CN108467838A - 一种小麦赤霉病菌规模化接种方法 - Google Patents

一种小麦赤霉病菌规模化接种方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种小麦赤霉病菌规模化接种方法，包括以下步骤：制备小麦赤霉病菌分生孢子接种体；鉴定材料处于扬花初期时，选择傍晚或者阴天，将分生孢子接种体，加入吐温20后，采用电动喷雾器，均匀喷雾于待接种鉴定的试验小区麦穗上；采用白色透明塑料薄膜，覆盖麦穗，保湿后撤去薄膜。本发明接种方法，在盖膜保湿条件下，其穗部发病病情指数及普遍率，分别达到80～90和90％～100％。

Description

一种小麦赤霉病菌规模化接种方法
技术领域
本发明属于植物病原真菌防治技术领域，具体地说，涉及一种小麦赤霉病菌规模化接种方法。
背景技术
小麦赤霉病是由禾谷类镰刀菌(Gibberella zeae(Schw.)Petch)引起的世界性小麦主要病害之一。长江中下游及东北麦区是我国小麦赤霉病传统的流行和高发地区。近年来，随着全球气候变暖和秸秆还田等耕作制度和方式的改变，赤霉病发生范围有向黄淮麦区持续扩大、频率不断增加、危害逐步加重的趋势。赤霉病主要为害小麦穗部，在小麦生长的各个阶段均可侵染为害，尤其是扬花期侵染最重。当天气条件适宜病菌发生侵染，小麦扬花初期遇到降水、雾露日连续3天以上，是造成小麦赤霉病发生大流行的主要原因。
国家小麦产业技术体系及小麦赤霉病综合防控协同创新联盟，动员全国小麦赤霉病防控研究主要产业技术力量，从品种和防控的角度，加快培育和筛选一批赤霉病抗性达中抗以上的小麦新品种，研制筛选合适的防治药剂以及配套的防治技术，为我国不同麦区有效提供小麦赤霉病防控技术方案。其中，在品种培育方面，大规模筛选和有效评价赤霉病抗性，是提高寄主抗性水平防治赤霉病大流行的有效途径。
目前国内外报道的小麦赤霉病抗性鉴定和评价方法，主要有病圃自然诱发和人工接种鉴定两种。自然诱发是指在赤霉病流行和易发区设置病圃诱发得病，但由于受田间菌源基数及温湿度的影响，导致不发病或发病不充分，且鉴定结果的一致性和稳定性较差，因此该方法使用较少。人工接种鉴定是指人工提供小麦赤霉病菌和适宜的温湿度条件并诱发得病。人工接种鉴定方法很多，代表性的有土表接种法和单花滴注法。土表接种法，一般是在小麦抽穗前1个月，将接有赤霉菌的病麦粒或玉米粒均匀撒于鉴定圃的小麦行间。之后多次保湿，促使子囊壳形成，通过产生子囊孢子感染麦穗引起发病。土表接种法需要配合喷雾设施，创造适宜条件诱发赤霉病，其历时较长，投入成本较高。单花滴注法，是在小麦扬花期，采用注射器将赤霉病菌孢子液注入穗中部的小花中而引起发病。该方法比较稳定，是目前赤霉病抗性鉴定中最常用的方法，但通常需要配套的保湿措施，比如塑料套袋或者迷雾保湿。塑料套袋需要密封和拆封，接种效率低；结合迷雾保湿效果虽好，但配备迷雾设施成本高，一般适合在室内或温室条件下小规模的鉴定。李韬等(李韬,李媛媛，李磊.小麦赤霉病：从表型鉴定到抗性改良[J].科技导报，2016,34(22):75-80)研发并改良了穗基部茎秆注射法，在田间或温室条件，接种后均无需保湿，解决了传统单花滴注法鉴定需要套袋或喷雾、喷水等保湿的问题。而穗基部茎秆注射法虽省去保湿措施，但通过人工注射的方法，接种工序相对费时费力，不利于育种材料的大规模鉴定筛选。因此，无论哪种注射方法，劳动强度大，费时费工，接种效率始终较低。
综上所述，现有技术存在的问题是：费时费工，投入成本高，接种效率低，生产应用上轻简化程度不高，不利于育种材料大规模接种鉴定。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种小麦赤霉病菌规模化接种方法。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种小麦赤霉病菌规模化接种方法，包括以下步骤：
步骤1、小麦赤霉病菌分生孢子接种体的制备：挑选5～6个有代表性的强致病力菌株作为菌种，将这些菌株在PDA平板培养基上分别进行活化培养；采用打孔器从上述活化好的培养基中取4～6块菌饼，接种于的CMC液体培养基中，每个菌株接种10～12瓶；在恒温摇床上培养；使用新灭菌的四层纱布将液体培养物进行过滤，分别收集各菌株孢子悬浮液，等比例混配后，摇匀取样，在显微镜下用血球计数板将分生孢子浓度调整至1×105个/mL～5×105个/mL，作为接种体备用；若暂时不接种，将接种悬浮液放置于冰箱中冷藏保存，制备得到分生孢子接种体；
步骤2、孢子悬浮液电动喷雾接种：鉴定材料处于扬花初期时，选择傍晚或者阴天，将步骤1的分生孢子接种体，加入吐温20后，采用电动喷雾器，均匀喷雾于待接种鉴定的试验小区麦穗上；
步骤3、盖膜保湿：采用白色透明塑料薄膜，覆盖麦穗，保湿后撤去薄膜。
可选地，PDA平板培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水定容至1L；配制方法：马铃薯洗净、去皮、切成小块，称取200g，加水煮沸20～30分钟直至完全煮烂熟，多层纱布过滤去渣，向滤液中补足水分至1L；按照一定体积分装后，依照比例加入葡萄糖和琼脂粉，摇晃混合均匀，121℃高温湿热灭菌20min，室温保存。
可选地，所述CMC液体培养基配方为：CMC 15g，KH2PO4 1.0g，NH4NO3 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，酵母膏1.0g，蒸馏水定容至1L；配制方法：将CMC缓慢加入80℃的热水中，待完全溶解后补足水分至1L；分装后，121℃高温湿热灭菌20min，室温保存。
可选地，恒温摇床中的温度为25℃，培养转速为175rpm，培养时间为5～7天。
可选地，冷藏温度为4℃，冷藏时间为5d～6d。
可选地，步骤2中的处于扬花初期是指扬花的麦穗数约占总穗数的10％；吐温20的添加量为分生孢子接种体体积的1/10000；加入吐温20后的分生孢子接种体的接种量为15L～18L/亩。
可选地，步骤3中的保湿时间为48h。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明接种方法，在盖膜保湿条件下，其穗部发病病情指数及普遍率，分别达到80～90和90％～100％，较单花滴注法及穗基部茎秆注射法接种效果不分上下甚至更佳。
2)本发明接种方法，接种浓度精确定量，接种效率高，成本低，对环境友好，生产应用上操作性强，轻简化程度高，该技术适合室内抗性鉴定及药剂活性筛选研究工作，更适用于大田育种材料的规模化接种筛选和评价。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明未接种的小麦发病情况；
图2是本发明接种但是未盖膜的小麦发病情况；
图3是本发明接种并盖膜的小麦发病情况。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明公开了一种小麦赤霉病菌规模化接种方法，包括以下步骤：
步骤1、小麦赤霉病菌分生孢子接种体的制备：挑选5～6个有代表性的强致病力菌株作为菌种，将这些菌株在PDA平板上分别进行活化培养。采用打孔器从上述活化好的培养基中取4～6块菌饼，接种于250ml的CMC液体培养基中，每个菌株接种10～12瓶。在25℃恒温摇床上，175rpm，培养5～7天。使用新灭菌的四层纱布将液体培养物进行过滤，分别收集各菌株孢子悬浮液，等比例混配后，摇匀取样，在显微镜下用血球计数板将分生孢子浓度调整至1×105个/mL～5×105个/mL，作为接种体备用。若暂时不接种，可将接种悬浮液放置于4℃冰箱中冷藏保存5d～6d。
所述PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)平板培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水定容至1L。配制方法：马铃薯洗净、去皮、切成小块，称取200g，加水煮沸大约20～30分钟左右直至完全煮烂熟，多层纱布过滤去渣，向滤液中补足水分至1L。按照一定体积分装后，依照比例加入葡萄糖和琼脂粉，摇晃混合均匀。121℃高温湿热灭菌20min。室温保存。
所述CMC(羧甲基纤维素钠)液体培养基配方为：CMC(sigma公司)15g，KH2PO4 1.0g，NH4NO3 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，酵母膏(Yeast Extract)1.0g，蒸馏水定容至1L。配制方法：将CMC缓慢加入80℃较高的热水中，待完全溶解后补足水分至1L。分装后，121℃高温湿热灭菌20min。室温保存。
步骤2、孢子悬浮液电动喷雾接种：鉴定材料处于扬花初期时(即扬花的麦穗数约占总穗数的10％时)，选择傍晚或者阴天，将步骤1的分生孢子接种体，加入1/10000体积的土温20后，采用电动喷雾器，均匀喷雾于待接种鉴定的试验小区麦穗上，接种量为15L～18L/亩。
步骤3、盖膜保湿：采用4米宽规格的白色透明塑料薄膜，覆盖麦穗，保湿48h后撤去薄膜。
步骤4、病情观察与统计：在接种后第3周，调查统计病小穗数与反应病级，根据病情指数和病穗率综合评价试验材料对赤霉病的抗性差异。
其中，病情指数＝∑(各级病穗数×各级代表值)/(调查总穗数×最高级代表值)×100。
其中，病穗反应级标准如下：
0级，接种小穗无可见发病症状；
1级，仅接种小穗发病，或相邻小穗发病，但病斑不扩展到穗轴；
2级，穗轴发病，发病小穗数占总小穗数的1/4以下；
3级，穗轴发病，发病小穗数占总小穗数的1/4～1/2；
4级，穗轴发病，发病小穗数占总小穗数的1/2以上。
病穗率＝发病的麦穗数/调查总穗数×100％。
实施例1
小麦品种：川麦104(四川主推品种)
小麦赤霉病菌分生孢子接种体的制备：挑选5～6个有代表性的强致病力菌株作为菌种，将这些菌株在PDA平板上分别进行活化培养。采用打孔器从上述活化好的培养基中取5块菌饼，接种于250ml的CMC液体培养基中，每个菌株接种11瓶。在25℃恒温摇床上，175rpm，培养6天。使用新灭菌的四层纱布将液体培养物进行过滤，分别收集各菌株孢子悬浮液，等比例混配后，摇匀取样，在显微镜下用血球计数板将分生孢子浓度调整至3×105个/mL，作为接种体备用。若暂时不接种，可将接种悬浮液放置于4℃冰箱中冷藏保存5d～6d。
所述PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)平板培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水定容至1L。配制方法：马铃薯洗净、去皮、切成小块，称取200g，加水煮沸大约20～30分钟左右直至完全煮烂熟，多层纱布过滤去渣，向滤液中补足水分至1L。按照一定体积分装后，依照比例加入葡萄糖和琼脂粉，摇晃混合均匀。121℃高温湿热灭菌20min。室温保存。
所述CMC(羧甲基纤维素钠)液体培养基配方为：CMC(sigma公司)15g，KH2PO4 1.0g，NH4NO3 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，Yeast Extract 1.0g，蒸馏水定容至1L。配制方法：将CMC缓慢加入80℃较高的热水中，待完全溶解后补足水分至1L。分装后，121℃高温湿热灭菌20min。室温保存。
田间处理：分接种+盖膜48h、不接种、接种不盖膜三个处理，三次重复，小区面积3*6米，孢子浓度2*105个/ml，接种量18L/亩，田间自然湿度。电动喷雾接种后，期间连续观察。三周后，调查统计病小穗数与反应病级。根据病情指数和病穗率综合评价试验材料对赤霉病的抗性差异。
结果与分析如表1所示：接种+盖膜48h，病指达88，病穗率达94.44％；接种不盖膜，分别为85.64和90％；而对照组仅分别为30和16.44％。处理间差异显著，且盖膜后发病效果比不盖膜显症快。总体发病效果：接种盖膜>接种不盖膜>>不接种。
如图1-3所示，未接种的小麦有少许病穗，青穗比较多，接种但是未盖膜的小麦病穗数量大于未接种的小麦，接种并盖膜的小麦病穗最多。
本发明采用孢子悬浮液电动喷雾法，结合盖膜保湿，接种效果好、显症快，经济又实用，生产上操作性强，轻简化程度高，可规模化接种应用。
表1实施例1中的孢子悬浮液电动喷雾法接种小麦赤霉病发生情况
Duncan’s multiple range test，P＝0.05.
实施例2
一种小麦赤霉病菌规模化接种方法，包括以下步骤：
步骤1、小麦赤霉病菌分生孢子接种体的制备：挑选5个有代表性的强致病力菌株作为菌种，将这些菌株在PDA平板上分别进行活化培养。采用打孔器从上述活化好的培养基中取6块菌饼，接种于250ml的CMC液体培养基中，每个菌株接种10瓶。在25℃恒温摇床上，175rpm，培养7天。使用新灭菌的四层纱布将液体培养物进行过滤，分别收集各菌株孢子悬浮液，等比例混配后，摇匀取样，在显微镜下用血球计数板将分生孢子浓度调整至1×105个/mL个/mL，作为接种体备用。若暂时不接种，可将接种悬浮液放置于4℃冰箱中冷藏保存6d。
所述PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)平板培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水定容至1L。配制方法：马铃薯洗净、去皮、切成小块，称取200g，加水煮沸大约20～30分钟左右直至完全煮烂熟，多层纱布过滤去渣，向滤液中补足水分至1L。按照一定体积分装后，依照比例加入葡萄糖和琼脂粉，摇晃混合均匀。121℃高温湿热灭菌20min。室温保存。
所述CMC(羧甲基纤维素钠)液体培养基配方为：CMC(sigma公司)15g，KH2PO4 1.0g，NH4NO3 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，酵母膏(Yeast Extract)1.0g，蒸馏水定容至1L。配制方法：将CMC缓慢加入80℃较高的热水中，待完全溶解后补足水分至1L。分装后，121℃高温湿热灭菌20min。室温保存。
步骤2、孢子悬浮液电动喷雾接种：鉴定材料处于扬花初期时(即扬花的麦穗数占总穗数的10％时)，选择傍晚或者阴天，将步骤1的分生孢子接种体，加入1/10000体积的土温20后，采用电动喷雾器，均匀喷雾于待接种鉴定的试验小区麦穗上，接种量为15L/亩。
步骤3、盖膜保湿：采用4米宽规格的白色透明塑料薄膜，覆盖麦穗，保湿48h后撤去薄膜。
实施例3
一种小麦赤霉病菌规模化接种方法，包括以下步骤：
步骤1、小麦赤霉病菌分生孢子接种体的制备：挑选6个有代表性的强致病力菌株作为菌种，将这些菌株在PDA平板上分别进行活化培养。采用打孔器从上述活化好的培养基中取4块菌饼，接种于250ml的CMC液体培养基中，每个菌株接种12瓶。在25℃恒温摇床上，175rpm，培养5天。使用新灭菌的四层纱布将液体培养物进行过滤，分别收集各菌株孢子悬浮液，等比例混配后，摇匀取样，在显微镜下用血球计数板将分生孢子浓度调整至5×105个/mL，作为接种体备用。若暂时不接种，可将接种悬浮液放置于4℃冰箱中冷藏保存5d。
所述PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)平板培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水定容至1L。配制方法：马铃薯洗净、去皮、切成小块，称取200g，加水煮沸大约20～30分钟左右直至完全煮烂熟，多层纱布过滤去渣，向滤液中补足水分至1L。按照一定体积分装后，依照比例加入葡萄糖和琼脂粉，摇晃混合均匀。121℃高温湿热灭菌20min。室温保存。
所述CMC(羧甲基纤维素钠)液体培养基配方为：CMC(sigma公司)15g，KH2PO4 1.0g，NH4NO3 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，酵母膏(Yeast Extract)1.0g，蒸馏水定容至1L。配制方法：将CMC缓慢加入80℃较高的热水中，待完全溶解后补足水分至1L。分装后，121℃高温湿热灭菌20min。室温保存。
步骤2、孢子悬浮液电动喷雾接种：鉴定材料处于扬花初期时(即扬花的麦穗数占总穗数的10％时)，选择傍晚或者阴天，将步骤1的分生孢子接种体，加入1/10000体积的土温20后，采用电动喷雾器，均匀喷雾于待接种鉴定的试验小区麦穗上，接种量为16L/亩。
步骤3、盖膜保湿：采用4米宽规格的白色透明塑料薄膜，覆盖麦穗，保湿48h后撤去薄膜。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.一种小麦赤霉病菌规模化接种方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、小麦赤霉病菌分生孢子接种体的制备：挑选5～6个有代表性的强致病力菌株作为菌种，将这些菌株在PDA平板培养基上分别进行活化培养；采用打孔器从上述活化好的培养基中取4～6块菌饼，接种于的CMC液体培养基中，每个菌株接种10～12瓶；在恒温摇床上培养；使用新灭菌的四层纱布将液体培养物进行过滤，分别收集各菌株孢子悬浮液，等比例混配后，摇匀取样，在显微镜下用血球计数板将分生孢子浓度调整至1×105个/mL～5×105个/mL，作为接种体备用；若暂时不接种，将接种悬浮液放置于冰箱中冷藏保存，制备得到分生孢子接种体；
步骤2、孢子悬浮液电动喷雾接种：鉴定材料处于扬花初期时，选择傍晚或者阴天，将步骤1的分生孢子接种体，加入吐温20后，采用电动喷雾器，均匀喷雾于待接种鉴定的试验小区麦穗上；
步骤3、盖膜保湿：采用白色透明塑料薄膜，覆盖麦穗，保湿后撤去薄膜。
2.根据权利要求1所述的小麦赤霉病菌规模化接种方法，其特征在于，PDA平板培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水定容至1L；配制方法：马铃薯洗净、去皮、切成小块，称取200g，加水煮沸20～30分钟直至完全煮烂熟，多层纱布过滤去渣，向滤液中补足水分至1L；按照一定体积分装后，依照比例加入葡萄糖和琼脂粉，摇晃混合均匀，121℃高温湿热灭菌20min，室温保存。
3.根据权利要求1所述的小麦赤霉病菌规模化接种方法，其特征在于，所述CMC液体培养基配方为：CMC 15g，KH2PO4 1.0g，NH4NO3 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，酵母膏1.0g，蒸馏水定容至1L；配制方法：将CMC缓慢加入80℃的热水中，待完全溶解后补足水分至1L；分装后，121℃高温湿热灭菌20min，室温保存。
4.根据权利要求1所述的小麦赤霉病菌规模化接种方法，其特征在于，恒温摇床中的温度为25℃，培养转速为175rpm，培养时间为5～7天。
5.根据权利要求1所述的小麦赤霉病菌规模化接种方法，其特征在于，冷藏温度为4℃，冷藏时间为5d～6d。
6.根据权利要求1所述的小麦赤霉病菌规模化接种方法，其特征在于，步骤2中的处于扬花初期是指扬花的麦穗数约占总穗数的10％；吐温20的添加量为分生孢子接种体体积的1/10000；加入吐温20后的分生孢子接种体的接种量为15L～18L/亩。
7.根据权利要求1所述的小麦赤霉病菌规模化接种方法，其特征在于，步骤3中的保湿时间为48h。
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