CN110579523B - 用于检测铅的生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测铅的生物传感器及其制备方法和应用，该生物传感器包括在三电极系统中用作工作电极的玻碳电极，玻碳电极的反应端表面修饰有还原氧化石墨烯，还原氧化石墨烯表面修饰有金纳米粒子，金纳米粒子表面自组装有巯基和二茂铁修饰的探针P，探针P为具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。制备方法包括玻碳电极修饰还原氧化石墨烯、修饰金纳米粒子、组装并连接探针P等步骤。本发明的生物传感器使用寿命长、抗干扰能力强、且检测精度和效率高，制备方法成本低廉、简单快速，可用于高效检测铅，抗干扰能力强、检测精度和效率高。

Description

用于检测铅的生物传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物传感器制备技术领域，涉及一种用于检测铅的生物传感器及其制备方法和应用，尤其涉及一种用单链DNA酶以及双信号扩增检测铅的生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
随着科技进步及社会发展，人们生活水平日益提高，但与此同时重金属污染等一系列问题频发，严重威胁了人们的生命健康及财产安全。重金属污染主要表现在水污染中，重金属会随雨水作用汇集在江河中或者渗入地下，重金属不能被生物降解，且具有生物累积性，人类通过饮水和食物链使重金属在体内聚集而引发各种疾病。一些重金属诸如铅，汞，铬等在水中不能被分解，会滞留在机体的肾脏、肺等靶器官中，从而对人或动物的机体造成不可逆的损伤。
铅及其化合物是一种不可降解的环境污染物，性质稳定，可通过废水、废气、废渣大量流入环境，产生污染，危害人体健康。铅对机体的损伤呈多系统性、多器官性，包括对骨髓造血系统、神经系统、消化系统及其他系统的毒害作用。作为中枢神经系统毒物，铅对儿童健康和智力的危害更为严重。为此，美国环境保护署将饮用水中Pb2+的最大污染水平规定为72nM。目前检测Pb2+最常用的技术方法有原子吸收光谱法、电感耦合等离子体光发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法、电感耦合等离子体原子发射光谱法和X射线荧光光谱法。虽然这些方法对于Pb2+的测定是灵敏和精确的，但它们依赖于昂贵的仪器和复杂的样品制备过程。因此，研究出一种快速、简便、低成本、高灵敏性的铅离子检测手段具有十分重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种使用寿命长、抗干扰能力强、检测精度和效率高的用于检测铅的生物传感器，并相应地提供一种方法简单、成本低廉、制作快速的用于检测铅的生物传感器的制备方法，在此基础上，还提供一种前述用于检测铅的生物传感器的应用，该应用能够以低成本、操作简单、快速响应、高检测精度及较强抗干扰性等特点实现对铅离子的高效检测。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案。
一种用于检测铅的生物传感器，包括在三电极系统中用作工作电极的玻碳电极，所述玻碳电极的反应端表面修饰有还原氧化石墨烯，所述还原氧化石墨烯表面修饰有金纳米粒子，所述金纳米粒子表面自组装有巯基和二茂铁修饰的探针P，所述探针P为具有SEQID No.1所示的核苷酸序列。
上述的生物传感器中，探针P的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，巯基和二茂铁修饰后的探针P具体为：
5′-SH-(CH2)6-CATCTCTTC-TCCGAGCCGGTCGAA-ATAGTGAGT-TTTTTT-ACTCACTAT-rA-GGAAGAGATG-Fc-3′(Fc＝ferrocene)，
或者可以写成：
5′-SH-(CH2)6-CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGTTTTTTTACTCACTATrAGGAAGAGATG-Fc-3′(Fc＝ferrocene)。
上述巯基和二茂铁修饰的探针P中包含了酶链和底物链，酶链和底物链可以自杂交成发夹结构，当Pb2+存在时，探针P发生结构转变，底物链被从中间切断形成松散的单链DNA结构。
探针P中酶链为：5′-SH-(CH2)6-CATCTCTTC-TCCGAGCCGGTCGAA-ATAGTGAGT-3′，探针P中底物链为：5′-ACTCACTAT-rA-GGAAGAGATG-Fc-3′。
上述的生物传感器中，在铅离子不存在时，包含酶链和底物链的DNA探针P通过碱基配对形成发夹结构，稳定地连接在玻碳电极反应端表面；在铅离子存在时，DNA探针P上底物链的rA位点被识别裂解形成单链，此时，DNA探针P的发夹结构被打开，二茂铁信号分子端远离电极表面，引起还原电流的变化，溶液中提供的铁氰化物流通提供的电流信号也会发生变化。随着铅离子浓度的增加，远离电极表面的二茂铁信号分子数量也增加，我们可以通过分析铅离子浓度和由二茂铁引起的还原电流的变化以及铁氰化物导致的电信号变化的关系而实现对铅离子的高效检测。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种用于检测铅的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
S1、修饰还原氧化石墨烯：准备玻碳电极，将还原氧化石墨烯分散于水中，然后滴涂于所述玻碳电极的反应端表面，得到还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极；
S2、修饰金纳米粒子：在所述还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极的反应端表面电沉积金纳米粒子，得到金纳米粒子/还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极；
S3、组装探针P：在所述金纳米粒子/还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极的反应端表面滴加巯基和二茂铁修饰的探针P，巯基和二茂铁修饰的探针P通过金硫共价键固定在所述金纳米粒子/还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极的反应端表面，得到组装有巯基和二茂铁修饰的探针P的金纳米粒子/还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极，即得到用于检测铅的生物传感器。
上述的用于检测铅的生物传感器的制备方法中，优选的，所述步骤S1中，所述还原氧化石墨烯与水的质量体积比为0.5mg～2mg∶1mL，所述分散为超声分散，所述超声分散的时间为0.5h～4h。
上述的用于检测铅的生物传感器的制备方法中，优选的，所述步骤S1中，所述还原氧化石墨烯主要由以下方法制备得到：
S1-1、合成氧化石墨烯：将石墨粉加入浓硫酸中，在冰水浴中搅拌冷却至5℃～10℃，石墨粉与浓硫酸的质量体积比为20mg～50mg∶1mL，然后加入1g～2g硝酸钾和7g～8g高锰酸钾混合，在25℃～40℃搅拌1h～2h，再加入100mL～150mL的水，将温度升至95℃～100℃并保持30min～60min，再用300mL～350mL的水稀释，并用100mL～150mL双氧水处理，经过滤、洗涤和干燥，得到氧化石墨烯；
S1-2、合成还原氧化石墨烯：将上述制得的氧化石墨烯和水混合并超声分散2h～3h，氧化石墨烯与水的质量体积比为1mg～2mg∶1mL，然后加入1mL～10mL的水合肼溶液，在95℃～100℃的油浴中搅拌回流24h～26h，经过滤、洗涤和干燥，得到还原氧化石墨烯。
上述的用于检测铅的生物传感器的制备方法中，优选的，所述步骤S2中，将还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极放入氯金酸水溶液中，采用循环伏安法将金纳米粒子电沉积在所述还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极的反应端表面，所述循环伏安法中扫描电位为0～1.8V，扫描速率为20mV/s～50mV/s，扫描圈数为3圈～6圈。
上述的用于检测铅的生物传感器的制备方法中，优选的，所述步骤S3的具体过程为：将10μL～20μL巯基和二茂铁修饰的探针P滴加在所述金纳米粒子/还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极的反应端表面，在4℃下反应10h～12h，再转入6-巯基-1-己醇溶液中培养1h～2h，得到组装有巯基和二茂铁修饰的探针P的金纳米粒子/还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的用于检测铅的生物传感器或者上述的制备方法制得的用于检测铅的生物传感器在检测铅中的应用。
上述的应用中，优选的，所述应用包括以下步骤：
(1)将用于检测铅的生物传感器浸泡在含有铅离子的水溶液中40min～120min，取出冲洗后浸泡在含有铁氰化物的磷酸盐缓冲溶液中，用差分脉冲伏安法进行测量，其中，所述生物传感器上的二茂铁是作为信号分子使用的，所述磷酸盐缓冲溶液中的铁氰化物也是作为信号分子使用的；
(2)根据铅离子浓度与电流值的变化构建线性回归方程，根据线性回归方程即可测定待测溶液中的铅离子浓度。
上述的应用中，优选的，所述铅离子浓度与电流值的变化的线性回归方程为：
y＝(14.25611±0.17368)x+(260.31871±1.2554) (1)
式(1)中，y为铅离子检测时不同浓度的Pb2+的电流峰值，即I，单位为μA；x为待测溶液中铅离子浓度值的对数值，即lg[Pb2+]，单位为M；式(1)的相关系数R2＝0.99904，铅离子检测线性范围为0.05nM～400000nM，检出限为0.015nM。
上述的应用中，优选的，所述含有铁氰化物的磷酸盐缓冲溶液中，所述铁氰化物为铁氰化钾K3[Fe(CN)6]和亚铁氰化钾K4[Fe(CN)6]的混合物，其中，所述铁氰化钾K3[Fe(CN)6]的浓度为1mM～5mM，所述亚铁氰化钾K4[Fe(CN)6]的浓度为1mM～5mM，所述磷酸盐的浓度为10mM～100mM；
所述含有铁氰化物的磷酸盐缓冲溶液中还包含有氯化钾，所述氯化钾的浓度为10mM～100mM。
更优选的，所述含有铁氰化物的磷酸盐缓冲溶液中，磷酸盐的浓度为100mM，[Fe(CN)6]3-与[Fe(CN)6]4-的浓度比为1∶1。
本发明中，浓度单位中的M指mol/L。
本发明的主要创新点在于：
1、本发明用于检测铅的生物传感器采用还原氧化石墨烯、金纳米粒子和巯基和二茂铁修饰的探针P协同检测铅离子，该设计思路是本发明的独创，现有技术中，并未有采用还原氧化石墨烯或其类似物来检测铅的相关技术，而还原氧化石黑烯也未显示出具有这方面的潜力，而单纯采用DNA链检测铅离子的电化学生物方法由于缺乏电极修饰优化的过程，通常检测范围窄，检测限高，存在很大的局限性，本发明的生物传感器采用还原氧化石墨烯、金纳米粒子和DNA链的协同增效作用来检测铅离子，可实现明显优于现有技术的铅离子检测效果，检测灵敏度和选择性都更好。
2、本发明的生物传感器采用了金纳米粒子/还原氧化石墨烯修饰玻碳电极，还原氧化石墨烯具有巨大的比表面积和良好的导电性，此外，由于金纳米粒子的高导电性和优良的生物相容性，使得该材料具有大量的活性位点，催化性能显著提高以及具有更高的电子转移速率，很大程度上提高了该材料电化学检测性能，使得生物传感器的铅离子检测线性范围在0.05nM～400000nM，检出限为0.015nM，而现有常规生物传感器检测线性范围通常较窄，检出限相对较高，本发明明显优于现有技术。
3、本发明的生物传感器采用巯基和二茂铁修饰的探针P连接在金纳米粒子/还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极表面，该探针P包含酶链和底物链，可在修饰电极表面自杂交成发夹结构，DNA链一次性加入，操作更简便省时，提高了活性物质的负载量以及本发明生物传感器的检测灵敏性。
4、本发明的生物传感器采用双信号检测铅离子。二茂铁信号分子标记在DNA链上，根据距离电极的远近提供不同的还原电流，铁氰化物分散在磷酸盐缓冲电解液中，通过在电极表面流通时的受阻情况不同反映不同的电信号，双信号能够大大提高本发明生物传感器的检测灵敏性。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供的用于检测铅的生物传感器具有优化的微观结构，首先，将玻碳电极用还原氧化石墨烯修饰，还原氧化石墨烯具有巨大的比表面积，使金纳米粒子能够更多地固定在修饰电极表面，其次，还原氧化石墨烯具有优越的电子传递能力和导电性能，能够显著提高生物传感器和待测溶液间电子的转移速度；此外，电沉积的金纳米粒子为探针P提供了结合位点，使得探针P通过金硫共价键(Au-S)能够稳定地固定在玻碳电极上，对生物传感器起到了协同增效作用，大大提高了生物传感器的稳定性、重复性和传感器结构的可靠性，同时也提高了生物传感器的检测水平。
(2)本发明提供的用于检测铅的生物传感器特异性强、检测精度高、效率高、成本低廉，可以实现对铅离子的高效检测，对铅离子检测线性范围为0.05nM～400000nM，检出限为0.015nM。
(3)本发明的生物传感器的制备方法不仅步骤简单、成本合理，且制作效率高。
(4)本发明采用生物传感器检测重金属铅离子的应用方法是：在铅离子不存在时，包含酶链和底物链的DNA探针P通过碱基配对形成发夹结构，稳定地连接在玻碳电极反应端表面；在铅离子存在时，DNA探针P的底物链被切断形成单链，此时，DNA探针P的发夹结构被打开，二茂铁信号分子端远离电极表面，引起还原电流的变化，磷酸盐缓冲溶液中铁氰化物流通提供的电流信号也会发生变化。随着铅离子浓度的增加，远离电极表面的二茂铁信号分子数量也增加，我们可以通过分析铅离子浓度和由二茂铁引起的还原电流的变化以及铁氰化物导致的电信号变化的关系而实现对铅离子的高效检测。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例2中用于检测铅的生物传感器的制备流程示意图。
图2为本发明实施例2中的还原氧化石墨烯的透射电镜图。
图3为本发明实施例3中Pb2+溶液浓度与差分脉冲伏安曲线的电流值的线性回归曲线图。
图4为本发明实施例4的用于检测铅的生物传感器检测的再现性图。
图5为本发明实施例5的用于检测铅的生物传感器检测不同金属离子得到的选择性图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1：
一种用于检测铅的生物传感器，包括一在三电极系统中用作工作电极的玻碳电极，玻碳电极的反应端表面修饰有还原氧化石墨烯，还原氧化石墨烯表面修饰有金纳米粒子，金纳米粒子表面自组装有巯基和二茂铁修饰的探针P，探针P为具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。该探针P中包含了可以自杂交成发夹结构的酶链和底物链，当Pb2+存在时，探针P发生结构转变，底物链被从中间切断形成松散的单链DNA结构。
探针P的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，巯基和二茂铁修饰的探针P具体如下：
5′-SH-(CH2)6-CATCTCTTC-TCCGAGCCGGTCGAA-ATAGTGAGT-TTTTTT-ACTCACTAT-rA-GGAAGAGATG-Fc-3′(Fc＝ferrocene)。
其中酶链为：5′-SH-(CH2)6-CATCTCTTC-TCCGAGCCGGTCGAA-ATAGTGAGT-3′，底物链为：5′-ACTCACTAT-rA-GGAAGAGATG-Fc-3′，rA是识别位点，其中r指RNA，A指核糖核苷酸RNA中的腺嘌呤核糖核苷酸，这是该段序列中唯一的RNA位点。
当待测水体中不存在铅离子时，包含酶链和底物链的探针P通过碱基配对形成发夹结构，稳定地连接在玻碳电极反应端表面；当待测水体中存在铅离子时，DNA探针P底物链上的rA位点被识别裂解形成单链，此时，探针P的发夹结构被打开，二茂铁信号分子端远离电极表面，引起还原电流的变化，溶液中提供的铁氰化物流通产生的电流信号也会发生变化。随着铅离子浓度的增加，远离电极表面的二茂铁信号分子数量也增加，我们可以通过分析铅离子浓度和由二茂铁引起的还原电流的变化以及铁氰化物导致的电信号变化的关系而实现对铅离子的高效检测。
实施例2
一种本发明的用于检测铅的生物传感器的制备方法，如图1所示，采用该制备方法可制备得到实施例1的生物传感器，该方法包括以下步骤：
S1、修饰还原氧化石墨烯：制作一玻碳电极，将4mg还原氧化石墨烯加入4mL超纯水中超声分散2h，然后逐滴滴加到玻碳电极反应端的表面，得到还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极。
还原氧化石墨烯是按照以下方法制备得到：
S1-1、合成氧化石墨烯：将2.5g石墨粉加入60mL浓硫酸(质量分数为98％)中，缓慢搅拌并在冰水浴中冷却至5℃，然后缓慢加入1.25g硝酸钾和7.5g高锰酸钾(持续30分钟以上)，在35℃搅拌1h后，加入120mL的水，将温度升至95℃并保持30min，再用350mL的水稀释悬浮液，并用100mL质量分数为6％的双氧水处理，以减少残留的高锰酸钾和二氧化锰。将悬浮液过滤，用1M的盐酸和水洗涤，随后对过滤残渣进行真空干燥，得到氧化石墨烯粉末。
S1-2、合成还原氧化石墨烯：将150mg的氧化石墨烯和100mL的超纯水加入烧瓶中，用超声波分散2h，然后在烧瓶中加入3mL的水合肼溶液(质量分数是85％)，混合均匀，溶液变成黑色。然后在95℃的油浴中搅拌回流24h并过滤。过滤残留物分别用500mL的水和500mL的甲醇洗涤几次，并在60℃下干燥。将合成的还原氧化石墨烯在超纯水中超声分散20h，得到还原氧化石墨烯。图2为本实施例还原氧化石墨烯的透射电镜图，从图2可知，该材料表面有大量绸缎式的褶皱，它有利于提供大的比表面积和大量的吸附位点。
S2、修饰金纳米粒子：将还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极放入质量分数为1％的氯金酸水溶液中，采用循环伏安法将金纳米粒子电沉积在还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极的反应端表面，循环伏安法中扫描电位为0～1.6V，扫描速率为20mV/s，扫描圈数为3圈，得到金纳米粒子/还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极。
S3、组装探针P：在金纳米粒子/还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极的反应端表面滴加10μL、1μM巯基和二茂铁修饰的探针P，在4℃下反应12h，使巯基和二茂铁修饰的探针P能够充分固定在金纳米粒子/还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极的反应端表面，然后将修饰电极浸泡在2mM的6-巯基-1-己醇溶液中培养1h，6-巯基-1-己醇能够对该修饰电极的表面进行封端，减少巯基和二茂铁修饰的探针P的非特异性吸附并且让探针P稳定地立在电极表面，再用Tris-醋酸溶液冲洗后，干燥，得到组装有巯基和二茂铁修饰的探针P的金纳米粒子/还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极，即为用于检测铅的生物传感器。
实施例3
一种本发明的用于检测铅的生物传感器在检测铅中的应用，该生物传感器具体为实施例1的生物传感器，也可采用实施例2制备得到的生物传感器，应用包括以下步骤：
(1)以用于检测铅的生物传感器的玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，将三个电极与电化学工作站连接，建立三电极系统。
(2)将本发明的用于检测铅的生物传感器浸泡在Pb2+浓度分别为0nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1.0nM、5.0nM、10.0nM、50.0nM、100.0nM、500.0nM、1000.0nM、5000.0nM、10000.0nM、50000.0nM、100000.0nM和400000.0nM的Pb2+的水溶液中，在37℃水浴锅中培养40min，取出用Tris-醋酸溶液冲洗、干燥后，置于磷酸盐缓冲溶液中以相同的方式测试差分脉冲伏安曲线。磷酸盐缓冲溶液中含有铁氰化物和氯化钾，铁氰化物为铁氰化钾K3[Fe(CN)6]和亚铁氰化钾K4[Fe(CN)6]的混合物，铁氰化钾K3[Fe(CN)6]的浓度为5mM，亚铁氰化钾K4[Fe(CN)6]的浓度为5mM，磷酸盐的浓度为100mM，氯化钾的浓度为10mM。
(3)根据铅离子浓度与电流值的变化构建线性回归方程。
图3是Pb2+溶液浓度与差分脉冲伏安曲线的电流值的线性回归曲线图，从图3中可知，铅离子浓度与电流值的变化的线性回归方程为：
y＝(14.25611±0.17368)x+(260.31871±1.2554) (1)
式(1)中，y为铅离子检测时不同浓度的Pb2+的电流峰值，即I，单位为μA；x为待测溶液中铅离子浓度值的对数值，即lg[Pb2+]，单位为M；式(1)的相关系数R2＝0.99904，铅离子检测线性范围为0.05nM～400000nM，检出限为0.015nM(检出限按照3倍空白样的标准偏差计算)。
实施例4
对用于检测铅的生物传感器的再现性进行检查。
为了验证实施例1的生物传感器及其检测方法的检测效果，按照实施例2的制备方法制备5个生物传感器，将5个生物传感器用于检测同一浓度的铅离子(铅离子浓度为1000.0nM)，检测结果参见图4。从图4中可知，5个生物传感器检测同一浓度的铅离子，相对标准偏差为1.07％，表明按照实施例2的制备方法制备的生物传感器有较好的再现性。
实施例5
对用于检测铅的生物传感器的选择性进行检查。
为了进一步验证实施例1的生物传感器的高选择性，现将1000.0nM的Pb2+以及100000.0nM的Ag+、Al3+、Ca2+、Cd2+、Co2+、Cu2+、Fe3+、Hg2+、K+、Mg2+、Mn2+、Ni2+和Zn2+溶液用实施例1的生物传感器进行测定(测定方法参照实施例3)，测定结果如图5所示，图5中的Mix指的是包括Pb2+在内的所有干扰离子的混合溶液。
从图5中可知，实施例1的生物传感器对Pb2+选择性高，不受Ag+、Al3+、Ca2+、Cd2+、Co2 +、Cu2+、Fe3+、Hg2+、K+、Mg2+、Mn2+、Ni2+和Zn2+等其他污染物的干扰。
实施例6
用于检测铅的生物传感器的实样检测。
取当地湘江水、桃子湖水和自来水分别配制3组不同铅离子浓度的待测溶液，分别用电感耦合等离子体质谱法和实施例1的生物传感器进行实样测定(测定方法参照实施例3)。
具体的实验步骤：取长沙当地湘江水、桃子湖水以及自来水，经过过滤等一系列预操作后，将河水、湖水和自来水平均分为三份，配制成浓度分别为100.0nM、10000.0nM和100000.0nM的待测溶液。分别用电感耦合等离子体质谱法和实施例1的用于检测铅的生物传感器检测待测溶液中的铅离子浓度，结果列于表1中。
表1由本发明的生物传感器和电感耦合等离子体质谱法对实际环境样品中Pb2+的检测结果
Figure BDA0002199073750000091
从表1中可以直观地看出，两种检测方法的检测结果基本相似。说明本发明制备用于检测铅的生物传感器具有很大的应用潜力。此外，与电感耦合等离子体质谱法相比，本发明的生物传感器还具有一些突出的优点：操作简单、仪器可便携以及不需要专业的技术操作等。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 湖南大学
<120> 用于检测铅的生物传感器及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(59)
<223> 根据实验要求而设计，以作为用于检测铅的生物传感器的探针P
<220>
<221> misc_feature
<222> (49)
<223> 根据实验要求而设计，以作为探针P中的RNA识别位点
<400> 1
catctcttct ccgagccggt cgaaatagtg agttttttta ctcactatag gaagagatg 59

Claims (10)

1.一种用于检测铅的生物传感器，包括在三电极系统中用作工作电极的玻碳电极，其特征在于，所述玻碳电极的反应端表面修饰有还原氧化石墨烯，所述还原氧化石墨烯表面修饰有金纳米粒子，所述金纳米粒子表面自组装有巯基和二茂铁修饰的探针P，所述探针P为具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一种用于检测铅的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
S1、修饰还原氧化石墨烯：准备玻碳电极，将还原氧化石墨烯分散于水中，然后滴涂于所述玻碳电极的反应端表面，得到还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极；
S2、修饰金纳米粒子：在所述还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极的反应端表面电沉积金纳米粒子，得到金纳米粒子/还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极；
S3、组装探针P：在所述金纳米粒子/还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极的反应端表面滴加巯基和二茂铁修饰的探针P，所述探针P为具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，巯基和二茂铁修饰的探针P通过金硫共价键固定在所述金纳米粒子/还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极的反应端表面，得到组装有巯基和二茂铁修饰的探针P的金纳米粒子/还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极，即得到用于检测铅的生物传感器。
3.根据权利要求2所述的用于检测铅的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述还原氧化石墨烯与水的质量体积比为0.5mg～2mg∶1mL，所述分散为超声分散，所述超声分散的时间为0.5h～4h。
4.根据权利要求2所述的用于检测铅的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述还原氧化石墨烯由以下方法制备得到：
S1-1、合成氧化石墨烯：将石墨粉加入浓硫酸中，在冰水浴中搅拌冷却至5℃～10℃，石墨粉与浓硫酸的质量体积比为20mg～50mg∶1mL，然后加入1g～2g硝酸钾和7g～8g高锰酸钾混合，在25℃～40℃搅拌1h～2h，再加入100mL～150mL的水，将温度升至95℃～100℃并保持30min～60min，再用300mL～350mL的水稀释，并用100mL～150mL双氧水处理，经过滤、洗涤和干燥，得到氧化石墨烯；
S1-2、合成还原氧化石墨烯：将上述制得的氧化石墨烯和水混合并超声分散2h～3h，氧化石墨烯与水的质量体积比为1mg～2mg∶1mL，然后加入1mL～10mL的水合肼溶液，在95℃～100℃的油浴中搅拌回流24h～26h，经过滤、洗涤和干燥，得到还原氧化石墨烯。
5.根据权利要求2～4中任一项所述的用于检测铅的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，将还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极放入氯金酸水溶液中，采用循环伏安法将金纳米粒子电沉积在所述还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极的反应端表面，所述循环伏安法中扫描电位为0～1.8V，扫描速率为20mV/s～50mV/s，扫描圈数为3圈～6圈。
6.根据权利要求2～4中任一项所述的用于检测铅的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤S3的具体过程为：将10μL～20μL巯基和二茂铁修饰的探针P滴加在所述金纳米粒子/还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极的反应端表面，在4℃下反应10h～12h，再转入6-巯基-1-己醇溶液中培养1h～2h，得到组装有巯基和二茂铁修饰的探针P的金纳米粒子/还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极。
7.一种如权利要求1所述的用于检测铅的生物传感器或者如权利要求2～6中任一项所述的制备方法制得的用于检测铅的生物传感器在检测铅中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
（1）将用于检测铅的生物传感器浸泡在含有铅离子的水溶液中40min～120min，取出冲洗后浸泡在含有铁氰化物的磷酸盐缓冲溶液中，用差分脉冲伏安法进行测量，其中，所述生物传感器上的二茂铁是作为信号分子使用的，所述磷酸盐缓冲溶液中的铁氰化物也是作为信号分子使用的；
（2）根据铅离子浓度与电流值的变化构建线性回归方程，根据线性回归方程即可测定待测溶液中的铅离子浓度。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述铅离子浓度与电流值的变化的线性回归方程为：
y = (14.25611 ± 0.17368)x + (260.31871 ± 1.2554) （1）
式（1）中，y为铅离子检测时不同浓度的Pb2+的电流峰值，即I，单位为μA；x为待测溶液中铅离子浓度值的对数值，即lg[Pb2+]，Pb2+浓度的单位为M；式（1）的相关系数R2=0.99904，铅离子检测线性范围为0.05nM～400000nM，检出限为0.015nM。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述含有铁氰化物的磷酸盐缓冲溶液中，所述铁氰化物为铁氰化钾K3[Fe(CN)6]和亚铁氰化钾K4[Fe(CN)6]的混合物，其中，所述铁氰化钾K3[Fe(CN)6]的浓度为1mM～5mM，所述亚铁氰化钾K4[Fe(CN)6]的浓度为1mM～5mM，所述磷酸盐的浓度为10mM～100mM；
所述含有铁氰化物的磷酸盐缓冲溶液中还包含有氯化钾，所述氯化钾的浓度为10mM～100mM。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104020204A (zh) * 2014-06-19 2014-09-03 湖南大学 一种用于检测铅的电化学传感器及其制备方法和应用
CN104483366A (zh) * 2014-12-05 2015-04-01 湖南大学 一种用于检测铅的生物传感器及其制备方法和应用
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007120299A2 (en) * 2005-11-29 2007-10-25 The Regents Of The University Of California Signal-on architecture for electronic, oligonucleotide-based detectors

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104020204A (zh) * 2014-06-19 2014-09-03 湖南大学 一种用于检测铅的电化学传感器及其制备方法和应用
CN104483366A (zh) * 2014-12-05 2015-04-01 湖南大学 一种用于检测铅的生物传感器及其制备方法和应用
CN108410953A (zh) * 2018-03-09 2018-08-17 湖南大学 一种用于检测汞的生物传感器及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Annual Review of Analytical Chemistry;Zhang, Xiao-Bing et al.;《Annual Review of Analytical Chemistry》;20110301;第4卷(第1期);全文 *
Au nanoparticles decorated C60 nanoparticle-based label-free electrochemiluminesence aptasensor via a novel "on-off-on" switch system;Zhao, Min et al.;《Biomaterials》;20150601;第52卷;全文 *
Cleavage of Metal-Ion-Induced DNAzymes Released from Nanolabels for Highly Sensitive and Specific Immunoassay;Zhang, Bing et al.;《Bioconjugate Chemistry》;20130417;第24卷(第4期);全文 *
DNAzymes for sensing, nanobiotechnology and logic gate applications;Willner, Itamar et al.;《Chemical Society Reviews》;20080424;第37卷(第6期);全文 *
Electrochemiluminescence of graphitic carbon nitride and its application in ultrasensitive detection of lead(II) ions;Zhang, Yan et al.;《Analytical and Bioanalytical Chemistry》;20161001;第408卷(第25期);全文 *
Engineering a Unimolecular DNA-Catalytic Probe for Single Lead Ion Monitoring;Wang, Hui et al.;《Journal of the American Chemical Society》;20090617;第131卷(第23期);全文 *
Rationally designed molecular beacons for bioanalytical and biomedical applications;Zheng, Jing et al.;《Chemical Society Reviews》;20150317;第44卷(第10期);全文 *

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