CZ295796A3 - Rps POLYPETIDE ENCODING DNA, PROCESS FOR PREPARING A TRANSGENIC PLANT AND A VECTOR CONTAINING SUCH DNA, METHOD OF ACHIEVING RESISTANCE TO PLANT PATHOGEN, DETECTION AND ISOLATION OF RESISTANCE GENE, Rps2 POLYPEPTIDE AND PROCESS FOR PREPARING THEREOF - Google Patents

Description

DNA kódující Rps polypeptid, způsob výroby transgenní rostliny a vektor obsahující tuto DNA, způsob dosažení resistence na rostlinný pathogen, způsob detegování a isolování genu resistence, polypeptid Rps2 a způsob jeho výroby

Oblast techniky

Tento vynález se týká DNA kódující Rps polypeptid, způsobu výroby transgenní rostliny a vektoru obsahujícího tuto DNA, způsobu dosažení resistence na rostlinný pathogen, způsobu detegování a isolováni genu resistence, polypeptidů Rps2 a způsobu jeho výroby.

Dosavadní stav techniky

Rostliny používají k potírání pathogenů rozmanité obranné strategie. Jednou obrannou odpovědí, tak zvanou hypersensitivní odpovědí (HR), je rychlé lokalizování nekrosy infikované tkáně.

U některých interakcí hosti tel-pathogen genetická analýza odhalila vztah gen-pro-gen mezi příslušným genem avirulence (avr) v avirulentním pathogenů, který vyvolává HR v hostiteli nesoucím příslušný gen resistence.

Podstata vynálezu

Obecně se tento vynález týká v podstatě čisté DNA (např. genomové DNA, cDNA nebo syntetické DNA) kódující Rps polypeptid, jak je níže uvedeno. V příbuzných aspektech se tento vynález týká vektoru, buňky (např. rostlinné buňky) a transgenní rostliny nebo jejího semene, které obsahuje tuto v podstatě čistou DNA kódující Rps polypeptid.

Ve výhodných uspořádáních gen RPS sekvence id. č. 5

Arg Leu Cys Asn His Lys Asn Gin Thr Ile Arg

(sekv. id. č. 5) znamená gen RPS2 rostliny rodu Arabidopsis. V různých výhodných provedeních buňka znamená transformovanou rostlinnou buňku odvozenou od buňky transgenní rostliny. V příbuzných aspektech se tento vynález týká transgenní rostliny obsahující transgen, který kóduje Rps polypeptid, který je exprimován v rostlinné tkáni vnímavé na infekci pathogeny exprimujícími gen avirulence avrRpt2 sekvence identifikační číslo 105

ATCGATTGAT	CTCTGGCTCA	GTGCGAGTAG	TCCATTTGAG	AGCAGTCGTA	50
GCCCCGCGTG	GCGCATCATG	GAGCTATTTG	GAATTTTCGC	AGGGTTATCG	100
ATTCGTAGTG	GGAACCCATT	CATTGTTTGG	AACCACCAAC	GGACGACTTA	150
ACAAGCTCCC	CGAGGTGCAT	GATGAAAATT	GCTCCAGTTG	CCATAAATCA	200
CAGCCCGCTC	AGCAGGGAGG	TCCCGTCACA	CGCGGCACCC	ACTCAGGCAA	250
AGCAAACCAA	CCTTCAATCT	GAAGCTGGCG	ATTTAGATGC	AAGAAAAAGT	300
AGCGCTTCAA	GCCCGGAAAC	CCGCGCATTA	CTCGCTACTA	AGACAGTACT	350
CGGGAGACAC	AAGATAGAGG	TTCCGGCCTT	TGGAGGGTGG	TTCAAAAAGA	400
AATCATCTAA	GCACGAGACG	GGCGGTTCAA	GTGCCAACGC	AGATAGTTCG	450
AGCGTGGCTT	CCGATTCCAC	CGAAAAACCT	TTGTTCCGTC	TCACGCACGT	500
TCCTTACGTA	TCCCAAGGTA	ATGAGCGAAT	GGGATGTTGG	TATGCCTGCG	550
CAAGAATGGT	TGGCCATTCT	GTCGAAGCTG	GGCCTCGCCT	AGGGCTGCCG	600
GAGCTCTATG	AGGGAAGGGA	GGCGCCAGCT	GGGCTACAAG	ATTTTTCAGA	650
TGTAGAAAGG	TTTATTCACA	ATGAAGGATT	AACTCGGGTA	GACCTTCCAG	700
ACAATGAGAG	ATTTACACAC	GAAGAGTTGG	GTGCACTGTT	GTATAAGCAC	750
GGGCCGATTA	TATTTGGGTG	GAAAACTCCG	AATGACAGCT	GGCACATGTC	800
GGTCCTCACT	GGTGTCGATA	AAGAGACGTC	GTCCATTACT	TTTCACGATC	850
CCCGACAGGG	GCCGGACCTA	GCAATGCCGC	TCGATTACTT	TAATCAGCGA	900
TTGGCATGGC	AGGTTCCACA	CGCAATGCTC	TACCGCTAAG	TAGCAGGGTA	950
TCTTCACGTG	GCGGCATCAT	GACAAGCCCA	TGATGCCGCC	AGCAGCTACC	1000
TGAATGCCGT	CTGGCTTTTT	GGTCCCTATT	GTCGTATCCG	GAAGATGACG	1050
TCAAAGAAŤC	TCGGCAAGAG	CTTTCTTGCT	CGACTCCTCA	GCTTCCGGAT	1100
CGATCAGGTC	GCTTGCCAGA	GCGCGCTTGT	CCATGAGCAT	CTGCCACAGC	1150
TGCTGGTCGA	TGGTGTCCTC	AGCTAAAGGG	ATTTTGACGA	CAACCATGCG	1200
CAACTGCCCG	TTGCGATACG	CTCGATCCTG	AAGCCCCGGT	GTCCATGGCA	1250
GCCCCAAGAA	AAAGACATAG	TTCGCCGCTG	TGAGGTTGTA	GCCTGTGCCG	1300
GCGGCCGACC	TGGTCCCGAT	AAACACCCTG	CAGTCCGGAT	CCTGCTGGAA	1350
AGCATCAATC	GCCTTCTGCC	GCTTCTTGGG	CGAGTCACTG	CCCACCAACG	1400
TCACGCACCC	GACGCCAAGC	TTGAGGCAGT	GCTCCCGCAA	CGTGGCCACG	1450

GATTCCTGAT ACTCGCAGAA GAGGATCACC TTGTCGTCGA C 1491 (sekv. id. č. 105) nebo pathogeny exprimujícími signál avirulence podobně rozpoznávaný Rps polypeptidem.

V druhém aspektu se tento vynález týká v podstatě čisté DNA, která obsahuje promotor schopný exprimovat gen RPS2 sekvence identifikační číslo 1

AAGTAAAAGA	AAGAGCGAGA	AATCATCGAA	ATGGATTTCA	TCTCATCTCT	50
TATCGTTGGC	TGTGCTCAGG	TGTTGTGTGA	ATCTATGAAT	ATGGCGGAGA	100
GAAGAGGACA	TAAGACTGAT	CTTAGACAAG	CCATCACTGA	TCTTGAAACA	150
GCCATCGGTG	ACTTGAAGGC	CATACGTGAT	GACCTGACTT	TACGGATCCA	200
ACAAGACGGT	CTAGAGGGAC	GAAGCTGCTC	AAATCGTGCC	AGAGAGTGGC	250
TTAGTGCGGT	GCAAGTAACG	GAGACTAAAA	CAGCCCTACT	TTTAGTGAGG	300
TTTAGGCGTC	GGGAACAGAG	GACGCGAATG	AGGAGGAGAT	ACCTCAGTTG	350
TTTCGGTTGT	GCCGACTACA	AACTGTGCAA	GAAGGTTTCT	GCCATATTGA	400
AGAGCATTGG	TGAGCTGAGA	GAACGCTCTG	AAGCTATCAA	AACAGATGGC	450
GGGTCAATTC	AAGTAACTTG	TAGAGAGATA	CCCATCAAGT	CCGTTGTCGG	500
AAATACCACG	ATGATGGAAC	AGGTTTTGGA	ATTTCTCAGT	GAAGAAGAAG	550
AAAGAGGAAT	CATTGGTGTT	TATGGACCTG	GTGGGGTTGG	GAAGACAACG	600
TTAATGCAGA	GCATTAACAA	CGAGCTGATC	ACAAAAGGAC	ATCAGTATGA	650
TGTACTGATT	TGGGTTCAAA	TGTCCAGAGA	ATTCGGCGAG	TGTACAATTC	700
AGCAAGCCGT	TGGAGCACGG	TTGGGTTTAT	CTTGGGACGA	GAAGGAGACC	750
GGCGAAAACA	GAGCTTTGAA	GATATACAGA	GCTTTGAGAC	AGAAACGTTT	800
CTTGTTGTTG	CTAGATGATG	TCTGGGAAGA	GATAGACTTG	GAGAAAACTG	850
GAGTTCCTCG	ACCTGACAGG	GAAAACAAAT	GCAAGGTGAT	GTTCACGACA	900
CGGTCTATAG	CATTATGCAA	CAATATGGGT	GCGGAATACA	AGTTGAGAGT	950
GGAGTTTCTG	GAGAAGAAAC	ACGCGTGGGA	GCTGTTCTGT	AGTAAGGTAT	1000
GGAGAAAAGA	TCTTTTAGAG	TCATCATCAA	TTCGCCGGCT	CGCGGAGATT	1050
ATAGTGAGTA	AATGTGGAGG	ATTGCCACTA	GCGTTGATCA	CTTTAGGAGG	1100
AGCCATGGCT	CATAGAGAGA	CAGAAGAAGA	GTGGATCCAT	GCTAGTGAAG	1150
TTCTGACTAG	ATTTCCAGCA	GAGATGAAGG	GTATGAACTA	TGTATTTGCC	1200
CTTTTGAAAT	TCAGCTACGA	CAACCTCGAG	AGTGATCTGC	TTCGGTCTTG	1250
TTTCTTGTAC	TGCGCTTTAT	TCCCAGAAGA	ACATTCTATA	GAGATCGAGC	1300
AGCTTGTTGA	GTACTGGGTC	GGCGAAGGGT	TTCTCACCAG	CTCCCATGGC	1350
GTTAACACCA	TTTACAAGGG	ATATTTTCTC	ATTGGGGATC	TGAAAGCGGC	1400
ATGTTTGTTG	GAAACCGGAG	ATGAGAAAAC	ACAGGTGAAG	ATGCATAATG	1450

TGGTCAGAAG CTTTGCATTG TGGATGGCAT CTGAACAGGG GACTTATAAG 1500 GAGCTGATCC TAGTTGAGCC TAGCATGGGA CATACTGAAG CTCCTAAAGC 1550 AGAAAACTGG CGACAAGCGT TGGTGATCTC ATTGTTAGAT AACAGAATCC 1600 AGACCTTGCC TGAAAAACTC ATATGCCCGA AACTGACAAC ACTGATGCTC 1650 CAACAGAACA GCTCTTTGAA GAAGATTCCA ACAGGGTTTT TCATGCATAT 1700 GCCTGTTCTC AGAGTCTTGG ACTTGTCGTT CACAAGTATC ACTGAGATTC 1750 CGTTGTCTAT CAAGTATTTG GTGGAGTTGT ATCATCTGTC TATGTCAGGA 1800 ACAAAGATAA GTGTATTGCC ACAGGAGCTT GGGAATCTTA GAAAACTGAA 1850 GCATCTGGAC CTACAAAGAA CTCAGTTTCT TCAGACGATC CCACGAGATG 1900 CCATATGTTG GCTGAGCAAG CTCGAGGTTC TGAACTTGTA CTACAGTTAC 1950 GCCGGTTGGG AACTGCAGAG CTTTGGAGAA GATGAAGCAG AAGAACTCGG 2000 ATTCGCTGAC TTGGAATACT TGGAAAACCT AACCACACTC GGTATCACTG 2050 TTCTCTCATT GGAGACCCTA AAAACTCTCT TCGAGTTCGG TGCTTTGCAT 2100 AAACATATAC AGCATCTCCA CGTTGAAGAG TGCAATGAAC TCCTCTACTT 2150 CAATCTCCCA TCACTCACTA ACCATGGCAG GAACCTGAGA AGACTTAGCA 2200 TTAAAAGTTG CCATGACTTG GAGTACCTGG TCACACCCGC AGATTTTGAA 2250 AATGATTGGC TTCCGAGTCT AGAGGTTCTG ACGTTACACA GCCTTCACAA 2300 CTTAACCAGA GTGTGGGGAA ATTCTGTAAG CCAAGATTGT CTGCGGAATA 2350 TCCGTTGCAT AAACATTTCA CACTGCAACA AGCTGAAGAA TGTCTCATGG 2400 GTTCAGAAAC TCCCAAAGCT AGAGGTGATT GAACTGTTCG ACTGCAGAGA 2450 GATAGAGGAA TTGATAAGCG AACACGAGAG TCCATCCGTC GAAGATCCAA 2500 CATTGTTCCC AAGCCTGAAG ACCTTGAGAA CTAGGGATCT GCCAGAACTA 2550 AACAGCATCC TCCCATCTCG ATTTTCATTC CAAAAAGTTG AAACATTAGT 2600 CATCACAAAT TGCCCCAGAG TTAAGAAACT GCCGTTTCAG GAGAGGAGGA 2650 CCCAGATGAA CTTGCCAACA GTTTATTGTG AGGAGAAATG GTGGAAAGCA 2700 CTGGAAAAAG ATCAACCAAA CGAAGAGCTT TGTTATTTAC CGCGCTTTGT 2750 TCCAAATTGA TATAAGAGCT AAGAGCACTC TGTACAAATA TGTCCATTCA 2800 TAAGTAGCAG GAAGCCAGGA AGGTTGTTCC AGTGAAGTCA TCAACTTTCC 2850 ACATAGCCAC AAAACTAGAG ATTATGTAAT CATAAAAACC AAACTATCCG 2900 CGA 2903 (sekv. id. č. 1) v rostlinné tkáni vnímavé na infekci bakteriálními pathogeny exprimujícími gen avirulence avrRpt2 sekvence identifikační číslo 105.

Ve výhodných provedeních promotor znamená promotor přírodní pro gen RPS. Transkripční a translační regulační oblasti jsou s výhodou přírodní pro gen RPS.

Transgenní rostliny podle vynálezu s výhodou znamenají rostliny, které jsou vnímavé na infekci pathogenem exprimuj ícím gen avirulence, s výhodou gen avirulence avrRpt2 (sekvence identifikační číslo 105). Ve výhodných provedeních transgenní rostlina znamená rostlinu ze skupiny rostlin sestávající z, ale neomezených pouze na ně, Arabidopsis, rajského jablka, sojového bobu, fazole, kukuřice, pšenice a rýže.

Podle jiného aspektu se tento vynález týká způsobu získání resistence rostliny na pathogen, který se vyznačuje tím, že zahrnuje a) přípravu buňky transgenní rostliny obsahující transgen kódující polypeptid Rps2, při čem tento transgen je integrován do genomu transgenní rostliny a je umístěn pro expresi v této rostlinné buňce, a b) pěstování transgenní rostliny z transgenní rostlinné buňky, při čemž transgen RPS2 je v této transgenní rostlině exprimován.

Podle jiného aspektu se tento vynález týká způsobu detegování genu resistence v rostlinné buňce, který zahrnuje a) uvedení genu RPS2 (sekvence id. č. 1) nebo jeho části o délce větší než 18 nukleových kyselin do kontaktu s přípravkem genomové DNA z rostlinné buňky za hybridizačnich podmínek poskytujících detekci sekvencí DNA o 50% nebo větší identitě sekvence se sekvencí DNA na obrázku 2 kódující Rps2 polypeptid, sekvence identifikační číslo 2 až 5

Lys Lys Glu Arg Glu Ile Ile Glu Met Asp Phe Ile Ser Ser Leu Ile 15 10 15

Val Gly Cys Ala Gin Val Leu Cys Glu Ser Met Asn Met Ala Glu Arg 20 25 30

Arg Gly His Lys Thr Asp Leu Arg Gin Ala Ile Thr Asp Leu Arg Ile 35 40 45

Gin Gin	Asp Gly	Leu Glu Gly Arg Ser 55	Cys Ser	Asn 60	Arg Ala	Arg	Glu
	50
Trp 65	Leu	Ser Ala	Val Gin Val Thr Glu 70	Thr Lys 75	Thr	Ala Leu	Leu	Leu 80
Val	Arg	Phe Arg Arg Arg Glu Gin Arg 85	Thr Arg 90	Met	Arg Arg Arg 95	Tyr
Leu	Ser	Cys Phe 100	Gly Cys Ala Asp Tyr 105	Lys Leu	Cys	Lys Lys 110	Val	Ser
Ala	Ile	Leu Lys 115	Ser Ile Gly Glu Leu 120	Arg Glu	Arg	Ser Glu 125	Ala	Ile
Lys	Thr 130	Asp Gly Gly Ser Ile Gin Val 135	Thr Cys	Arg 140	Glu Ile	Pro	Ile
Lys 145	Ser	Val Val	Gly Asn Thr Thr Met 150	Met Glu 155	Gin	Val Leu	Glu	Phe 160
Leu	Ser	Glu Glu	Glu Glu Arg Gly Ile 165	Ile Gly 170	Val	Tyr Gly	Pro 175	Gly
Gly	Val	Gly Lys 180	Thr Thr Leu Met Gin 185	Ser Ile	Asn	Asn Glu 190	Leu	Ile
Thr	Lys	Gly His 195	Gin Tyr Asp Val Leu 200	Ile Trp	Val	Gin Met 205	Ser	Arg
Glu	Phe 210	Gly Glu	Cys Thr Ile Gin Gin 215	Ala Val	Gly 220	Ala Arg	Leu	Gly
Leu 225	Ser	Trp Asp	Glu Lys Glu Thr Gly 230	Glu Asn Arg 235	Ala Leu	Lys 240	Ile

Tyr Arg Ala Leu Arg	Gin	Lys	Arg Phe Leu Leu Leu Leu Asp Asp Val
	245	250	255
Trp	Glu Glu Ile Asp 260	Leu	Glu	Lys Thr Gly Val Pro Arg 265	Pro Asp Arg 270
Glu	Asn Lys Cys Lys 275	Val	Met	Phe Thr Thr Arg Ser Ile 280 285	Ala Leu Cys
Asn	Asn Met Gly Ala 290	Glu	Tyr 295	Lys Leu Arg Val Glu Phe 300	Leu Glu Lys
Lys 305	His Ala Trp Glu	Leu 310	Phe	Cys Ser Lys Val Trp Arg 315	Lys Asp Leu 320
Leu	Glu Ser Ser Ser 325	Ile	Arg Arg Leu Ala Glu Ile Ile 330	Val Ser Lys 335
Cys	Gly Gly Leu Pro 340	Leu	Ala	Leu Ile Thr Leu Gly Gly 345	Ala Met Ala 350
His	Arg Glu Thr Glu 355	Glu	Glu	Trp Ile His Ala Ser Glu 360 365	Val Leu Thr
Arg	Phe Pro Ala Glu 370	Met	Lys 375	Gly Met Asn Tyr Val Phe 380	Ala Leu Leu
Lys 385	Phe Ser Tyr Asp	Asn 390	Leu	Glu Ser Asp Leu Leu Arg 395	Ser Cys Phe 400
Leu	Tyr Cys Ala Leu 405	Phe	Pro	Glu Glu His Ser Ile Glu 410	Ile Glu Gin 415
Leu	Val Glu Tyr Trp 420	Val	Gly	Glu Gly Phe Leu Thr Ser 425	Ser His Gly 430

Val Asn	Thr Ile Tyr Lys Gly Tyr Phe Leu Ile Gly Asp Leu Lys Ala
435	440	445
Ala Cys 450	Leu Leu Glu	Thr Gly Asp Glu Lys 455	Thr Gin Val Lys Met His 460
Asn Val 465	Val Arg Ser	Phe Ala Leu Trp Met 470	Ala Ser Glu Gin Gly Thr 475 480
Tyr Lys	Glu Leu Ile 485	Leu Val Glu Pro Ser 490	Met Gly His Thr Glu Ala 495
Pro Lys	Ala Glu Asn 500	Trp Arg Gin Ala Leu 505	Val Ile Ser Leu Leu Asp 510
Asn Arg	Ile Gin Thr 515	Leu Pro Glu Lys Leu 520	Ile Cys Pro Lys Leu Thr 525
Thr Leu 530	Met Leu Gin	Gin Asn Ser Ser Leu 535	Lys Lys Ile Pro Thr Gly 540
Phe Phe 545	Met His Met	Pro Val Leu Arg Val 550	Leu Asp Leu Ser Phe Thr 555 560
Ser Ile	Thr Glu Ile 565	Pro Leu Ser Ile Lys 570	Tyr Leu Val Glu Leu Tyr 575
His Leu	Ser Met Ser 580	Gly Thr Lys Ile Ser 585	Val Leu Pro Gin Glu Leu 590
Gly Asn	Leu Arg Lys 595	Leu Lys His Leu Asp 600	Leu Gin Arg Thr Gin Phe 605
Leu Gin 610	Thr Ile Pro	Arg Asp Ala Ile Cys 615	Trp Leu Ser Lys Leu Glu 620

Val Leu Asn Leu Tyr Tyr Ser Tyr Ala Gly Trp Glu Leu Gin Ser Phe
625	630	635	640
Gly Glu Asp	Glu Ala Glu Glu Leu Gly	Phe Ala	Asp Leu Glu Tyr Leu
	645	650	655
Glu Asn Leu	Thr Thr Leu Gly Ile Thr	Val Leu	Ser Leu Glu Thr Leu
	660 665		670
Lys Thr Leu	Phe Glu Phe Gly Ala Leu	His Lys	His Ile Gin His Leu
675	680		685
His Val Glu	Glu Cys Asn Glu Leu Leu	Tyr Phe	Asn Leu Pro Ser Leu
690	695		700
Thr Asn His	Gly Arg Asn Leu Arg Arg	Leu Ser	Ile Lys Ser Cys His
705	710	715	720
Asp Leu Glu	Tyr Leu Val Thr Pro Ala	Asp Phe	Glu Asn Asp Trp Leu
	725	730	735
Pro Ser Leu	Glu Val Leu Thr Leu His	Ser Leu	His Asn Leu Arg Cys
	740 745		750
Ile Asn Ile	Ser His Cys Asn Lys Leu	Lys Asn	Val Ser Trp Val Gin
755	760		765
Lys Leu Pro	Lys Leu Glu Val Ile Glu	Leu Phe	Asp Cys Arg Glu Ile
770	775		780
Glu Glu Leu	Ile Ser Glu His Glu Ser	Pro Ser Val Glu Asp Pro Thr
785	790	795	800

Leu Phe Pro Ser Leu Lys Thr Leu Arg Thr Arg Asp Leu Pro Glu Leu 805 810 815

Asn Ser Ile Leu Pro Ser Arg Phe Ser Phe Gin Lys Val Glu Thr Leu 820 825 830

Val Ile Thr Asn Cys Pro Arg Val Lys Lys Leu Pro Phe Gin Glu Arg 835 840 845

Arg Thr Gin Met Asn Leu Pro Thr Val Tyr Cys Glu Glu Lys Trp Trp 850 855 860

Lys Ala Leu Glu Lys Asp Gin Pro Asn Glu Glu Leu Cys Tyr Leu Pro 865 870 875 880

Arg Phe Val Pro Asn 885 (sekv. id. č. 2)

Glu His Ser Val Gin Ile Cys Pro Phe Ile Ser Ser Arg Lys Pro Gly 15 10 15

Arg Leu Phe Gin 20 (sekv. id. Č. 3)

Ser His Gin Leu Ser Thr 1 5 (sekv. id. č. 4)

Podle jiného aspektu se tento vynález týká způsobu výroby polypeptidu Rps2, který zahrnuje: a) získání buňky transformované DNA kódující polypeptid Rps2 umístěný pro expresi v této buňce, b) kultivování této transformované buňky za podmínek, při nichž exprimuje DNA, a c) isolování polypeptidu Rps2.

Podle jiného aspektu se tento vynález týká v podstatě čistého polypeptidu Rps2. Tento polypeptid s výhodou obsahuje sek11 věnci o více než 50 aminokyselinách v podstatě identickou se sekvencí větší než 50 aminokyselin uvedenou na obrázku 2, otevřenou čtecí oblast a. Nejvýhodněji tento polypeptid znamená polypeptid Rps2 z Arabidopsis thaliana (sekv. id. č. 2 až 5).

Podle jiného aspektu se tento výraz týká způsobu dosaženi resistence na infekci pathogeny v transgenní rostlině, které nenesou gen avirulence avrRpt2, který zahrnuje: a) získání transgenní rostlinné buňky obsahující transgeny kódující polypeptid Rps2 stejně jako transgen kódující produkt genu avrRpt2 sekvence identifikační číslo 106

Met Lys Ile Ala Pro Val Ala Ile Asn His Ser Pro Leu Ser Arg Glu
1	5	10	15
Val	Pro Ser His Ala 20	Ala Pro Thr Gin Ala Lys Gin 25	Thr Asn Leu Gin 30
Ser	Glu Ala Gly Asp 35	Leu Asp Ala Arg Lys Ser Ser 40	Ala Ser Ser Pro 45
Glu	Thr Arg Ala Leu 50	Leu Ala Thr Lys Thr Val Leu 55 60	Gly Arg His Lys
Ile 65	Glu Val Pro Ala	Phe Gly Gly Trp Phe Lys Lys 70 75	Lys Ser Ser Lys 80
His	Glu Thr Gly Gly 85	Ser Ser Ala Asn Ala Asp Ser 90	Ser Ser Val Ala 95
Ser	Asp Ser Thr Glu	Lys Pro Leu Phe Arg Leu Thr	His Val Pro Tyr

100 105 110

Val Ser Gin Gly Asn Glu Arg Met Gly Cys Trp Tyr Ala Cys Ala Arg 115 120 120

Met

Val 125

Gly

His

Ser

Val

Glu 130

Ala

Gly

Pro

Arg Leu 135

Gly

Leu

Pro

Glu

Leu 140

Tyr

Glu

Gly Arg

Glu 145

Ala

Pro

Ala

Gly

Leu 150

Gin

Asp

Phe

Ser

Asp 155

Val

Glu

Arg

Phe

Ile 160

His

Asn

Glu

Gly

Leu 165

Thr

Arg

Val

Asp

Leu 170

Pro

Asp

Asn

Glu

Arg 175

Phe

Thr

His

Glu

Glu 180

Leu

Gly

Ala

Leu

Leu 185

Tyr

Lys

His

Gly

Pro 190

Ile

Ile

Phe

Gly Trp 195

Lys

Thr

Pro

Asn

Asp 200

Ser

Trp

His

Met

Ser 205

Val

Leu

Thr

Gly

Val 210

Asp

Lys

Glu

Thr

Ser 215

Ser

Ile

Thr

Phe

His

Asp

Pro

Arg

Gin

Gly

Pro

Asp

Leu

Ala

Met

Pro

Leu

Asp

Tyr

Phe

220 225 230 235

Asn Gin Arg Leu Ala Trp Gin Val Pro His Ala Met Leu Tyr Arg 240 245 250 (sekvence id. č. 106), při čemž transgeny jsou integrovány do genomu transgenní rostliny a jsou umístěny pro expresi v této rostlinné buňce a jestliže je to žádoucí gen RPS2 je pod kontrolou regulačních sekvencí vhodných pro regulovanou expresi genu (genů) a b) vypěstování transgenní rostliny z transgenní rostlinné buňky, při čemž v této transgenní rostlině jsou exprimovány transgeny RPS2 a avrRpt2.

Podle jiného aspektu se tento vynález týká způsobu dosažení resistence na infekci pathogeny v transgenní rostlině v nepřítomnosti exprese genu avirulence v pathogenu, při čemž tento způsob zahrnuje: a) získání transgenní rostlinné buňky, která má v genomu integrován transgen obsahující gen RPS2 pod kontrolou promotoru, čímž se získá konstitutivní exprese genu RPS2, a b) vypěstování transgenní rostliny z transgenní rostlinné buňky, při čemž transgen RPS2 je exprimován konstitutivně v transgenní rostlině.

Podle jiného aspektu se tento vynález týká způsobu dosažení kontrolovatelné resistence na infekci pathogeny v transgenní rostlině v nepřítomnosti exprese genu avirulentce v pathogenu, při čemž tento způsob zahrnuje: a) vypěstování transgenní rostlinné buňky, která má v genomu integrován transgen obsahující gen RPS2 pod kontrolou promotoru poskytujícího kontrolovatelnou expresi genu RPS2, a b) vypěstování transgenní rostliny z transgenní rostlinné buňky, při čemž transgen RPS2 je kontrolovatelně exprimován v transgenní rostlině. Ve výhodných provedeních je gen RPS2 exprimován tkáňově specifickým nebo buněčně specifickým promotorem nebo takovým promotorem, který je aktivován zavedením vnějšího signálu nebo činidla, jako je chemický signál nebo činidlo.

Pod pojmem gen resistence na onemocnění (chorobu) se rozumí gen kódující polypeptid, který je schopen spustit obrannou odpověá v rostlinné buňce nebo rostlinné tkáni. Gen RPS znamená gen resistence na chorobu, který má 50% nebo větší identitu sekvence se sekvencí RPS2 (sekvence id. č. 1) z obr. 2 nebo jeho části. Gen RPS2 znamená gen resistence na chorobu kódující polypeptid resistence na chorobu Rps2 (sekvence id. č. 2 až 5) z Arabidopsis thaliana.

Pojem polypeptid znamená jakýkoliv řetězec aminokyselin, bez ohledu na délku nebo post-translační modifikaci (např. glykosylaci nebo fosforylaci).

Pojem v podstatě identický znamená polypeptid nebo nukleovou kyselinu, která vykazuje alespoň 50%, s výhodou 85%, výhodněji 90% a nejvýhodněji 95% homologii s referenční sekvencí aminokyselin nebo nukleové kyseliny. Pro polypeptidy bude délka srovnávání obecně alespoň 16 aminokyselin, s výhodou alespoň 20 aminokyselin, výhodněji alespoň 25 aminokyselin a nejvýhodněji 35 aminokyselin. U nukleových kyselin bude délka srovnávaných sekvencí alespoň 50 nukleotidů, s výhodou alespoň 60 nukleotidů, výhodněji alespoň 75 nukleotidů a nejvýhodněji 110 nukleotidů.

Sekvenční identita se typicky měří softwarem pro sekvenční analýzu (např. Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wi. 53705, USA). Tento software se hodí pro podobné sekvence přiřazením stupně homologie různým substitucím, delecím a jiným modifikacím. Mezi konzervativní substituce typicky patří substituce z následující skupiny substitucí: glycin a alanin, valin, isoleucin a leucin, kyselina aspartová, glutamová, asparagin a glutamin, serin a threonin, lysin a arginin a fenylalanin a tyrosin.

Pojem v podstatě čistý polypeptid” znamená polypeptid Rps2, který byl oddělen od složek přirozeně ho doprovázajících. Tento polypeptid je v podstatě čistý, jestliže alespoň 60 % hmotn. neobsahuje proteiny a organické molekuly, které ho přirozeně doprovázejí. S výhodou tento přípravek obsahuje alespoň 75 %, výhodněji alespoň 90 % a nejvýhodněji alespoň 99 % hmotn. polypeptidu Rps2. V podstatě čistý polypeptid Rps2 lze získat například extrakcí z přirozeného zdroje (např. rostlinné buňky) , expresí rekombinantní nukleové kyseliny kódující polypeptid Rps2 nebo chemickou syntézou proteinu. Čistotu lze změřit jakýmkoliv odpovídajícím způsobem, např. chromatografií na koloně, elektroforesou na polyakrylamidovém gelu nebo HPLC analýzou.

Protein v podstatě neobsahuje složky, které ho přirozeně doprovázejí, jestliže je oddělen od těchto znečištěnin, které ho doprovázejí v přirozeném stavu. Protein, který je chemicky syntetizován nebo vyroben v buněčném systému odlišném od buňky, z níž původně pochází, nebude tedy v podstatě obsahovat jeho přirozeně ho doprovázející složky. Mezi v podstatě čisté polypeptidy tedy patří ty polypeptidy, které jsou odvozeny od eukaryotických organismů, ale jsou syntetizovány v E. coli nebo jiných prokaryotech.

Pojem v podstatě čistá DNA znamená takovou DNA, která neobsahuje geny, které v přirozeně se vyskytujícím genomu organismu, z něhož je DNA podle vynálezu odvozena, tento gen obklopují. Tento pojem tedy zahrnuje například rekombinantní DNA, která je zahrnuta do vektoru, do autonomně se replikujícího plasmidu nebo viru, do genomové DNA prokaryota nebo eukaryota nebo která existuje jako oddělená molekula (např. cDNA nebo genomový nebo cDNA fragment produkovaný PCR nebo štěpením restrikční endonukleasou) nezávisle na jiných sekvencích. Zahrnuje také rekombinantní DNA, která je částí hybridního genu kódujícího další polypeptidovou sekvenci.

Pojem transformovaná buňka znamená takovou buňku, do které (nebo do jejíhož předka) je zavedena způsoby rekombinatní DNA DNA molekula kódující (jak je zde použita) polypeptid Rps2.

Pojem umístěný pro expresi znamená, že DNA molekula je umístěna tak, že přiléhá k DNA sekvenci, která řídí transkripci a translaci sekvence (tj. usnadňuje přípravu např. polypeptidu Rps2, rekombinantního proteinu nebo RNA molekuly).

Pojem reporterový gen znamená takový gen, jehož expresi lze analyzovat. Mezi takové geny patří, bez omezení na ně, B-glukuronidasa (GUS), luciferasa, chloramfenikolová transacetylasa (CAT) a B-galaktosidasa.

Pojem promotor znamená minimální sekvenci, která postačuje k řízení transkripce. Do vynálezu jsou zahrnuty také takové promotorové prvky, které postačují pro získání promotorově závislé exprese genu kotrolovatelnou buněčně specifickými, tkáňově specifickými nebo indukovatelnými vnějšími signály nebo činidly. Tyto prvky mohou být umístěny v 5' nebo 3* oblastech přírodního genu.

Pojem odštěpitelně napojený” znamená, že gen a regulační sekvence jsou spojeny takovým způsobem, aby umožnil expresi genu, jestliže se příslušné molekuly (např. transkripční aktivátorové proteiny) navážou na regulační sekvenci (sekvence).

Pojem rostlinná buňka znamená jakoukoliv samostatně se množící buňku navázanou semipermeabilní membránou a obsahující plastid. Jestliže je další množení žádoucí, potřebuje tato buňka také buněčnou stěnu. Rostlinná buňka, jak se zde tento pojem používá, zahrnuje, ale bez omezení, řasy, kyanobakterie, semena, suspenzní kultury, embrya, meristemové oblasti, tkáňový kalus, listy, kořeny, stonky, gametofyty, sporofyty, pyly a mikrospory.

Pojem transgen znamená jakýkoliv kousek DNA, který je záměrně vložen do buňky a stává se částí genomu organismu, který se z této buňky vyvíjí. Mezi takový transgen patří gen, který je částečně nebo plně heterologní (např. cizí) pro transgenní organismus, nebo může znamenat gen homologní pro endogenní gen organismu.

Pojem transgenní znamená jakoukoliv buňku, která zahrnuje DNA sekvenci, která je záměrně vložena do buňky a která se stává částí genomu organismu, který se z této buňky vytvoří. Transgenní organismy, jak se zde tento pojem používá, znamenají obecně transgenní rostliny a DNA (trasgen) je záměrně vložena do jaderného nebo plastidového genomu.

Pojem pathogen znamená organismus, jehož infekce do buněk životaschopné rostlinné tkáně vyvolává chorobnou odpověá v rostlinné tkáni.

Další vlastnosti a výhody tohoto vynálezu budou zřejmé z následujícího popisu jeho výhodných provedení a z nároků.

V následující části spisu budou nejdříve popsány obrázky.

Obrázky 1A až IF jsou schematickým shrnutím fyzikální a RFLP analýzy, která vedla ke klonování místa RPS2.

Obrázek 1A je diagram ukazující uspořádání genetické a RFPL mapy odpovídající části Arabidopsis thaliana chromosomu IV adaptovaného z mapy publikované Listerem a Deanem (Plant J. 4, 745 (1993).). RFLP markér L11F11 představuje levé raménko klonu YUP11F11 YAC.

Obrázek 1B je diagram ukazující seřazení odpovídajících YAC kolem místa RPS2. YAC konstrukce označené YUP16G5, YUP18G9 a YUP11F11 byly poskytnuty J. Eckerem z University of Pennsylvania. YAC konstrukce označené EW3H7, EW11D4, EW11E4 a EW9C3 byly poskytnuty E. Wardem z Ciba-Geigy, lne.

Obrázek 1C je diagram ukazující seřazeni kosmidových klonů kolem místa RPS2. Kosmidové klony s označením H znamenají deriváty klonu EW3H7 YAC, zatímco s označením E znamenají deriváty klonu EW11E4 YAC. Vertikální šipka označuje relativní polohy RFLP markérů mezi ekotypy La-er a rps2-101N rostliny. RFLP markéry byly identifikovány analyzováním Southernova blotu obsahujícího více než 50 různých štěpů restrikčními enzymy použitím buň celé části nebo kousků odpovídajících kosmidových klonů jako sond. Kosmidové klony popsané na obr. 1C byly poskytnuty J. Giraudatem, C.N.R.S., Gif-sur-Yvette, Francie.

Obrázky ID a IE jsou mapy míst štěpení restrikční endonukleasou EcoRI v kosmidech E4-4 a E4-6. Místa rekombinantních zlomů obklopujících místo RPS2 jsou umístěna ve fragmentech získaných štěpením restrikční endonukleasou EcoRI s 4 500 a 7 500 páry nukleotidů.

Obrázek IF je diagram ukazující přibližné umístění genu, které kódují RNA transkripty, které byly identifikovány polyA* RNA blotovou analýzou. Velikosti transkriptů jsou uvedeny v tisících párech nukleotidů (kpn) pod každým transkriptem.

Obrázek 2 je úplná sekvence nukleotidů cDNA-4 obsahující místo genu RPS2 (sekvence id. č. 1). Pod sekvencí nukleotidů níže jsou uvedeny tři čtecí oblasti. Je uvedena odvozená aminokyselinová sekvence (sekvence id. č. 2 až 5) čtecí oblasti a a obsahuje 909 aminokyselin. Methionin kódovaný ATG start kodonem je v otevřené čtecí fázi a obrázku 2 zakroužkován. A start kodonu ATG znamená nukleotid 31 na obrázku 2.

Obrázek 3 je sekvence nukleotidů genu avrRpt2 (sekvence id. č. 105) a jeho odvozená aminokyselinová sekvence (sekvence id. č. 106). Potenciální ribosomové vazebné místo je podtrženo. Invertované opakování je označeno horizontálními šipkami na 3' konci otevřené čtecí oblasti. Pod nukleotidovou sekvencí otevřené čtecí fáze je uvedena odvozená aminokyselinová sekvence.

Obrázek 4 je schematické shrnutí komplementační analýzy, která umožňuje funkční potvrzení, že DNA nesená na p4104 a p4115 (kódující cDNA-4) uděluje aktivitu RPS2 resistence na choroby rostlin Arabidopsis thaliana, kterým před tím chyběla aktivita RPS2 resistence na choroby. Malé vertikální značky kolem čáry genomu” představují místa rozpoznávaná restrikčním enzymem EcoRI. Čísla nad touto čarou znamenají velikost výsledných DNA fragmentů v tisících párech nukleotidů (kpn) (viz také obr. IE). Opačné cDNA jsou přibližná místa kódujících sekvencí RNA transkriptů (viz také obr. 1F); šipky označují směr transkripce cDNA 4, 5 a 6. Pro funkční komplementační pokusy byly rostliny rps2-201C/rps2-201C geneticky transformovány označenými Arabidopsis thaliana genomovými DNA sekvencemi. Tyto sekvence byly neseny na pojmenovaných plasmidech (derivátech binárního kosmidového vektoru pSLJ4541) a dodány do rostliny Agrobacterium-zprostředkovanými transformačními způsoby. Fenotyp resistence na chorobu výsledných transformantů následujících po inokulaci P. syringae exprimující avrRpt2 je uveden jako Sus. (od anglického susceptible, vnímavý, žádná resisteční odpověá) nebo Res. (resistentní na chorobu).

V následující části popisu bude pojednáno o genetické podstatě resistence na pathogeny.

Je uveden přehled interakce mezi rostlinným hostitelem a mikrobiálním pathogenem. Invase potenciálního pathogenu do rostliny může mít následující rozsah: bučí pathogen úspěšně proliferuje v hostiteli a způsobuje příznaky choroby nebo je jeho růst zastaven obranami hostitele. U některých interakcí rostlina-pathogen je viditelný znak zastavení aktivní obrannou odpovědí, tak zvanou hypersensitivní odpovědí HR. HR zahrnuje rychlou nekrosu buněk kolem místa infekce a může zahrnovat tvorbu viditelného suchého hnědého poranění. Pathogeny, které vyvolávají HR u daného hostitele, jsou označovány jako avirulentní na tomto hostiteli, o hostiteli se mluví jako o resistentním a o interakci rostlina-pathogen se mluví jako o neslučitelné. Kmeny, které proliferují a způsobují onemocnění příslušného hostitele, se nazývají virulentní, v tomto případě je hostitel vnímavý a interakce rostl ina-pathogen se označuje slučitelná.

Klasická genetická analýza se úspěšně používá pro objasnění genetického základu rozpoznávání rostlina-pathogen u těch případů, v nichž serie kmenů (druhů) příslušného houbového nebo bakteriálního pathogenu jsou bučí virulentní nebo avirulentní na serie kultivarů, příslušných hostitelských druhů. V mnoha těchto případech genetická analýza jak hostitele tak pathogenu odhalila, že mnoho avirulentních houbových a bakteriálních kmenů se liší od virulentních tím, že mají jeden nebo více genů avirulence (avr), které mají odpovídající geny resistence v hostiteli. Tento vztah gen avirulence-gen resistence je označen jako model gen-pro-gen [Crute a spol.: strana 197 v Mechanisme of Resistance to Plant Disease, R.S.S. Fraser (red.), (1985), Ellingboe: Annu. Rev. Phytopathol. 9, 125 (1981), Flor: Annu. Rev. Phytopathol. 19. 275 (1971), Keen a Staskawicz: viz shora (1988) a Keen a spol. v Application of Biotechnology to Plant Pathogen Control, I. Chet (red.), John Wiley & Sons, 65 (1993).]. Podle jednoduché formulace tohoto modelu geny resis20 tence rostlin kódují specifické receptory pro molekulární signály generované avr geny. Cesta (cesty) signální transdukce potom přináší (přinášejí) signál do řady cílových genů, které inicují HR a další obrany hostitele [Gabriel a Rolfe: Annu. Rev. Phytopathol. 28, 365 (1990).]. Přes tento jednoduchý prediktivní model je molekulární podklad interakce gen avr-resistence stále ještě neznámý.

Jeden základní předpoklad hypotézy gen-pro-gen byl přesvědčivě potvrzen na molekulární úrovni klonováním různých bakteriálních genů avr [Innes a spol.: J. Bacteriol. 175. 4859 (1993), Dong a spol.: Plant Cell 2, 61 (1991), Whelan a spol.: Plant Cell 3, 49 (1991), Staskawicz a spol.: J. Bacteriol. 169. 5789 (1987), Gabriel a spol.: P.N.A.S., USA 21, 6415 (1986), Keen a Staskawicz: Annu. Rev. Microbiol. 42, 421 (1988), Kobayashi a spol.: Mol. Plant-Microbe Interact. 2, 94 a 103 (1990).]. Bylo ukázáno, že mnoho těchto klonovaných genů avirulence odpovídá jednotlivým genům resistence v příbuzných hostitelských rostlinách a že způsobují avirulentni fenotyp, jestliže jsou přeneseny na jinak virulentní kmen. Místo avrRpt2 bylo isolováno z Pseudomonas syringae pv. tomato a sekvenováno Innesem a spol. [Innes R. a spol.: J. Bacteriol. 175. 4859 (1993).]. Obrázek 3 představuje sekvenci nukleotidů (sekv. id. č. 105) a odvozenou sekvenci aminokyselin genu avrRpt2 sekvenci identifikační číslo 6

Ser Lys Arg Lys Ser Glu Lys Ser Ser Lys Trp Ile Ser Ser His Leu 15 10 15

Leu Ser Leu Ala Val Leu Arg Cys Cys Val Asn Leu 20 25 (sekv. id. č. 6)

Mezi příklady známých signálů, na které rostliny odpovídají, jestliže jsou infikovány pathogeny, patří vlásenková struktura z Erwinia [Wei a spol.: Science 257. 85 (1992).] a

Pseudomonas [He a spol.: Cell 73, 1255 (1993).], avr4 [Joosten a spol.: Nátuře 367. 384 (1994).] a avr9 peptidy [van den Ackerveken a spol.: Plant J. 2, 359 (1992).] z Cladosporium, PopAl z Pseudomonas [Arlat a spol.: EMBO J. 13, 543 (1994).], avrD-generovaný lipopolysacharid [Midland a spol.: J. Org. Chem. 58, 2940 (1993).] a NIP1 z Rhynchosporium [Hahn a spol.: Mol. Plant-Microbe Interact. 6, 745 (1993).].

Při srovnání s geny avr je o genech resistence rostlin známo podstatně méně než o specifických avr-generovaných signálech. Gen resistence rostlin, RPS2 (rps jako resistence na Pseudomonas syringae), první gen nové, dříve neidentifikované třídy genů resistence onemocnění rostlin, odpovídá specifickému avr genu (avrRpt2). Část práce vedoucí ke klonování RPS2 je popsána Yuem a spol.: Molecular Plant-Microbe Interactions 6, 434 (1993) a Kunkelem a spol.: Plant Cell 5, 865 (1993).

Zřejmě nepříbuzný gen avirulence, který specificky odpovídá genu resistence na onemocnění rostlin, Pto, byl isolován z rajského jablka (Lycopersicon esculentum) [Martin a spol.: Science 262. 1432 (1993).]. Rostliny rajského jablka, které exprimují gen Pto, jsou resistentní na infekci kmeny Pseudomonas syringae pv. tomato, které exprimují gen avirulence avrPto. Sekvence aminokyselin odvozená od DNA sekvence Pto genu vykazuje silnou podobnost k serin-threonin proteinovým kinasam, implikujícím Pto do signální transdukce. Žádná podobnost k místu Pto rajského jablka nebo jakékoliv známé proteinové kinasy nebyla pro RPS2 pozorována, což ukazuje na to, že RPS2 je představitelem nové třídy genů resistence onemocnění rostlin.

Byla popsána isolace genu specifického pro druh ze Zea mays (kukuřice) známého jako Hml [Johal a Briggs: Science 258, 985 (1992).]. Hml uděluje resistenci proti specifickým druhům houbového pathogenů Cochliobolus carbonum regulováním degradace houbového toxinu, strategie, která je mechanisticky odlišná od resistence specifické pro gen avirulence mechanismu RPS2-avrRpt2 resistence.

Klonovaný RPS2 gen podle tohoto vynálezu se může použít pro usnadnění konstrukce rostlin, které jsou resistentní na specifické pathogeny a které překonávají neschopnost přenést geny resistence na onemocnění mezi druhy klasickými způsoby pěstování [Keen a spol.: viz shora (1993).]. Nyní zde následuje popis klonování a charakterizace RPS2 genetického místa Arabidopsis thaliana RPS2 genomové DNA a RPS2 cDNA. Gen avrRpt2 a gen RPS2 stejně jako mutanty rps2-101C, rps2-102C a rps2-201C (také označovaný rps2-201) jsou popsány Dongem a spol.: Plant Cell 3, 61 (1991), Yuem a spol.: viz shora (1993), Kunkelem a spol.: viz shora (1993), Whalenem a spol.: viz shora (1991) a Innesem a spol.: viz shora (1993).]. Byl isolován také mutant označený rps2-101N. Identifikace a klonování genu RPS2 jsou popsány níže.

RPS2 překonává citlivost na pathogeny nesoucí gen avrRpt2. Pro demonstrování vzájemného genetického vztahu mezi genem avirulence v pathogenu a genem resistence v hostiteli bylo nejdříve nutné isolovat gen avirulence. Testováním kmenů Pseudomonas, které jsou známými pathogeny rostlin plodin příbuzných Arabidopsis, byly identifikovány a analyzovány vysoce virulentní kmeny P. syringae pv. maculicola (Psm) ES4326, P. syringae pv. tomato (Pst) DC3000 a avirulentní kmen Pst MM1065, pokud jde o jejich případné schopnosti růst v přírodních rostlinách Arabidopsis thaliana [Dong a spol.: Plant Cell 3., 61 (1991), Whalen a spol.: Plant Cell 49 (1991), MM1065 je v práci Whalena a spol. označen jako JL1065.]. Psm ES4326 nebo Pst DC3000 se mohou namnožit 10⁴krát v listech Arabidopsis thaliana a způsobují poranění nasakující vodu, která se objevují během dvou dnů. Pst MM1065 se namnoží maximálně desetkrát v listech Arabidopsis thaliana a po 48 h způsobuje mírně chlorotické suché poškození. Resistence na onemocnění tedy souvisí s velmi intenzivně inhibovaným růstem pathogenu.

Gen avirulence (avr) kmene Pst MM1065 byl klonován použitím standardních technik, jak je popsali Dong a spol.: Plant Cell 3, 61 (1991), Whalen a spol.: viz výše (1991) a Innes a spol.: viz výše (1993). Isolovaný gen avirulence z tohoto kmene byl označen avrRpt2. Virulentní kmen Psm ES4326 nebo Pst DC3000 normálně způsobuje, že se příznaky onemocnění objeví po 48 h, jak shora popsáno. Naproti tomu Psm ES4326/avrRpt2 nebo Pst DC3000/avrRpt2 vylovává viditelné nekrotické hypersensitivní odpovědi (HR) během 16 h a namnoženi 50 krát menší než Psm EC 4326 nebo Pst DC3000 v přírodních listech Arabidopsis thaliana [Dong a spol.: viz výše (1991) a Whalen a spol.: viz výše (1991). ]. Resistence na onemocnění u přírodní rostliny Arabidopsis vyžaduje, zčásti, gen avirulence v pathogenu nebo signál generovaný genem avirulence.

Byla popsána isolace čtyř mutantů resistence onemocnění Arabidopsis thaliana použitím klonovaného genu avrRptž pro hledání hostitelského genu potřebného pro resistence na onemocnění pathogeny nesoucími gen avrRpt2 [Yu a spol.: viz výše (1993) a Kunkel a spol.: viz výše (1993).]. Čtyři mutanty Arabidopsis thaliana selhaly při vyvíjení HR, jestliže byly infiltrovány Psm ES4326/avrRpt2 nebo Pst DC3000/avrRpt2, jak je očekáváno pro rostliny, které ztratily svou kapacitu resistence na onemocnění. V případě jednoho z těchto mutantů přibližně 3000 pět až šest týdnů starých rostlin M₂ ekotyp Columbia (Col-0 rostliny) rostlin generovaných mutagenesi ethylmethansulfonovou kyselinou (EMS) bylo ručně naočkováno Psm ES4326/avrRpt2. Byl identifikován jediný mutant, rps2-101C (resistence na Pseudomonas syringae) (Yu a spol.: viz výše (1993).].

Druhý mutant byl isolován postupem, který specificky obohacuje mutanty neschopné nést HR [Yu a spol.: viz výše (1993).]. Jestliže jsou 10 dnů staré sazeničky Arabidopsis thaliana rostoucí na Petriho deskách infiltrovány Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (Psp) NPS3121 versus PsP NPS3121/ /avrRpt2, asi 90 % rostlin infitrovaných Psp NS3121 přežívá, zatímco asi 90 až 95 % rostlin infiltrovaných Psp NPS3121/ /avrRpt2 hyne. Vakuová infiltrace celých malých sazeniček Arabidopsis thaliana PsP NPS3121/avrRpt2 vyvolává systémovou HR, která obvykle sazeničky ničí. Naproti tomu sazeničky infiltro24 váné Psp NPS3121 přežívají, protože Psp NPS3121 je slabým pathogenem u Arabidopsis thaliana. Druhý mutant resistence na onemocnění byl isolován infiltrováním 4000 EMS-mutagenizovaných sazeniček Columbia M₂ PsP NPS3121/avrRpt2. Bylo získáno 200 sazeniček, které přežily. Tyto sazeničky byly přesazeny do země a reanalyzovány ručním očkováním, když tyto rostliny dozrály. Z těchto 200 přežilých jedna rostlina nedala HR, když byla ručně infiltrována Psm ES4326/avrRpt2. Tento mutant byl označen rps2-102C [Yu a spol.: viz výše (1993).].

Třetí mutant rsp2-201C byl isolován při testování přibližně 7500 rostlin M₂ odvozených od semen Arabidopsis thaliana ekotyp Col-O, který byl mutagenizován diepoxybutanem [Kunkel a spol.: viz výše (1993).]. Rostliny byly naočkovány ponořením celých listových rozet do roztoku obsahujícího Pst DC3000/ /avrRpt2 bakterie a povrchově aktivní činidlo Silwet L-77 [Whalen a spol.: viz výše (1993).]. Rostliny byly inkubovány v kontrolovaném růstovém boxu 3 až 4 dny. Potom byly pozorovány příznaky rozvinutí choroby. Toto testování odhalilo čtyři linie mutantů (nesoucí allely rps2-201C, rps2-202C, rps2-203C a rps2-204C). Rostliny homozygotní na rps2-201C byly primárním předmětem pro další studie [Kunkel a spol.: viz výše (1993) a bezprostřední aplikace].

Isolace čtvrtého rps2 mutantu, rps2-101N, ještě nebyla publikována. Tento čtvrtý isolát je buá mutant nebo vnímavý Arabidopsis ekotyp. Semena Arabidopsis Nossen ekotypu byla ozářena gama zářením a potom byla hustě vyseta na rovnou plochu a nechána klíčit a růst skrz nylonovou sít. Když byly rostlinky staré pět až šest týdnů, rovnné plochy byly obráceny a rostlinky byly částečně ponořeny do misky obsahující kulturu Psm ES4326/avrRpt2 a vakuově infiltrovány ve vakuovém exikátoru. Takto naočkované rostliny vyvíjejí HR během 24 h. Tímto postupem bylo analyzováno přibližně 40 000 rostlin. Byla identifikována jedna vnímavá rostlina. Následná RFLP analýza této rostliny ukazuje, že to nemusí být Nossen mutant, ale spíše jiný Arabidopsis ekotyp, který je vnímavý na Psm ES4326/avrRpt2.

Tato rostlina se označuje jako rps2-101N. Isolované mutanty rps2-101C, rps2-102C, rps2-201C a rps2-101N jsou souhrnně označovány jako rps2 mutanty”.

Mutanty rps2 selhávají specificky odpovídat na klonovaný gen avirulence, avrRpt2. RPS2 genový produkt je specificky vyžadován pro resistenci na pathogeny nesoucí gen avirulence, avrRpt2. Mutace v Rps2 polypeptidu, která odstraňuje nebo snižuje jeho funkci, by byla pozorovatelná jako nepřítomnost hypersenzitivní odpovědi po infiltraci pathogenem. Mutanty rsp2 vykazovaly příznaky onemocnění nebo nulovou odpověá, když byly infiltrovány Psm ES4326/avrRpt2, Pst DC3000/avrRpt2 nebo Psp NPS3121/avrRpt2. Konkrétně - nebyla vyvolána žádná HR odpověá, která by ukazovala, že rostliny byly vnímavé a že ztratily resistenci na pathogen přes přítomnost avrRpt2 genu v pathogenu.

Růst pathogenu v listech rostliny rps2 mutantu byl podobný v přítomnosti i nepřítomnosti avrRpt2 genu. Byl srovnán Psm ES4326 a Psm ES4326/avrRpt2 růst v rps2 mutantech a bylo zjištěno, že probíhá stejně dobře v rps2 mutantech, stejnou rychlostí, kterou se Psm ES4326 množí v přírodních Arabidopsis listech. Podobné výsledky byly pozorovány pro růst Pst DC3000 a Pst DC3000/avrRpt2 v rps2 mutanech.

Mutanty rps2 vykazovaly HR, když byly infiltrovány pathogeny Pseudomonas nesoucími jiné avr geny, Psm ES4326/avrB, Pst DC3000/avrB, Psm ES4326/avrRpml a Pst DC3000/avrRpml. Schopnost namontovat HR na avr gen jiný než avrRpt2 znamená, že rps2 mutanty isolované selekcí s avrRpt2 jsou specifické na avrRpt2.

Mapování a klonování RPS2 genu se provádí následujícím způsobem. Genetická analýza rps2 mutantů rps2-101C, rps2-102C, rps2-201C a rps2-101N ukázala, že všechny odpovídají genům, které se segregují podle očekávání pro jediné Mendelovské místo a že všechny čtyři byly nejpravděpodobněji alelové. Tyto čtyři rps mutanty byly zmapovány na dolní části chromosomu IV standardními RFLP postupy mapování včetně markérů na bázi polymera26 sové řetězové reakce (PCR) [Yu a spol.: viz výše (1993), Kunkel a spol.: viz výše (1993) a Mindrinos K.: nepublikováno.]. Segregační analýza ukázala, že rps2-101C a rps2-102C jsou pevně napojeny na PCR markér, PG11, zatímco RFLP markér M600 byl použit pro definování místa chromosomu mutace rps2-201C (obr. 1A) [Yu a spol.: viz výše (1993) a Kunkel a spol.: viz výše (1993).]. RPS2 byl pak následně mapován na centromerním místě PG11.

Heterozygotní RPS2/rps2 rostliny vykazují obrannou odpověá, která je mezi odpovědí vykazovanou přírodní a homozygotní rps2/rps2 mutovanou rostlinou [Yu a spol.: viz výše (1993) a Kunkel a spol.: viz výše (1993).]. Heterozygotní rostliny mají HR jako odpověá ha Psm4326/avrRpt2 nebo Pst DC3000/avrRpt2 infiltraci. HR se však objevuje později než u přírodních rostlin a vyžaduje vyšší minimální množství inokula [Yu a spol.: viz výše (1993) a Kunkel a spol.: viz výše (1993).].

Mapování s vysokým rozlišením RPS2 genu a RPS” cDNA isolátů se provádí následujícím postupem. Pro klonování RPS2 genu založeném na mapování byl rps2-101N/rps2-101N zkřížen s Ladsberg erecta RPS2/RPS2. Rostliny generace F_x byly nechány samoopylit (samo)· 165 F₂ rostlin samoopylením poskytlo F₃ generaci. Postupy standardního RFLP mapování ukázaly, že rps2-101N se mapuje blízko k a na centromerní straně RFLP markéru, PG11. Aby se získala podrobnější mapa poloh, rps2-101N/rsp-101N se zkříží s dvojitě označeným kmenem Landsberg erecta obsahujícím recesivní mutace, cer2 a ap2. Genetická vzdálenost mezi cer2 a ap2 je přibližně 15 cm a místo rps2 je umístěno uvnitř tohoto intervalu. Rostliny F₂, které vykazovaly bučí CER2 ap2 nebo cer2 AP2 genotyp, byly isolovány, samoopyleny a vyhodnoceny na RPS2 naočkováním alespoň 20 F₃ rostlin pro každou F₂ Psm ES4326/ /avrRpt2. Také byla připravena DNA ze sbírky přibližně 20 F₃ rostlin pro každou F₂ linii. CER2 ap2 a cer2 AP2 rekombinanty byly použity pro analýzu na chromosomy, jak je to ilustrováno na obr. 1.

Jak je uvedeno na obrázku 1, RPS2 byl mapován v oblasti o 28 000 až 35 000 párů nukleotidů překlenuté kosmidovými klony E4-4 a E4-6. Tato oblast obsahuje alespoň šest genů, které poskytují detegovatelné transkripty. Podle RNA blotové analýzy neexistovaly žádné významné rozdíly ve velikostech transkriptů nebo jejich úrovní exprese v rps2 mutantech. Byly klonovány cDNA klony každého z těchto transkriptů byly isolovány a pět z nich bylo sekvenováno. Jak je popsáno níže, bylo ukázáno, Že jeden z těchto transkriptů, cDNA-4, odpovídá místu RPS2. Z této studie byly získány tři nezávislé cDNA klony (klon cDNA-4-4, cDNA-4-5 a cDNA-4-11) odpovídající RPS2 z Columbia ekotypu přírodních rostlin. Zdánlivé velikosti RPS2 transkriptů byly podle RNA blotové analýzy 3 800 a 3 100 párů nukleotidů.

Čtvrtý, nezávislý cDNA-4 klon (cDNA-4-2453) byl získán na základě mapování isolátu RPS2 v oddělené studii. Byly identifikovány kvasinkové umělé chromosomové (YAC) klony, které nesou přilehlé, překrývající se inserty Arabidopsis thaliana ekotyp Col-0 genomové DNA z oblasti M600 překlenující přibližně 900 000 párů nukleotidů v oblasti RPS2. Arabidopsis YAC knihovny byly získány od J. Eckera a E. Warda, viz výše, a od E. Grilla [Grill a Somerville: Mol. Gen. Genet. 226. 484 (1991).]. Kosmidy označené ”H a E” byly odvozeny od YAC insertů a byly použity při isolaci RPS2 (obr. 1).

Genetické a fyzické umístění RPS2 bylo přesněji definováno fyzickým mapováním RFLP, RAPD (náhodně amplifikovaná polymorní DNA) a CAPS (štěpená amplifikovaná polymorfní sekvence) markérů. Pro genetické mapování byly použity oddělené populace ze zkřížení mezi rostlinami genotypu RPS2/RPS2 (žádný O přírodní typ) a rps2-201/rps2-201 (Col-0 pozadí). RPS2 místo bylo mapováno použitím markérů 17B7LE, PG11, M600 a dalších. Pro genetické mapování s vysokým rozlišením se generuje řada těsně navázaných RFLP markérů použitím fragmentů koncového insertu z YAC a kosmidových klonů (obr. 1) [Kunkel a spol.: viz výše (1993), Konieczny a Ausubel: Plant J. 4, 403 (1993) a Chang a spol.: PNAS USA 85. 6856 (1988).]. Kosmidové klony E4-4 a E4-6 byly potom použity pro identifikaci exprimovaných transkriptů (označené cDNA-4, -5, -6, -7, -8 na obrázku IF) z této oblasti, včetně cDNA-4-2453 klonu.

V další části spisu bude popsána RPS2 DNA sekvenační analýza. DNA sekvenační analýza cDNA-4 z přírodních Col-0 rostlin a z mutantů rps2-101C, rps2-102C, rps2-201C a rps2-101N ukázala, že cDNA-4 odpovídá RPS2. DNA sekvenační analýza rps2-101C, rps2-102C a rps2-201C odhalila změny proti přírodní sekvenci, jak je to uvedeno v tabulce 1. Systém číslování v tabulce 1 začíná u ATG start kodonu, který kóduje první methionin, při čemž A znamená nukleotid 1. DNA sekvenační analýza cDNA-4 odpovídající mutantu rps2-102C ukázala, že se liší od přírodní sekvence na zbytku aminokyseliny 476. Navíc DNA sekvenační analýza cDNA odpovídající cDNA-4 z rsp2-101N ukázala, že obsahuje inserci o 10 párech nukleotidů na aminokyselinovém zbytku 581, místě v oblasti bohaté na opakující se leucin, což způsobuje posun RPS2 čtecí fáze. Mutant rps2-101C obsahuje mutaci, která vede k tvorbě kodonu terminačního řetězce. DNA sekvence mutantové alely rps2-201C odhalila mutaci měnící jedinou aminokyselinu v segmentu LRR oblasti, která má také podobnost s helix-smyčka-helix motifem, což dále podporuje označení tohoto místa jako RPS2 gen. DNA a aminokyselinové sekvence, které znamenají sekvenci id. č. 1 a sekv. id. č. 2 až 5, jsou uvedeny na obrázku 2.

Tabulka 1

mutant	přírodní	typ	poloha	změna mutace
rps2-101C	703 TGA	705	704	TAA stop kodon
rps2-101N	1741 GTG	1743	1741	GTGGAGTTGTATG inserce
rps2-102C 476	1426 AGA arg	1428	1427	AAA aminokyselina lys
rps2-201C	2002 ACC thr	2004	2002	CCC aminokyselina pro

DNA sekvenační analýza cDNA-4 odpovídající RPS2 z přírodních Col-0 rostlin odhalila otevřenou čtecí fázi (mezi dvěma stop kodony) překlenující 2 751 párů nukleotidů. Mezi prvním methioninovým kodonem této čtecí fáze a 3'-stop kodonem, je 2 727 párů nukleotidů, které odpovídají odvozenému polypeptidů o 909 aminokyselinách (viz otevřená čtecí oblast a” na obr. 2). Aminokyselinová sekvence má relativní molekulovou hmotnost 104 460 a pl 6,51.

RPS2 patří k nové třídě genů resistence na onemocnění. Struktura Rps2 polypeptidů se nepodobá proteinové struktuře produktu pouze předem klonovaného a známého genu avirulence-genu resistence na specifické onemocnění rostlin, Pto, který má domnělou doménu proteinové kinasy. Ze shora uvedené analýzy odvozené aminokyselinové sekvence plyne, Se RPS2 obsahuje několik rozdílných proteinových domén zachovaných v jiných proteinech jak z eukaryotů tak prokaryotů. Mezi tyto domény patří, ale bez omezení na ně, na leucin bohatá opakování (LRR) [Kobe a Deisenhofer: Nátuře 366, 751 (1994).], P-smyčka [Saraste a spol.: Trends in Biological Sciences TIBS 15, 430 (1990).], helix-smyčka-helix [Murre a spol.: Cell 56, 777 (1989).] a leucinový zip [Rodrigues a Park: Mol. Cell Biol. 13, 6711 (1993).]. Aminokyselinová sekvence Rps2 obsahuje LRR motif (LRR motif od aminokyselinového zbytku 505 k aminokyselinovému zbytku 867), který je přítomen v mnoha známých proteinech a o kterém se předpokládá, že obsahuje interakce protein-protein a může tedy umožnit interakci s jinými proteiny, které jsou zahrnuty v resistenci na onemocnění rostlin. N-Koncová část Rps2 polypeptidů LRR je například příbuzná s LRR kvasinkové (Saccharomyces cerevisiae) adenylátcyklasy CYR1. Oblast, o které se předpokládá, že znamená transmebránovou překlenovací doménu [Klein a spol.: Biochim. Biophys. Acta 815. 468 (1985).], je umístěna od aminokyselinového zbytku 350 k aminokyselinovému zbytku 365, na N-konci k LRR. O motifu ATP/GTP vazebného místa (P-smyčka) se předpokládá, že je umístěn mezi aminokyselinovým zbytkem 177 a aminokyselinovým zbytkem 194 včetně.

Ze shora uvedené analýzy odvozené aminokyselinové sekvence plyne, že Rps2 polypeptid může mít strukturu membrána-receptor, která sestává z N-koncové extracelulární oblasti a C-koncové cytoplasraové oblasti. Topologie Rps2 může být také opačná: N-koncová cytoplasmová oblast a C-koncová extracelulární oblast. LRR motify jsou v mnoha případech extracelulární a Rps2 LRR obsahuje pět potenciálních N-glykosylačních míst.

V následující části je popsána identifikace RPS2 funkčním doplněním. Doplnění rps2-201 homozygotů genomovou DNA odpovídající Arabidopsis thaliana funkčně potvrdilo, že genomová oblast kódující cDNA-4 nese RPS2 aktivitu. Byly zkonstruovány kosmidy, které obsahovaly překrývající se přilehlé sekvence přírodní Arabidopsis thaliana DNA z RPS2 oblasti obsažené v YCA EW11D4, EW9C3 a YUP11F1 na obr. 1 a obr. 4. Kosmidové vektory byly zkonstruovány z pSLJ541 (získaný od J. Jonese, Sainsbury Institute, Norwich, Anglie), který obsahuje sekvence, které umožňují, aby vložená sekvence byla integrována do rostlinného genomu Agrobacterium zprostředkovanou transformací (označení binární kosmid). H a E kosmidy (obrázek 1) byly použity pro identifikování klonů, které nesou DNA z Arabidopsis thaliana genomové RPS2 oblasti.

Více než 40 binárních kosmidů obsahujících vložené DNA RPS2 oblasti bylo použito pro transformování rps2-201 homozygotních mutantů Agrobacterium zprostředkovanou transformací [Chang a spol.: Abstracts of Fourth International Conference on Arabidopsis Research, str. 28, Vídeň, Rakousko, 1990.]. Transformanty, které zůstaly vnímavé (stanoveno způsoby zahrnujícími pozorovanou nepřítomnost HR po infekci P. syringae pv. phaseolicola kmen 3121 nesoucí avrRpt2 a Psp 3121 bez avrRpt2), ukazovaly, že vložená DNA neobsahuje funkční RPS2. Tyto kosmidy udělují Sus. nebo vnímavý fenotyp uvedený na obr. 4. Transformanty, které získaly avrRpt2 resistenci na specifické onemocnění (stanoveno způsoby zahrnujícími vykázání silné hypersensitivní odpovědi (HR), jestliže se naočkuje Psp 3121 s avrRpt2, ale nikoliv po naočkování Psp 3121 bez avrRpt2), uka31 zují na to, že vložená DNA obsahovala funkční RPS2 gen schopný udělit Res.” nebo resistentní fenotyp uvedený na obr. 4. Trans formanty získané použitím pD4 binárního kosmidu vykazovaly silný resistenční fenotyp, jak shora popsáno. Přítomnost vložené DNA v transformantech byla potvrzena klasickou genetickou analýzou (úzké genetické spojení fenotypu resistence na onemocnění a fenotypu resistence na kanamycin udělených kotransformovaným selektovatelným markérem) a Southernovou analýzou. Tyto výsledky naznačují, že RPS2 je kodován segmentem Arabidopsis thaliana genomové oblasti o 18 párech nukleotidů nesený na kosmidu pD4 (obr. 4).

Pro další lokalizaci místa RPS2 a potvrzení jeho schopnosti udělit fenotypovou resistenci rps2-201 homozygotním mutantům byla testována řada šesti binárních kosmidů obsahujících částečně se překrývající genomové DNA inserty. Překrývající se inserty pD2, pD4, pD14, pD15, pD27 a pD47 byly vybrány na základě umístění transkripce odpovídající pěti cDNA klonům v RPS2 oblasti (obr. 4). Tyto transformační pokusy využívaly postup vakuové infiltrace [Bechtold a spol.: C.R.Acad.Sci. Paris 316. 1194 (1993).] pro Agrobacterium zprostředkovanou transformaci. Agrobacterium-zprostředkované transformace s kosmidy pD2, pD14, pD15, pD39 a pD49 byly prováděny postupem kořenové transformace/regenerace [Valveekens a spol.: PNSA 85. 5536 (1988).]. Výsledky pokusů s inokulací pathogenů testováním na RPS2 aktivitu těchto transformantů jsou uvedeny na obrázku 4.

Další transformační pokusy využívaly binární kosmidy nesoucí úplnou kódovací oblast a genomovou sekvenci o více než 1000 páru nukleotidů proti směru vlákna pro pouze cDNA-4 nebo cDNA-6. Transformací s použitím vakuové infiltrace byly získány tři nezávislé transformanty, které nesly přírodní cDNA-6 genoraovou oblast v rps2-201c homozygotním pozadí (pAD431 na obrázku 4). Žádná z těchto rostlin nevykazovala resistenci na onemocnění závislou na avrRpt2. Homozygotní rps2-201c mutanty byly transformovány přírodní genomovou cDNA-4 (p4104 a p4115, každá nesoucí Col-0 genomové sekvence odpovídající celé cDNA-4 ote32 vřené čtecí fázi plus 5' sekvenci proti směru vlákna s přibližně 1700 páry nukleotidů a 3' sekvenci o 300 párech nukleotidů po směru vlákna stop kodonu). Tyto p4104 a 4115 transformanty vykazovaly fenotyp resistence na onemocnění, který je podobný přírodním RPS2 homozygotům, od nichž byly rps2 odvozeny. Další mutanty (rps2-101N a rps2-101C homozygoty) také vykazovaly resistenci závislou na avrRpt2, když byly transformovány cDNA-4 genomovou oblastí.

RPS2 sekvence umožňují detekci jiných genů resistence. DNA blotová analýza Arabidopsis thaliana genomové DNA používající RPS2 cDNA jako sondu ukázala, že Arabidopsis obsahuje několik DNA sekvencí, které hybridizují na RPS2 nebo jejich část, což přepokládá, že v Arabidopsis genomu existuje několik příbuzných genů.

Ze shora uvedeného popisu a sekvence nukleové kyseliny (sekv. id. č. 1) uvedené na obrázku 2 je možné isolovat další geny resistence na onemocnění rostlin, které mají 50% nebo větší identitu sekvence s genem RPS2. Detekce a isolace se mohou provádět s oligonukleotidovou sondou obsahující RPS2 gen nebo jeho část o větší délce než 18 nukleových kyselin. Sondy na sekvence kódující specifické strukturní vlastnosti polypeptidu Rps2 (sekv. id. č. 2 až 5) jsou výhodné, protože poskytují prostředky pro isolování genů resistence na onemocnění, které mají podobné strukturní domény. Hybridizace se může provádět standardními způsoby, jak jsou popsány Ausubelem a spol.: Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons (1989).

Například vysokoselektivni podmínky pro detekci genu RPS2 zahrnují hybridizací při 42 °C a 50% (hmotn.) formamidu. První promytí je při 65 °C, 2 x SSC a 1% (hmotn.) SDS, následuje druhé promytí při 65 °C a 0,1% (hmotn.) SSC. Nízkoselektivní podmínky detekce RPS genů s 50% identitou sekvence s genem RPS2 znamenají detegování například hybridizací při 42 °C v nepřítomnosti formamidu, první promytí při 42 °c 6 x SSC a 1% (hmotn.) SDS, druhé při 50 °C, 6 x SSC a 1% (hmotn.) SDS. Ve shora uvedeném příkladu se jako sonda použije DNA sonda s přibližně 350 nukleotidy kódující střední část LRR oblasti Rps2. Za nízkoselektivních podmínek bylo v Arabidopsis thaliana genomové DNA rozštěpené působením BamHI detegováno minimálně 5 DNA pásů jako sekvence, které mají dostatečnou identitu sekvence pro hybridizaci DNA kódující střední část LRR motifu Rps2. Podobné výsledky byly získány se sondou obsahující 300 nukleotidů z genu RPS2 kódující krajní N-část Rps2 mimo motif LRR.

Isolace jiných genů resistence na onemocnění se provádí způsoby PCR amplifikace dobře známými zručným odborníkům z oblasti techniky molekulární biologie použitím oligonukleotidových primerů určených pro amplifikován! pouze těch sekvencí, které jsou obklopeny oligonukleotidy v genech, které mají sekvenční identitu s RPS2. Primery jsou případně navrženy tak, aby umožnily klonování aplifikovaného produktu do vhodného vektoru.

V následující části spisu bude popsána RPS2 exprese v transgenních rostliných buňkách a rostlinách. Exprese genu RPS2 v rostlině vnímavé na pathogeny nesoucí avrRpt2 se dosáhne zavedením DNA sekvence obsahující gen RPS2 pro expresi polypeptidu Rps2 do rostliny. Veřejně jsou dostupné četné vektory, které jsou vhodné pro stabilní transfekci rostlinných buněk nebo pro získání transgenních rostlin. Takové vektory jsou popsány například v následujících publikacích: Pouwels a spol.: Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, dopl. 1987, Weissbach a Weissbach: Methods for Plant Molecular Biology, Academie Press, 1989, a Gelvin a spol.: Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academie Publishers, 1990. Rostlinné expresní vektory typicky obsahují 1) jeden nebo více klonovaných rostlinných genů pod transkripční kontrolou 5^# a 3' regulačních sekvencí a 2) dominantní selektovatělný markér. Tyto rostlinné expresní vektory mohou obsahovat také, jestliže je to žádoucí, promotorovou regulační oblast (např. regulační oblast kontrolující indukovatelnou nebo konstitutivní, okolím nebo vývojově regulovanou nebo buněčně- nebo tkáňově specifickou expresi), místo počátku iniciace transkripce, ribosomové vazebné místo, signál pro opracování RNA, místo ukončení transkripce a/nebo polyadenylační signál.

Příkladem užitečného rostlinného promotoru, který by mohl být použit pro expresi genu resistence rostlin podle tohoto vynálezu, je caulimovirus promotor, např. 35S promotor viru květákové mosaiky (CaMV). Tyto promotory způsobují vysoké hladiny exprese ve většině rostlinných tkání Aktivita těchto promotorů není závislá na virově kódovaných proteinech. CaMV je zdrojem jak 35S tak 19S promotorů. Ve většině tkání transgenních rostlin CaMV 35S promotor je silný promotor [viz např. Oděl a spol.: Nátuře 313. 810 (1985).]. CaMV promotor je vysoce aktivní také v jednoděložních rostlinách [viz např. Dekeyser a spol.: Plant Cell 2, 591 (1990), Terada a Shimamoto: Mol. Gen. Genet. 220, 389 (1990).].

Mezi další užitečné rostlinné promotory patří, bez omezení, nopalinový synthasový promotor [An a spol.: Plant Physiol. 88, 547 (1988).] a oktopinový synthasový promotor [Fromm a spol.: Plant Cell 1, 977 (1980).].

Pro některé aplikace může být žádoucí vyrobit v příslušné tkáni, v příslušném množství nebo v příslušné době vývoje RPS2 genový produkt nebo avrRpt2 genový produkt. Existují tedy rozmanité genové promotory, každý se svými vlastnostmi zahrnutými ve svých regulačních sekvencích, o nichž je ukázáno, že jsou regulovány jako odpověá na prostředí, hormony a/nebo vývojové podněty. Patří mezi ně genové promotory, které jsou odpovědné za 1) teplem regulovanou genovou expresi [viz např. Callis a spol.: Plant Physiol. 88, 965 (1988).], 2) světlem regulovanou genovou expresi [např. hrachový rbcS-3A popsaný Kuhlemeierem a spol.: Plant Cell i, 471 (1989), kukuřičný rbcS promotor popsaný Schaffnerem a Sheenem: Plant Cell 3, 997 (1991) nebo chlorofylový a/b-vázající proteinový gen nalezený v hrachu, popsaný Simpsonem a spol.: EMBO J. 4, 2723 (1985).], 3) hormonem regulovanou genovou expresi [např. sekvence vnímavé na kyselinu abscisovou z Em genu pšenice popsané Marcotem a spol.: Plant Cell 1, 969 (1989).], 4) poraněním indukovanou genovou expresi [např. wunl popsaný Siebertzem a spol.: Plant Cell 1, 961 (1989).] nebo 5) orgánově specifickou genovou expresi [např. gen specifického skladování proteinu v hlízách popsaný Roshalem a spol.: EMBO J. 6, 1155 (1987), zein gen o molekulové hmotnosti 23 000 z kukuřice popsaný Schernthanerem a spol.: EMBO J. 7, 1249 (1988) nebo β-phaseolin gen z fazolových lusků popsaný Bustosem a spol.: Plant Cell 1, 839 (1989).].

Rostlinné expresní vektory mohou popřípadě obsahovat signály pro opracování RNA, např. introny, které mohou být důležité pro efektivní syntézu a akumulaci RNA [Callis a spol.: Genes a Dev. 1, 1183 (1987).]. Umístění sekvencí štěpení RNA může ovlivňovat úroveň exprese transgenu v rostlinách. Z pohledu této skutečnosti může být intron umístěn po směru vlákna nebo proti směru vlákna sekvence kódující Rps2 polypeptid v transgenu tak, aby upravoval úroveň expresu genu.

Vedle shora uvedených 5' regulačních kontrolních sekvenci mohou expresní vektory zahrnovat také regulační kontrolní oblasti, které jsou obvykle přítomny v 3' oblastech rostlinných genů [Thornburg a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA £4, 744 (1987), An a spol.: Plant Cell 1, 115 (1980).]. V expresním vektoru může být zahrnuta například 3' terminační oblast, aby se zvýšila stabilita mRNA. Jedna taková terminační oblast může být odvozena od PI-II terminační oblasti rajského jablka. Jiné obvykle používané terminátory jsou odvozeny od oktopinových nebo nopalinových synthasových signálů.

Rostlinný expresní vektor také typicky obsahuje gen dominantního selektovatelného markéru použitý pro identifikování buněk, které byly transformovány. Mezi geny užitečných selektovatelných markérů rostlinných systémů patří geny kódující geny antibiotické resistence, například ty, které kódují resistenci na hygromycin, kanamycin, bleomycin, G418, streptomycin nebo spektinomycin. Jako selektovatelné markéry u fotosynteticky deficitních kmenů se mohou používat také geny, které jsou potřebné pro fotosyntézu. A konečně, jako selektovatelné markéry se mohou použít geny kódující herbicidní resistenci; užitečným genem je v tomto případě bar gen kódující enzym fosfinothricin-acety1transferasu, který způsobuje resistenci na širokospektrální herbicid Basta^<R) (Hoechst AG, Frankfurt, Německo).

Účinné použiti selektovatelných markérů je usnadněno stanovením vnímavosti rostlinné buňky na příslušné selektovatelné činidlo a stanovením koncentrace tohoto činidla, které efektivně zabíjí většinu, jestliže ne všechny transformované buňky. Mezi některé užitečné koncentrace antibiotik pro transformaci tabáku patří např. 75 až 100 Mg/ml (kanamycin), 20 až 50 Mg/ml (hygromycin) nebo 5 až 10 Mg/^ml (bleomycin). Užitečná strategie pro selekci transformantů na hebicidní resistenci je popsána např. v práci Vasil I.K.: Cell Culture and Somatic Cell Genetice of Plants, díl I., II., III., Laboratory Procedures and Their Applications, Academie Press, New York 1984.

Pro zručného odborníka v oblasti rostlinné molekulární biologie by mělo být zřejmé, že úroveň genové exprese je závislá nejen na kombinaci promotorů, signálech pro opracování RNA a terminačních prvcích, ale také na tom, jako jsou tyto prvky používány pro zvýšení úrovně genové exprese.

V další části je popsána transformace rostlin. U konstrukce rostlinnéhp expresního vektoru je známo několik standardních způsobů zavedení rekombinantního genetického materiálu do hostitelské rostliny pro generaci transgenní rostliny. Mezi tyto způsoby patří: 1) Agrobacterium zprostředkovaná transformace (A. tumefaciens nebo A. rhizogenes) (viz např. Lichtenstein a Fuller v Genetic Engineering, díl 6., P.W.J. Rigby (red.), Londýn, Academie Press, 1987, a Lichtenstein C.P. a Draper J. v DNA Cloning, díl II., D.M.Glover (red.), Oxford, IRI Press, 1985), 2) systém dodávání částic [viz např. Gordon-Kamm a spol.: Plant Cell 2, 603 (1990), nebo Bio Rad Technical Bulle37 tin 1687, viz shora.], 3) mikroinjekční postupy [viz např. Green a spol.: Plant Tissue and Cell Culture”, Academie Press, New York, 1987.], 4) polyethylenglykolové (PEG) postupy [viz např. Draper a spol.: Plant Cell Physiol. 23, 451 (1982) nebo např. Zhang a Wu: Theor. Appl. Genet. 76 _f 835 (1988).], 5) liposomem zprostředovaný příjem DNA [viz např. Freeman a spol.: Plant Cell Physiol. 25. 1353 (1984).], 6) elektroporační postupy [viz např. Gelvin a spol.: viz výše, Dekeyser a spol.: viz výše nebo From a spol.: Nátuře 319. 791 (1986).] a 7) způsob vířením [viz např. Kindle K.: Proč. Nati. Acad. Sci., USA £7, 1228 (1990).].

Následuje příklad ukazující Agrobacterium zprostředkovanou transformaci rostlin. Obecný postup manipulování s geny při přenosu do genomu rostlinných buněk se provádí ve dvou fázích. Nejdříve se provedou všechny klonovací a DNA modifikující stupně v E. coli a plasmid obsahující genovou konstrukci, o kterou se jedná, se přenese konjugací do Agrobacterium. Za druhé, výsledný Agrobacterium kmen se použije pro transformování rostlinných buněk. Pro zobecněný rostlinný expresní vektor tedy plasmid obsahuje počátek replikace, který umožňuje jeho replikaci v Agrobacterium a vysoký počet počátků replikace funkční v E. coli. To umožňuje snadnou výrobu a testování transgenů v E. coli před přenosem na Agrobacterium pro následné zavedení do rostlin. Na vektoru mohou být neseny geny resistence, jeden pro selekci v bakterii, např. streptoraycin, a druhý, který bude exprimovat v rostlinách, např. gen kódující resistenci na kanamycin nebo gen resistence na herbicid. Přítomna jsou také místa restrikčních endonukleas pro přidání jednoho nebo více transgenů odštěpitelně napojených na příslušné regulační sekvence a přímé T-DNA hraniční sekvence, které, když jsou rozpoznány přenosem funkcí Agrobacterium, vymezují oblast, která bude přenesena do rostliny.

V jiném příkladu mohou být rostlinné buňky transformovány vstřelováním wolframových mikroprojektilů, na nichž je klonovaná DNA vysrážena, do buňky. V přístroji Biolistic Apparatus (Bio-Rad, Hercules, Ka., USA) použitém pro střílení je plastický makroprojektil hnán hlavní zbraně náplní prachu (22 caliber Power Piston Tool Charge) nebo vzduchem. Část suspenze wolframových částic, na které byla umístěna DNA, se umístí na přední část plastického makroprojektilu. Potom se odpálí na akrylovou zastavovací desku, která má v sobě otvor, který je pro makroprojektil příliš malý na to, aby jím prošel. Výsledkem je, že plastický makroprojektil se na desce rozbije a wolframové mikroprojektily pokračují na svůj cíl otvorem v desce. Pro předložený vynález může být cílem jakákoliv rostlinná buňka, tkáň, semeno nebo embryo. DNA zavedená do buňky na mikroprojektilech se integruje do jádra nebo chloroplastu.

Přenos do rostlinných buněk a exprese transgenů v těchto buňkách je nyní běžnou praxí pro zručné odborníky v oblasti techniky. Je hlavním nástrojem pro provádění studií genové exprese a pokusů pro získání zlepšených rostlinných variant zemědělského nebo komerčního zájmu.

Na závěr tohoto popisu bude popsáno získávání transgenní rostliny. Rostlinné buňky transformované rostlinným expresním vektorem se mohou získávat např. z jediné buňky, tkáňového kalusu nebo disků listu podle stadardních způsobů z oblasti rostlinných tkáňových kultur. Odborníkům z oblasti techniky je velmi dobře známo, že různé buňky, tkáně a orgány téměř jakékoliv rostliny mohou být úspěšně kultivovány tak, aby se regenerovala celá rostlina. Takové způsoby jsou popsány například Vasilem: viz výše, Greenem a spol.: viz výše, Weissbachem a a Weissbachem: viz výše a Gelvinem a spol.: viz výše.

V jednom možném příkladu se vektor nesoucí gen selektovatelného markéru (např. resistenci na kanamycin), klonovaný RPS2 gen pod kontrolou jeho vlastního promotoru a terminátor nebo, jestliže je to žádoucí, pod kontrolou exogenních regulačních sekvencí, jako je 35S CaMV promotor a nopalinový synthasový terminátor, transformují do Agrobacterium. Transformace tkáně listu vektorem obsahujícím Agrobacterium se provádí jak popsáno

Horschem a spol. [Science 227. 1229 (1985).]. Dočasné transformanty se vyberou po několika týdnech (např. 3 až 5 týdnech) na kultivačním mediu tkáňové kultury obsahujícím kanamycin (např. 100 /xg/ml). Na kanamycin resistentní výhonky se pak umístí do media rostlinné tkáňové kultury bez hormonů pro iniciaci kořenů. Na kanamycin resistentní rostliny se pak vyberou pro pěstování ve skleníku. Jestliže je to žádoucí, semena ze samooplodněných transgenních rostlin se mohou vysít do media bez země a pěstují se ve skleníku. Progeny resistentní na kanamycin se pak vyberou setím povrchově sterilovaných semen na medium obsahující kanamycin a neobsahující hormon. Analýza, kterou se zjišťuje integrace transgenu, se provádí standardními způsoby (viz např. Ausubel a spol.: viz výše a Gelvin a spol.: viz výše).

Transgenní rostliny exprimující selektovatelný markér se pak analyzují na přenos transgenové DNA standardním imunoblotováním a způsoby detekce DNA a RNA. Každá positivní transgenní rostlina a její transgenový progen jsoue jedinečné při srovnání s jinými transgenními rostlinami získanými se stejným transgenem. Integrace transgenové DNA do rostlinné genomové DNA je ve většině případů náhodná a misto integrace může zásadně ovlivnit úroveň a tkáňovou a vývojovou sestavu exprese transgenu. Četné transgenové linie se obvykle analyzuji na každý transgen, aby se identifikovaly a vybraly rostliny s nejvhodnějšími profily exprese.

Transgenní linie se vyhodnocují na úroveň exprese transgenu. Při expresi na RNA úrovni se nejdříve identifikují a kvantifikují rostliny positivní na expresi. Používají se standardní způsoby analýzy RNA. Patří sem analýzy PCR amplifikací použitím oligonukleotidových primerů navržených pro amplifikování pouze templátů transgenové RNA a analýzy hybridizaci roztoku s použitím sond specifických pro transgen (viz např. Ausubel a spol.: viz shora). RNA positivní rostliny se pak analyzují na expresi proteinu Westernovou imunoblotovou analýzou s použitím protilátek specifických pro Rps2 polypeptid (viz např. Ausubel a spol.: viz shora). Hybridizace in šitu a imunocytochemie podle standardních postupů se mohou povádět pomocí nukleotidových sond a protilátek specifických pro transgen, aby se lokalizovala místa exprese v transgenové tkáni.

Jakmile je jednou Rps2 polypeptid exprimován v jakékoliv buňce nebo v transgenní rostlině (např. jak shora popsáno), může být isolován jakýmkoliv standardním způsobem, např. afinitní chromatografii. V jednom příkladu se anti-Rps2 protilátka (např. vyrobená podle toho, jak popisuje Ausubel a spol.: viz výše, nebo jakýmkoliv jiným standardním způsobem) může dát na kolonu a použít k isolaci polypeptidu. Lyse a frakcionace Rps2 produkujících buněk před afinitní chromatografii se mohou provádět standardními způsoby (viz např. Ausubel a spol.: viz výše). Jakmile je jednou isolován, může se rekombinantní polypeptid, jestliže je to žádoucí, dále vyčistit, např. vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (viz např. Fisher: Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, Work a Burdon (red.), Elsevier, 1980.).

Tyto obecné způsoby exprese a čištění polypeptidů se mohou používat také k výrobě a isolaci užitečných Rps2 fragmentů nebo analogů.

Zavedení RPS2 do transformované rostlinné buňky poskytuje resistenci na bakteriální pathogeny nesoucí avrRpt2 gen avirulence. Například transgenní rostliny podle předloženého vynálezu exprimující RPS2 se mohou použít pro změnu, jednoduchou a nedrahou, resistence na onemocnění rostlin, které jsou normálně vnímavé na rostlinné pathogeny nesoucí gen avirulence avrRpt2.

Tento vynález poskytuje také širokospektrální resistenci na pathogen napodobující přírodní mechanismus resistence hostitele. Nejdříve se transgen RPS2 exprimuje v rostlinných buňkách v dostatečně vysoké míře na to, aby se iniciovala rostlinná obranná odpověá v podstatě v nepřítomnosti signálů od pathogenu. Úroveň exprese související s iniciací rostlinné obranné odpovědi se stanoví změřením úrovní obranné odpovědi genové exprese, jak popsal Dong a spol.: viz výše. Za druhé, transgen RPS2 se exprimuje kontrolovatelným promotorem, jako je tkáňově specifický promotor, buněčně specifický promotor nebo promotor, který je indukován vnějším signálem nebo činidlem limitujícím dočasnou a tkáňovou expresi obranné odpovědi. A konečně, RPS2 genový produkt se koexprimuje s produktem avrRpt2 genu. RPS2 gen se exprimuje jeho přirozeným promotorem, dočasně exprimovaným promotorem, jako je CaMV 35S promotor, tkáňově specifickým nebo buněčně specifickým promotorem nebo promotorem, který je aktivován vnějším signálem nebo činidlem. Ko-exprese RPS2 a avrRpt2 napodobuje produkci genových produktů souvisejících s iniciací rostlinné obranné odpovědi a poskytuje resistenci vůči pathogenům v nepřítomnosti specifických odpovídajících párů gen resistence-gen avirulence v hostitelské rostlině a pathogenu.

Tento vynález poskytuje také expresi nukleové kyseliny, která má sekvenci identifikační číslo 1 na obrázku 2, nebo expresi její degenerované varianty kódující aminokyselinovou sekvenci id. č. 2 až 5 otevřené čtecí fáze a na obrázku 2 v rostlinných buňkách.

Vynález dále poskytuje isolaci sekvencí nukleových kyselin s 50% nebo větší identitou sekvence se sekvencí RPS2 použitím RPS2 sekvence, sekvence identifikační číslo 1 na obr. 2, nebo její části o délce větší než 18 nukleových kyselin jako sondy. Pro isolaci DNA sekvencí s 50% nebo větší identitou sekvence se sekvencí RPS2, sekvencí identifikační číslo 1 z obr. 2, se použije příslušná snížená hybridizce za vysokoselektivních podmínek.

Tento vynález poskytuje resistenci na onemocnění rostlin, zvláště rostlin plodin, zvláště pak důležitých plodin, jako je rajské jablko, pepř, kukuřice, pšenice, rýže a luštěniny, jako je sojový bob a fazole, nebo jakékoliv rostliny, která je vnímavá na pathogeny nesoucí gen avirulence, např. gen avirulence avrRpt2. Mezi tyto pathogeny patří, ale bez omezení na ně, kmeny Pseudomonas syringae.

Tento vynález zahrnuje také jakýkoliv biologicky aktivní fragment nebo analog Rps2 polypeptidů. Pojem biologicky aktivní znamená, že má jakoukoliv in vivo aktivitu, která je charakteristická pro Rps2 polypeptid sekvence identifikační číslo 2 až 5 na obrázku 2. Užitečný Rps2 fragment nebo Rps2 analog je jedním, který vykazuje biologickou aktivitu v jakémkoliv biologickém testu aktivity genu resistence na onemocnění, např. testech popsaných Dongem a spol.: viz výše (1991), Yuem a spol.: viz výše (1993), Kunkelem a spol.: viz výše (1993) a Whalenem a spol. (1991). Zvláště pak biologicky aktivní Rps2 polypeptidový fragment nebo analog je schopný poskytovat podstatnou resistenci na rostlinné pathogeny nesoucí avrRpt2 gen avirulence. Podstatnou resistenci se rozumí alespoň částečné snížení vnímavosti na rostlinné pathogeny nesoucí gen avrRpt2.

Mezi výhodné analogy patří Rps2 polypeptidy (nebo jejich biologicky aktivní fragmenty), jejichž sekvence se liší od přírodní sekvence pouze konservativními substitucemi aminokyselin, například substitucí jedné aminokyseliny jinou aminokyselinou s podobnými vlastnostmi (např. valin za glycin, arginin za lysin atd.) nebo jednou nebo více nekonservativními substitucemi, delecemi nebo insercemi aminokyselin, které neodstraňují polypeptidovou biologickou aktivitu.

Analogy se mohou lišit od přirozeně se vyskytujícího Rps2 polypeptidů v sekvenci aminokyselin nebo mohou být modifikovány způsoby, které nezahrnují sekvenci, nebo obojím. Analogy podle vynálezu mají obvykle alespoň 70%, s výhodou 80%, výhodněji 90% a nejvýhodněji 95% nebo dokonce 99% homologii se segmentem 20 aminokyselinových zbytků, s výhodou 40 aminokyselinových zbytků nebo výhodněji s celou sekvencí přirozeně se vyskytujícího Rps2 polypeptidů (sekvence identifikační číslo 2 až 5).

Mezi změny v primární sekvenci patří genetické varianty, jak přirozené tak indukované. Patří sem také analogy, které zahrnují zbytky jiných než přirozeně se vyskytujících L-aminokyselin, např. D-aminokyselin nebo nepřirozeně se vyskytujících nebo syntetických aminokyselin, např. B- nebo γ-aminokyselin. Tento vynález zahrnuje také Rps2 polypeptidy modifikované in vivo chemickou derivatizací polypeptidů, včetně acetylace, methylace, fosforylace, karboxylace nebo glykosylace.

Vedle peptidů s v podstatě plnou délkou zahrnuje tento vynález také biologicky aktivní fragmenty těchto polypeptidů. Pojem fragment tak, jak je zde používán, znamená polypeptid, který má obvykle délku alespoň 20 zbytků, typičtěji alespoň 40 zbytků, s výhodou alespoň 60 zbytků. Fragmenty Rps2 polypeptidů se mohou získávat způsoby známými zručným odborníkům z oblasti techniky. Schopnost příslušného fragmentu vykazovat biologickou aktivitu Rps2 lze stanovit zde popsanými způsoby. Tento vynález zahrnuje také Rps2 polypeptidy obsahující zbytky, které nejsou potřebné pro biologickou aktivitu tohoto peptidů, např. takové, které jsou přidány alternativním střihem mRNA nebo alternativním opracováním proteinu.

Do rozsahu následujících patentových nároků patří i další provedení.

Claims (26)

1. V podstatě čistá DNA kódující Rps polypeptid.

   jaídinisvia 0H 3Λ 0 3 ΛίΛ! jd d avya

   9 6 .IX 8 0

   Ol^Oa

   1 5 b I 8 ΐ aen

   DNA podle nároku 1, při čemž tato DNA obsahuje RPÉ
2. 2“ gen sekvence identifikační číslo 1 (o

   AAGTAAAAGA AAGAGCGAGA AATCATCGAA ATGGATTTCA TCTCATCTCT 50 TATCGTTGGC TGTGCTCAGG TGTTGTGTGA ATCTATGAAT ATGGCGGAGA 100 GAAGAGGACA TAAGACTGAT CTTAGACAAG CCATCACTGA TCTTGAAACA 150 GCCATCGGTG ACTTGAAGGC CATACGTGAT GACCTGACTT TACGGATCCA 200 ACAAGACGGT CTAGAGGGAC GAAGCTGCTC AAATCGTGCC AGAGAGTGGC 250 TTAGTGCGGT GCAAGTAACG GAGACTAAAA CAGCCCTACT TTTAGTGAGG 300 TTTAGGCGTC GGGAACAGAG GACGCGAATG AGGAGGAGAT ACCTCAGTTG 350 TTTCGGTTGT GCCGACTACA AACTGTGCAA GAAGGTTTCT GCCATATTGA 400 AGAGCATTGG TGAGCTGAGA GAACGCTCTG AAGCTATCAA AACAGATGGC 450 GGGTCAATTC AAGTAACTTG TAGAGAGATA CCCATCAAGT CCGTTGTCGG 500 AAATACCACG ATGATGGAAC AGGTTTTGGA ATTTCTCAGT GAAGAAGAAG 550 AAAGAGGAAT CATTGGTGTT TATGGACCTG GTGGGGTTGG GAAGACAACG 600 TTAATGCAGA GCATTAACAA CGAGCTGATC ACAAAAGGAC ATCAGTATGA 650 TGTACTGATT TGGGTTCAAA TGTCCAGAGA ATTCGGCGAG TGTACAATTC 700 AGCAAGCCGT TGGAGCACGG TTGGGTTTAT CTTGGGACGA GAAGGAGACC 750 GGCGAAAACA GAGCTTTGAA GATATACAGA GCTTTGAGAC AGAAACGTTT 800 CTTGTTGTTG CTAGATGATG TCTGGGAAGA GATAGACTTG GAGAAAACTG 850 GAGTTCCTCG ACCTGACAGG GAAAACAAAT GCAAGGTGAT GTTCACGACA 900 CGGTCTATAG CATTATGCAA CAATATGGGT GCGGAATACA AGTTGAGAGT 950 GGAGTTTCTG GAGAAGAAAC ACGCGTGGGA GCTGTTCTGT AGTAAGGTAT 1000 GGAGAAAAGA TCTTTTAGAG TCATCATCAA TTCGCCGGCT CGCGGAGATT 1050 ATAGTGAGTA AATGTGGAGG ATTGCCACTA GCGTTGATCA CTTTAGGAGG 1100 AGCCATGGCT CATAGAGAGA CAGAAGAAGA GTGGATCCAT GCTAGTGAAG 1150 TTCTGACTAG ATTTCCAGCA GAGATGAAGG GTATGAACTA TGTATTTGCC 1200 CTTTTGAAAT TCAGCTACGA CAACCTCGAG AGTGATCTGC TTCGGTCTTG 1250 TTTCTTGTAC TGCGCTTTAT TCCCAGAAGA ACATTCTATA GAGATCGAGC 1300 AGCTTGTTGA GTACTGGGTC GGCGAAGGGT TTCTCACCAG CTCCCATGGC 1350 GTTAACACCA TTTACAAGGG ATATTTTCTC ATTGGGGATC TGAAAGCGGC 1400 ATGTTTGTTG GAAACCGGAG ATGAGAAAAC ACAGGTGAAG ATGCATAATG 1450 TGGTCAGAAG CTTTGCATTG TGGATGGCAT CTGAACAGGG GACTTATAAG 1500

   GAGCTGATCC TAGTTGAGCC TAGCATGGGA CATACTGAAG CTCCTAAAGC 1550 AGAAAACTGG CGACAAGCGT TGGTGATCTC ATTGTTAGAT AACAGAATCC 1600 AGACCTTGCC TGAAAAACTC ATATGCCCGA AACTGACAAC ACTGATGCTC 1650 CAACAGAACA GCTCTTTGAA GAAGATTCCA ACAGGGTTTT TCATGCATAT 1700 GCCTGTTCTC AGAGTCTTGG ACTTGTCGTT CACAAGTATC ACTGAGATTC 1750 CGTTGTCTAT CAAGTATTTG GTGGAGTTGT ATCATCTGTC TATGTCAGGA 1800 ACAAAGATAA GTGTATTGCC ACAGGAGCTT GGGAATCTTA GAAAACTGAA 1850 GCATCTGGAC CTACAAAGAA CTCAGTTTCT TCAGACGATC CCACGAGATG 1900 CCATATGTTG GCTGAGCAAG CTCGAGGTTC TGAACTTGTA CTACAGTTAC 1950 GCCGGTTGGG AACTGCAGAG CTTTGGAGAA GATGAAGCAG AAGAACTCGG 2000 ATTCGCTGAC TTGGAATACT TGGAAAACCT AACCACACTC GGTATCACTG 2050 TTCTCTCATT GGAGACCCTA AAAACTCTCT TCGAGTTCGG TGCTTTGCAT 2100 AAACATATAC AGCATCTCCA CGTTGAAGAG TGCAATGAAC TCCTCTACTT 2150 CAATCTCCCA TCACTCACTA ACCATGGCAG GAACCTGAGA AGACTTAGCA 2200 TTAAAAGTTG CCATGACTTG GAGTACCTGG TCACACCCGC AGATTTTGAA 2250 AATGATTGGC TTCCGAGTCT AGAGGTTCTG ACGTTACACA GCCTTCACAA 2300 CTTAACCAGA GTGTGGGGAA ATTCTGTAAG CCAAGATTGT CTGCGGAATA 2350 TCCGTTGCAT AAACATTTCA CACTGCAACA AGCTGAAGAA TGTCTCATGG 2400 GTTCAGAAAC TCCCAAAGCT AGAGGTGATT GAACTGTTCG ACTGCAGAGA 2450 GATAGAGGAA TTGATAAGCG AACACGAGAG TCCATCCGTC GAAGATCCAA 2500 CATTGTTCCC AAGCCTGAAG ACCTTGAGAA CTAGGGATCT GCCAGAACTA 2550 AACAGCATCC TCCCATCTCG ATTTTCATTC CAAAAAGTTG AAACATTAGT 2600 CATCACAAAT TGCCCCAGAG TTAAGAAACT GCCGTTTCAG GAGAGGAGGA 2650 CCCAGATGAA CTTGCCAACA GTTTATTGTG AGGAGAAATG GTGGAAAGCA 2700 CTGGAAAAAG ATCAACCAAA CGAAGAGCTT TGTTATTTAC CGCGCTTTGT 2750 TCCAAATTGA TATAAGAGCT AAGAGCACTC TGTACAAATA TGTCCATTCA 2800 TAAGTAGCAG GAAGCCAGGA AGGTTGTTCC AGTGAAGTCA TCAACTTTCC 2850 ACATAGCCAC AAAACTAGAG ATTATGTAAT CATAAAAACC AAACTATCCG 2900 CGA 2903 (sekv. id. č • i)·
3. 3. DNA podle nároku 1, při čemž tato DNA znamená genomovou DNA.
4. 4. DNA podle nároku 1, při čemž tato DNA znamená cDNA.
5. 5. DNA podle nároku 1, při čemž tato DNA pochází z rostliny rodu Arabidopsis.
6. 6. V podstatě čistá DNA se sekvencí identifikační číslo 1 podle nároku 2 z obrázku 2 nebo její degenerované varianty kódující sekvence aminokyselin identifikační číslo 2 až

   5 otevřené čtecí fáze a Lys 1 Lys Glu Arg Glu Ile 5 Ile Glu Met Asp 10 Phe Ile Ser Ser Leu 15 Ile Val Gly Cys Ala Gin Val 20 Leu Cys Glu 25 Ser Met Asn Met Ala 30 Glu Arg Arg Gly His Lys Thr Asp 35 Leu Arg 40 Gin Ala Ile Thr Asp 45 Leu Arg Ile Gin Gin 50 Asp Gly Leu Glu Gly Arg 55 Ser Cys Ser Asn 60 Arg Ala Arg Glu Trp 65 Leu Ser Ala Val Gin 70 Val Thr Glu Thr Lys 75 Thr Ala Leu Leu Leu 80 Val Arg Phe Arg Arg Arg 85 Glu Gin Arg Thr 90 Arg Met Arg Arg Arg 95 Tyr Leu Ser Cys Phe Gly Cys 100 Ala Asp Tyr 105 Lys Leu Cys Lys Lys 110 Val Ser Ala Ile Leu Lys Ser Ile 115 Gly Glu 120 Leu Arg Glu Arg Ser 125 Glu Ala Ile Lys Thr 130 Asp Gly Gly Ser Ile 135 Gin Val Thr Cys Arg 140 Glu Ile Pro Ile Lys 145 Ser Val Val Gly Asn 150 Thr Thr Met Met Glu 155 Gin Val Leu Glu Phe 160

   Leu Ser Glu Glu Glu Glu Arg Gly Ile Ile Gly Val Tyr Gly Pro Gly 165 170 175

   Gly Val Gly Lys Thr Thr Leu Met Gin Ser Ile Asn Asn Glu Leu Ile 180 185 190

   Thr Lys Gly His Gin Tyr Asp Val Leu Ile Trp Val Gin Met Ser Arg 195 200 205

   Glu Phe Gly Glu Cys Thr Ile Gin Gin Ala Val Gly Ala Arg Leu Gly 210 215 220

   Leu Ser Trp Asp Glu Lys Glu Thr Gly Glu Asn Arg Ala Leu Lys Ile

   225 230 235 240

   Tyr Arg Ala Leu Arg Gin Lys Arg Phe Leu Leu Leu Leu Asp Asp Val

   245 250 255

   Trp Glu Glu Ile Asp Leu Glu Lys Thr Gly Val Pro Arg Pro Asp Arg 260 265 270

   Glu Asn Lys Cys Lys Val Met Phe Thr Thr Arg Ser Ile Ala Leu Cys 275 280 285

   Asn Asn Met Gly Ala Glu Tyr Lys Leu Arg Val Glu Phe Leu Glu Lys 290 295 300

   Lys His Ala Trp Glu Leu Phe Cys Ser Lys Val Trp Arg Lys Asp Leu

   305 310 315 320

   Leu Glu Ser Ser Ser Ile Arg Arg Leu Ala Glu Ile Ile Val Ser Lys

   325 330 335

   Cys Gly Gly Leu Pro Leu Ala Leu Ile Thr Leu Gly Gly Ala Met Ala 340 345 350

   His Arg Glu Thr Glu Glu Glu Trp Ile His Ala Ser Glu Val Leu Thr 355 360 365 Arg Phe 370 Pro Ala Glu Met Lys Gly Met Asn Tyr 375 Val Phe Ala Leu Leu 380 Lys Phe 385 Ser Tyr Asp Asn Leu Glu Ser Asp Leu 390 395 Leu Arg Ser Cys Phe 400 Leu Tyr Cys Ala Leu Phe Pro Glu Glu His Ser 405 410 Ile Glu Ile Glu Gin 415 Leu Val Glu Tyr Trp Val Gly Glu Gly Phe Leu 420 425 Thr Ser Ser His Gly 430 Val Asn Thr 435 Ile Tyr Lys Gly Tyr Phe Leu Ile 440 Gly Asp Leu Lys Ala 445 Ala Cys 450 Leu Leu Glu Thr Gly Asp Glu Lys Thr 455 Gin Val Lys Met His 460 Asn Val 465 Val Arg Ser Phe Ala Leu Trp Met Ala 470 475 Ser Glu Gin Gly Thr 480 Tyr Lys Glu Leu Ile Leu Val Glu Pro Ser Met 485 490 Gly His Thr Glu Ala 495 Pro Lys Ala Glu Asn Trp Arg Gin Ala Leu Val 500 505 Ile Ser Leu Leu Asp 510 Asn Arg Ile 515 Gin Thr Leu Pro Glu Lys Leu Ile 520 Cys Pro Lys Leu Thr 525 Thr Leu 530 Met Leu Gin Gin Asn Ser Ser Leu Lys 535 Lys Ile Pro Thr Gly 540

   Phe Phe Met His Met Pro Val Leu Arg Val Leu Asp Leu Ser Phe Thr

   545 550 555 560

   Ser Ile Thr Glu Ile Pro Leu Ser Ile Lys Tyr Leu Val Glu Leu Tyr

   565 570 575

   His Leu Ser Met Ser Gly Thr Lys Ile Ser Val Leu Pro Gin Glu Leu 580 585 590

   Gly Asn Leu Arg Lys Leu Lys His Leu Asp Leu Gin Arg Thr Gin Phe 595 600 605

   Leu Gin Thr Ile Pro Arg Asp Ala Ile Cys Trp Leu Ser Lys Leu Glu 610 615 620

   Val Leu Asn Leu Tyr Tyr Ser Tyr Ala Gly Trp Glu Leu Gin Ser Phe

   625 630 635 640

   Gly Glu Asp Glu Ala Glu Glu Leu Gly Phe Ala Asp Leu Glu Tyr Leu

   645 650 655

   Glu Asn Leu Thr Thr Leu Gly Ile Thr Val Leu Ser Leu Glu Thr Leu 660 665 670

   Lys Thr Leu Phe Glu Phe Gly Ala Leu His Lys His Ile Gin His Leu 675 680 685

   His Val Glu Glu Cys Asn Glu Leu Leu Tyr Phe Asn Leu Pro Ser Leu 690 695 700

   Thr Asn His Gly Arg Asn Leu Arg Arg Leu Ser Ile Lys Ser Cys His 705 710 715 720

   Asp Leu Glu Tyr Leu Val Thr Pro Ala Asp Phe Glu Asn Asp Trp Leu 725 730 735

   Pro Ser Leu Glu 740 Val Leu Thr Leu His Ser Leu His Asn Leu Arg Cys 745 750 Ile Asn Ile Ser His Cys Asn Lys Leu Lys Asn Val Ser Trp Val Gin 755 760 765 Lys Leu Pro Lys Leu Glu Val Ile Glu Leu Phe Asp Cys Arg Glu Ile 770 775 780 Glu GlU Leu Ile Ser Glu His Glu Ser Pro Ser Val Glu Asp Pro Thr 785 790 795 800 Leu Phe Pro Ser Leu Lys Thr Leu Arg Thr Arg Asp Leu Pro Glu Leu 805 810 815 Asn Ser Ile Leu Pro Ser Arg Phe Ser Phe Gin Lys Val Glu Thr Leu 820 825 830 Val Ile Thr Asn Cys Pro Arg Val Lys Lys Leu Pro Phe Gin Glu Arg 835 840 845 Arg Thr Gin Met Asn Leu Pro Thr Val Tyr Cys Glu Glu Lys Trp Trp 850 855 860 Lys Ala Leu Glu Lys Asp Gin Pro Asn Glu Glu Leu Cys Tyr Leu Pro 865 870 875 880 Arg Phe Val Pro • Asn

   885

   (sekv. id. č. 2), Glu His Ser Val Gin Ile Cys Pro Phe Ile Ser Ser Arg Lys Pro 1 5 10 15 Gly Arg Leu Phe Gin 20 (sekv. id. č. 3),

   Ser His Gin Leu Ser Thr

   1 5 (sekv. id. č. 4) a

   Arg Leu Cys Asn His Lys Asn Gin Thr Ile Arg 1 5 1O (sekv. i d. č. 51 .
7. 7. V podstatě čistá DNA, resistentní na onemocnění rostlin, která má 50% nebo větší identitu sekvence s DNA sekvencí identifikační číslo 1 podle nároku 2.
8. 8. DNA podle nároku 1 nebo 2, při čemž tato DNA je odštěpí tělně napojena na regulační sekvence exprese polypeptidu a tyto regulační sekvence obsahují promotor.
9. 9. DNA podle nároku 8, při čemž promotor znamená konstitutivní promotor.
10. 10. DNA podle nároku 8, při čemž promotor je indukovatelný jedním nebo více vnějšími činidly.
11. 11. DNA podle nároku 8, při čemž promotor znamená buněčně spéci f i cký promotor.
12. 12. Způsob výroby transgenní rostliny, vyznačuj í císet ím, že se do genomu této rostliny integruje DNA podle nároku 1, přičemž se DNA v této transgenní rostlině exprimuje.
13. 13. Způsob výroby transgenní rostliny, vyznačuj i c í set ím, že se do genomu této rostliny integruje DNA podle nároku 8, přičemž se DNA v této transgenní rostlině exprimuje.
14. 14. Způsob výroby transgenní rošt1 i ny vyznačuj ícísetím, ěe se generuje z rostlinné buňky obsahující DNA podle nároku 1 a dále obsahující gen avrRpt2 odštěpí telně napojený na regulační sekvence, přičerně regulační sekvence obsahuj í promotor, a DNA a gen avrRpt2 se v této transgenní rostlině exprimují.
15. 15. Způsob dosažen í res i stence na rošt1 i nný pathogen v roštlíně, vyznačující se tím, ěe zahrnuje:

    získání buňky transgenní rostliny obsahující DNA podle nároku 1 integrovanou do genomu této buňky transgenní rostliny a umístěnou pro expresi v této rostlinné buňce a

    pěstování transgenní rostliny z rostlinné buňky, při čemž DNA je v transgenní rostlině exprimována.
16. 16. Způsob detegování genu resistence v rostlinné buňce, vyznačující se tím, ěe zahrnuje uvedení

    DNA podle nároku 1 nebo její části o délce větší než 18 nukleových kyselin do kontaktu s přípravkem genomové DNA z rostlinné buňky za hybridizačních podmínek poskytujících detekci DNA sekvencí o 50% nebo větší identitě sekvence se sekvencí identifikační číslo 1 podle nároku 2.
17. 17. Způsob výroby polypeptidu Rps2, vyznačuj ící se t i m, ěe zahrnuje:

    získání buňky transformované DNA kódující polypeptid Rps2 umístěný pro expresi v této buňce, kultivování této transformované buňky za podmínek, při nichž exprimuje DNA, a

    isolování polypeptidu Rps2.
18. 18. Způsob dosažení resistence na rostlinný pathogen v transgenní rostl i ně, vyznačující se tím, ěe zahrnuje:

    získání transgenní rostlinné buňky obsahující DNA po53 dle nároku 8 integrovanou do genomu Léto buňky transgenní rostliny a umístěnou pro expresi v této buňce a vypěstování transgenní rostliny z rostlinné buňky, při čemž DNA je v transgenní rostlině exprimována.
19. 19.Způsob dosažení resistence na rostlinný pathogen v transgenní rostl i ně, vy z n a č u jícís etím, že zahrnuje způsob výroby transgenní rostliny podle nároku 14.
20. 20. Způsob isolování genu resistence na onemocněni rostlin nebo jeho části se sekvencí identickou s RPS2, sekvencí identifikační číslo 1 podle nároku 2, vyznačuj í cí se tím, že zahrnuj e:

    PCR amplifikaci genu resistence na onemocnění nebo jeho části použitím oligonukleotidových primerů, při čemž tyto primery

    a) mají každý větší délku než 13 nukleotidů,

    b) mají každý oblasti doplňkové k opačným DNA vláknům v oblasti sekvence nukleotidů identifikační číslo 1 podle nároku 2, a

    c) popřípadě obsahují sekvence schopné poskytovat místa štěpení restrikčními enzymy v amplifikovaném produktu, a isolování genu resistence na onemocnění nebo jeho část i.
21. 21. V podstatě čistý polypeptid Rps2.
22. 22. Polypeptid podle nároku 17, který obsahuje sekvenci aminokyselin, která je v podstatě identická se sekvencí aminokyselin identifikační čislo 2 až 5 podle nároku 6.
23. 23. Vektor, který obsahuje DNA podle nároku 1 a který je schopen řídit expresi peptidů kódovaného DNA v buňce obsahující vektor.
24. 24.Vektor, který obsahuje DNA genu avrRpt2 sekvence identifikační číslo 105

    ATCGATTGAT CTCTGGCTCA GTGCGAGTAG TCCATTTGAG AGCAGTCGTA 50 GCCCCGCGTG GCGCATCATG GAGCTATTTG GAATTTTCGC AGGGTTATCG 100 ATTCGTAGTG GGAACCCATT CATTGTTTGG AACCACCAAC GGACGACTTA 150 ACAAGCTCCC CGAGGTGCAT GATGAAAATT GCTCCAGTTG CCATAAATCA 200 CAGCCCGCTC AGCAGGGAGG TCCCGTCACA CGCGGCACCC ACTCAGGCAA 250 AGCAAACCAA CCTTCAATCT GAAGCTGGCG ATTTAGATGC AAGAAAAAGT 300 AGCGCTTCAA GCCCGGAAAC CCGCGCATTA CTCGCTACTA AGACAGTACT 350 CGGGAGACAC AAGATAGAGG TTCCGGCCTT TGGAGGGTGG TTCAAAAAGA 400 AATCATCTAA GCACGAGACG GGCGGTTCAA GTGCCAACGC AGATAGTTCG 450 AGCGTGGCTT CCGATTCCAC CGAAAAACCT TTGTTCCGTC TCACGCACGT 500 TCCTTACGTA TCCCAAGGTA ATGAGCGAAT GGGATGTTGG TATGCCTGCG 550 CAAGAATGGT TGGCCATTCT GTCGAAGCTG GGCCTCGCCT AGGGCTGCCG 600 GAGCTCTATG AGGGAAGGGA GGCGCCAGCT GGGCTACAAG ATTTTTCAGA 650 TGTAGAAAGG TTTATTCACA ATGAAGGATT AACTCGGGTA GACCTTCCAG 700 ACAATGAGAG ATTTACACAC GAAGAGTTGG GTGCACTGTT GTATAAGCAC 750 GGGCCGATTA TATTTGGGTG GAAAACTCCG AATGACAGCT GGCACATGTC 800 GGTCCTCACT GGTGTCGATA AAGAGACGTC GTCCATTACT TTTCACGATC 850 CCCGACAGGG GCCGGACCTA GCAATGCCGC TCGATTACTT TAATCAGCGA 900 TTGGCATGGC AGGTTCCACA CGCAATGCTC TACCGCTAAG TAGCAGGGTA 950 TCTTCACGTG GCGGCATCAT GACAAGCCCA TGATGCCGCC AGCAGCTACC 1000 TGAATGCCGT CTGGCTTTTT GGTCCCTATT GTCGTATCCG GAAGATGACG 1050 TCAAAGAAŤC TCGGCAAGAG CTTTCTTGCT CGACTCCTCA GCTTCCGGAT 1100 CGATCAGGTC GCTTGCCAGA GCGCGCTTGT CCATGAGCAT CTGCCACAGC 1150 TGCTGGTCGA TGGTGTCCTC AGCTAAAGGG ATTTTGACGA CAACCATGCG 1200 CAACTGCCCG TTGCGATACG CTCGATCCTG AAGCCCCGGT GTCCATGGCA 1250 GCCCCAAGAA AAAGACATAG TTCGCCGCTG TGAGGTTGTA GCCTGTGCCG 1300 GCGGCCGACC TGGTCCCGAT AAACACCCTG CAGTCCGGAT CCTGCTGGAA 1350 AGCATCAATC GCCTTCTGCC GCTTCTTGGG CGAGTCACTG CCCACCAACG 1400 TCACGCACCC GACGCCAAGC TTGAGGCAGT GCTCCCGCAA CGTGGCCACG 1450 GATTCCTGAT ACTCGCAGAA GAGGATCACC TTGTCGTCGA C 1491

    (sekv. id. č. 105) odštěpi telně napojenou na regulační sekvence, při čemž tyto regulační sekvence obsahují promotor.
25. 25, Vektor, který obsahuje DNA podle nároku 1 a DNA avrRpt2 genu sekvence identifikační číslo 105 podle nároku 24 odštěpí tel ně napojené na regulační sekvence, při čemž tyto regulační sekvence obsahují promotor.
26. 26. V podstatě čisá DNA, která má 85% nebo větší identitu sekvence se sekvencí DNA na obrázku 2.