CN117430679A - 来源于小麦的广谱抗病相关蛋白及其相关生物材料与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了来源于小麦的广谱抗病相关蛋白及其相关生物材料与应用。该蛋白质为下述任一种：A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质，A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。本发明的TaCNGC5.1过表达株系的抗病性显著提高，由此可见TaCNGC5.1将在培育条锈病抗性增强的植物育种中发挥重要的作用。

Description

来源于小麦的广谱抗病相关蛋白及其相关生物材料与应用
技术领域
本发明属于遗传工程领域，具体涉及来源于小麦的广谱抗病相关蛋白及其相关生物材料与应用。
背景技术
小麦条锈病是由小麦条锈菌(Puccinia stiiformis f.sp.tritici)引起的小麦重大病害，在世界范围内危害严重。中国是世界上最大的条锈病流行区，年均发病面积约400万公顷。条锈菌侵染进入寄主植物后，寄主植物出现了黄萎和坏死等症状。或当真菌在寄主表面产生了大量的夏孢子堆时，绿色叶片和组织减少，导致了植物的光合作用大大降低。
自然界中，植物进化出成熟的防御机制来抵御病原微生物的侵染。这些防御机制包括寄主植物的防卫反应(PAMP-triggered immunity，PTI)和效应蛋白诱导的防卫反应(Effector-triggered immunity，ETI)。ETI通常伴随着过敏性坏死反应的发生(Hypersensitive response，HR)。HR是植物中最常见的抗病形式，具体表现为侵染点局部形成枯死并限制病原菌的生长。由于MAMPs、PAMPs或者是DAMPs非常保守，因此PTI很容易的被大部分病原菌识别，而效应蛋白具有高度的特异性，从而使ETI在不同物种或是不同生理小种间存在差异。尽管激活效应蛋白诱导的防卫反应(Effector-triggered immunity，ETI)和寄主植物的防卫反应(PAMP-triggered immunity，PTI)的方式不同，但是两者均能诱导一系列的植物免疫反应，包括脂膜上的离子流动、细胞内钙离子浓度的增长、活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的形成、激活MAPK(Mitogen-activatedprotein kinase)信号通路等。随后引起的反应包括：抗菌蛋白的分泌、细胞壁木质化等。
因此，挖掘小麦抗病基因，了解小麦在条锈菌胁迫下的应答与信号传导机制，提高小麦的抗病性，成为小麦条锈病的可持续控制的重要手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种小麦抗病基因。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种蛋白质或调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控蛋白质活性和/或含量的物质在下述D1)-D6)中的用途：
所述蛋白质名称为TaCNGC5.1，为下述任一种：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
所述D1-D6为下述任一种，
D1)增加小麦抗病性；
D2)制备提高小麦抗病性的产品；
D3)培育抗病性提高的小麦；
D4)制备培育抗病性提高的小麦的产品；
D5)改良高抗病性小麦或制备高抗病性小麦的产品；
D6)小麦育种。
本发明提供的蛋白质来源于小麦品种水源11(Triticum aestivum)。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。所述标签蛋白包括但不限于表1中所列的标签蛋白。
表1、标签蛋白的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tagII 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述A2)中的蛋白质TaCNGC5.1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)中的蛋白质TaCNGC5.1的编码基因可通过将SEQ ID No.1所示的DNA序列进行缺失和/或错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码TaCNGC5.1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的TaCNGC5.1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码TaCNGC5.1且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
所述调控蛋白质TaCNGC5.1的编码基因表达的物质可为增强蛋白质TaCNGC5.1的编码基因表达、上调蛋白质TaCNGC5.1的编码基因表达或提高蛋白质TaCNGC5.1的编码基因表达。所述调控蛋白质TaCNGC5.1的蛋白质活性和/或含量可为增强蛋白质TaCNGC5.1的活性和/或含量、可为上调蛋白质TaCNGC5.1的活性和/或含量、可为提高蛋白质TaCNGC5.1的活性和/或含量。
所述小麦的抗病性为抗条锈病。该条锈病可通过条锈菌生理小种CYR31、CYR32、CYR33和CYR34中至少一种病原的感染引起。
上文中所述物质为生物材料，所述生物材料为下述任一种：
B1)编码所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。
其中，B1)所述核酸分子为编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子，编码SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
上述生物材料中，所述的含有编码TaCNGC5.1的核酸分子的表达盒(TaCNGC5.1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达TaCNGC5.1的DNA，该DNA不但可包括启动TaCNGC5.1转录的启动子，还可包括终止TaCNGC5.1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。
可用现有的表达载体构建含有所述TaCNGC5.1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1305、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。
本发明还提供一种培育抗病性提高的转基因小麦的方法，包括上调或增强或提高目的小麦中前述蛋白质的编码基因的表达量或所述蛋白质的含量得到抗病性小麦，所述抗病性小麦的抗病性高于所述目的小麦。
上述方法中所述小麦的抗病性为抗条锈病。所述条锈病可通过条锈菌生理小种CYR31、CYR32、CYR33和CYR34中至少一种病原的感染引起。抗条锈病具体体现在如下(1)-(3)中任一种：(1)在条锈菌胁迫条件下，侵染转基因小麦的条锈菌产孢量低于受体植物；(2)条锈菌胁迫条件下，转基因植物的病程相关基因的表达水平高于受体植物；(3)条锈菌胁迫条件下，侵染转基因小麦的条锈菌菌丝侵染面积低于受体植物。所述条锈菌胁迫为亲和或非亲和处理，亲和处理用CYR31菌种，非亲和处理用CYR23菌种。
所述小麦具体为野生型小麦Fielder。
上述方法中所述上调或增强或提高目的小麦中前述蛋白质的编码基因的表达量或所述蛋白质的含量为将前述蛋白质的编码基因导入所述目的小麦。
在本发明的实施方式中，TaCNGC5.1蛋白质的编码基因(即SEQ ID No.2所示的核苷酸)通过含有TaCNGC5.1蛋白质的编码基因的表达盒的重组载体CUB-TaCNGC5.1导入农杆菌EHA105中。所述重组载体CUB-TaCNGC5.1是用同源重组的方法将为将TaCNGC5.1的DNA片段插入CUB载体且保持CUB载体的其他序列不变。载体酶切位点为BamH1。
上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述TaCNGC5.1基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
前述蛋白质、B1)-B4)所述生物材料也属于本发明所保护的范围。
本发明的实验证明，本发明发现的TaCNGC5.1基因受条锈菌诱导表达，且将TaCNGC5.1基因导入小麦中得到的转基因小麦，其对条锈菌多个生理小种的抗性高于野生型小麦。本发明提供的蛋白和基因为人为控制抗病相关基因的表达提供了基础，将在培育广谱抗病的植物中发挥重要的作用。
附图说明
图1为TaCNGC5.1在小麦与条锈菌互作组合中的表达特征。
图2为TaCNGC5.1在小麦原生质体中的定位结果。
图3为TaCNGC5.1过表达小麦T3代的PCR鉴定结果。
图4为TaCNGC5.1转基因小麦的抗病性鉴定(CYR31、CYR32、CYR33、CYR34)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的GFP16318(绿色荧光蛋白)载体记载于文献“谷子WRKY36转录因子的分子特性及功能鉴定[J].中国农业科学,2015,48(5):851-860.”，公众可从西北农林科技大学处获得。
下述实施例中的小麦条锈菌生理小种CYR23在文献“Liu P,Guo J,Zhang R,etal.TaCIPK10 interacts with and phosphorylates TaNH2 to activate wheat defenseresponses to stripe rust[J].Plantbiotechnologyjournal,2019,17(5):956-968.”中公开过。公众可从西北农林科技大学处获得。
下述实施例中的小麦品种Fielder、小麦条锈菌生理小种CYR32、CYR33和CYR34在文献“Bai X,Zhan G,Zhang R,Tian S,et al.Transcription factor BZR2 activateschitinase Cht20.2 transcription to confer resistance to wheat stripe rust[J].Plantphysiology,2021,187:2749-2762.”中公开过。公众可从西北农林科技大学处获得。
下述实施例中的小麦条锈菌生理小种CYR31在文献“王凤乐,吴立人,徐世昌,金社林,贾秋珍,袁文焕,杨家秀.中国条锈菌新小种条中30、31号的研究[J].植物保护学报,1996(01):39-44.”中公开过。公众可从西北农林科技大学处获得。
下述实施例中的小麦品种水源11在文献“曹张军,井金学,王美南,等.国内重要抗源品种水源11,水源92及Hybrid46抗条锈基因关系分析[J].西北植物学报,2003,23(1):64-68.”中公开过。公众可从西北农林科技大学处获得。
Cellulase R10(YaKult Honsha)纤维素酶(Yakult，C6270-1 g)、Mecerozyme R10(YaKult Honsha)果胶酶(荣兴生物，RX-L0042-100 mg)、Mannitol甘露醇(北京梦怡美商贸中心，M0122-500 g)、KOH(北京溪洋汇智科技有限公司，XYHZ-2017-05185)、KCl(北京宝瑞杰科技有限公司，7447-40-7)、MES(北京拜尔迪生物技术有限公司，DE-E169-100 g)、CaCl2(北京拜尔迪生物技术有限公司，031-00435)、NaCl(北京拜尔迪生物技术有限公司，7647-14-5)、MgCl2(北京拜尔迪生物技术有限公司，DE-0288-500g)、Glucose(北京拜尔迪生物技术有限公司，049-31165)、PEG4000(北京拜尔迪生物技术有限公司，BR-0084)、BSA牛血清蛋白(北京泽平科技有限责任公司，0219989980)、β-Mercaptoethanol巯基乙醇(北京瑞德百奥生物科技有限公司，0482-100ml)。
下述实施例中所使用的试剂配方如下：
表2、纤维素酶解液配方
表3、PEG4000溶液
表4、W5溶液
表5、MMG溶液
表6、WI溶液
实施例1、TaCNGC5.1蛋白及其编码基因的获得
一、mRNA的分离及TaCNGC5.1的扩增
取正常生长的7天大的小麦水源11的幼苗，用液氮速冻，-80℃保存备用。
利用多糖多酚植物RNA提取试剂盒(华越洋生物科技有限公司)提取小麦叶片总RNA，第一链cDNA合成用反转录酶XL(AMV)。采用SMART法合成cDNA，以该cDNA为模板，TaCNGC5.1-F和TaCNGC5.1-R为引物进行PCR，PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，得到2070bp的PCR产物。扩增引物为：
TaCNGC5.1-F:5｀-ATGGACGGCCCCGGCAGCGGCCACC-3｀；
TaCNGC5.1-R:5｀-TTAGTCTTTTGGCTTGGGCAGCAGA-3｀。
经过测序，该PCR产物具有序列表中序列2(SEQ ID No.2)所示的核苷酸，该核苷酸具有的基因命名为TaCNGC5.1基因，该基因的核苷酸序列为序列表中序列2(SEQ ID No.2)，编码的蛋白的氨基酸序列为序列表中序列1(SEQ ID No.1)所示，该蛋白命名为TaCNGC5.1蛋白。
SEQ ID No.1(689AA)
MDGPGSGHQMDSYFSRAPKIRSRSIRMAAAGVMSQSERLKNIGRRVFQEDLKSISLKIYDPQDPFLMRMNRLFVFACIISVATDPLFFYLPSVNVTQSNTCIGFKRELAVAATAVRTAIDFFYLARIVLQFHTAFIAPSSRVFGRGELVVDHGDIARRYLRRFFVVDLLSVLPLPQIQMYKFFMKPKNADLLPVKTALFFNVLTQYLPRLLRFYPITAELRRTTGVFAETALSGAAFYLLLYMLCSHMVGSFWYLLAVERLDDCWREKCAGLKFHQCRIYMYCGGKQEGDEDDFMKWRTMIRQVLAQECAPVDNNGTGFSYGIYTSAMTSGVTHTNDLVPKILYCLWWGLQNLSSGAQGLETTHYKGEALFAIILAVFGLILMALLIGNMQTYLQSMTLRMEEMRLKRRDSEEWMRHRDLPDDLRERVWRHNQYKWLETRGVDEDGLVSCLPKDIRRDVKRHLCLRLVRRVPLFANMDERLLDAICERLKPSLCTETTYVVREGEPVDEMLFIIRGRLESSTTDGGRTGFFNKGLLKEGDFCGEELLTWALDPKAAANLPLSTRSVKALSEVEGFALHADELKFVAGQFRRLHSKQLQQTFRFYSQQWRT WASCFIQAAWRRYEKRKAAEHRRREEEEMYAAEMVSASSSSQIKTAFLVSRFAKNAMRGVQRQRSHQEERLILLPKPKD
SEQ ID No.2(2070bp)
ATGGACGGCCCCGGCAGCGGCCACCAGATGGACAGCTACTTCTCCCGCGCCCCCAAGATCCGGTCCCGGTCCATCCGCATGGCGGCTGCCGGCGTGATGAGCCAGTCGGAGCGGCTCAAGAACATCGGGCGCCGTGTCTTCCAGGAGGACCTTAAGAGCATCTCCCTCAAGATCTACGACCCGCAGGACCCGTTCCTGATGCGCATGAACCGCCTCTTCGTCTTCGCCTGCATCATCTCCGTCGCCACCGACCCGCTCTTCTTCTACCTCCCTTCCGTCAACGTGACCCAGAGCAACACATGCATCGGCTTCAAACGTGAACTGGCCGTCGCTGCCACCGCTGTGCGCACCGCCATCGACTTCTTCTACCTGGCGCGGATCGTGCTGCAGTTCCACACCGCCTTCATCGCGCCGTCGTCGCGGGTGTTTGGCCGCGGGGAGCTCGTCGTCGACCATGGTGACATAGCGCGCCGCTACCTCCGCCGTTTTTTCGTCGTCGACCTCCTCTCTGTGCTCCCCCTGCCACAAATCCAGATGTACAAGTTCTTCATGAAGCCCAAGAACGCGGACCTGCTTCCCGTCAAGACGGCGCTCTTCTTCAACGTACTCACCCAGTACTTGCCCCGCCTCCTCCGCTTCTACCCTATCACCGCCGAACTCAGGCGCACCACCGGCGTCTTCGCAGAGACTGCCTTATCCGGCGCCGCCTTCTACCTCCTCCTCTACATGCTATGCTCACACATGGTGGGTTCCTTCTGGTACCTCCTCGCCGTCGAGCGCCTCGACGACTGCTGGCGCGAGAAGTGCGCGGGGCTCAAGTTCCACCAGTGCAGGATATACATGTACTGCGGGGGGAAACAAGAGGGCGATGAGGACGACTTCATGAAGTGGCGGACCATGATCCGGCAGGTGCTCGCGCAGGAGTGCGCGCCTGTGGACAACAACGGCACGGGCTTCAGCTACGGCATCTACACCTCCGCCATGACCTCAGGGGTCACCCACACCAACGACCTCGTCCCGAAGATTCTCTACTGCCTGTGGTGGGGTCTCCAGAACCTCAGCAGTGGCGCCCAGGGGCTGGAGACCACGCACTACAAGGGGGAGGCCCTTTTCGCCATCATCCTCGCGGTCTTCGGCCTCATCCTCATGGCGCTGCTCATCGGCAACATGCAGACGTACCTCCAGTCCATGACGCTGCGTATGGAGGAGATGCGGCTCAAGCGGCGGGACTCGGAGGAGTGGATGCGCCATCGCGACCTCCCCGATGACCTCCGGGAGCGTGTGTGGCGACACAACCAGTACAAGTGGCTGGAGACGCGGGGCGTGGACGAGGACGGCCTTGTGAGCTGCCTCCCCAAGGACATCCGGCGAGACGTCAAGCGCCACCTCTGCCTCCGCCTCGTCCGCCGCGTGCCGCTCTTTGCCAACATGGACGAGCGCCTCCTCGACGCCATCTGCGAGAGGCTCAAGCCCAGCCTATGCACGGAGACCACCTACGTGGTGCGGGAAGGGGAGCCCGTCGACGAGATGCTCTTCATCATCAGAGGCCGGCTCGAGAGTTCCACCACCGACGGGGGCCGCACGGGGTTCTTCAACAAGGGGCTCCTCAAGGA AGGGGACTTCTGCGGCGAGGAGCTCCTCACATGGGCGCTGGACCCAAAGGCTGCGGCGAACCTGCCGCTGTCCACTCGTAGTGTCAAGGCGCTCTCCGAGGTGGAGGGCTTCGCGCTGCACGCCGATGAGCTTAAGTTCGTCGCGGGGCAGTTCCGGCGCCTGCACAGCAAGCAATTGCAGCAGACCTTCAGGTTCTACTCGCAGCAGTGGCGCACCTGGGCGTCGTGCTTCATCCAGGCCGCGTGGAGAAGGTACGAGAAGCGGAAGGCGGCGGAGCATCGGAGGCGAGAGGAGGAAGAGATGTACGCCGCCGAGATGGTGTCTGCGTCGTCGTCGAGCCAGATCAAGACAGCGTTCCTCGTGTCGAGGTTCGCCAAGAATGCCATGCGCGGTGTGCAACGCCAGCGGTCGCACCAGGAGGAGAGGCTCATTCTGCTGCCCAAGCCAAAAGACTAA
二、RT-PCR检测TaCNGC5.1受条锈菌诱导表达情况
1、实验材料的准备
小麦条锈菌接种参照康振生等(1984，西北农学院学报)描述的方法。小麦水源11叶片分别接种条锈菌非亲和小种CYR23或条锈菌亲和小种CYR31组成非亲和与亲和互作组合，接种无菌水作为对照。
分别于接种后0h、6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h取样，对照取样时间点与处理保持一致。取样时，剪取新鲜叶片，用锡铂纸包好，投入液氮中速冻，后置于-80℃保存备用。采用Trizol法(TianGen)提取小麦叶片总RNA，第一链cDNA合成用反转录酶XL(AMV)。采用SMART法合成cDNA。
2、RT-PCR检测TaCNGC5.1的表达量
根据小麦TaCNGC5.1和延伸因子基因TaEF-1α的序列(GenBank登陆号：U76744)设计特异的定量PCR引物，具体序列如下：
RT-PCR引物序列为：
QTaCNGC5.1-F：5’-GCGGCCACCAGATGGACAGCTACTT-3’
QTaCNGC5.1-R：5’-TCTTAAGGTCCTCCTGGAAGACACG-3’。
QTaEF-F：5’-TGGTGTCATCAAGCCTGGTATGGT-3’
QTaEF-R：5’-ACTCATGGTGCATCTCAACGGACT-3’
定量PCR引物在使用前需检测其扩增产物的特异性及扩增效率(≥90％)，TaEF-1α在Real-time PCR分析中作为内参基因。使用AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，中国南京)和Bio-Rad CFX Manager定量PCR仪器(Bio-rad，Hercules，California)，参照说明书，分别以各处理取样点的cDNA为模板进行实时定量PCR扩增。每个反应至少做3个重复，各个重复的Ct值及其平均值和标准差通过手动调节基线由定量PCR仪生成。每个反应做3个重复，Ct值取平均值，采用Delta Delta Ct法分析实验数据，确定基因的相对表达量。
TaCNGC5.1在小麦水源11分别接种条锈菌非亲和小种CYR23和条锈菌亲和小种CYR31后的qRT-PCR的结果如图1所示，由图1可知，TaCNGC5.1在非亲和组合和亲和组合中表现出接种后侵染前期上调表达。由此可见，TaCNGC5.1受条锈菌诱导表达。
三、TaCNGC5.1亚细胞定位分析
1、载体构建
将上述“一、mRNA的分离及TaCNGC5.1的扩增”中扩增到的PCR产物TaCNGC5.1片段连接到经过BamH I酶切后的GFP16318(绿色荧光蛋白)载体上，得到重组载体TaCNGC5.1-GFP，该重组载体TaCNGC5.1-GFP可表达融合蛋白TaCNGC5.1-GFP。
用于TaCNGC5.1亚细胞定位的TaCNGC5.1-GFP的引物序列如下(下划线表示酶切位点BamH I)：
TaCNGC5.1-GFP-F:
5’-TATCTCTAGAGGATCCATGGACGGCCCCGGCAGCGGCCACC-3’
TaCNGC5.1-GFP-R:
5’-TGCTCACCATGGATCC GTCTTTTGGCTTGGGCAGCAGAATG-3’。2、原生质体制备
小麦原生质体制备转化方法：
⑴土培室播种种植的水源11小麦。
⑵生长良好情况下，在未开花前取叶片制备原生质体。
⑶剪取中部生长良好的叶片，用刀片切成0.5-1mm宽的叶条。
⑷将切好叶条放入预先配好的表2所示的纤维素酶解液中，每5-10ml酶解液大约可酶解10-20片叶子。用镊子使叶子完全浸入酶解液。
⑸真空泵于黑暗中(锡箔纸包裹)抽真空30分钟。配制表3所示PEG4000溶液，200ul和1000μl枪头去尖，使操作时吸打缓和。
⑹在室温中无须摇动，继续黑暗条件下28℃50rpm摇动酶解至少3h。当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来。
⑺显微镜下检查溶液中的原生质体，小麦叶肉原生质体大小大约30-50μm。
⑻在过滤除去未溶解的叶片前用等量的表4所示W5溶液(预冷)稀释含有原生质体的酶液。
⑼先用W5溶液润湿35-75μm的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。
⑽用30ml的圆底离心管100g，1-2min，4℃离心，沉淀原生质体，尽量去除上清。然后用10ml冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体。
⑾在冰上静至原生质体30分钟。
以下操作在室温23℃下进行
⑿100g离心8-10min，使原生质体沉淀。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。然后用适量MMG溶液(1ml)重悬原生质体，使之最终浓度在2×105个/ml。
⒀加入10μl或者20ul DNA(10-20微克约5-10kb的重组载体TaCNGC5.1-GFP)至2mlEP管中。
⒁加入100μl原生质体(2×104个)，轻柔混合。
⒂加入110μl PEG溶液，轻柔拍打离心管完全混合(每次大约可以转化6-10个样品)。
⒃诱导转化混合物20-30min(转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更长转化时间)。
⒄室温下用400-440μl W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好，以终止转化反应。
⒅室温下100g离心2min，然后除上清。再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g离心2min去上清。
⒆用1ml WI溶液轻柔重悬原生质体于多孔组织培养皿中。
⒇室温下(20-25℃)诱导原生质体18小时以上。
以转入GFP16318载体为对照。
之后在激光共聚焦显微镜下观察GFP标签表达。
3、小麦原生质体镜检：
将暗培养18h之后的原生质体压片，然后在激光扫描共聚焦显微镜(Bio-RadMicroRadiance)(Laser scanning confocal microscopy,LSMC)观察GFP(绿色荧光蛋白)荧光，并进行扫描照像。LSCM的工作参数为：Ex＝488nm,Em＝525±15nm，Power＝10％,Zoom7,中速扫描，Frame512×512。软件为TIME-COURSE和PHOTOSHOP5.0。
结果见图2(标尺＝10μm)，上面的为转入GFP16318空载体原生质体的对照(16318-GFP)；下面的为转入重组载体TaCNGC5.1-GFP的原生质体(TaCNGC5.1-GFP)中TaCNGC5.1定位图，由图可知TaCNGC5.1定位于细胞膜。
实施例2、TaCNGC5.1基因在提高植物抗条锈病中的应用
一、转TaCNGC5.1基因小麦的获得
1、TaCNGC5.1基因过表达载体的构建
CUB载体记载于文献“谢书章,雷开荣,杨小艳等.农杆菌介导抗虫基因GmCry1F转化玉米的研究[J].西南农业学报,2015,28(3):962-966”，公众可以从西北农林科技大学处获得。
TaCNGC5.1-CUB载体具体构建方法如下：
以TaCNGC5.1-CUB-F和TaCNGC5.1-CUB-R为引物，实施例1的第一部分中扩增得到的TaCNGC5.1全长CDS为模板进行PCR扩增，将扩增得到的片段(具有序列表中SEQ ID No.2中第1-2067所示的核苷酸)利用ClonExpress II One Step Cloning Kit(vazyme)同源重组构建到经过BamH I酶切后的CUB载体上，得到重组载体TaCNGC5.1-CUB。该重组载体TaCNGC5.1-CUB是以SEQ ID No.2中第1-2067核苷酸序列插入CUB载体上且保持其余碱基不变得到的重组载体。
TaCNGC5.1-CUB-F:
5`-CAGGTCGACTCTAGAGGATCCATGGACGGCCCCGGCAGCGGCCACC-3`
TaCNGC5.1-CUB-R:
5`-GAGCTCGGTACCCGGGGATCCGTCTTTTGGCTTGGGCAGCAGAATG-3`。注：下划线表示酶切位点BamH I。
2、转TaCNGC5.1基因小麦的获得
将重组载体TaCNGC5.1-CUB利用农杆菌侵染野生型小麦Fielder的愈伤组织，得到T0代转TaCNGC5.1基因小麦。培育T0代转TaCNGC5.1基因小麦直至得到T3代转TaCNGC5.1基因小麦2个株系。
3、PCR验证
利用CTAB法分别提取T3代转TaCNGC5.1基因小麦2个株系和野生型对照小麦(Fielder)叶片的基因组DNA，利用TaCNGC5.1过表达检测引物(F/R)验证前述植株是否为转基因阳性植株。
F：TGGGGTCTCCAGAACCTCAGCAGTG；
R：AATTGCGGGACTCTAATCATA。
对转基因T3代植株进行分子检测(上游引物F位于TaCNGC5.1基因上，下游引物R位于NOS终止子上)。以水为空白对照。每个株系随机取10株。
结果如图3所示，PCR产物中约2000-1000bp的DNA片段的植株为阳性株系，过表达TaCNGC5.1的T3代两株系(TaCNGC5.1过表达株系17和TaCNGC5.1过表达株系29)均为阳性株系，分别命名为TaCNGC5.1过表达株系17、TaCNGC5.1过表达株系29。
二、转TaCNGC5.1基因小麦的条锈病抗性分析
将野生型小麦Fielder、TaCNGC5.1过表达株系17和TaCNGC5.1过表达株系29种植于25/23℃白天/黑夜温度，16小时光照/8小时黑暗光周期的培养箱。第二叶展开后(图4中A)分别接种条锈菌生理小种CYR31、CYR32、CYR33、CYR34，接种方法记载在文献“康振生,李振岐.洛夫林10常温致病新菌系的发现[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),1984(04):18-28”，在接菌后120小时取接种部位叶片作为RNA提取样品，于接菌后14d观察发病表型。采用Graphpad Prism8.3.0对数据进行处理，试验结果以平均值±标准差表示，采用双尾t检验P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异。
表型结果如图4中A所示，在条锈菌CYR31、CYR32、CYR33、CYR34侵染条件下，对照植株野生型小麦Fielder所有处理的叶片上均观察到大量孢子堆，而TaCNGC5.1过表达株系17、TaCNGC5.1过表达株系29小麦叶片夏孢子堆数量明显减少，褪绿坏死面积增加。同时检测了在条锈菌侵染过程中野生型小麦Fielder、TaCNGC5.1过表达株系17和TaCNGC5.1过表达株系29中TaCNGC5.1的表达量，以不同接菌后120h的RNA为模板，参照实施例1的RT-PCR检测方法检测。结果如图4中B所示，过表达材料中TaCNG C5.1表达量始终比对照高5倍以上。
3、生物量检测
通过对接种条锈菌后14天的小麦进行条锈菌生物量检测。生物量的检测方法记载在文献“Tuo Qi,Jia Guo,Peng Liu,Fuxin He,Cuiping Wan,MdAshraful Islam,Brett MTyler,Zhensheng Kang,Jun Guo，Stripe Rust EffectorPstGSRE1 Disrupts NuclearLocalization ofROS-Promoting Transcription Factor TaLOL2 to Defeat ROS-Induced Defense in Wheat.Mol Plant.2019Dec 2；12(12):1624-1638.”。
结果如图4中C所示，发现过表达小麦中条锈菌生物量明显降低(图4中C)。
上述抗病性鉴定结果表明在CYR31、CYR32、CYR33、CYR34四个生理小种处理条件下，转TaCNGC5.1基因小麦显示出较强的抗性。这在生产应用方面具有佷大优势。
由此可见，TaCNGC5.1是一个参与小麦抗条锈病反应过程的重要基因。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.蛋白质或调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控蛋白质活性和/或含量的物质在下述D1)-D6)中的用途：
所述蛋白质为下述任一种，
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
所述D1-D6为下述任一种，
D1)增加小麦抗病性；
D2)制备提高小麦抗病性的产品；
D3)培育抗病性提高的小麦；
D4)制备培育抗病性提高的小麦的产品；
D5)改良高抗病性小麦或制备高抗病性小麦的产品；
D6)小麦育种。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述小麦的抗病性为抗条锈病。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述物质为生物材料，所述生物材料为下述任一种：
B1)编码所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：B1)所述核酸分子为编码序列是SEQ IDNo.2的cDNA分子或DNA分子。
5.一种培育抗病性提高的转基因小麦的方法，包括上调或增强或提高目的小麦中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达量或所述蛋白质的含量得到抗病性小麦，所述抗病性小麦的抗病性高于所述目的小麦。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述小麦的抗病性为抗条锈病。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述上调或增强或提高目的小麦中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达量或所述蛋白质的含量为将权利要求1中所述蛋白质的编码基因导入所述目的小麦。
8.权利要求1中所述的蛋白质。
9.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：
B1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。
10.根据权利要求9所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为编码序列是SEQID No.2的cDNA分子或DNA分子。
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