CN101621921A

CN101621921A - 水稻avrXa27基因对Xa27的诱导赋予抗水稻白叶枯病菌的广谱抗性和抗水稻细菌性条斑病菌的增强抗性

Info

Publication number: CN101621921A
Application number: CN200880006590.1A
Authority: CN
Inventors: 尹中朝; 田冬生
Original assignee: Temasek Life Sciences Laboratory Ltd
Current assignee: Temasek Life Sciences Laboratory Ltd
Priority date: 2007-01-29
Filing date: 2008-01-08
Publication date: 2010-01-06
Anticipated expiration: 2028-01-08
Also published as: US8334427B2; CN101621921B; US20100162438A1; AU2008211358B2; WO2008094127A1; AU2008211358A1

Abstract

本发明提供了一种在植物中产生抗水稻白叶枯病的广谱抗性的方法。更具体地，本发明提供了一种产生抗水稻白叶枯病菌(水稻白叶枯病的致病菌)的广谱抗性和抗水稻细菌性条斑病菌(水稻细菌性条斑病的致病菌)的增强抗性的方法。Xa27是一种可诱导的水稻白叶枯病R基因，受宿主表达的关联avrXa27基因诱导。携带avrXa27转基因和野生型Xa27基因的水稻具有抗非亲和性病原菌和亲和性病原菌的抗性和抗水稻细菌性条斑病菌菌株L8的增强抗性。在IRBB27和携带pHM1avrXa27的L8之间的互作中也观察到Xa27介导的抗水稻细菌性条斑病菌的增强抗性。IRBB27的Xa27基因受细菌avrXa27基因诱导这一事实进一步证实了这一点。该方法可用于改造水稻对白叶枯病的广谱抗性和对水稻细菌性条斑病的增强抗性。该技术稍加修改后，可应用于控制其他作物的细菌性病害。

Description

水稻avrXa27基因对Xa27的诱导赋予抗水稻白叶枯病菌的广谱抗性和抗水稻细菌性条斑病菌的增强抗性

相关申请的交叉引用

本发明主张2007年1月29日提交的美国临时专利申请60/897,864的优先权。每件申请以引用方式纳入本文。

发明背景

一般而言，本发明涉及改造植物对细菌性病害的增强和广谱抗性的植物分子生物学和遗传学方法。

本文用于阐述本发明背景的出版物和其他材料，特别是提供实施附加细节的例子以引用方式纳入本文，为方便起见，在下文中按作者和日期进行引用，并在所附参考书目中按作者的字母顺序进行排列。

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)引起的水稻(Oryzasativa)白叶枯病(bacterial blight)是世界上最具破坏力的细菌性病害之一(Mew，1987)。水稻白叶枯病菌通过排水器进入感病品种，在上皮繁殖，随后迁移到木质部导管，引起整株感染(Ronald，1997)。抗病品种中无毒小种的生长减缓表现为细菌群体下降、病斑形成减少、防御基因表达活化、毗邻无毒细菌细胞的细胞壁和质膜改变(Young等人，1996；Gu等人，2005)。

细菌性条斑病(bacterial leaf streak)是另一种由水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)引起的水稻细菌性病害，它是水稻种植国家面临的新问题(Nino-Liu等人，2006)。水稻细菌性条斑病菌主要通过气孔进入叶片，在气孔下腔内繁殖，随后在薄壁组织的细胞间隙建群(Nino-Liu等人，2006)。与水稻白叶枯病菌一样，水稻细菌性条斑病菌也可通过伤口进入植物，但只限于叶肉组织的质外体，不侵入木质部(Ou，1985)。水稻细菌性条斑病菌从叶片的天然开口处呈链状或带状溢出，或在潮湿条件下呈小珠状溢出，这是细菌性条斑病的典型症状(Nino-Liu等人，2006)。

使用抗病品种是控制白叶枯病最经济有效的方法(Ogawa，1993)。水稻和水稻白叶枯病菌之间的小种专化性互作被认为遵循了经典的基因对基因概念(Flor，1971)。植物抗性(R)基因产物识别可能由病原菌的无毒(Avr)基因编码的激发分子或与其互作，导致级联防御反应的活化，有效抑制病原菌的侵入。目前，已从水稻鉴定出24种以上抗水稻白叶枯病菌的R基因或位点，其中大多数提供完整的小种专化抗性(Kinoshita，1995；Lin等人，1996；Zhang等人，1998；Khush和Angeles，1999；Gao等人，2001；Chen等人，2002；Yang等人，2003；He等人，2006)。已通过图位克隆分离出4种显性R基因即Xa21(Song等人，1995)、Xa1(Yoshimura等人，1998)、Xa26(Sun等人，2004)和Xa27(Gu等人，2005)和2种隐性R基因xa5(Iyer和McCouch，2004)和xa13(Chu等人，2006)。

很少开展关于细菌性条斑病控制方法的研究。和白叶枯病一样，实际上宿主的遗传抗性是细菌性条斑病最重要的控制措施，但到目前为止只局限于数量抗性(Gnanamanickam等人，1999；Sheng等人，2005；Tang等人，2000)。

与其他从双子叶植物分离的R基因不同的是，从水稻分离的白叶枯病抗性R基因编码差异极大的产物。Xa21和Xa26编码受体样蛋白(Song等人，1995；Sun等人，2004)。Xa21推定激酶结构域的生化分析揭示Xa21编码可在多个位点催化自身磷酸化的功能性丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Liu等人，2002)。Xa1基因产物含有核苷酸结合位点(NBS)和富含亮氨酸重复区域(LRR)，它是植物R蛋白最大类中的成员(Yoshimura等人，1998)。xa5基因编码转录因子IIA(TFIIA)的γ亚基，它是一个真核转录因子，没有先前已知的抗病作用(Iyer和McCouch，2004)。xa13基因编码MtN3样蛋白(Chu等人，2006)。该基因的显性等位基因在疾病易感性和花粉发育中可能都发挥作用(Chu等人，2006)。新近分离的Xa27基因编码一种新蛋白，它与水稻以外的生物的蛋白质没有明显的序列同源性(Gu等人，2005)。

目前，已从水稻白叶枯病菌分离出5种Avr基因，它们都属于III型效应物的AvrBs3家族。4种III型效应物AvrXa3(Li等人，2004；Lee等人，2005)、AvrXa7(Hopkins等人，1992；Vera Cruz等人，2000)、AvrXa10(Hopkins等人，1992；Zhu等人，1998)和avrXa27(Gu等人，2005)分别被宿主的4种关联显性R基因Xa3、Xa7、Xa10和Xa27识别。如果Xa5基因型易感水稻白叶枯病菌，推测III型效应物Avrxa5靶向野生型Xa5以产生致病性。Avrxa5在致病期间不能靶向突变蛋白xa5，因此含有纯合xa5等位基因的植物可抵抗或不易感水稻白叶枯病菌感染(Schornack等人，2006)。

Xa27和avrXa27是第一对分别从水稻和水稻白叶枯病菌分离的R基因和Avr基因(Gu等人，2005)。avrXa27是定位于细胞核的III型效应物AvrBs3/PthA家族的成员，具有含16.5个34氨基酸直接重复的中央重复结构域、含有3个核定位信号(NLS)基序的保守C末端区域和转录活化结构域(AD)。中央重复区域决定avrXa27激发的抗性特异性，而NLS基序和AD结构域则是Xa27依赖性的激发和抗性所需要的。出乎意料的是，Xa27作图群体的抗病亲本品系和感病亲本品系编码相同的Xa27蛋白。位于推测的Xa27/xa27启动子之间的核苷酸序列的多态性表明这两个等位基因可能存在不同的表达。的确，RNA印迹分析只检测到Xa27等位基因，而没有检测到xa27等位基因。进一步研究揭示，仅当水稻被携带avrXa27的细菌激发时，才发生Xa27等位基因表达，而当水稻被缺乏avrXa27的突变同基因株激发时，不发生Xa27等位基因表达。这些数据表明，Xa27对非亲和性病原菌的抗性特异性涉及Xa27等位基因在avrXa27效应物存在下的差异表达。

Avr基因具有毒性和宿主识别的双功能信号(Kjemtrup等人，2000；Alfano等人，2004；Yang等人，2000)。当Avr基因发挥其毒性功能时，它抑制亲和性互作中致病期间的宿主防御。但是，当Avr基因作为无毒基因时，它背叛病原菌，转而参与植物防御，被宿主的关联R基因识别，触发非亲和性互作中的过敏反应(HR)。发现植物表达的几种Avr蛋白的毒性功能可在缺乏关联R基因的植物中引起宿主防御抑制、细胞死亡或坏死(Gopalan等人，1996；McNellis等人，1998；Duan等人，1998；Chen等人，2000；Chen等人，2004；Hauck等人，2003)。在携带特异R基因的植物中，植物表达的Avr蛋白可激发HR或引起致死(Gopalan等人，1996；Scofield等人，1996；Tang等人，1996；Van den Ackerveken等人，1996；de Feyter等人，1998；McNellis等人，1998；Stevens等人，1998)。

有必要开发在植物中产生抗病性的方法，特别是开发产生抗白叶枯病的广谱抗性和抗细菌性条斑病的增强抗性的方法。

发明内容

一般而言，本发明提供了在植物中产生抗白叶枯病的广谱抗性和抗细菌性条斑病的增强抗性的方法。更具体地，本发明提供了一种产生抗水稻白叶枯病菌(水稻白叶枯病的致病菌)的广谱抵抗性和抗水稻细菌性条斑病菌(水稻细菌性条斑病的致病菌)的增强抗性的方法。Xa27是一种可诱导的水稻白叶枯病R基因，受宿主表达的关联avrXa27基因诱导。携带avrXa27转基因和野生型Xa27基因的水稻具有抗非亲和性病原菌和亲和性病原菌的抗性和抗水稻细菌性条斑病菌菌株L8的增强抗性。同样在IRBB27和携带pHM1avrXa27的L8之间的互作中观察到Xa27介导的抗水稻细菌性条斑病菌的增强抗性。IRBB27的Xa27基因受细菌avrXa27基因诱导这一事实进一步证实了这一点。该方法可用于改造水稻对白叶枯病的广谱抗性和对细菌性条斑病的增强抗性。该技术稍加修改后，可应用于控制其他作物的细菌性病害。

因此，在第一方面，本发明提供了具有稳定整合到其基因组的avrXa27基因的转基因植物。在一个实施方式中，avrXa27基因是从水稻白叶枯病菌分离的野生型基因。在另一实施方式中，avrXa27基因已被修饰。在另一实施方式中，所述基因是avrXa27样的III型效应物基因，其可为野生型或修饰型。本文使用的avrXa27基因一般意义上指这些实施方式中的每一种，除非上下文另有说明。

在第二方面，本发明提供了具有avrXa27基因和Xa27基因的植物。在一个实施方式中，以avrXa27基因转化含有Xa27基因的植物，产生所述植物。在另一实施方式中，以含有avrXa27基因的转基因植物与含有Xa27基因的植物杂交，产生所述植物。在一个实施方式中，含有Xa27基因的植物是含有该基因的天然植物，所述植物天然含有该基因或是来自常规育种。在另一实施方式中，含有Xa27基因的植物是Xa27基因的转基因植物。具有avrXa27基因和Xa27基因的植物对亲和性和非亲和性白叶枯病菌菌株具有广谱抗性，对细菌性条斑病菌菌株具有增强抗性。

在第三方面，本发明提供了一种通过在植物中表达avrXa27基因来诱导Xa27基因表达的方法。avrXa27基因在启动子控制下在植物中表达。在一个实施方式中，启动子是组成型启动子。在另一实施方式中，启动子是诱导型启动子。在另一实施方式中，启动子是组织特异性启动子。植物可为上述的任何植物。

在第四方面，本发明提供了一种在植物中产生抗白叶枯病的增强和广谱抗性的方法。该方法包括在含有Xa27基因的植物中表达avrXa27基因，其中avrXa27基因的表达诱导Xa27基因的表达。在一个实施方式中，avrXa27基因在感染致病病原菌前表达。在另一实施方式中，avrXa27基因在植物已被感染后表达。植物可为上述的任何植物。

在第五方面，本发明提供了一种在植物中产生抗细菌性条斑病的增强抗性的方法。该方法包括在含有Xa27基因的植物中表达avrXa27基因，其中avrXa27基因的表达诱导Xa27基因的表达。在一个实施方式中，avrXa27基因在感染致病病原菌前表达。在另一实施方式中，avrXa27基因在植物已被感染后表达。植物可为上述的任何植物。

依据本发明的植物可为稻(rice)、胡椒、番茄、豆类(bean)、棉花、黄瓜、甘蓝(cabbage)、大麦、燕麦(oat)、小麦、玉米和柑橘(citrus)。

附图简述

图1显示了pCPR1avrXa27的T-DNA区域的示意图。箭头表示Hpt基因的转录方向。LB，左边界；RB，右边界；T_35S，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S基因的终止子；P_35S，CaMV 35S基因的启动子；P_PR1，水稻PR1基因的启动子；avrXa27ORF，水稻白叶枯病菌PXO99^A的avrXa27编码区域；T_nos，胭脂碱合成酶(nos)基因的终止子。B，BamHI；N，NdeI；X，XbaI；F1，PR1启动子的正向引物；R1，PR1启动子的反向引物；F2，T_nos的正向引物；R2，T_nos的反向引物。

图2显示了转基因avrXa27植物的分子分析。从转基因植物(L1、L14、L24和L25)以及对照植物分离的2-5微克DNA以限制性内切酶NdeI和XbaI消化，或仅以BamHI消化。以来自avrXa27的³²P-标记的3234-bp BamHI片段探测DNA印迹。箭头表示pCPR1avrXa27中avrXa27编码区域的BamHI片段的位置。对照品系源自以pC1305.1转化的Nipponbare。

图3显示了avrXa27转基因在转基因植物中的表达。对4种选择的avrXa27转基因植物(L24、L1、L14和L25)以及对照植物进行RNA印迹分析。分离未接种植物(UI)或以水稻白叶枯病菌菌株PXO99^A接种3天后的植物(3DAI)的总RNA。每泳道上样约30μg总RNA。以亚甲蓝对RNA印迹进行染色，评价RNA上样。以来自avrXa27的³²P-标记的3234-bp BamHI片段探测RNA印迹。对照品系源自以pC1305.1转化的Nipponbare。

图4a和4b显示了F₁植株中avrXa27转基因对Xa27基因的特异诱导。图4a：Xa27在源自IRBB27与不同转基因植物(L24、L1、L14和L25)杂交的F₁植株中的表达。在两个实验中，每泳道上样约5μgmRNA，水稻泛素基因2(Ubi)的表达用作上样对照。以³²P-标记的全长Xa27cDNA探测RNA印迹。对照品系源自以pC1305.1转化的Nipponbare。图4b：来自L24的avrXa27转基因特异诱导Xa27，但没有特异诱导xa27。

图5显示IRBB27xL24的F₁植株具有抗非亲和性和亲和性水稻白叶枯病菌菌株的抗性。PXO99^A和AXO1947(pHM1avrXa27)是携带野生型Xa27基因的IRBB27植物上的非亲和性水稻白叶枯病菌菌株，而AXO1947是亲和性菌株。Nipponbare是野生型粳稻品种。L24是以Nipponbare为背景的avrXa27转基因品系。Nipponbare和L24易感所有受试的细菌菌株。F₁植株(F₁)源于IRBB27和L24之间的杂交。

图6a-6e显示了Xa27基因的表达提供抗水稻细菌性条斑病菌的增强抗性。图6a：以水稻细菌性条斑病菌菌株L8接种后第10天时IRBB27x对照品系、IR24xL24和IRBB27xL24的BC₃F₁植株叶片上的细菌性条斑病的病害表型。对照品系源自以pC1305.1转化的Nipponbare。图6b：注射浸润10天内，IRBB27x对照品系、1R24xL24和1RBB27xL24的BC₃F₁植株叶片上的水稻细菌性条斑病菌菌株L8的细菌群体。图6c：以水稻细菌性条斑病菌菌株L8(pHM1)(叶1和3)和L8(pHM1avrXa27)(叶2和4)接种后第3天(叶1和2)和第10天(叶3和4)时，IRBB27植物叶片上的细菌性条斑病的病害表型。图6d：注射浸润10天内，IRBB27植物叶片上水稻细菌性条斑病菌菌株L8(pHM1)和L8(pHM1avrXa27)的细菌群体。图6e：水稻细菌性条斑病菌菌株L8(pHM1)和L8(pHM1avrXa27)对IRBB27植物叶片中Xa27的诱导。泳道1，注射浸润后第0天时以L8(pHM1)浸润的IRBB27；泳道2，注射浸润后第0天时以L8(pHM1avrXa27)浸润的IRBB27；泳道3，注射浸润后第3天时以L8(pHM1)浸润的IRBB27；泳道4，注射浸润后第3天时以L8(pHM1avrXa27)浸润的IRBB27。

具体实施方式

植物对病原菌的小种专化抗性是由宿主的抗性(R)基因和病原菌的关联无毒(Avr)基因控制的。一般而言，本发明提供了在植物中产生抗白叶枯病的广谱抗性的方法。一般而言，本发明还提供了在植物中产生抗细菌性条斑病的增强抗性的方法。更具体地，本发明提供了一种产生抗水稻白叶枯病菌(水稻白叶枯病的致病菌)的广谱抗性和抗水稻细菌性条斑病菌(水稻细菌性条斑病的致病菌)的增强抗性的方法。Xa27是一种可诱导的水稻白叶枯病R基因，受宿主植物表达的关联avrXa27基因诱导。携带avrXa27转基因和野生型Xa27基因的水稻具有抗非亲和性病原菌和亲和性病原菌的抗性和抗水稻细菌性条斑病菌菌株L8的增强抗性。该方法可用于改造水稻对白叶枯病的广谱抗性。该技术稍加修改后，可应用于控制其他作物的细菌性病害。

细菌性病原菌与其植物宿主之间的互作一般分为两类：(1)亲和性互作(病原菌-宿主)，导致宿主植物出现细胞内细菌生长、症状和发生病害；和(2)非亲和性互作(病原菌-非宿主)，导致过敏反应，这是一种特殊类型的、没有出现日益严重的病害症状的非亲和性互作。与宿主植物发生亲和性互作时，细菌群体显著增加，并出现日益严重的症状。发生非亲和互作时，细菌群体没有增加，也没有出现日益严重的症状。

在本发明的一个实施方式中，以农杆菌介导的转化产生稳定的avrXa27转基因品系。也可使用本文描述的DNA构建体和技术人员熟知的技术制备稳定的转基因品系。αvrXα27基因在转基因品系中的表达在缺乏Xα27的Nipponbare中没有引起明显的HR或其他可见的应激表型。以RNA印迹分析揭示来自IRBB27(Xα27/Xα27)与αvrXα27转基因品系杂交的F₁植株中Xα27基因的组成型诱导。即使没有在免疫印迹分析中检测到转基因品系的avrXa27蛋白，但F₁植株仍表现出对非亲和性病原菌和亲和性病原菌的高度抗性。Xa27基因是1R24遗传背景中的显性抗性基因。但是，它在其他水稻遗传背景例如CO39中可能为半显性抗性基因(Gu等人，2004)。Xa27在源自IRBB27与Nipponbare杂交的F₁植株中也表现出对白叶枯病的中抗或半显性表型。本发明提供了一种在源自IRBB27与Nipponbare杂交的F₁植株中以及其他植物中产生Xa27基因对白叶枯病的增强抗性或完全抗性的新方法。即使Xa27基因具有抗多种水稻白叶枯病菌菌株的广谱抗性，IRBB27植物仍易感5种亲和性水稻白叶枯病菌菌株(Gu等人，2004)。本发明提供了一种产生抗亲和性水稻白叶枯病菌菌株的增强抗性的新方法，因此，改造的水稻比IRBB27植株具有更宽的抗谱。此外，本发明提供了一种产生抗细菌性条斑病菌的增强抗性的新方法，因此，改造的水稻与亲本植株相比，具有增强的抗性。总之，本发明提供了一种在水稻和其他植物中产生抗白叶枯病的增强抗性和广谱抗性的新方法，以及一种在水稻和其他植物中产生抗细菌性条斑病的增强抗性的新方法。

更具体地，本发明的方法包括以无毒基因稳定转化植物，该无毒基因具体为编码avrXa27蛋白的核酸，其可操作连接于可驱动基因在植物细胞内表达的启动子。多核苷酸如果在其天然状态下或以本领域技术人员熟知的方法操作时，可被转录和/或翻译产生mRNA和/或多肽或多肽片段时，即被认为“编码”多肽。反义链是这类核酸的互补链，可从反义链推导出编码序列。无毒基因的表达诱导Xa27基因，从而提供了抗亲和性和非亲和性病原菌(具体为黄单胞菌属)的广谱和增强抗性。

在一个实施方式中，avrXa27蛋白具有SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列(GenBank登录号AAY54168)。当在含有Xa27抗性基因的植物中表达时，avrXa27蛋白提供抗白叶枯病的广谱抗性和抗细菌性条斑病的增强抗性。

在又一实施方式中，avrXa27蛋白可为修饰的或可为活性片段。本文使用的“蛋白质修饰物或片段”与初级结构序列基本同源，但含有例如体内或体外化学和生化修饰或掺有非常见氨基酸，但一般不影响该蛋白质的生物学活性。这类修饰包括例如乙酰化、羧化、磷酸化、糖基化、泛素化、标记(例如以放射性核素进行的标记)、各种酶学修饰，这些修饰容易为本领域技术人员所理解。为方便起见，将使用avrXa27蛋白(或相应基因)用于本文的描述目的。但是，应理解的是，该蛋白质(或相应基因)可指野生型或修饰型avrXa27蛋白(或基因)。

其他的蛋白质修饰包括氨基酸置换。置换变体一般在蛋白质内的一个或多个位点处含有一个氨基酸与另一个氨基酸的交换，可设计用于调节多肽的一种或多种属性，例如对蛋白酶剪切的稳定性，而不损失其他功能或属性。可根据涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性，进行氨基酸置换。优选的置换是保守的置换，即一个氨基酸被替换为一个具有类似形状和电荷的氨基酸。保守置换为本领域技术人员所熟知，一般包括但不限于下列基团内的置换：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。

蛋白质结构中的某些氨基酸可被置换为其他氨基酸，而该蛋白质与结构例如抗体的抗原结合区域或底物分子的结合位点或与多肽互作的蛋白质的结合位点的交互结合能力没有明显损失。由于正是蛋白质的交互能力和性质决定了该蛋白质的生物功能活性，可对蛋白质序列及其DNA编码序列进行某些氨基酸的置换，仍得到具有类似属性的蛋白质。进行这类变化时，可考虑氨基酸的亲水指数。疏水氨基酸指数在赋予蛋白质交互生物学功能中的重要性一般为本领域所理解。或者，可根据亲水性有效地进行类似氨基酸的置换。亲水性在赋予蛋白质交互生物学功能中的重要性一般为本领域所理解(例如参阅美国专利4,554,101)。疏水指数或亲水性在设计多肽中的应用进一步在美国专利5,691,198中进行了描述。

本发明还提供了融合多肽，其包含avrXa27多肽及其片段和本领域知晓的多肽或其他蛋白质的片段。同源多肽可为两个或更多多肽序列之间的融合物或avrXa27序列和相关蛋白序列之间的融合物。同样，可构建表现出衍生蛋白的属性或活性组合的异源融合物。例如，配体结合结构域或其他结构域可在不同的新融合多肽或片段之间“交换”。这类同源或异源融合多肽可表现出例如改变的结合强度或特异性，可包括例如配偶体例如FLAG表位、免疫球蛋白、细菌β-半乳糖苷酶、trpE、蛋白A、β-内酰胺酶、α-淀粉酶、醇脱氢酶和酵母α-交配因子。

本发明的多核苷酸组成(composition)包括RNA、cDNA、基因组DNA、合成形式，可被化学或生化方式修饰，或含有非天然或衍生的核苷酸碱基，这些容易为本领域的技术人员理解。这类修饰包括例如标记、甲基化、以类似物置换一个或多个天然核苷酸、核苷酸间修饰例如不带电的连接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电的连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、悬垂部分(例如多肽)、嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂和修饰键(例如α-异头核酸等)。模拟多核苷酸经氢键和其他化学相互作用结合到指定序列的能力的合成分子也包括在内。这类分子为本领域知晓，包括例如分子骨架中的磷酸酯键被替换为肽键的分子。本发明的多核苷酸可为分离的或基本上纯的。“分离的”或“基本上纯的”核酸或多肽是基本同其他细胞组分分离开的核酸或多肽，其中其他细胞组分在自然状态下伴随天然序列或蛋白质，例如核糖体、聚合酶、许多其他人类基因组序列和蛋白质。该术语包括已从其天然环境除去的核酸序列或蛋白质，包括重组或克隆DNA分离物和化学合成类似物或以异源系统生物合成的类似物。

在一个实施方式中，编码avrXa27蛋白的核酸具有SEQ ID NO：1列出的核酸序列(GenBank登录号AY986494)。还预见了编码该蛋白质的其他核酸序列，例如源自遗传密码简并性的核酸。此外，还预见了编码该被修饰的蛋白质的核酸序列。

需要时，可优化无毒序列和任何其他基因，以增加在转化植物中的表达。即可使用植物优选的密码子合成这些核苷酸序列，提高表达。本领域有合成植物优选基因的方法。例如参阅美国专利5,380,831、美国专利5,436,391和Murray等人(1989)，其中每篇以引用方式纳入本文。

若可操作连接于在植物中有功能的启动子和/或其他调控序列时，本发明无毒基因的核苷酸序列可用于任何植物的基因操作。术语“启动子”或“调控元件”系指位于转录起始点上游或下游的区域或序列决定子，参与对RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合，以启动转录。“植物启动子”是可在植物细胞内启动转录的启动子。这类启动子无需为植物来源，例如源自植物病毒的启动子例如CaMV35S启动子可用于本发明。“调控序列”系指影响基因表达(包括基因转录、信使RNA的翻译、剪切、稳定性等)的序列。所谓“可操作地连接”是指启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列启动和介导对应于第二序列的DNA序列的转录。一般而言，可操作地连接是指相连的核酸序列是紧邻的，并在需要连接两个蛋白质编码区域时也是紧邻的，并处于同一阅读框内。

本发明的核苷酸序列提供在表达盒内，用于在目的植物中表达。“表达盒”系指核酸构建体，当它被导入到宿主细胞后，会导致RNA或多肽的分别转录和/或翻译。该定义明确地包括不翻译或不能翻译的反义构建体或有义构建体。“构建体”是从天然基因分离的核酸分子或已被修饰成含有核酸片段的核酸分子，其中这些核酸片段以自然状态下不会存在的方式被合并和并列在一起。这类表达盒含有可操作连接于本发明无毒基因序列的5′和3′调控序列。表达盒还可含有至少一个待共转化到生物体内的附加基因。或者，附加基因可提供到多个表达盒上。

一般而言，从5′-3′的转录方向，表达盒含有在植物中具有功能的转录和翻译起始区、本发明无毒基因序列、转录和翻译终止区。对于植物宿主而言，转录起始区即启动子可为天然的或类似的，或为外源的或异源的。此外，启动子可为天然序列或者为合成序列。所谓“外源”是指转录起始区不存在于导入转录起始区的天然植物，或者在转化后位于基因组上的不同位点。本文使用的嵌合基因包含可操作连接于转录起始区的编码序列，其中转录起始区与编码序列是异源的。

实施本发明时可使用许多启动子，其中包括组成型、诱导型、病原菌诱导型、伤口诱导型和组织特异性启动子。例如参阅美国专利7,109,397。例如，为了实现过表达，可使用植物启动子片段，指导基因在再生植株的所有组织中表达。这类启动子在本文中被称为“组成型”启动子，它们在大多数环境条件、发育或细胞分化状态下都具有活性。

广泛用于诱导转基因表达的一些组成型启动子的实例包括但不限于来自根癌农杆菌的胭脂碱合成酶(NOS)基因(美国专利5,034,322)、花椰菜花叶病毒(CMV)35S和19S启动子(美国专利5,352,605)、源自己知在大多数细胞类型中表达的几种肌动蛋白基因中任何一种的启动子(美国专利6,002,068)、泛素启动子(已知可在许多细胞类型中积累的基因产物)、增强型35S启动子(美国专利5,106,739)、双35S启动子、来自玄参花叶病毒的FMV启动子(美国专利5,378,619)、RI T-DNA启动子(美国专利5,466,792)、章鱼碱T-DNA启动子(美国专利5,428,147)、醇脱氢酶1启动子(Callis等人，1987)、patatin启动子B33(Rocha-Sosa等人，1989)、E8启动子(Deikman和Fishcer，1988)、β-伴大豆球蛋白启动子(Tierney等人，1987)、酸性几丁质酶启动子(Samac等人，1990)、拟南芥组蛋白H4启动子(美国专利5,491,288)、或用于单子叶植物基因表达的重组启动子(美国专利5,290,924)。包括用于单子叶植物有效表达的调控元件的其他组成型调控元件也是本领域所知晓的，例如pEmu启动子和基于水稻肌动蛋白-15′区域的启动子(Last等人，1991；McElroy等人，1991；McElroy等人，1990)。

诱导型启动子是在诱导物作用下可直接或间接活化一种或多种DNA序列或基因转录的启动子。如果没有诱导物，DNA序列或基因不会被转录。诱导物可为化学剂，例如代谢物、生长调节剂、除草剂或酚类化合物，或直接施加给植物的生理应激，例如冷、热、盐、毒素，或通过病原菌或致病剂例如病毒或真菌的作用。可通过向细胞或植物外部施加诱导物例如通过喷雾、浇水、加热或通过暴露于致病病原菌使含有诱导型启动子的植物细胞暴露于诱导物。诱导型启动子系统的一个实例使用XVE转录因子(美国专利6,784,340)。诱导型启动子的另一实例是病原菌诱导型启动子。这类启动子包括来自致病相关蛋白(例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶)的启动子，感染病原菌后它们被诱导表达(例如参阅Redolfi等人，1983；Uknes等人，1992和Van Loon，1985)。在一个实施方式中，启动子是水稻PR1基因的启动子(Gu等人，2005；SEQ ID NO：13)。

或者，使用暴露于植物激素例如生长素时可被诱导的植物启动子来表达本发明的核酸。例如，本发明可使用大豆(Glycine max L.)的生长素应答元件E1启动子片段(AuxREs)(Liu，1997)；生长素应答拟南芥GST6启动子(也应答唾液酸和过氧化氢)(Chen等人，1996)；来自烟草的生长素诱导型parC启动子(Sakai等人，1996)；植物生物素应答元件(Streit和Phillips，1997)和应答应激激素脱落酸的启动子(Sheen，1996)。

此外，诱导型启动子包括以组织特异性方式在植物的选择组织内调控目的基因的启动子。处于发育控制下的组织特异性启动子的实例包括仅在某些组织例如果实、种子、根或花中启动转录的启动子。这类组织特异性启动子的实例为本领域熟知(美国专利5,750,385)，包括茎尖分生组织中表达的H4A748启动子(Atanassova等人，1992)。RCc2和RCc3启动子指导水稻的根部特异性基因转录(Xu等人，1995)。

因此，从5′-3′转录方向，表达盒含有在植物中具有功能的转录和翻译起始区、编码本发明无毒蛋白的核苷酸序列、转录和翻译终止区。终止区可与转录起始区为同一来源、与目的DNA序列为同一来源或可源自另外的来源。可从根癌农杆菌的Ti质粒获得方便的终止区，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。同样参阅Guerineau等人，(1991)；Proudfoot(1991)；Sanfacon等人，(1991)；Mogen等人，(1990)；Munroe和Jacobson(1990)；Joshi(1987)。

其他的序列修饰已知可提高细胞宿主内的基因表达。这些序列修饰包括消除编码假多腺苷酸化信号的序列、外显子-内含子剪切位点信号、转座子样重复和可能有害于基因表达的其他良好表征的序列。序列的G-C含量可调节至特定细胞宿主的平均水平，其水平参考宿主细胞内表达的已知基因进行计算。如果可能，修饰序列以避免预测的发夹二级mRNA结构。

表达盒在表达盒构建体中还可含有5′前导序列。这类前导序列可增强翻译。翻译前导序列为本领域知晓，包括：小RNA病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区)(Elroy-Stein等人，1989)；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Allison等人，1986)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak和Samow，1991)；来自苜蓿花叶病毒外壳蛋白mRNA的未翻译前导序列(AMV RNA 4)(Jobling和Gehrke，1987)；烟草花叶病毒前导序列(Gallie等人，1989)；和玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel等人，1991)。同样参阅Della-Cioppa等人，(1987)。还可使用其他已知可增强翻译的方法，例如内含子等。

制备表达盒时，可操作各种DNA片段，以提供具有适宜定向和需要时适宜阅读框的DNA序列。为了实现这一目的，可使用衔接头或接头连接DNA片段，或可涉及其他操作，以提供适宜的限制酶切位点、多余DNA的除去、限制酶切位点的除去等。出于该目的，可涉及体外诱变、引物修复、限制酶切、退火、替代例如转换和颠换。

包含本发明基因序列(例如启动子或编码区域)的载体一般包含赋予植物细胞选择表型的标记基因。例如，标记基因可编码杀生物剂抗性，特别是抗生素抗性，例如卡那霉素、G418、博莱霉素、潮霉素抗性，或除草剂抗性，例如氯磺隆或Basta抗性。可在瞬时测定中使用任何可评分或可筛选的标记基因。用于本发明启动子或启动子片段的瞬时分析的优选标记基因包括GUS基因(美国专利5,599,670)或GFP基因(美国专利5,491,084)。含有可操作连接于标记基因的启动子或启动子片段的构建体被递送到组织内，根据标记基因以适宜的机制分析组织。使用定量或定性分析作为工具，评估启动子或启动子片段可操作连接于稳定植物中具有农艺价值的基因时的潜在表达概况。

一旦核酸已被克隆到表达载体上，可使用常规转化方法将它导入到植物细胞。术语“植物细胞”旨在涵盖源自植物包括未分化组织例如愈伤组织和悬浮培养以及植物种子、花粉或植物胚的任何细胞。适合转化的植物组织包括叶组织、根组织、分生组织、原生质体、下胚轴、子叶、盾片、茎尖、根、幼胚、花粉和花药。“转化”是指通过外部施加来自具有不同基因型的另一种细胞的重组DNA对细胞基因组进行的定向修饰，导致重组DNA被吸收并整合到对象细胞的基因组上。可以这样的方式得到遗传修饰的植物、植物细胞、植物组织、种子等。

含有本发明无毒序列的DNA构建体可用于转化任何植物，并可通过各种常规技术导入所需植物宿主的基因组上。转化各种高等植物物种的技术是熟知的，并在技术和科学文献中进行了描述。例如参阅Weising等人(1988)。转化方案可依靶向转化的植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)而异，而这是技术人员所熟知的。例如，可使用植物细胞原生质体电穿孔和显微注射等技术将DNA构建体直接导入植物细胞的基因组DNA，或者可使用冲击法(ballistic method)例如DNA粒子轰击法将DNA构建体直接导入植物组织。或者，DNA构建体可与适宜的T-DNA侧翼区结合，导入到常规的根癌农杆菌宿主载体上。当细胞被细菌感染时，根癌农杆菌宿主的毒性功能将指导构建体和邻近的标记基因插入到植物细胞DNA上。

显微注射技术为本领域知晓，并在科学和专利文献中进行了很好的描述。Paszkowski等人(1984)描述了使用聚乙二醇沉淀法导入DNA构建体。Fromm等人(1985)和美国专利5,384,253描述了电穿孔技术。Klein等人(1987)；Tomes等人(1995)；美国专利4,945,050；美国专利5,015,580；美国专利5,550,318；美国专利5,538,880；美国专利6,160,208；美国专利6,399,861和美国专利6,403,865描述了微弹轰击技术。

根癌农杆菌介导的转化技术，包括双元载体的解毒(disarming)和使用，在科学文献中得到了很好的描述。例如参阅Horsch等人(1984)；Fraley等人(1983)；美国专利5,563,055；美国专利5,824,877；美国专利5,591,616；美国专利5,981,840；美国专利6,384,301和美国专利7,112,721。

可培养源自以上转化技术中任何一种的转化植物细胞，再生成具有转化基因型和所需表型的完整植株，例如转基因植物。“转基因植物”是导入外源DNA的植物。“转基因植物”包括转基因植物有性繁殖或无性繁殖产生的继续携带外源DNA的所有后代、杂交种和杂种。再生技术依赖某些植物激素在组织培养生长培养基中的操作，一般依赖于与所需核苷酸序列一同导入的杀生物剂和/或除草剂标记基因。Evans等人(1983)；Binding(1985)；Vasil(1984)和Vasil(1986)描述了来自培养的原生质体的植物再生。还可从植物愈伤组织、外植体、器官或部分的愈伤组织、外植体、器官得到再生。Klee等人(1987)概括地描述了这类再生技术。已知可从培养的细胞或组织再生几乎所有植物。

再生的方法依植物物种而异，但一般首先提供转化原生质体的混悬液或含有转化外植体的培养皿。形成愈伤组织，可从愈伤组织诱导出茎，随后生根。或者，可在愈伤组织上诱导胚形成。这些胚作为天然胚开始发育，形成植株。培养基一般含有各种氨基酸和激素，例如生长素和细胞因子。向培养基加入谷氨酸和脯氨酸也是有利的，特别是对于玉米和苜蓿等物种。有效的再生取决于培养基、基因型和培养时间。如果控制这三个变量，再生通常是可再现和可重复的。

上述转化方法一般用于产生稳定整合表达盒的转基因品种。表达盒被稳定整合到转基因植物后，它可通过有性杂交转移到其他植株。在一个实施方式中，转基因品种随后与另一(非转化或转化)品种杂交，以产生新的转基因品种。或者，可使用植物育种领域熟知的传统回交技术将利用上述转化技术改造到特定棉花品系上的遗传性状转移到另一品系。例如，可使用回交方法将改造的性状从公共的、非优良品种转移到优良品种，或从基因组含有外源基因的品种转移到不含有该基因的单个品种或多个品种。根据上下文，本文使用的“杂交”可指简单的X与Y的杂交，或回交过程。根据待杂交的物种，可使用许多标准育种技术中的任何一种。

一旦产生这一类型的转基因植物，这些植物本身可按照常规方法进行培养。当然，可从转基因植物回收转基因种子。随后可使用常规方法将这些种子种植到土壤中进行培养，以产生转基因植株。

依据本发明，产生含有avrXa27基因的转基因植物。在一个实施方式中，以本文描述的avrXa27基因转化水稻细胞，产生转基因植物。在一方面，转化的水稻细胞不含有Xa27基因。在第二方面，转化的水稻细胞可含有Xa27基因，这样就得到同时含有avrXa27基因和Xa27基因的转基因植物。含有Xa27基因的水稻细胞可源自天然含有Xa27基因的水稻品种，或源自依据本文描述原理已被稳定转化从而含有Xa27基因的水稻品种。SEQID NO：4列出了Xa27蛋白，SEQ ID NO：3列出了Xa27基因的一个实施方式。还预见了编码Xa27蛋白的其他核酸序列，例如源自遗传密码简并性的核酸。与avrXa27蛋白一样，Xa27蛋白可为被修饰的蛋白质，只要它保留其活性。蛋白质修饰包括本文对avrXa27蛋白所描述的蛋白质修饰。还预见了编码所述被修饰的蛋白质的核酸序列。

根据本发明，提供了具有avrXa27基因和Xa27基因的植物。在一个实施方式中，所述植物是含有这两种基因的转基因植物。在一个方面，使用例如本文描述的技术以avrXa27基因和Xa27基因同时转化植物，产生转基因植物。在另一方面，使用例如本文描述的技术首先以avrXa27基因或Xa27基因转化植物，产生转基因植物，随后使用例如本文描述的技术以另一基因转化该转基因植物。在另一实施方式中，使用常规植物育种技术以含有avrXa27基因的转基因植物与含有Xa27基因的植物杂交，产生所述植物。在一个实施方式中，含有Xa27基因的植物是含有该基因的天然植物，其中该基因或是天然含有，或是来自常规育种。在另一实施方式中，所述植物是含有Xa27基因的转基因植物。这些植物具有抗白叶枯病致病菌的亲和性和非亲和性细菌菌株的广谱抗性。这些植物还具有抗细菌性条斑病的增强抗性。

依据本发明，提供了一种通过在植物中表达avrXa27基因来诱导Xa27基因表达的方法。在一个实施方式中，avrXa27基因在还含有Xa27基因的植物中表达。该植物可为转基因植物或可通过常规育种产生。avrXa27基因在本文所述启动子的控制下在植物中表达。在一个实施方式中，启动子是组成型启动子，其中avrXa27基因在植物生长期间的各个时期表达。在另一实施方式中，启动子是诱导型启动子，其中avrXa27基因在植物生长期间在诱导物的存在下被诱导表达。在另一实施方式中，启动子是组织特异性启动子，其中avrXa27基因表达局限于植物生长期间具有该活性启动子的组织。

同样依据本发明，提供了一种在植物中产生抗白叶枯病的增强和广谱抗性和抗细菌性条斑病的增强抗性的方法。该方法包括在含有Xa27基因的植物中表达avrXa27基因，其中avrXa27基因的表达诱导Xa27基因的表达。在一个实施方式中，avrXa27基因在感染致病病原菌前表达。在另一实施方式中，avrXa27基因在植物已被感染后表达。avrXa27基因的表达可为组成型、诱导型或组织特异性的。如果表达是组成型的，avrXa27基因在植物生长期间的各个时期表达。如果表达是诱导型的，avrXa27基因在植物生长期间因诱导物在植物中的存在而被诱导表达。如果表达是组织特异性的，avrXa27基因表达局限于植物生长期间具有活性启动子的组织。avrXa27基因表达引起的Xa27基因表达产生抗亲和性和非亲和性病原菌菌株引起的白叶枯病的广谱抗性。avrXa27基因表达引起的Xa27基因表达还产生抗细菌性条斑病的增强抗性。

本文描述的技术稍加修饰后，应用于控制其他植物的细菌性病害，这些植物包括但不限于胡椒、番茄、豆类、棉花、黄瓜、甘蓝、大麦、燕麦、小麦、玉米和柑橘。除1例以外(来自茄科罗尔斯通氏菌(Ralstoniasolanacearum)的Brgll)(Cunnac等人，2004)，III型效应物的AvrBs3/PthA家族成员均只存在于黄单胞菌属(Lahaye和Bonas，2001)。来自野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种(X.campestris pv.vesicatoria，一种胡椒和番茄的病原菌)的AvrBs3(Bonas等人，1989)、来自地毯草黄单胞菌柑桔致病变种(X.axonoposis pv.citri，一种柑橘病原菌)的PthA(Swarup等人，1991)、来自野油菜黄单胞菌锦葵致病变种(X.campestris pv.malvacearum，一种棉花病原菌)的Avrb6(De Feyter和Gabriel，1991)、来自水稻白叶枯病菌(一种水稻病原菌)的AvrXa7或AvrXa10(Hopkins等人，1992)的无毒活性激发携带相应R基因的抗性植物的HR和抗性。这些无毒效应物在宿主植物的表达激发抗这些病原细菌的R基因介导的抗性。应注意的是，AvrBs3/PthA家族的一些成员不仅表现出无毒活性，还有助于细菌的毒性(Swarup等人，1991；Yang等人，1996；Bai等人，2000；Marois等人，2002)。因此，应使用诱导型启动子(例如病原菌诱导型启动子)控制这些Avr基因在携带相应R基因的植物宿主内的表达。

除非另有说明，本发明的实施采用了化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学的常规技术，它们都位于本领域的技术内。例如参阅Maniatis等人，1982，Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，2nd Ed.(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Sambrook和Russell，2001，Molecular Cloning，3rd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York)；Ausubel等人，1992)，Current ProtocolsinMolecular Biology(John Wiley&Sons，including periodic updates)；Glover，1985，DNA Cloning(IRL Press，Oxford)；Russell，1984，Molecular biology ofplants：a laboratory course manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.)；Anand，Techniques for the Analysis of Complex Genomes，(Academic Press，New York，1992)；Guthrie和Fink，Guide to Yeast Geneticsand Molecular Biology(Academic Press，New York，1991)；Harlow和Lane，1988，Antibodies，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical GuideTo Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology(AcademicPress，Inc.，N.Y.)；Methods In Enzymology，Vols.154and 155(Wu等人.eds.)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell，eds.，1986)；Riott，EssentialImmunology，6th Edition，Blackwell Scientific Publications，Oxford，1988。

实施例

参照下列实施例对本发明进行了描述，提供的这些实施例用于阐释，而绝非用于限制本发明。使用了本领域熟知的标准技术或下文具体描述的技术。

实施例1

材料和方法

质粒、细菌菌株和生长条件

本研究使用的质粒是粘粒99-avrXa27-20(Gu等人，2005)和pHM1avrXa27、克隆载体pGEM-T-easy(Promega，WI 53711，USA)和植物转化载体pC1305.1(CAMBIA，Canberra，Australia)和pCPR1avrXa27(本文描述了制备方法)。本研究使用的细菌菌株是大肠杆菌菌株DH10b(Carlsbad，CA92008，USA)、根癌农杆菌菌株AGL1(Lazo等人，1991)、水稻白叶枯病菌菌株PXO99^A、AXO1947、AXO1947(pHM1avrXa27)、K202、ZHE173和CIAT1185以及水稻细菌性条斑病菌菌株L8(pHM1)和L8(pHM1avrXa27)。大肠杆菌以Luria-Bertani培养基37℃培养；根癌农杆菌菌株以YEB培养基28℃培养；水稻白叶枯病菌菌株和水稻细菌性条斑病菌菌株以PSA培养基28℃培养(Gu等人，2004)。采用电穿孔将质粒导入大肠杆菌、根癌农杆菌、水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌菌株(Sambrook等人，1989)。

植物材料和生长条件

本研究使用的水稻品系是Xa27的近等基因系IRBB27(Gu等人，2004)和Nipponbare品种。以26℃(夜)到32℃(日)的温室培养水稻，其中包括以水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌菌株接种的水稻。

植物转化

按照前人描述方法对Nipponbare进行根癌农杆菌介导的转化(Yin和Wang，2000)。简而言之，源自成熟胚盾片且生长旺盛的胚性愈伤组织与携带pCPR1avrXa27的根癌农杆菌菌株AGL1进行共培养。共培养后，以含有250mg/L头孢噻肟、200mg/L氨苄西林、2mg/L 2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)和50mg/L潮霉素的NB₀培养基26℃暗处培养水稻组织3-4周。抗潮霉素的愈伤组织以新鲜选择培养基传代培养两周；随后转移到含有1mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、2mg/L萘乙酸(NAA)、5mg/L脱落酸(ABA)和50mg/L潮霉素的NB₀培养基，培养2-3周。表现出潮霉素抗性的致密白色胚性愈伤组织转移到含有2mg/L 6-BA、1mg/L吲哚乙酸(IAA)、1mg/L NAA、1mg/LKT(激动素)和50mg/L潮霉素的NB₀培养基上，采用14小时光照、10小时黑暗的周期在26℃下培养胚性愈伤组织。再生植株随后转移到罐中土壤，温室培养。

白叶枯病接种

使用剪叶法进行白叶枯病接种(Kauffrnan等人，1973)。简而言之，水稻白叶枯病菌菌株以PSA培养基(10g/L蛋白胨、10g/L蔗糖、1g/L谷氨酸、16g/L细菌培养用琼脂，pH 7.0)培养2-3天。细菌细胞以无菌水混悬，菌体密度OD₆₀₀为0.5。使用蘸取接种物的剪刀距叶片顶部5-6cm处剪取叶片，将细菌细胞混悬液施用给每个分蘖的两片最嫩完全展开叶。接种两周后测量病斑长度(LL)。病害症状依次分为抗病(R，LL＜3.0cm)，中度抗病(MR，3.0cm＜LL＜6.0cm)，中度感病(MS，6.0cm＜LL＜9.0cm)和感病(S，LL＞9.0cm)(Amante-Bordeos等人，1992)。

细菌性条斑病接种

为了进行细菌性条斑病接种，水稻细菌性条斑病菌菌株L8、L8(pHM1)或L8(pHM1avrXa27)以含有适宜抗生素的PSA培养基培养2-3天。细菌细胞以无菌水混悬，菌体OD₆₀₀密度为0.5。6周时，使用无针注射器以细菌混悬液浸润叶片对水稻进行接种(Schaad等人，1996)。使用Makino等人(2006)报道的方法，稍加修改，测定接种植物的细菌群体。简而言之，取下水稻叶片的浸润区域，以5ml无菌水研磨。制备逐级稀释液，涂抹到含有适宜抗生素的PSA琼脂平板上。28℃下接种平板，直到可计数单个菌落。随后估算每叶片的CFU数目，使用来自重复实验的菌落数目计算标准差。实验重复5次。

DNA印迹分析

从叶片提取水稻基因组DNA(Dellaporta等人，1984)。约2μg的水稻DNA以适宜的限制性内切酶消化，随后以0.65-0.8％琼脂凝胶电泳分离。按照标准方法进行DNA印迹分析(Sambrook等人，1989)。以来自AmershamBiosciences的Rediprime^TMII进行探针标记和信号检测。

RNA印迹分析

使用QIAGEN的RNeasy Plant Mini Kit从水稻叶片分离总RNA。每份样品约20μg总RNA用于RNA印迹分析。按照标准方法进行RNA印迹分析(Sambrook等人，1989)。通过溴化乙锭(EtBr)染色或通过与水稻泛素1(Ubi)基因的杂交评估RNA上样。按照上述方法进行探针标记和信号检测。

实施例2

pCPR1avrXa27的构建

基于CAMBIA载体pC1305.1构建pCPR1avrXa27。来自粘粒99-avrXa27-20(Gu等人，2005)avrXa27基因的3482-bp基因组克隆(包括3411-bp的全长编码序列(SEQ ID NO：5))被亚克隆到pGEM-T-easy载体(Promega)上，生成中间构建体pTavrXa27。pTavrXa27中avrXa27基因的3234-bp BamHI片段被替换为来自pZWavrXa27(Gu等人，2005)的avrXa27F2H基因的BamHI片段，生成pTZWavrXa27。分离来自pTZWavrXa27(含有avrXa27基因(SEQ ID NO：I))的Sac II-AseI片段，经平端化后，克隆到pC1305.1中的水稻PR1启动子(Gu等人，2005；SEQ ID NO：5)下游，产生pCPR1avrXa27(图1)。用于测定转基因植物中PR1启动子和胭脂碱合成酶基因(Tnos)存在的引物对分别是PF/PR(5′-CCATGATTACGAATTCGAGCTCGG-′3(SEQ ID NO：6)和5′-AAGAAGCGACGGATCGAACTGAC-3′(SEQ ID NO：7))以及TF/TR(5′-CGAAGAGGAGCTCGCATGGTTGAT-3′(SEQ ID NO：8)和5′-CACTGATAGTTTAATTCCCGATCTAG-3′(SEQ ID NO：9))。

实施例3

avrXa27转基因植物的生成

以双元质粒pCPR1avrXa27(图1)对Nipponbare品种进行农杆菌介导的转化，产生avrXa27转基因植物。pCPR1avrXa27在其T-DNA区携带P_PR1-αvrXα27-Tnos融合基因。一共产生34株独立的转基因T₀植株。但是，经过分子分析，仅发现4株T₀植株(L1、L14、L24和L25品系)携带完整的αvrXα27基因。在这4株转基因植株中(图2，泳道5、7、9和11)，DNA印迹分析均检测到对应于αvrXα27编码区域(图1)的预计BαmHI片段的3.2-kb条带。在L24(图2，泳道8)中检测到对应于预计Nde I-XbαI片段的4.5-kb条带，该片段包含PR1启动子和avrXa27编码区域(图1)。但是，没有在L1、L14和L25中检测到这条4.5-kb的Nde I-XbαI条带。相反，它们都携带分子大小大于4.5kb的Nde I-XbαI条带(图2，泳道4、6和10)。为了进一步鉴定这些转基因植物中的avrXa27基因，我们分别采用引物对F1/R1和F2/R2经PCR分离P_PR1-αvrXα27-Tnos融合基因的5′启动子区域和3′终止子区域。PCR扩增产物的DNA序列表明L24携带完整的5′启动子和3′终止子。L1、L14和L25也含有完整的3’终止子区域。但是，它们在PR1启动子5′端的少数几个碱基对处发生轻微突变，导致XbαI位点丢失。这些avrXa27转基因植物的形态与非转基因的Nipponbare或以空载体pC1305.1转化的对照品系的形态类似。avrXa27转基因植物进行自交，选择纯合后代用于进一步研究。

实施例4

avrXa27基因在转基因植物中的表达

RNA印迹分析表明，avrXa27转基因在L1、L14、L24和L25中呈组成型表达(图3)。未接种(UI)植株和以水稻白叶枯病菌菌株PXO99^A接种的植株在接种后第三天(3DAI)的avrXa27表达没有明显差异。RNA印迹分析检测到的全长avrXa27转录物为约4kb的杂交条带。avrXa27转基因品系和对照品系用作花粉供体，分别与IRBB27(具有IR24背景的近等基因系)和IR24杂交。

实施例5

L24白叶枯病抗性的病害评估

为了检测水稻的avrXa27基因是否具有毒性和/或无毒功能，我们以5种亲和性和1种非亲和性水稻白叶枯病菌菌株接种纯合的L24T₂植株。感染细菌时，avrXa27基因在Nipponbare中的表达没有表现出任何的毒性功能。相反，在这5种亲和互作和1种非亲和互作中(表1)，L24T₂植株上的白叶枯病病斑比未转化的野生型植株略短。这些数据表明宿主的avrXa27基因对水稻白叶枯病菌的致病没有或只有极弱的毒性功能。

表1

Nipponbare的avrXa27转基因对亲和性或非亲和性水稻白叶枯病菌菌株均没有表现出任何毒性功能^a

病斑长度(cm)和抗性评分^b

品系	PXO99^A	AXO1947	AXO1947(PHM1avrXa27)	K202	ZHE173	CIAT1185
品系	PXO99^A	AXO1947	AXO1947(PHM1avrXa27)	K202	ZHE173	CIAT1185	Nipponbare	20.8±4.7(S)	24.5±8.3(S)	18.9±4.2(S)	18.9±4.2(S)	15.6±4(S)	4.7±2.5(MR)
L24	20±2.4(S)	19.7±3(S)	16.9±2.5(S)	16.5±3.1(S)	14±3.2(S)	3.7±2.5(MR)	Nipponbare	20.8±4.7(S)	24.5±8.3(S)	18.9±4.2(S)	18.9±4.2(S)	15.6±4(S)	4.7±2.5(MR)

^a六周龄植株以水稻白叶枯病菌接种。对于每种水稻白叶枯病菌菌株，至少接种来自四棵植株的16片叶。病斑长度是16片受感染叶片的平均值。示出了均值的标准差。

^b括号中抗性评分的标准差。R，抗病，0cm＜病斑长度＜3.0cm；MR，中度抗病，3.0cm＜病斑长度＜6.0cm；MS，中度感病，6.0cm＜病斑长度＜9.0cm；S，感病，病斑长度＞9.0cm

实施例6

水稻avrXa27转基因对Xa27基因的诱导

我们以前发现IRBB27(Xa27/Xa27)中的Xa27受非亲和水稻白叶枯病菌菌株的III型效应物avrXa27的特异诱导。为了研究水稻avrXa27基因是否具有类似功能，我们将IRBB27分别与avrXa27品系和对照品系进行杂交。采用RNA印迹分析源自这些杂交的F₁植株的分离信使RNA(mRNA)，检测Xa27的诱导。Xa27在源自IRBB27与avrXa27转基因品系杂交的F₁植株中被组成型诱导(图4a，泳道2-5)。与IRBB27xL24的F₁植株的Xa27高表达相比，源自IRBB27与L1、L14或L25杂交的F₁植株的Xa27表达要低些(图4a，泳道2-5)。源自IRBB27与对照转基因植株杂交的F₁植株中没有检测到信号(图4a，泳道1)。

IR24(xa27/xa27)携带Xa27基因的感病等位基因，该等位基因与Xa27具有相同的编码区域，但不受携带avrXa27的水稻白叶枯病菌菌株的诱导(Gu等人，2005)。这种抗性特异性在水稻中的Xa27(或xa27)和avrXa27基因中得到了保留。没有在源自IR24和L24杂交的F₁植株中诱导出IR24的感病等位基因xa27(图4b，泳道4)。我们的结果表明，就特异诱导Xa27表达而言，水稻avrXa27基因与细菌的avrXa27基因具有相同的功能。这些结果符合并补充了我们以前的发现，即Xa27在III型效应物avrXa27的存在下被特异诱导。在本例中，水稻avrXa27基因的表达产生avrXa27。

实施例7

来自IRBB27与avrXa27品系杂交的F₁植株的病害评估

我们以前的研究表明，处于水稻PR1启动子控制下的Xa27异位表达提供了抗非亲和性和亲和性水稻白叶枯病菌菌株的抗性(Gu等人，2005)。为了研究水稻avrXa27基因对Xa27的诱导是否起了类似于抗白叶枯病的作用，我们对源自IRBB27植株(F)与avrXa27转基因品系(F)杂交的F₁植株的白叶枯病抗性进行了病害评估。IRBB27x L24的F₁植株以Xα27-非亲和菌株(PXO99^A)或Xa27-亲和菌株(AXO1947、K202和ZHE173)接种。源自IRBB27与L24杂交的F₁植株不仅表现出对PXO99^A的完全抗性，还提供了抗3种原本为亲和菌株的广谱完全抗性(图5和表1)。在源自IRBB27与L1、L14、L24和L25回交的BC₁F₁植株上也观察到抗亲和菌株AXO1947的增强抗性(表2)。在对照实验中，IRBB27提供了抗非亲和性菌株PXO99^A的抗性(表2)。源自IRBB27与对照品系杂交的对照F₁植株部分抗非亲和性菌株PXO99^A，易感3种亲和性菌株，而源自IR24与L24杂交的F₁植株易感所有受试菌株(表1)。

表2

野生型植株、转基因品系及其F1后代对各种水稻白叶枯病菌菌株的病害评估^a

^a根据两次独立实验计算平均病斑长度和标准差。对于每个菌株，至少接种来自8株不同植株的60片叶。抗性评分请参阅材料和方法。R，抗病；S，感病；MR，中度抗病；MS，中度感病；ND，未检测。

^b以空载体pC1305.1转化Nipponbare，产生对照品系。杂交时，L24或对照转基因植株用作花粉供体。

实施例8

avrXa27转基因诱导的Xa27表达也提供了抗水稻细菌性条斑病菌的增强抗性

在IRBB27x对照品系或IR24xL24的BC₃F₁植株中，由于缺乏Xa27或avrXa27基因，没有检测到Xa27的表达(数据未显示)。水稻细菌性条斑病菌菌株L8接种后第10天，细菌性条斑病的大病斑在这些BC₃F₁植株叶片上朝叶基和叶尖两个方向发展(图6a，叶1和2)。叶片表面观察到许多黄色珠状的水稻细菌性条斑病菌(图6a，叶1和2)。在IRBB27xL24的BC₃F₁植株中，Xa27基因受来自L24的avrXa27基因诱导(数据未显示)。IRBB27xL24的BC₃F₁植株具有比IRBB27x对照品系或IR24xL24的BC₃F₁植株小的细菌性条斑病病斑(图6a，叶3)。但是，在IRBB27xL24的BC₃F₁植株的病斑边缘仍观察到黄色珠状的水稻细菌性条斑病菌(图6a，叶3)。后一结果表明Xa27介导的抗水稻细菌性条斑病菌菌株L8的增强抗性是部分的或不完全的。这一点进一步被以下事实证实，即IRBB27xL24的BC₃F₁植株接种叶片的细菌群体在注射浸润后的10天内仍保持增长(图6b)。但是，IRBB27xL24的BC₃F₁植株接种叶片的细菌群体比对照BC₃F₁植株的细菌群体要低10到5000倍(图6b)。

为了进一步证实抗水稻细菌性条斑病菌菌株L8的增强抗性源自于Xa27的表达，我们以含有或不含有avrXa27基因的水稻细菌性条斑病菌菌株L8接种IRBB27植株。细菌注射浸润后第3天，两种互作中感染部位处的叶片组织变成褐色(图6c，叶1和2)。但是，发现以水稻细菌性条斑病菌L8(pHM1avrXa27)接种的IRBB27植株只有很少或没有微小黄色珠状的细菌，而在以水稻细菌性条斑病菌L8(pHM1)接种的IRBB27植株的叶片感染部位处观察到许多珠状细菌(图6c，叶1和2)。感染后第10天，以L8(pHM1avrXa27)接种的IRBB27植株的细菌性条斑病病斑比以L8(pHM1)接种的IRBB27植株要小，分布更窄(图6c，叶3和4)。同样，以L8(pHM1avrXa27)浸润的IRBB27植株叶片的细菌群体比以L8(pHM1)接种的IRBB27植株的细菌群体要低8到8373倍(图6d)。此外，接种后第3天检测到来自L8(pHM1avrXa27)的avrXa27对IRBB27的Xa27的诱导，而当L8(pHM1)用于接种时则没有发现诱导(图6e)。

总之，Xa27异位品系提供了抗非亲和性和亲和性水稻白叶枯病菌菌株的抗性(Gu等人，2005)。本文我们通过以水稻avrXa27转基因诱导Xa27基因的野生型等位基因，生成了另一种具有抗水稻白叶枯病菌菌株的广谱抗性和抗水稻细菌性条斑病菌增强抗性的Xa27异位品系。

在描述本发明的上下文中(特别是在下列权利要求的上下文中)，术语“一个”、“一种”和“该”以及类似的指称对象应理解为同时涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应理解为开放术语(即意为“包括但不限于”)，除非另有说明。除非本文另有说明，本文列举的数值范围仅用作一种单独提及该范围内的每个独立数值的简写方法，每个独立数值按照本文单独列举的方式被纳入到本说明书中。可以任何适宜次序实施本文描述的所有方法，除非本文另有说明或除非与上下文明显矛盾。本文提供的任何和全部实施例或例示性语言(例如“例如”)的使用仅仅是为了更好地阐述本发明，而不构成对本发明范围的限制，除非另有说明。本说明书的语言不应理解为表明任何非主张的要素对于本发明的实施是必不可少的。

本文描述了本发明的实施方式，其中包括发明人已知可实施本发明的最佳实施方式。本领域的技术人员在阅读上述说明后，这些实施方式的各种变化对于他们可变得清楚明了。发明人预计技术人员可使用适宜的变化，而且发明人计划可按照不同于本文具体描述的方式实施本发明。因此，本发明包括本发明所附权利要求列举的主题的所有修改和等同物，只要适用法律许可。而且，本发明涵盖上述要素在本发明所有可能的变化中的任何组合，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。

参考文献

Alfano，J.R.，and Collmer，A.(2004).Type III secretion system effector proteins：double agentin bacterial disease and plant defense.Annu.Rev.Phytopathol.42：385-414.

Allison，R.F.et al.(1985).Sequence determination of the capsid protein gene and flankingregions of tobacco etch virus：Evidence for synthesis and processing of a polyprotein inpotyvirus genome expression.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3969-3972.

Amante-Bordeos，A.et al.(1992).Transfer of bacteria blight and blast lresistance from thetetraploid wild rice Oryza minuta to cultivated rice，Oryza saliva.Theor Appl Genet 84：345-354.

Atanassova，R.et al.(1992).A 126 bp fragment of a plant histone gene promoter conferspreferential expression in meristems of transgenic Arabidopsis.Plant J.2：291-300

Bai，J.et al.(2000).Xanthomonas oryzae pv.oryzae avirulence genes contribute differentlyand specifically to pathogen aggressiveness.Mol.Plant-Mircobe Interact.13：1322-1329.

Binding(1985).″Regeneration of Plants，″In Plant Protoplasts，Fowke，L.C.and Constabel，F.(eds)，pp.2173，CRC Press，Boca Raton.

Bonas，U.et al.(1989).Genetic and structural characterization of the avirulence gene avrBs3from Xanthomonas campestris pv.vesicatoria.Mol.Gen.Genet.218：127-136.

Callis，J.et al.(1987).Introns increase gene expression in cultured maize cells.Genes Dev.1：1183-1200.

Chen，H.et al.(2002).A new gene for bacterial blight resistance in rice located onchromosome 12 identified from Minghui 63，an elite restorer line.Phytopathology92：750-754.

Chen，W.et al.(1996).The promoter of a H2O2-inducible，Arabidopsis glutathioneS-transferase gene contains closely linked OBF- and OBPl-binding sites.Plant J.10：955-966.

Chen，Z.et al.(2000).The Pseudomonas syringgae avrRpt2 gene product promotes pathogenvirulence from inside plant cells.Mol.Plant-Microbe Interact.13：1312-1321.

Chen，Z.et al.(2004).The Pseudomonas syringae type III effector AvrRpt2 functionsdownstream or independently of SA to promote virulence on Arabidopsis thaliana.Plant J.37：494-504.

Chu，Z.et al.(2006).Promoter mutations of an essential gene for pollen development result indisease resistance in rice.Genes Dev.20：1250-1255.

Cunnac，S.et al.(2004).Inventory and functional analysis of the large Hrp regulon inRalstonia solanacearum：Identification of novel effector proteins translocated to plants hostcells through the type III secretion system.Mol.Microbiol.53：115-128.

De Feyter，R.，and Gabriel，D.W.(1991).At least six avirulence genes are clustered on a90-kilobase plasmid in Xanthomonas campestris pv.malvacearum.Mol.Plant-MicrobeInteract 4：423-432.

De Feyter，R.et al.(1998).Five avirulence genes from Xanthomonas campestris pv.malvacearum cause genotype-specific cell death when expressed transiently in cotton.Mol.Plant-Microbe Interact.11，698-701.

Deikman，J.and Fischer，R.L.(1988).Interaction of a DNA binding factor with the5′-flanking region of an ethylene-responsive fruit ripening gene from tomato.EMBO J.7：3315-3320.

Della-Cioppa，G.et al.(1987).Protein trafficking in plant cells.Plant Physiol.84：965-968.Dellaporta，S.et al.(1984).Maize DNA mini prep.In：Russell M(Ed)Molecular biology ofplants：a laboratory course manual.Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，pp36-37.

Duan，Y.P.et al.(1999).Expression of a single，host-specific，bacterial pathogenicity gene inplant cells elicits division，enlargement，and cell death.Mol.Plant-Microbe Interact.12：556-560.

Elroy-Stein，O.et al.(1989).Cap-independent translation of mRNA conferred byencephalomyocarditis virus 5′sequence improves the performance of the vacciniavirus/bacteriophage T7 hybrid expression system.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6126-6130.

Evans et al.(1983).″Protoplasts Isolation and Culture，″In Handbook of Plant Cell Culture，pp.124-176，MacMillilan Publishing Company，New York.

Flor，H.H.(1971).Current status of the gene-for-gene concept.Annu Rev Phytopathol.9：275-96.

Fraley，R.T.et al.(1983).Expression of bacterial genes in plant cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803-4807.

Fromm，M.et al.(1985).Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cellsby electroporation.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5824-5828.

Gallie，D.R.et al.(1989).In Molecular Biology of RNA，ed.Cech，Liss，New York，pp.237-256.

Gao，D.Y.et al.(2001).Identification of a new gene for resistance to bacterial blight in asomaclonal mutant HX-3(indica).Rice Genet Newsl.18：66-68.

Gopalan，S.et al.(1996).Expression of the Pseudomonas syringae avirulence protein AvrB inplant cells alleviates its dependence on the hypersensitive response and pathogenicity(Hrp)secretion system in eliciting phenotype-specific hypersensitive cell death.Plant Cell.8：1095-1105.

Gu，K.et al.(2004).High-resolution genetic mapping of Xa27(t)，a new bacterial blightresistance gene in rice，Oryza sativa L.Theoretical and Applied Genetics 108：800-807.

Gu，K.et al.(2005.R gene expression induced by a type-III effector triggers diseaseresistance in rice.Nature 435：1122-1125.

Gnanamanickam，S.et al.(1999).An overview of bacterial blight disease of rice andstrategies for its management.Curr Sci 77：1435-1443.

Guerineau，F.et al.(1991).Effect of deletions in the cauliflower mosaic virus polyadenylationsequence on the choice of the polyadenylation sites in tobacco protoplasts.Mol.Gen.Genet.226：141-144.

Hauck，P.et al.(2003).A pseudomonas syringae type III effector suppresses cell wall-basedextracellular defense in susceptible Arabidopsis plants.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.100：8577-8582.

Horsch，R.B.et al.(1984).Inheritance of functional genes in plants.Science 233：496-498.He，Q.，Li，D.，Znu，Y.，Tan，M.，Zhang，D.，and Lin，X.(2006).Fine mapping of Xa2，abacterial blight resistance gene in rice.Molecular Breeding 17：1-6.

Hopkins，CM.et al.(1992).Identification of a family of avirulence genes from Xanthomonasoryzae pv.oryzae.Mol.Plant-Microbe Interact.5：451-459.

Iyer，A.S.，and McCouch，S.R.(2004).The rice bacterial blight resistance gene xa5 encodes anovel form of disease resistance.Mol.Plant-Microbe Interact.17：1348-1354.

Jobling，S.A.and Gehrke，L.et al.(1987).Enhanced translation of chimaeric messengerRNAs containing a plant viral untranslated leader sequence.Nature 325：622-625.

Joshi，CP.(1987).Putative polyadenylation signals in nuclear genes of higher plants：acompilation and analysis.Nucleic Acids Res.15：9627-9639.

[0131]Kauffrnan，H.E.et al.(1973).An improved technique for evaluating resistance to ricevarieties of Xanthomonas oryzae.Plant Dis.Rep.57：537-541.

Khush，G.S.，and Angeles，E.R.(1999).A new gene for resistance to race 6 of bacterial blightin rice，Oryza sativa L.Rice Genet.Newsl.16：92-93.

Kinoshita，T.(1995).Report of Committee on gene symbolization，nomemclature and linkagegroups.Rice Genet.Newsl.12：9-115.

Kjemtrup，S.et al.(2000).Effector proteins of phytopathogenic bacteria：bifunctional signalsin virulence and host recognition.Current Opinion in Microbiology 3：73-78.

Klee，H.et al.(1987).Agrobacterium-mediated plant transformation and its furtherapplications to plant biolog y.Ann.Rev.of Plant Phys.Plant Mol.Biol.38：467-486.

Klein，T.M.et al.(1987).High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids intoliving cells.Nature 327：70-73.

Last，D.I.et al.(1991).pEmu：an improved promoter for gene expression in cereal cells.Theor.Appl.Genet.81：581.

Lazo，G.R.et al.(1991).A DNA transformation competent Arabidopsis genome library inArobacterium.BioTechnology 9：963-967.

Lahaye，T.，and Bonas，U.2001.Molecular secrets of bacterial type III effector proteins.Trends Plant Sci 6：479-485

Lee，B.M.et al(2005).The genome sequence of Xanthcmonas oryzae pathovar oryzaeKACCl 0331，the bacterial blight pathogen of rice.Nucleic Acids Res 33：577-586.

Li，P.et al.(2004).avrXa3：A novel member of avrBs3 gene family from Xanthomonasoryzae pv.oryzae has a dual function.Prog Natl Sci USA 14：774-780.

Lin，X.H.et al.(1996).Identification and mapping of a new gene for bacterial blightresistance in rice based on RFLP markers.Phytopathology 86：1156-1159.

Liu，G.-Z.et al.(2002).Biochemical characterization of the kinase domain of the rice diseaseresistance receptor-like kinase XA21.J Biol Chem 277：20264-20269.

Liu，Z.B.(1997).A G-Box-Binding Protein from Soybean Binds to the El Auxin-ResponseElement in the Soybean GH3 Promoter and Contains a Proline-Rich Repression Domain.Plant Physiol115：397-407.

Lommel，S.A.et al.(1991).Identification of the maize chlorotic mottle virus capsid proteincistron and characterization of its subgenomic messenger RNA.Virology 81：382-385.

Macejak，D.G.and Sarnow，P.(1991).Internal initiation of translation mediated by the 5’leader of a cellular mRNA.Nature 353：90-94.

Makino，S.et al.(2006).Inhibition of resistance Gene-mediated defense in rice byXanthomonas oryzae pv.oryzicola.Mol Plant-Microbe Interact 19：240-249.

Marois，R.et al.(2002).The Xanthomonas type III effector protein AvrBs3 modulates plantgene expression and induces cell hypertrophy in the susceptible host.Mol Plant-MicrobeInteract 15：637-646.

McElroy，D.et al.(1990).Isolation of an efficient actin promoter for use in ricetransformation.Plant Cell 2：163-171.

McElroy，D.et al.(1991).Construction of expression vectors based on the rice actin 1(Act1)5′region for use in monocot transformation.Mol Gen Genet 231：150-160.

McNellis，T.W.et al.(1998).Glucocorticoid-inducible expression of a bacterial avirulencegene in transgenic Arabidopsis induces hypersensitive cell death.Plant J.14：247-258.

Mew，T.W.(1987).Current status and future prospects of research on bacterial blight of rice.Annual Review of Phytopathology 25：359-382

Mogen，B.D.et al.(1990).Upstream sequences other than AAUAAA are required forefficient messenger RNA 3′-end formation in plants.Plant Cell 2：1261-1272.

Munroe，D.and Jacobson，A.(1990).Tales of poly(A)：a revie w.Gene 91：151-158.

Murray，E.E.et al.(1989).Codon usage in plant genes.Nucleic Acids Res.17：477-498.

Nino-Liu，D.et al.(2006).Xanthomonas oryzae pathovars：model pathogens of a model crop.Molecular Plant Pathology 7：303-324.

Ogawa，T.(1993).Methods and strategy for monitoring race distribution and identification ofresistance genes to bacterial leaf blight(Xanthomonas oryzae pv oryzae)in rice.JARQ27：71-80.

Ou，S.H.(1985).Rice Diseases.Kew，Surrey：Commonwealth Agricultural Bureau.Paszkowski，J.et al.(1984).Direct gene transfer to plants.EMBO J.3：2717-2722.

Proudfoot，N.(1991).Poly(A)signals.Cell 64：671-674.

Redolfi，P.et al.(1983).Occurrence of pathogenesis-related(b) and similar proteins indifferent plant species.Neth.J.Plant Pathol.89：245-254.

Rocha-Sosa，M.et al.(1989).Both developmental and metabolic signals activate the promoterof a class I patatin gene.EMBO J.，8：23-29.

Ronald，P.C.(1997).The molecular basis of disease resistance in rice.Plant Mol.Biol.35：179-186.

Sakai，T.et al.(1996).Analysis of the promoter of the auxin-inducible gene，parC，of tobacco.Plant Cell Physiol.37：906-913.

Samac，D.A.et al.(1990).Isolation and Characterization of the Genes Encoding Basic andAcidic Chitinase in Arabidopsis thaliana.Plant Physiol.，93：907-914.

Sambrook，J.et al.(1989).Molecular Cloning a laboratory manual(2nd ed.).Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.

Sanfacon，H.et al.(1991).A dissection of the caulfilower mosaic virus polyadenylation signal.Genes Dev.5：141-149.

Schaad，N.W.et al.(1996).An improved infiltration technique to test the pathogenicity ofXanthomonas oryzae pv.oryzae in rice seedlings.Seed Sci Technol 24：449-456.

Schornack，S.et al.(2006).Gene-for-gene-mediated recognition of nuclear-targetedAvrBs3-like bacterial effector proteins.J.Plant Physiol.163：256-272.

Scofield，S.R.et al.(1996).Molecular basis of gene-for-gene specificity in bacterial speckdisease of tomato.Science 274：2063-2065.

Sheen，J.(1996).Ca2+-dependent protein kinases and stress signal transduction in plants.Science 274：1900-1902.

Sheng，Z.-J.et al.(2005).Detection of QTL conferring resistance to bacterial leaf streak inrice chromosome 2(O.sativa L.spp.indica).ScientiaAgric Sinica 38：1923-1925.

Song，W.Y.et al.(1995).A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistancegene，Xa21.Science 270：1804-1806.

Stevens，C.et al.(1998).Sequence variation in allele of avirulence gene avrPphE.R2 fromPseudomonas syringe pv.phaseolicola lead to loss of recognition of the AvrPphE proteinwithin bean cells and a gain in cultivar-specific virulence.Mol.Microbiol.29：165-177.

Streit，W.R.and Phillips，D.A.(1997).A biotin-regulated locus，bioS，in a possible survivaloperon of Rhizobium meliloti.Mol.Plant Microbe Interact.10：933-937.

Sun，X.et al.(2004).Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae inrice，encodes an LRR receptor kinase-like protein.Plant J.37：511-521.

Tang，D.et al.(2000).Mapping of QTLs conferring resistance to bacterial leaf streak in rice.Theor Appl Genet 101：286-291.

Tang，X.et al.(1996).Initiation of plant disease resistance by physical interaction of AvrPtoand Pto kinase.Science 274，2060-2063

Tierney，M.L.et al.(1987).Isolation and characterization of a genomic clone encoding theβ-subunit of β-conglycinin.Planta 172：356-363.

Tomes et al.(1995).″Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via MicroprojectileBombardment，″In Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips，Springer-Verlag，Berlin.

Uknes，S.et al.(1992).Acquired resistance in Arabidopsis.Plant Cell 4：645-656(1992)

Van den Ackerveken，G.et al.(1996).Recognition of the bacterial avirulence protein AvrBs3occurs inside the host plant cell.Cell 87：1307-1316.

Van Loon，L.C.(1985).Pathogenesis-relatedproteins.Plant Mol.Biol.4：111-116.

Vasil，I.R.(ed.)(1984).Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants，Vol.I，AcademicPress，Orlando.

Vasil，I.R.(ed.)(1986).Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants，Vol.III，AcademicPress，Orlando.

Vera Cruz，CM，et al.(2000).Predicting durability of a disease resistance gene based on anassessment of the fitness loss and epidemiological consequences of avirulence gene mutation.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：13500-13505.

Weising，K.et al.(1988).Foreign genes in plants：transfer，structure，expression，andapplications.Ann.Rev.Genet.22：421-477.

Xu，Y.et al.(1995).Characterization of a rice gene family encoding root-specific proteins.Plant Mol.Biol.27：237-248.

Yang，B.et al.(2000).The virulence factor AvrXa7 of Xanthomonas oryzae pv.oryzae is atype III secretion pathway-dependent nuclear-localized double-stranded DNA-binding protein.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：9807-9812.

Yang，Y.et al.(1996).Watersoaking function(s)of XcmH1005 are redundantly encoded bymembers of the Xanthomonas avr/pth gene family.Mol.Plant-Mocrobe Interact.9：105-113.

Yang，Z.et al.(2003).Genetic and physical mapping of a new gene for bacterial blightresistance in rice.Theor.Appl.Genet.106：1467-1472.

Yin，Z.and Wang，G.L.(2000).Evidence of multiple complex patterns of T-DNA integrationinto the rice genome.Theor.Appl.Genet.100：461-470.

Yoshimura，S.et al.(1998).Expression of Xa1，a bacterial blight-resistance gene in rice，isinduced by bacterial inoculation.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：1663-1668

Young，S.A.et al.(1996).Changes in the plasma membrane distribution of phospholipase Dduring resistant interactions with Xathanomonas oryzae pv.oryzae.Plant Cell.8：1079-1090.

Zhang，Q.et al.(1998).Identification and tagging a new gene for resistance to bacterial blight(Xanthomonas oryzae pv oryzae)from O.rufipogon.Rice Genet.Newsl.15：138-142.

Zhu，W.G.et al.(1998).AvrXa10 contains an acidic transcriptional activation domain in thefunctionally conserved C terminus.Mol.Plant-Microbe Interact.11：824-832

序列表

<110>淡马锡生命科学研究院有限公司

<120>水稻avrXa27基因对Xa27的诱导赋予抗水稻白叶枯病菌的广谱抗性

和抗水稻细菌性条斑病菌的增强抗性

<130>2577-179PCT

<150>US 60/897,864

<151>2007-01-29

<160>9

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>3411

<212>DNA

<213>Xanthomonas oryzae

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(3411)

<400>1

atg gat ccc att cgt tcg cgc acg cca agt cct gcc cgc gag ctt ctg 48

Met Asp Pro Ile Arg Ser Arg Thr Pro Ser Pro Ala Arg Glu Leu Leu

1 5 10 15

ccc gga ccc caa ccg gat agg gtt cag ccg act gca gat cgg ggg ggg 96

Pro Gly Pro Gln Pro Asp Arg Val Gln Pro Thr Ala Asp Arg Gly Gly

20 25 30

gct ccg cct gct ggc ggc ccc ctg gat ggc ttg ccc gct cgg cgg acg 144

Ala Pro Pro Ala Gly Gly Pro Leu Asp Gly Leu Pro Ala Arg Arg Thr

35 40 45

atg tcc cgg acc cgg ctg cca tct ccc cct gcg ccc tcg cct gcg ttc 192

Met Ser Arg Thr Arg Leu Pro Ser Pro Pro Ala Pro Ser Pro Ala Phe

50 55 60

tcg gcg ggc agc ttc aac gat ctg ctc cgt cag ttc gat ccg tcg ctt 240

Ser Ala Gly Ser Phe Asn Asp Leu Leu Arg Gln Phe Asp Pro Ser Leu

65 70 75 80

ctt gat aca tcg ctt ctt gat tcg atg cct gcc gtc ggc acg ccg cat 288

Leu Asp Thr Ser Leu Leu Asp Ser Met Pro Ala Val Gly Thr Pro His

85 90 95

aca gcg gct gcc cca gca gag tgg gat gag gtg caa tcg ggt ctg cgt 336

Thr Ala Ala Ala Pro Ala Glu Trp Asp Glu Val Gln Ser Gly Leu Arg

100 105 110

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Ala Ala Asp Asp Pro Pro Pro Thr Val Arg Val Ala Val Thr Ala Ala

115 120 125

cgg ccg ccg cgc gcc aag ccg gcc ccg cga cgg cgt gcg gcg caa ccc 432

Arg Pro Pro Arg Ala Lys Pro Ala Pro Arg Arg Arg Ala Ala Gln Pro

130 135 140

tcc gac gct tcg ccg gcc gcg cag gtg gat cta cgc acg ctc ggc tac 480

Ser Asp Ala Ser Pro Ala Ala Gln Val Asp Leu Arg Thr Leu Gly Tyr

145 150 155 160

agt cag cag cag caa gag aag atc aaa tcg aag gtg cgt tcg aca gtg 528

Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Ser Lys Val Arg Ser Thr Val

165 170 175

gcg cag cac cac gag gca ctg gtg ggc cat ggg ttt aca cac gcg cac 576

Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala His

180 185 190

atc gtt gcg ctc agc caa cac ccg gca gcg tta ggg acc gtc gct gtc 624

Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala Val

195 200 205

aag tat cag cac ata atc acg gcg ttg cca gag gcg aca cac gaa gac 672

Lys Tyr Gln His Ile Ile Thr Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu Asp

210 215 220

atc gtt ggc gtc ggc aaa cag tgg tcc ggc gca cgc gcc ctg gag gcc 720

Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ala

225 230 235 240

ttg ctc acg aag gcg ggg gag ttg aga ggt ccg ccg tta cag ttg gac 768

Leu Leu Thr Lys Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu Asp

245 250 255

aca ggc caa ctt ctc aag att gca aaa cgt ggc ggc gtg acc gca gtg 816

Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala Val

260 265 270

gag gca gtg cat gca tcg cgc aat gca ctg acg ggt gcc ccc ctg aac 864

Glu Ala Val His Ala Ser Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu Asn

275 280 285

ctg acc ccg gac caa gtg gtg gcc atc gcc agc aat att ggc ggc aac 912

Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Asn

290 295 300

cag gcg ctg gag acg gtg cag cgg ctg ttg ccg gtg ctg tgc cag gac 960

Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp

305 310 315 320

cat ggc ctg acc ccg gac caa gtg gtg gcc atc gcc aac aat aac ggc 1008

His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Asn Asn Asn Gly

325 330 335

ggc aag cag gcg ctg gag acg gtg cag cgg ctg ttg ccg gtg ctg tgc 1056

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys

340 345 350

cag gcc cat ggc ctg acc ccg gac caa gtg gtg gcc atc gcc agc aat 1104

Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn

355 360 365

ggc ggc aag cag gcg ctg gag acg gtg cag cgg ctg ttg ccg gtg ctg 1152

Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu

370 375 380

tgc cag gcc cat ggc ctg acc ccg aac cag gtc gtg gcc atc gcc agc 1200

Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asn Gln Val Val Ala Ile Ala Ser

385 390 395 400

aat ggc ggc ggc aag cag gcg ctg gag acg gtg cag cgg ctg ttg ccg 1248

Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro

405 410 415

gtg ctg tgc cag gcc cat ggc ctg acc cag gac cag gtg gtg gcc atc 1296

Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Gln Asp Gln Val Val Ala Ile

420 425 430

gcc agc aat agt ggc ggc aag cag gcg ctg gag acg gtg cag cgg ctg 1344

Ala Ser Asn Ser Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu

435 440 445

ttg ccg gtg ctg tgc cag gcc cat ggc ctg acc ccg gcc caa gtg gtg 1392

Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val

450 455 460

gcc atc gcc agc aat aac ggc ggc aag cag gcg ctg gag acg gtg cag 1440

Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln

465 470 475 480

cgg ctg ttt ccg gtg ctg tgc cag gac cat ggc ctg acc ccg gac cag 1488

Arg Leu Phe Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln

485 490 495

gtg gtg acc atc gcc aac aat aac ggc ggc aag cag gcg ctg gag acg 1536

Val Val Thr Ile Ala Asn Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr

500 505 510

gtg cag cgg ctg ttg ccg gtg ctg tgc cag gcc cat ggc ttg atc ccg 1584

Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Ile Pro

515 520 525

gac cag gtg gtg gcc atc gcc aac aat aac ggc ggc aag cag gcg ctg 1632

Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Asn Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu

530 535 540

gag acg gtg cag cgg ctg ttg ccg gtg ctg tgc cag gcc cat ggc ctg 1680

Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu

545 550 555 560

acc ccg gcc caa gtg gtg gcc atc gcc agc aat att ggc ggc aag cag 1728

Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln

565 570 575

gcg ctg gag acg gtg cag cgg ctg ttg ccg gtg ctg tgc cgg gcc cat 1776

Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Arg Ala His

580 585 590

ggc ctg acc ccg gcc caa gtg gtg gcc atc gcc aac aat aac ggc ggc 1824

Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Asn Asn Asn Gly Gly

595 600 605

aag cag gcg ctg gag acg gtg cag cgg ctg ttg ccg gtg ctg tgc cag 1872

Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln

610 615 620

gcc cat ggc ctg acc ccg gat caa gtg gtg gcc atc gcc agc aat att 1920

Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile

625 630 635 640

ggc ggc aag cag gcg ctg gag acg gtg cag cgc ctg ttg ccg gtg ctg 1968

Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu

645 650 655

tgc cag gac cat ggc ctg acc ccg gac cag gtc gtg gcc atc gcc agc 2016

Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser

660 665 670

aat ggc ggc aag cag gcg ctg gag acg gtg cag cgg ctg ttg ccg gtg 2064

Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val

675 680 685

ctg tgc cag gac cat ggc ctg acc ccg gcc cag gtg gtg gcc atc gcc 2112

Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala

690 695 700

agc cac gat ggc ggc aag cag gcg ctg gag acg gtg cag cgg ctg ttg 2160

Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu

705 710 715 720

ccg gtg ctg tgc cag gac cat ggc ctg acc ctg gac cag gtc gtg gcc 2208

Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Leu Asp Gln Val Val Ala

725 730 735

atc gcc agc cac gat ggc ggc aag cag gcg ctg gag acg gtg cag cgg 2256

Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg

740 745 750

ctg ttg ccg gtg ctg tgc cag gac cat ggc ctg acc ctg gac cag gtg 2304

Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Leu Asp Gln Val

755 760 765

gtg gcc atc gcc agc aat att ggc ggc aag cag gcg ctg gag acg gtg 2352

Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val

770 775 780

cag cgg ctg ttg ccg gtg ctg tgc cag gac cat ggc ctg acc ccg gac 2400

Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp

785 790 795 800

cag gtc gtg gcc atc gcc agc aat ggc ggc ggc aag cag gcg ctg gag 2448

Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu

805 810 815

acg gtg caa cgg ctg ttg ccg gtg ctg tgc cag gac cat ggc ctg acc 2496

Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr

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ccg gac cag gtc gtg gcc atc gcc agc aat ggc ggc ggc aag cag gcg 2544

Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala

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ctg gag agc att gtt gcc cag tta tct cgc cct gat ccg gcg ttg gcc 2592

Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro Asp Pro Ala Leu Ala

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gcg ttg acc aac gac cac ctc gtc gcc ttg gcc tgc ctc ggc gga cgt 2640

Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala Cys Leu Gly Gly Arg

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cct gcc ctg gat gca gtg aaa aag gga ttg ccg cac gcg ccg gaa ttg 2688

Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Pro His Ala Pro Glu Leu

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atc aga aga atc aat cgc cgt att ccc gaa cgc acg tcc cat cgc gtt 2736

Ile Arg Arg Ile Asn Arg Arg Ile Pro Glu Arg Thr Ser His Arg Val

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Ala Asp Leu Ala His Val Val Arg Val Leu Gly Phe Phe Gln Ser His

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Ser His Pro Ala Gln Ala Phe Asp Asp Ala Met Thr Gln Phe Gly Met

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Ser Arg His Gly Leu Val Gln Leu Phe Arg Arg Val Gly Val Thr Glu

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ttc gaa gcc cgc tgc gga acg ctc ccc cca gcc tcg cag cgt tgg gac 2928

Phe Glu Ala Arg Cys Gly Thr Leu Pro Pro Ala Ser Gln Arg Trp Asp

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Arg Ile Leu Gln Ala Ser Gly Met Lys Arg Ala Lys Pro Ser Pro Thr

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tca gct caa acg ccg gat cag gcg tct ttg cat gca ttc gcc gat tcg 3024

Ser Ala Gln Thr Pro Asp Gln Ala Ser Leu His Ala Phe Ala Asp Ser

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ctg gag cgt gac ctt gat gcg ccc agc cca atg cac gag gga gat 3069

Leu Glu Arg Asp Leu Asp Ala Pro Ser Pro Met His Glu Gly Asp

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cag acg cgg gca agc agc cgt aaa cgg tcc cga tcg gat cgt gct 3114

Gln Thr Arg Ala Ser Ser Arg Lys Arg Ser Arg Ser Asp Arg Ala

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Val Thr Gly Pro Ser Thr Gln Gln Ser Phe Glu Val Arg Val Pro

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Glu Gln Arg Asp Ala Leu His Leu Pro Leu Ser Trp Arg Val Lys

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Arg Pro Arg Thr Arg Ile Gly Gly Gly Leu Pro Asp Pro Gly Thr

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Pro Ile Ala Ala Asp Leu Ala Ala Ser Ser Thr Val Met Trp Glu

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Gln Asp Ala Ala Pro Phe Ala Gly Ala Ala Asp Asp Phe Pro Ala

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325 330 335

Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu cys

340 345 350

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465 470 475 480

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485 490 495

Val Val Thr Ile Ala Asn Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr

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580 585 590

Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Asn Asn Asn Gly Gly

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770 775 780

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805 810 815

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835 840 845

Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro Asp Pro Ala Leu Ala

850 855 860

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865 870 875 880

Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Pro His Ala Pro Glu Leu

885 890 895

Ile Arg Arg Ile Asn Arg Arg Ile Pro Glu Arg Thr Ser His Arg Val

900 905 910

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930 935 940

Ser Arg His Gly Leu Val Gln Leu Phe Arg Arg Val Gly Val Thr Glu

945 950 955 960

Phe Glu Ala Arg Cys Gly Thr Leu Pro Pro Ala Ser Gln Arg Trp Asp

965 970 975

Arg Ile Leu Gln Ala Ser Gly Met Lys Arg Ala Lys Pro Ser Pro Thr

980 985 990

Ser Ala Gln Thr Pro Asp Gln Ala Ser Leu His Ala Phe Ala Asp Ser

995 1000 1005

Leu Glu Arg Asp Leu Asp Ala Pro Ser Pro Met His Glu Gly Asp

1010 1015 1020

Gln Thr Arg Ala Ser Ser Arg Lys Arg Ser Arg Ser Asp Arg Ala

1025 1030 1035

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1040 1045 1050

Glu Gln Arg Asp Ala Leu His Leu Pro Leu Ser Trp Arg Val Lys

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Arg Pro Arg Thr Arg Ile Gly Gly Gly Leu Pro Asp Pro Gly Thr

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Pro Ile Ala Ala Asp Leu Ala Ala Ser Ser Thr Val Met Trp Glu

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Gln Asp Ala Ala Pro Phe Ala Gly Ala Ala Asp Asp Phe Pro Ala

1100 1105 1110

Phe Asn Glu Glu Glu Leu Ala Trp Leu Met Glu Leu Leu Pro Gln

1115 1120 1125

Ser Gly Ser Val Gly Gly Thr Ile

1130 1135

<210>3

<211>342

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(342)

<400>3

atg gcg gat tgg gcg atg cac cac tac ctc cta cta gcc aac cag caa 48

Met Ala Asp Trp Ala Met His His Tyr Leu Leu Leu Ala Asn Gln Gln

1 5 10 15

cgc cac cga gcc ctc gcc gac gtc gcc gtc cgc cgc cgc cag ctg ctc 96

Arg His Arg Ala Leu Ala Asp Val Ala Val Arg Arg Arg Gln Leu Leu

20 25 30

ctc gac tcc ggc cgc gtc ttc atg ctc ctc ggc gcc gtc atc ctc atg 144

Leu Asp Ser Gly Arg Val Phe Met Leu Leu Gly Ala Val Ile Leu Met

35 40 45

cac atg ctc acc act acc ggc ggc gga gca tcg tcc ggc tgc acc cgc 192

His Met Leu Thr Thr Thr Gly Gly Gly Ala Ser Ser Gly Cys Thr Arg

50 55 60

ggc gcc gaa cct tgc gtc gcc ctc ctc ctg tgg ctg ctc ggc gcg gcg 240

Gly Ala Glu Pro Cys Val Ala Leu Leu Leu Trp Leu Leu Gly Ala Ala

65 70 75 80

ctc gcc atg ctg tcg ctc gtc gcc ggc cga ttc ccc gtt ctc gct gcc 288

Leu Ala Met Leu Ser Leu Val Ala Gly Arg Phe Pro Val Leu Ala Ala

85 90 95

gcc att gct gag gag ctc ggt gat cac ctg ctt ggt ggt ctc tgg tct 336

Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly Asp His Leu Leu Gly Gly Leu Trp Ser

100 105 110

ctc tag 342

Leu

<210>4

<211>113

<212>PRT

<213>Oryza sativa

<400>4

Met Ala Asp Trp Ala Met His His Tyr Leu Leu Leu Ala Asn Gln Gln

1 5 10 15

Arg His Arg Ala Leu Ala Asp Val Ala Val Arg Arg Arg Gln Leu Leu

20 25 30

Leu Asp Ser Gly Arg Val Phe Met Leu Leu Gly Ala Val Ile Leu Met

35 40 45

His Met Leu Thr Thr Thr Gly Gly Gly Ala Ser Ser Gly Cys Thr Arg

50 55 60

Gly Ala Glu Pro Cys Val Ala Leu Leu Leu Trp Leu Leu Gly Ala Ala

65 70 75 80

Leu Ala Met Leu Ser Leu Val Ala Gly Arg Phe Pro Val Leu Ala Ala

85 90 95

Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly Asp His Leu Leu Gly Gly Leu Trp Ser

100 105 110

Leu

<210>5

<211>964

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<400>5

gaatttcttg gattccttta atttattcga gcgccacatg acggcttgag agtgtttata 60

ggaagtttaa tggacgtttt tgtatataat agatagatag atagatagat atcctccgtc 120

ccacaatata gggattttta gtttttgctt gcaatgtttg accactcgtc ttattcaaat 180

tttttttaca aatataaaaa atgaaaagtt gtgcttaaag tactgtagat aataaagtaa 240

gtcacaaata aaataaataa taatttcaaa attttttgaa taagacaagt ggtcaaacgt 300

tgaaagcaaa aactcaaaat cccttatatt atgggacaga gggactagaa gatagttttt 360

gtatgtgttg ttcgatgttt tacgctccca aatatattaa tactacattg gatcaccatt 420

ttaaatttat tatagataag tttaatacga aaatttcaga tttgttttct taatttttat 480

gaacaacatt tgcatacaac atctggtcgt aataactacg ttgaatatta ccctcttgat 540

gacttgacta attttagaca aaagatggtc acccacccag cttttcattg aaagtataag 600

agttcgtaca gtgcaaaaag gaacaaaggt aaaataaaag gaaagtaaaa atcccaagtc 660

ctgcgtacaa atctatagtt caagacatac acatcgcctt ccaactgagg tcgagttgcc 720

ccggtgccat gtcttattcg tggaattcta tgtccaagtg catactttgc gggggtaaaa 780

ttttctacac gtatgttgcc aaaatttctg ctaagttttc gtgccaactc gagaaattct 840

tacacagcct gcagtctata aatattcaca catttcacaa aaaaatactt gcaacatcaa 900

agctacacag gtagaatcat cgaccgtaag taggtacgta cattaagtgt gagcttgatt 960

aact 964

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<400>6

ccatgattac gaattcgagc tcgg 24

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<400>7

aagaagcgac ggatcgaact gac 23

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>Agrobacterium tumefaciens

<400>8

cgaagaggag ctcgcatggt tgat 24

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>Agrobacterium tumefaciens

<400>9

cactgatagt ttaattcccg atctag 26

Claims

1.一种转基因植物，在其基因组中含有可操作连接于在植物中具有活性的启动子的第一核酸，其中所述第一核酸编码具有SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列的avrXa27蛋白。

2.如权利要求1所述的转基因植物，其中所述第一核酸具有SEQ IDNO：1列出的核苷酸序列。

3.如权利要求1或2所述的转基因植物，其中所述第一启动子选自组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子组成的组。

4.如权利要求1-3任一项所述的转基因植物，其中所述植物在其基因组中还含有可操作连接于在植物中具有活性的第二启动子的第二核酸，其中所述第二核酸编码具有SEQ ID NO：4列出的氨基酸序列的Xa27蛋白。

5.如权利要求4所述的转基因植物，其中所述第二核酸具有SEQ IDNO：3列出的核苷酸序列。

6.如权利要求4或5所述的转基因植物，其中所述植物对于编码Xa27蛋白的核酸是非转基因的。

7.如权利要求4或5所述的转基因植物，其中所述植物对于编码Xa27蛋白的核酸是转基因的。

8.如权利要求7所述的转基因植物，其中所述第二启动子是天然的Xa27启动子。

9.如权利要求1-8任一项所述的转基因植物，其中所述植物是稻。

10.如权利要求1-8任一项所述的转基因植物，其中所述植物选自胡椒、番茄、豆类、棉花、黄瓜、甘蓝、大麦、燕麦、小麦、玉米和柑橘组成的组。

11.一种植物，在其基因组中含有可操作连接于在植物中具有活性的第一启动子的第一核酸和可操作连接于在植物中具有活性的第二启动子的第二核酸，其中所述第一核酸编码具有SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列的avrXa27蛋白，其中所述第二核酸编码具有SEQ ID NO：4列出的氨基酸序列的Xa27蛋白。

12.如权利要求11所述的植物，其中所述第一核酸具有SEQ ID NO：1列出的核苷酸序列。

13.如权利要求11或12所述的植物，其中所述第二核酸具有SEQ IDNO：3列出的核苷酸序列。

14.如权利要求11-13任一项所述的植物，其中所述第一启动子选自于由组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子组成的组，所述第二启动子是天然的Xa27启动子。

15.如权利要求11-14任一项所述的植物，其中通过将含有编码所述Xa27蛋白的天然核酸的第一植物与含有所述第一核酸的转基因植物杂交，得到所述植物。

16.如权利要求11-14任一项所述的植物，其中通过将含有所述第二核酸的第一转基因植物与含有所述第一核酸的第二转基因植物杂交，得到所述植物。

17.如权利要求11-16任一项所述的植物，其中所述植物是稻。

18.如权利要求11-16任一项所述的植物，其中所述植物选自胡椒、番茄、豆类、棉花、黄瓜、甘蓝、大麦、燕麦、小麦、玉米和柑橘组成的组。

19.一种诱导Xa27基因在植物中表达的方法，其包括在所述植物中表达核酸，其中所述核酸可操作连接于在植物中具有活性的启动子，其中所述核酸编码具有SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列的avrXa27蛋白。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述核酸具有SEQ ID NO：1列出的核苷酸序列。

21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述启动子选自组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子组成的组。

22.如权利要求19-21任一项所述的方法，其中所述植物是稻。

23.如权利要求21-21任一项所述的方法，其中所述植物选自胡椒、番茄、豆类、棉花、黄瓜、甘蓝、大麦、燕麦、小麦、玉米和柑橘组成的组。

24.一种在植物中产生抗白叶枯病的增强和广谱抗性的方法，其包括通过在植物中表达核酸来诱导Xa27基因在植物中表达，其中所述核酸可操作连接于在所述植物中具有活性的启动子，其中所述核酸编码具有SEQ IDNO：2列出的氨基酸序列的avrXa27蛋白。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述核酸具有SEQ ID NO：1列出的核苷酸序列。

26.如权利要求24或25所述的方法，其中所述启动子选自组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子组成的组。

27.如权利要求24-26任一项所述的方法，其中所述植物是稻。

28.如权利要求24-26任一项所述的方法，其中所述植物选自胡椒、番茄、豆类、棉花、黄瓜、甘蓝、大麦、燕麦、小麦、玉米和柑橘组成的组。

29.如权利要求24-28任一项所述的方法，其中所述Xa27基因在感染白叶枯病的植物中被诱导表达。

30.一种在植物中产生抗细菌性条斑病的增强抗性的方法，其包括通过在植物中表达核酸来诱导Xa27基因在该植物中表达，其中所述核酸可操作连接于在所述植物中具有活性的启动子，其中所述核酸编码具有SEQ IDNO：2列出的氨基酸序列的avrXa27蛋白。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述核酸具有SEQ ID NO：1列出的核苷酸序列。

32.如权利要求30或31所述的方法，其中所述启动子选自组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子组成的组。

33.如权利要求30-32任一项所述的方法，其中所述植物是稻。

34.如权利要求30-32任一项所述的方法，其中所述植物选自胡椒、番茄、豆类、棉花、黄瓜、甘蓝、大麦、燕麦、小麦、玉米和柑橘组成的组。

35.如权利要求30-34任一项所述的方法，其中所述Xa27基因的表达在感染细菌性条斑病的植物中诱导。