CN105132517B - 联合鉴定小麦对Bipolaris Sorokiniana黑胚病与叶枯病抗性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种联合鉴定小麦对B.sorokiniana黑胚病与叶枯病抗性的方法。首先将4℃保存的B.sorokiniana单孢菌株切成块状，接种于PDA培养基上暗培养，培养后将孢子刮下，冲洗、纱布过滤，得到孢子悬浮液，调整孢子浓度；小麦抽穗后，将穗部及旗叶套袋；开花后第6天，将所得B.sorokiniana孢子悬浮液摇匀，喷洒在穗部及旗叶，套袋、保湿；接菌后记录病斑面积百分率和黑胚率，根据记录结果来同时评价小麦对B.sorokiniana黑胚病与叶枯病的抗性。本发明鉴定方法与大田自然发病率鉴定相比，提高了鉴定结果的准确性与可靠性，与两种病害分开鉴定相比，大大提高了鉴定的效率。

Description

联合鉴定小麦对Bipolaris Sorokiniana黑胚病与叶枯病抗 性的方法

一、技术领域：

本发明属于农作物病害检测技术领域，具体涉及一种联合鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病与叶枯病抗性的方法。

二、背景技术：

黑胚病与叶枯病是小麦的常见病害，黑胚病是指小麦颖果表面有不同形状和程度的黑色、褐色等病变；叶枯病是小麦叶斑和叶枯病害的总称，这两种病的病因复杂，小麦根腐平脐蠕孢(Bipolaris sorokiniana即B.sorokiniana，中文名称还可称为“小麦根腐病菌”)能同时引起这两种小麦病害，其感染小麦籽粒引起黑胚病，侵染叶片会引起小麦叶枯病。

蠕孢叶枯病在一般的年份可使小麦减产5～20％，严重者减产50％以上(参见朱修涛、常适滔、周春元，小麦叶枯病(HLB)研究进展；农业科技与装备，2010，8:15-18)，小麦黑胚病的严重程度随品种、地点、年份及防治措施等因素的不同而变化，各国报道的发病率一般在0.3～66.7％之间变化(参见：1、Li Q Y,Qin Z,Jiang Y M,Shen C C,Duan Z B,andNiu J S.Screening wheat genotypes for resistance to black point and theeffects of diseased kernels on seed germination.Journal of Plant Diseases andProtection,2014,121(2):79-88；2、Sissons M,Sissons S,and Egan N.The black pointstatus of selected tetraploid species and Australian durum wheat and breedinglines.Crop Science,2010,50:1279-1286.3、康业斌,郭秀璞,成玉梅,刘顺通,谢贞.小麦对黑胚病的抗性及黑胚对种质的影响，麦类作物,1998,4:28-31)。蠕孢菌引起的黑胚病不仅使小麦穗粒数减少、千粒重降低从而影响小麦产量，而且降低籽粒品质，从而影响农民收入，可见蠕孢黑胚病与叶枯病给小麦生产带来严重的危害。

准确、高效的品种抗性鉴定技术是抗病遗传研究、抗病育种和病害防治的基础。目前，小麦品种对黑胚病与叶枯病抗性的鉴定方法主要是基于大田自然发病率。然而，这两种病的发生受病原种类与环境条件等多种因素的影响，同一品种在不同年度、不同地点的发病程度变化很大。所以，基于自然发病情况评价品种抗性的稳定性较差，鉴定结果的可靠性差。虽然也有一些针对黑胚病与叶枯病的接菌鉴定方法的报告，如康业斌等(康业斌，刘顺通，成玉梅，段爱菊.小麦对黑胚病的抗性及黑胚对产量损失的影响，植物保护，1999，3:25-27.)在小麦不同生育期(抽穗期、扬花初期、扬花末期和灌浆初期)接种麦类根腐叶枯病菌(Drechlera sorokiniana)评价小麦对黑胚病抗性及该病对产量的影响，不过接菌后的保湿时间短(连续3天，每天喷水2次保湿)，马骥超(马骥超.小麦抗蠕孢菌叶枯病微卫星标记检测.沈阳农业大学硕士学位论文，2007，中国，沈阳.)用离体叶片孢子液滴接种法鉴定了小麦对B.sorokiniana叶枯病的抗性，由于实验室条件与大田有差异，故实验室的鉴定结果不能充分反应小麦的大田抗性，更重要的是，这些研究将黑胚病与叶枯病两种病害分开鉴定，效率较低。因此，非常有必要研究一种联合鉴定的方法，同时评价小麦对这两种病害的抗性。

三、发明内容：

本发明要解决的技术问题是：根据目前小麦B.sorokiniana叶枯病与黑胚病抗性分开鉴定、且小麦对黑胚病与叶枯病抗性鉴定方法存在的不足之处，本发明从接菌时期与保湿时间这两个影响发病的主要因素入手，建立了一种能够同时鉴定小麦对B.sorokiniana黑胚病与叶枯病害的方法；即本发明首次提供了一种联合鉴定小麦对B.sorokiniana黑胚病与叶枯病抗性的方法(一种用于联合鉴定小麦品/系对小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana黑胚病与叶枯病抗性的方法)。本发明技术方案是在小麦抽穗后套硫酸纸袋隔离杂菌，开花后第6天进行孢子悬浮液喷洒接菌、换套塑料袋保湿7天后，再换套硫酸纸袋，通过叶病斑面积与种子黑胚率同时评价小麦对B.sorokiniana叶枯病与黑胚病抗性的方法。本发明鉴定方法与大田自然发病率鉴定相比，提高了鉴定结果的准确性与可靠性，与两种病害分开鉴定相比，大大提高了鉴定的效率。

为了解决上述问题，本发明采取的技术方案是：

本发明提供一种联合鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病与叶枯病抗性的方法，所述联合鉴定方法包括以下步骤：

a、小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana的保存：将实验室分离的小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana单孢菌株置于马铃薯葡萄糖琼脂PDA试管斜面培养基上，于4℃冰箱保存备用；

b、小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana的孢子悬浮液的制备：将步骤a中4℃冰箱保存的小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana切成0.3cm²的块状，接种于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基上，在25℃条件下暗培养，培养后用载玻片从培养好的菌落上将孢子刮下，采用蒸馏水冲洗、纱布过滤，得到孢子悬浮液，用血球计数板检测孢子悬浮液的浓度，调整至孢子浓度为3×10⁵个/mL，配置得到的孢子悬浮液放在溶液瓶中于4℃冰箱保存备用；

c、喷洒接菌、套袋保湿：小麦抽穗后，采用硫酸纸袋将小麦穗部及旗叶套袋；在小麦开花后第6天，将步骤b制备的Bipolaris sorokiniana孢子悬浮液摇匀，然后均匀喷洒在小麦穗部及旗叶，喷洒后采用塑料袋将小麦穗部及旗叶罩住保湿，保湿7天后换套硫酸纸袋；

d、鉴定结果记录：接菌后第15～18天记录叶片病斑面积占总叶片面积的百分比即为病斑面积百分率，作为小麦叶枯病抗性的评价指标；小麦收获后晾晒干，手工脱粒，统计黑胚籽粒占籽粒总数的百分比即为黑胚率，作为小麦黑胚病抗性的评价指标；

e、抗病性评价：根据步骤d记录所得病斑面积百分率和黑胚率来同时评价小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病与叶枯病的抗性。

根据上述的联合鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病与叶枯病抗性的方法，马铃薯葡萄糖琼脂PDA的配制方法：

首先准备好原料马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉20g和自来水1000mL，自然pH；将马铃薯洗净去皮切成小块，水沸后放入煮10～15分钟，然后用四层纱布过滤、除掉土豆块，加入准备的葡萄糖和琼脂粉，继续加热搅拌混匀，冷却后再补足水分至1000mL；分装至15×150mm试管与250mL三角瓶中，121℃灭菌20分钟后取出；试管摆斜面，冷却后用于Bipolarissorokiniana的保存；三角瓶中的培养基倒入9cm培养皿中，冷却后用于培养Bipolarissorokiniana。

根据上述的联合鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病与叶枯病抗性的方法，步骤b中Bipolaris sorokiniana在25℃条件下暗培养9～12天，培养后菌丝基本布满培养皿，颜色深黑，产生大量孢子时取出培养皿，用灭菌载玻片将孢子轻轻刮下，用蒸馏水冲洗培养皿2～3次，并用四层纱布过滤得到B.sorokiniana孢子悬浮液。

根据上述的联合鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病与叶枯病抗性的方法，步骤c中将步骤b制备的Bipolaris sorokiniana孢子悬浮液中加入吐温-20摇匀，吐温-20的加入量占Bipolaris sorokiniana孢子悬浮液体积的0.02％，然后均匀喷洒在小麦穗部及旗叶。

根据上述的联合鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病与叶枯病抗性的方法，步骤e中所述根据步骤d记录所得病斑面积百分率和黑胚率来同时评价小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病与叶枯病的抗性，其具体鉴定方法为：

采用6级分类法评价小麦品种对叶枯病抗性：0级无病斑，属于高抗，计为HR；1级的病斑面积为0.1～1.9％，属于抗，计为R；2级的病斑面积为2.0～9.9％，属于中抗，计为MR；3级的病斑面积为10.0～49.9％，属于中感，计为MS；4级的病斑面积＞50.0％属于感，计为S；5级全叶干死，属于高感，计为HS；

评价黑胚病抗性的方法：无病粒，属于免疫，计为M；黑胚率为0.1～1.9％，属于高抗，计为HR；黑胚率为2.0～4.9％，属于抗，计为R；黑胚率为5.0～14.9％，属于轻感，计为hS；黑胚率为15.0～30.0％，属于感，计为S；黑胚率＞30％，属于高感，计为HS。

本发明技术方案中：使用硫酸纸袋套袋隔离杂菌与塑料袋套袋保湿交替进行，抽穗后套硫酸纸袋有效隔离了杂菌，开花6天后接菌换套塑料袋保湿7天，接菌时期与保湿天数是本发明通过实验优化的两个重要条件，既给小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana致黑胚病与叶枯病提供适宜条件，又尽量缩短套塑料袋对小麦生长的影响，病菌侵染后又换套硫酸纸袋隔离杂菌。

本发明的积极有益效果：

1、小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana是小麦黑胚病与叶枯病的主要病原菌，广泛存在于小麦生产区。在没有准确鉴定品种抗性的情况下，无法就小麦对这种病原的专化抗病性进行研究。本发明所述的B.sorokiniana黑胚病与叶枯病的联合鉴定方法是首次提出、一次鉴定，同时评价小麦对两种病害的抗性，节省了一半的试验时间，提高了效率。

2、本发明方法将硫酸纸袋与塑料袋交替使用，进行杂菌隔离与B.sorokiniana菌侵染所需湿润条件的保持，即保证了B.sorokiniana菌充分致病，又大大降低了抗病鉴定对小麦正常生长发育的影响，从而增强了鉴定结果的准确性与可靠性。因此，本发明可用于小麦对B.sorokiniana黑胚病与叶枯病的联合鉴定，能准确、高效地筛选抗、感病品种和进行分离群体的表型鉴定，便于小麦抗B.sorokiniana黑胚病与叶枯病遗传与基因/QTL定位、分子标记开发等研究，有利于推进小麦抗蠕孢黑胚病与叶枯病的遗传研究和抗病育种工作。

3、本发明不同接菌时期与保湿时间条件下B.sorokiniana黑胚病发病情况，详见表1。

表1不同接菌时期与保湿时间条件下B.sorokiniana黑胚病发病情况

注明：

表1中，(1)分别在抽穗期、开花期、开花后6、12、18、24天六个发育阶段进行孢子悬浮液喷洒接菌，每阶段接菌后采取塑料袋套袋保湿0、3、5、7、9、12天六个时间段(表中分别表示为0,3,5,7,9,12d)，以确定合适的接菌鉴定时期与保湿时间，CK喷洒灭菌蒸馏水；

(2)抗病结果用黑胚率(％)表示，同一列数据后的大写字母不同表示在0.01水平上差异显著；

(3)接菌的六个发育时期，开花-花后6天的黑胚率明显高于其它时期，所有试验品种均表现出同样的规律(试验用了4个品系，为节省空间，表中列了2个)，表明这个阶段小麦对B.sorokiniana的侵入比较敏感，适易作为黑胚病鉴定的接菌期；

(4)不同时期的黑胚率均随着保湿时间的延长而升高，在保湿7天的发病率显著高于不保湿处理，而又与保湿最长时间段的发病率无显著差异，表明保湿7天是黑胚病鉴定的适宜保湿时间。

4、本发明不同接菌时期与保湿时间条件下B.sorokiniana叶枯病发病情况详见表2。

表2不同接菌时期与保湿时间条件下B.sorokiniana叶枯病发病情况

注明：

(1)接菌时期与保湿时间处理同表1，抗病结果用病斑面积百分比表示，同一列数据后的大写字母不同表示在0.01水平上差异显著；

(2)接菌的六个发育时期，抽穗、开花、花后12天四个时期的病斑面积较高，此后病斑面积下降，所以B.sorokiniana叶枯病接菌鉴定应放在抽穗到花后12天之间；

(3)不同时期接菌，病斑面积均随着保湿时间的延长而升高，在抽穗到花后12天接菌，在保湿7天后的病斑面积显著高于不保湿处理，保湿9天时，面积达到90％(山农4143)以上或接近50％(宛原白1号)，表明发病情况已过于严重，所以以套袋保湿7天的处理比较合适，此时发病比较充分，品种间差异也较大；

(4)综合黑胚病发病情况，选择花后6天喷洒接菌，套袋保湿7天处理作为本发明联合鉴定B.sorokiniana黑胚病与叶枯病抗性方法的较佳条件。

5、利用本发明方法对小麦进行抗B.sorokiniana黑胚病与叶枯病鉴定结果与现有大田结果比较，详见表3。

表3本发明对小麦进行抗B.sorokiniana黑胚病与叶枯病鉴定结果与大田结果比较

注明：

(1)三年的大田抗性鉴定试验分别在河南农业大学科教园区(郑州市毛庄镇，2013-2014年)与荥阳育种田(荥阳市豫龙镇，2015年)完成；

(2)表中“％”表示黑胚率(黑胚病)或病斑面积百分率(叶枯病)，抗性评价中HR、MR、HS、MS、hS、S分别表示高抗、中抗、高感、中感、轻感和感病。

(3)RB与自然CK分别表示用本发明方法接菌鉴定与自然环境鉴定的结果，抗性评价结果表明：用本发明方法鉴定，三年四个品种对B.sorokiniana叶枯病与黑胚病的抗性评价一致；而自然环境条件下，四个品种的抗性评价在年度间不一致，如LWX-285的黑胚率在三年间变化较大，抗性评价为高抗(2013年)或轻感(2014-2015年)。

(4)接菌鉴定的发病程度比自然情况严重，表明如果给予适宜环境，一些在自然条件下鉴定为抗病的材料可能不是真正抗病的，所以筛选抗病品种还是接菌条件下的结果可靠。

四、附图说明：

图1：本发明方法进行B.sorokiniana黑胚病(上)和叶枯病(下)抗性鉴定的结果。

图1中：黑胚病鉴定材料分别为宛原白1号(A)与山农4143(B)，自然CK、CK、RB分别指不接菌不套袋处理(自然生长状况)，用蒸馏水喷洒套袋处理，开花后6天孢子液喷洒接菌套袋7天保湿处理；叶枯病鉴定材料分别为LWX-285(C)与豫优1号(D)，0，3，5，7，9，12，15分别为接菌处理后的天数。

五、具体实施方式：

以下结合实施例进一步阐述本发明，但并不限制本发明的内容。

以下实施例中采用的马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基的配方及其配制方法：

PDA培养基配方：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉20g和自来水1000mL，自然pH；其配制步骤：将马铃薯洗净去皮切成小块，水沸后放入煮10～15分钟，然后用四层纱布过滤、除掉土豆块，加入准备的葡萄糖和琼脂粉，继续加热搅拌混匀，冷却后再补足水分至1000mL；分装至15×150mm试管与250mL三角瓶中，121℃灭菌20分钟后取出；试管摆斜面，冷却后用于Bipolaris sorokiniana的保存；三角瓶中的培养基倒入9cm培养皿中，冷却后用于培养Bipolaris sorokiniana。

实施例1：

本发明联合鉴定温室种植情况下小麦对B.sorokiniana黑胚病与叶枯病抗性的方法，其详细步骤如下：

a、小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana的保存：将实验室分离的B.sorokiniana单孢菌株置于马铃薯葡萄糖琼脂PDA试管斜面培养基上，于4℃冰箱保存备用；在小麦孕穗期，配置马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基；

b、小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana孢子悬浮液的制备：将步骤a中4℃冰箱保存的小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana切成0.3cm²的块状，接种于配制的马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基上，在25℃条件下暗培养10天，此时菌丝基本布满培养皿，颜色发黑，产生大量孢子时取出培养皿，用灭菌载玻片从培养好的菌落上将孢子刮下，采用灭菌蒸馏水冲洗2～3次、4层纱布过滤，得到孢子悬浮液，用血球计数板检测孢子悬浮液的浓度，调整至孢子浓度为3×10⁵个/mL，配置得到的孢子悬浮液放在溶液瓶中于4℃冰箱保存备用；

c、喷洒接菌、套袋保湿：在河南农业大学国家小麦工程技术研究中心温室盆栽的小麦抽穗后，采用25×17mm的硫酸纸袋将小麦穗部及旗叶套袋(每袋罩5个发育状况一致的穗子，每品种套15～25穗)；在小麦开花后第6天(将硫酸纸袋取下，将穗部与叶片上的花粉清理干净)，将步骤b制备的B.sorokiniana孢子悬浮液摇匀后，用喷壶将其均匀喷洒在小麦穗部及旗叶(对照CK喷洒灭菌蒸馏水)，喷洒后采用塑料袋将小麦穗部及旗叶罩住保湿，保湿7天后换套硫酸纸袋继续隔离杂菌；

d、鉴定结果记录：接菌后第15天记录叶片病斑面积占总叶片面积的百分比即为病斑面积百分率，作为小麦叶枯病抗性的评价指标(统计病斑面积后叶片就不用罩塑料袋，穗子继续罩上隔离杂菌)；小麦收获后晾晒干，手工脱粒，统计黑胚籽粒占籽粒总数的百分比即为黑胚率，作为小麦黑胚病抗性的评价指标；

e、抗病性评价：根据步骤d记录所得病斑面积百分率和黑胚率来同时评价小麦对小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana黑胚病与叶枯病的抗性。

本实施例：根据Hossain与Azad 1992年报道的6级分类法评价小麦品种对叶枯病抗性(参考文献：Hossain I,and Azad A K.Reaction of wheat to Helminthosporiumsativum in Bangladesh.Hereditas,1992,116,203-205.)：0级无病斑，属于高抗，计为HR；1级的病斑面积为0.1～1.9％，属于抗，计为R；2级的病斑面积为2.0～9.9％，属于中抗，计为MR；3级的病斑面积为10.0～49.9％，属于中感，计为MS；4级的病斑面积＞50.0％属于感，计为S；5级全叶干死，属于高感，计为HS；

根据Li等2014年报道的方法评价黑胚病抗性(参考文献：Li Q Y,Qin Z,Jiang YM,Shen C C,Duan Z B,and Niu J S.Screening wheat genotypes for resistance toblack point and the effects of diseased kernels on seed germination.Journalof Plant Diseases and Protection,2014,121(2):79-88.)：无病粒，属于免疫，计为M；黑胚率为0.1～1.9％，属于高抗，计为HR；黑胚率为2.0～4.9％，属于抗，计为R；黑胚率为5.0～14.9％，属于轻感，计为hS；黑胚率为15.0～30.0％，属于感，计为S；黑胚率＞30％，属于高感，计为HS。

试验统计结果显示：在接菌的六个发育时期中，开花-花后6天的黑胚率明显高于其它时期，所有试验品种均表现出同样的规律，表明这个阶段小麦对B.sorokiniana的侵入比较敏感，适易作为黑胚病鉴定的接菌期；不同发育时期接菌，黑胚率均随着保湿时间的延长而升高，在保湿7天的发病率显著高于不保湿处理，而又与保湿最长时间段的发病率无显著差异，表明保湿7天是黑胚病鉴定的适宜保湿时间(详见表1)。不同时期接菌，病斑面积均随着保湿时间的延长而升高，在抽穗到花后12天接菌，在保湿7天后的病斑面积显著高于不保湿处理，保湿9天时，面积达到90％(山农4143)以上或接近50％(宛原白1号)，表明发病情况已过于严重，所以以套袋保湿7天的处理比较合适，此时发病比较充分，品种间差异也较大(详见表2)；综合黑胚病与叶枯病的发病情况，选择花后6天喷洒接菌，套袋保湿7天处理作为本发明联合鉴定B.sorokiniana黑胚病与叶枯病抗性方法，该方法的鉴定效果明显，如附图1所示，处理样品的黑胚率和叶枯病斑面积与CK差异明显，能够反映出小麦品种对B.sorokiniana黑胚病与叶枯病抗性情况。

实施例2：

本发明联合鉴定大田种植情况下小麦对B.sorokiniana黑胚病与叶枯病抗性的方法，其详细步骤如下：

a、小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana的保存：将实验室分离的B.sorokiniana单孢菌株置于马铃薯葡萄糖琼脂PDA试管斜面培养基上，于4℃冰箱保存备用；在小麦孕穗期，配置马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基；

b、小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana孢子悬浮液的制备：将步骤a中4℃冰箱保存的小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana切成0.3cm²的块状，接种于配制的马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基上，在25℃条件下暗培养10天，此时菌丝基本布满培养皿，颜色发黑，产生大量孢子时取出培养皿，用灭菌载玻片从培养好的菌落上将孢子刮下，采用灭菌蒸馏水冲洗2～3次、4层纱布过滤，得到孢子悬浮液，用血球计数板检测孢子悬浮液的浓度，调整至孢子浓度为3×10⁵个/mL，配置得到的孢子悬浮液放在溶液瓶中于4℃冰箱保存备用；

c、喷洒接菌、套袋保湿：2013到2015年4月中旬，在河南农业大学科教园区(郑州市毛庄镇，2013-2014年)与荥阳育种田(荥阳市豫龙镇，2015年)种植的小麦抽穗后，采用25×17mm的硫酸纸袋将小麦穗部及旗叶套袋(每袋罩10个发育状况一致的穗子，每品种套30～50穗)；在小麦开花后第6天(将硫酸纸袋取下，将穗部与叶片上的花粉清理干净)，将步骤b制备的B.sorokiniana孢子悬浮液摇匀后，用喷壶将其均匀喷洒在小麦穗部及旗叶(对照CK喷洒灭菌蒸馏水)，喷洒后采用塑料袋将小麦穗部及旗叶罩住保湿，保湿7天后换套硫酸纸袋继续隔离杂菌；

d、鉴定结果记录：接菌后第15天记录叶片病斑面积占总叶片面积的百分比即为病斑面积百分率，作为小麦叶枯病抗性的评价指标(统计病斑面积后叶片就不用罩塑料袋，穗子继续罩上隔离杂菌)；小麦收获后晾晒干，手工脱粒，统计黑胚籽粒占籽粒总数的百分比即为黑胚率，作为小麦黑胚病抗性的评价指标；

e、抗病性评价：根据步骤d记录所得病斑面积百分率和黑胚率来同时评价小麦对小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana黑胚病与叶枯病的抗性。

本实施例：根据Hossain与Azad 1992年报道的6级分类法评价小麦品种对叶枯病抗性(参考文献：Hossain I,and Azad A K.Reaction of wheat to Helminthosporiumsativum in Bangladesh.Hereditas,1992,116,203-205.)：0级无病斑，属于高抗，计为HR；1级的病斑面积为0.1～1.9％，属于抗，计为R；2级的病斑面积为2.0～9.9％，属于中抗，计为MR；3级的病斑面积为10.0～49.9％，属于中感，计为MS；4级的病斑面积＞50.0％属于感，计为S；5级全叶干死，属于高感，计为HS；

根据Li等2014年报道的方法评价黑胚病抗性(参考文献：Li Q Y,Qin Z,Jiang YM,Shen C C,Duan Z B,and Niu J S.Screening wheat genotypes for resistance toblack point and the effects of diseased kernels on seed germination.Journalof Plant Diseases and Protection,2014,121(2):79-88.)：无病粒，属于免疫，计为M；黑胚率为0.1～1.9％，属于高抗，计为HR；黑胚率为2.0～4.9％，属于抗，计为R；黑胚率为5.0～14.9％，属于轻感，计为hS；黑胚率为15.0～30.0％，属于感，计为S；黑胚率＞30％，属于高感，计为HS。

大田种植情况下的鉴定结果与抗性评价结果详见表3，表3的结果表明：三年中，用本发明方法鉴定的四个品种在不同年度、不同实验地点对B.sorokiniana叶枯病与黑胚病的抗性评价结果一致；而自然环境条件下，四个品种的抗性评价在年度间不一致，如LWX-285的黑胚率在三年间变化较大，抗性评价为高抗(2013年)或轻感(2014-2015年)，表明由于不同年度间环境有变化，若采用自然发病率作为鉴定方法，将导致对同一小麦品系抗性评价出现偏差；而采用本发明的鉴定方法，则在三年中的鉴定结果一致，保证了抗性评价的一致性，另外，接菌鉴定的发病程度比自然情况严重，表明如果给予适宜环境，一些在自然条件下鉴定为抗病的材料可能不是真正抗病的，所以用本发明方法采用花后6天接菌，硫酸纸袋与塑料袋交替使用进行杂菌隔离与保湿，筛选出的抗病品种的结果更可靠。

实施例3：与实施例1基本相同，不同之处在于：

步骤c中：将步骤b制备的B.sorokiniana孢子悬浮液加入吐温-20摇匀，吐温-20的加入量占Bipolaris sorokiniana孢子悬浮液体积的0.02％，摇匀后用喷壶将其均匀喷洒在小麦穗部及旗叶(对照CK喷洒灭菌蒸馏水)。

实施例4：与实施例2基本相同，不同之处在于：

步骤c中：将步骤b制备的B.sorokiniana孢子悬浮液加入吐温-20摇匀，吐温-20的加入量占Bipolaris sorokiniana孢子悬浮液体积的0.02％，摇匀后用喷壶将其均匀喷洒在小麦穗部及旗叶(对照CK喷洒灭菌蒸馏水)。

Claims (4)

1.一种联合鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病与叶枯病抗性的方法，其特征在于，所述联合鉴定方法包括以下步骤：

a、小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana的保存：将实验室分离的小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana单孢菌株置于马铃薯葡萄糖琼脂PDA试管斜面培养基上，于4℃冰箱保存备用；

b、小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana的孢子悬浮液的制备：将步骤a中4℃冰箱保存的小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana切成0.3cm²的块状，接种于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基上，在25℃条件下暗培养，培养后用载玻片从培养好的菌落上将孢子刮下，采用蒸馏水冲洗、纱布过滤，得到孢子悬浮液，用血球计数板检测孢子悬浮液的浓度，调整至孢子浓度为3×10⁵个/mL，配置得到的孢子悬浮液放在溶液瓶中于4℃冰箱保存备用；

c、喷洒接菌、套袋保湿：小麦抽穗后，采用硫酸纸袋将小麦穗部及旗叶套袋；在小麦开花后第6天，将步骤b制备的Bipolaris sorokiniana孢子悬浮液中加入吐温-20摇匀，吐温-20的加入量占Bipolaris sorokiniana孢子悬浮液体积的0.02％，然后均匀喷洒在小麦穗部及旗叶，喷洒后采用塑料袋将小麦穗部及旗叶罩住保湿，保湿7天后换套硫酸纸袋；

d、鉴定结果记录：接菌后第15～18天记录叶片病斑面积占总叶片面积的百分比即为病斑面积百分率，作为小麦叶枯病抗性的评价指标；小麦收获后晾晒干，手工脱粒，统计黑胚籽粒占籽粒总数的百分比即为黑胚率，作为小麦黑胚病抗性的评价指标；

e、抗病性评价：根据步骤d记录所得病斑面积百分率和黑胚率来同时评价小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病与叶枯病的抗性。

2.根据权利要求1所述的联合鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病与叶枯病抗性的方法，其特征在于，马铃薯葡萄糖琼脂PDA的配制方法：

首先准备好原料马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉20g和自来水1000mL，自然pH；将马铃薯洗净去皮切成小块，水沸后放入煮10～15分钟，然后用四层纱布过滤、除掉土豆块，加入准备的葡萄糖和琼脂粉，继续加热搅拌混匀，冷却后再补足水分至1000mL；分装至15×150mm试管与250mL三角瓶中，121℃灭菌20分钟后取出；试管摆斜面，冷却后用于Bipolarissorokiniana的保存；三角瓶中的培养基倒入9cm培养皿中，冷却后用于培养Bipolarissorokiniana。

3.根据权利要求1所述的联合鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病与叶枯病抗性的方法，其特征在于：步骤b中Bipolaris sorokiniana在25℃条件下暗培养9～12天，培养后菌丝基本布满培养皿，颜色深黑，产生大量孢子时取出培养皿，用灭菌载玻片将孢子轻轻刮下，用蒸馏水冲洗培养皿2～3次，并用四层纱布过滤得到B.sorokiniana孢子悬浮液。

4.根据权利要求1所述的联合鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病与叶枯病抗性的方法，其特征在于：步骤e中所述根据步骤d记录所得病斑面积百分率和黑胚率来同时评价小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病与叶枯病的抗性，其具体鉴定方法为：

采用6级分类法评价小麦品种对叶枯病抗性：0级无病斑，属于高抗，计为HR；1级的病斑面积为0.1～1.9％，属于抗，计为R；2级的病斑面积为2.0～9.9％，属于中抗，计为MR；3级的病斑面积为10.0～49.9％，属于中感，计为MS；4级的病斑面积＞50.0％属于感，计为S；5级全叶干死，属于高感，计为HS；

评价黑胚病抗性的方法：无病粒，属于免疫，计为M；黑胚率为0.1～1.9％，属于高抗，计为HR；黑胚率为2.0～4.9％，属于抗，计为R；黑胚率为5.0～14.9％，属于轻感，计为hS；黑胚率为15.0～30.0％，属于感，计为S；黑胚率＞30％，属于高感，计为HS。