CN111394494B - 拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记的应用 - Google Patents

拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物KNAT3，通过应用所述拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物KNAT3，进而对拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因进行表达，能够快速，准确，高效地鉴定拟南芥叶片边缘地形状，为拟南芥品种的筛选提供了依据，同时也为种质资源鉴定中分子标记提供了重要的途径。

Description

拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记的应用。
背景技术
植物叶子的锯齿状边缘是一种在遗传和环境方面受到调节的形态特征，在野生型的拟南芥叶中，锯齿仅限于叶的基部。拟南芥中的叶片形状通过利用基于PIN的生长素输出蛋白CUC2转录因子系统的边缘中的图案化事件来调节，以定义促进和延迟生长的区域，从而产生形态改变。然而植物叶片的锯齿状边缘的发生难以通过肉眼界定。叶片锯齿状边缘会对植物的生长有一定的影响，分子标记辅助育种技术具有方便快捷、周期短、准确性高、不受种植环境影响等优点，在近年深受农艺工作者的青睐。因此，利用分子生物学手段开发并应用拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记，不但可以对特定拟南芥进行快速识别和品种保护，而且可以结合杂交育种、遗传转化等技术，使基因聚合的分子设计育种成为可能。
近年来，发现了是拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的第2类KN1-LIKE基因KNAT3有三种主要的表达模式，分别是：(1)在早期器官发育过程的幼叶，芽和花梗中表达；(2)在发育过程中两个器官交界处及其附近表达，包括幼苗的下胚轴-根边界，成熟花中的花药-细丝连接处，以及伸长的长角果中的胚珠-细丝和花序-长角果；(3)在成熟组织中表达，例如伸长的长角果，成熟叶片的叶柄和大部分根。不同的表达模式可能表明KNAT3在植物中起着几种不同的作用，因此对该基因进行研究有利于进一步对拟南芥叶片锯齿状边缘的相关基因功能性分子标记进行研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因功能性分子标记及应用，旨在解决现有技术中无法准确对拟南芥叶片锯齿状边缘进行准确定位和控制的问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记在表达拟南芥叶片形成锯齿状边缘性状的应用；其中，所述功能性分子标记物为KNAT3，所述KNAT3的启动子基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述KNAT3的编码序列如SEQ ID NO.2所示。
以及，一种引物对，所述引物对用于扩增表达拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物，所述功能性分子标记物为KNAT3，且所述引物对包括与KNAT3-F启动子基因序列结合的上游引物和与所述KNAT3-R启动子基因序列结合的下游引物；其中，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。
以及，种用于表达拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物对。
本发明所述的拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物KNAT3，通过应用所述拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物KNAT3，进而对拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因进行表达，能够快速，准确，高效地鉴定拟南芥叶片边缘地形状，为拟南芥品种的筛选提供了依据，同时也为种质资源鉴定中分子标记提供了重要的途径。
本发明所述的用于表达拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记的引物对，通过应用所述引物对，进而对所述拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记进行克隆，进而实现对拟南芥叶片锯齿状边缘相关进行表达及性状分析的作用。
本发明所述的用于表达拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物的试剂盒，所述试剂盒包括引物对，利用所述引物对，进而对所述拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物进行克隆，进而实现采用所述试剂盒对拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因进行表达及性状分析的作用。
附图说明
图1是本发明实施例提供的KNAT3p:GUS在拟南芥第6片莲座叶2mm发育时期GUS染色图。
图2是本发明实施例提供的KNAT3p:GUS在拟南芥第6片莲座叶3mm发育时期GUS染色图。
图3是本发明实施例提供的KNAT3p:GUS在拟南芥第6片莲座叶4mm发育时期GUS染色图。
图4是本发明实施例提供的KNAT3p:GUS在拟南芥第6片莲座叶6mm发育时期GUS染色图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
本发明实例提供一种拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记在表达拟南芥叶片形成锯齿状边缘性状的应用；其中，所述功能性分子标记物为KNAT3，所述KNAT3的启动子基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述SEQ ID NO.1如下：
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具体的，所述KNAT3的编码序列如SEQ ID NO.2所示，所述SEQ ID NO.2如下：
atggcgtttcatcacaatcatctctcacaagacctctccttcaatcatttcaccgaccaacaccaacctcacctccgcaaccgcctcctcctcctccgcaacagcaacaacatttccaagaagcaccgcctcctaattggttaaacacagcgcttcttcgttcctcagataacaacaataacttcctcaacctccacacagccaccgctaacaccacaaccgcaagcagctccgattctccttcctccgccgccgccgccgccgctgctaaccagtggctatctcgctcctcctctttcctccaacgaaacaacaacaacaacgcttccatagtcggagatgggatcgatgatgtcaccggaggagcagacactatgattcagggagagatgaaaaccggcggtggagaaaacaaaaacgacggcggaggagctacggcggcggatggagtagtgagctggcagaatgcgagacacaaggcggagatcctttcgcatcctctttacgagcagcttttgtcggcgcacgttgcttgtttgagaatcgcgactccggttgatcagcttccgagaatcgatgctcagcttgctcagtctcaacacgtcgtcgctaaatactcagctttaggcgccgccgctcaaggtctcgtcggcgacgataaagaacttgaccagttcatggtatataaatttcagatttttttgttctataattttataattaacgatttcataattatacttagcacaaattttaataatacacaccgacttaggtttcttgatttttgaaatcttaaaatattaaaatcaagatttgtgtttttagggataaacaagactaaaatcccaaaaaaagagcttatgatataataatggtcatgatgatgaagaaaatacaaattttgttctttgtgtttattgtgtgtttgattaatgttttttttatggtgtagacacattatgtgttgctactgtgttcatttaaagagcaattgcaacaacatgtgcgtgttcatgcaatggaagctgtgatggcttgttgggagattgagcagtctcttcaaagcttaacaggtgagaaaatgaatcctgtgattagctcatgaatccaatagttagttttatgacattgacaagttttgtgttttattggtgagattaggagtgtctcctggagaagggatgggagcaacaatgtctgacgatgaagatgaacaagtagagagtgatgctaatatgttcgatgggggattagatgtgttgggttttggtcctttgattcctactgagagtgagaggtcgttgatggaaagagttagacaagaacttaaacatgaactcaaacaggtaataatcaacaaacttgttctttgaactagttcatgaactaacaatgtagagggctttgtcttgttgatgaaaagggttacaaggagaagatagtagacataagagaggagatattaaggaagagaagagctgggaagttaccaggagataccacctctgttctcaaagcttggtggcaatctcattccaaatggccttaccctactgtgagttcactcatctaacatctctttataacttcttcaagttcattcattgagccataaccaaatattggtttgtaggaggaagataaggcgaggttggtgcaagagacaggtttgcagctaaaacagataaacaattggttcatcaatcagagaaagaggaactggcatagcaatccatcttcttccactgtattgaagaacaaacgcaaaaggtattattatactttaatatagtcttgtaacataaccgaaaaacttatggatcggactcaaagaagactgaaacttttgtttgtctgatgaaagcaatgcaggtgacaatagcggaagagagcggttcgcgtagaaacaacaaacatatgatgtgaattggggaggtggaagatgggatttgaaagcagggttttagggatttaaagttgagaattttatggaggagtttggattatacagagagaggggacagtattagaaagtaactttttgtgcaattacatagtaacgtagtttggttatgtgattatgcccatatattttattaagtagcacacaaaccaaaaagaaaatatgaaaactgaagatgcaggcttttgtttaatgttttttgtttgtttgtctgcatgagttttttttttatgaaccatcagataatcatcatcatcatccataatatatcttgtgaataaagatagtgagagaggagaacattgggatgcacaagttttcttaatctactagtatatgttacgcattgaccaggtgcatatgttaatttgtatcgcaccacttggttagcttaatctatgtgactattatacagtatatgtttcg。
本发明所述的拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物KNAT3，通过应用所述拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物KNAT3，进而对拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因进行表达，能够快速，准确，高效地鉴定拟南芥叶片边缘地形状，为拟南芥品种的筛选提供了依据，同时也为种质资源鉴定中分子标记提供了重要的途径。
相应的，本发明提供了一种引物对，所述引物对用于扩增表达拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物，所述功能性分子标记物为KNAT3，且所述引物对包括与KNAT3-F启动子基因序列结合的上游引物和与所述KNAT3-R启动子基因序列结合的下游引物；其中，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。
其中，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述SEQ ID NO.3如下：
5‘-cgggatcctattatgggtatgtggaggggaac-3’。
所述下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示，所述SEQ ID NO.4如下：
5‘-gttcggtgaaatgattgaaggagag-3’。
本发明所述的用于表达拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记的引物对，通过应用所述引物对，进而对所述拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记进行克隆，进而实现对拟南芥叶片锯齿状边缘相关进行表达及性状分析的作用。
相应的，本发明还提供一种用于表达拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物对。
优选的，所述引物对包括与KNAT3-F启动子基因序列结合的上游引物和与所述KNAT3-R启动子基因序列结合的下游引物。
其中，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述SEQ ID NO.3如下：
5‘-cgggatcctattatgggtatgtggaggggaac-3’。
所述下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示，所述SEQ ID NO.4如下：
5‘-gttcggtgaaatgattgaaggagag-3’。
本发明所述的用于表达拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物的试剂盒，所述试剂盒包括引物对，利用所述引物对，进而对所述拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物进行克隆，进而实现采用所述试剂盒对拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因进行表达及性状分析的作用。
相应的，本发明还提供一种控制拟南芥叶片锯齿状边缘的相关基因的鉴定方法，所述鉴定方法如下：
S01.提取拟南芥植物的基因组DNA；
S02.利用与所述KNAT3-F启动子基因序列结合的上游引物和所述与所述KNAT3-R启动子基因序列结合的下游引物对所述基因组DNA进行扩增，构建拟南芥TSK KNAT3-Promoter-GUS表达载体，将所述表达载体通过农杆菌转化法进行侵染植物拟南芥Col-O并进行培养及筛选得到阳性转基因植物；
S03.对所述TSK KNAT3-Promoter-GUS表达载体进行测序验证，分析所述阳性转基因植物叶片形状，鉴定控制拟南芥叶片锯齿状边缘的相关基因为功能性分子标记物KNAT3。
在上述步骤S01中，提取拟南芥植物的基因组DNA，优选的，采用CTAB法提取所述拟南芥植物的基因组DNA。
在本发明优选实施例中，采用CTAB法提取拟南芥的DNA的方法包括如下步骤：
S011.在液氮中研磨拟南芥的幼嫩叶至粉末，收集800μL所述粉末于离心管中，加入800μL采用65℃预热处理得到的CTAB提取液，混合得到第一混合液，将所述第一混合液在65℃的条件下保温处理30分钟；
S012.将保温处理得到的第一混合液加入比例为400：384：16的酚：氯仿：异戊醇的混合溶液，混匀，室温静置1分钟；再在4℃/12000rpm的条件下离心2分钟，收集第一混合上清液；
S013.在第一混合上清液中加入比例为768：32的氯仿：异戊醇的混合溶液，混匀，室温静置1分钟；再在4℃/12000rpm的条件下离心2分钟，收集第二混合上清液；
S014.在所述第二混合上清液中加入800μL异丙醇，混匀，室温静置10分钟；再在4℃/12000rpm的条件下离心15分钟，收集第三混合上清液；
S015.在所述第三混合上清液中加入800μL的70％乙醇溶液，混匀，再在4℃/12000rpm的条件下离心2分钟，收集沉淀，加入30μL蒸馏水，混匀得到所述拟南芥DNA。
在上述步骤S02中，利用与所述KNAT3-F启动子基因序列结合的上游引物和所述与所述KNAT3-R启动子基因序列结合的下游引物对所述基因组DNA进行扩增，构建拟南芥TSKKNAT3-Promoter-GUS表达载体，将所述表达载体通过农杆菌转化法进行侵染植物拟南芥Col-O并进行培养及筛选得到阳性转基因植物；
具体的，利用与所述KNAT3-F启动子基因序列结合的上游引物和所述与所述KNAT3-R启动子基因序列结合的下游引物对所述基因组DNA进行扩增，其中，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述SEQ ID NO.3如下：5‘-cgggatcctattatgggtatgtggaggggaac-3’；所述下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示，所述SEQ ID NO.4如下：5‘-gttcggtgaaatgattgaaggagag-3’。
进一步，对所述基因组DNA进行扩增；优选的，所述PCR反应的体系如下：
再用BIO-RAD PCR仪进行qPCR，运用三步法PCR扩增程序，程序如下：
/>
采用上述PCR反应的体系和反应程序对所述基因组DNA进行扩增，扩增得到所述功能性分子标记物KNAT3启动子基因序列。
进一步的，将所述功能性分子标记物KNAT3启动子基因序列和载体分别进行双酶切得到第一启动子基因序列和第一载体，将第一启动子基因序列和所述第一载体进行连接反应，构建得到克隆载体TSK KNAT3-Promoter。
优选的，所述第一载体选自TSK108载体；选择该载体进行试验，有利于后续进行试验。
优选的，将所述功能性分子标记物KNAT3启动子基因序列和载体分别进行双酶切得到第一启动子基因序列和第一载体的步骤中，所述限制性内切酶选自BamH I和Nco I。在本发明优选实施例中，所述双酶切的温度为36～37℃，所述双酶切的时间为30～35分钟。进一步优选的，当双酶切反应结束后，在80℃条件下处理5分钟，保证限制性内切酶失活，确保双酶切反应结束。
进一步，将第一启动子基因序列和第一载体进行连接反应，构建得到克隆载体TSKKNAT3-Promoter。优选的，将第一启动子基因序列和第一载体进行连接反应的步骤中，所述第一启动子基因序列与所述第一载体的摩尔比为(6～6.5):1。选择上述摩尔比进行连接反应，确保所述第一启动子基因序列与所述第一载体能够成功连接，构建得到克隆载体TSKKNAT3-Promoter。优选的，所述连接反应的条件如下：在25℃条件下，进行连接反应3小时。
优选的，将构建得到克隆载体TSK KNAT3-Promoter进行转化至大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中。优选的，所述转化方法包括如下步骤：
S021.将10μL克隆载体TSK KNAT3-Promoter加入解冻的大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中，冰浴20～30分钟得到感受态混合物；
S022.将所述感受态混合物放置于42℃条件下热激处理90秒，再进行冰浴4～6分钟；加入600μL LB液体培养基混匀，放置于37℃摇床上50min-60min进行活化。
优选的，将活化好的感受态细胞去除，倒于LB(Amp+抗性)的固体平板，干燥彻底后倒置过来于37℃恒温培养箱中培养12-16h。观察37℃烘箱里面的平板上长出的菌落克隆，选择特征为圆形边缘整齐、表面光滑、半透明、小凸起和菌落间互相分开的大肠杆菌单克隆进行菌落PCR。优选的，所述菌落PCR的反应体系如下：
再用BIO-RAD PCR仪进行qPCR，运用三步法PCR扩增程序，所述PCR扩增程序如下：
将鉴定出来的阳性菌落送至艾基生物技术有限公司测序。从Tair数据库下载目的基因的核酸序列，并在muscle alignment网站上将测序结果对照Tair网站上的基因序列信息进行对照分析，直至测序得到的碱基和Tair的基因序列完全匹配则说明所述克隆载体构建成功。
进一步，将所述测序成功的克隆载体TSK KNAT3-Promoter与包含GUS报告基因的TSK108载体进行LR反应，得到包含KNAT3-Promoter融合GUS的表达载体TSK KNAT3-Promoter-GUS。
优选的，将所述克隆载体TSK KNAT3-Promoter与包含GUS报告基因的第二载体进行LR反应，得到包含KNAT3-Promoter融合GUS的表达载体TSK KNAT3-Promoter-GUS。
通过上述反应构建得到拟南芥TSK KNAT3-Promoter-GUS表达载体。
具体的，将所述表达载体通过农杆菌转化法进行侵染植物拟南芥Col-O并进行培养及筛选得到阳性转基因植物。
在本发明优选实施例中，所述方法如下：
提取所述表达载体的目的质粒，将所述目的质粒通过农杆菌转化法得到已转化的表达载体的农杆菌菌液；将扩大培养好的已转化的表达载体的农杆菌菌液，在室温下，转速为6000g的条件下离心处理10min，除去上清液得到农杆菌沉淀，将所述沉淀悬浮于5％蔗糖渗透培养液中，使培养液的OD600为0.8-1.0，再加入0.010％-0.015％Silwet L-77，摇匀，制备得到农杆菌悬浮液；将植物的地上部分浸入农杆菌悬浮液中侵染40s；将侵染好的植株平放在铺有湿纸巾的黑色托盘里，遮光处理18-22h后，掀开盖子，将植株放置于人工培养室中，于22℃中连续光照培养得到转基因植物。
进一步，将所述转基因植物进行筛选得到阳性转基因植物；优选的，采用潮霉素抗生素培养基和PCR进行阳性种子的筛选。在本发明优选实施例中，所述筛选的步骤如下：将Tl代种子先用75％的酒精浸泡，放在摇床清洗15min。将消毒后的种子均匀地铺展在潮霉素抗性的培养基表面，于4℃冰箱中放置2-3d后，移至人工培养室光照培养(培养室条件：22℃恒温、连续光照)。培养7-10d后可通过萌发的幼苗形态鉴定出转化子。提取抗性平板筛选出的转基因植物的DNA，以该DNA作为模板，以TaqDNA聚合酶作为DNA聚合酶，开始进行PCR反应，所述PCR反应的体系和程序如下：。
再用BIO-RAD PCR仪进行qPCR，运用三步法PCR扩增程序，所述PCR扩增程序如下：
通过上述反应，制备得到TSK KNAT3-Promoter-GUS表达载体。
在上述步骤S03中，对所述TSK KNAT3-Promoter-GUS表达载体进行测序验证，分析所述阳性转基因植物叶片形状，鉴定控制拟南芥叶片锯齿状边缘的相关基因为功能性分子标记物KNAT3。
具体的，对所述TSK KNAT3-Promoter-GUS表达载体进行测序验证，将鉴定出来的阳性植株PCR产物送至艾基生物技术有限公司测序。从Tair数据库下载目的基因的核酸序列，并在muscle alignment网站上将测序结果对照Tair网站上的基因序列信息进行对照分析，直至测序得到的碱基和Tair的基因序列，完全匹配则说明功能性分子标记物KNAT3的启动子基因序列被准确克隆，且制备得到植株为阳性转基因植物，所述阳性转基因植物即为将拟南芥TSK KNAT3-Promoter-GUS表达载体成功转化的植物。
进一步，分析所述阳性转基因植物叶片形状，优选的，分析所述阳性转基因植物叶片形状的方法如下：将所述阳性转基因植物的叶片进行GUS染色，分析所述阳性转基因植物叶片形状。
优选的，将所述阳性转基因植物的叶片进行GUS染色的方法包括如下步骤：选取拟南芥莲座叶在2mM的GUS染色工作液中于37℃温育12小时，再用75％乙醇连续洗涤进行脱色得到终产品，将所述终产品进行分析。
其中，阴性对照材料为白色，GUS染色阳性材料为蓝色。所述GUS染色阳性材料的蓝色斑点很稳定，在酒精中不褪色。使用蔡司(ZEISS)研究级体式显微镜SteREO Discover.V8观察拟南芥莲座叶的GUS染色情况，拍照并获取图片。使用Photoshop软件对图片进行进一步处理。
优选的，选用拟南芥低6片莲座叶进行分析比较，目的使为了保证能够明明显看出所述叶片边缘的形状。同时，由于其他植物进行控制鉴定时，均采用第6片叶片进行分析，故本发明采用第6片莲座也进行分析为了更好地进行对比。
具体的，分析所述阳性转基因植物叶片形状，鉴定控制拟南芥叶片锯齿状边缘的相关基因为功能性分子标记物KNAT3。通过分析可知，所述阳性转基因植物叶片形状为锯齿状边缘，即所述功能性分子标记物KNAT3为控制拟南芥叶片锯齿状边缘的相关基因。
进一步以具体实施例的内容进行说明。
一种控制拟南芥叶片锯齿状边缘的相关基因的鉴定方法：
提取拟南芥植物的基因组DNA；利用与所述KNAT3-F启动子基因序列结合的上游引物和所述与所述KNAT3-R启动子基因序列结合的下游引物对所述基因组DNA进行扩增，构建拟南芥TSK KNAT3-Promoter-GUS表达载体，将所述表达载体通过农杆菌转化法进行侵染植物拟南芥Col-O并进行培养及筛选得到阳性转基因植物；对所述TSK KNAT3-Promoter-GUS表达载体进行测序验证，鉴定所述阳性转基因植物叶片形状，分析所述功能性分子标记物KNAT3是否为控制拟南芥叶片锯齿状边缘的相关基因。
其中，采用CTAB法提取拟南芥的DNA的方法包括如下步骤：
在液氮中研磨拟南芥的幼嫩叶至粉末，收集800μL所述粉末于离心管中，加入800μL采用65℃预热处理得到的CTAB提取液，混合得到第一混合液，将所述第一混合液在65℃的条件下保温处理30分钟；
将保温处理得到的第一混合液加入比例为400：384：16的酚：氯仿：异戊醇的混合溶液，混匀，室温静置1分钟；再在4℃/12000rpm的条件下离心2分钟，收集第一混合上清液；
在第一混合上清液中加入比例为768：32的氯仿：异戊醇的混合溶液，混匀，室温静置1分钟；再在4℃/12000rpm的条件下离心2分钟，收集第二混合上清液；
在所述第二混合上清液中加入800μL异丙醇，混匀，室温静置10分钟；再在4℃/12000rpm的条件下离心15分钟，收集第三混合上清液；
在所述第三混合上清液中加入800μL的70％乙醇溶液，混匀，再在4℃/12000rpm的条件下离心2分钟，收集沉淀，加入30μL蒸馏水，混匀得到所述拟南芥DNA。
进一步，构建拟南芥TSK KNAT3-Promoter-GUS表达载体。
拟南芥TSK KNAT3-Promoter-GUS表达载体的构建方法包括如下步骤：
以提取得到的拟南芥的DNA为模板，采用与KNAT3-F启动子基因序列结合的上游引物和与所述KNAT3-R启动子基因序列结合的下游引物进行PCR反应扩增得到KNAT3启动子基因序列，所述PCR反应体系如下：
再用BIO-RAD PCR仪进行qPCR，运用三步法PCR扩增程序，所述PCR扩增程序如下：
将所述KNAT3启动子基因序列和载体分别采用限制性内切酶BamHI和NcolI进行双酶切，所述双酶切的条件为：在37℃条件下双酶切处理30分钟后，在80℃条件下处理5分钟终止反应，得到第一KNAT3启动子基因序列和第一载体；
将第一KNAT3启动子基因序列和所述第一载体进行连接反应，所述连接反应中，第一KNAT3启动子基因序列和第一载体摩尔比为6：1的添加量进行混合，在25℃连接3h，构建得到克隆载体TSK KNAT3-Promoter；
将构建得到克隆载体TSK KNAT3-Promoter进行转化至大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中，所述转化方法包括如下步骤：将10μL克隆载体TSK KNAT3-Promoter加入解冻的大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中，冰浴20～30分钟得到感受态混合物；将所述感受态混合物放置于42℃条件下热激处理90秒，再进行冰浴4～6分钟；加入600μL LB液体培养基混匀，放置于37℃摇床上50min-60min进行活化。
将活化好的感受态细胞去除，倒于LB(Amp+抗性)的固体平板，干燥彻底后倒置过来于37℃恒温培养箱中培养12-16h。观察37℃烘箱里面的平板上长出的菌落克隆，选择特征为圆形边缘整齐、表面光滑、半透明、小凸起和菌落间互相分开的大肠杆菌单克隆进行菌落PCR，所述菌落PCR的反应体系如下：
再用BIO-RAD PCR仪进行qPCR，运用三步法PCR扩增程序,所述PCR扩增程序如下：
将鉴定出来的阳性菌落送至艾基生物技术有限公司测序。从Tair数据库下载目的基因的核酸序列，并在muscle alignment网站上将测序结果对照Tair网站上的基因序列信息进行对照分析，直至测序得到的碱基和Tair的基因序列完全匹配则说明所述克隆载体构建成功。
将所述克隆载体TSK KNAT3-Promoter与包含GUS报告基因的第二载体进行LR反应，到包含KNAT3-Promoter融合GUS的表达载体TSK KNAT3-Promoter-GUS。
进一步，将所述表达载体通过农杆菌转化法进行侵染植物拟南芥Col-O并进行培养及筛选得到阳性转基因植物。将所述表达载体通过农杆菌转化法进行侵染植物拟南芥Col-O并进行培养的具体方法如下：
提取所述表达载体TSK KNAT3-Promoter-GUS的目的质粒，将所述目的质粒通过农杆菌转化法得到已转化的表达载体的农杆菌菌液；将扩大培养好的已转化的表达载体的农杆菌菌液，在室温下，转速为6000g的条件下离心处理10min，除去上清液得到农杆菌沉淀，将所述沉淀悬浮于5％蔗糖渗透培养液中，使培养液的OD600为0.8-1.0，再加入0.010％-0.015％Silwet L-77，摇匀，制备得到农杆菌悬浮液；将植物的地上部分浸入农杆菌悬浮液中侵染40s；将侵染好的植株平放在铺有湿纸巾的黑色托盘里，遮光处理18-22h后，掀开盖子，将植株放置于人工培养室中，于22℃中连续光照培养得到转基因植物。
进一步，鉴定所述阳性转基因植物叶片形状，通过所述阳性转基因植物叶片形状分析控制拟南芥叶片锯齿状边缘的相关基因。
将所述转基因植物进行筛选得到阳性转基因植物，采用潮霉素抗生素培养基和PCR进行阳性种子的筛选。在本发明优选实施例中，所述筛选的步骤如下：将Tl代种子先用75％的酒精浸泡，放在摇床清洗15min。将消毒后的种子均匀地铺展在潮霉素抗性的培养基表面，于4℃冰箱中放置2-3d后，移至人工培养室光照培养(培养室条件：22℃恒温、连续光照)。培养7-10d后可通过萌发的幼苗形态鉴定出转化子。提取抗性平板筛选出的转基因植物的DNA，以该DNA作为模板，以TaqDNA聚合酶作为DNA聚合酶，开始进行PCR反应，所述PCR反应的体系如下：
再用BIO-RAD PCR仪进行qPCR，运用三步法PCR扩增程序,所述PCR扩增程序如下：
将鉴定出来的阳性植株PCR产物送至艾基生物技术有限公司测序。从Tair数据库下载目的基因的核酸序列，并在muscle alignment网站上将测序结果对照Tair网站上的基因序列信息进行对照分析，直至测序得到的碱基和Tair的基因序列，完全匹配则说明该植株为阳性的转基因植株。
进行GUS染色，分析所述拟南芥叶片边缘的锯齿形状。
将所述阳性转基因植物的叶片进行GUS染色的方法包括如下步骤：选取不同发育时期(2mm、3mm、4mm、6mm)的拟南芥第6片莲座叶在2mM的GUS染色工作液中于37℃温育12小时，再用75％乙醇连续洗涤进行脱色得到终产品，将所述终产品进行分析。
使用蔡司(ZEISS)研究级体式显微镜SteREO Discover.V8观察拟南芥莲座叶的GUS染色情况，拍照并获取图片。使用Photoshop软件对图片进行进一步处理。
其中，GUS染色阳性材料为蓝色。所述GUS染色阳性材料的蓝色斑点很稳定，在酒精中不褪色。
分析所述阳性转基因植物叶片形状，鉴定控制拟南芥叶片锯齿状边缘的相关基因为功能性分子标记物KNAT3。
结果分析：
使用蔡司（ZEISS）研究级体式显微镜SteREO Discover.V8观察实施例5制备得到的拟南芥莲座叶的GUS染色情况，图1是KNAT3p:GUS在拟南芥第6片莲座叶2mm发育时期的，可以看出叶片有锯齿形边缘发生；图2是KNAT3p:GUS在拟南芥第6片莲座叶3mm发育时期的，可以看出叶片有锯齿形边缘发生；图3是KNAT3p:GUS在拟南芥第6片莲座叶4mm发育时期的，可以看出叶片有锯齿形边缘发生；图4是KNAT3p:GUS在拟南芥第6片莲座叶6mm发育时期的，可以看出叶片有锯齿形边缘发生。分析得到所述阳性转基因植物的叶片形状为锯齿状，进而鉴定得到所述功能性分子标记物KNAT3为控制拟南芥叶片锯齿状边缘的相关基因。
通过应用所述拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物KNAT3，进而对拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因进行控制，能够快速，准确，高效地鉴定拟南芥叶片边缘地形状，为拟南芥品种的筛选提供了依据，同时也为种质资源鉴定中分子标记提供了重要的途径。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳大学
<120> 一种拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因功能性分子标记及其应用
<130> 2019.12.12.
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 14132
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
tatatgtctt attcctcttg acttttatat actactttaa ctcattcttt ttacattcat 60
caacattaca tgtttctgtg agttctacta gttagaaaat tttatgatca aaatacagtt 120
tttgttcctc tttctgtctt tgttattttt actgattact tactatgaaa ggtaattaat 180
tttaattgaa tttaatgttg gattattaca tgatttatgt gctatatgtc tcattaaaag 240
tctattgtag attcggttta atttgctcgg actggaaatc ttttaccata gccggccaag 300
aagattagta ggccccaaac tggacttttt tttggttcac aatatatatt ttatacaaat 360
taatatatac aatgataaag tagaaccata aatatgttgc atttagcttt ttggaaacaa 420
cctaaacatg aaaaaagtgg aataaaaata tcaataatgt tgggatttca aatcaaaatt 480
gtctgtcttg gttcaatggt tcacaaattc acatatttgt tgtgtattaa ctataaccaa 540
tgggaaagaa aaatgaaata aaaagactaa atgtaagcaa taatcttaaa aaatctttat 600
atggcatggt tttttccagt ttttaacata actattttat gttgcaattt gatcaaattt 660
ggaagaaatt tgagcacttc agtcaatttg aatatatggg gaccgagtat tattgattaa 720
aagtagggta tgtgtatcca atatactttg agttgttgga tattaagatt tttttgtgga 780
aatgtgatga ctttaagtac acaattcgca catagatgta tcatacatta actacaccta 840
gaacataaat taaaattgat attaaaataa ttatgcgtat caatatttaa ttttcaaaat 900
gtaaaaggta aattaatact atttaacatc ttgatcatgt agttaacttt gacatcatct 960
ttttcatttc agaccaaatt ttctcatcct cttattctaa aacaacacca cgaataataa 1020
aaattacatg aatctgttaa tcatcgtata tataatccta actaactttt ggtttttgtt 1080
tcttaccgct atgactttga tattttctat atggcaagat agaaaaaatc ccttctgatt 1140
ataagaatag cttaagaaac actaactgtg ctagcaatgg ccaatgcttg ttaatcaaat 1200
agttcaattt tttaaatgtt taactgttat atgctctttc tctctaacta tcactaaaat 1260
ttaggaagcc tccgtcccag ataaactaca aatacaatgg ttcacctgga taaacagaaa 1320
aagaatcaag atttcttatg aactttacat gttcacatga tatatgtgac atatccaaaa 1380
ttggacccaa aatctaatca attatgatca ataacgtcta tcgaattctt cgaggtttgt 1440
catatcactt gccataagtt ttgtccatac ccaatagaaa ttttgtgaac aaaattttag 1500
tgataatagt tcaccacttt atccggtata caagtgggaa atgattgcca ttaacttttt 1560
atcgaaatat taatatcaca aaagaaaaag acttgatttg gataatagta gacaggttaa 1620
ccaaattgaa tattttctat tggtcaagat aatttgttgg ggaaaggttg agtcttgctc 1680
ccaaatttaa acatggtcgg agagtaatta taattcacgt cttaaatcta ttactctctc 1740
tattccttat tatttaattt tctagaaaag aaaatttatt tcaaaaaaaa taatttttta 1800
ggttttctat gcaatattat tggttattat tgatggatat caaattttaa gataaacaat 1860
taaatatcat tggtttagga ttataaaaaa tgtaaattac aaaacataat atatttataa 1920
tcaattttta atatgttttt tagtgttttt ctagaaaatc aagtatcaat gaatagagga 1980
agtattaatt tattatcaaa cgcatgtttg gtttgggatt tctttgataa caacaaaaac 2040
caaaatacac acttactaat taacgataaa actatataga agtgttttat atatttgcat 2100
ttaattccat tgcaaataaa ctgttctttc tggtgttcaa tttcataata tattgaggcg 2160
tgtaccttgt cggcaatata tatttgtgta agaatgagat atgtcatgac gtacactatt 2220
tagctatgaa gatagacaaa gtaatgagac ttgcctttga caaagtgtat atgactttct 2280
gcaagtactc tcgtttaaac ccatcaaatt acattaatgt ttctgattag tatagatgat 2340
cgacaaggtt taatgaattt ttttgtcaat tagcaacatt tcgtttccat ctctacccca 2400
caaatttaac taacccgttt gacaaaatcc tttaggtact ccattgtcgg caaactaatt 2460
gaaatctatg aaaacctgtt ttaccttata caaacaaaac tatgaaaata tagtgaaaaa 2520
agattatttt cacgtttact tgttttcgac ctcatatcta attttcttat caaaacaata 2580
atttgtggca ttatattttg agctacacaa aaaaaaattg tgaagacaaa ttgatgcatt 2640
tttatcggtt ttagaatctt ttgtttgtgc atttttgtca aacctaaatg tgattttagt 2700
gtcccttata attttttttt cttcaagtaa tttcagattc taagagaaat gtgagtctca 2760
tttagttata ataaaatggg aatgcatttt ctaaatataa ttttacacaa tttcaaattt 2820
tttctactcc tcaaaaactg tctatcctac aatataaact taacaaagtg tttatatata 2880
gtaacaacaa caacaacaac aacaacaaca acaacaaaaa aaaagaacaa acaaagtttg 2940
tgtatatata tgcaacacat cctacttagt attttactgt tgcatagtaa gtaaaacagt 3000
agtgtgtcat aaaaagcata gatattattt cccgcttttt ctttttaaat tattctcgta 3060
agtcgtaact aaaatattat actatactat agtataattt aggaaccgaa tatatatctt 3120
ccaaagtttg tttatttttc gttatggctt gacagccttg tgtgaaattt ggatggatgt 3180
gttgttcagg ctttaaagaa aaggacgcaa gcgaagatca aaaggttgtg aaaaggacac 3240
acttccatta aaatagtaag cctctctctc gataacgatg acccaaaggc aaacacattt 3300
tcttgtttag ccactgacct ataacaacat attcactgtt cgataatctc acgttttcta 3360
taacataatt atatcgatga atgtatatta caatttaggt ttgaaccact tagttttgta 3420
gttaaccaaa ataccgaata gtgaatgatg agatggatta atgggtattg gtgagctaga 3480
ccgaagataa gatgaaattg caacaaacta caaaatgaga ttaacaagac aaacataatg 3540
ttacaaaacg tataactata ttacatttgt tttttaatca aaaagtttat gtctccttag 3600
gtccaaacca aaacatgaat cattcatccc caatgtattg attggagttc cttctaaatt 3660
cgattttaaa aagtacaaac caaacgaaac actaaattat ttaataatgt gttggaagat 3720
cggtaataat ataaaggatt tttttgcttt atgtcagaat acgacagata taaaatttga 3780
aaaatgtttc atgaaaatgt gtttttgtca gaaccaaaat tgattttatt accttaaaga 3840
aataaaatgg ttttattcag aattgtgtgg agtagtaggc aggggaccat ttggtgatag 3900
ctaaacagtt ggctatttaa cacaccttct tctcaccaac aactggaacc cacgcgctat 3960
ctcgtcccca cacccatttt tcttctttca ataataatta tatgtttttc ttaattttca 4020
atgtgaatcg aaatattcaa tcagaaaatt gaattagtat atcttaatac atagtttgaa 4080
caaattaatt ttctttttat tggagaaatc gaatccaaat taaagaaaat atattggata 4140
atgaatatta atggatttaa aaatcttatt atataaaata tgatattcaa agtttattgt 4200
catgaaataa ataggtaacc tgtattgtaa aatagaatga gtaaaattta tatcaaatgt 4260
ataaagtgca aattgttatt ataatttaaa tattattaaa aactctatta tattttttcc 4320
acctatttat tttggcaaac cttattaact ctaatataaa ataataattt gtttttgtaa 4380
gttaggaaat atatttgcat aaaaggagaa tttaaaccaa aatgaaatca tatcaatcct 4440
tcattctaga ttatgtttta gttttgatac aattatgcca gataaatcaa ttcaatccaa 4500
accaaaatat tcaattccaa aaccaaacta tatcttaata tagtttaatc gtattcattt 4560
tcttatattt actaatctga atatgaacta aaacccaaaa aaagatctaa aactaaaatt 4620
ttagttctaa attaagacta tatttaaatt aactaaagtt cgaatctaaa caaaaattat 4680
aaacctaaat cgaaaactaa accgaatctg aaacccggtt tgagcatctc aactttattt 4740
ttcattgttg gggttaaatc agtccttctg ctttaattaa gccggcggct gtcaggctaa 4800
gtctgaaaaa tctaggattg gtccccacgt tttttttttt tttttttttt tgctttttca 4860
atcttttgtc gtatctattc atttcctaat tttcttataa tcggtgttgc atcaatccaa 4920
atgtacggtt gggattctct tatccgaaac gcatgctatt gctttgttga ggggaccatc 4980
tgtggtccaa agtccaaggt cttgacgcgt gtcctctgtc ttttttggcc cgcgagtgta 5040
gcgacgtgat ttatggtccc ctcatctctc tcttaatttt tttccttcat taccggctat 5100
ttccggttga ttggtttatg ctaaccggtt ttatcctctg tcgccgttaa atagagggaa 5160
gctagttcgg taataattgt gattagcttc tcactaattt atactatggt taagcagaat 5220
ttttaatgcg gttgatacat aacaaacgaa attaatattg ttgatgcatc taggttatta 5280
ggttcgattc ttataacata atttagtttt tcatgtaaaa ttatttttcg tggttaacta 5340
aaaccttgag ttgtctacca aaaaagaaag aaaaagttaa gcataagtgt ataaccttaa 5400
gttatggact tattatgggt atgtggaggg gaacgtagtt tctaaaattg ttcatcaata 5460
ttgcatatat tgatttgtta gttataaacg gatagtattt tagtgatgat ataggagaga 5520
aaaacaagta aagatttttg ggaaatcata aagaaaacaa atgggtatta gtgtatgaca 5580
aaattaaaaa ggttagagag ggatgtcaaa agtgattaag agataagaaa tcttcgaagt 5640
tgattggttc ttttttcgac ttcaatcaat acttctcctt tttgttgatg ttgttcttca 5700
catacacact tcgttgtttt ttctttcatt cttatgtagt ttttagtatt tgatttgagt 5760
tatcttcttc tttttgtttt tgtatttctc atgttaaatt attcatctct tataattata 5820
aatactagtg aatgattagt tgaaaataaa atttacatta caaataaaaa tgttattacg 5880
acaagcaatt gatttaattt aatttatgaa tatcttttat tttagctgat tatgattttc 5940
tgacgctcct cggagtgacg tggaaatcac gctccaacat ttacgggggt tgttacgtat 6000
cgcgtcgctt tagatttgtg ggttgcttat tgtttaggga ttgtttatta gttttccggt 6060
tactatccat ttgcatccaa ataactcaat aaacctaagt atgactcact tgtaggaata 6120
ttcagtagat gatggagaat atttcaataa taaaaccatt tctgactaga attaatataa 6180
atcaatagaa ggacgtaaac atcactcaaa aaatgatgat cgatattaga agaaactgta 6240
gtgggtacca agaaaattaa acatacttgt cgtcggcaca aaatattttg gattgtgaaa 6300
ctataatgcc ttgttttaga aagatgtgag agaatataaa aaaacttatg tgttattcaa 6360
ttatagagag atgaaattca ccatataaaa cttacatgtg ttatcatcag taattacaat 6420
tatacacatc aagaaaattt ctatattttt ctaactagga aaattgtact tcaactgttg 6480
atttcatcat tgatctagaa tatctaatta cttttactat cgtacatatt aaaatcggag 6540
atatgatgaa tcgaaaagat taaaactata taaattttta tttttgtaaa ctttcctaca 6600
tggacataca ttatactaaa attatataat atgtaatgta tgatcgtgca tgtttaaaat 6660
tcagcgtttc acacgtgtag tttgggacaa cttcggcgtt tttttggttg agtaagatga 6720
catgtggctc gacattcata actattgtga ataaaataaa ttgatttatg taatgattgg 6780
acacatttga tgaagtggtt tcttgaaaat aagactttgg atggatgcag tgtggacaaa 6840
ccggtataat ttgtttgcgg tttagtttat ctggcagaca aaaaaccgtt gcagaccaag 6900
tttatttgta tgtaaaaatg gtctgcagat ggtccgttgc ggttttcttc tatttttttt 6960
agatcactac gaactataat taataaataa taaataaaaa acggtatgat ccgttgacgg 7020
ttttatccgc cccaaccgcc ataaccattc aaatcctaaa taaaaacggt tttgataata 7080
taagaaccag cccaaagatg aagttatata tgtgactatg ttaacacaca tttatagtat 7140
gagttaacct agacctattt gcgtctcact tcttattaaa tgctaaaaat ttaccaaaag 7200
gacgctattc atcacaatta agtttaaatc tctaaattaa ttgatcgttt aagtttttaa 7260
ccaaactcaa ataaataaaa aaatatacga taacttttat tgtgacgatc gaatatacta 7320
ccatcaaatt ttataccaaa tttctgtttc gtagcatgta cgaaaatttt cactccaaaa 7380
aaaatctaaa aattatattt accaaaaact gtgatttcag aaaattatgt gattttaaag 7440
aaccagtgat ttctcaaatt atattatatg aaatgattat tattatttta aaaaggtgaa 7500
agggtgaagc aaaaaaatag tgtgcataaa caaataagct aatttgtttt ctggtactta 7560
ggtcttttaa atccatataa ataaattctt aaaagattgt tttatttcaa atctttaacc 7620
taaaattgta actttaaatt catgattaaa ttttttgttt tcaataattt ctcgtaactt 7680
cattacataa aacgagaagg atttataata ggtaaaggcg tgaagcaaaa aataattgta 7740
taaataaata agttaaattt gtttcatagt gccataaaat tacactaaca tctgaacgtg 7800
aaacgcacgc gcttcttcat atcatagata cgttgcgtct taaaacacaa cacgtagcaa 7860
ctctttttaa aaaggaaaaa tacatttatt attcccaaca ataaaaaaaa tcaaacacag 7920
tcgaagaagg caacgacctt tcgcagccgt cagatcttaa taaatacagt cgccactaaa 7980
atttaacgac atagatcgaa ccatgacgac ctactttctt taattaattt tctgtcgtga 8040
cctaatcttc tatttgttgt ttcattagtc acttactttt atatttattc tttcttaggt 8100
ctatgtggac caaagtgatt ggaaaagaaa aaaaaataca tttttgtcaa ccataactaa 8160
attatcttat tttctcaaat gcactgttta ttatgtagcg tactgattta ttaaatactt 8220
ttgctttcta tggttaattt atgatgtcgg atttttatct ttcccccaat aataatatca 8280
ctatagaaga aagtttacaa attcttagtt aaatcaaaaa agattttatc agttgatttg 8340
attatacgag gtgacatcaa tttttgtctt ctttaacaaa aaaaatcaat ttttgttttc 8400
tttaacaaaa aaaatcaatt tttgtccaaa ataccgaata gtgaatgatg agatggatta 8460
atgggtattg gtgagctaga ccgaagataa gatgaaattg caacaaacta caaaatgaga 8520
ttaacaagac aaacataatg ttacaaaacg tataactata ttacatttgt tttttaatca 8580
aaaagtttat gtctccttag gtccaaacca aaacatgaat cattcatccc caatgtattg 8640
attggagttc cttctaaatt cgattttaaa aagtacaaac caaacgaaac actaaattat 8700
ttaataatgt gttggaagat cggtaataat ataaaggatt tttttgcttt atgtcagaat 8760
acgacagata taaaatttga aaaatgtttc atgaaaatgt gtttttgtca gaaccaaaat 8820
tgattttatt accttaaaga aataaaatgg ttttattcag aattgtgtgg agtagtaggc 8880
aggggaccat ttggtgatag ctaaacagtt ggctatttaa cacaccttct tctcaccaac 8940
aactggaacc cacgcgctat ctcgtcccca cacccatttt tcttctttca ataataatta 9000
tatgtttttc ttaattttca atgtgaatcg aaatattcaa tcagaaaatt gaattagtat 9060
atcttaatac atagtttgaa caaattaatt ttctttttat tggagaaatc gaatccaaat 9120
taaagaaaat atattggata atgaatatta atggatttaa aaatcttatt atataaaata 9180
tgatattcaa agtttattgt catgaaataa ataggtaacc tgtattgtaa aatagaatga 9240
gtaaaattta tatcaaatgt ataaagtgca aattgttatt ataatttaaa tattattaaa 9300
aactctatta tattttttcc acctatttat tttggcaaac cttattaact ctaatataaa 9360
ataataattt gtttttgtaa gttaggaaat atatttgcat aaaaggagaa tttaaaccaa 9420
aatgaaatca tatcaatcct tcattctaga ttatgtttta gttttgatac aattatgcca 9480
gataaatcaa ttcaatccaa accaaaatat tcaattccaa aaccaaacta tatcttaata 9540
tagtttaatc gtattcattt tcttatattt actaatctga atatgaacta aaacccaaaa 9600
aaagatctaa aactaaaatt ttagttctaa attaagacta tatttaaatt aactaaagtt 9660
cgaatctaaa caaaaattat aaacctaaat cgaaaactaa accgaatctg aaacccggtt 9720
tgagcatctc aactttattt ttcattgttg gggttaaatc agtccttctg ctttaattaa 9780
gccggcggct gtcaggctaa gtctgaaaaa tctaggattg gtccccacgt tttttttttt 9840
tttttttttt tgctttttca atcttttgtc gtatctattc atttcctaat tttcttataa 9900
tcggtgttgc atcaatccaa atgtacggtt gggattctct tatccgaaac gcatgctatt 9960
gctttgttga ggggaccatc tgtggtccaa agtccaaggt cttgacgcgt gtcctctgtc 10020
ttttttggcc cgcgagtgta gcgacgtgat ttatggtccc ctcatctctc tcttaatttt 10080
tttccttcat taccggctat ttccggttga ttggtttatg ctaaccggtt ttatcctctg 10140
tcgccgttaa atagagggaa gctagttcgg taataattgt gattagcttc tcactaattt 10200
atactatggt taagcagaat ttttaatgcg gttgatacat aacaaacgaa attaatattg 10260
ttgatgcatc taggttatta ggttcgattc ttataacata atttagtttt tcatgtaaaa 10320
ttatttttcg tggttaacta aaaccttgag ttgtctacca aaaaagaaag aaaaagttaa 10380
gcataagtgt ataaccttaa gttatggact tattatgggt atgtggaggg gaacgtagtt 10440
tctaaaattg ttcatcaata ttgcatatat tgatttgtta gttataaacg gatagtattt 10500
tagtgatgat ataggagaga aaaacaagta aagatttttg ggaaatcata aagaaaacaa 10560
atgggtatta gtgtatgaca aaattaaaaa ggttagagag ggatgtcaaa agtgattaag 10620
agataagaaa tcttcgaagt tgattggttc ttttttcgac ttcaatcaat acttctcctt 10680
tttgttgatg ttgttcttca catacacact tcgttgtttt ttctttcatt cttatgtagt 10740
ttttagtatt tgatttgagt tatcttcttc tttttgtttt tgtatttctc atgttaaatt 10800
attcatctct tataattata aatactagtg aatgattagt tgaaaataaa atttacatta 10860
caaataaaaa tgttattacg acaagcaatt gatttaattt aatttatgaa tatcttttat 10920
tttagctgat tatgattttc tgacgctcct cggagtgacg tggaaatcac gctccaacat 10980
ttacgggggt tgttacgtat cgcgtcgctt tagatttgtg ggttgcttat tgtttaggga 11040
ttgtttatta gttttccggt tactatccat ttgcatccaa ataactcaat aaacctaagt 11100
atgactcact tgtaggaata ttcagtagat gatggagaat atttcaataa taaaaccatt 11160
tctgactaga attaatataa atcaatagaa ggacgtaaac atcactcaaa aaatgatgat 11220
cgatattaga agaaactgta gtgggtacca agaaaattaa acatacttgt cgtcggcaca 11280
aaatattttg gattgtgaaa ctataatgcc ttgttttaga aagatgtgag agaatataaa 11340
aaaacttatg tgttattcaa ttatagagag atgaaattca ccatataaaa cttacatgtg 11400
ttatcatcag taattacaat tatacacatc aagaaaattt ctatattttt ctaactagga 11460
aaattgtact tcaactgttg atttcatcat tgatctagaa tatctaatta cttttactat 11520
cgtacatatt aaaatcggag atatgatgaa tcgaaaagat taaaactata taaattttta 11580
tttttgtaaa ctttcctaca tggacataca ttatactaaa attatataat atgtaatgta 11640
tgatcgtgca tgtttaaaat tcagcgtttc acacgtgtag tttgggacaa cttcggcgtt 11700
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ttgatttatg taatgattgg acacatttga tgaagtggtt tcttgaaaat aagactttgg 11820
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ggttttcttc tatttttttt agatcactac gaactataat taataaataa taaataaaaa 12000
acggtatgat ccgttgacgg ttttatccgc cccaaccgcc ataaccattc aaatcctaaa 12060
taaaaacggt tttgataata taagaaccag cccaaagatg aagttatata tgtgactatg 12120
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aaaattatgt gattttaaag aaccagtgat ttctcaaatt atattatatg aaatgattat 12480
tattatttta aaaaggtgaa agggtgaagc aaaaaaatag tgtgcataaa caaataagct 12540
aatttgtttt ctggtactta ggtcttttaa atccatataa ataaattctt aaaagattgt 12600
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tcaataattt ctcgtaactt cattacataa aacgagaagg atttataata ggtaaaggcg 12720
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ataaaaaaaa tcaaacacag tcgaagaagg caacgacctt tcgcagccgt cagatcttaa 12960
taaatacagt cgccactaaa atttaacgac atagatcgaa ccatgacgac ctactttctt 13020
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aaaaaacata ttaaaactaa ttataaacat attatctttt gtgatttata tttttttata 13620
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aattcaatta tattgataaa taggttgcaa aaaataagaa agaataaata tgagaataaa 13860
tggtcatctc tcgatctctc agctctgtgc aactctgaac acacccacac atatatactc 13920
agatacatac atacacacca caaaaaccaa ttattttcca attttaagaa aagtttctgt 13980
gtcttttttt ttttttttgg tgataattga aacatatgaa acaatcgtcg tcatagaagc 14040
agcagagatt caccttcttt ctttatcttt ccctctcaga aacaggaaac aaaattcaaa 14100
aagaacaaaa aaaaaaaggt caaaccaaaa cg 14132
<210> 2
<211> 2393
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
atggcgtttc atcacaatca tctctcacaa gacctctcct tcaatcattt caccgaccaa 60
caccaacctc cacctccgca accgcctcct cctcctccgc aacagcaaca acatttccaa 120
gaagcaccgc ctcctaattg gttaaacaca gcgcttcttc gttcctcaga taacaacaat 180
aacttcctca acctccacac agccaccgct aacaccacaa ccgcaagcag ctccgattct 240
ccttcctccg ccgccgccgc cgccgctgct aaccagtggc tatctcgctc ctcctctttc 300
ctccaacgaa acaacaacaa caacgcttcc atagtcggag atgggatcga tgatgtcacc 360
ggaggagcag acactatgat tcagggagag atgaaaaccg gcggtggaga aaacaaaaac 420
gacggcggag gagctacggc ggcggatgga gtagtgagct ggcagaatgc gagacacaag 480
gcggagatcc tttcgcatcc tctttacgag cagcttttgt cggcgcacgt tgcttgtttg 540
agaatcgcga ctccggttga tcagcttccg agaatcgatg ctcagcttgc tcagtctcaa 600
cacgtcgtcg ctaaatactc agctttaggc gccgccgctc aaggtctcgt cggcgacgat 660
aaagaacttg accagttcat ggtatataaa tttcagattt ttttgttcta taattttata 720
attaacgatt tcataattat acttagcaca aattttaata atacacaccg acttaggttt 780
cttgattttt gaaatcttaa aatattaaaa tcaagatttg tgtttttagg gataaacaag 840
actaaaatcc caaaaaaaga gcttatgata taataatggt catgatgatg aagaaaatac 900
aaattttgtt ctttgtgttt attgtgtgtt tgattaatgt tttttttatg gtgtagacac 960
attatgtgtt gctactgtgt tcatttaaag agcaattgca acaacatgtg cgtgttcatg 1020
caatggaagc tgtgatggct tgttgggaga ttgagcagtc tcttcaaagc ttaacaggtg 1080
agaaaatgaa tcctgtgatt agctcatgaa tccaatagtt agttttatga cattgacaag 1140
ttttgtgttt tattggtgag attaggagtg tctcctggag aagggatggg agcaacaatg 1200
tctgacgatg aagatgaaca agtagagagt gatgctaata tgttcgatgg gggattagat 1260
gtgttgggtt ttggtccttt gattcctact gagagtgaga ggtcgttgat ggaaagagtt 1320
agacaagaac ttaaacatga actcaaacag gtaataatca acaaacttgt tctttgaact 1380
agttcatgaa ctaacaatgt agagggcttt gtcttgttga tgaaaagggt tacaaggaga 1440
agatagtaga cataagagag gagatattaa ggaagagaag agctgggaag ttaccaggag 1500
ataccacctc tgttctcaaa gcttggtggc aatctcattc caaatggcct taccctactg 1560
tgagttcact catctaacat ctctttataa cttcttcaag ttcattcatt gagccataac 1620
caaatattgg tttgtaggag gaagataagg cgaggttggt gcaagagaca ggtttgcagc 1680
taaaacagat aaacaattgg ttcatcaatc agagaaagag gaactggcat agcaatccat 1740
cttcttccac tgtattgaag aacaaacgca aaaggtatta ttatacttta atatagtctt 1800
gtaacataac cgaaaaactt atggatcgga ctcaaagaag actgaaactt ttgtttgtct 1860
gatgaaagca atgcaggtga caatagcgga agagagcggt tcgcgtagaa acaacaaaca 1920
tatgatgtga attggggagg tggaagatgg gatttgaaag cagggtttta gggatttaaa 1980
gttgagaatt ttatggagga gtttggatta tacagagaga ggggacagta ttagaaagta 2040
actttttgtg caattacata gtaacgtagt ttggttatgt gattatgccc atatatttta 2100
ttaagtagca cacaaaccaa aaagaaaata tgaaaactga agatgcaggc ttttgtttaa 2160
tgttttttgt ttgtttgtct gcatgagttt tttttttatg aaccatcaga taatcatcat 2220
catcatccat aatatatctt gtgaataaag atagtgagag aggagaacat tgggatgcac 2280
aagttttctt aatctactag tatatgttac gcattgacca ggtgcatatg ttaatttgta 2340
tcgcaccact tggttagctt aatctatgtg actattatac agtatatgtt tcg 2393
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
cgggatccta ttatgggtat gtggagggga ac 32
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gtcggtgaaa tgattgaagg agag 24

Claims (3)

1.一种检测拟南芥第6片莲座叶锯齿状边缘的方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用CTAB法提取拟南芥植物的基因组DNA；
利用上游引物和下游引物对所述基因组DNA进行扩增获得KNAT3启动子基因序列，构建以所述KNAT3启动子启动报告基因GUS表达的拟南芥TSK KNAT3-Promoter-GUS表达载体，将所述表达载体通过农杆菌转化法进行侵染植物拟南芥Col-O并进行培养及筛选得到阳性转基因植物；其中，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的序列如SEQ IDNO.4所示；
对所述TSK KNAT3-Promoter-GUS表达载体进行测序验证，分析所述阳性转基因植物叶片形状；
其中，构建所述拟南芥TSK KNAT3-Promoter-GUS表达载体，包括：
将所述KNAT3启动子基因序列和载体分别进行双酶切得到第一启动子基因序列和第一载体，将所述第一启动子基因序列和所述第一载体进行连接反应，构建得到克隆载体TSKKNAT3-Promoter；其中，所述载体选自TSK108载体，所述双酶切的限制性内切酶为BamH I和Nco I，所述双酶切的温度为36～37℃，所述双酶切的时间为30～35分钟，所述第一启动子基因序列与所述第一载体的摩尔比为(6～6.5):1；
将所述克隆载体TSK KNAT3-Promoter与包含GUS报告基因的TSK108载体进行LR反应，得到包含KNAT3-Promoter融合GUS的表达载体TSK KNAT3-Promoter-GUS。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用CTAB法提取拟南芥植物的基因组DNA，包括：
在液氮中研磨拟南芥的幼嫩叶至粉末，收集800μL所述粉末于离心管中，加入800μL采用65℃预热处理得到的CTAB提取液，混合得到第一混合液，将所述第一混合液在65℃的条件下保温处理30分钟；
将保温处理得到的第一混合液加入比例为400：384：16的酚：氯仿：异戊醇的混合溶液，混匀，室温静置1分钟；再在4℃，12000rpm的条件下离心2分钟，收集第一混合上清液；
在第一混合上清液中加入比例为768：32的氯仿：异戊醇的混合溶液，混匀，室温静置1分钟；再在4℃，12000rpm的条件下离心2分钟，收集第二混合上清液；
在所述第二混合上清液中加入800μL异丙醇，混匀，室温静置10分钟；再在4℃，12000rpm的条件下离心15分钟，收集第三混合上清液；
在所述第三混合上清液中加入800μL的70％乙醇溶液，混匀，再在4℃，12000rpm的条件下离心2分钟，收集沉淀，加入30μL蒸馏水，混匀得到拟南芥DNA。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将构建得到的所述克隆载体TSK KNAT3-Promoter转化至大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中，所述转化的步骤包括：
将10μL克隆载体TSK KNAT3-Promoter加入解冻的大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中，冰浴20～30分钟得到感受态混合物；
将感受态混合物放置于42℃条件下热激处理90秒，再进行冰浴4～6分钟；
加入600μL LB液体培养基混匀，放置于37℃摇床上50min-60min进行活化。
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