CN109490387A - 基于核酸适配体的铅离子电化学传感器的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于核酸适配体的重金属离子电化学传感器的制备方法及应用，将四氯合金酸的水溶液滴加入聚吡咯的二甲基甲酰胺溶液中加热反应并加入柠檬酸三钠溶液制备得到聚吡咯‑纳米金复合材料，最后将聚吡咯‑纳米金复合材料涂于丝网印刷碳电极的表面，与涂有铅离子核酸适配体层的工作电极组成电化学传感器。本发明能够很灵敏，准确的检测铅离子的含量，并绘制了相应的工作曲线。用该传感器检测土壤溶液中的铅离子其检测限0.038nmol/L，线性范围为0.5‑10nmol/L。该方法还具有很好的重现性和稳定性。通过对土壤溶液的检测，进一步验证了该方法的在铅离子检测方面的可行性。

Description

基于核酸适配体的铅离子电化学传感器的制备方法
技术领域
本发明涉及的是一种传感分析领域的技术，具体是一种基于核酸适配体的重金属离子电化学传感器的制备方法及应用。
背景技术
核酸适配体aptamer是一段脱氧核糖核酸DNA序列，可以通过体外筛选出具有特定序列的一种物质，它能与目标物结合具有特异性高、选择性强的特点。它是一种新型的识别分子，具有许多优点，如可化学合成、稳定性好且没有毒性。大量研究表明，铅离子核酸适配体能够特异性识别铅离子并且形成G-四连体结构。
近年来，具有特殊性质(例如，表面效应、量子尺寸效应、宏观量子隧道效应以及独特的物理化学性质)的纳米材料被应用到各个领域中。将纳米材料应用到生物传感器中开辟了一种非常有价值的研究DNA生物传感器的新思路。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于核酸适配体的重金属离子电化学传感器的制备方法及应用，首次将聚吡咯-纳米金复合材料涂在丝网印刷碳电极上对电化学信号进行放大，核酸适配体中特定碱基与金属离子的特异性结合的特点，在核酸适配体与铅离子结合前后，其相对应的电流信号会发生变化，以此来判断铅离子的含量，本发明检测限达到0.038nmol/L，线性范围为0.5-10nmol/L。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种基于核酸适配体的重金属离子电化学传感器的制备方法，将四氯合金酸的水溶液滴加入聚吡咯的二甲基甲酰胺溶液中加热反应并加入柠檬酸三钠溶液制备得到聚吡咯-纳米金复合材料，最后将聚吡咯-纳米金复合材料涂于丝网印刷碳电极的表面，与涂有铅离子核酸适配体层的工作电极组成电化学传感器。
所述的聚吡咯，通过将硫酸铵的盐酸溶液缓慢滴加到吡咯单体的盐酸溶液中充分反应得到。
所述的硫酸铵的盐酸溶液，通过将过硫酸铵溶于盐酸水溶液中制备得到，其浓度为176mg/mL。
所述的吡咯单体的盐酸溶液，通过在盐酸水溶液中加入吡咯单体并搅拌得到，其浓度为27mg/mL。
所述的充分反应是指：将硫酸铵的盐酸溶液缓慢滴加到吡咯单体盐酸溶液中，持续搅拌12h，得到黑色固体经离心处理和去离子水洗涤后真空干燥6h。
所述的四氯合金酸的水溶液，通过将2mL 1％的氯金酸水溶液加入去离子水中进行磁力搅拌、加热得到，其浓度为0.28mg/mL。
所述的聚吡咯的二甲基甲酰胺溶液，通过将聚吡咯溶于二甲基甲酰胺中并超声处理后得到，其浓度为50mg/mL。
所述的加热反应是指：将四氯合金酸加热并滴加聚吡咯悬浊液，待沸腾后迅速加入7mL1％的柠檬酸三钠溶液并继续加热，直到颜色变为酒红色后停止加热，待自然冷却至室温后依次进行离心、洗剂、真空干燥，即可得到聚吡咯-纳米金复合材料。
所述的涂于丝网印刷碳电极的表面是指：聚吡咯-纳米金复合材料的悬浊液滴加到丝网印刷碳电极的表面并在室温下干燥。
所述的悬浊液，通过将聚吡咯-纳米金复合材料加入到超纯水然后超声处理形成，其浓度为0.5mg/mL。
所述的涂有铅离子核酸适配体层的工作电极：通过在工作电极上均匀地涂覆3μL5.0μmol/L铅离子核酸适配体孵育1.5h后用0.01mol/L PBS冲洗该工作电极，洗去未结合的核酸适配体得到。
本发明涉及上述基于核酸适配体的重金属离子电化学传感器的应用，即用于检测重金属离子。
所述的检测具体为通过预制差分脉冲伏安曲线对待测样品溶液进行检测得到重金属离子浓度。
所述的差分脉冲伏安法曲线，通过设置扫描电位范围为-0.1～0.3V，扫速为0.1V/S，对已知浓度的重金属离子进行检测，扫描完成后根据重金属离子添加前后的峰电流的大小与重金属离子浓度的关系，绘制工作曲线。
技术效果
与现有技术相比，本发明的优点在于：通过该新型复合导电材料对电流信号的有效放大，使结果更加准确，而且重现性好，操作简单。
附图说明
图1为本发明中传感器的层层组装及检测Pb2+的示意图；
图2为聚吡咯-纳米金复合材料的扫描电镜示意图；
图3为CV测定的电极修饰过程示意图；
图中：(a)裸电极，(b)复合材料修饰电极，(c)复合材料/核酸适配体修饰电极，(d)复合材料/核酸适配体/铅离子修饰电极；
图4A为差分脉冲伏安法测定不同浓度的不同浓度的铅离子与DPV关系示意图；
图4B为差分脉冲伏安法测定不同浓度的铅离子与电流差值关系示意图；
图中：(a)10.0，(b)7.5，(c)5.0，(d)3.75，(e)2.5，(f)1.25，(g)1.0，(h)0.75，(i)0.5nM。
具体实施方式
纳米金和聚吡咯复合材料的制备
步骤1、聚吡咯单体的制备：在35mL 0.1mol/L的盐酸中加入1mL吡咯单体并用搅拌器搅拌30min。同时将3.51g过硫酸铵溶于20mL 0.1mol/L的盐酸中，并将该溶液缓慢滴加到吡咯单体盐酸溶液中，持续搅拌12h。将反应完后的溶液用离心机12000r/min离心15min，得到的固体用离子水洗剂并离心，重复洗剂三次后用真空干燥箱60℃干燥6h得到聚吡咯。
步骤2、聚吡咯-纳米金混合材料的制备：将0.1g聚吡咯溶于2mL二甲基甲酰胺中并超声15min。同时将2mL 1％氯金酸水溶液加入到70mL去离子水中进行磁力搅拌、加热，并逐滴加入聚吡咯悬浊液，等溶液沸腾后迅速加入7mL 1％的柠檬酸三钠溶液并继续加热，直到颜色由亮红色变为酒红色后停止加热并冷却至室温。将得到的溶液在12000r/min作用下离心15min，将生成物用去离子水清洗6次后用真空干燥箱60℃干燥6h即可得到如图1所示的聚吡咯-纳米金复合物。
步骤3、基于核酸适配体的电化学传感器的制备：
3.1称取2mg聚吡咯-纳米金复合材料加入到4mL超纯水，用超声10分钟形成均匀的悬浊液。之后取3μL该悬浊液均匀涂到丝网印刷碳电极的工作电极表面并在室温下干燥2h；
3.2在工作电极上均匀地涂覆浓度为3μL 5.0μmol/L的铅离子核酸适配体(核苷酸片段为5’-GGGTGGGTGGGTGGGT-3’)室温下孵育1.5h后用0.01mol/L PBS冲洗修饰电极，洗去未结合的核酸适配体，电化学传感器形成，放在4℃冰箱中保存。如图2所示，在电极修饰的每一步中，都用电化学循环伏安法(CV)进行了信号检测，扫描范围-0.2V-0.6V，扫描速率50mV·s-1。用聚吡咯-纳米金复合材料修饰电极后，其电流信号极度增大，为整个传感器的制备提供了基础，该材料为以后的电化学传感器制备提供了技术支持。
铅离子含量的检测
步骤a、用电话学工作站(上海辰华仪器公司，CHI1030A)的差分脉冲伏安法测定电流(DPV)，扫描电位范围为-0.1～0.3V，扫速为0.1V/S，记录数据I。
步骤b、将3μL核酸适配体均匀涂到电化学传感器中的工作电极上孵育30min后，再次用脉冲伏安法测定电流，扫描电位范围为-0.1～0.3V，扫速为0.1V/S，记录数据I’。
步骤c、根据电流的差值ΔI(I和I’的差值)绘制工作曲线。
步骤d、将消煮好的重金属污染土壤的代替铅离子水溶液进行检测，其0.038nmol/L，线性范围为0.5-10nmol/L。如图3所示，结果充分说明了运用电化学生物传感器检测铅离子是一种新型有效的方法。
上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。

Claims (9)

1.一种基于核酸适配体的重金属离子电化学传感器的制备方法，其特征在于，将四氯合金酸的水溶液滴加入聚吡咯的二甲基甲酰胺溶液中加热反应并加入柠檬酸三钠溶液制备得到聚吡咯-纳米金复合材料，最后将聚吡咯-纳米金复合材料涂于丝网印刷碳电极的表面，与涂有铅离子核酸适配体层的工作电极组成电化学传感器。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的聚吡咯，通过将硫酸铵的盐酸溶液缓慢滴加到吡咯单体的盐酸溶液中充分反应得到。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的充分反应是指：将硫酸铵的盐酸溶液缓慢滴加到吡咯单体盐酸溶液中，持续搅拌12h，得到黑色固体经离心处理和去离子水洗涤后真空干燥6h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的加热反应是指：将四氯合金酸加热并滴加聚吡咯悬浊液，待沸腾后迅速加入7mL 1％的柠檬酸三钠溶液并继续加热，直到颜色变为酒红色后停止加热，待自然冷却至室温后依次进行离心、洗剂、真空干燥，即可得到聚吡咯-纳米金复合材料。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的涂于丝网印刷碳电极的表面是指：聚吡咯-纳米金复合材料的悬浊液滴加到丝网印刷碳电极的表面并在室温下干燥。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的涂有铅离子核酸适配体层的工作电极：通过在工作电极上均匀地涂覆3μL 5.0μmol/L铅离子核酸适配体孵育1.5h后用0.01mol/L PBS冲洗该工作电极，洗去未结合的核酸适配体得到。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征是，所述的铅离子核酸适配体，其核苷酸片段为5’-GGGTGGGTGGGTGGGT-3’。
8.一种基于上述任一权利要求所述方法制备得到的核酸适配体的重金属离子电化学传感器的应用，其特征在于，通过预制差分脉冲伏安曲线对待测样品溶液进行检测得到重金属离子浓度。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征是，所述的差分脉冲伏安法曲线，通过设置扫描电位范围为-0.1～0.3V，扫速为0.1V/S，对已知浓度的重金属离子进行检测，扫描完成后根据重金属离子添加前后的峰电流的大小与重金属离子浓度的关系，绘制工作曲线。
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