CN108642064A - 小麦种子休眠持续期基因TaCNGC-2A及其功能标记 - Google Patents

Abstract

本发明属于作物遗传育种领域，提供一种小麦休眠持续期候选基因TaCNGC‑2A，利用该候选基因获得小麦植株穗发芽抗性持续期判断功能标记，CAPS标记CNG2A，位于TaCNGC‑2A基因启动子‑313位置具有A/T碱基变异，其标记序列如SEQ ID NO.2所示。根据标记序列设计相应标记引物，扩增产物长度为813bp。扩增产物经FokI限制性内切酶(GGATGN₉/)于37℃酶切3h后可直接在1.5％琼脂糖凝胶电泳中进行检测。其中CNG2A‑a等位变异不能被酶切，而CNG2A‑b等位变异为可被酶切类型，酶切产物分别为584bp和229bp，且携带CNG2A‑b等位变异类型的植株比携带CNG2A‑a类型具有更长的穗发芽抗性持续期，本发明提供的标记可直接应用于分子标记辅助小麦抗穗发芽育种选择，也有助于加快抗穗发芽品种的培育进程。

Description

小麦种子休眠持续期基因TaCNGC-2A及其功能标记

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，涉及小麦种子休眠持续期基因TaCNGC-2A及其功能标记。

背景技术

全球约35-40％人口以小麦为主食，中国是全球最大的小麦生产国和消费国，因此，高产、稳产和优质一直是小麦育种的重要目标(何中虎等2018)。然而，小麦收获期若遭遇阴雨天气，容易穗上发芽(简称穗发芽)，如果阴雨天气持续时间较长，则加剧穗发芽，严重影响产量和品质。

种子休眠性是穗发芽抗性的主要遗传因素，包括休眠深度(水平)和持续期两个方面，种子休眠程度深(或水平高)且持续期长的穗发芽抗性持续性就强。但是，以往的研究多关注于收获后某一时期的种子休眠深度对穗发芽抗性的影响，忽略了在麦收季节阴雨持续时间较长的环境下，较长的种子休眠持续期对抗穗发芽持续性的作用。因此，有关种子休眠深度的QTL/基因报道较多，如已克隆的TaSdr(2AS/2BS，Zhang等2014，2017)、TaVp-1(3AL/3BL，Yang等2007；Chang等2011)、TaMFT和TaPHS1(3AS，Nakamura等2011；Liu等2013)以及PM19-A1(4AL，Barrero等2015)和TaMKK3-A(4AL，Torada等2016)；而调控种子休眠持续期的相关QTL/基因报道较少，一定程度上阻碍了穗发芽抗性持续期较长的品种的培育。

因此，培育穗发芽抗性持续期长的小麦品种尤为必要，是减轻其危害的根本途径；挖掘抗穗发芽持续期长的主效QTL及其候选基因，开发功能标记，将有助于加快这类品种的培育进程。

发明内容

本发明提供一种小麦休眠持续期候选基因TaCNGC-2A，该候选基因序列如SEQ IDNO.1所示，全长6842bp，由大小为2151bp的7个外显子、大小为3356bp的6个内含子、为大小906bp的启动子和大小为429bp 3’非翻译区组成，具有控制种子休眠持续期的作用。各品种小麦候选基因TaCNGC-2A序列会有微小差异，但总体结构相同及控制种子休眠持续期作用相同。上所示6842bp大小的TaCNGC-2A统计于小麦红芒春21。

本发明还提供上述小麦候选基因TaCNGC-2A的应用，该候选基因序列如SEQ IDNO.1所示，在候选基因TaCNGC-2A第595个碱基位置(即启动子-313位置)具有A/T碱基变异，具有碱基变异A的植株比具有碱基变异B的植株具有更长的穗发芽抗性持续期。

在该位点携带A碱基的等位变异均来源于遂宁坨坨麦、红芒春21、扬麦16xiao等具有较长穗发芽抗性持续期的小麦品种；而携带T碱基的等位变异均来源于济麦22、京411等持续期较短的小麦品种。遗传资源来源披露表中仅列出京411和红芒春21两个重要的实验材料来源，其他材料或品种在市场均可以买到。

本发明还提供小麦候选基因TaCNGC-2A的扩增引物，扩增引物包括引物CNGC2AL1、CNGC2AL2、CNGC2AL3、CNGC2AL4；其中，CNGC2AL1序列如下：F:TCGTCTTGCCTACCACC，R:GATAGACCAAGTGACAGTAAAAT；CNGC2AL2序列如下：F:TTTACTGTCACTTGGTCTAT，R:TGTGAGTATGTAATGTAGGG；CNGC2AL3序列如下：F:GCCCTACATTACATACTCAC，R:CTATTCGGCAGCAAAAC；CNGC2AL4序列如下：F:GAACTACACTGATTTCCTCCTG，R:AGTGGACCGACCCTGAAT。

本发明还提供一种小麦植株穗发芽抗性持续期判断标记，该标记为CAPS标记CNG2A，序列如SEQ ID NO.2所示全长813bp，第584与585碱基之间具有FokI限制性内切酶酶切位点，第595碱基位置，即启动子-313位置上具有A/T碱基变异，具有碱基变异A的植株比具有碱基变异B的植株具有更长的穗发芽抗性持续期。

本发明还提供一种小麦植株穗发芽抗性持续期判断标记引物，该标记引物为CNG2A，序列为如下：F：TCGTCTTGCCTACCACCCTC；R：CAATCAGCCGACCCTTTAGC。

本发明还提供上述标记的应用，其中，具有碱基变异位点A的CNG2A-a等位变异类型植株比具有碱基变异位点B的CNG2A-b等位变异类型植株具有更长的穗发芽抗性持续期。

本发明还提供上述标记引物的应用，其中，以标记引物CNG2A扩增小麦全基因组DNA，获得扩增产物813bp；以FokI限制性内切酶酶切扩增产物，可被酶切为584bp和229bp片段的为CNG2A-b等位变异类型，不能被酶切的为CNG2A-b等位变异类型；携带CNG2A-b等位变异类型的植株比携带CNG2A-a类型具有更长的穗发芽抗性持续期。

上述标记引物的应用，标记引物扩增条件如下：94℃预变性5min；以95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min为条件进行37个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

扩增产物经FokI限制性内切酶(GGATGN₉/)于37℃酶切3h后可直接在1.5％琼脂糖凝胶电泳中进行检测。其中CNG2A-b为携带A碱基的等位变异，是可被酶切类型，酶切产物长度分别为584bp和229bp；携带CNG2A-b等位变异类型的植株比携带CNG2A-a类型具有更长的穗发芽抗性持续期。

有益效果：

本发明根据京411/红芒春21RIL群体中各家系的种子休眠持续期表型，选择30个持续期极长的家系以及30个持续期极短的家系，分别提取基因组DNA后等量混合，构建极端混池(30+30)，并对其及双亲进行转录组测序，获得两池及亲本间一致的转录组信息，然后筛选差异表达的候选基因(筛选标准为P≤10^-4和错误发生率FDR≤10^-3)。根据中国春转录组参考序列获取目的差异基因CDS序列，通过DNAMAN软件分析该基因CDS序列信息，并在NCBI上Blast比对获取目的基因序列。利用Primer Premier5.0软件设计基因组特异引物在极端穗发芽抗性持续期材料(遂宁坨坨麦、红芒春21、扬麦16、济麦22、京411及烟农19)中进行扩增，测序比对进行等位变异鉴定，并开发功能标记。在260份小麦品种资源和201份微核心种质及京411/红芒春21RIL群体中进行等位变异分析，并对不同等位变异的穗发芽抗性持续期表型进行差异显著性分析，评价该基因变异对穗发芽抗性持续性的作用。

本发明在小麦2AL染色体上克隆一个控制穗发芽抗性持续期的候选基因TaCNGC-2A，并在其启动子-313位置鉴定到一个A/T碱基变异，因此对该位点开发CAPS标记CNG2A，利用连锁群体、自然群体以及微核心种质共同验证了该基因变异对穗发芽抗性持续期的显著效应，可直接应用于小麦抗穗发芽的遗传改良。该标记可直接应用于分子标记辅助小麦抗穗发芽育种选择过程，而且在每一世代均可进行分子标记检测和后代选择，从而可取代繁琐的材料收获及表型鉴定过程，这极大地减少了抗穗发芽育种过程中人力、物力的投入成本，还有助于加快抗穗发芽品种的培育进程。

本发明提供的功能基因标记能有效区分穗发芽抗性持续期存在差异的品种/品系，其中携带CNG2A-b等位变异的品种/品系具有较长的穗发芽抗性持续期，反之携带CNG2A-b等位变异的品种/品系则具有较短的穗发芽抗性持续期，这为小麦穗发芽抗性育种提供新的基因资源和功能标记，并拓宽其抗性遗传基础。

附图说明

图1TaCNGC-2A基因的结构示意图及其等位变异

图2引物CNG2A在不同穗发芽抗性持续期小麦品种中的电泳图；以中间M为分界线，a部分为酶切前电泳图，b部分为酶切后电泳图；M为Marker II，1-6分别为济麦22、京411、烟农19、遂宁坨坨麦、红芒春21及扬麦16

图3TaCNGC-2A基因在济麦20(J20)和遂宁坨坨麦(SNTT)的表达模式；其中，a图为种子发育不同时期；b图为后熟不同时期；c图为浸润不同时期

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。

实施例1

(一)小麦种子休眠持续性表型的测定

(1)种子萌芽指数(GI)测定

于小麦蜡熟期分别收获主茎穗，室内风干2天，立即存放于-20℃冰箱以维持种子的休眠性，待全部试验材料收获完毕，手工脱粒，一并进行后熟5天、15天和30天的籽粒发芽试验。具体为：每个材料取50粒进行种子发芽试验，2次重复。籽粒腹沟朝下摆放在培养皿内，培养皿内加9ml无菌水，置于人工气候培养箱(20℃，光照14h，黑暗10h，湿度80％)，24小时候后开始统计每个培养皿萌发种子数，于每天同一时间统计萌芽数并剔除发芽种子(以胚部露白为萌芽鉴定标准)，3天后计算种子萌芽指数(germination index，GI)，计算两次平均值。种子萌芽指数(GI)计算公式：GI＝(3×n1+2×n2+1×n3计算)/(3×N)，其中n1、n2、n3是种子第1天、第2天、第3天每天所萌芽的籽粒数，N指总粒数。

260份小麦品种组成的自然群体在2012年收获后5天、15天、30天测定的GI分别命名为12GI5-NP、12GI15-NP及12GI30-NP；在2013年测定的GI分别命名为13GI5-NP、13GI15-NP和13GI30-NP；在2014年测定的GI分别命名为14GI5-NP、14GI15-NP和14GI30-NP；在2015年测定的GI分别命名为15GI5-NP，15GI15-NP和15GI30-NP。京411/红芒春21RIL群体在2014和2015年测定的GI分别命名为14GI5-JH、14GI15-JH、15GI5-JH和15GI15-JH。201份微核心种质材料在2014、2015和2016年测定的GI分别命名为14GI5-CMCC、14GI15-CMCC、15GI5-CMCC、15GI15-CMCC、16GI5-CMCC和16GI15-CMCC。

(2)田间降雨穗发芽率(FS)测定

小麦收获期间遇到自然降雨天气，于田间保留10个小麦主茎穗进行自然降雨整穗发芽率测定。收获后置于电热恒温干燥箱中，150℃快速烘干，手工脱粒，统计发芽种子数和总粒数，计算田间整穗发芽率(field sprouting，FS)。田间整穗发芽率(FS)计算公式：FS＝10穗发芽数÷10穗总粒数。

260份小麦品种组成的自然群体在2013年和2015年测定的FS分别命名为13FS-NP和15FS-NP。京411/红芒春21RIL群体在2015年测定的FS命名为15FS-JH。201份微核心种质材料在2015和2016年测定的FS分别命名为15FS-CMCC和16FS-CMCC。

(二)SDS-Tris饱和酚法抽提小麦基因组DNA

(1)取2-3粒小麦种子置于2ml灭菌离心管，利用MP高通量组织研磨仪研磨成粉末。

(2)加入1.2ml DNA提取缓冲液(200mM Tris-Cl,250mM NaCl,25mM EDTA,0.5％SDS,2％β-ME)。

(3)60℃水浴45min，期间间歇振荡以充分提取。

(4)室温下12000rpm离心10min。

(5)转移上清液至新的2ml灭菌离心管中，加入预冷的等体积Tris饱和酚/氯仿异/戊醇(体积比为25：24：1)，于冰上颠倒混匀15min，期间间歇振荡。

(6)室温下12000rpm离心10min。

(7)转移上清液至新的2ml灭菌离心管中，重复步骤(5)、(6)，以充分去除蛋白。

(8)转移上清液至新的1.5ml灭菌离心管中，加入0.6倍异丙醇(300μl)和1/10倍体积(50μl)NaAc(pH5.2)，充分混合混匀后冰上静置17min，使DNA白色沉淀充分析出。

(9)4℃10000rpm离心10min。

(10)弃上清，加入预冷的70％乙醇漂洗2遍，然后用无水乙醇漂洗1遍，室温晾干，加入100μl其中含2μl 10mg/ml RNase酶的1×TE缓冲液(或双蒸水)过夜溶解。

(11)在NanoVue Plus微量分光光度计上检测DNA浓度，并统一稀释成50ng/ul工作液，备用。

(三)PCR扩增与检测

PCR扩增体系为10μL，包括10×buffer(含有2.0mmol L-1Mg²⁺)1.0μL，2.5mmol L-1dNTPs 0.8μL，5UμL-1Taq DNA polymerase 0.1μL，10μmol L-1引物各0.4μL，2.0μL模板DNA(50～60ngμL-1)，ddH₂O 5.3μL。

扩增程序为94℃预变性5min；35个循环(95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min)；72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物则利用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析检测，GelStain荧光染料染色，Bio-Rad凝胶成像系统扫描拍照。

(四)转录组数据分析

根据京411/红芒春21RIL群体穗发芽抗性持续期极端混池及双亲的转录组数据，在小麦2AL染色体上筛选到一个两池间差异表达基因(筛选标准为P≤10-4和FDR≤10-3)，该基因编码一个环核苷酸门控通道蛋白，暂时命名为TaCNGC-2A。根据中国春转录组参考序列获取该差异基因CDS序列，通过DNAMAN软件分析该基因CDS序列信息，并在NCBI上Blast比对获取目的基因序列。

(五)目的基因克隆及等位变异鉴定

利用Primer Premier 5.0软件设计染色体特异引物CNGC2AL1，CNGC2AL2，CNGC2AL3，CNGC2AL4，分段扩增TaCNGC-2A基因全长(表1和图1)。利用EasyPure Quick GelExtraction Kit对目的片段进行胶回收，将产物连接pGEM-T载体并转化Trans-T1感受态细胞，进而挑选阳性克隆进行测序。通过序列拼接获得6,842bp TaCNGC-2A基因全长，其包含7个外显子、6个内含子、906bp启动子和429bp3’非翻译区，CDS长2,151bp，编码由716个氨基酸组成的环核苷酸门控离子通道蛋白。

通过对极端穗发芽抗性持续期材料(遂宁坨坨麦、红芒春21、扬麦16、济麦22、京411及烟农19)的TaCNGC-2A基因序列进行比对分析，共鉴定了18处基因变异(17个SNP变异和1个InDel变异)，其中在启动子-313位置存在A/T碱基变异(图1)，遂宁坨坨麦、红芒春21、扬麦16这3个穗发芽抗性持续期较长的品种均携带A碱基变异，而济麦22、京411、烟农19这3个穗发芽抗性持续期较短的品种均携带T碱基变异。

表1用于扩增小麦TaCNGC-2A基因全长引物、功能基因标记及定量分析引物的开发

(六)功能标记开发及在不同群体中的验证

在启动子-313位置A/T碱基变异所在区域利用Primer Premier 5.0软件设计染色体特异引物CNG2A(CAPS标记，表1)，扩增产物长813bp，其中遂宁坨坨麦、红芒春21、扬麦16等穗发芽抗性持续期较长材料的扩增片段中均包含FokI限制性内切酶酶切位点。因此取5μL PCR扩增产物，加入1μL Cutsmart缓冲液、0.2μL FokI限制性内切酶及3.8μL dH₂O，并于37℃恒温酶切3h后直接进行琼脂糖凝胶电泳，此时含有酶切位点的材料(即CNG2A-b等位类型)被酶切，其酶切产物长度为584bp和229bp(图2)。

在自然群体、微核心种质以及京411/红芒春21RIL群体中，TaCNGC-2A不同等位变异与多年(2012-2016)不同后熟时期的种子发芽指数和田间整穗发芽率均呈极显著相关(P＜0.01)，且携带CNG2A-b等位类型的材料具有较低的种子发芽指数、田间自然发芽率以及较长的穗发芽抗性持续期(表2)。

表2TaCNGC-2A基因不同等位变异在京411/红芒春21RIL群体、自然群体和微核心种质中与穗发芽抗性持续期的关系

(七)RT-PCR分析

取济麦20(J20)和遂宁坨坨麦(SNTT)种子发育不同时期(花后25天，30天和35天)，后熟不同时期(后熟5天，15天和30天)以及浸润不同时间(浸润0h，6h和10h)分析TaCNGC-2A基因的相对表达水平(图3)。

利用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取小麦籽粒总RNA。并利用TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒将不同材料提取的总RNA反转录成cDNA。

定量引物使用Beacon Designer 7软件设计，qCNG2A引物序列为F：GGTATGAACGGTATAGG；R：ATATTCTCAAACAAAGGTAC。RT-PCR体系为20μL，包括2×SYBR PremixEx Taq II(Tli RNaseH plus)10μL，10μmol L-1引物各0.8μL，2.0μL cDNA模板DNA(50ngμL-1)，ddH2O 6.4μL。扩增程序为95℃30s；40个循环(95℃/5s，58℃/30s)；最后95℃/15s、60℃/30s、95℃/15s熔解。扩增完毕后，进入结果分析界面，以β-Actin为内参照基因(F：AGCCATACTGTGCCAATC；R：GCAGTGGTGGTGAAGGAGTAA)，用2^-△△Ct方法计算试验原始数据及基因表达量变化，用GraphPad prizm 5软件(www.graphpad.com)进行数据统计分析，计算基因的相对表达量以及图形绘制。

在种子发育不同时期(花后25天，30天和35天)，TaCNGC-2A基因的表达水平逐渐降低，而在后熟不同时期(后熟5天，15天和30天)逐渐升高；浸润处理会诱导该基因的上调表达，且表达量在浸润不同时间(浸润0h，6h和10h)逐渐上升；在这些过程中，遂宁坨坨麦的TaCNGC-2A基因的表达水平始终较低。这也反映了TaCNGC-2A基因负调控穗发芽抗性持续期。

可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 小麦种子休眠持续期基因TaCNGC-2A及其功能标记

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6842

<212> DNA

<213> 小麦红芒春21(Triticum aestivum L)

<220>

<221> misc_feature

<222> (595)..(595)

<223> n is a or t

<400> 1

tcgtcttgcc taccaccctc cctcctcgcc ttccccgaac ccgtgcttcc gccttccgcc 60

tccccttccc ccaactcgcc ccgctccgcc tccgctcccc tccagacctc gccgccggcc 120

ggctcctccc cccggcctct cccccccgcg aggcccgcag gtgagccgca gccgtctcct 180

cctccctcga ttcctcgctg ctcttttttt ccctttcggc cgctgctgcc gccgcgtagc 240

gaatttgatg ctgccatggc agttccctcg attcgatcgc cgcgttccgg gagccgcttg 300

gtgctgctcc ctgccggctc gtagatctgg atcagcccag ccagcgcggg agggacgaag 360

gccggtggac ggattcagtc agacagcacg ggggcaccac ttccgttcct ctgccagcat 420

agtaccctat cgggaaatgg aggcgtggtc tccgctggcg cggcgcctaa ttcgggcgga 480

ggccgcagag tttcagcgct cagcctcttt ttttgcttgc taataatagt aggccgctcc 540

actttactta ctgtatcagg attctaccat acccgttcct taaatgtatc aggcntccca 600

atttgagtgc cccagttcct tttctgtgtg ccactaccgc atttgtgcta catctatatg 660

tatatgatga ggcttacctt gcaacttcct ttttgtactt acgcttgttt tttgtgttca 720

ttcagtgtga ttgatcaaac agatcagagc attttgtgca aggacggact gtggacggct 780

tttgacaaca tcagctaaag ggtcggctga ttgatggcag ttattggagc tgtggagggt 840

ctctcgccag ctttgctctt cctttgacat agccgtatgt ttgattgtgg ttagaaagct 900

caatacatgg acagacacag agaggacttt aagaggttgg tcatttttgc ttaaaagggc 960

actcctgcta tgcgcttcca taactagtat taaaggtcat ttactttgaa gtgacaatgt 1020

tttccttttt cctctttcac atgtcatgac tatcaattct taagcctgaa catttgtagt 1080

actcaacacc ttcctgtcac gaatttctct ctggacacct tcctgtagct ttggttctct 1140

cctgtatata gtggtattcc tgttgccgaa acatacactt ttgctgtata gtccatgtcc 1200

acaacaaata ttcatgagtt cttcctatgg taccccctcg tccgatacct ggcatctttc 1260

tcactgtctt tcttagcttc aataggtctt ttttttttac cttctggttt tacctgtaag 1320

agttatgtca tgttaatttt tggaagaaat cgataaagcc agtcattcgt tttacatttt 1380

tccgtcatgt tgaacagata aactgggttt tacttttacc cattttgctg taagagttgc 1440

atcatgttta ttcctagaat aaacagagaa gcagccagta tttgttttta cattttcctt 1500

catgctggag tgatgatgta gaaaatataa gggagaaatc tcaatcatag cactctatca 1560

gacgcattat atgatttaac ttatcactgt gcactgtacg tacacatatt tatgttactt 1620

ttgtttaacc gtgggctctt ttgaatttgt tttaattata tatcaatact ctatgcaggc 1680

tggatgagtt tagccctaga tcatctgtac aatctgaaat tggtgggagg agcagcctga 1740

ggttcagcat gcctgggttc ggttatgatt cgtttaatcc actaagatca ttcatgtcag 1800

ggctgagaaa gagttctgga agactgaaat cacttaggca ccccaatcca tctggtgctc 1860

ctaagacagc ttttgcggaa gatcttaaat cttttaagaa gaatatattt gatccccagc 1920

aaaagttcct gctgcgaatg aatagatttt tcttcctgtc atgtattttc gctgttgcag 1980

ttgatccact cttcttcttc ctacccatca tcgacaactc aaattgcatc ggtatagata 2040

agaaattggc agtgacatca acagtagtac ggactattat tgactctgtc tatcttatcc 2100

gtgtgtttct tcaattccgc accgcttatg ttgctccatc ttctcgagtg tttggaagtg 2160

gcgagcttgt gattgatcca acgctaattg cgatgcgtta cattaagagt tactttctaa 2220

tggacttctt tgcactgtta ccacttccac aggtacttct ttgcattcat gctcttcaat 2280

agtatgaagg ttattttact gtcacttggt ctatctgaaa caataagcct tttcttttac 2340

atgaaaatga taaacctttt aagtgctttt acactttagc gttagatatt tttatttgtc 2400

atttcaatag cccggctcta tgcacagttt tgctgcatta aatttgtccc attaatttga 2460

tattcgtatt cgactatcct gaactatgat tactgcatac ttcaagacaa ttttcatatt 2520

ttccttgaat gatctcgttg gttatcgaca gattgttgtt tggagatatc tccacagttc 2580

tgatggtcca gatgtgctgg ctacaaaaga tgcactggtt tgggttgtcc tgtgccaata 2640

cattccaagg ttgctaagga tattccctgt gaccaaagat ttgaaaagga cagctggtgt 2700

ttttattgag actgcatggg ctggtgctgg ttactatctt ctctggttta tgcttgctgg 2760

ccatgtaagt gattgctatg ctatgtattg tttatccatg ccatgtgcat cttcatctag 2820

agagcattat cacacaatta tctgtgcgtt tttacactat gattagtgcc tcgagtagaa 2880

acattgttga tacactgagg ttccttgcat acctggtagc ttttcaaaat ttaccatctt 2940

tgctatctga actcttcagt tatcccgtca gatatgatag tttaaagatt tcgtagcact 3000

tggagattgt gcataatact ctacattgta ggcagtgcta atatgtcaac taattgacta 3060

cagttatggt tagatgattt ttgttagtta acttttgatg gtatcctttt ctcctcacat 3120

atagttattg tcttacgtca tgttaagcat aattctctga acatagtttg tcgtaggtgc 3180

tcatgttttc cttgattaac cctgtaattt ttctatacgc tgtttgttgc agaatgttgg 3240

tactctgtgg tacttcttat ccatagagcg caaagatagt tgctggcttg tcaactgtca 3300

tgccacagat ggttgtgaac ccagctactt gtattgtagt gagaatcatg ctagcagtga 3360

caagtacaaa aattggagta cgagtacccc aatatttaat cagtgcaatg gcactaatga 3420

ttctttcaat tttggtatct atcagcaagc attggtgtct ggaatacttg gtccaggaaa 3480

ttttgtctct aaaagttgtt attgcttctg gtggggatta caaaatttaa ggtaatagaa 3540

aaaaacaata ctccgtacat ctgttcatta ttctatagga agtctttcat tgtgcacaag 3600

aaaatatatt tgaaaaactc tgatttaaac agttcccaca aaatgagtca ttttttaccg 3660

gaacggaatt tctcttgtgg caggagtgtg taaagtccat ttcactccct gtctcgcaaa 3720

ataaattttg ttagatacct ggatctgcat gatgaccact ccagacaaac tggactattg 3780

gagcttggaa gcaacaaatg gagtggatct tagagacccg taaaggaact gcctactttc 3840

ctaactttgt atgctgtggc atacatataa cttgcagaga ttatttttgt atgatttgaa 3900

agagcatgcc agttaatatt ggttatacta atggtctgaa aagccaacgt gtgccatatt 3960

gctagtgaga atataagata ttgtatatga tgtgttatcc tgttagtata acctggactt 4020

actggtgtta gattagattt tgtttggaaa tagcaatatt ataacataac ttaccaattc 4080

aaatatgatt gccgtggcgt caaaaagttg cacccaactt tctagctatt tagggtttgt 4140

ttggtttgag actaagtttg ccaaaggttg ccacacctaa ggttaggcaa gtttgaccaa 4200

cttaggtggg tgtttggttc aagccacact agggccctac attacatact cacaaaaagt 4260

gtggcatgat tcccttagga ttgccaactt gtggctctca ttttattgaa ctaaccttag 4320

gcaagcttgg cagaaagtgt atggcaaagt gtggcaatgc aaggcataga accaaatagc 4380

cccttaaact ggccttcttt ccagcagtac actttttgat tattggggtt tacagagaac 4440

taaagggaac tggccgctgc aggttctggg tttcctgttg tgctatttca tatgctgcct 4500

ttaacagaat gcatatactg ctctttccgt ttctaaatat aagccctttt agatatttca 4560

atcactacgg aatacatagg gatgtatata gacatatttt atagtgtaga ttcactcatt 4620

ttactccgta tgtagtccgt attggaatct ctaaaaaggc ttatatttag gaatggaggg 4680

agtactagtc atccaagatg gagagaacac aagatcttaa gttccttgca gcaaaaatgg 4740

cataccagga aagaggcaaa aaccagcctg ttcacatttt tctggcttag gtcatgaaat 4800

ctagcaaaag ctattttctg aaccctgacc tgggtccttc tgcttggggt gtcaactttg 4860

cattctaatt gttgcaggtt tatatgagca gctatcattg tttggatact tcttccgatt 4920

tcagatatag tgtcctagag actgtattgg tcaaacattt ttgaagacta atggaccttc 4980

agtgtataga atttttgtat tggcagcatg gaattcgttt tactagatct tttgtgagtt 5040

tcaaaaatag attatttttt gcgaccttaa aaaatattat gataaaaaat agcagctaac 5100

gtggtaattg tttgtcttca caatggctat tttttgtgac tagagcgtac attatttttc 5160

catatcttat atttgtggtt cattgtgctt gatatgttta acttccttta catttaacag 5220

tacccttggc caagggtttg taacaagtac atatccctgg gaggtgttat tctccattgc 5280

aatatgcatc cttggactga ttctctttgc gctcctcatc ggtaacatgc aggtagaatg 5340

ataatgcatc gcaaactatc ttttcaccct gttttgccgg attctaagtt gtaacattgt 5400

ctttttagac ctaccttcaa tcagttgcta tacgccttga agagatgaga gttaagaagc 5460

gtgatgctga gcagtggatg catcaccgat cgctgccgcc ggatatcaga gaacgagtaa 5520

ggcggtatga acggtatagg tggttggaaa ccagaggagt agatgaagaa aatttggttc 5580

aaacccttcc aaaagacctt aggagggaca tcaaacgcca tctctgtttg ggtttagtga 5640

aaagggtagg atatatattt ggtcaggtat ctttgaaatt cttgtagcga actacactga 5700

tttcctcctg ttttgctgcc gaataggtac ctttgtttga gaatatggat gaaagactac 5760

tagatgcaat atgcgagcga ttaagacctg cactctacac tgaacatgaa tacattttga 5820

gggaaggtga tccagtggat gagatgcaat ttattctcca tggttccttg gagagtatga 5880

ctactgatgg aggccgaagt ggattcttca acaaggtcca gctaaaggag ggttctttct 5940

gtggcgacga gctgctcact tgggcattgg atcccaagtc tggtgctaac ttcccggttt 6000

cgtccaggac agtgaaggct cttagcgagg tcgaggcatt ctccctgcgt gccgacgagc 6060

tgaaatttgt ggccagtcag ttcaggaggc tgcacagcag gcaagttcag cacacattcc 6120

ggttttactc gcagcagtgg aggacatggg gagcctgctt catccaggcg gcctggcgcc 6180

gctactacaa gcggaaaatg gccgagcagc gccggaggga agaggaggct gcgaaccggc 6240

agagcagcag cagcggcccg agcctgggag cgaccatcta cgcgtcccgg ttcgcggcca 6300

acgctctccg gggagtccac cggcttcgga gcaaggctgc tgctctcccc attgtgagag 6360

tgccgaagcc ctccgagcca gattttggcg tcgacgttga cgacgcggac taacaaaaac 6420

agaccatact gggaattacc tgtgctaatt aattaagctg atacttcagg catgtagatt 6480

gtgtacaaaa ttcaaaagac agcagccgca cacaacattg tgatgatgat tgtaaaagtt 6540

ttactgctcc aaggagtata gaagatgcaa atgtataatg tttcagtttt gctacttgct 6600

ggttgcctga aaattttgat gcctctgcca cctagagttg cacatcactg agcccaaaaa 6660

tcgctgtgcc gaaaatctgc aagactgaca cgacatcaaa atagatgttt ttttttgata 6720

aaagagagct tctctctccg atttccatta acagaaattt gttgaaatta tggaaatatg 6780

atttgaattt aatcagttga ctcagatttt ggctgagatt tgaagaagtt tcaggtcagg 6840

tc 6842

<210> 2

<211> 813

<212> DNA

<213> 小麦红芒春21(Triticum aestivum L)

<220>

<221> misc_feature

<222> (595)..(595)

<223> n is a or t

<400> 2

tcgtcttgcc taccaccctc cctcctcgcc ttccccgaac ccgtgcttcc gccttccgcc 60

tccccttccc ccaactcgcc ccgctccgcc tccgctcccc tccagacctc gccgccggcc 120

ggctcctccc cccggcctct cccccccgcg aggcccgcag gtgagccgca gccgtctcct 180

cctccctcga ttcctcgctg ctcttttttt ccctttcggc cgctgctgcc gccgcgtagc 240

gaatttgatg ctgccatggc agttccctcg attcgatcgc cgcgttccgg gagccgcttg 300

gtgctgctcc ctgccggctc gtagatctgg atcagcccag ccagcgcggg agggacgaag 360

gccggtggac ggattcagtc agacagcacg ggggcaccac ttccgttcct ctgccagcat 420

agtaccctat cgggaaatgg aggcgtggtc tccgctggcg cggcgcctaa ttcgggcgga 480

ggccgcagag tttcagcgct cagcctcttt ttttgcttgc taataatagt aggccgctcc 540

actttactta ctgtatcagg attctaccat acccgttcct taaatgtatc aggcntccca 600

atttgagtgc cccagttcct tttctgtgtg ccactaccgc atttgtgcta catctatatg 660

tatatgatga ggcttacctt gcaacttcct ttttgtactt acgcttgttt tttgtgttca 720

ttcagtgtga ttgatcaaac agatcagagc attttgtgca aggacggact gtggacggct 780

tttgacaaca tcagctaaag ggtcggctga ttg 813

Claims (8)

1.一种小麦休眠持续期候选基因TaCNGC-2A，其特征在于：该候选基因序列如SEQ IDNO.1所示，全长6842bp，由大小为2151bp的7个外显子、大小为3356bp的6个内含子、大小为906bp的启动子和大小为429bp3’非翻译区组成，具有控制种子休眠持续期的作用。

2.权利要求1所述小麦休眠持续期候选基因TaCNGC-2A的应用，其特征在于：该候选基因序列如SEQ ID NO.1所示，在候选基因TaCNGC-2A第595碱基位置，即启动子-313位置具有A/T碱基变异，具有碱基变异A的植株比具有碱基变异B的植株具有更长的穗发芽抗性持续期。

3.小麦候选基因TaCNGC-2A的扩增引物，其特征在于：扩增引物包括引物CNGC2AL1、CNGC2AL2、CNGC2AL3、CNGC2AL4；其中，CNGC2AL1序列如下：F:TCGTCTTGCCTACCACC，R:GATAGACCAAGTGACAGTAAAAT；CNGC2AL2序列如下：F:TTTACTGTCACTTGGTCTAT，R:TGTGAGTATGTAATGTAGGG；CNGC2AL3序列如下：F:GCCCTACATTACATACTCAC，R:CTATTCGGCAGCAAAAC；CNGC2AL4序列如下：F:GAACTACACTGATTTCCTCCTG，R:AGTGGACCGACCCTGAAT。

4.一种小麦植株穗发芽抗性持续期判断标记，其特征在于：该标记为CAPS标记CNG2A，序列如SEQ ID NO.2所示全长813bp，第584与585碱基之间具有FokI限制性内切酶酶切位点，第595碱基位置具有A/T碱基变异，具有碱基变异A的植株比具有碱基变异B的植株具有更长的穗发芽抗性持续期。

5.一种小麦植株穗发芽抗性持续期判断标记引物，其特征在于：该标记引物为CNG2A，序列为如下：F：TCGTCTTGCCTACCACCCTC；R：CAATCAGCCGACCCTTTAGC。

6.权利要求4所述标记的应用，其特征在于：具有碱基变异位点A的CNG2A-a等位变异类型植株比具有碱基变异位点B的CNG2A-b等位变异类型植株具有更长的穗发芽抗性持续期。

7.权利要求5所述标记引物的应用，其特征在于：以标记引物CNG2A扩增小麦全基因组DNA，获得扩增产物813bp；以FokI限制性内切酶酶切扩增产物，可被酶切为584bp和229bp片段的为CNG2A-b等位变异类型，不能被酶切的为CNG2A-b等位变异类型；携带CNG2A-b等位变异类型的植株比携带CNG2A-a类型具有更长的穗发芽抗性持续期。

8.权利要求5所述标记引物的应用，其特征在于，标记引物扩增条件如下：94℃预变性5min；以95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min为条件进行37个循环；72℃延伸10min；4℃保存。