試験した。これを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
媒介性形質転換を通して、各コスミドで変異体ｄｎｄ１植物を形質転換すること
、そして野生型特徴への復帰について、形質転換体をスクリーニングすることに
よって達成した。このプロセスを単純化するため、推定形質転換体を、最初にサ
イズに基づいてのみスクリーニングした。ｄｎｄ１変異体のすべての公知の表現
型は、密接に連鎖しているようであるので、矮性サイズの補完を、ＤＮＤ１遺伝
子座の遺伝的補完を表すとみなした。一般的に、ｄｎｄ１植物は、野生型Ｃｏｌ
−０と比較して、有意により低い形質転換率を示した（Ｃｏｌ−０についての約
０．２〜０．５％と比較して、試験された種子の総数あたり約０．００１％の形
質転換体）。この形質転換体を土壌に植え、そして２〜３週間後に、サイズにつ
いて分析した。３つのコスミド（１Ａ８，１Ｈ２および１Ｈ３）由来のＴ１が、
野生型コントロールのサイズと類似のサイズを示し、そしてＢＡＣ３Ｈ２の同
一領域に対して重複した（図９を参照のこと）。まとめると、補完性データは、
ＤＮＤ１遺伝子座の位置の範囲を定め、そしてこの領域内においてコードされる
遺伝子が、ｄｎｄ１植物における機能の損失（すなわち、矮性）を担うことを示
した。

【００４４】さらに、ＤＮＤ１遺伝子座の遺伝的補完性を確認するために、ＨＲアッセイお
よび細菌増殖曲線を、３つのサイズ補完性コスミド由来のＴ２植物において実施
し、野生型防御応答への復帰を確証した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを用いて
形質転換された植物は代表的に、導入遺伝子について半接合性であるので、サイ
ズについて３：１（野生型：矮性）に分離する（１Ａ８（２３：６），１Ｈ２（
３２：１０），および１Ｈ３（２９：１３））各コスミド由来のＴ２植物を観察
したことは、驚くことではない。従って、これらの分離するＴ２集団は、コスミ
ド導入遺伝子によって補完されるｄｎｄ１植物、ならびに補完されていない変異
体ｄｎｄ１植物を含む。

【００４５】予期されたように、野生型サイズのＴ２植物は、Ｃｏｌ−０の防御応答に類似
した防御応答を示したが、矮性丈のＴ２植物は、ｄｎｄ１植物の防御応答に匹敵
する防御応答を示した。ｄｎｄ１のトレードマークの表現型は、非病原性Ｐｓｇ
でのチャレンジの間のＨＲの欠損である。しかし、コスミド１Ａ８または１Ｈ２
で形質転換されたｄｎｄ１植物（これは、野生型サイズであった）は、Ｐｓｇ
Ｒ４（ａｖｒＲｐｔ２⁺）に対して強力なＨＲ応答を示した（図１０）。逆に、
矮性Ｔ２植物は、ＨＲ細胞死を欠損し、これらのｄｎｄ１植物が、補完性コスミ
ド導入遺伝子を含んでいなかったことを示す（図１０）。

【００４６】ｄｎｄ１変異に特徴的な別の防御応答は、病原性病原体に対する抵抗性の上昇
である。サイズが野生型であった、コスミド１Ｈ３で形質転換されたＴ２植物は
、ＰｓｔＤＣ３０００に対して感受性であった（すなわち、それらの応答は、
Ｃｏｌ−０の応答に似ていた）。図１１に示されるように、矮性Ｔ２植物の日数
での３つの生育分析は、これらの植物が、ｄｎｄ１変異に特徴的な抵抗性の上昇
を保持していたことを示すデータを与えた。従って、これらの植物は、補完性コ
スミド導入遺伝子を含んでいなかった。

【００４７】上記のような一連のサブクローニングおよび引き続く機能試験によって、図１
２にまとめられたサブクローンおよび補完性データが得られた。特に、ＤＮＤ１
をコードする遺伝子領域が、サブクローン１８Ｂおよび２７．１での首尾よい補
完によって、そして５６．２または６１．１で補完するのに失敗したことによっ
て、厳密に描写されたことに留意のこと。サブクローニングはまた、５．２ｋｂ
長のクローン（１７．１）を生じた。生じたクローンから作成された部分的配列
データを用いたヌクレオチドＢＬＡＳＴ検索は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈ
ａｌｉａｎａのサイクリックヌクレオチドゲートイオンチャネルＡｔＣＮＧＣ２
ｍＲＮＡ（登録番号ＡＴＹ１６２８）に対する完全な４７０ｂｐの整合をも
たらした。このｃＤＮＡは、哺乳動物イオンチャネルのサイクリックヌクレオチ
ド結合ドメインを用いて、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＥＳＴデータベースをスク
リーニングすることによって得られた［Ｋｏｈｌｅｒら（１９９８）ＴｈｅＰ
ｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ１８（１）：９７−１０４］。これは、Ｃ末端のサ
イクリックヌクレオチド結合ドメイン、推定カルモジュリン結合部位、およびＮ
末端の疎水性領域によって特徴付けられる７２６アミノ酸のタンパク質をコード
する２１７８ｂｐのオープンリーディングフレームを有する（図６および７）。
ＡｔＣＮＧＣ２ｃＤＮＡにわたるゲノムＤＮＡの配列決定によって、ＤＮＤ１
（ＡｔＣＮＧＣ２）が、８つのエキソンから構成される３３２７ｂｐの遺伝子で
あることが明らかにされた（図６）。引き続くクローニングおよび配列決定によ
って、ｄｎｄ１変異の性質が、アミノ酸１２０で未熟停止コドンを作製するＧか
らＡへの転換にあることを同定した（図６）。

【００４８】ｄｎｄ２変異体を、本明細書中に開示されたような、ｄｎｄ１変異体を特徴付
けるために確立された手順に従って同様に分析し、そして大半の局面において、
ｄｎｄ１変異体と類似することを見出した；ｄｎｄ１についての植物表現型デー
タ全体は、ｄｎｄ１植物について収集された同様のデータの代表である。ｄｎｄ
２変異体は野生型に対して劣性であり、そしてホモ接合性ｄｎｄ２／ｄｎｄ２変
異体植物は、非病原性Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅに応答するＨＲ細胞死程度の極度な
減少を示した。ｄｎｄ２変異体植物はまた、矮性（より小さなサイズの）植物生
育習性、葉組織における遊離サリチル酸および結合体化サリチル酸の構成的なレ
ベル上昇、および全身獲得抵抗性について誘導された植物と類似した、構成的な
広域スペクトル防御表現型を示した。ｄｎｄ２変異体植物の表現型は、野生型へ
の交雑のＦ２後代において、単一メンデル遺伝子座として同時分離した。しかし
、ｄｎｄ２植物は、１つの表現型に関して、ｄｎｄ１植物とは異なる；ｄｎｄ２
植物は、野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓまたはｄｎｄ１Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓの大半の葉が黄化を示さない時点で、葉先端および葉の遠位の側縁（ｄｉｓｔ
ａｌｌａｔｅｒａｌｍａｒｇｉｎ）において萎黄病または黄化となる傾向が
ある。

【００４９】ＤＮＤ１は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの第５染色体の上腕にマッピングされる
が、ＤＮＤ２は、その第５染色体の下腕にマッピングされる。ＤＮＤ２遺伝子は
、利用可能なＰＣＲに基づく多型性検出遺伝マーカーのｎｇａ１２９およびＬＦ
Ｙ３に隣接される遺伝区画にマッピングされる（ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓ．ｏｒｇ）。

【００５０】生態型Ｎｏ−０に対するＣｏｌ−０ｄｎｄ２−１／ｄｎｄ２−１の交雑に由
来するＦ２個体およびＦ３ファミリーを使用する、ＤＮＤ２遺伝子座のさらなる
遺伝子マッピングによって、ＤＮＤ２遺伝子座の部位を、ｇ４１３０とＫ１９Ｐ
１７との間の遺伝区画に精密化した。これは、６つの重複するＢＡＣクローンの
及ぶ、約２．５センチモルガンの遺伝的サイズに対応し、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓゲノムの約４００ｋｂをカバーする。この区画内のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓゲ
ノムが、近年、配列決定され、注解され、そしてＧｅｎｂａｎｋに公開されたこ
とが注目された。この区画内においてコードされる遺伝子の調査により、ＡｔＣ
ＮＧＣ１と称される、推定サイクリックヌクレオチドゲートイオンチャネル（Ｃ
ＮＧＣ）コード遺伝子が明らかにされた（ＫｏｈｌｅｒおよびＮｅｕｈａｕｓ
１９９８，前出）。

【００５１】ＰＣＲプライマーを、図１３および配列番号４に示される、Ａｒａｂｉｄｏｐ
ｓｉｓ生態型のＣｏｌ−０野生型ゲノムＤＮＡのセグメントを増幅するように設
計した。このプライマー配列は、以下の通りであった：ＭＦＨ８１３．９Ｘ（配
列番号７），５’−ＡＴＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＧＡＴＴＧＧＴＴＴＣＧＴＣＴＴ
ＧＴＣＣ−３’；およびＭＦＨ８１９．９Ｂ（配列番号８），５’−ＴＴＣＧＣ
ＧＧＡＴＣＣＴＡＴＧＣＡＣＴＧＴＧＣＣＴＧＴＧＴＧＡ−３’。生じたＰＣＲ
産物のＤＮＡは、ＡｔＣＮＧＣ１コード配列全体（図１４および配列番号５を参
照のこと）、ならびに約２ｋｂの上流ＤＮＡ（推定プロモーター領域）および約
０．５ｋｂの下流ＤＮＡ（推定ターミネーター領域）に及んだ。高忠実度ＤＮＡ
ポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｏ．ＬａＪｏ
ｌｌａ，ＣＡ）を、上記のプライマーおよび鋳型と共にポリメラーゼ連鎖反応に
使用して、期待される産物を生成した。この産物を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ／植物形質転換−コンピテントプラスミドベクターｐＣＬＤ０４５４１［Ｊｏ
ｎｅｓ，Ｊ．Ｄ．Ｇ．ら（１９９２）ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓｅａｒｃｈ
１：２８５−２９７］中にクローニングした。（３つの独立したＰＣＲ反応か
ら）生じた産物（ｐＡＣｏｌ−０１−１ａ，ｐＳＣｏｌ−０７−２３ａ，および
ｐＺＣｏｌ−０８−２７ｃと命名）を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｓ中に移動させ、そして「植物浸漬（ｆｌｏｒａｌｄｉｐ）」方
法［ＣｌｏｕｇｈおよびＢｅｎｔ（１９９８）ＰｌａｎｔＪ．１６：７３５−
７４３］を使用して、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＣｏｌ−０ｄｎｄ２−１／ｄ
ｎｄ２−１植物を遺伝的に形質転換するために用いた。推定形質転換体を、標準
的方法を用いて、カナマイシンプレートにおける選択により同定した。次いで、
これらの推定形質転換体を、まだ非常に若い間（約１０日齢）に、土壌に植えた
。さらなる数週間の生育後、３つすべてのプラスミド構築物で、形質転換ｄｎｄ
２変異体植物が、表現型的に補完され、そしてｄｎｄ２よりも野生型に似ること
が明らかとなった。ＤＮＤ１の首尾よいポジショナルクローニングにおけるのと
同様に、これを、最初に、植物サイズの観察によって決定した［Ｃｌｏｕｇｈら
（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、印刷中］。
ｐＣＬＤ０４５４１ベクターで形質転換されたコントロールｄｎｄ２植物（これ
は、ＡｔＣＮＧＣ１にわたるＤＮＡを含まない）は、表現型の補完を示さなかっ
た（図１６を参照のこと）。

【００５２】まとめると、表現型の特徴（すなわち、増強された病害抵抗性およびＨＲ細胞
死の抑制）によって最初に発見されたＤＮＤ１遺伝子およびＤＮＤ２遺伝子は両
方とも、哺乳動物および他の後生動物のサイクリックヌクレオチドゲートイオン
チャネルに対する明らかな類似性を有するタンパク質産物をコードする［Ｋｏｈ
ｌｅｒおよびＮｅｕｈａｕｓ（１９９８）前出；Ｋｏｈｌｅｒら（１９９９）Ｐ
ｌａｎｔＪ．１８：９７−１０４；Ｌｅｎｇら（１９９９）ＰｌａｎｔＰｈ
ｙｓｉｏｌ１２１：７５３−７６１］。これらの遺伝子座に由来するｃＤＮＡ
は、他の研究者らによって研究された。Ｌｅｎｇらによる近年の研究によって、
ＡｔＣＮＧＣ２の産物が、実際に、サイクリックヌクレオチドによってゲート制
御される機能的イオンチャネルであることが実証された。しかし、本発明は、サ
イクリックヌクレオチドゲートイオンチャネル遺伝子と、変異されたＤＮＤ遺伝
子の病害抵抗性／細胞死抑制の機能との間の重要な関係を形成する最初の開示で
ある。従って、本発明は、ＤＮＤ遺伝子（または、遺伝子産物）またはサイクリ
ックヌクレオチドゲートイオンチャネル遺伝子（または、遺伝子産物）のいずれ
かを操作することによって、病害抵抗性植物を作製する方法を提供する。

【００５３】ゲノム配列情報の利用可能性と共に、病害抵抗性の調節因子としてのＡｔＣＮ
ＧＣ２／ＤＮＤ１遺伝子およびＡｔＣＮＧＣ１／ＤＮＤ２遺伝子の発見によって
、植物の病害抵抗性または細胞死を、当該分野において周知の組換えＤＮＡ技術
によって操作し得ることが可能となる。例えば、当業者は、本明細書中に開示さ
れたＡｔＣＮＧＣ／ＤＮＤ遺伝子のヌクレオチド配列を使用して、他の植物にお
ける関連の遺伝子を単離し得る。ＤＮＤ１遺伝子およびＤＮＤ２遺伝子は、コー
ド領域において、ヌクレオチドレベルで約４６％の配列同一性を共有する。Ａｔ
ＣＮＧＣ２／ＤＮＤ１遺伝子およびＡｔＣＮＧＣ１／ＤＮＤ２遺伝子の機能的ま
たは構造的なホモログは、類似の配列相同性を共有する可能性がある。一旦同定
されると、これらの遺伝子を使用して、病害抵抗性を改良し得る。ＣＮＧＣ／Ｄ
ＮＤタンパク質またはそのホモログは、アミノ酸の残基の置換、欠失、付加など
によって改変され得る。作製された変異体は、病原体抵抗性の程度を変更するこ
とに加えて、多様な表現型を示し得る。矮性丈を伴わずに、増強された病害抵抗
性を示す変異体（または、変異体（複数））が、単離され得る。変異誘発および
ヌクレオチド配列変更のための方法は、当該分野において周知である。例えば、
Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２を参照のこと。

【００５４】あるいは、病害抵抗性は、ＣＮＧＣ／ＤＮＤ遺伝子またはそのホモログを不活
性化またはダウンレギュレーションすることによって増強され得る。図６に示さ
れるＤＮＤ１ゲノム配列は、イントロンおよびエキソンに加えて、約１．６ｋｂ
の５’隣接配列、ならびに約７００ヌクレオチドの３’隣接領域を含む。図１３
に示されるＤＮＤ２ゲノム配列は、ＡｔＣＮＧＣ１のコード配列に加えて、約２
ｋｂの５’隣接配列および約０．５ｋｂの３’隣接配列を含む。遺伝子を取り囲
む隣接配列は、一般的に、転写的または翻訳的のいずれかで、その遺伝子の発現
を制御する種々の調節配列を含む。従って、ＡｔＣＮＧＣ２／ＤＮＤ１遺伝子ま
たはＡｔＣＮＧＣ１／ＤＮＤ２遺伝子の発現は、転写的または翻訳的のいずれか
によって、ダウンレギュレーションまたは不活性化され得る。同様に、当業者は
、本明細書中に示される配列（スプライス部位（すなわち、イントロン−エキソ
ンの接合部）を含む）に基づいた任意のアンチセンス分子を誘導して、ＣＮＧＣ
／ＤＮＤ遺伝子を不活性化またはダウンレギュレーションし得る。センス鎖抑制
、ウイルス誘導性ジーンサイレンシング、二本鎖ＲＮＡおよび他の不活性化方法
もまた、適用可能である［ＨａｍｉｌｔｏｎおよびＢａｕｌｃｏｍｂｅ（１９９
９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８６：９５０−９５２；Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｃ．ら
（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５：３８０−３８３；Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら
米国特許第５，２８３，１８４号］。転写に対する調節エレメントを含む隣接配
列もまた使用されて、ＣＮＧＣ／ＤＮＤ遺伝子発現を阻害する組成物を同定し得
る。

【００５５】ＤＮＤ１遺伝子およびＤＮＤ２遺伝子は、配列相同性によって証拠付けられる
ように、高度に関連する（ヌクレオチドレベルで、約４６％同一性）。Ｋｏｈｌ
ｅｒら（１９９９）は、顕著な構造的相同性を共有する、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓｔｈａｌｉａｎａにおける６つの推定ＣＮＧＣの遺伝子ファミリーを報告し
た。当業者は容易に、本明細書中に提供されるＤＮＤ１遺伝子およびＤＮＤ２遺
伝子をコードするヌクレオチド配列を利用して、さらなる潜在的な病害抵抗性遺
伝子を単離し得る。

【００５６】ＡｔＣＮＧＣ２／ＤＮＤ１およびＡｔＣＮＧＣ１／ＤＮＤ２をコードするヌク
レオチド配列を利用して、他の植物（モロコシ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、コムギ、タ
バコ、ワタ、オオムギ、ヒマワリ、キュウリ、アルファルファ、ダイズ、モロコ
シなどを含む）から相同な遺伝子を単離し得る。他の植物由来のコード配列は、
本明細書中に配列番号２および５で示されるＡｔＣＮＧＣ２／ＤＮＤ１またはＡ
ｔＣＮＧＣ１／ＤＮＤ２のコード配列に対するその配列相同性に基づいて、周知
技術に従って単離され得る。これらの技術では、公知のコード配列のすべてまた
は部分が、選択された生物体由来のゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブ
ラリー中に存在する他の病害抵抗性コード配列に対して選択的にハイブリダイズ
するプローブとして使用されるか、あるいはゲノム配列またはコード配列が、同
じ目的のためのＰＣＲプライマーを設計するために使用される。あるいは、相同
な遺伝子は、ＡｔＣＮＧＣ２／ＤＮＤ１またはＡｔＣＮＧＣ１／ＤＮＤ２のゲノ
ム配列またはｃＤＮＡ配列を使用して、ＥＳＴ配列データベースまたはゲノム配
列データベースから同定され得る。同様に、検索は、ＡｔＣＮＧＣ２／ＤＮＤ１
遺伝子もしくはＡｔＣＮＧＣ１／ＤＮＤ２遺伝子の全体、または誘導されるアミ
ノ酸配列、あるいはそれらのサブドメインを利用し得る。類似性検索のための方
法は、Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．およびＬｅｗｉｔｔｅｒ，Ｆ．編（１９９８）Ｔｒ
ｅｎｄｓＧｕｉｄｅｔｏＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．，Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒＳｃｉｅｎｃｅＬｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．において見出され得
る。他の植物におけるＡｔＣＮＧＣ２／ＤＮＤ１またはＡｔＣＮＧＣ１／ＤＮＤ
２およびそれらのホモログの同定は、ＡｔＣＮＧＣ２／ＤＮＤ１もしくはＡｔＣ
ＮＧＣ１／ＤＮＤ２またはそれらのホモログの遺伝子もしくは遺伝子産物と相互
作用するエフェクター遺伝子の同定；あるいは、所望され得る様式で、ＡｔＣＮ
ＧＣ２／ＤＮＤ１またはＡｔＣＮＧＣ１／ＤＮＤ２の機能を変更するエフェクタ
ー化学薬品または他の介入の同定を容易にし得る。これらの実験（プレーティン
グされたＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングを含む）
の詳細なプロトコールは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ
ｉｎｇ，ｅｄｓ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９７）「Ｃ
ｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇ
ｙ」Ｗｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒｋにおいて見出され得る。

【００５７】例えば、このような配列のハイブリダイゼーションは、標準的なハイブリダイ
ゼーションアッセイにおいて、本明細書中に開示される病害抵抗性遺伝子をコー
ドするＤＮＡに対して、低下したストリンジェンシー条件下、中程度のストリン
ジェンシー条件下、またはずっと高いストリンジェンシー条件下（例えば、それ
ぞれ、３７℃での５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳおよび１×ＳＳＰＥを有
する３５〜４０％ホルムアミドの洗浄ストリンジェンシーによって表される条件
；４２℃での５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳおよび１×ＳＳＰＥを有する
４０〜４５％ホルムアミドの洗浄ストリンジェンシーによって表される条件；な
らびに、４２℃での５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳおよび１×ＳＳＰＥを
有する５０％ホルムアミドの洗浄ストリンジェンシーによって表される条件）に
おいてさえも実施され得る。

【００５８】Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ以外の植物におけるサイクリックヌクレオチドゲート
イオンチャネル遺伝子の変異を、従来の植物育種プロセスに使用して、選り抜き
の品種中にｄｎｄ表現型を導入し得る。このような変異は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓ
ｉｓについて本明細書中で記載されたように同定され得る。育種は、ＤＮＤ遺伝
子に連鎖した１以上のマーカーを同定することによって容易にされる。このよう
なマーカーとしては、従来のマーカー、または分子マーカー（例えば、ＲＦＬＰ
またはＳＳＲマーカー）が挙げられ得る。例えば、ＳＳＲ（単純配列反復）マー
カーは、ダイズゲノム全体に対してマッピングされており、そしてＵＳＤＡ（ｈ
ｔｔｐ：ＳｏｙＢａｓｅ．ａｇｒｏｎ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕを参照のこと）
またはＲｅｓｅａｒｃｈＧｅｎｅｔｉｃｓＩｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ
，ＡＬから公的に利用可能である。従来のマッピング方法を使用して、ＤＮＤ遺
伝子座に連鎖した１以上のＳＳＲマーカーを同定する。同様の分子マーカーが、
ほとんどの農学作物について利用可能である。従来の育種によって、適切なＤＮ
Ｄ変異対立遺伝子は、当該分野において公知であるような交雑または戻し交雑の
間に、適切に連鎖したＳＳＲマーカーを追跡することによって、所望される商業
的ダイズ系統中に遺伝子移入され得る。上記に概要を述べた同じプロセスを、他
の植物品種にＤＮＤ変異を交雑するために、適切なマーカーを用いて使用し得る
。

【００５９】本発明の方法および当該分野において公知の方法を使用して、任意の植物を形
質転換し得る。この様式では、遺伝子改変された植物、植物細胞、植物組織、種
子などが得られ得る。形質転換プロトコールは、形質転換の標的となる植物また
は植物細胞の型（すなわち、単子葉植物または双子葉植物）に依存して変化し得
る。植物細胞を形質転換する適切な方法としては、以下が挙げられる：マイクロ
インジェクション［Ｃｒｏｓｓｗａｙら（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ４：３２０−３３４］；エレクトロポレーション［Ｒｉｇｇｓら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８３：５６０２−５６０６］；Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換［Ｈｉｎｃｈｅｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ６：９１５−９２１］；直接遺伝子移入［Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら（１
９８４）ＥＭＢＯＪ．３：２７１７−２７２２］；および、弾道的粒子加速［
例えば、Ｓａｎｆｏｒｄら，米国特許第４，９４５，０５０号；およびＭｃＣａ
ｂｅら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：９２３−９２６を参照の
こと］。また、Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒら（１９８８）ＡｎｎｕａｌＲｅｖ．Ｇ
ｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７；Ｓａｎｆｏｒｄら（１９８７）Ｐａｒｔｉｃ
ｕｌａｔｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：２７−３７
（タマネギ）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９８８）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．
８７：６７１−６７４（ダイズ）；ＭｃＣａｂｅら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ６：９２３−９２６（ダイズ）；Ｄａｔｔａら（１９９０）Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：７３６−７４０（イネ）；Ｋｌｅｉｎら（１９
８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：４３０５−４３
０９（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
６：５５９−５６３（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０−４４４（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍら（１
９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：８３３−８３９；および、Ｔｏｍｅ
ｓら「ＤｉｒｅｃｔＤＮＡｔｒａｎｓｆｅｒｉｎｔｏｉｎｔａｃｔｐ
ｌａｎｔｃｅｌｌｓｖｉａｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｂｏｍｂａ
ｒｄｍｅｎｔ」ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）ＰｌａｎｔＣｅ
ｌｌ，ＴｉｓｓｕｅａｎｄＯｒｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎ
ｔａｌＭｅｔｈｏｄｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１
９９５）；Ｈｏｏｙｄａａｓ−ＶａｎＳｌｏｇｔｅｒｅｎおよびＨｏｏｙｋａ
ａｓ（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），３１１：７６３−７６４；Ｂ
ｙｔｅｂｉｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
．８４：５３４５−５３４９（ユリ科）；ＤｅＷｅｔら（１９８５）Ｔｈｅ
ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆＯｖｕｌｅＴ
ｉｓｓｕｅｓ，Ｇ．Ｐ．Ｃｈａｐｍａｎら編，１９７−２０９頁；Ｌｏｎｇｍａ
ｎ，ＮＹ（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒら（１９９０）ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲ
ｅｐｏｒｔｓ９：４１５−４１８；ならびに、Ｋａｅｐｐｌｅｒら（１９９２
）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８４：５６０−５６６（ホイスカー媒介
性形質転換（ｗｈｉｓｋｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏ
ｎ））；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら（１９９２）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ４：１４９
５；１５０５（エレクトロポレーション）；Ｌｉら（１９９３）ＰｌａｎｔＣ
ｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ１２：２５０−２５５、ならびにＣｈｒｉｓｔｏｕお
よびＦｏｒｄ（１９９５）ＡｎｎａｌｓｏｆＢｏｔａｎｙ７５：４０７−
４１３（イネ）；Ｏｓｊｏｄａら（１９９６）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ１４：７４５−７５０（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｓを介したトウモロコシ）（これらのすべてが、本明細書中で参考と
して援用される）。

【００６０】形質転換された細胞は、従来の方法に従って、植物へと生育され得る。例えば
、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら（１９８６）ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ
５：８１−８４を参照のこと。次いで、これらの植物を、生育し得、そして同じ
形質転換株または異なる株のいずれかと受粉し得、そして所望の表現型特徴を有
する、生じたハイブリッドを同定し得る。２以上の世代を生育させて、目的の表
現型特徴が、安定に維持および遺伝されることを確証し得、次いで、種子を収穫
して、所望の表現型または他の特性が達成されたことを確証し得る。

【００６１】単一の細胞またはプロトプラストからの植物の効率的再生が、種々の遺伝子移
入技術を使用する植物の遺伝子操作において必須である。このような手順につい
ての詳細なプロトコールは、以下の参考文献において見出され得る：Ｌｉ，Ｈ．
Ｑ．ら，（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（６）：７３６−７
４０；ＧｈｏｓｈＢｉｓｗａｓ，Ｇ．Ｃ．ら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．３２（１）：１−１０；Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｋ．ら（１９９２）Ｐｌａｎ
ｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０（４）：６１９−６２９；および、Ｌｏｒｚ，Ｈ．
ら（１９７９）Ｐｌａｎｔａ．Ｍｅｄ．３６（１）：２１−２９。

【００６２】先に言及したように、本発明のヌクレオチド配列は、病害、特に、植物病原体
によって引き起こされる病害から、植物を防御するために利用され得る。本発明
の病原体としては、ウイルスまたはウイロイド、細菌、真菌などが挙げられるが
、これらに限定されない。これらの病原体の特定の例としては、表Ｉに列挙され
る病原体が挙げられるが、これらに限定されない。

【００６３】Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるサイクリックヌクレオチドゲートイオンチャ
ネル遺伝子としてのＤＮＤ１遺伝子およびＤＮＤ２遺伝子の同定により、植物に
おける病害抵抗性を増強し得る組成物を同定するためのさらなる手段が与えられ
る。ＣＮＧＣ／ＤＮＤ遺伝子のタンパク質およびヌクレオチド配列を含む植物組
織培養物および組換え植物細胞、またはＣＮＧＣ／ＤＮＤタンパク質または精製
されたＣＮＧＣ／ＤＮＤタンパク質を発現する、他の種（例えば、Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈａｃｏｌｉまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓａｅま
たはＸｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓ）のトランスジェニック細胞をアッセイにお
いて使用して、サイクリックヌクレオチドゲートイオンチャネルタンパク質の機
能を阻害する組成物をスクリーニングし得る。このようなアッセイは、ＡｔＣＮ
ＧＣ２／ＤＮＤ１タンパク質の活性またはＡｔＣＮＧＣ１／ＤＮＤ２タンパク質
の活性を阻害する組成物を同定するための一般的スクリーニングとして有用であ
る。チャネル活性を測定するための詳細なアッセイプロトコールは、Ｌｅｎｇら
（１９９９）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１２１：７５３−７６１において見
出され得る。コントロールと比較して、アッセイへの添加に際してより低いチャ
ネル活性を生じさせる組成物は、インヒビターとして規定される。このような組
成物が見出された場合、これは、植物における病害抵抗性を増強するために有用
である。

【００６４】考察したように、本発明の遺伝子を操作して、植物における病害抵抗性および
／または細胞死を増強し得る。この様式において、ＡｔＣＮＧＣ２／ＤＮＤ１（
または、ＡｔＣＮＧＣ１／ＤＮＤ２）または他の病害抵抗性遺伝子の発現または
活性が変更され得る。遺伝子のこのような変更手段としては、コサプレッション
（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）、アンチセンス、変異誘発、タンパク質の亜
細胞局在性の変更などが挙げられる。いくつかの場合では、誘導可能プロモータ
ーから、特に、病原体誘導可能プロモーターから、または組織特異的プロモータ
ーもしくは生育段階特異的プロモーターから、あるいは、化学薬品噴霧によって
誘導される様式によって、この遺伝子を発現することが有益であり得る（米国特
許第５，６８９，０４２号，同第６，００８，４３６号，同第５，５８９，６２
２号，および同第５，７８９，２１４号を参照のこと）。このようなプロモータ
ーとしては、病原体の感染後に誘導される感染特異的タンパク質（ＰＲタンパク
質）（例えば、ＰＲタンパク質、ＳＡＲタンパク質、β−１，３−グルカナーゼ
、キチナーゼなど）由来のプロモーターが挙げられる。例えば、Ｒｅｄｏｌｆｉ
ら（１９８３）Ｎｅｔｈ．Ｊ．ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌ．８９：２４５−２５
４；Ｕｋｎｅｓら（１９９２）ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ４：６４５−６
５６；およびＶａｎＬｏｏｎ（１９８５）ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｖｉｒｏｌ．
４：１１１−１１６を参照のこと。

【００６５】ｄｎｄ１変異またはｄｎｄ２変異についてホモ接合性の植物は、「過敏感応答
」（ＨＲ）細胞死（「遺伝子対遺伝子」植物病害抵抗性と関連し、そしてまた、
病害損傷または感受性の部分としての病原体誘導性壊死のいくつかの例と関連す
る、局所的細胞死の形態）の実質的な抑制を示す。この細胞死は、いくつかの場
合には植物に対して有益であるが、他の場合には有害である。植物細胞死は、本
発明に開示されるような、ＡｔＣＮＧＣ２／ＤＮＤ１遺伝子もしくはＡｔＣＮＧ
Ｃ１／ＤＮＤ２遺伝子、またはそれらのホモログの類似の改変によって、部分的
または完全に制御され得る。

【００６６】（実施例）以下の実施例は、例示目的のために提供され、そして本明細書中で特許請求さ
れる本発明の範囲を制限することを意図しない。当業者に思い浮かぶ、例示的記
載事項の任意の改変は、本発明の範囲内にあることが意図される。

【００６７】（実施例１．Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅでの接種）最初の変異体およびそれらの後代を、個々の葉にＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ
．ｇｌｙｃｉｎｉａレース４ｐＶ２８８（ａｓｖｒＲｐ２⁺）またはレース４
ｐＶＳＰ６１（非ａｖｒ遺伝子）を約２×１０⁸コロニー形成単位（ｃｆｕ
）／ｍｌでピペット接種することによって、ＨＲについて試験した。遺伝子対遺
伝子ＨＲについて試験するために使用された、さらなるＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅ株
には、Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅｐｖｇｌｙｃｉｎｉａレース４ｐＡｖｒＲｐ
ｍ１（ａｖｒＲｐｍ１⁺）およびレース４ｐＶＢ０１（ａｖｒＢ⁺）［Ｋｕｎｋ
ｅｌ（１９９３）前出；Ｂｉｓｇｒｏｖｅ（１９９４）前出］が含まれた。ポジ
ティブおよびネガティブのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓコントロールには、野生型Ｃ
ｏｌ−０、Ｃｏｌ−０ｒｐｓ−２０１／ｒｐｓ２−２０１，およびＣｏｌ−０
ｒｐｍ／ｒｐｍ１（「ｒｐｓ３−１」）変異体［Ｋｕｎｋｅｌ（１９９３）前
出；Ｂｉｓｇｒｏｖｅ（１９９４）前出］の使用が含まれた。細菌増殖実験およ
び遺伝子発現研究のために、Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ．ｔｏｍａｔｏＤＣ
３０００株およびＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ．ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ４３２
６株を、上記プラスミドまたはｐＫｅｃ２１８（ａｖｒＲｐｓ４⁴）［Ｈｉｎｓ
ｃｈ，Ｍ．ら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−ＭｉｃｒｏｂｅＩｎｔｅｒａ
ｃｔ．９：５５−６１］と共に使用した。葉における細菌増殖の定量的決定は、
Ｗｈａｌｅｎ（１９９１）前出に記載のように、選択培地上に、ホモジネートし
た葉組織を希釈プレーティングすることによって実施した。

【００６８】（実施例２．変異体スクリーニングおよび交雑）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ生態型Ｃｏｌ−０の種子に、エチ
ルメタンスルホネートで変異誘発し；Ｍ２集団を、ＬｅｈｌｅＳｅｅｄｓ（Ｒ
ｏｕｎｄＲｏｃｋ，ＴＸ）から得た。ＨＲの活性化について試験するため、１
０ｍＭＭｇＣｌ₂中の約２×１０⁸ｃｆｕ／ｍｌ濃度のＰ．ｓｖｒｉｎｇａｅ
ｐｖ．ｇｌｙｃｉｎｉａレース４ｐＶ２８８（ａｖｒＲｐｔ⁺）を、真空浸潤
によって、約１１，０００個のＭ２実生の葉肉組織中に接種した。葉を、浸潤の
２４時間後および４０時間後に観察し、そして葉の崩壊の減少、遅延を有する植
物、または葉の崩壊を有さない植物を、さらなる分析のために保存した。潜在的
に目的の系統を、野生型のＣｏｌ−０親と交雑して戻し交雑を開始し、そして生
態型Ｎｏ−０と交雑して、遺伝マッピングを開始した。補完性試験のために、Ａ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＣｏｌ−０ｄｎｄ１／ｄｎｄ１植物を、ホモ接合性の
ｃｐｒ１変異体およびｃｐｒ５変異体（これらはまた、減少したロゼットサイズ
を示す）に対して交雑した［Ｂｏｗｌｉｎｇ，Ｓ．Ａ．ら（１９９７）Ｐｌａｎ
ｔＣｅｌｌ９：１５７３−１５８４；Ｃａｏ（１９９４）。優性／劣性およ
び遺伝的補完性を、すべてのＦ１植物が見かけ上サイレント型（ｓｉｌｔ−ｔｙ
ｐｅ）であり、そしてＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅｐｖｇｌｙｃｉｎｉａレース４
ｐＶ２８８での接種後にＨＲを示したことを観察することによって推測した。

【００６９】（実施例３．顕微鏡検査）細胞レベルでＨＲ細胞死をモニターするために、ピペット浸潤を使用して、Ｐ
．ｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ．ｇｌｙｃｉｎｉａレース４ｐＶ２８８（ａｖｒＲ
ｐｔ⁺）またはレース４ｐＶＳＰ６１（非ａｖｒ遺伝子）を、示される細菌濃
度で、個々の葉の葉肉空間の４０〜約７０％（４０−＝７０％）に導入した。２
４時間後に植物から葉を取り除き、２％ホルムアルデヒド、５％酢酸および４０
％エタノール中で３０分間固定し、次いで、５０％エタノールおよび９５％エタ
ノールで連続的に清澄化した［Ｙｕ（１９９３）前出］。次いで、葉の柔組織細
胞を、フルオレセインフィルターセット（Ｅｘ４９５±２０ｎｍ，Ｅｍ＞５０
５ｎｍ［Ｋｌｅｍｅｎｔ（１９９０）前出］を用いる蛍光顕微鏡検査を使用する
ことによって、ＨＲに関連した自己蛍光について試験した。あるいは、エバンス
ブルー（Ｓｉｇｍａ）を、病原体接種から２２〜２６時間後に、１％水溶液とし
て葉に浸潤させた［Ｋｌｅｍｅｎｔ（１９９０）前出］。少なくとも１０分間の
染色後、植物から葉を取り除き、表皮の一部分を剥ぎ戻し（ｐｅｅｌｂａｃｋ
）、そしてＨ₂Ｏ中で葉をリンスし、Ｈ₂Ｏ中に置き、そして光学顕微鏡検査によ
って観察した。物理的操作によって損傷を受けた葉の領域は、死滅細胞と生存細
胞との比率を評価する場合に考慮しなかった。

【００７０】（実施例４．遺伝マッピング）Ｎｏ−０×Ｃｏｌ−０ｄｎｄ１／ｄｎｄ１交雑由来のＦ２集団を、マッピン
グのために使用した。ＨＲ表現型を、１０ｍＭＭｇＣｌ₂中の約１×１０⁸ｃｆ
ｕ／ｍｌに再懸濁されたＰ．ｓｙｒｉｎｇｅｐｖ．ｇｌｙｃｉｎｉａレース４
ｐＶ２８８（ａｖｒＲｐｔ⁺）での葉のピペット接種から、２４時間後および
４８時間後に、視覚的に評価した。情報を与えるＦ２系統を、自家受粉したＦ３
ファミリーにおけるＨＲに対して再試験した。ＰＣＲに基づいて切断された増幅
多型性配列およびマイクロサテライトマーカーを、Ｂｅｌｌ，Ｃ．Ｊ．ら（１９
９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１９：１３７−１４４；およびＫｏｎｉｅｃｚｎｙ，
Ａ．ら（１９９３）ＰｌａｎｔＪ．４：４０３−４１０に記載のように使用し
た；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの５つすべての染色体にわたる１７マーカーのセッ
トを、最初の連鎖分析のために使用した。

【００７１】（実施例５．他の病原体での接種）タバコ輪点ウイルスｇｒａｐｅ株を植物に適用し、そしてウイルスの増殖を、
Ｌｅｅ（１９９６）前出に記載のようなＥＬＩＳＡを使用することによって、モ
ニターした。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ．ｃａｍｐ
ｅｓｔｒｉｓ２６６９株［Ｐａｒｋｅｒ，Ｊ．Ｅ．ら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｐ
ｌａｎｔ−ＭｉｃｒｏｂｅＩｎｔｅｒａｃｔ．６：２１６−２２４］を、約１
×１０⁷ｃｆｕ／ｍｌの濃度で適用し、そしてＰａｒｋｅｒ（１９９３）前出に
記載のようにモニターした。Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａ分
離菌Ｎｏｃｏ２を、Ｐａｒｋｅｒ，Ｊ．Ｅ．ら（１９９７）ＴｒｅｎｄｓＢｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２２：２９１−２９６に記載のように適用し、そしてモニ
ターした。すべての実験について、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ生態型Ｃｏｌ−０を
、病原体増殖および病原性に対する感受性コントロールとして供した。

【００７２】（実施例６．遺伝子発現研究）Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ．ｔｏｍａｔｏＤＣ３０００株（ｐＶ２８８）
またはＤＣ３０００株（ｐＶＳＰ６１）を、代表的に５×１０⁴ｃｆｕ／ｍｌの
用量で、真空浸潤（上記の通り）によってインタクトな植物の葉肉中に接種した
。総ＲＮＡを、葉材料から抽出し、そして各サンプルからの等量のＲＮＡを、本
質的にＡｕｓｕｂｅｌ（１９９７）前出に記載のように、アガロース−ホルムア
ルデヒドゲルにおいて分離し、ブロットし、そして³²Ｐ放射性標識プローブでハ
イブリダイズさせた。ＤＮＡプローブは、Ｃａｏら［Ｃａｏ（１９９４）前出］
由来であった。ハイブリダイゼーションを、製造業者（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤ
ｙｎａｍｉｃｓ）の指示書に従って、記憶リン光体画像化システム（ｓｔｏｒａ
ｇｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇｓｙｓｔｅｍ）を使用することによ
って定量した。各レーンにおけるＰＲ−１またはβ−グルカナーゼ（β−ｇｌｕ
ｔａｎａｓｅ）についてのシグナルを、ゲルローディングにおけるわずかな差異
を補正するためのレーンについてのコントロールβ−ＡＴＰａｓｅシグナルに対
して正規化し、次いで、この正規化されたシグナルを、相対的尺度を確立するた
めに、Ｃｏｌ−０／病原体無しのサンプルについてのシグナルで除算した。

【００７３】（実施例７．サリチル酸測定）サリチル酸測定を、Ｕｋｎｅｓ，Ｓ．ら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−Ｍ
ｉｃｒｏｂｅＩｎｔｅｒａｃｔ．６：６９２−６９８に記載されるように、接
種されていない６週齢の植物由来の葉材料において実施した。

【００７４】（実施例８．ｄｎｄ１表現型の機能的補完性）三親交雑：補完性研究のためにＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ中にコスミドを形質転
換するため、コスミドをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中に配置した。コスミドラ
イブラリーのメンバーを、三親交雑を介して、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＧＶ３１０１株に移入した。液体培養物を、各親につい
て調製した：ＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０）、交雑へルパープラスミドｐＲＫ２０
１３を含有するＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１株、およびコスミドを保有するＥ．ｃ
ｏｌｉＸＬ−１ドナー。培養物を、ＬＢＡ培地（抗生物質無し）にスポットし
た。その結果、約５：１：１の比率の、レシピエント、ヘルパーおよびドナーが
、各コスミドについての単一スポットにおいて達成された。これらの交雑スポッ
トを、２８℃で一晩増殖させた。翌日、各交雑スポットを、低塩ＬＢ培地（１０
ｇトリプトン、５ｇ酵母抽出物、および５ｇＮａＣｌ／リットル）＋テトラサ
イクリン（２．５μｇ／ｍｌ）＋リファンピシン（１００μｇ／ｍｌ）＋ゲンタ
マイシン（５０μｇ／ｍｌ）上に再画線し、そして、２８℃で２日間増殖させた
。これらのプレートからコロニーを拾い、そしてリファンピシン（１００μｇ／
ｍｌ）およびカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含有する低塩ＬＢＡ（１．５％
寒天）に再画線して、コスミドベクターを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
コロニーについて選択した。

【００７５】Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ形質転換：変異体ｄｎｄ１植物を、植物浸漬方法（Ｃ
ｌｏｕｇｈおよびＢｅｎｔ，１９９８）を通して、コスミドクローンを保有する
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍで遺伝的に形質転換した。各コスミドの細菌培養物
（１５０ｍｌ）を、低塩ＬＢ＋カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）中において２８
℃で一晩増殖させ、１５分間６，０００ｒｐｍでスピンした。細菌を、０．０５
％界面活性剤ＳｉｌｗｅｔＬ−７７（ＯｓｉＳｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ，Ｉ
ｎｃ．）でスパイク（ｓｐｉｋｅｄ）された５％スクロース中に再懸濁した。変
異体ｄｎｄ１植物を、温室において８〜１５時間日長で、チュール（ｔｕｌｌｅ
）で拘束され築山土壌を有する３．５インチポット中において、第１抽だいが現
われるまで生育させた。植物を、２〜５秒間Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ溶液中
に浸漬し、次いで、ドーム（ｄｏｍｅ）下に一晩置いた。この時点で、植物を１
５時間日長に移した。一旦、長角果が褐色化し、そして徹底的に乾燥されると、
種子を、３〜５週間後に収集した。研究室ベンチでの１．５ｍｌマイクロ遠心チ
ューブ中での２〜３日間のさらなる乾燥後、記載されたような（Ａｐｐｅｎｄｉ
ｘ４）液相または気相でのいずれかの滅菌によって、種子を滅菌した。滅菌種
子を、滅菌０．１％アガロース中に再懸濁し、そしてカナマイシン（５０μｇ／
ｍｌ）選択プレートにプレーティングした。代表的に、１５０×１５ｍｍペトリ
皿あたり約３０００種子をプレーティングした。２４時間日長下での７〜１０日
間の生育後に、緑色葉および十分に確立された根系を有するカナマイシン耐性実
生を、推定形質転換体とみなし、そしてさらなる分析のために土壌に移植した。
ｄｎｄ変異体は、野生型よりも形質転換に対して約１００倍より剛健なので、い
くつかの種子プレート（時折、５〜１０）をスクリーニングして、少数の推定形
質転換体を得た。

【００７６】推定形質転換体が得られ、そして土壌に移植された後、これらの推定形質転換
体を８時間日長下でグロースチャンバー（ｇｒｏｗｔｈｃｈａｍｂｅｒ）内で
さらに３〜４週間生育させた。この時点で、個々の形質転換体のサイズを、野生
型Ｃｏｌ−０コントロール（Ａ２１系統、野生型サイズでありかつカナマイシン
耐性であるベクターコントロール形質転換体）のサイズと比較した。これは、同
様に、カナマイシンプレートにおいて選択され、そして土壌に移植された。推定
上補完性であるコスミドを、サイズに基づいて同定し、そして自家受粉させ、そ
してさらなる分析のために、Ｔ２種子をこれらの植物から収集した。

【００７７】細菌増殖曲線：植物サイズに影響を与えることに加えて、ｄｎｄ１変異体はま
た、病原体増殖および非病原性病原体に応答してＨＲを生じる能力に影響を与え
る。ｄｎｄ１の矮性表現型を補完するコスミドが実際に、ＤＮＤ１遺伝子座を補
完したことを確認するために、ｄｎｄ１のこれらの他の特徴的な表現型の復帰も
また、これらの植物において試験した。増殖曲線を、補完性コスミド、ならびに
Ｃｏｌ−０およびｄｎｄ１コントロールで形質転換されたＴ２植物において実施
した。ａｖｒＲＰ２（ｐＶ２８８）または非ａｖｒ遺伝子ベクターのみのいずれ
かを有するｐ．ｓ．ｐｖ．ｔｏｍａｔｏＤＣ３０００（ＰｓｔＤＣ３０００
）を用いて、植物を真空浸潤した。約５×１０⁴ｃｆｕ／ｍｌの細菌を、各接種
について使用した（Ｏ．Ｄ．₆₀₀＋０．００５）。このレベルの病原体は、天然
の感染の間に生じる、低い病原体レベルを効率的に模倣する。各サンプルについ
て、＃１コルクボーラーを用いて、三連で、２つの植物の各々から２つのリーフ
ディスクを採取した。従って、各植物／病原体の組合せについて、時間点あたり
１２枚のリーフディスクをサンプリングした。接種後０日目、２日目、および４
日目（または、ちょうど３日目）に、サンプルを収集した。リーフディスクを、
２００μｌの１０ｍＭＭｇＣｌ₂を有する１．５ｍｌマイクロ遠心チューブ内
に収集し、乳棒ですり潰し、そしてＮＹＧＡ（５ｇＢａｃｔｏ−ペプトン、３
ｇ酵母抽出物、２０ｍｌグリセロール、および１５ｇ寒天／リットル）＋リファ
ンピシン（１００μｇ／ｍｌ）＋シクロヘキシミド（５０μｇ／ｍｌ）において
段階希釈し、次いで、２８℃で２日間生育させた。コロニーを計数し、そしてデ
ータを、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（ＪａｎｄｅｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＣＯ）
を用いて分析した。

【００７８】ＨＲアッセイ：ＨＲアッセイを、Ｃｏｌ−０およびｄｎｄ１コントロールに加
えて、２つの補完性コスミド由来のＴ２において実施した。ａｖｒＲｐｔ２を保
有する、高レベルのＰ．ｓ．ｇｌｙｃｉｎｉａレース４（ＰｓｇＲ４）（Ｎ．
Ｔ．Ｋｅｅｎ，Ｕｎｉｖ．ｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ−Ｒｉｖｅｒｓｉｄｅか
ら得た）での接種によって、不適合性反応においてＨＲ（可視的な葉の崩壊）が
誘導された。注射器を用いて、２×１０⁸ｃｆｕ／ｍｌ（Ｏ．Ｄ．₆₀₀＝０．２）
の細菌を植物に接種し、そして接種後２４時間の可視的な葉の崩壊についてスコ
ア付けした。ＨＲの重篤度を、０〜５スケール（０＝崩壊なし、５＝総崩壊）で
評価した。各植物について、３枚の葉にＰｓｇＲ４（ｐＶ２８８）（ａｖｒ遺
伝子有り）を接種し、そして１枚の葉にＰｓｇＲ４（ｐＶＳＰ６１）（ａｖｒ
遺伝子無し）を接種した。

【００７９】（実施例９．病害抵抗性を増強し、および／または細胞死を減少させるための
ダイズ植物の改変）本発明の使用の１例として、病原体による感染後の病害抵抗性の増強および／
または細胞死の減少を示すようにダイズ植物を操作し得る。本明細書中に記載さ
れるＤＮＡ配列のうちの１つに対して相同なサイクリックヌクレオチドゲートイ
オンチャネルをコードするダイズＤＮＡ配列は、過度な実験を伴なわずに、当該
分野で利用可能な情報および材料から得られ得る。ゲノム配列データベースにお
いて現在利用可能な情報としては、ダイズから単離されたｃＤＮＡについてのＥ
ＳＴＤＮＡ配列が挙げられる。近年、ＥＳＴクローン（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番
号ＡＷ７８１０８８）は、ダイズの推定ＣＮＧＣとして同定された。同様に、
複数のＥＳＴクローンが、他の植物種（ハス（ｌｏｔｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ
）、トマト、ワタ、およびスイカを含む）の推定ＣＮＧＣタンパク質をコードす
ることが同定された。コンピューター支援方法を使用して、当業者は、所定のｃ
ＤＮＡによってコードされる有望なアミノ酸配列を誘導し得る。研究者は、サイ
クリックヌクレオチド結合ドメイン、またはサイクリックヌクレオチドゲートイ
オンチャネルに特徴的な他の誘導体化アミノ酸配列モチーフをコードするダイズ
ＤＮＡ配列を、配列データベースにおいて容易に同定し得る。次いで、このｃＤ
ＮＡについての完全ＤＮＡ配列、またはダイズゲノムＤＮＡの対応領域について
の完全ＤＮＡ配列を決定して、ＤＮＤ／サイクリックヌクレオチドゲートイオン
チャネル遺伝子としての配列の同定を完了する。発現カセットを、アンチセンス
遺伝子またはセンス遺伝子の病原体誘導性発現のために構築する。この目的のた
めに、多くの異なる病原体誘導性遺伝子が、適切なプロモーターの供給源として
使用され得る。例えば、病原体誘導性のダイズＰＲ−１遺伝子のプロモーター領
域［Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１３６６３６、また、Ｒｙａｌｓら（１９９６
）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ８：１８０９−１８１９；Ｒａｙｍｏｎｄら（２００
０）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１２：７０７−７２０を参照のこと］、または、別
の感染誘導性プロモーターが、プロモーターに対してセンス配向またはアンチセ
ンス配向で、ダイズＤＮＤ遺伝子の小さなセグメント（２５〜１００ｂｐ）、中
程度のセグメント（１０１〜５００ｂｐ）、または大きなセグメント（５０１ｂ
ｐ〜完全遺伝子長）に融合される［ＨａｍｉｌｔｏｎおよびＢａｕｌｃｏｍｂｅ
（１９９９）前出；Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら、米国特許第５，２８３，１８４号；
ならびにＢｒｉｄｇｅｓら，米国特許第５，０７３，６７６号］。これには、標
準的な転写ターミネーター（例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ３’ターミネーター領域）が続く。当業者に周
知の方法を使用して、ＰＲ−１プロモーター／アンチセンスＤＮＤ／ｎｏｓター
ミネーターＤＮＡ構築物、またはＰＲ−１プロモーター／センスＤＮＤ／ｎｏｓ
ターミネーターＤＮＡ構築物が、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）またはＡｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介によるダイズの形質転換について適切なベクター内に
配置され、次いで、農業上適切なダイズ品種を形質転換するために使用される。
形質転換体は、選択可能なマーカー（例えば、カナマイシン耐性）またはスクリ
ーニング可能なマーカー（例えば、ＧＵＳ）のいずれかを使用する、同時形質転
換マーカー遺伝子を用いることによって、同定される。形質転換体は、当該分野
における公知技術に従って再生されて、成熟植物を生成する。それにより、これ
らのＤＮＡ構築物を保有する稔性生産性のトランスジェニックダイズ系統は作製
され、そして同定される。植物を、ＰＲ−１プロモーター／アンチセンスＤＮＤ
／ｎｏｓターミネーターＤＮＡ構築物、またはＰＲ−１プロモーター／センスＤ
ＮＤ／ｎｏｓターミネーターＤＮＡ構築物の病原体誘導性発現について試験する
。植物をさらに、内因性ダイズＤＮＤ／サイクリックヌクレオチドゲートイオン
チャネル遺伝子の発現の転写的または翻訳的なサイレンシングについて試験し得
る。サイレンシングは、感染した組織においてのみ生じ得るか、または大半の植
物を通して全身的に生じ得、そして種々の分子機構に起因して生じ得る。病原体
に対する抵抗性または病原体誘導性細胞死が、トランスジェニック植物において
アッセイされ得る。抵抗性は、感染部位で局所的に生じ得るか、または感染植物
の多くの他の部分へと全身的に広がり得、そして種々の分子機構に起因して生じ
得る。多くの植物病害の疫学と一致して、最初の感染はしばしば、植物において
限られた数の部位で生じ、その結果、感染後初期の抵抗性の誘導は、感染植物に
おいて他の部位に感染が伝播するのを減少させ得、そしてまた、他の植物への病
原体の伝播を減少させ得る。

【００８０】本発明の第２の例としては、誘導性化学薬品で処理することによって誘導され
る病害抵抗性の増強および／または細胞死の減少を示すように、ダイズ植物を操
作する。ダイズＤＮＤ／サイクリックヌクレオチドゲートイオンチャネル遺伝子
を、先の段落において記載される方法によってか、または本明細書中で考察され
る他の方法によって、同定し得る。プロモーターに対してセンス配向またはアン
チセンス配向において、ダイズＤＮＤ遺伝子の小さなセグメント（２５〜１００
ｂｐ）、中程度のセグメント（１０１〜５００ｂｐ）、または大きなセグメント
（５０１ｂｐ〜完全遺伝子長）に融合された、Ｒｙａｌｓら、米国特許第５，７
８９，２１４号に開示されるプロモーターのような、化学的誘導可能プロモータ
ーを含むＤＮＡ構築物を作製する［ＨａｍｉｌｔｏｎおよびＢａｕｌｃｏｍｂｅ
（１９９９）前出；Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら、米国特許第５，２８３，１８４号；
ならびに、Ｂｒｉｄｇｅｓら、前出］。これには、標準的な転写ターミネーター
（例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシン
ターゼ３’ターミネーター領域）が続く。当業者に周知の方法を使用して、プロ
モーター／アンチセンスＤＮＤ／ｎｏｓターミネーターＤＮＡ構築物、またはプ
ロモーター／センスＤＮＤ／ｎｏｓターミネーターＤＮＡ構築物が、微粒子銃ま
たはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介によるダイズの形質転換について適切なベ
クター内に配置され、次いで、農業上適切なダイズ品種を形質転換するために使
用される。形質転換体の同定および再生は、以前に記載されたように実施される
。それにより、このＤＮＡ構築物を保有する稔性生産性のトランスジェニックダ
イズ系統は作製され、そして同定される。植物を、プロモーター／アンチセンス
ＤＮＤ／ｎｏｓターミネーターＤＮＡ構築物、またはプロモーター／センスＤＮ
Ｄ／ｎｏｓターミネーターＤＮＡ構築物の化学的誘導可能発現について試験する
。植物をさらに、内因性ダイズＤＮＤ／サイクリックヌクレオチドゲートイオン
チャネル遺伝子の発現の転写的または翻訳的なサイレンシングについて試験し得
る。サイレンシングは、感染した組織においてのみ生じ得るか、または大半の植
物を通して全身的に生じ得、そして種々の分子機構に起因して生じ得る。病原体
に対する抵抗性または病原体誘導性細胞死が、トランスジェニック植物において
アッセイされ得る。抵抗性は、感染部位で局所的に生じ得るか、または感染植物
の多くの他の部分へと全身的に広がり得、そして種々の分子機構に起因して生じ
得る。多くの植物病害の疫学と一致して、最初の感染はしばしば、植物において
限られた数の部位、および所定の圃場における限られた数の植物において生じ、
その結果、最初の感染後初期の抵抗性の誘導は、感染植物において他の部位に感
染が伝播するのを減少させ得、そしてまた、他の植物への病原体の伝播を減少さ
せ得る。感染前に化学薬品処理によって植物に抵抗性を誘導することによって、
感染発生前に、危険性がある植物の病害に対する感受性を減少し得る。

【００８１】植物細胞および／または植物組織中に異種ＤＮＡを導入し、そしてその存在を
選択するための技術および薬剤は周知である。植物細胞において異種ＤＮＡの選
択を可能にする遺伝マーカーは周知である（例えば、カナマイシン、ハイグロマ
イシン、ゲンタマイシン、またはブレオマイシンのような抗生物質に対する耐性
を有する遺伝子）。このマーカーによって、適切な抗生物質を含有する培地にお
いて増殖する、首尾良く形質転換された植物細胞の選択が可能となる。なぜなら
、首尾良く形質転換された植物細胞は、対応する耐性遺伝子を有するからである
。大半の場合において、植物細胞中に挿入された異種ＤＮＡは、選択可能マーカ
ー（例えば、抗生物質耐性マーカー）をコードする遺伝子を含むが、これは必須
ではない。例示的な薬物耐性マーカーは、発現によってカナマイシン耐性を生じ
る遺伝子（すなわち、ノパリンシンターゼプロモーター、Ｔｎ５ネオマイシンホ
スホトランスフェラーゼＩＩ、およびノパリンシンテターゼ３’非翻訳領域を含
むキメラ遺伝子（Ｒｏｇｅｒｓら、ＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＰｌａｎｔＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ａ．ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＨ．Ｗｅｉｓ
ｓｂａｃｈ編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ
、ＣＡ（１９８８）に記載））である。

【００８２】異種コード配列（可能な、アンチセンスＤＮＡ構築物および／または二本鎖Ｒ
ＮＡ媒介性ジーンサイレンシングを誘発するように設計されたＤＮＡ構築物を含
む）に融合された誘導可能プロモーターまたはキメラプロモーター、次いで、転
写終結配列を含む発現カセットを用いて、植物細胞および／または植物組織を遺
伝子操作するための技術は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換、エレ
クトロポレーション、マイクロインジェクション、粒子ボンバードメント、また
は当該分野において公知の他の技術によって、植物細胞または植物組織中に導入
されることが意図される。発現カセットは、有利なことには、さらに、植物細胞
における異種ＤＮＡの選択を可能にするマーカー（例えば、カナマイシン、ハイ
グロマイシン、ゲンタマイシン、またはブレオマイシンのような抗生物質に対す
る耐性を有する遺伝子）を含む。

【００８３】植物で発現可能な遺伝子または目的の他のＤＮＡを有するＤＮＡ構築物が、任
意の適切な方法によって、植物のゲノム中に挿入され得る。このような方法とし
ては、例えば、リポソームの使用、エレクトロポレーション、拡散、粒子ボンバ
ードメント、マイクロインジェクション、遺伝子銃、遊離ＤＮＡの取り込みを増
加させる化学薬品（例えば、リン酸カルシウム共沈）、ウイルスベクター、およ
び当該分野において実施される他の技術が挙げられ得る。適切な植物形質転換ベ
クターとしては、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉ
プラスミド由来のベクター（例えば、Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ（１９
８３），Ｂｅｖａｎ（１９８３），Ｋｌｅｅ（１９８５）および欧州特許庁公開
第１２０，５１６号（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔら）によって開示されるベクタ
ー）が挙げられる。ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＴｉプラスミドまたは根誘導
性（Ｒｉ）プラスミド由来の植物形質転換ベクターに加えて、代替的な方法が、
本発明のＤＮＡ構築物を植物細胞に挿入するために使用され得る。

【００８４】目的のＤＮＡが作動可能に連結されるベクターの選択は、当該分野において周
知のように、所望される機能的特性（例えば、複製、タンパク質発現、および形
質転換される宿主細胞）に直接依存し、これらは、組換えＤＮＡ分子を構築する
当該分野における固有の制限である。ベクターは、望ましくは、原核生物レプリ
コン（すなわち、原核生物宿主細胞（例えば、細菌宿主細胞）中に導入された場
合に、自律複製を指向し、そして組換えＤＮＡ分子を染色体外に維持する能力を
有するＤＮＡ分子）を含む。このようなレプリコンは、当該分野において周知で
ある。さらに、原核生物レプリコンを含む好ましい実施形態はまた、形質転換細
胞中に導入された場合に、発現によって細菌性宿主細胞に選択的利点（例えば、
薬物耐性）を付与する遺伝子を含む。

【００８５】代表的な細菌性薬物耐性遺伝子は、他の選択的薬剤の中でも、アンピシリンま
たはテトラサイクリンに対して耐性を付与する遺伝子である。ネオマイシンホス
ホトランスフェラーゼ遺伝子は、真核生物細胞ならびに原核生物細胞において発
現されるという利点を有する。

【００８６】原核生物レプリコンを含むこれらのベクターはまた、代表的に、本発明の組換
えＤＮＡ分子の挿入のための従来の制限部位を含む。このようなベクタープラス
ミドの代表例は、以下の通り：ｐＵＣ８，ｐＵＣ９，ｐＢＲ３２２，およびｐＢ
Ｒ３２９（ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ
）から入手可能）ならびにｐＰＬ，ｐＫ，およびＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能），ならびにｐＢＬＵＥＳＣＲＩ
ＰＴおよびｐＢＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）から入手
可能））。本発明のベクターはまた、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，Ｍａｎｉａｔｉｓら編，Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ（１９８９）に記載されるλベ
クターを含む、λファージベクター、ならびにＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪ
ｏｌｌａ，ＣＡ）から入手可能なλＺＡＰベクターであり得る。他の例示的なベ
クターとしては、ｐＣＭＵ［Ｎｉｌｓｓｏｎら（１９８９）Ｃｅｌｌ５８：７
０７］が挙げられる。他の適切なベクターはまた、公知な方法に従って、合成さ
れ得る；例えば、本明細書中の種々の適用において使用されるｐＣＭＵ／Ｋｂお
よびｐＣＭＵＩＩベクターは、ｐＣＭＵＩＶ［Ｎｉｌｓｓｏｎ（１９８９）前出
］の改変体である。

【００８７】植物細胞において組換え核酸配列を発現し得る代表的な発現ベクター、および
、宿主植物細胞における安定な組み込みを指向し得る代表的な発現ベクターとし
ては、Ｒｏｇｅｒｓら（１９８７）Ｍｅｔｈ．ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．１５３：
２５３−２７７に記載された、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓの腫瘍誘導性（Ｔｉ）プラスミド由来のベクター、および植物において機
能することが公知のいくつかの他の発現ベクター系が挙げられる。例えば、Ｖｅ
ｒｍａら，Ｎｏ．ＷＯ８７／００５５１；ＣｏｃｋｉｎｇおよびＤａｖｅｙ（１
９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６：１２５９−１２６２を参照のこと。

【００８８】トランスジェニック植物は、当該分野において公知の任意の手段（Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介性ＤＮＡ移入（好ましくは、無
害化（ｄｉｓａｒｍｅｄ）Ｔ−ＤＮＡベクターを有する）、エレクトロポレーシ
ョン、直接ＤＮＡ移入および粒子ボンバードメントが挙げられるが、これらに限
定されない）によって作製され得る［Ｄａｖｅｙら（１９８９）ＰｌａｎｔＭ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２７５；ＷａｌｄｅｎおよびＳｃｈｅｌｌ（１９９０）
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：５６３；ＪｏｅｒｓｂｏおよびＢｕｒｎ
ｓｔｅｄｔ（１９９１）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．８１：２５６；Ｐｏｔｒ
ｙｋｕｓ（１９９１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａ
ｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２０５；ＧａｓｓｅｒおよびＦｒａｌｅｙ（１９
８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１２９３；Ｌｅｅｍａｎｓ（１９９３）Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１：５２２；Ｂｅｃｋら（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ１１：１５２４；Ｋｏｚｉｅｌら（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ１１：１９４；Ｖａｓｉｌら（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ１１：１５３３ならびにＧｅｌｖｉｎ，Ｓ．Ｂ．（１９９９）Ｃ
ｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：２２７−２３２を参照のこと］。単子
葉植物および双子葉植物中にＤＮＡを導入するための技術は、当該分野において
周知のであり、このような植物組織を培養する技術、およびこれらの組織を再生
する技術も同様である。

【００８９】本明細書中に詳細に記載されているか否かに関わらず、本発明を実施するため
に有用な手順の多くが、植物分子生物学分野における当業者に周知である。クロ
ーニング、ＤＮＡ単離、増幅および精製のための標準的技術、ＤＮＡリガーゼ、
ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む酵素的反応のための標
準的技術、ならびに種々の分離技術が、当業者に公知のものであり、そして一般
に使用されている。多くの標準的技術が、以下に記載されている：Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，第２版，Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ
ｅｗＹｏｒｋ；Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ
ｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐ
ｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮｅｗＹｏｒｋ；Ｗｕ（編）（１９９３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ．２１８，第Ｉ部；Ｗｕ（編）（１９７９）ＭｅｔｈＥｎｚｙｍｏ
ｌ．６８；Ｗｕら（編）（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００および
１０１；ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＭｏｌｄａｖｅ（編）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．６５；Ｍｉｌｌｅｒ（編）（１９７２）ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹ
ｏｒｋ；ＯｌｄおよびＰｒｉｍｒｏｓｅ（１９８１）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏ
ｆＧｅｎｅＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａ
ｌｉｆｏｒｎｉａＰｒｅｓｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ；ＳｃｈｌｅｉｆおよびＷｅ
ｎｓｉｎｋ（１９８２）ＰｒａｃｔｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ；Ｇｌｏｖｅｒ（編）（１９８５）ＤＮＡＣｌｏ
ｎｉｎｇ第Ｉ巻および第ＩＩ巻，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ；
ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（編）（１９８５）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ；な
らびにＳｅｔｌｏｗおよびＨｏｌｌａｅｎｄｅｒ（１９７９）Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ，第
１−４巻，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｋａｕｆｍａｎ（１
９８７）ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａ
ｎｄＭｅｔｈｏｄｓ，Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ，編，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ
，ＮＹ，１５５−１９８頁；Ｆｉｔｃｈｅｎら（１９９３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７：７３９−７６４；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖら（１９９
３）ＧｅｎｏｍｉｃＲｅｓｅａｒｃｈｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉ
ｃｉｎｅａｎｄＶｉｒｏｌｏｇｙ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ；Ａｕｓ
ｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９７）「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉ
ｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」Ｗｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ。略
記および命名法は、使用される場合には、当該分野における標準とみなされ、そ
して本明細書中に引用されたような専門雑誌において通常使用される。

【００９０】本願において引用されたすべての参考文献を、それと矛盾しない程度まで、そ
れらの全体において本明細書中で参考として援用される。

【００９１】

【表１】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａ〜１Ｄは、ｄｎｄ１変異体におけるＨＲ細胞死欠損を示す。野生型の親
（Ｃｏｌ）植物およびｄｎｄ１変異体（ｄｎｄ１）植物の葉に、高用量（２×１
０⁸ｃｆｕ／ｍｌ）の非病原性、ＨＲ−刺激性Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ．ｇ
ｌｙｃｉｎｉａＲｃｔ４ｐＶ２８８（ＰｓｇａｖｒＲｐ２⁺）、または
同質遺伝子型の非非病原性（ｎｏｎａｖｉｒｕｌｅｎｔ）コントロール株Ｐ．ｓ
ｙｒｉｎｇａｅｐｖ．ｇｌｙｃｉｎｉａＲａｃｅ４ｐＶＳＰ６１（Ｐｓ
ｇ）を接種した。接種後２４時間目に葉を収集し、固定し、そして蛍光顕微鏡を
用いることによって、自己蛍光性の死細胞について試験した。図１Ｃは、接種領
域の縁を示し、これは、左（接種）側のみにおける細菌に応答したコンフルエン
トな細胞死を示す。

【図２】図２Ａ〜２Ｂは、植物葉内における細菌の増殖を例示する。図２Ａは、Ｐ．ｓ
ｙｒｉｎｇａｅｐｖ．ｔｏｍａｔｏＤＣ３０００ｐＶ２８８（ａｖｒＲｐ
ｔ２⁺）を接種した、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ系統Ｃｏｌ（Ｃｏｌ−０野生型
，ＲＰＳ２／ＲＰＳ２；ＤＮＤ１／ＤＮＤ１）、ｒｐｓ２（Ｃｏｌ−０ｒｐｓ
２−２０１／ｒｐｓ２−２０１；ＤＮＤ１／ＤＮＤ１）、およびｄｎｄ１（Ｃｏ
ｌ−０およびＲＰＳ２／ＲＰＳ２；ｄｎｄ１／ｄｎｄ１）を示す。図２Ｂは、プ
ラスミドｐＶＳＰ６１に保持された非病原性遺伝子ａｖｒＲｐｍ１の存在（ｐＡ
ｖｒＲｐｍ１、黒記号）または不在（ｐＶＳＰ６１、白記号）によって異なる同
質遺伝子型Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ．ｔｏｍａｔｏＤＣ３０００を接種し
た、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ系統Ｃｏｌ−０およびｄｎｄ１を示す。両方の植物
系統ともＲＲＭ１／ＲＰＭ１遺伝子型である。すべてのデータポイントは、平均
±ＳＤである。

【図３】図３Ａ〜３Ｃは、Ｃｏｌ−０野生型（Ｃｏｌ）植物およびＣｏｌ−０ｄｎｄ
１／ｄｎｄ１変異体（ｄｎｄ１）植物のＲＮＡブロット分析によってモニターさ
れた、感染特異的（ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ）遺伝子発現を
示す。図３Ａは、病原体を含まない（φ）か、非非病原性コントロール株Ｐ．ｓ
ｙｒｉｎｇａｅｐｖ．ｔｏｍａｔｏＤＣ３０００ｐＶＳＰ６１（ｖｉｒ）
を含むか、または同質遺伝子型ａｖｒＲｐ２発現株Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ
．ｔｏｍａｔｏＤＣ３０００ｐＶ２８８（ａｖｒ）を含む、１０ｍＭＭｇ
Ｃｌ₂での葉の処理後７２時間目のβ−グルカナーゼ発現を例示する。図３Ｂは
、図３Ａにおける通りの処理後２４時間目のＰＲ−１発現を例示する。図３Ｃは
、構成的なβ−ＡＴＰａｓｔｍＲＮＡのレベルに対して正規化された、図３Ｂ
に示されるブロットからのＰＲ−１発現のＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ定量を
示す。類似の結果が、複数の実験において得られた。

【図４】図４Ａ〜４Ｂは、Ｃｏｌ−０植物および変異体Ｃｏｌ−０ｄｎｄ１−１ｄｎ
ｄ１−１植物またはＣｏｌ−０ｄｎｄ２−１／ｄｎｄ２−１植物における、サ
リチル酸およびグルコシド結合体化サリチル酸化合物のレベルを示す。

【図５】図５Ａおよび５Ｂは、ｄｎｄ１変異体植物およびｄｎｄ２変異体植物が、野生
型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓと比較して、フモニシンＢ１（セラミドシンターゼの
インヒビター）によって誘導される細胞死に対してより高い抵抗性を示すことを
例証する。図５Ａは、コントロール（Ｃｏｌ）植物およびｄｎｄ１変異体植物を
用いて作成された、フモニシンＢ１の用量応答曲線である。図５Ｂは、野生型Ａ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓと比較した、フモニシン処理後のｄｎｄ２変異体植物の遅
延した応答を示す。両方のグラフにおけるＹ軸は、０〜５の尺度で評価された壊
死の重篤度を示す（０＝病斑なし、５＝完全壊死）。

【図６】図６は、ＡｔＣＮＧＣ２／ＤＮＤ１遺伝子を含むゲノム領域のヌクレオチド配
列（５，８９７ヌクレオチド長）を示す。注目に値する特徴は以下の通りである
：ｎｔ１６３２；ＡｔＣＮＧＣ２／ＤＮＤ１ｃＤＮＡの５’末端，ｎｔ１
６６３；ＡＴＧ推定開始コドン，ｎｔ１７１６；ＡｔＣＮＧＣ２／ＤＡＤ１遺
伝子のエキソン１の末端，ｎｔ２０８８〜２７６３；エキソン２，ｎｔ２９
２８〜３１４３；エキソン３，ｎｔ３３３３〜３６５２；エキソン４，ｎｔ
３７４７〜３８６３；エキソン５，ｎｔ３９５３〜４１９２；エキソン６，ｎ
ｔ４２７５〜４３６３；エキソン７，ｎｔ４４７８〜５１５３；ＡｔＣＮＧ
Ｃ２／ＤＮＤ１ｃＤＮＡの３’末端，ｎｔ４９８７そしてＴＡＡ推定終止コ
ドン。本発明において記載されるｄｎｄ１変異体は、ＧからＡへの点変異を含み
、下線を付したように３１０１ｎｔ位で終止コドンを作製する。図６に示される
配列は、配列番号１の配列と同一である。

【図７】図７は、ＤＮＤ１遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配
列番号３）を示す。

【図８】図８は、ＡｔＣＮＧＣ２／ＤＮＤ１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号
２）を示す。

【図９】図９は、補完性研究の結果を例証する。ＢＡＣ３Ｈ２に由来する３つの補完的
コスミド（１Ａ８、１Ｈ２および１Ｈ３）を、黒色棒によって示す。斜線棒は、
ｄｎｄ１矮性表現型を補完できなかったコスミドを表す。数値データは、各コス
ミドについて試験されたＴ２植物の総数の中からサイズを補完した植物の数であ
る。

【図１０】図１０は、コスミド１Ａ８および１Ｈ２で形質転換されたＴ２Ｃｏｌ−０
ｄｎｄ１／ｄｎｄ１植物の応答を示す。Ｔ２植物は、サイズについて、３：１（
野生型：矮性）に分離した。両方の型の植物に、ＰｓｇＲ４ａｖｒＲｐｔ２
またはＰｓｇＲ４（非ａｖｒ）と接種した。ＨＲを、接種後２４時間目にスコ
ア付けした。ＨＲの程度を、それぞれ、０（ＨＲなし）〜５（重篤なＨＲ）で評
価した。矮性丈の植物について、７、３および４植物を、それぞれ、ｄｎｄ１、
１Ａ８および１Ｈ２に関して試験した。数値は、野生型サイズの植物に対する、
１植物体あたり３葉（ａｖｒ）および１植物体あたり１葉（非ａｖｒ）の平均を
示す。矮性植物スコアは、少なくとも６つの接種葉（ａｖｒ）または３葉（非ａ
ｖｒ）の平均を表す。

【図１１】図１１は、コスミド１Ｈ３で形質転換されたＣｏｌ−０ｄｎｄ１／ｄｎｄ１
植物における、病原性Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ．ｔｏｍａｔｏ（ｐｓｔ）Ｄ
Ｃ３０００の増殖を示す。３：１（野生型：矮性）のサイズに分離する、６週齢
のＴ２植物に、ａｖｒ遺伝子を有さないＰｓｔＤＣ３０００を接種した。細菌
増殖を、野生型サイズのＴ２植物、ならびにＣｏｌ−０コントロールおよびｄｎ
ｄ１コントロールについて、接種後０日目、２日目、および４日目にサンプリン
グした。矮性丈のＴ２植物については、細菌増殖を、接種後３日目のみにサンプ
リングした（Ｘによって示される）。

【図１２】図１２は、補完的コスミドおよびサブクローンを示す。補完的コスミドは、黒
色棒によって表される。補完的サブクローンは、斑点を付けた棒によって表され
、そしてそれらの親コスミドの直ぐ上に示される。補完できなかったコスミドお
よびサブクローンは、白色棒によって表される。注記された場合を除き、サブク
ローンは、ＥｃｏＲＩおよび／またはＸｂａＩを用いて作製された。

【図１３】図１３は、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＤＮＤ２（ＡｔＣＮＧＣ１）遺伝子を含
むゲノム領域のヌクレオチド配列（配列番号４）を示す。

【図１４】図１４は、ＤＮＤ２（ＡｔＣＮＧＣ１）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番
号５）を示す。

【図１５】図１５は、ＤＮＤ２（ＡｔＣＮＧＣ１）遺伝子によってコードされるタンパク
質のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。

【図１６】図１６は、ＡｔＣＮＧＣ１／ＤＮＤ２をコードする、図１３に示されるＡｒａ
ｂｉｄｏｐｓｉｓゲノムＤＮＡフラグメント（配列番号４）での形質転換による
、ｄｎｄ２小ロゼットサイズ表現型の補完性研究の結果を示す。「Ｃｏｌ＋ベク
ター」は、ベクターのみで形質転換された野生型植物を表し、「ｄｎｄ２＋ベク
ター」は、ベクターのみで形質転換されたｄｎｄ２変異体植物を表し、そして「
ｄｎｄ２＋ＡｔＣＮＧＣ１」は、ＡｔＣＮＧＣ１／ＤＮＤ２をコードする、図１
３に示されるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓゲノムＤＮＡフラグメント（配列番号４）
を含むベクターで形質転換されたｄｎｄ変異体植物を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ユ，イ−チンアメリカ合衆国ノースカロライナ 27510，カーボロ，ナンバー421， 54 バイパスウエスト 201エイチダブリューワイ (72)発明者クロフ，スティーブンジェイ．アメリカ合衆国イリノイ 61801，アーバナ，ダブリュー．ネバダストリート 308 (72)発明者フェングラー，ケビンエイ．アメリカ合衆国メリーランド 21921，エルクトン，ストーンゲイトブールバード 1206 (72)発明者スミス，ロジャーケイ．ジュニアアメリカ合衆国ウィスコンシン 53711，マディソン，ナンバー206，ミッケルソンパークウェイ 2800 Ｆターム(参考） 2B030 AD05 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 CA04 DA01 EA04 FA02 GA11 HA12 4B063 QA01 QA18 QQ04 QQ43 QR55 QS25 QS34 4B065 AA88X AA89Y AB01 AC20 BA02 CA53

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】サイクリックヌクレオチドゲートイオンチャネル（ＣＮＧＣ
）ＤＮＤ遺伝子または遺伝子産物を、ダウンレギュレーションすること、変異さ
せること、または不活性化することによって、植物における病害抵抗性を改良す
る方法。
【請求項２】前記病害が、植物病原体の結果である、請求項１に記載の方
法。
【請求項３】前記植物病原体が、ウイルス、細菌および真菌からなる群か
ら選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記病原体が、タバコ輪点ウイルスを含むネポウイルス属の
群から選択されるウイルスである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】前記病原体が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅ
ｐｖ．ｔｏｍａｔｏおよびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ
ｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓを含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属またはＸａｎｔ
ｈｏｍｏｎａｓ属の細菌を含む、グラム陰性細菌である、請求項３に記載の方法
。
【請求項６】前記病原体が、Ｅｒｙｓｉｐｈｅｏｒｏｎｔｉｉを含む、
Ｅｒｙｓｉｐｈｅ属の真菌を含む、子嚢菌綱真菌である、請求項３に記載の方法
。
【請求項７】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、配列番号２
に対して相同性である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、低いストリ
ンジェンシー条件下で、配列番号２とハイブリダイズする遺伝子である、請求項
７に記載の方法。
【請求項９】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、中程度のス
トリンジェンシー条件下で、配列番号２とハイブリダイズする遺伝子である、請
求項７に記載の方法。
【請求項１０】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、高いスト
リンジェンシー条件下で、配列番号２とハイブリダイズする遺伝子である、請求
項７に記載の方法。
【請求項１１】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、配列番号
５に対して相同性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、低いスト
リンジェンシー条件下で、配列番号５とハイブリダイズする遺伝子である、請求
項１１に記載の方法。
【請求項１３】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、中程度の
ストリンジェンシー条件下で、配列番号５とハイブリダイズする遺伝子である、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、高いスト
リンジェンシー条件下で、配列番号５とハイブリダイズする遺伝子である、請求
項１１に記載の方法。
【請求項１５】前記ダウンレギュレーションまたは前記不活性化が、前記
植物中でＣＮＧＣアンチセンス分子もしくはＣＮＧＣセンス分子、または、ＤＮ
Ｄアンチセンス分子もしくはＤＮＤセンス分子を発現させることによって達成さ
れる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】前記ＣＮＧＣアンチセンス分子もしくは前記ＣＮＧＣセン
ス分子、または、前記ＤＮＤアンチセンス分子もしくは前記ＤＮＤセンス分子が
、誘導可能プロモーターの制御下で発現される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】前記誘導可能プロモーターが、病原体誘導可能プロモータ
ーである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】請求項１に記載の方法に従って改変された、形質転換植物
または形質転換植物組織または形質転換種子。
【請求項１９】ＣＮＧＣアンチセンス分子またはＤＮＤアンチセンス分子
を含む、形質転換植物または形質転換植物組織または形質転換種子。
【請求項２０】ＣＮＧＣセンス分子またはＤＮＤセンス分子を含む、形質
転換植物または形質転換植物組織または形質転換種子。
【請求項２１】植物に、ＣＮＧＣ活性化のインヒビターを与えることによ
って、該植物における病害抵抗性を改良する方法。
【請求項２２】ＣＮＧＣ遺伝子もしくはＣＮＧＣ遺伝子産物、または、Ｄ
ＮＤ遺伝子もしくはＤＮＤ遺伝子産物を、ダウンレギュレーションすること、変
異させること、または不活性化することによって、植物における細胞死を制御す
る方法。
【請求項２３】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、配列番号
２に対して相同性である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、低いスト
リンジェンシー条件下で、配列番号２とハイブリダイズする遺伝子である、請求
項２３に記載の方法。
【請求項２５】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、中程度の
ストリンジェンシー条件下で、配列番号２とハイブリダイズする遺伝子である、
請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、高いスト
リンジェンシー条件下で、配列番号２とハイブリダイズする遺伝子である、請求
項２３に記載の方法。
【請求項２７】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、配列番号
５に対して相同性である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、低いスト
リンジェンシー条件下で、配列番号５とハイブリダイズする遺伝子である、請求
項２７に記載の方法。
【請求項２９】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、中程度の
ストリンジェンシー条件下で、配列番号５とハイブリダイズする遺伝子である、
請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、高いスト
リンジェンシー条件下で、配列番号５とハイブリダイズする遺伝子である、請求
項２７に記載の方法。
【請求項３１】前記ダウンレギュレーションまたは前記不活性化が、ＣＮ
ＧＣアンチセンス分子もしくはＣＮＧＣセンス分子、または、ＤＮＤアンチセン
ス分子もしくはＤＮＤセンス分子を用いることによって達成される、請求項２２
に記載の方法。
【請求項３２】前記センス分子または前記アンチセンス分子が、誘導可能
プロモーターの制御下で発現される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】前記誘導可能プロモーターが、病原体誘導可能プロモータ
ーである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】サイクリックヌクレオチドゲートイオンチャネルＣＮＧＣ
遺伝子もしくはサイクリックヌクレオチドゲートイオンチャネルＣＮＧＣ遺伝子
産物、または、ＤＮＤ遺伝子もしくはＤＮＤ遺伝子産物を、ダウンレギュレーシ
ョンすること、変異させること、または不活性化することによって、植物におけ
る病原体攻撃に応答する過敏感応答を減少させる方法。
【請求項３５】前記病原体が、ウイルス、細菌および真菌からなる群から
選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】前記病原体が、タバコ輪点ウイルスを含むネポウイルス属
の群から選択されるウイルスである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】前記病原体が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａ
ｅｐｖ．ｔｏｍａｔｏおよびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ
ｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓを含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属またはＸａｎ
ｔｈｏｍｏｎａｓ属の細菌を含む、グラム陰性細菌である、請求項３５に記載の
方法。
【請求項３８】前記病原体が、Ｅｒｙｓｉｐｈｅｏｒｏｎｔｉｉを含む
、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ属の真菌を含む、子嚢菌綱真菌である、請求項３５に記載の
方法。
【請求項３９】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、配列番号
２に対して相同性である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、低いスト
リンジェンシー条件下で、配列番号２とハイブリダイズする遺伝子である、請求
項３９に記載の方法。
【請求項４１】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、中程度の
ストリンジェンシー条件下で、配列番号２とハイブリダイズする遺伝子である、
請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、高いスト
リンジェンシー条件下で、配列番号２とハイブリダイズする遺伝子である、請求
項３９に記載の方法。
【請求項４３】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、配列番号
５に対して相同性である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、低いスト
リンジェンシー条件下で、配列番号５とハイブリダイズする遺伝子である、請求
項４３に記載の方法。
【請求項４５】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、中程度の
ストリンジェンシー条件下で、配列番号５とハイブリダイズする遺伝子である、
請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、高いスト
リンジェンシー条件下で、配列番号５とハイブリダイズする遺伝子である、請求
項４３に記載の方法。
【請求項４７】前記ダウンレギュレーションまたは前記不活性化が、前記
植物中でＣＮＧＣアンチセンス分子もしくはＣＮＧＣセンス分子、または、ＤＮ
Ｄアンチセンス分子もしくはＤＮＤセンス分子を発現させることによって達成さ
れる、請求項３４に記載の方法。
【請求項４８】前記センス分子または前記アンチセンス分子が、誘導可能
プロモーターの制御下で発現される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】前記誘導可能プロモーターが、病原体誘導可能プロモータ
ーである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】ＣＮＧＣ遺伝子またはＤＮＤ遺伝子をスクリーニングする
ことによって、植物において病害抵抗性遺伝子を同定する方法。
【請求項５１】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、配列番号
２として与えられるＡｔＣＮＧＣ２／ＤＮＤ１である、請求項５０に記載の方法
。
【請求項５２】前記ＣＮＧＣ遺伝子または前記ＤＮＤ遺伝子が、配列番号
５として与えられるＡｔＣＮＧＣ１／ＤＮＤ２である、請求項５０に記載の方法
。