KR20080017738A

KR20080017738A - 나노어레이 단백질 칩 및 이것의 제조 방법

Info

Publication number: KR20080017738A
Application number: KR1020060079302A
Authority: KR
Inventors: 정형일; 김경희; 김정동; 김성규
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2006-08-22
Filing date: 2006-08-22
Publication date: 2008-02-27
Also published as: WO2008023907A1

Abstract

본 발명은 나노어레이 단백질 칩에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 핀 마이크로어레이 (pin microarray) 방식이나 잉크젯 (inkjet) 방식을 사용하여 나노어레이 단백질 패턴이 제공된다. 본 발명에 따른 나노어레이 단백질 칩은 단일분자 수준에서 그 기능이 유지되는 질환 관련 단백질 등의 상호작용 연구에 중요한 수단을 제공할 수 있다.

나노어레이 단백질 칩, DPN (dip-pen nanolithography)

Description

나노어레이 단백질 칩 및 이것의 제조 방법 {NANOARRAY PROTEIN CHIP AND THE METHOD FOR PREPARING THEREOF}

도 1은 본 발명에 사용된 DPN을 이용한 나노어레이 과정을 나타낸다.

도 2는 DPN을 이용한 나노어레이 과정과 유리 표면위에 MPTMS [3-(mercaptopropyl)-trimethoxysilane], 말레이미도 (maleimido)-C3-NTA와 Ni이온, 및 히스티딘-단백질의 순차적 결합을 나타낸 것이다.

도 3은 유리기판상 NTA/Ni²⁺ 나노어레이를 나타낸 사진이다.

도 4는 NTA/Ni²⁺의 나노어레이에 히스티딘-형광단백질 (EGFP, enhanced green fluorescence protein)이 선택적으로 결합함을 나타낸 사진이다.

도 5는 다수의 AFM 탐침을 이용하여 복수의 NTA/Ni²⁺ 나노어레이를 구현하는 과정을 나타낸 것이다.

도 6은 NTA/Ni²⁺의 나노어레이에 핀어레이 또는 잉크젯 프린팅 방법을 적용하여, 단백질칩을 제조하는 것을 나타낸다.

도 7은 서로 다른 단백질로 스팟팅 된 단백질칩을 세척하여 나노단백질칩을 제작하는 과정을 나타낸다.

도 8은 히스티딘-단백질이 균주에서 발현된 후 분리 정제없이, NTA/Ni²⁺ 나노어레이에 결합함을 나타낸다.

도 9는 히스티딘 결합된 HRP (horseradish peroxidase)가 NTA/Ni²⁺로 나노패턴된 유리 기판상에서 활성을 가짐을 나타낸다.

도 10은 제조된 NTA/Ni²⁺로 나노어레이를 재사용할 수 있음을 보여주는 것이다. 이미다졸로 세척 (b) 한 후 세척된 NTA/Ni²⁺ 나노어레이에 재결합시킨 히스티딘-형광단백질 (c)의 활성을 세척되기 전의 활성 (a)과 비교한 것이다.

* 도면부호의 간단한 설명

10: 마이크로어레이어 51: Automatic force microscope의 탐침

20: 기판 52: NTA/Ni²⁺

50: Automatic force microscope 60: 핀어레이어

기술분야

본 발명은 단백질칩에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 고정화시키고자 하는 목적 단백질의 분리 정제 없이, 핀 마이크로어레이 (pin microarray) 방식이나 잉크젯 (inkjet) 방식을 사용하여 나노 수준에서 단백질 패턴을 구현하는 나노어레이 단백질칩 및 이것의 제조방법에 관한 것이다.

종래기술

DNA 칩이 특정 질환과 관련된 유전자에 관한 정보를 얻기 위해 제조되어 이용되었으나, 질환 등과 직접적으로 연관되어 세포내에서 실질적으로 중요한 기능을 하는 단백질의 특성 및 활성을 규명하는데 한계가 있었다. 이에 많은 연구자 들은 단백질 수준에서 프로테오믹스 (proteomics)를 분석하거나 특정 질병의 진단 및 바이오마커의 발굴 등을 위해 단백질칩 (protein chip)을 개발하였다. 단백질칩은 단백질의 발현 및 기능연구, 단백질 상호작용 연구뿐만 아니라, 신약 개발 및 질병의 진단, 식품 및 환경 모니터링 등에 있어 DNA 칩 보다 더 유용한 수단으로 기대되고 있다.

단백질칩은 특정 단백질과 결합하는 수십에서 수백 종류 이상의 서로 다른 단백질 또는 리간드 등을 고체 (유리, 금속, 플라스틱 등) 기판 상에 고정하고, 이들과 특이적으로 반응하는 생체분자의 존재, 또는 기능 및 역할을 형광, SPR (surface plasma resonance), 질량분석기 등의 여러 가지 분석 방법을 이용하여 대량으로 신속하게 분석하는 시스템으로 정의된다. 따라서, 단백질칩은 수십 내지 수천 개의 유전자를 유리 또는 플라스틱 기판 상에 고정시키고 이들의 상호작용을 정량분석 함으로써, 유전자의 발현이나 돌연변이를 검색하는 DNA 마이크로어레이 칩과 유사한 기술적 특성을 갖는다. 단백질칩을 제작함에 있어, 기판 표면에 단백질을 고정화 시키는 기술과 패턴을 만드는 기술이 중요하다. 기판상 단백질 고정화 방법에는 카르복시메틸-덱스트란 (carboxymethyl-dextran)을 이용하거나 아비딘 -바이오틴 (avidin-biotin) 결합을 이용하는 방법이 널리 사용되어 왔다. 또한, 단백질을 기판의 표면에 고정시키기 위해 기판 표면을 미리 화학물질로 처리하거나 불특정 다수의 단백질을 결합시키기 위해 폴리라이신 또는 칼릭스크라운을 이용하는 방법이 알려져 있다. 단백질 패턴은 종래기술에 따라 포토리소그래피(photolithography), 마이크로컨택트 프린팅 (microcontact printing), 스팟 어레이 (spot array) 등을 포함하는 다양한 방법에 의해서 수행될 수 있다.

한편, 세포내 주요 단백질은 단일분자 수준 (세포내에서 1 내지 10개미만 분포)으로 존재하므로 마이크로 수준에서 패턴이 이루어지는 종래의 단백질칩을 이용하는 경우, 검출 효율이 높지 않아 초기 단계에서의 질병 진단이 용이하지 않았다. 일반적으로 세포는 약 40,000개의 유전자와 약 1,000,000개의 단백질에 의해 그 기능을 수행하는 것으로 알려졌는데, 세포 당 약 5,000개 이상일 때 그 기능을 나타나는 단백질과 관련된 유전자는 전체 유전자의 0.1% 정도에 불과하고, 나머지 95% 이상의 유전자에 의해 발현되는 대부분의 단백질은 세포내에서 그 수가 약 1 내지 10개 정도 존재하므로 이들은 단일 분자 수준에서 그 기능을 나타내는 것으로 알려졌다. 특히, 환자의 조직, 혈액, 타액 혹은 기타 생물학적 시료로부터 단백질의 절대량을 증폭시키기는 것이 현재의 기술로는 불가능하므로, 극소량의 특정 단백질을 검출, 정량하기 위해서는 새로운 차원의 칩의 개발이 필요하다. 이를 실현하기 위해서 단백질칩의 사이즈를 나노 수준으로 제조하여 검출 효율 (sensitivity)이 증진된 나노단백질칩을 제공하고자 하는 연구가 많은 연구자들에 의해 수행되었다.

기존의 핀 마이크로어레이 방식이나 잉크젯 방식을 이용한 단백질칩은 모세 관 방식으로 핀 내부의 미세관에 고정시키고자 하는 목적 단백질 등을 주입 시킨 후 기판상에 핀을 직접 접촉하거나 압전 분사 방식으로 직접 단백질 스팟을 만드는 방식이다. 이러한 방식은 고정화 되는 목적 단백질의 스팟 크기가 마이크로 수준 (65 ~200 um)으로 한정 될 수밖에 없었다. 단백질칩을 나노 수준으로 제조하기 위해서는, 수십 혹은 수백 나노미터 크기로 샘플을 스팟팅 할 수 있는 작은 핀을 제작하거나 한 번에 피코리터에서 펨토리터를 분주할 수 있는 노즐을 제작하여야 한다. 또한, 마이크로 어레이어에서 사용되는 로봇 팔이 한 스팟을 찍고 다른 샘플을 가져 왔을 때 수 십 혹은 수 백 나노미터 간격을 정확하게 유지하면서 다음 스팟을 찍을 수 있을 정도의 매우 정밀한 위치 조절이 가능해야 한다.

한편, 머킨 (Mirkin) 등은 나노 크기의 단백질칩을 제작하기 위해 기존의 핀어레이 방식이나 잉크젯 방식이 아닌, AFM (atomic force microscope)의 탐침 (probe)을 이용한 DPN (dip-pen nanolithography) 방식을 사용하여 기판상에 나노 크기 즉, 100 nm 미만의 패턴을 형성하여 나노 단백질 칩을 제공한 바 있다 ("Protein Nanoarrays Generated by Dip-Pen Nanolithography, Science, Vol. 295, March 2002, 1702-1705). DPN을 이용한 머킨 등의 방식은 고정시키고자 하는 목적 단백질이 선택적으로 결합할 수 있는 물질, 예를 들어, 16-머켑토헥사데카논산 (16-mercaptohexadecanoic acid) (MHA) 등으로 나노 스팟팅을 한 후 목적 단백질이 이 영역에 선택적으로 결합하게 하여 나노 단백질칩을 제조하는 것이다. 이 방법의 경우 기존 핀 마이크로 어레이 방식이나 잉크젯 방식이 갖고 있는 문제점을 극복하고 나노크기의 단백질칩을 만들 수 있었으나, MHA의 카르복실산 말단과 고정화되는 목적 단백질 사이의 높은 친화력을 이용하는 이 방법은 고정화되는 단백질의 방향성을 제어할 수 없어 단백질의 활성 부위가 기판위에 고정화됨으로써 단백질의 활성을 잃을 수 있으며, MHA의 카르복실산의 말단기와 높은 친화력을 갖는 단백질만 한정된다는 단점이 있다. 또한, 서로 다른 다수의 MHA 나노어레이에 서로 다른 목적 단백질을 독립적으로 결합 시킬 수 없어, 다수의 서로 다른 목적 단백질로 고정화된 나노단백질칩을 제조하는데 한계가 있었다.

이를 개량하여 목적 단백질을 직접 고정화 시키는 방법이 머킨 등에 의해 개발되었다 (Bioactive Protein Nanoarrays on Nickel Oxide Surfaces Formed by Dip-Pen Nanolithography, Angew. Chem. Int. Ed., Vol. 43, 2004, 1246-1249). 이 방법은 나노단백질칩으로 제작하고자 하는 기판 전체를 Ni로 코팅한 후, 히스티딘과 결합된 목적단백질을 AFM 탐침을 이용한 DPN 방식으로 직접 나노어레이하여, Ni²⁺ 이온과 히스티딘의 특이적 반응을 이용한 나노단백질칩의 제작에 관한 것이다. 히스티딘과 같이 목적 단백질의 활성을 저해하지 않으면서 목적단백질에 결합할 수 있는 친화 태그를 이용하므로, 나노어레이에 결합하는 목적 단백질의 활성을 유지 시킬 수 가 있다. 또한, 직접 목적 단백질로 나노어레이를 만드는 이 방법은 복수의 AFM 탐침을 사용하면 서로 다른 히스티딘이 결합된 목적 단백질로 나노 단백질칩을 제조할 수 있다. 하지만, 핀 마이크로어레이나 잉크젯에 사용되는 핀과 달리 AFM 탐침을 세척하여 다른 목적 단백질로 코팅 할 수 없으므로, 기판위에 형성되는 서로 다른 목적단백질의 수는 AFM 탐침의 수에 제한된다는 문제점이 있다. 또한, AFM 탐침에 코팅하는 히스티딘-단백질을 분리 정제해야 하는 문제점이 있으며, 분자량이 상대적으로 큰 단백질의 경우 AFM 탐침에서 기판으로의 이동이 자유롭지 않아 단백질칩을 제작하는데 용이하지 않으며, 마이크로 어레이 방법과 달리 자동화 되어 있지 않은 문제점이 있다. 이와 같이, 종래기술에 따른 단백질칩은, i) 단백질을 분리 정제를 필수적으로 포함하고, ii) 단백질을 나노 패터닝하기 곤란하며, iii) AFM 탐침을 이용한 DPN 방법의 경우, 나노 수준으로 단백질을 패터닝 하고 있으나, 기판상 단백질의 나노 패터닝이 AFM 탐침의 수에 의존하여 고정화 시키고자 하는 목적 단백질의 수에 한계가 있어 고집적 단백질칩을 제조할 수 없으며, 목적하는 부위 이외의 곳에 단백질이 결합하는 것을 방지하기 어렵다는 문제가 있었다.

이에 본 발명자들은 종래기술과는 달리, 먼저 목적단백질과 결합할 수 있는 프로브를 기판에 나노어레이 한 후 목적단백질을 마이크로어레이어를 사용하여 나노어레이된 프로브와 동일한 위치에 스팟팅 하고, 스팟팅된 목적 단백질이 나노어레이된 프로브와 결합하지 않은 영역은 세척에 의해 제거함으로써 나노 어레이된 단백질칩을 제작하였으며, 기판상 프로브에 의해 고정화된 단백질의 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 본 발명은 종래기술의 문제점을 완전히 해소하여 서로 다른 다수의 목적 단백질을 나노어레이 할 수 있는 획기적인 방법으로서, 기존의 자동화된 마이크로어레이어를 사용하여 단백질 나노어레이를 실현하였을 뿐만 아니라 칩의 제작과정에 단백질을 분리 정제 없이 적용할 수 있으므로, 나노단백질칩을 개발하고자 하는 여러 그룹이 수년간 해결하지 못했던 근본적인 문제를 해결한 것이라고 할 수 있다.

본 발명은 기판 상에 단백질을 나노 수준으로 패터닝 하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 따른 나노단백질칩을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 기판 예를 들어, 유리 또는 플라스틱 기판 상에 프로브 예를 들어, NTA/Ni²⁺를 나노어레이 한 후, 핀어레이 또는 잉크젯 방법으로 목적 단백질 예를 들어, 히스티딘과 결합된 목적 단백질을 나노어레이 된 프로브 패턴 예를 들어, NTA/Ni²⁺패턴에 스팟팅하고 세척 함으로써 고집적 된 나노단백질칩을 완성하였다.

본 발명에서 기판은 유리 뿐만 아니라 플라스틱, 금속 (metals), 유기 박막 (organic thin film) 및 기타 절연체 (insulator) 등 다양한 소재가 사용될 수 있다. 또한, 글루타시온 S-트랜스퍼라제 (glutathione S-transferase) (GST)는 기질인 글루타시온에, 단백질-A (protein-A)는 Immunoglobulin에, 말토스 결합 단백질 (maltose binding protein) (MBP)는 말토스에 특이적으로 결합하고, 글루타시온 S-트랜스퍼라제, 단백질-A, 말토스 결합 단백질 등이 각각 단백질 정제에 대표적으로 사용되는 친화 태그이므로, 본 발명에서, 기판상 나노어레이 되는 프로브로서 사용되는 물질로서, NTA/Ni²⁺ 이외에 글루타시온, 이뮤노글로블린 (IgG), 말토스 등이 프로브로 사용될 수 있음은 자명하다. 또한, 친화 태그로 사용되는 히스티딘, 단백질-A, GST, MBP 등은 단백질 이외에 펩타이드, DNA 등 다양한 분자에 결합되어 사용이 가능하므로, 친화 태그에 결합할 수 있는 분자가 본 발명에 따른 나노어레이에 사용될 수 있음은 자명하다.

본 발명에서 DPN 프린팅은 시판중인 접촉식 AFM 탐침을 사용하여 나노 수준 예를 들어, 직경 또는 폭 100 nm 미만, 바람직하게는 80 nm 내지 50 nm인 패턴을 제공하며, 보다 바람직하게는 20 nm의 DNA 패턴을 제공한다.

이와 같이, 본 발명의 나노어레이 단백질 칩은, i) 목적 단백질과 결합하기 위한 프로브 (probe)를 기판 상에 나노어레이 하여 20 ~ 100 nm의 나노패턴을 형성시키는 단계; ⅱ) 목적 단백질의 비특이적 결합을 방지하기 위한 물질로 기판 상 나노어레이 되지 않은 부분을 패시베이션 (passivation)하는 단계; ⅲ) 프로브와 특이적으로 결합하는 친화 태그와 목적 단백질의 결합체를 포함하는 용액 또는 분리 정제된 결합체를 기판에 가하여 단백질을 기판 상에 고정화시키는 단계; 및 iv) 기판을 세척하는 단계를 포함하여 제작되며, 단위 면적당 1,000 스팟/㎠ ~ 10,000 스팟/㎠ , 바람직하게는 2,500 스팟/㎠ ~ 6,400 스팟/㎠ 의 나노 어레이된 단백질을 갖도록 할 수 있다.

이하 도면을 참조하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 도 1은 는 본 발명에 사용된 DPN을 이용한 나노어레이 과정을 보여준다. 도 2는 유리 표면에 MPTMS [3-(머캡토프로필)-트리메톡시실란)] [3-(mercaptopropyl)-trimethoxysilane), 말레이미도-C3-NTA ( maleimido-C3-NTA), Ni이온, 및 히스티딘 -단백질의 순차적 결합을 나타낸다. 먼저, 피라냐 클리닝 (piranha cleaning)된 유리 표면을 MPTMS 처리하면 유리 표면은 사이올그룹 (-SH)로 치환된다. 사이올그룹으로 치환된 표면에 말레이미도-C3-NTA를 잉크로써 사용하는 DPN을 수행하면, 말레이미도-C3-NTA가 기판에 나노어레이 되고, 나노어레이 영역에서만 말레이미드 (maleimide)와 -SH그룹사이의 공유결합에 의해 기판 표면에 NTA 나노어레이가 형성된다. 다음, NTA 나노어레이에 니켈이온 [염화니켈 (II) 6수화물] [Nickel(II) chloride hexahydrate]을 처리하면, Ni²⁺이온이 NTA의 부분에 킬레이팅 되어, 표면은 NTA/Ni²⁺ 나노어레이로 치환 된다. 도 3은 유리기판상 NTA 나노어레이를 나타낸 것으로, 사용된 계면활성제 [예를 들어, 트윈 20 (시그마-알드리히)]의 농도, 탐침과 기판과의 접촉시간 등에 따라 나노어레이된 스팟의 크기를 조절할 수 있음을 나타낸 것이다. 도 4는 NTA/Ni²⁺의 나노어레이에 히스티딘-형광단백질 (EGFP, enhanced green fluorescence protein)이 선택적으로 결합함을 나타낸 것이다. 도 5는 다수의 AFM 탐침을 이용하여 복수의 NTA/Ni²⁺ 나노어레이를 구현하는 것을 나타낸 것이다. 도 6은 NTA/Ni²⁺의 나노어레이에 기존의 핀어레이나 잉크젯 프린팅 방법을 적용하여, 단백질칩을 제조하는 과정을 나타낸다. 도 6에서, 핀어레이 방법에 의해 스팟팅되는 단백질은 히스티딘-단백질이며, 도 5에서 미리 제작된 NTA/Ni²⁺의 나노어레이에 스팟팅된다. 도 6은 이러한 과정을 보여주는 것으로서 기판 1의 특정 위치에 히스티딘-단백질 1을 스팟팅하고, 다시 기판 2의 특정 위치에 동일한 단백질을 스팟팅하는 것을 나타낸다. 준비된 복수의 기판상에 히스티딘-단백질 1을 모두 스팟팅 한 후, 핀을 세척하고, 히스티딘 결합된 다른 단백질 2 (히스티딘-단백질 2)을 핀에 로딩 한 다음 히스티딘-단백질 1과 다른 위치에 히스티딘-단백질 2를 핀 어레이 방법으로 스팟팅한다. 이를 반복 수행함으로써, 도 5의 NTA/Ni²⁺ 나노어레이에 서로 다른 종류의 히스티딘-단백질을 어레이 할 수 있다. 도 7은 서로 다른 단백질로 스팟팅된 단백질칩을 세척하여 나노단백질칩을 제작하는 과정을 나타낸다. 도 8은 나노단백질칩 제조시 사용되는 히스티딘-단백질이 균주에서 발현된 후 분리 정제없이, NTA/Ni²⁺ 나노어레이에 결합함을 나타낸다. 도 9는 (삭제) 목적 단백질이 형광단백질 이외 histidine과 결합한 단백질, 효소, DNA 등 다양한 생체분자를 이용하여 나노어레이한 것을 보여 주는 것으로, 히스티딘 결합된 HRP (horseradish peroxidase)가 NTA/Ni²⁺로 나노패턴된 유리 기판상에서 활성을 유지함을 나타낸다. 도 10은 제조된 NTA/Ni²⁺로 나노어레이를 재사용할 수 있음을 보여주는 것이다.

본 발명에서 사용된 용어, "히스티딘-단백질"은 히스티딘과 결합된 단백질을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어, "목적 단백질"은 기판에 고정시키고자 하는 단백질을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 "친화 태그 (affinity tag)"는 기판에 나노 어레이 되는 프로브와 특이적으로 결합하는 것으로서 목적 단백질에 결합된다.

이하, 실시 예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 명세서로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가에게 자명한 내용은 모두 본 발명의 권리범위에 속함은 물론이다. 본 발명의 명세서에 인용된 모든 문헌은 본 발명에 참조로서 통합된다.

실시예

실시예 1: NTA/Ni ²⁺ 나노패터닝 및 히스티딘-단백질 나노어레이

나노패터닝

유리 기판과 AFM 탐침을 각각 피라냐 클리닝 (piranha cleaning) (70% 황산, 30% 과산화수소수) 및 자외선 클리닝한 후 밀폐 용기에 넣고, 120^oC에서 30분간 MPTMS 5 ㎕를 사용하여 코팅했다. 사이올그룹 (-SH)으로 치환된 AFM의 탐침에 말레이미도-C3-NTA 잉크로 10분간 코팅한 후, 질소 가스로 건조하여 말레이미도-C3-NTA로 코팅된 AFM 탐침을 준비했다. DPN (Bio-AFM, DI 제품) 기술을 사용하여 사이올그룹 (-SH)으로 치환된 유리기판 상에 말레이미도-C3-NTA로 나노 패터닝을 수행했다. 도 3은 나노패터닝된 말레이미도-C3-NTA를 나타낸다. 생체분자 및 작은 분자의 비특이적 결합을 방지하기 위해, 나노어레이된 유리기판상의 패터닝되지 않은 영역을 PEG-말레이미드를 사용하여 패시베이션 (passivation) 했다. 준비된 패 턴에 염화니켈 6수화물 [Nickel(II) chloride hexahydrate] 50 mM을 반응시켜 유리기판상에 NTA/Ni²⁺로 이루어진 나노어레이 패턴을 제작했다. 제작된 NTA/Ni²⁺ 나노어레이 패턴에 히스티딘-EGFP를 반응시켜, 히스티딘이 결합된 EGFP가 NTA/Ni²⁺ 나노어레이 패턴에 선택적으로 결합함을 확인했다.

나노어레이

도 8는 히스티딘 표지된 형광 단백질을 분리 정제 없이 적용하여 나노어레이된 NTA/Ni 패턴에 결합시킨 것을 나타낸다. 먼저 히스티딘 결합된 히스티딘-EGFP 형광 단백질을 균주 (BL21) 를 사용하여 발현 시켰다. 발현된 단백질이 세포 밖으로 배출 되는 경우 균주를 원심분리기로 분리하고, 발현된 단백질이 포함된 상등액을 수득했다. 발현된 단백질이 세포 밖으로 배출되지 않는 경우에는 세포를 초음파 분쇄기 등으로 파괴한 후 원심분리하여 목적 단백질이 포함된 상등액을 수득했다. 발현된 목적 단백질이 포함된 상등액을 미리 제조한 NTA/Ni²⁺ 나노패턴에 반응시켜 목적 단백질이 선택적으로 NTA/Ni²⁺ 나노패턴에만 결합함을 확인하였다 (도 8 참조). 히스티딘 표지되지 않은 형광단백질은 NTA/Ni²⁺ 나노패턴에 결합하지 않았다 (도 8).

도 9는 나노어레이 된 목적 단백질이 GFP(green fluorescent protein)나 RFP(red fluorescent protein) 등과 같은 형광단백질뿐만 아니라 다양한 생분자에도 응용할 수 있음을 보여주는 결과이다. 히스티딘과 결합된 HRP (Horse Radish Peroxidase)를 발현시킨 후 분리정제 없이 미리 제작한 NTA/Ni²⁺ 패턴에 처리하여 고정화 시킨 다음, 고정화된 나노어레이에서 HRP에 의해 비형광 기질인 앰플렉스 레드 (Amplex Red)가 형광인 레조루핀 (Resorufin)으로 전환됨을 실시간으로 형광현미경을 통해 관찰하였다.

실시예 2: 마이크로 어레이어를 사용한 히스티딘 태그 (histag) 단백질의 나노어레이

기존의 핀어레이나 잉크젯 프린팅 방식은 자동화된 장점이 있으나, 어레이가 수십에서 수백 마이크로 크기로서 나노수준으로 스팟을 만들기 위해서는 나노미터 크기로 샘플을 스팟팅 할 수 있는 작은 핀을 제작하거나 한 번에 피코리터에서 펨토리터를 분주할 수 있는 노즐을 제작해야 하는 문제점이 있었다. 본 실시예에서는 DPN을 이용한 NTA/Ni²⁺ 나노어레이에 기존의 마이크로어레이를 사용하여 나노단백질칩을 제작하였다. 먼저, 마이크로어레이어에 의해 만들어질 스팟에 NTA/Ni²⁺ 나노어레이를 만든 후, 마이크로 어레이어를 사용하여 고정시키고자 하는 다양한 히스티딘-단백질을 NTA/Ni²⁺ 나노어레이에 일치하게 스팟팅했다. 고정시키고자 하는 단백질의 종류에 따라 세척과 스팟팅을 반복 수행하여, NTA/Ni²⁺ 나노어레이에 다양한 단백질의 어레이를 제작했다. 스팟팅된 단백질 중에서 NTA/Ni²⁺ 나노어레이 영역에서만 Ni-히스티딘 결합이 선택적으로 형성되었음을 확인하였다. 다음 PBS로 세척하여 단백질이 나노어레이된 나노단백질칩을 제작하였다.

이와 같이, 본 발명에 따르면 기판상에 단백질을 나노어레이 할 수 있으므로, 보다 더 검출 감도가 우수한 단백질칩을 나노 수준에서 구현할 수 있다. 또한, 고정시키고자 하는 목적 단백질을 분리 정제 없이 사용하는 것이 가능하므로, 본 발명의 나노단백질칩은, 프로테오믹스, 질병 진단 및 면역 검정 등에 있어 매우 유용한 수단으로 사용될 수 있다.

Claims

i) 목적 단백질과 결합하기 위한 프로브 (probe)를 기판 상에 나노어레이 하여 20 ~ 100 nm 의 나노패턴을 형성시키는 단계; ⅱ) 목적 단백질의 비특이적 결합을 방지하기 위한 물질로 기판 상 나노어레이 되지 않은 부분을 패시베이션 (passivation)하는 단계; ⅲ) 프로브와 특이적으로 결합하는 친화 태그 (affinity tag)와 목적 단백질의 결합체를 포함하는 용액 또는 분리 정제된 결합체를 기판에 가하여 단백질을 기판 상에 고정화시키는 단계; 및 ⅳ) 기판을 세척하는 단계를 포함하여, 단위 면적당 1,000 스팟/㎠ ~ 10,000 스팟/㎠ 의 나노 어레이된 단백질을 갖는 나노단백질칩의 제조방법.
제 1항에 있어서, 친화 태그가 히스티딘이고, 프로브가 Ni²⁺ 이온임을 특징으로 하는, 나노단백질칩의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 친화 태그가 글루타시온 S-트랜스퍼라제 (glutathione S-transferase) (GST), 단백질-A (protein-A) 또는 말토스 결합 단백질 (maltose binding protein) (MBP)이고, 프로브가 글루타시온, 이뮤노글로블린 또는 말토스 임을 특징으로 하는, 나노단백질칩의 제조방법.
제 1항 내지 제 3항에 있어서, 친화 태그 (affinity tag)와 목적 단백질의 결합체를 포함하는 용액 또는 분리 정제된 결합체가 마이크로어레이어 (Microarryer)에 의해 기판에 가해짐을 특징으로 하는, 나노단백질칩의 제조방법.
i) 목적 단백질과 결합하기 위한 프로브 (probe)를 기판 상에 나노어레이 하여 20 ~ 100 nm의 나노패턴을 형성시키고; ⅱ) 목적 단백질의 비특이적 결합을 방지하기 위한 물질로 기판 상 나노어레이 되지 않은 부분을 패시베이션 (passivation)하며; ⅲ) 프로브와 특이적으로 결합하는 친화 태그 (affinity tag)와 목적 단백질의 결합체를 포함하는 용액 또는 분리 정제된 결합체를 기판에 가하여 단백질을 기판 상에 고정화시키고; 및 ⅳ) 기판을 세척하여 제작한, 단위 면적당 1,000 스팟/㎠ ~ 10,000 스팟/㎠ 의 나노 어레이된 단백질을 갖는 나노단백질칩.
제 5항에 있어서, 친화 태그가 히스티딘이고, 프로브가 Ni²⁺ 이온임을 특징으로 하는, 나노단백질칩.
제 5항에 있어서, 친화 태그가 글루타시온 S-트랜스퍼라제 (glutathione S-transferase) (GST), 단백질-A (protein-A) 또는 말토스 결합 단백질 (maltose binding protein) (MBP)이고, 프로브가 글루타시온, 이뮤노글로블린 또는 말토스 임을 특징으로 하는, 나노단백질칩.
제 5항 내지 제 7항에 있어서, 친화 태그 (affinity tag)와 목적 단백질의 결합체를 포함하는 용액 또는 분리 정제된 결합체가 마이크로어레이어 (Microarryer)에 의해 기판에 가해짐을 특징으로 하는, 나노단백질칩.