JP4570363B2 - タンパク質およびペプチドのナノアレイ - Google Patents

Description

本願は、2001年10月2日に出願された仮出願第60/326,767号および2001年5月24日に出願された米国出願第09/866,533号の利益を請求する。これらの完全な開示は、それらの全体が参照として本明細書に組み入れられる。

発明の分野
本発明は、タンパク質およびペプチドのナノアレイ、それらを作製するための方法、ならびにそれらの使用に関する。本発明はまた、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングに関する（DPN（商標）およびDIP PEN NANOLITHOGRAPHY（商標）はNanoInk, Inc; Chicago, Illinoisの商標である）。

背景
DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングの開発は、2001年5月24日に出願された優先権出願09/866,533号に記載され（特に「発明の背景」のセクション（第1〜3頁））、これは、本明細書によってその全体が参照として組み入れられる。

さらに、タンパク質およびペプチドアレイ、マイクロアレイならびにナノアレイの開発は、文献の引用を伴って、2001年10月2日に出願された優先権出願60/326,767号に記載され、これには、タンパク質およびペプチドナノアレイを生成するためのDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングの使用が含まれ、これは、本明細書によってその全体が参照として組み入れられる。

タンパク質およびペプチドアレイ、ならびにマイクロアレイは、バイオテクノロジーおよび製薬工業にとって重要であり、そして、例えば、プロテオミクス、薬学的スクリーニングプロセス、診断学、治療学、およびパネルイムノアッセイにおける応用を見い出す。しかし、ナノアレイは、より十分に開発されておらず、そしてタンパク質およびペプチドナノアレイの生産は、ナノテクノロジーの重要な商業的目的である。

種々のパターン化技術がこのようなアレイ（フォトリソグラフィー、マイクロコンタクトプリンティング、ナノグラフティング、およびスポットアレイイングを含む）を組み立てるための試みにおいて使用されてきた。しかし、タンパク質およびペプチドナノアレイを作製する際の試みられた小型化は、重要な問題を生じ得る。大規模なアレイ製造のために適切な技術は、ナノアレイ製造に適切でない可能性がある。例えば、小型化は、アレイに対する非特異的結合を増大させ得、実験的および診断的結果を歪曲させる。非特異的バックグラウンドノイズは、アレイの不活性領域を区別することを困難にし得、それによってナノスケールライブラリーの分析を複雑化する。また、これらの技術のいくつかにおいて使用されるソフト材料は、ナノスケール生産が可能でないかもしれない。最後に、伝統的な光学的スクリーニング方法は機能しないかもしれない。

これら困難性にも関わらず、例えば、1,000nmより小さく、好ましくは300nmより小さい特徴を有するタンパク質およびペプチドナノアレイは、商業的に重要な標的である。これらは、ペプチドおよびタンパク質のライブラリーの密度を増大させ、かつライブラリー分析を拡張する。これらの構造を調製するために使用される方法は、全般的に、従来のナノテクノロジー（例えば、電子ビームリソグラフィーのようなもの）に付随する問題がない方がよい。

概要
本発明は、ナノ範囲の（nanoscopic）ペプチドおよびタンパク質ナノアレイを提供し、これは、好ましくは、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングの使用を伴って調製される。本明細書中での本発明の1つの利点は、広範な種々の異なる実施態様であり、これは、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティング法の汎用性およびペプチド化学の広いスペクトルを反映している。ナノアレイは、高密度ペプチドおよびタンパク質パターンを含み、これは、生物活性および実質的に非特異的吸着がないことを示す。

例えば、以下を含むタンパク質ナノアレイが提供される：（a）ナノアレイ基材、（b）該基材上の複数のドットであって、該ドットは該基材上の少なくとも1つのパターン化合物（patterning compound）、および該パターン化合物上の少なくとも1つのタンパク質を含む。パターン化合物は、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって基材上に配置され得、そして複数のドットが格子の形態であり得る。このタンパク質ナノアレイはさらに、ドットを取り囲む基材上のタンパク質保護（passivation）化合物を含み得る。

本発明はまた、以下を含むタンパク質ナノアレイを提供する：（a）ナノアレイ基材、（b）該基材上の複数のラインであって、該ラインは該基材上の少なくとも1つのパターン化合物、および該パターン化合物上の少なくとも1つのタンパク質を含む。パターン化合物は、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって基材上に配置され得、そして複数のラインが垂直線または平行線のグリッドの形態であり得る。このタンパク質ナノアレイはさらに、ライン間の基材上にタンパク質保護化合物を含み得る。

より全般的には、本タンパク質ナノアレイは、ナノアレイ基材、および該基材上の複数のパターンを含み、そして該パターンは該基材上の少なくとも1つのパターン化合物、および該パターンの各々に吸着する少なくとも1つのタンパク質を含む。

より全般的には、本明細書中に記載されるナノアレイは、ペプチドナノアレイとして使用され得る。このペプチドは、例えば、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドであり得る。ペプチドは、例えば、100〜300ペプチド結合を有する化合物であり得る。ペプチドナノアレイは以下を含み得る：a）ナノアレイ基材、b）該基材上の複数のライン、ここで該ラインは該基材上に少なくとも1つの化合物および該化合物上に少なくとも1つのペプチドを含む。

別のペプチドナノアレイは、ナノアレイ基材、該基材上の少なくとも1つのパターンを含み得、このパターンは、該基材に共有結合したか、または化学吸着したパターン化合物を含み、このパターンは、該パターン化合物上に吸着されたペプチドを含む。

なおさらに、ナノアレイは、ナノアレイ基材、該基材上の少なくとも1つのパターンを含み得、このパターンは、該基材に共有結合したか、または化学吸着したパターン化合物を含み、このパターンは、該パターン化合物上に吸着された粒子状の生体高分子を含む。この粒子状の生体高分子は、例えば、ペプチドである。

本発明はまた、以下の工程を含むナノアレイを作製するための方法を提供する：（a）化合物を、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによってナノアレイ表面にパターン化してパターンを形成する工程；および（b）少なくとも1つのペプチドを該パターンに組み入れる工程（すなわち、「方法1」）。

本発明はまた、以下の工程を含む方法を提供する：（a）ナノアレイ表面上の化合物を、被覆した原子間力顕微鏡チップを使用してパターン化してナノスケールパターンを形成する工程、および（b）該パターンに1つまたはそれ以上のタンパク質を吸着させる工程（すなわち、「方法2」）。

本発明はまた、以下の工程を含む、ナノ範囲の特徴を有するタンパク質アレイを作製するための方法を提供する：あらかじめ形成された（preformed）ナノアレイパターンに1つまたはそれ以上のタンパク質を組み入れる工程であって、ここで該タンパク質は該パターンに吸着され、そして該パターンはDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって形成される工程（すなわち、「方法3」）。

なおさらに、本発明はまた、以下の工程を含む、ナノ範囲の特徴を有するペプチドアレイを作製するための方法を提供する：あらかじめ形成されたナノアレイパターンに1つまたはそれ以上のタンパク質を組み入れる工程であって、ここで該タンパク質は該パターンに吸着され、そして該パターンはDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって形成される工程（すなわち、「方法4」）。

本発明はまた、以下の工程を含む、タンパク質のナノスケールアレイを作製するための方法を提供する：（a）パターン化合物を、ナノアレイ表面上にdip-penナノリソグラフプリンティングによって沈着させる工程；（b）該表面の沈着されていない領域を保護化合物で保護する工程；（c）パターン化合物を有する該表面および保護化合物を、少なくとも1つのタンパク質を含む溶液にさらす工程；（d）該タンパク質溶液から該表面を取り除く工程であって、ここで該表面はタンパク質のナノスケールアレイを含む工程（すなわち、「方法5」）。

本発明の方法はまた、方法1、方法2、方法3、方法4、または方法5によって調製された物品、アレイ、およびナノアレイを提供する。

タンパク質のナノスケールアレイおよびナノアレイは種々の用途を見い出し、これらには、標的が試料中にあるか否かを検出することが含まれる。例えば、本発明はまた、以下の工程を含む、試料中の標的の存在または非存在を検出するための方法を提供する：
ナノアレイ基材表面を試料にさらす工程であって、該基材表面が、該基材表面に結合された1つまたはそれ以上の化合物上に組み入れられた1つまたはそれ以上の複数のペプチドを含む、工程、
特性の変化がさらす工程に際して生じるか否かを観察し、このことが該試料中の標的の存在または非存在を示す工程。

さらに、本発明はまた、以下の工程を含む、試料中の標的の存在または非存在を検出するための方法を提供する：
ナノアレイ基材表面を、（i）標的を含んでも含まなくてもよい試料、および（ii）標的と相互作用し得る分子、にさらす工程であって、ここで、該基材表面は、該基材表面に結合された1つまたはそれ以上の化合物上に組み入れられた1つまたはそれ以上のペプチドを含み、かつ該ペプチドが標的に結合し得る工程、
該分子の標的との相互作用に基づいて試料中の標的の存在または非存在を検出する工程であって、該標的が該ペプチドに結合される工程。

最後に、以下の工程を含む、試料中の標的の存在または非存在を検出するための方法が提供される：
表面上のペプチドの1つまたはそれ以上のナノスケール沈着の少なくとも1つの次元を測定する工程；
該表面を該試料にさらす工程；および
ペプチドの1つまたはそれ以上のナノスケール沈着の該次元において変化が生じるか否かを検出し、そのことが該標的の存在または非存在を示す工程。

本発明の基本的かつ新規な特徴は、特に、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングが使用される場合に、多い。例えば、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングは、比較的少量の分子物質を、レジスト、スタンプ、複雑なプロセス方法、または洗練された非商業的な機器に頼ることなく、高い解像度でナノリソグラフ様式で基材に送達し得る。多くの実施態様において、本発明はまた、これらおよび他のステップの除去から本質的になるので、先行技術において普及しておりかつ競合的な技術である。単なるミクロンレベルの技術に対して、100nm以下まで下の次元を含むナノメーター技術が可能である。

なおさらに、本発明は、AFMに基づくスクリーニング手順を、ナノアレイを含む特徴の反応性を研究するために使用できることを示す。

最後に、本発明は、従来の組織化学的アッセイにおいて使用されてきた多くの抗体を含む、広範な種々のペプチドおよびタンパク質構造と共に実行され得る。

詳細な説明
2001年5月24日に出願された優先権出願09/866,533において、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングの背景および手順が詳細に記載されており、例えば、以下を含む広範な種々の実施態様を包括する：
−背景（第1〜3頁）；
−概要（第3〜4頁）；
−図面の簡単な説明（第4〜10頁）；
−スキャニングプローブ顕微鏡チップの使用（第10〜12頁）；
−基材（第12〜13頁）；
−パターン化合物（第13〜17頁）；
−実施方法（例えば、被覆チップを含む）（第18〜20頁）；
−ナノプロッターを含む機器（第20〜24頁）；
−複数のレイヤーおよび関連するプリンティングおよびリソグラフィー方法の使用（第24〜26頁）；
−解像度（第26〜27頁）
−アレイおよびコンビナトリアルアレイ（第27〜30頁）；
−ソフトフェアおよび較正（第30〜35頁；第68〜70頁）；
−キットおよび他の物品（疎水性化合物で被覆したチップを含む）（第35〜37頁）；
−実用的実施例（第38〜67頁）；
−対応する特許請求の範囲および要約（第71〜82頁）；ならびに
−図1〜28
上記の優先権書類のテキストのすべて（図面を含む上記に列挙された種々のサブセクションの各々を含む）は、その全体が参照として本明細書によって組み入れられ、特許請求の範囲を支持する本開示の一部を形成する。

DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングおよび上述の手順、機器、および実用的実施例は、驚くべきことに、本明細書中でさらに記載するようなタンパク質およびペプチドナノアレイを作製するために適合させることもできる。全体的に使用されるアプローチを図1に図示する。

DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティング、特に並行DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングはまた、ナノアレイ（特にコンビナトリアルナノアレイ）の調製のためにとりわけ有用である。アレイは、基材上でより大きなパターンを形成する、複数の別個の試料領域またはパターン単位の配列である。試料領域またはパターンは、任意の形状（例えば、ドット、ライン、円、四角、または三角）であり得、かつ任意のより大きなパターン（例えば、別個の試料領域の行および列、格子、グリッドなど）で配列され得る。各試料領域は、アレイの他の試料領域に含まれる同じまたは異なる試料を含み得る。「コンビナトリアルアレイ」は、各試料領域または複製の試料領域の小さなグループ（通常2〜4）が、アレイの他の試料領域において見い出されるものとは異なる試料を含むアレイである。「試料」は、研究、同定、反応などがなされる材料または材料の組み合わせである。

DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティング、特に並行DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングは、サブマイクロメーター（submicrometer）スケールでのナノアレイおよびコンビナトリアルナノアレイの調製のために特に有用である。サブマイクロメータースケールでのアレイとは、試料領域の少なくとも1つの次元（例えば、長さ、幅、または直径）が、奥行きを除いて、1μmより小さいことを意味する。DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングは、例えば、直径が10nmであるドットを調製するために使用され得る。チップの改善（例えば、より先の尖ったチップ）により、直径が1nmに近いドットが製造され得る。サブマイクロメータースケールでのアレイは、現在使用されているマイクロスケールアレイ（すなわち、1〜999μmである、奥行き以外の次元を有する）およびより大きなアレイよりも、より速い反応時間およびより少ない試薬の使用を可能にする。また、単位領域あたりより多くの情報を得ることができる（すなわち、ナノアレイは現在使用されているマイクロメータースケールのアレイよりもより高密度である）。最後に、サブマイクロメーターナノアレイの使用は、スクリーニングのための新しい機会を提供する。例えば、このようなアレイは、パターン（例えば、形状、粘着性、高さ）における物理的変化を探索するため、および／または試料領域に存在する化学物質（核酸の配列決定を含む）を同定するためにSPMのものを用いてスクリーニングされ得る。

アレイの各試料領域は、単一の試料を含み得る。例えば、試料は、生物学的材料（例えば、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド、DNA、もしくはRNA）、タンパク質またはペプチド（例えば、抗体もしくは酵素）、リガンド（例えば、抗原、酵素基質、レセプター、もしくはレセプターのリガンド）、または生物学的材料の組み合わせもしくは混合物（例えば、タンパク質の混合物））であり得る。このような材料は、上記のような所望の基材上に直接的に沈着され得る（優先権書類において上記のパターン化合物の記載を参照されたい）。あるいは、各試料領域は生物学的材料を捕捉するための化合物を含み得る。例えば、PCT出願 WO00/04382、WO 00/04389、およびWO 00/04390を参照されたい。これらの完全な開示は、参照として本明細書に組み入れられる。例えば、特定の官能基（例えば、-COOH）で終止するパターン化合物は、タンパク質上に存在するかまたはタンパク質に付加された官能基（例えば、-NH₂）を通してタンパク質を結合し得る。また、上記の基材に結合され得るポリリジンが細胞の基材への結合を促進することが報告されている。Jamesら、Langmuir, 14, 741-744（1998）を参照されたい。別の例としては、各試料領域は化合物（有機材料、無機材料、および複合材料）または化合物の混合物を含み得る。化合物は、基材上に直接沈着され得るか、または試料領域中に存在するパターン化合物上に存在する官能基を通して結合され得る。なお別の例として、各試料領域は、マイクロ粒子またはナノ粒子の型を含み得る。実施例7を参照されたい。前述から、当業者は、パターン化合物が試料を含み得るか、または試料を捕捉するために使用され得ることを認識する。

本発明は、特に、ペプチドおよびタンパク質ナノアレイに焦点を当てている。アレイおよびアレイを使用する方法は当該分野で公知である。例えば、このようなアレイは、生物学的および化学的スクリーニングのために使用され得、生物学的または化学的材料を同定および／または定量する（例えば、イムノアッセイ、酵素活性アッセイ、ゲノミクス、およびプロテオミクス）。天然に存在するかまたは合成の化合物、および他の材料（細胞を含む）の生物学的および化学的ライブラリーは、例えば、薬物候補、酵素阻害剤、レセプターのリガンド、およびリガンドのレセプターを同定および設計またはリファインするため、ならびにゲノミクスおよびプロテオミクスにおいて、使用され得る。マイクロ粒子およびナノ粒子のアレイは、種々の目的のために使用され得る（実施例7を参照されたい）。アレイはまた、結晶化、エッチング（実施例5を参照されたい）などの研究のために使用され得る。コンビナトリアルアレイおよび他のアレイならびにそれらの使用を記載する参考文献には、米国特許第5,747,334号、同第5,962,736号、および同第5,985,356号、ならびに、PCT出願WO 96/31625、WO 99/31267、WO 00/04382、WO 00/04389、WO 00/04390、WO 00/36136、およびWO 00/46406が含まれ、これらはその全体が参照として組み入れられる。最後に、本発明のアレイ上で実行された実験の結果は、従来の手段によって検出され得る（例えば、蛍光、化学発光、生物発光、および放射能）。あるいは、SPMがアレイをスクリーニングするために使用され得る。例えば、AFMが分子の定量的画像化および同定のために使用され得る（化学的または生物分子同定要素で被覆したSPMチップの使用を通した化学的および生物学的分子の画像化および同定を含む）。

を参照されたい。これらの完全な開示は、参照として本明細書に組み入れられる。

DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングは、ナノアレイ、ナノ範囲の特徴を有するサブマイクロメータースケールのアレイの調製のために特に有用である。好ましくは、複数のドットまたは複数のラインが基材上に形成される。この複数のドットは、当該分野で公知のような六角形格子または四角形格子を含む、ドットの格子であり得る。複数のラインは、ラインの垂直配置および平行配置を含むグリッドを形成し得る。

ドット直径およびライン幅を含む個々のパターンの次元は、例えば、約1000nm以下、約500nm以下、約300nm以下、およびより詳細には、約100nm以下であり得る。次元の範囲は、例えば、約1nm〜約750nm、約10nm〜約500nm、およびより詳細には、約100nm〜約350nmであり得る。

複数のパターンにおけるパターンの数は、特に限定されない。これは例えば、少なくとも10、少なくとも100、少なくとも1,000、少なくとも10,000、さらに少なくとも100,000であり得る。四角形の配列は例えば、10×10アレイであり得る。高密度アレイが好ましい。

ナノアレイ上の個々のパターン間の距離は変動し得、そして特に限定されない。例えば、パターンは、1ミクロン未満、または1ミクロンより大きい距離によって隔てられ得る。この距離は、例えば、約300〜約1,500ミクロン、または約500ミクロン〜約1,000ミクロンであり得る。隔てられたパターン間の距離は、パターンの中心（例えば、ドットの中心またはラインの中点）から測定され得る。

本発明のペプチドおよびタンパク質ナノアレイにおいて、ペプチド結合を含む種々の種類の化学構造を含むナノアレイが調製され得る。これらには、単一または複合体である、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、およびポリペプチドが含まれる。ペプチド単位は、非ペプチド単位との組み合わせであり得る。タンパク質またはペプチドは、単一のポリペプチド鎖または複数のポリペプチド鎖を含み得る。より高分子量のペプチドが一般的には好ましいが、より低分子量のペプチド（オリゴペプチドを含む）が使用され得る。ペプチド中のペプチド結合の数は、例えば、少なくとも3、10以下、少なくとも100、約100〜約300、または少なくとも500であり得る。

タンパク質が特に好ましい。タンパク質は、単一であるかまたは結合体化され得る。結合体化されたタンパク質の例には、核タンパク質、リポタンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質、および糖タンパク質が含まれるがこれらに限定されない。

タンパク質は、タンパク質が他のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドとの複合体として共存する場合に機能的であり得る。タンパク質は、ウイルスであり得、これは、タンパク質および核酸の複合体であり得、この核酸はDNAまたはRNAの型である。タンパク質は、シェル（shell）〜球形（sphere）および棒状構造のようなより大きな構造であり得る。

タンパク質は、球状（globular）または線維状の構造であり得る。後者は、水中で典型的には不溶性である一般的に強靱な材料である。これらは、例えば、線維におけるような並行して配列されたポリペプチド鎖を含み得る。例としてはコラーゲンおよびエラスチンが含まれる。球状タンパク質は、水系で大部分可溶性である球形（spherical）または球状（globular）形状に固く折り畳まれたポリペプチドである。抗体、いくつかのホルモン、ならびに血清アルブミンおよびヘモグロビンのような輸送タンパク質のように、例えば、多くの酵素は球状タンパク質である。

固い棒状の構造であるが可溶性であるミオシンおよびフィブリノーゲンのような線維状と球状の両方の特性を有するタンパク質が使用され得る。これらのタンパク質は1つより多いポリペプチド鎖を有し得、そしてオリゴマータンパク質であり得、それらの個々の成分はプロトマーと呼ばれる。オリゴマータンパク質は、普通は偶数のポリペプチド鎖を含み、通常互いに共有結合していない。ヘモグロビンはオリゴマータンパク質の一例である。

本発明のナノアレイに組み入れられ得るタンパク質のタイプには、酵素、貯蔵タンパク質、輸送タンパク質、収縮タンパク質、保護タンパク質、毒素、ホルモン、および構造タンパク質が含まれるがこれらに限定されない。

酵素の例には以下が含まれるがこれらに限定されない：リボヌクレアーゼ、シトクロムc、リゾチーム、プロテアーゼ、キナーゼ、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、およびエンドヌクレアーゼ。酵素およびそれらの結合メカニズムは、例えば、Enzyme Structure and Mechanism、第2版、Alan Fersht、1977に開示され、15章には以下の酵素のタイプを含む：デヒドロゲナーゼ、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、リゾチーム、カルボニックアンヒドラーゼ、およびトリオースホスフェートイソメラーゼ。

貯蔵タンパク質の例には、オボアルブミン、カゼイン、フェリチン、グリアジン、およびゼインが含まれるがこれらに限定されない。

輸送タンパク質の例には、ヘモグロビン、ヘモシアニン、ミオグロビン、血清アルブミン、β1-リポタンパク質、鉄結合グロブリン、セルロプラスミンが含まれるがこれらに限定されない。

収縮タンパク質の例には、ミオシン、アクチン、ダイニンが含まれるがこれらに限定されない。

保護タンパク質の例には、抗体、補体タンパク質、フィブリノーゲン、およびトロンビンが含まれるがこれらに限定されない。

毒素の例には、Clostridium botulinum毒素、ジフテリア毒素、ヘビ毒、およびリシンが含まれるがこれらに限定されない。

ホルモンの例には、インスリン、副腎皮質刺激ホルモン、およびインスリン様成長ホルモン、および成長ホルモンが含まれるがこれらに限定されない。

構造タンパク質の例には、ウイルスコートタンパク質、糖タンパク質、膜構造タンパク質、α−ケラチン、スクレロチン、フィブロイン、コラーゲン、エラスチン、およびムコタンパク質が含まれるがこれらに限定されない。

天然または合成のペプチドおよびタンパク質が使用され得る。例えば、組換え方法によって調製されたタンパク質が使用され得る。

好ましいタンパク質の例には、免疫グロブリン、IgG（ウサギ、ヒト、マウスなど）、プロテインA/G、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、リゾチーム、ストレプトアビジン、アビジン、フェリチン、レクチン（Con A）、およびBSAが含まれる。サンドイッチ配置でIgGに結合したウサギIgGおよびウサギ抗IgGは有用な例である。

スプライセオソームおよびリボゾームなどが使用され得る。

広範な種々のタンパク質が当業者に公知であり、使用され得る。例えば、A. L. Lehninger, 1970によるBiochemistryの55〜66頁、第3章「Proteins and their Biological Functions: A Survey」を参照されたい。これは、参照として本明細書に組み入れられる。

種々のペプチドタイプの化合物（タンパク質、ポリペプチド、およびオリゴペプチドを含む）が、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングの使用を伴って、パターン化様式で、表面に直接的に転写および吸着され得る。ここで、ペプチドまたはタンパク質は、原子間力顕微鏡チップのようなチップから、基材に直接的に転写される。しかし、代替的には、間接的な方法においては、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングがパターン中の化合物（パターン化合物）を沈着または送達するために使用され得、次いで、ペプチドまたはタンパク質が、パターン化の後でパターン化合物に組み入れられるか、または吸着され得る。

当該技術において公知である、組み入れられた優先権書類（09/866,533）において記載される方法が使用され得、その全体を本明細書中で反復する必要はない。例えば、公知の基材および公知のパターン化合物が、ナノアレイを作製するために使用され得る。高解像度のプリンティングを提供する、より滑らかな基材が一般的には好ましい。

例えば、ナノアレイ表面を有するナノアレイ基材は、例えば、ガラスのような絶縁体、または例えば、金属（金を含む）のような導体であり得る。さらに、基材は、金属、半導体、磁気材料、ポリマー材料、ポリマーコートされた基材、または超伝導体材料であり得る。基材は、1つまたはそれ以上の吸着質であらかじめ処理され得る。なおさらに、適切な基材の例には、金属、セラミックス、金属酸化物、半導体材料、磁気材料、ポリマーもしくはポリマーコートされた基材、超伝導体材料、ポリスチレン、およびガラスが含まれるがこれらに限定されない。金属には、金、銀、アルミニウム、銅、白金、およびパラジウムが含まれるがこれらに限定されない。化合物がその上にパターン化され得る他の基材には、シリカ、酸化ケイ素、GaAs、およびInPが含まれるがこれらに限定されない。

パターン化合物は、パターン化合物を結合するため、および安定性を改善するために基材に化学吸着される得るか、または共有結合され得る。これは、例えば、チオール、ポリチオール、スルフィド、環状ジスルフィドなどのような硫黄含有化合物であり得る。これは、例えば、カルボン酸末端基を有するアルカンチオールのような、一方の末端に硫黄基、および他方の末端に末端反応性基を有する硫黄含有化合物であり得る。パターン化合物は、例えば、100未満、もしくは500未満、もしくは1,000未満の低分子量化合物であり得るか、またはオリゴマー性およびポリマー性化合物を含む高分子量化合物であり得る。合成および天然のパターン化合物が使用され得る。他の例には、16-メルカプトヘキサデカン酸のような官能性の末端基を有するアルカンチオール；1-オクタデカンチオールのような疎水性チオール；ならびにEDCおよびマンノース-SHのような有機カップリング分子が含まれる。硫黄含有化合物の他の例には、硫化水素、メルカプタン、チオール、スルフィド、チオエステル、ポリスルフィド、環状スルフィド、およびチオフェン誘導体が含まれるがこれらに限定されない。例えば、硫黄含有化合物は、チオール基、ホスホチオール基、チオシアノ基、スルホン酸基、ジスルフィド基、またはイソチオシアノ基を含み得る。

他の化合物は、カルボン酸基、アルデヒド、アルコール、アルコキシ基、またはビニル基を有するシルオキシ基またはシリル基を有するケイ素含有化合物を含む。化合物はまた、アミン基、ニトリル基、またはイソニトリル基を有し得る。

金への硫黄吸着は好ましい系であるが、本発明はこの実施態様に限定されるものではない。

従って、全般的には、本発明の方法は、表面に化合物を沈着させて、「あらかじめ形成されたアレイテンプレート」を生成し、次いでその表面に、これらの化合物に吸着するペプチドおよびタンパク質を組み入れる、ナノリソグラフ法、好ましくはDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングを使用する工程を包含する。「組み入れる」プロセスは、あらかじめ形成されたアレイテンプレートを、所望のペプチドまたはタンパク質を含む溶液にさらすことによって達成され得る。すなわち、本発明の方法は、あらかじめ形成されたアレイテンプレートをペプチドもしくはタンパク質溶液に浸す工程；またはあらかじめ形成されたアレイテンプレートの表面に溶液を噴霧する工程を含み得る。あらかじめ形成されたテンプレートをペプチドまたはタンパク質溶液にさらす他の方法には、ペプチドまたはタンパク質の溶液の蒸気または霧を含むチャンバー中にアレイを配置する工程、またはテンプレート上にペプチドまたはタンパク質の溶液を注ぐ工程が含まれる。あるいは、組み入れプロセスは、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングを使用して、あらかじめ形成されたアレイテンプレートの化合物にペプチドまたはタンパク質を沈着させる工程を含み得る。

表面の他の「非化合物」領域へのタンパク質の非特異的結合は、表面のこれらの領域を、タンパク質溶液または試料にさらす前に、別の化合物または化合物の混合物（1つまたはそれ以上の保護化合物）で覆うかまたは「保護する」ことによって避けることができる。公知の保護化合物が使用され得、そして本発明は、非特異的吸着が生じない限り、この特徴によって特に限定されない。種々の保護化合物が使用され得、これらには、例えば、基材への吸着のために官能化されたアルキレングリコールのような界面活性剤が含まれる。保護のために有用な化合物の例は、11-メルカプトウンデシル-トリ（エチレングリコール）である。タンパク質は、11-メルカプトウンデシル-トリ（エチレングリコール）で被覆された表面に対して比較的弱い親和性を有し得、従って、このような表面には結合しない。例えば、

を参照されたい。これらは参照として本明細書によって組み入れられる。しかし、他の化学物質および化合物（例えば、ウシ血清アルブミン（BSA）および粉ミルク）が、表面へのタンパク質の非特異的結合を妨害するために同様の様式で表面を覆うために使用され得る。しかし、BSAは、11-メルカプトウンデシル-トリ（エチレングリコール）よりもより低い性能を与え得る。保護後、得られるアレイは、タンパク質またはペプチドの保護アレイと呼ばれ得る。あるいは、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティング法は、保護化合物をパターン化するために使用され得、ペプチドおよびタンパク質の吸着は他の非保護領域上で実行され得る。

本発明は、ペプチドまたはタンパク質とパターン化合物間の相互作用のタイプによって特に限定されない。一般的に、その相互作用は、吸着後に機能的に有用なタンパク質を生じ、かつその相互作用が強いことが好ましい。化合物−タンパク質結合は、例えば、共有結合、イオン結合、水素結合、または静電的相互作用によるものであり得る。このように、共有結合は、タンパク質と、表面に沈着した化合物との間で形成され得る。このような化合物には、末端スクシンイミド基、アルデヒド基、カルボキシル基、および光活性化可能なアジ化アリール基が含まれるがこれらに限定されない。さらに、スクシンイミド、または代替的には、生理学的なpHでのタンパク質中の一級アミンへのアルデヒド表面基の自発的カップリングは、表面にタンパク質を結合するために組み入れられ得る。例えば、タンパク質は、しばしば、pH7で、カルボン酸末端を有する単層に高い親和性を有する（例えば、16-メルカプトヘキサデカン酸（「MHA」）によって示されるもの）。光活性化可能な表面（例えば、アジ化アリールを含むもの）もまた、タンパク質を結合するために使用され得る。従って、光活性化可能な表面は、紫外線活性化に際して種々の化学基と反応する高度に反応性のニトレンを形成する。

また、天然には存在しないかもしれない種々の生化学的部分間の相互作用を利用するためにアレイ成分を修飾し得る。例えば、ヒスチジンはニッケルに強固に結合する。それゆえに、ヒスチジン残基のストレッチ（通常6〜10アミノ酸長）を産生するために組換え方法を使用して修飾されたタンパク質は、表面に沈着されたニッケル含有化合物に結合し得る。あるいは、スルフヒドリル基がタンパク質に導入され得るか、またはそれらはタンパク質中に天然に存在し得、金表面にすでに結合している化合物にタンパク質を結合させるために使用され得る。同様に、化合物は、スルフヒドリル基を含むように修飾され得る。次いで、化合物は、金表面に結合し得、そしてまたタンパク質に結合し得る。

アレイの表面に沈着された化合物に結合するタンパク質は、それ自体、タンパク質標的を含む種々の標的（すなわち、他の「標的タンパク質」）に結合し得、および／あるいは、生物学的または化学的反応性（例えば、酵素的触媒、切断、もしくは加水分解）を実行するか、または誘発し得る。このように、本発明に従って、その表面に沈着した化合物を介して表面に吸着したタンパク質は、例えば、（i）標的に結合するため、（ii）基材と反応および基材を利用するため、または（iii）標的による利用のために基材として使用されるために使用され得る。

例えば、原子間力顕微鏡法（AFM）を、本発明のアレイをスクリーニングするために利用することができ、単一タンパク質レベルでのタンパク質反応性のような情報を提供し得るか、または、アレイ中でのタンパク質への標的タンパク質のような標的の結合を検出し得る。例えば、捕捉タンパク質が結合する位置の高さ、疎水性、粘性、粗さ、および形状は、別の物質との反応または結合に際して変化する可能性が非常に高い。このような変数のすべては、従来の原子間力顕微鏡を用いて容易に探索される。他の探索または検出方法もまた、当業者に公知のように使用され得る。

本発明のナノ範囲のタンパク質アレイまたはナノアレイは、広範な種々の技術的応用（例えば、プロテオミクス；薬理学的調査；イムノアッセイの実行；タンパク質−タンパク質相互作用の研究；および試料中の特定の物質のレベル、量、または濃度の測定）のために有用であり得る。これらは、細胞の制御および誘導を研究するために、生物学において有用であり得る；そしてこれらはまた、情報技術において有用である。後者に関しては、順序付けられた生体分子アレイが、超高密度、ナノメータースケール生物電子工学集積回路を製作するために仕立てられ得る。

図1〜5および以下の実用的実施例8に例証される、1つの特定の実施態様において、ナノ範囲のリゾチームおよびウサギ免疫グロブリンG（「IgG」）ナノアレイが本発明の技術に従って作製された。DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングは、化合物16-メルカプトヘキサデカン酸を、ドットまたは線状のグリッドの形態で、金フィルムの表面にパターン化するために使用された。次いで、MHAドットまたはラインを取り囲む領域を、界面活性剤である11-メルカプトウンデシル−トリ（エチレングリコール）で保護した。次いで、パターン化され保護された金フィルムを、ウサギIgGのリゾチームを含む溶液のいずれかに浸し、次いですすいだ。次いで、タンパク質アレイは、AFMによって特徴付けられ、これは、リゾチームタンパク質が金フィルムのMHAパターン化された表面上にのみ組み入れられ、ドットまたはラインのアレイを形成したことを示した。リゾチームは形状が楕円形であるので、これは、金フィルム表面上で2つの有意に異なるコンホメーションをとり得る（すなわち、その長軸上に横たわるか、または直立する）。これらのコンホメーションの両方が、AFMによって高さの差異を測定することによって区別され得る。

同様に、ウサギIgGは、それが一旦、金フィルム表面に結合されたならば、高さの統計学に従って測定された。リゾチームアレイと同様に、ウサギIgGのみがナノ範囲のMHAパターンに結合した。MHA結合IgG免疫グロブリンの生物活性は、IgGと強力に結合する複合体を形成することが知られている抗IgGタンパク質を用いてIgGの反応性を試験することによって評価された。抗IgGはIgGにのみ結合し、AFMによって測定可能である高さの増加を生じたことが見い出された。従って、高さの変化を検出することは（すなわち、抗IgGにさらす前後で）、ポジティブシグナルについてアレイをスクリーニングする容易な方法であることを証明する。同時に行われた対照実験は、この場合は、IgGへの抗IgGの結合がランダムまたは非特異的でないことを示すために有用である。例えば、抗IgGタンパク質は、リゾチーム高さプロフィールの変化を欠くことによって証明されたように、上記のリゾチームアレイに結合するようにならなかった。例えば、Leeら、Science, 295, 1702-1705, 2002を参照されたい。

本明細書中に記載される方法の解像度が評価されかつ最適化され得、そして統合されたタンパク質のナノライブラリーが作製され得る。

本発明はさらに、以下の実用的実施例によって例証される。特に、実施例8はペプチドおよびタンパク質ナノアレイに焦点を当てている。実施例1〜7は、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングについての種々の実施態様を例証する。

実施例
実施例1：金基材上でアルカンチオールを使用するDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティング
ODTで被覆したAFMチップが試料表面と接触させられた場合、ODTは毛管作用によってチップから試料に流れる（これは、つけペン（dip pen）とよく似ている）。このプロセスは、室温でマイカ上での300Åの多結晶Auを熱蒸着することによって調製された、薄層フィルム基材上での従来のAFMチップを使用して研究されてきた。すべての実験を実行するために、Park Scientific Model CP AFM機器を使用した。スキャナーをガラスの分離チャンバー中に封入し、相対湿度を湿度計で測定した。すべての湿度測定は±5％の絶対誤差を有する。窒化ケイ素チップ（Park Scientific Microlever A）を、1分間、アセトニトリル中のODTの飽和溶液中にカンチレバーを浸すことによりODTで被覆した。このカンチレバーを、使用前に圧縮ジフルオロエタンでブロードライした。

DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングプロセスの単純な実証は、Au基材の1μm×1μmセクションを横切るこの様式で調製されたチップをラスタスキャニングすることを含んだ。より大きなスキャン領域（3μm×3μm）中のこのセクションのLFM画像は、異なるコントラストの2つの領域を示した。内部の暗い領域、またはより低い側方向力の領域はODTの沈着された単層であり、そして外部のより明るい領域は裸のAuであった。

高品質の自己集合単層（self-assembled monolayer, SAM）の形成が、沈着プロセスがAu（111）／マイカ（これは、300℃で3時間、Au薄フィルム基材を焼鈍することによって調製された）上で実行された場合に起こった。Alvesら、J Am. Chem. Soc., 114: 1222（1992）。この場合、ODT SAMの格子分解画像を得ることが可能であった。5.0±0.2Åの六角形格子パラメーターは、Au（111）上のODTのSAMについて報告されている値に十分に匹敵し（同上）、そして、他のいくつかの吸着質（水またはアセトニトリル）ではなくODTが、チップから基材に輸送されたことを示す。

Au（111）／マイカ上で実行された実験は、これらの実験において輸送された種の化学的同一性に関して重要な情報を提供したが、Au（111）／マイカは、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングについては不十分な基材である。Au（111）の小さな刻面の周りの深い溝は、ナノメーター幅を有する長い（マイクロメーター）連続するラインを引くことを困難にする。

焼き鈍していないAu基材は、比較的荒いが（平方自乗平均の粗さ、2nm）、しかし、30nmのラインがDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって沈着され得る。この距離は、薄いフィルム基材の平均のAu粒子直径であり、このタイプの基材上のDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングの分解能の限界を表す。このタイプの基材上に調製された30nm分子に基づくラインは不連続であり、Auの粒子の端に従った。より滑らかでかつより連続的なラインは、100nmまでライン幅を増大させることにより、またはおそらくより滑らかなAu基材を使用することにより、引かれ得る。ラインの幅は、チップのスキャン速度およびチップから基材へのアルカンチオールの輸送の速度に依存する（相対湿度は輸送速度を変化させ得る）。より速いスキャン速度および痕跡のより少ない数はより狭いラインを与える。

DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングをまた、「インク」の拡散特性を実証するために分子ドット特徴を調製するために使用した。ODT被覆チップを、一連の時間の期間、Au基材と接触させた（設定値＝1nN）。例えば、0.66μm、0.88μm、および1.6μm直径のODTドットを、それぞれ、2分間、4分間、および16分間、表面と接触させてチップを保持することによって作製した。ドットの均一な外見は、チップから表面までのすべての方向におけるODTの均一な流れを反映していると考えられる。反対の対照的な画像は、アルカンチオール誘導体、16-メルカプトヘキサデカン酸のドットを類似の様式にて沈着させることによって得られた。これは、分子がチップから表面まで輸送されているさらなる証拠を提供するのみならず、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングの分子的な一般性もまた実証する。

アレイおよびグリッドが、個々のラインおよびドットに加えて生成され得る。0.54μm離れて配置されている25個の0.46μm直径のODTドットのアレイを、各ドットを形成するために側方向の動きなしで、45％の相対湿度で、20秒間、表面（1nM）と接触させて、ODT被覆チップを保持することによって生成した。2μmの長さおよび100nmの幅の8個の交差するラインからなるグリッドを、各ラインを形成するために、ODT被覆チップで、4μm/秒のスキャン速度で、1nNの力で、1.5分間、Au表面を掃くことによって生成した。

実施例2：種々の基材および「インク」を用いるDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティング
多数の化合物および基材がDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングにおいて首尾よく利用されてきた。これらは、表1において、化合物および基材の組み合わせについての可能な使用と共に、以下に列挙される。

AFMチップ（Park Scientific）を使用した。このチップはケイ素チップ、窒化ケイ素チップ、および、パターン化合物の物理吸着を増強するために10nmのチタン層で被覆した窒化ケイ素チップであった。窒化ケイ素チップを、Holland、Vacuum Deposition Of Thin Films（Wiley, New York, NY, 1956）に記載されるように真空沈着によってチタンで被覆した。窒化ケイ素チップをチタンで被覆することは、チップを鈍くし、かつDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングの分解能を減少させることに注意すべきである。しかし、チタン被覆チップは、水がパターン化合物の溶媒として使用される場合に有用である。被覆していない窒化ケイ素チップを用いて実行されたDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングは、最もよい解像度を与えた（約10nmの低さ）。

表1に列挙された金属フィルム基材を、Holland、Vacuum Deposition Of Thin Films（Wiley, New York, NY, 1956）に記載されるように真空沈着によって調製した。半導体基材を、Electronic Materials, Inc., Silicon Quest, Inc. MEMS Technology Applications Center, Inc., またはCrystal Specialties, Inc.から入手した。

表1に列挙したパターン化合物はAldrich Chemical Co.から入手した。表1に列挙した溶媒はFisher Scientificから入手した。

AFMチップを、実施例1に記載したように、蒸着によってまたは直接的接触スキャニングによって、パターン化合物で被覆した（パターン化合物の溶液に浸し、続いて不活性ガスで乾燥させた）。実施例1の方法が最も良好な結果を与えた。また、複数回チップを浸すことおよび乾燥させることは、さらに結果を改善した。

チップを、Sherman, Chemical Vapor Deposition For Microelectronics: Principles, Technology And Applications（Noyes, Park Ridges, NJ, 1987）に記載されるように蒸着によって被覆した。手短に述べると、純粋な型のパターン化合物（固体または液体、溶媒なし）を、密封したチャンバー中の固体基材（例えば、ガラスまたは窒化ケイ素；Fisher ScientificまたはMEMS Technology Application Centerから入手）上に配置した。空気によって酸化される化合物については、真空チャンバーまたは窒素で満たしたチャンバーを使用した。AFMチップは、パターン化合物から約1〜20cmの位置であり、この距離は、材料の量およびチャンバーの設計に依存した。次いで、その化合物を、それが蒸発する温度まで加熱し、それによって、チップをその化合物で被覆した。例えば、1-オクタデカンチオールは、60℃で蒸着され得る。蒸着によるチップの被覆は、チップ上にパターン化合物の薄い均一な層を産生し、そしてDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングについてかなり信頼できる結果を与えた。

チップを、固体基材（例えば、ガラスまたは窒化ケイ素；Fisher ScientificまたはMEMS Technology Application Centerから入手）上にパターン化合物の飽和溶液の滴を沈着させることによる直接接触スキャニングによって被覆した。乾燥に際して、パターン化合物は、基材上に微結晶相を形成した。AFMチップ上にパターン化合物を負荷させるために、この微結晶相を横断して、チップを反復してスキャンさせた（-5Hzスキャン速度）。この方法は単純であったが、チップの最も良好な負荷をもたらすことはなかった。なぜなら、基材からチップに転写されるパターン化合物の量を制御することが困難であったからである。

DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングを、Park Scientific AFM, Model CP、スキャニング速度5-10Hzを使用して、実施例1に記載されるように実行した。スキャニング時間は、10秒間から5分間の範囲であった。調製されたパターンには、グリッド、ドット、文字、および長方形が含まれた。グリッドラインおよび文字を形成したラインの幅は、15nm〜250nmの範囲であり、そして個々のドットの直径は、12nm〜5μmの範囲であった。

実施例3：被覆したチップを用いる原子間力顕微鏡法
この実施例は、1-ドデシルアミンの物理吸着層を有する窒化ケイ素AFMチップの修飾を記載する。このようなチップは、毛管力を実質的に減少させること、およびより高い解像度を提供することによって（とりわけソフト材料を使用して）、空気中でLFMを行う能力を改善する。

この実施例において提示されるすべてのデータは、複合AFM/LFMヘッドを有するPark Scientific Model CP AFMを用いて得た。カンチレバー（モデル番号MLCT-AUNM）はPark Scientificから入手し、以下の仕様を有した：金被覆マイクロレバー、窒化ケイ素チップ、カンチレバーA、スプリング定数＝0.05N/m。AFMを、乾燥窒素パージラインで修飾したPark vibration単離チャンバーにマウントした。また、チャンバー内部に配置した電子湿度計を、湿度の測定のために使用した（12〜100％の範囲で±5％）。白雲母緑色マイカを、Ted Pella, Inc.から入手した。ソーダライムガラス顕微鏡スライドを、Fisherから入手した。0.23±0.002μm直径を有するポリスチレン球を、Polysciencesから購入し、そしてケイ素上のSi₃N₄を、MCNC MEMS Technology Applications Centerから入手した。1-ドデシルアミン（99+％）をAldrich Chemical Inc.から購入し、そしてさらに精製することなく使用した。アセトニトリル（A.C.S.グレード）を、Fisher Scientific Instruments, Inc.から購入した。

1-ドデシルアミンでAFMチップを被覆するための2つの方法を検討した。第1の方法はエタノールまたはアセトニトリルを1-ドデシルアミンで飽和させる工程、次いで、この溶液の液滴をガラス基材上に沈着させる工程を包含した。乾燥に際し、1-ドデシルアミンは、ガラス基材上に微結晶相を形成した。AFMチップ上に1-ドデシルアミンを負荷するために、このチップを、この微結晶相を横断して反復してスキャンした（約5Hzスキャン速度）。この方法は単純であったが、チップの最も良好な負荷をもたらすことはなかった。なぜなら、基材からチップに転写される1-ドデシルアミンの量を制御することが困難であったからである。

より良好な方法は、ドデシルアミンを、溶液からAFMカンチレバーに直接転写することであった。この方法は、チップ上のいかなる残存夾雑物も除去するために、数分間、AFMカンチレバーおよびチップをアセトニトリル中に浸す工程を包含した。次いで、このチップを、約30秒間、約5mMの1-ドデシルアミン／アセトニトリル溶液中に浸した。次に、このチップを、圧縮フレオンでブロー乾燥した。この手順を数回反復し、典型的に最良の結果を得た。1-ドデシルアミンは、窒化ケイ素チップに、化学吸着ではなく、物理吸着する。実際、バルクの窒化ケイ素を用いる場合と同様に、ドデシルアミンは、アセトニトリルを用いてチップからすすがれ得る。Benoitら、Microbeam and Nanobeam Analysis; Springer Verlag, （1996）。この様式におけるチップの修飾は、以下に記載するいくつかの実験によって証明されるように、大気中の水の結露による毛管効果を有意に減少させた。

最初に、AFMの側方向力の検出器に直接接続されたデジタルオシロスコープを使用して、時間の関数としての側方向力の出力を記録した。この実験において、チップを左から右にスキャンした場合に、右から左にスキャンした場合と比較して、摩擦力が方向を変えた。従って、LFM検出器の出力は、チップのスキャン方向が変化する度に、極性を切り換えた。1つまたはそれ以上のAFMラスタスキャンが記録された場合、検出器の出力は、方形波の形態であった。方形波の高さは、試料上のチップの滑り摩擦に直接比例する。従って、修飾していないチップとガラス基材との間の摩擦力、および修飾したチップとガラス基材との間の摩擦力を、単に、ほぼ同一のスキャニングおよび環境的条件の下で方形波の高さを比較することによって比較し得る。このチップ／試料摩擦力は、修飾していないチップよりも、修飾しているチップでは少なくとも1/3より小さかった。この実験をマイカ基材上で反復し、そして同様の摩擦力の減少を観察した。一般的に、この方法およびこれらの条件下で測定された摩擦の減少は、修飾されたチップについては1/3から1/10より小さい範囲にわたり、これは、基材および環境の条件、例えば、相対的湿度に依存する。

この実験は、AFMチップの1-ドデシルアミン処理が摩擦を低減したことを示したが、このことは、水および毛管力が鍵となる因子であることを証明しなかった。別の実験において、水の毛管輸送に対する1-ドデシルアミン被覆の効果を調べた。修飾していないチップを含む水輸送の詳細は、他に議論されている。Finerら、Langmuir 13, 6864-6868（1997）。AFMチップが試料を横切ってスキャンされた場合、それは、毛管作用によって水を試料に輸送した。4μm×5μm領域のソーダガラス基材を数分間スキャン後、水の連続した漸進層（adlayer）が基材上に沈着され、そしてスキャンサイズを増大させることによってLFMによって画像化された。摩擦がより低い領域（水が沈着したところ）は、付着させていないところよりもより暗く見えた。1-ドデシルアミンを用いて被覆したチップを用いて実行した同じ実験は、実質的な水の輸送の証拠を示さなかった。実際、摩擦のランダムなバリエーションのみが観察された。

これらの実験は、摩擦が減少し得、そして毛管作用によるチップから基材への水の輸送は、1-ドデシルアミンでチップを被覆することによって阻害され得ることを示したが、これらは、修飾されたチップの解像力に関する情報を提供しなかった。マイカは、この問題を評価するために優秀な基材であり、実際、格子の解像画像は、この修飾されたチップで日常的に得ることができ、このことは、この修飾手順がチップを切断することなしに摩擦力を減少させたことを実証する。画像に含まれたチップの一部が裸であったか、または1-ドデシルアミンの層をその上に有したかを決定することは困難であった。実際、1-ドデシルアミン層がチップのこの部分から機械的に除去されて、裸のSi₃N₄を露出した可能性がある。いずれにしても、チップの残りの部分は、その上にドデシルアミンの疎水性層を有していたに違いない。なぜなら、水は、接触点を取り囲むキャピラリーを満たすことを阻害され、それによって毛管効果を減少するからである（上記を参照されたい）。

AFMの原子スケールの画像化能力は、チップ上の1-ドデシルアミン被覆によって有害な影響を受けなかったが、上記の実験は、より大きなスケールでの形態学的データを得るためのチップの適合性についての有用な情報を提供しなかった。このような情報を得るために、単分散の0.23μm直径ラテックス球の試料を、修飾していないチップおよび修飾したチップの両方を用いて画像化した。AFMによって記録されたトポグラフィーは、チップの形状および試料の形状の重畳であるので、チップの形状のいかなる変化も、ラテックス球の画像化されたトポグラフィーの変化に反映される。修飾したチップおよび修飾していないチップをそれぞれ用いて取られた画像において、検出可能な差異は見い出されなかった。このことは、金属被覆がチップ上に蒸着された場合に変化するようには、チップの形状が有意に変化しなかったことを示す。さらに、このことは、1-ドデシルアミン被覆がチップの表面にわたって全く均一であって、かつ十分に尖っているので、これは、原子スケールの画像化に有害な効果を与えなかったことを示唆する。

重要な問題は、ソフト材料の画像化における修飾したチップの性能に関する。典型的には、化学修飾したチップが、裸のチップを用いた場合と比較して、改善された性能を示すか否かを決定することは難しい。このことは、化学修飾が、しばしば不可逆的なプロセスであり、このプロセスは、時折、中間の層の沈着を必要とするからである。しかし、本明細書中に報告される修飾プロセスは、1-ドデシルアミンの物理吸着層に基づいていたので、修飾前、修飾後、およびチップがすすがれかつ1-ドデシルアミンが除去された後のチップの性能を比較することが可能であった。定性的に、1-ドデシルアミン修飾チップは、種々の基材上に沈着されたアルカンチオールおよび有機結晶に基づく単層の画像化において、常に、有意な改善を提供した。例えば、Au（111）表面上の11-メルカプト-1-ウンデカノールの親水性自己集合単層の格子解像画像は、日常的に修飾チップを用いて得られた。この格子は、同じ修飾していないAFMチップを用いて分解され得なかった。この表面上で、被覆チップは、方形波分析（上記を参照されたい）によって、少なくとも1/5の摩擦の減少を示した。OH-末端を有するSAMは親水性であり、従って、きれいなチップに対して強い毛管引力を有することは注意されるべきである。修飾チップによって毛管力を減少することは、格子を画像化することを可能にする。

改善された解像の第2の例は、マイカ上で結露した水のような、自由な状態の液体表面の画像化を含んだ。30〜40％の間の湿度では水はマイカ上で2つの別個の相を有することは周知である。Huら、Science 268, 267-269（1995）。このグループによる以前の研究において、非接触モードスキャニング偏光力顕微鏡（SPFM）を使用してこれらの相を画像化した。プローブチップがマイカに接触するようになったときに、強力な毛管力は、水がチップを濡らすこと、およびマイカ上での水の結露を強力に妨害することを引き起こすことが見い出された。水の2つの相が画像化され得るように毛管効果を減少させるために、チップを表面から約20nm離して保持した。この制約によって、接触モードスキャニングプローブ技術を用いてこのような相を画像化することはできない。接触モードで1-ドデシルアミン修飾したチップを用いて、30％湿度で記録したマイカ上での水の2つの相の画像が得られた。特徴の高さは、摩擦マップに対応し、より高い特徴はより低い摩擦を有した。チップ上の1-ドデシルアミン層の均一性と相関すると考えられている修飾チップの品質は重要であった。十分に修飾されたチップのみが、水の2つの相を画像化することを可能にしたが、一方十分に修飾されていないものは、より乏しい品質の画像を生じた。実際、これは、他の試料に進む前に、1-ドデシルアミン修飾チップの品質の診断的インジケーターとして使用され得るような高感度の試験であった。

結論として、この実施例は、Si₃N₄AFMチップを疎水性にするための非常に有用な方法を記載する。この修飾手順は、毛管力を低減させ、かつ空気中でのAFMの性能を改善する。意義深いことには、これは、AFMチップの形状に悪影響を与えず、かつ、固体支持体上で、SAMのようなソフト材料および自由状態の水でさえをも含む親水性基材の格子解像画像を得ることを可能にする。

実施例4：多成分DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティング
この実施例は、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによる多成分ナノ構造の生成を記載し、かつ、2つの異なるソフト材料のパターンが、ほぼ完全な整列かつ10nm空間解像度で、任意の様式で、この技術によって生成され得ることを示す。これらの結果は、分子に基づく電子工学に興味がある者に、従来の巨視的にアドレス可能なマイクロ電子回路を用いて、ソフト構造を生成、整列、およびお互いの表面を接するための多くの道を開くはずである。

他に特定しない限りは、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングは、従来の機器（Park Scientific CP AFM）およびカンチレバー（Park Scientific Microlever A）を使用して、原子的に平らなAu（111）基材上で実行した。原子的に平らなAu（111）基材を、最初に真空中、120℃で12時間、マイカの断片を加熱して、存在するかもしれない水を除去すること、次いで、真空中で220℃でマイカ表面に30nmの金を熱蒸着させることによって調製した。原子的に平らなAu（111）基材を使用して、15nm幅のラインが沈着され得る。圧電管ドリフトの問題を避けるために、閉じたループスキャン制御を有する100μmスキャナー（Park Scientific）をすべての実験のために使用した。パターン化合物を、実施例1に記載したように（溶液中での浸漬）または蒸着によって（液体および低融点固体について）チップに被覆した。蒸着を、100ml反応容器中、パターン化合物（ODT）の1cm上に窒化ケイ素カンチレバーをぶら下げることによって実行した。系を閉じ、60℃で20分間加熱し、次いで、被覆したチップの使用前に室温まで冷却させた。溶液中での浸漬または蒸着による被覆の前後のチップのSEM分析は、パターン化合物はチップを均一に被覆したことを示した。チップ上の均一な被覆は、制御された様式で基材上にパターン化合物を沈着すること、ならびに高品質画像を得ることを可能にする。

DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングは、それを形成するために使用されるのと同じツールを用いてナノ構造を画像化することを可能にするので、優秀なレジストリを有する異なるソフト材料から作られるナノ構造を生成するという、興味を引き立てられる見込みが存在した。DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによるレジストリにおける複数のパターンを生成するための基本的アイデアは、整列マークに頼っているe-ビームリソグラフィーによる多成分構造を生成するための類似するストラテジーに関する。しかし、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティング法は、これが整列マークを位置決めするためにレジストまたは光学的方法を使用しないという意味で2つの別個の利点を有する。例えば、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングを使用することにより、Au（111）に刻まれた基材上で（原子的に平らなAu（111）基材について上記と同じ調製）、MHA被覆されたチップをAu（111）表面と接触（0.1nN）させて10秒間保持することにより、1,16-メルカプトヘキサデカン酸（MHA）の15nm直径の自己集合単層（SAM）ドットを生成し得る。スキャンサイズを増大させることにより、次いで、パターン化されたドットを、同じチップを用いて、側方力顕微鏡（LFM）によって画像化する。SAMおよび裸の金は非常に異なる濡れ特性を有しているので、LFMは、優れたコントラストを提供する。Wilburら、Langmuir 11, 825（1995）。第1のパターンの位置に基づいて、さらなるパターンの座標が決定され得、これは、MHAドットの第2のパターンの正確な配置を可能にする。ドットの均一性および第2のパターンに関する第1のパターンの最大の誤った整列が10nm未満であることに注意されたい。データを生成する間の経過時間は10分間であった。このことは、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングが、環境にわたり適切な制御を伴って、大気条件下で、10nmよりも良好な、空間的かつパターンの配列解像度を有する有機単層をパターン化するために使用され得ることを実証する。

複数のパターン化合物を用いてパターン化するためのこの方法は、上記の実験のさらなる修飾を必要とした。MHA SAMドットパターンはパターン化合物で被覆したチップを用いて画像化したので、少量の検出可能でないパターン化合物が画像化の間に沈着された可能性が高い。これは、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングのいくつかの応用、とりわけ、分子に基づく構造に対する電子的測定を扱うものに有意な影響を与え得る。この問題を克服するために、MHA被覆チップで描いたミクロンスケールの整列マークを使用して、Au基材上の汚れていない（pristine）領域中にナノ構造を正確に配置した。典型的な実験において、MHAからなり、かつ190nm隔てられている50nmの平行線の最初のパターンを調製した。このパターンは外部の整列マークから2μm離れていた。これらのラインの画像はパターン化された領域の夾雑を避けるために取られなかったことに注意されたい。次いで、MHA被覆されたチップを、ODT被覆したチップで置き換えた。このチップは、整列マークを位置付けするために使用され、次いで、整列マークの位置に基づいてあらかじめ計算された座標を使用して、50nmのODT SAMの平行線の第2のセットを用いて、基材をパターン化した。これらのラインを互いにかみ合うような様式で、かつMHA SAMラインの第1のセットに関してほぼ完全なレジストリを伴って配置したことに注意されたい。

「上書き」と呼ばれる、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングの1つの独特な能力が存在する。上書きは、パターン化合物の1つのタイプから1つのソフト構造を生成する工程、次いで、もともとのナノ構造を横切るラスタスキャニングによってパターン化合物の第2のタイプを用いて穴埋めする工程を包含する。中程度に大きな領域にわたるDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングの複数のパターン化合物、高度なレジストリ、および上書きの能力を実証することをねらう概念の実験のさらなる証明として、MHA被覆チップを使用して、100nmライン幅を有する3つの幾何学的構造（三角形、四角形、および五角形）を生成した。次いで、このチップをODT被覆チップに変更し、もともとのナノ構造を含む10μm×8.5μm領域を、ODT被覆チップを用いて、基材を横切る20回のラスタスキャニング（接触力約0.1nN）によって上書きした。水をこれらの実験において輸送媒体として使用し、そしてこれらの実験において使用されたパターン化合物の水溶解性は非常に低いので、ナノ構造を生成するために使用した分子と、露出した金に上書きするために使用された分子との間の検出可能な交換は本質的に存在しなかった。

要約すると、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングの、高解像度の、複数のパターン化合物レジストレーション能力が実証されてきた。原子的に平らなAu（111）表面上で、15nmのパターンが、10nmよりもより良好な空間的解像度を伴って生成された。アモルファス金のような粗い表面においてさえ、空間的解像度は、ソフト材料をパターン化するために、従来のフォトリソグラフィーおよびe-ビームリソグラフィー法よりも良好であった。

実施例5：レジストを生成するためのDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングの使用
DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって生成されたナノ構造の、標準的なウェットエッチング技術によって三次元多層固体状態構造を生成するためのレジストとしての適合性を、体系的な研究において評価した。この結果をこの実施例において報告する。この研究において、Au/Ti/Si基材上にアルキルチオール単層レジストを沈着するために使用した。引き続くウェット化学エッチングにより、標的化された三次元構造を産生した。多くの空間的に分離した単層レジストのパターンが、単一のAu/Ti/Siチップ上にDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって沈着され得、従って、エッチング条件の効果は、コンビナトリアル様式で複数の特徴において試験され得る。

この研究における典型的な実験において、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングを使用して、Au/Ti/Si基材上にアルキルチオールを沈着させた。アルキルチオールが、Au薄フィルム上で十分に順序付けられた単層を形成する（これは、特定のウェット化学エッチング手順の間の分解から基底にあるAuを保護する）ことは十分に確立されている（Xiaら、Chem. Mater., 7: 23 32（1995）；Kumarら、J. Am. Chem. Soc., 114: 9188（1992））。そして、このことは、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって生成されたレジストについてもまた適用されるようである（以下を参照されたい）。従って、Au、Ti、およびSiO₂（これらは単層によって保護されなかった）は、段階化された手順において、化学的腐食液によって除去され得る。この手順は、「第1段階」の三次元特徴：多層、Si基材上でのAuをトップに有する特徴を産生した。さらに、「第2段階」の特徴は、エッチングレジストとして残存するAuを使用することによって調製され、露出したSi基材の選択的エッチングを可能にした。最後に、残ったAuは、最終段階のすべてのSi特徴を産生するために除去した。このように、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングは、ウェット化学エッチングと組み合わせ得、100nmより下の長さのスケール上での、少なくとも1つの次元を有するSi（100）ウェハ上の三次元的特徴を産生する。

Siウェハ上のナノスケール特徴を調製するために使用される手順は図示され得る。第1に、磨かれた単一結晶Si（100）ウェハを、熱蒸発によって5nmのTiで、続いて10nmのAuで被覆した。Si（100）ウェハ（4"直径（1-0-0）ウェハ；3-4.9 ohm/cm 抵抗率；500-550μm厚）は、Silicon Quest International, Inc.（Santa Clara, CA）から購入した。5nmのTi（99.99％；Alfa Aesar；Ward Hill, MA）続いて10nmのAu（99.99％；D.F.Goldsmith；Evanston, IL）の熱蒸発は、ターボポンプ（モデルEXT510）を備えたEdwards Auto 306 Turbo EvaporatorおよびEdwards FTM6 quartz crystal microbalanceを使用して達成し、フィルムの厚さを決定した。AuおよびTiの沈着を、室温、1nm／秒の速度、および基底の圧力＜9×10^-7mbで実行した。

Au蒸発の後、以下の手順を基材上で実行した：a）DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングを、ODTのパターンを沈着するために使用した、b）AuおよびTiを、以前に報告されたフェリ／フェロシアナイドに基づく腐食剤を使用してODT単層によって保護されていない領域からエッチングした（Xiaら、Chem. Mater., 7: 2332（1995））、c）残渣のTiおよびSiO₂を、1％HF溶液に試料を浸すことによって除去した（注記：この手順はまた、自然酸化物成長に関して、露出したSi表面を保護する）（Ohmi, J. Electrochem. Soc., 143: 2957（1996））、d）残存するSiを、以前に報告された塩基性腐食液のマイナーな修飾によって異方性エッチングした（Seidelら、J. Electrochem. Soc., 137: 3612（1990））。得られたウェハのトポグラフィーを、AFMおよびSEMによって評価した。

すべてのDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングおよびすべてのAFM画像化実験を、Thermomicroscopes CP AFMおよび従来のカンチレバー（Thermomicroscopes sharpened Microlever A、力定数0.05N/m、Si₃N₄）を用いて実行した。0.5nNの接触力を、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングパターン化のために典型的に使用した。圧電管ドリフトの問題を最小化するために、閉じたループスキャン制御を有する100μmスキャナーをすべての実験に使用した。DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングのために、チップを、以下の様式でODTで処理した：1）チップを、30％のH₂O, :H, SO₄（3:7）中に30分間浸した(注意：この混合物は有機物質と激しく反応する)、2）チップを水ですすいだ、3）チップを密封したキャニスター（約15cm³内部容積）中で、200mg ODTを用いて、60℃で30分間加熱した、そして、4）チップを、使用前に圧縮ジフルオロエタンでブロー乾燥した。代表的な周囲画像化条件は、他に報告しない限り、30％湿度および23℃であった。走査型電子顕微鏡法（SEM）を、EDS検出器を備えたHitachi SEMを使用して実行した。

標準的なフェリ／フェロシアニド腐食液を、以前に報告されているように（Xiaら、Chem. Mater., 7: 2332（1995））、マイナーな修飾を伴って調製した：ナノ純度水中、0.1M Na₁S,O₃, 1.0M KOH, 0.01M K₃Fe(CN)₅, 0.001M K₄Fe(CN)₆。Auエッチングを、ウェハをこの溶液中に、攪拌しながら2〜5分間浸すことによって達成した。HF腐食液（ナノ純度水中1％（v:v）溶液）を、49％ HFから調製し、そして基材をこの溶液中で10秒間攪拌した。ケイ素エッチングを、55℃、10秒間、攪拌しながら、ナノ純度水中15％（v:v）イソプロパノール中、4M KOHにウェハを浸すことによって達成した（Seidelら、J. Electrochem. Soc., 137: 3612（1990））。SiO成長に関するSi基材の最終的な保護は、穏やかに攪拌しながら、10秒間、1％ HF中に試料を浸すことによって達成した。基材を、各エッチング手順の後でナノ純度水ですすいだ。残渣のAuを除去するために、基材を、O₂プラズマで3分間洗浄し、王水に1分間（3:1 HCl:HNO₃）浸し、続いて、穏やかに攪拌しながら、10秒間、1％ HF中に試料を浸した。

分析は、上記に概説した手順に従ってパターン化したAu/Ti/SiチップのAFMトポグラフィー画像を示す。この画像は、中心から中心への距離が0.8μmであるODTの4つの等しいサイズのドットでパターン化されたAu/Ti/Siチップをエッチングすることによって形成された55nmの高さを有する4つのピラー（pillar）を示す。各ODTドットを、AFMチップをAu表面と2秒間接触させて保持することによって沈着させた。ODTドットのサイズはエッチングの前に測定しなかったが、それらの見積もり直径は約100nmであった。この見積もりは、示されたピラーに対応するODTドットの沈着の直前に同じ表面上で同じチップを用いて沈着したODT「テスト」パターンの測定されたサイズに基づく。示されたピラーのトップの平均直径は90nmであり、平均の基底の直径は240nmであった。分析は、同じAu/Ti/Si基材上で同様にパターン化されかつエッチングされた領域からのピラー（55nm高さ、45nmトップ直径、および155nm基底直径）を示す。ピラー直径を横切る横断面のトポグラフィーの痕跡は、平らなトップおよび対称的な側壁を示した。この構造の形状は、AFMチップの形状（湾曲の約10nm半径）によって複雑化され得、実際の幅よりもより長くなり得る、AFMによって測定されるような側面の幅を生じた。

さらに、Au/Ti/Si基材を、1μmの中心から中心への距離を有する、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティング（0.4μm／秒、各ODTラインの見積もられた幅は100nm）によって描かれた3つのODTラインでパターン化した。分析は、この基材をエッチングした後のAFMトポグラフィー画像を示す。トップおよび基底の幅は、それぞれ、65nmおよび415nmであり、そしてラインの高さは55nmである。分析は、50nmのトップ幅、155nmの基底幅、および55nm高さを有する、同じAu/Ti/Siウェハ上で同様にパターン化およびエッチングされた領域からのラインを示す。ラインの直径を横切るこの横断面のトポグラフィーの痕跡は、平らなトップおよび対称的な側壁を示す。

分析は、この技術を用いる、特徴のサイズの可能なバリエーションを示す。ODT被覆したAFMチップを種々の長さの時間（16〜0.062秒）、表面と接触させて保持して、2μmの中心から中心への距離を有する種々のサイズのドットを生成した。これは次に、エッチングされた三次元構造を産生し、トップ直径は1.47μm〜147nmの範囲であり、高さは80nmであった。SEMによって測定されたトップ直径は、AFM画像から測定された直径から15％未満、異なっていた。さらに、エネルギー分散分光法（EDS）は、ピラートップ上のAuの存在を示したのに対して、Auは上昇したマイクロおよびナノ構造を取り囲む領域中には観察されなかった。予想されたように、マイクロおよびナノ−三層構造の直径は、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって生成されたレジスト特徴のサイズ（これは、チップ−基材接触時間と直接的に関連した）と相関した。ライン構造はまた、コンビナトリアル様式で製造された。ODTラインは、1μmの中心から中心の距離で、0.2〜2.8μm／秒で変動するスキャン速度で描かれた。エッチング後、これらのレジストは三層構造を与え、すべてが80nmの高さおよびトップライン幅が505nm〜50nmの範囲であった。パターン化された領域の電界放出走査型電子顕微鏡写真は、同じ領域のAFM画像と比較し得るように見られ、2つの技術によって決定されるように、互いの15％以内のトップ幅を有した。

結論として、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングは、Au/Ti/Si三層基材の表面上のミクロンから100nmより下の次元を有する、単層に基づくレジストを沈着するために使用され得ることが実証された。これらのレジストは、保護されていない基材層を除去するためにウェット化学的腐食液を用いて使用され得、比較し得る次元を有する三次元の固体状態の特徴を生じる。この実施例は、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによる固体状態のナノ構造の製造の最終的な解像度に対処するものではないことに注意することが重要である。実際、特徴サイズは新規な「インク」およびより尖った「ペン」の使用を通して減少すると考えられている。最後に、この研究は、複雑かつより高価なハードリソグラフィー技術（例えば、e-ビームリソグラフィー）を、種々の固体状態ナノリソグラフィー適用に置き換えるための、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングを使用することの潜在能力を実証した。

実施例6：連続および並行DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングのためのマルチペンナノプロッター
本実施例において、カンチレバーのアレイおよび単一のフィードバック系を用いる従来のAFMを使用する、並行または単一のペンのソフトナノリソグラフィーを行うための方法を報告する。

DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングを、実質的に複雑化された機器の必要なしで、連続プロセスから並行プロセスまで転換させることを可能にする、鍵となる科学的観察が存在する。インク（例えば、1-オクタデカンチオール（ODT））から生成された特徴（例えば、ドットおよびライン）は、二桁の強度範囲にわたる異なる接触力の下で、それぞれ直径およびライン幅に関して実質的に同一であることが発見された。驚くべきことに、パターン化実験が小さな負の接触力を用いて実行された場合でさえ（この場合、AFMチップは表面に向かって下に曲がる）、4nNの大きさのチップ−基材接触力で実行された実験と比較し得るインク輸送速度を示す。これらの実験は、DIP PEN（商標）ナノリソグラフライティングにおいて、インク分子はチップからメニスカスを通って基材まで拡散によって移動し得、そしてチップは分子の流れを方向付けていることを示す。

並行DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングを行い得る8個のペンのナノプロッターの開発がこの実施例において記載される。意義深いことには、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングのライン幅および書き込み速度は接触力とは独立しているので、これは、二重の画像化および書き込み能力を有するチップ（「画像化チップ」と命名された）をモニターするための単一チップフィードバックシステムを使用する構成において達成された。並行書き込みモードにおいて、すべての他のチップが受動的様式で画像化チップで起こったことを再現する。8個のペンの並行書き込み、インクおよびすすぎウェル、ならびにナノプロッターによって生成された構造による「分子囲い込み」を実証する実験を報告する。

すべての実験を、熱ドリフトを最小化する閉じたループスキャナーを備えたThermomicroscopes MS AFMで実行した。特注のDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングソフトウェア（上記を参照のこと）を使用して、機器を駆動した。機器は、200mm×200mm試料ホルダーを有し、そして自動化された移動ステージを有する。

DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングを、並行プロセスに転換する際の意図は、連続して、並行または単一の複数インクパターンにおいて、複数の単一インクパターンを生成することを可能にするSPL法を作製することであった。このツールは、並行した書き込み能力を有する複数ペンナノプロッターの、ナノ技術者の等価物である。この目的を達成するために、AFMおよびDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングプロセスのいくつかの修飾が必要であった。

第1に、傾斜ステージ（Newport Corporationから購入）をAFMの移動ステージにマウントした。パターン化される基材は、試料ホルダーに配置され、これは、傾斜ステージにマウントされる。この配置は、インクで被覆されたチップに関して基材の方向を制御することを可能にし、これは、次には、パターン化実験の間に、単一または複数のチップを選択的に係合することを可能にする。

第2に、ナノプロッターにおいて個々にペンを位置決めおよびインク付けすることを可能にするインクウェルを製造した。詳細には、異なるインクまたは溶媒に浸した濾紙の長方形の断片を、インクウェルおよびすすぎウェルとしてそれぞれ使用し得ることが見い出された。この濾紙のインクウェルおよびすすぎウェルを、基材に近接した移動ステージ上に配置した。AFMチップを、単に適切な濾紙インクまたはすすぎウェルと30秒間（接触力＝1nN）接触させることによって、関心対象の分子インクで被覆し得るか、または溶媒ですすぎ得る。

最後に、複数のチップアレイを、250の個々のカンチレバーを含む市販のウェハブロック（Thermomicroscopes Sharpened Microlevers C、力定数＝0.01N/m）からのカンチレバーのアレイを単に物理的に分離することによって、次いで、単一のカンチレバーとしてそのアレイを使用することによって製造した。このアレイを、市販のマウントされたカンチレバーを用いるセラミックチップキャリアに固定し、そしてエポキシ接着剤を用いてAFMチップホルダーにマウントした。

単純化のために、アレイ中の2つのカンチレバーのみを含む実験を最初に記載する。並行の書き込みにおいて1つのチップ（「画像化チップ」と命名された）を、画像化および書き込みの両方のために使用するのに対して、第2のチップは単に書き込みのために使用する。画像化チップは通常のAFMチップが使用される方法で使用され、そしてフィードバックを提供する力センサーと接続される；書き込みチップは、フィードバックシステムを必要としない。パターン化実験において、画像化チップは、全体の表面のトポロジーを決定するため、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって生成された整列マークを位置決めするため、および、整列マークに関して定義された座標を有する領域における分子をリソグラフ的にパターン化するために使用される（実施例4およびHongら、Science, 286: 523（1999））。このストラテジーを用いて、書き込みチップは、カンチレバーアレイにおけるチップの間隔（2つのペンの実験の場合は600μm）によって決定される距離での画像化チップを用いて生成された構造を再現する。

代表的な、カンチレバーアレイを含む複数ペン実験においては、各チップは、それを適切なインクウェルに浸すことによって、インクで被覆された。このことは、移動ステージを被覆されるチップの下の所望のインクウェルの位置まで移動させること、およびチップを、それが濾紙に接触するまで低くすることによって達成した。接触は、30秒間維持し、接触力＝1nNであった。並行パターン化を開始するために、傾斜ステージを、書き込みチップが画像化チップよりも試料に0.4μm近接するように調整した。アレイ実験におけるチップから試料への距離は、Zステッパーモーターカウンターを用いてモニターし得る。レーザーを、パターン化の間、両方のチップが表面と接触するように、画像化チップ上に配置した。

並行書き込みの最初の実証は、同じインク、ODTで被覆した2つのチップを含んだ。この実験において、ODTからなる2つの1分子厚ナノ構造を、四角形の形態の表面に沿って、画像化チップを移動させることによって、金表面にパターン化した（接触力約0.1nN；相対湿度30％；書き込み速度＝0.6μm／秒）。ラインの幅はほぼ同一であり、ナノ構造レジストレーション（第2の四角形に対する第1の四角形の方向）はほぼ完全であることに注意されたい。

並行パターン化は、1つより多いインクを用いて達成され得る。この場合、画像化チップはすすぎウェルに配置されて、ODTインクを除去し、次いで、MBAインク中にこれを十分に浸すことによって、16-メルカプトヘキサデカン酸（MBA）で被覆された。次いで、並行複数インク実験を、実質的に同一の条件下で並行単一インク実験と類似した様式で実行した。2つの得られるナノ構造が、側方向力に基づいて区別され得るが、しかし、再度、2つのチップの硬い、固定された性質に起因して完全に整列される。興味深いことに、2つのパターンのライン幅は同一であった。このことは、おそらく、一致する結果である。なぜなら、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティング実験における特徴サイズおよびライン幅は、しばしば、特定のインクの輸送特性およびインク負荷に依存するからである。

このタイプのナノプロッターの顕著な特徴は、並行書き込み能力を提供することに加えて、異なるインクから作製される特注のナノ構造を生成するための一連の様式でシステムを操作し得るという点である。この能力を実証するために、ODTで被覆したチップおよびMHAで被覆したチップを有するカンチレバーアレイを使用した。レーザーを、ODT被覆したチップに焦点を合わせ、そして傾斜ステージを、このチップのみが表面と接触するように調整した。次いで、ODT被覆したチップを使用して、Au表面上の横断面の垂直方向のスライドを生成した（接触力約0.1nN；相対湿度約30％；書き込み速度＝1.3μm／秒）。次いで、レーザーをMBA被覆したチップまで移動させ、そして傾斜ステージを、このチップのみが表面と接触するように再調整した。次いで、MBAチップを使用して、ナノ構造の30nm幅の水平方向のスライドを描いた（「ナノ」とはラインの幅をいう）。パターン化される領域の周辺に沈着された顕微鏡的なODT整列マークを使用して、上記のように、最初のナノ構造を位置決めした（実施例4およびHongら、Science, 286: 523（1999）もまた参照されたい）。

裸の金の内部を有するこのタイプの複数インクナノ構造は、スタンプの方法論または従来のナノリソグラフィー法によって調製することは非常に困難であるが、複数ペンのナノプロッターを用いて5分以内に調製された。さらに、このツールおよびこのタイプの構造は、現在、ナノメーター長スケールでの分子拡散およびナノメーター幅を横切る分子に基づく障壁を含む、重要な問題の評価を開始するために使用され得る。概念の証明として、このタイプの「分子に基づく囲い込み」中の、チップから表面までのMHAの拡散を試験した。第1のステップとして、横断面の形状は単一のインク、ODTを用いて生成された（接触力約0.1nN；相対湿度約30％；書き込み速度＝0.5μm／秒）。次いで、MHA被覆チップを、MHA分子が表面に輸送されるように、かつ接触点から拡散し得るように、横断面の中心で、10分間、表面と接触して保持した。重要なことには、80nm幅のODTラインが拡散障壁として働いた場合でさえ、MBA分子はODT横断面パターンの内側にトラップされた。分子囲い込みの水平方向のスライドがMHA障壁からなる場合、MHA分子は、チップから表面に、親水性MHA障壁を超えて拡散する。興味深いことに、この2成分のナノ構造において、MBAはMHA障壁を超えて進まず、異方性のパターンを生じる。囲い込みがメニスカスの形状（これは、次にインク拡散を制御する）を変化させるか、あるいはインクが沈着され、次いでこの構造を生成するために接触点から移動するかどうかはまだ知られていないが、このタイプの概念の証明実験により、この新規なナノテクノロジーツールを使用して、重要なインターフェースのプロセスをいかにして発見および研究することを開始し得るかが示される。

本実施例において報告される並行ナノプロッティングストラテジーは、2つのチップには限定されない。実際、8個のチップからなるカンチレバーアレイが、並行様式のナノ構造を生成するために使用され得ることが示された。この場合、8個のチップの各々がODTで被覆された。最も外側のチップは、画像化チップと命名され、フィードバックレーザーが、書き込み実験の間、それに焦点を当てた。この概念を実証するために、4つの別個のナノ構造である、180nmドット（接触力約0.1nN、相対湿度＝26％、接触時間＝1秒間）、40nm幅ライン、四角形、および八角形（接触力約0.1nN、相対湿度＝26％、書き込み速度＝＝0.5μm／秒）を生成し、そして7つの受動的に従うチップを用いて並行様式で再現した。もともとのナノ構造および7つのコピーについてのライン幅の10％未満の標準偏差が存在することに注意されたい。

要約すると、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングは連続プロセスから並行プロセスまで転換され、このような研究を通して、連続および並行の両方の書き込み能力を有する複数ペンのナノプロッターの概念が実証された。ナノ構造を受動的に再現するための並行DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティング実験において使用され得るペンの数は、8までに限定されないことに注意することが重要である。実際、ペンの数は、さらなるフィードバックシステムの必要なしで、何百または何千でさえのペンまで増加できないという理由は存在しない。最後に、この研究は、生物学、化学、物理学、および工学の分野の研究者に、基礎科学および技術的応用の両方について、自動化された、大規模な、中程度に速い、高解像度およびナノ構造の整列パターン化をするために、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングおよび従来のAFM機器を使用することを開始させることを可能にする。

実施例7：コンビナトリアルアレイを調製するためのDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングの使用
この実施例において、全般的な方法は、特異的なタイプの粒子を誘引および結合するインクのドットのアレイからなる基材上に、パターンを形成することである。現在の研究について、MHAは、金基材上でテンプレートを作製するために使用され、そして正に荷電したプロトン化アミン−またはアミジン−修飾したポリスチレン球を、粒子ビルディングブロックとして使用された。

金被覆された基材を実施例5に記載されるように調製した。透明な基材を必要とするインサイチュー画像化実験のために、カバーガラス（Corning No.1 thickness, VWR, Chicago, IL）を、Ar/O-,プラズマで1分間洗浄し、次いで、2nmのTiおよび15nmのAuで被覆した。金基材のパターン化していない領域を、別のアルカンチオール（例えば、ODTまたはシスタミン）の1mMエタノール溶液中に基材を浸すことによって保護した。ODTでの処理の前後で基材の側方力顕微鏡によって証明されるように、最小の交換は、もしあれば、この処理の間に、固定化MHA分子と溶液中のODTまたはシスタミンとの間で行われた。

金基材をMHAでパターン化して、ドットのアレイを形成した。DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングパターン化を、実施例5に記載されるように、周囲研究室条件の下で実行した（30％湿度、23℃）。MHAパターンにおけるカルボン酸基が脱プロトンされて、粒子組み入れのための静電的な駆動力を提供することに注意することが重要である（Vezenovら、J.Am. Chem. Soc. 119: 2006-2015（1997））。

水中の荷電したポリスチレンラテックス粒子の懸濁物を、Bangs Laboratories（0.93μm、Fishers, IN）またはIDC Latex（1.0μmおよび190nm、Portland, OR）のいずれかから購入した。粒子を、Barnstead（Dubuque, IA）NANOpure water systemを用いて精製した蒸留脱イオン水（18.1MΩ）で2回、遠心分離および再分散によって界面活性剤を含まないようにすすいだ。基材上の粒子の組み入れは、分散した粒子の20μlの液滴を（脱イオン水中、10％ w/v）、湿度チャンバー（100％相対湿度）中の水平な基材上に配置することによって達成された。脱イオン水を用いる穏やかなすすぎでこのプロセスを完了した。

光学的顕微鏡法を、Park Scientific CP AFM光学機器（Thermomicroscopes, Sunnyvale, CA）、または、インサイチュー画像化のために、ディファレンシャルな干渉コントラストモード（DIC）において操作した倒立光学顕微鏡（Axiovert 100A, Carl Zeiss, Jena, Germany）を使用して実行した。画像を、Penguin 600 CLデジタルカメラ（Pixera, Los Gatos, CA）を用いて捕捉した。粒子の断続性の接触の画像化を、Thermomicroscopes MS AFMを用いて、シリコンウルトラレバーを使用して（Thermomicroscopes, スプリング定数＝3.2N/m）実行した。側方向力の画像化を、周囲研究室条件下で（30％湿度、23℃）、以前に報告されたように（Weinbergerら、Adv. Mater. 12: 1600-1603（2000））実行した。

0.93μm直径粒子を含む代表的な実験において、光学顕微鏡によって、粒子組み入れについて複数のテンプレートが同時にモニターされた。これらの実験において、テンプレートのドット直径は粒子−テンプレート認識のための最適条件を探索するために変化された。粒子組み入れの1時間後、基材を脱イオン水ですすぎ、周囲研究室条件下で乾燥させ、次いで、光学顕微鏡法によって画像化した。コンビナトリアル実験は、パターンとの高度なレジストリにあるこのタイプの単一の粒子を固定化するテンプレートパッドの最適サイズが、約500〜750nmであったことを示した。基材の乾燥はテンプレート上のそれらの好ましい位置から粒子を置き換える傾向があり、より大規模な実験に伴う効果が他者によって注記されていること（Aizenbergら、Phys. Rev. Lett. 84: 2997-3000（2000））に注意することが重要である。実際、より良好な、実際にほぼ完全な粒子の組織化についての証拠が、1μmのアミン修飾粒子が1時間テンプレートと反応した後の、表面のインサイチュー画像処理によって得られる。

ミクロン長スケールでの単一の粒子の空間的な組織化は、物理的手段、例えば、光学的ピンセットを使用して（Mioら、Langmuir 15: 8565-8568（1999））、またはe-ビームのリソグラフィー的パターン化ポリマーフィルム上への沈降によって（van Blaaderenら、Nature 385: 321-323（1997））、達成された。しかし、本明細書に記載するDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングに基づく方法は、以前の方法を超えた利点を提供する。なぜなら、これは、長さのスケールおよびパターン型の柔軟性、ならびにより強固な粒子アレイ構造を達成するための手段を提供するからである。例えば、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングは、190nm直径のアミジン修飾したポリスチレン粒子の四角形アレイを調製するために使用され得る化学テンプレートを構築するために使用されてきた。非接触AFMおよびSEM画像化を使用する乾燥した粒子アレイのスクリーニングは、300nmのMHAのテンプレートドット、570nm離れた間隔、取り囲む反発的なシスタミンの単層がアレイ中の各々の部位で単一の粒子を固定化するために適切であることを示した。しかし、700nmおよび850nmの直径および間隔のMHAドットは、いくつかの部位で複数の粒子の固定化を生じた。

同様の粒子組み入れ実験をpH＜5または＞9で実行し、表面の酸の基のプロトン化または粒子のアミン基もしくはアミド基の脱プロトン化におそらく起因して、ランダムな、非選択的な粒子吸着を生じた。これらの実験は、粒子組み入れプロセスが、荷電した粒子と基材のパターン化合物との間の静電的な相互作用によって誘導されることを強く示唆した。

結論として、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングは、二次元アレイにおいて単一の粒子を位置決めするためのコンビナトリアルな化学テンプレートを生成するためのツールとして使用され得ることを実証した。この実施例において記載した荷電したアルカンチオールおよびラテックス粒子の特定の例は、単一もしくは複数の粒子サイズおよび組成からなり得るあらかじめ決定した結晶構造における引き続く粒子層を位置決めするための二次元テンプレートを作製するための一般的なアプローチを提供する。より一般的な意味において、コンビナトリアルDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティング法は、研究者に、パターン化基材を効率的かつ迅速に形成することを可能にする。このパターン化基材は、粒子−粒子および粒子−基材の相互作用を研究するため、粒子が、特定の光子性バンドギャップ物質、金属、潜在的な触媒的もしくは電子工学的特性を有する半導体粒子、または生きている生物学的細胞および生体高分子さえを含む、誘電性球であるか否かを研究するためのものである。

実施例8：DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって生成される、ナノ範囲のリゾチームおよび免疫グロブリンのペプチドおよびタンパク質ナノアレイ
この実施例において、高解像度パターン化方法であるDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングが、いかにして100nm特徴を有するタンパク質のナノアレイを構築するために使用され得るかを記載する。さらに、これらのアレイが、アレイの保護された部分へのタンパク質の検出可能な非特異的な結合をほぼ伴うことなく製造され得ること、ならびに、タンパク質の特徴および溶液中の抗原を含む反応がAFMによってスクリーニングされ得ることを実証する。

代表的なタンパク質アレイは、16-メルカプトヘキサデカン酸（MHA）を、金の薄いフィルム基材上で、ドットまたはグリッドの形態で最初にパターン化することによって製造した。これまで研究された特徴は、ラインおよびドットの両方で、350nm程度の大きさ（それぞれ、ライン幅およびドット直径）および100nm程度の小ささ、図2であった。これらの特徴を取り囲む領域を、パターン化した領域上に界面活性剤の10mMエタノール溶液の液滴を45分間配置し、続いて、エタノール、次いでナノ純度水で大量にすすぐことによって、11-メルカプトウンデシル−トリ（エチレングリコール）で保護した。リゾチームまたはウサギ免疫グロブリンGタンパク質を、あらかじめ形成したMHAパターン上に組み入れた（図1）。これは、所望のタンパク質（10μg/mL）を含有する溶液中にMHA特徴のアレイを有する金基材を1時間浸すことによって達成した。関心対象のタンパク質とのインキュベーションの後、基材を取り除き、そして10mM Tris緩衝液（トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、Tween-20溶液（0.05％）、次いでナノ純度水ですすいだ。

すべてのDIP PENナノリソグラフ（商標）プリンティングパターン化および接触モード画像化実験を、特注のソフトウェアでインターフェースを接するThermomicroscopes CP AFMおよび従来のSi₃N₄カンチレバー（Thermo Microscopes sharpened Microlever A、力定数0.05N/m）を用いて行った。タッピングモード画像を、Nanoscope IIIaおよびDigital InstrumentsからのMultiMode顕微鏡を用いて取得した。他に言及しない場合には、すべてのDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングパターン化実験を、40％相対湿度および24℃の周囲条件下で、0.5nNのチップ−基材接触力で実行した。圧電管ドリフトおよび整列の問題を最小化するために、すべてのDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティング実験について、閉じたループスキャン制御を備える100μmスキャナーを使用した。

リゾチームは、接触およびタッピングモードのAFMによって証明されるように、MHAナノパターンアレイ上できれいに組み入れられることが示された（それぞれ、図2B〜D）。アレイ上に非特異的なタンパク質の吸着の証拠がほぼないこと、高さプロフィールが各MHA部位での吸着の1つおよび2つの層の間でのタンパク質を示唆することに注意されたい。リゾチームは楕円型の形状を有するので（4.5×3.0×3.0nm³）（Blakeら、Nature 206, 757, 1965を参照されたい）、これは、基材表面上で2つの有意に異なる配置をとり得る（その長軸上に横たわるか、または直立する）。これは高さの違いに基づいて区別され得る（図2C（挿入図））。実際、4.5nmまたは3.0nmの高さのいずれかを有する特徴によって証明されるように、両方の方向がAFM実験の高さプロフィールにおいて観察される。最後に、タンパク質は、ほぼ任意の種類のアレイ配置（ラインおよびグリッドを含む、図2D）において組み入れられ得る。

免疫グロブリンGは、実質的に異なる次元を有し（Y-形状、高さ＝14.5nm、幅＝8.5nm、厚さ＝4.0nm³）（Silvertonら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5140, 1977を参照されたい）、定量的に同様の吸着特性、図3を示す。モノマー性IgGの基本構造は、2つの同一の半分からなる；各半分は、重鎖および軽鎖を有する。IgGナノアレイの高さプロフィールは、各IgG特徴が8.0±0.7nm（n=10）の高さを示し、これは、MHA特徴に吸着されたタンパク質の単層と一致し、かつ他が巨視的特徴について観察したことと比較し得る（Browning-Kelleyら、Langmuir 13, 343, 1997；Waud-Mesthrigeら、Langmuir 15, 8580, 1999；Waud-Mesthrigeら、Biophys. J. 80 1891, 2001；Kensethら、Langmuir 17, 4105, 2001を参照されたい）。このことは十分に理解されてはいないが、この高さはまた、互いのトップに平らに横たわるタンパク質の2つの層と一致し得るが、このことはアレイの反応性に基づくものではないようである。

タンパク質アレイを作製するためのすべてのストラテジーに関する関心は、タンパク質吸着後の構造の活性である（Bernardら、Langmuir 14, 2225, 1998）。DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって作製されたIgGナノパターンの生物活性を試験するために、IgGの抗IgGとの反応性を評価した。図3Cを参照されたい。意義深いことには、抗IgGのみがIgGに結合し、16±0.9nm（n=10）までの高さの増加を生じた。リゾチームアレイを抗IgGで処理した対照実験において、AFM高さプロフィールによって証明されるように、反応は検出されなかった。

図4および図5は、リゾチームナノアレイおよびIgGナノアレイをそれぞれさらに例証する。

本発明は、以下を含むタンパク質ナノアレイ（「アレイ1」）を意図する：a）基材、b）基材上の複数のドット、このドットは基材上の少なくとも1つのパターン化合物を含む、およびc）パターン化合物上の少なくとも1つのタンパク質。1つの実施態様において、パターン化合物は、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって基材上に配置される。別の実施態様において、複数のドットは、ドットの格子である。なお別の実施態様において、複数のドットは少なくとも10ドットを含む。別の実施態様において、複数のドットは少なくとも100ドットを含む。

なお別の実施態様において、基材は絶縁体である。別の実施態様において、基材はガラスである。別の実施態様において、基材は金属、半導体、磁気材料、ポリマー材料、ポリマー被覆基材、または超伝導体材料である。なお別の実施態様において、基材は金属である。

1つの他の実施態様において、パターン化合物は、基材に化学吸着されるか、または共有結合される。1つの実施態様において、パターン化合物は、硫黄含有パターン化合物である。別の実施態様において、パターン化合物は、一方の末端に硫黄基、および他方の末端に末端の反応性基を有する硫黄含有化合物である。

なお別の実施態様において、タンパク質は球状タンパク質である。別の実施態様においてタンパク質は線維状タンパク質である。別の実施態様においてタンパク質は酵素である。別の実施態様において、タンパク質は抗体である。別の実施態様において、タンパク質はリゾチームである。別の実施態様においてタンパク質は免疫グロブリンである。

好ましい実施態様において、ドットは約300nm以下の直径を有する。なお別の好ましい実施態様において、ドットは約100nm以下の直径を有する。

なお別の実施態様において、パターン化合物は、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって基材上に配置される。ここで、タンパク質は吸着によってパターン化合物上に配置され、基材は金属または絶縁体であり、タンパク質は球状タンパク質または線維状タンパク質であり、そしてドットは約1,000nm以下の直径を有する。なお別の実施態様において、基材は金属またはガラスであり、タンパク質は酵素または抗体であり、そしてドットは約500nm以下の直径を有する。なお別の実施態様において、基材は金属であり、パターン化合物は硫黄化合物であり、タンパク質は酵素または抗体であり、そしてドットは約300nm以下の直径を有する。

さらなる実施態様において、複数のドットが格子を形成し、ここで基材は金であり、パターン化合物はアルカンチオール化合物であり、タンパク質は酵素または抗体であり、ドットは約100nm以下の直径を有し、そして基材は、ドットを取り囲む基材上のタンパク質保護化合物を含む。

本発明の別の局面は、以下を含むタンパク質ナノアレイ（「アレイ2」）を意図する：a）基材、b）基材上の複数のライン、このラインは基材上の少なくとも1つのパターン化合物およびパターン化合物上の少なくとも1つのタンパク質を含む。1つの実施態様において、パターン化合物は、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって基材上に配置される。別の実施態様において、複数のラインは垂直線または平行線のグリッドである。なお別の実施態様において、複数のラインは少なくとも10ラインを含む。別の実施態様において、複数のラインは少なくとも100ラインを含む。なお別の実施態様において、アレイ2の基材は絶縁体である。別の実施態様において、基材はガラスまたは金属である。なお別の実施態様において、パターン化合物は、基材に化学吸着されるか、または共有結合される。別の実施態様において、パターン化合物は、硫黄化合物である。なお別の実施態様において、パターン化合物は、一方の末端にチオール基、および他方の末端に末端の反応性基を有する硫黄化合物である。

なお別の実施態様において、タンパク質は球状タンパク質である。別の実施態様においてタンパク質は線維状タンパク質である。別の実施態様において、タンパク質は酵素である。別の実施態様において、タンパク質は抗体である。別の実施態様において、タンパク質はリゾチームである。別の実施態様においてタンパク質は免疫グロブリンである。

好ましい実施態様において、ラインは約300nm以下の幅を有する。別の好ましい実施態様において、ラインは約100nm以下の幅を有する。

別の実施態様において、パターン化合物は、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって基材上に沈着される。ここで、タンパク質はパターン化合物に吸着され、基材は絶縁体または金属であり、タンパク質は球状タンパク質または線維状タンパク質であり、そしてラインは約1,000nm以下の幅を有する。

なお別の実施態様において、パターン化合物は、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって基材上に沈着される。ここで、タンパク質はパターン化合物に吸着され、基材は絶縁体または金属であり、タンパク質は球状タンパク質または線維状タンパク質であり、パターン化合物は硫黄化合物であり、そしてラインは約500nm以下の幅を有する。

なお1つの他の実施態様において、基材は金属または絶縁体であり、タンパク質は球状タンパク質または線維状タンパク質であり、パターン化合物は硫黄化合物であり、ラインは約500nm以下の幅を有し、そして基材はライン間の基材上にタンパク質保護化合物を含む。

なお別の実施態様において、基材は金属であり、タンパク質は酵素または抗体であり、そしてラインは約500nm以下の幅を有する。

さらなる実施態様において、基材は金であり、ラインは基材上にチオール化合物を含み、タンパク質は酵素または抗体であり、そしてラインは約300nm以下の幅を有する。

別の実施態様において、基材は絶縁体または金属であり、パターン化合物は、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって基材上に沈着され、続いて基材の保護が行われ、タンパク質は酵素または抗体であり、そしてラインは約100nm以下の幅を有する。

本発明の別の局面は、以下を含むタンパク質ナノアレイ（「アレイ3」）を意図する：a）基材、b）基材上の複数のパターン、このパターンは基材上の少なくとも1つのパターン化合物およびパターンの各々に吸着した少なくとも1つのタンパク質を含む。1つの実施態様において、パターンは、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって形成される。別の実施態様において、パターンは、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって基材上で形成され、続いて、基材の保護、続いてパターン化合物へのタンパク質の吸着が行われる。なお別の実施態様において、パターンは、基材に化学吸着されるか、または共有結合される少なくとも1つのパターン化合物を含む。好ましい実施態様において、パターンは約500nm以下の直径を有するドットである。なお別の好ましい実施態様において、パターンは約300nm以下の直径を有するドットである。なお1つの他の好ましい実施態様において、パターンは約100nm以下の直径を有するドットである。他の好ましい実施態様において、パターンは約500nm以下の幅を有するラインである。なお別の実施態様において、パターンは約300nm以下の幅を有するラインである。好ましい実施態様において、パターンは約100nm以下の幅を有するラインである。

本発明はまた、以下を含むペプチドナノアレイ（「アレイ4」）を意図する：a）基材、b）基材上の複数のドット、このドットは基材上の少なくとも1つの化合物およびドットの各々に吸着した少なくとも1つのペプチドを含む。1つの実施態様において、複数のドットは、ドットの格子である。別の実施態様において、ペプチドはオリゴペプチドである。なお別の実施態様において、ペプチドはポリペプチドである。さらなる実施態様において、ペプチドは少なくとも3つのペプチド結合を含む化合物である。代替的な実施態様において、ペプチドは10個以下のペプチド結合を含む化合物である。なお別の実施態様において、ペプチドは少なくとも100、300、または500のペプチド結合を含む化合物である。

別の実施態様において、アレイ4の化合物は、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって基材上に配置され、化合物は化学吸着されるかまたは共有結合される。

本発明の別の局面は、以下を含むペプチドナノアレイ（「アレイ5」）である：a）基材、b）基材上の複数のライン、このラインは基材上の少なくとも1つの化合物および化合物上の少なくとも1つのペプチドを含む。別の実施態様において、ペプチドはオリゴペプチドまたはポリペプチドである。さらなる実施態様において、ペプチドは少なくとも3つのペプチド結合を含む化合物である。代替的な実施態様において、ペプチドは10個以下のペプチド結合を含む化合物である。なお別の実施態様において、ペプチドは少なくとも100、300、または500のペプチド結合を含む化合物である。
別の実施態様において、アレイ5の化合物は、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって基材上に配置され、化合物は化学吸着されるかまたは共有結合される。

本発明によって想定されるなお別の局面は、以下を含むペプチドナノアレイ（「アレイ6」）である：基材、基材上の少なくとも1つのパターン、このパターンは、基材に化学吸着されるかまたは共有結合されたパターン化合物を含み、このパターンはパターン化合物上に吸着したペプチドを含む。好ましい実施態様において、パターンはドットまたはラインである。別の実施態様において、ナノアレイは、基材上の少なくとも2つのパターンを含む。なお別の実施態様において、パターンはドットまたはラインであって、ドットは500nm以下の直径を有し、ラインは500nm以下の幅を有する。さらなる実施態様において、パターン化合物は硫黄化合物である。1つの他の実施態様において、パターン化合物はDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって基材上に沈着される。1つの他の実施態様において、ペプチドは少なくとも100ペプチド結合を有する。別の実施態様において、ペプチドは200よりも少ない、300よりも少ない、400よりも少ない、500よりも少ない、ペプチド結合を有する。別の実施態様において、ペプチドはタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドであり、パターンはドットまたはラインの形態である。なお別の実施態様において、ペプチドは、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドであり、パターンは、ドットまたはラインの形態であり、そしてナノアレイは、アレイまたはグリッド中に少なくとも10パターンを含む。

本発明はまた、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって表面に化合物をパターン化して、パターンを形成する工程；およびパターンに少なくとも1つのペプチドを組み入れる工程を包含する、ナノアレイを作成するための方法を提供する。1つの実施態様において、ペプチドは、タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドである。別の実施態様において、表面上でのパターン化後の化合物はタンパク質を吸着し得る。なお別の実施態様において、表面上でのパターン化後の化合物は、タンパク質と、共有結合、イオン結合、水素結合、または静電的相互作用を形成し得る。別の実施態様において、パターン化後の化合物はタンパク質に結合する末端の官能基を有する。なお別の実施態様において、化合物は、硫黄含有化合物、ケイ素含有化合物、カルボン酸含有化合物、アルデヒド含有化合物、アルコール化合物、アルコキシ含有化合物、ビニル含有化合物、アミン化合物、ニトリル化合物、およびイソニトリル化合物からなる群より選択される。好ましい実施態様において、化合物は硫黄含有化合物である。1つの他の実施態様において、タンパク質は球状タンパク質、線維状タンパク質、水溶性タンパク質、水不溶性タンパク質、酵素、または抗体である。別の実施態様において、パターン化が実行されて複数のパターンを形成し、このパターンは複数のラインまたは複数のドットである。好ましい実施態様において、パターンは1つのラインまたは1つのドットである。なお別の実施態様において、ラインは約1,000nm未満の幅を有し、そしてドットは約1,000nm未満の直径を有する。なお別の実施態様において、ラインは約350nm未満の幅を有し、そしてドットは約350nm未満の直径を有する。さらなる実施態様において、ラインは約100nm未満の幅を有し、そしてドットは約100nm未満の直径を有する。

本発明の方法は、上記の化合物がパターン化されていない表面の領域を保護する工程をさらに包含する。1つの実施態様において、組み入れ工程は、ペプチドの溶液中にパターン化された表面を浸す工程を包含する。

本発明の1つの実施態様において、化合物は硫黄含有化合物であり、ペプチドは球状タンパク質または線維状タンパク質であり、そしてパターンはドットまたはラインである。なお別の実施態様において、化合物は硫黄含有化合物であり、ペプチドはタンパク質であり、パターンはドットまたはラインであり、そして上記表面はパターン化後に保護される。さらなる実施態様は、化合物は硫黄含有化合物であり、タンパク質は球状タンパク質または線維状タンパク質であり、パターン化は複数回実行され、複数のドットまたはラインを形成し、上記表面はパターン化後に保護され、そして各ドットの直径は約1,000nm未満であり、各ラインの幅は約1,000nm未満である、方法を想定する。別の実施態様において、直径および幅は、約500nm未満または約100nm未満である。別の実施態様において、ペプチドはポリペプチドであり、パターンはドットまたはラインである。

なお別の実施態様において、ペプチドはポリペプチドであり、パターンは500nm以下の直径を有するドット、または500nm以下の幅を有するラインである。別の実施態様において、ペプチドはポリペプチドであり、パターンは500nm以下の直径を有するドット、または100nm以下の幅を有するラインである。

本発明のなお1つの他の局面は、被覆された原子間力顕微鏡チップを使用して表面状の化合物をパターン化してナノスケールパターンを形成する工程、および1つまたはそれ以上のペプチドをパターンに吸着させる工程を包含する方法である。1つの実施態様において、ペプチドはタンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドである。なお別の実施態様において、パターン化は複数のドットまたはラインを形成するために実行される。1つの他の実施態様において、化合物は硫黄化合物である。別の実施態様において、化合物は硫黄化合物であり、タンパク質は球状タンパク質または線維状タンパク質であり、そしてパターン化は複数のドットまたはラインを形成するために実行される。なお別の実施態様において、ドットは300nm以下の直径、およびラインは300nm以下の幅を有する。この方法において、パターン化は、少なくとも10である、複数のドットまたはラインを作製するために実行される。この方法はさらに、パターン化後に表面を保護する工程を含む。この方法によって産生されるパターンもまた意図される。本発明のなお別の局面は、ナノ範囲の特徴を有するタンパク質アレイを作製する方法を意図する。この方法は、あらかじめ形成されたパターンに1つまたはそれ以上のタンパク質を組み入れる工程を包含し、ここで、タンパク質はパターンに吸着され、そしてパターンは、DIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって形成される。

なお1つの他の局面は、あらかじめ形成されたパターンに1つまたはそれ以上のペプチドを組み入れる工程を包含する、ナノ範囲の特徴を有するペプチドアレイを作製するための方法を想定し、ここで、ペプチドはパターンに吸着され、パターンはDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングによって形成される。

さらなる局面は、タンパク質のナノスケールアレイを作製するための方法を想定し、この方法は、ディップペンナノリソグラフプリンティングによって表面にパターン化化合物を沈着させる工程；保護化合物を用いて、表面の沈着されていない領域を保護する工程；パターン化合物を有する該表面およびパターン化合物を、少なくとも1つのタンパク質を含む溶液にさらす工程；および、該タンパク質の溶液から該表面を取り除く工程を包含し、ここで、該表面はタンパク質のナノスケールアレイを含む。

さらに、試料中の標的の存在を検出するための方法が提供される。この方法は、表面上のタンパク質のナノスケールの沈着の次元を測定する工程；該表面を該試料にさらす工程；次いで、該タンパク質のいずれかの任意の次元の変化を検出する工程、を包含する。本発明の1つの他の局面は、本明細書中に記載した方法のいずれかによって調製された組成物、パターン、アレイ、およびナノアレイを意図する。

特許請求される本発明は、上述の開示および実用的実施例に限定されるものではない。

引き続く保護のために使用される構造を生成するためのDIP PEN（商標）ナノリソグラフプリンティングの使用、ならびに、ペプチドおよびタンパク質ナノアレイを作製するためのペプチドおよびタンパク質吸着工程の図解を示す。 リゾチームナノアレイのAFM画像および高さプロフィールを示す。（A）Au基材上に沈着されたMHAドットの8μm×8μm平方格子の側方向力の画像。このアレイは、42％の相対湿度で裸のチップを用いて画像化した（スキャン速度＝4Hz）。（B）トポグラフィー画像（接触モード）およびリゾチーム吸着後のナノアレイの高さプロフィール。0.2nNのチップ−基材接触力を使用して、チップでタンパク質パターンを損傷することを避けた。（C）六角形リゾチームナノアレイのタッピングモード画像（シリコンカンチレバー、スプリング定数＝約40N/m）および高さプロフィール。画像は、高解像度を得るために0.5Hzスキャン速度で取り込んだ。（D）リゾチームナノアレイの三次元トポグラフィー画像（意図的に変化させた特徴の次元を有するライングリッドおよびドットからなる）。画像化は（B）に記載されるような接触モードでなされた。 （A）生成されたMHAドットアレイ上に組み入れられたIgGのAFMタッピングモード画像および高さプロフィール。スキャン速度は0.5Hzであった。（B）（A）において示された同じ領域の三次元トポグラフィー画像。（C）（A）および（B）において示されたIgGナノアレイ上に生物特異的に結合された抗IgGのAFMタッピングモード画像および高さプロフィール。高さプロフィールは反応後の高さが16±0.9nm（n=10）であることを示す。書き込みおよび画像化条件は（A）と同じであった。（D）（C）において示された領域の三次元トポグラフィー画像。 六角形リゾチームナノアレイのタッピングモード画像および高さプロフィールを示す。 （A）IgGナノアレイのトポグラフィー画像（接触モード）、（B）32（A）において示された同じ領域の三次元トポグラフィー画像を示す。

Claims (11)

1. a）未パターンのナノアレイ基材、
   b）基材上の少なくとも1つのパターン化合物、およびパターン化合物上の少なくとも1つのタンパク質を含む、前記未パターンの基材上の複数のドット、
   を含むタンパク質ナノアレイであって（ただし、前記パターン化合物が金属である場合を除く）、
   前記パターン化合物は前記未パターンのナノアレイ基材に化学吸着したか、または共有結合しており、
   前記基材は、ドットを取り囲む基材上のタンパク質保護化合物を含み、該タンパク質保護化合物は11-メルカプトウンデシル-トリ（エチレングリコール）であり、
   前記パターン化合物は、ディップペン（商標）ナノリソグラフプリンティングによって基材上に配置されたものであり、
   前記ドットは直径が１ｎｍ〜３００ｎｍであり、
   前記ナノアレイは、生物活性を有し、実質的に非特異的吸着がない、
   タンパク質ナノアレイ。
2. 複数のドットが格子のドットである、請求項1記載のタンパク質ナノアレイ。
3. a）未パターンのナノアレイ基材、
   b）基材上の少なくとも1つのパターン化合物、および各パターンに吸着した少なくとも1つのタンパク質を含む、前記未パターンの基材上の複数のパターン、
   を含むタンパク質ナノアレイであって（ただし、前記パターン化合物が金属である場合を除く）、
   前記パターン化合物は前記未パターンのナノアレイ基材に化学吸着したか、または共有結合しており、
   前記基材は、パターンを取り囲む基材上のタンパク質保護化合物を含み、該タンパク質保護化合物は11-メルカプトウンデシル-トリ（エチレングリコール）であり、
   前記パターンは、ディップペン（商標）ナノリソグラフプリンティングによって形成されたものであり、
   前記パターンは、奥行きを除いて、１ｎｍ〜３００ｎｍである少なくとも一つの次元を有し、
   前記ナノアレイは、生物活性を有し、実質的に非特異的吸着がない、
   タンパク質ナノアレイ。
4. 複数のパターンが、垂直線または平行線のグリッドである、請求項３記載のタンパク質ナノアレイ。
5. 未パターンの基材、
   基材に共有結合されたか、または化学吸着されたパターン化合物を含み、パターン化合物に吸着されたペプチドを含む、前記未パターンの基材上の少なくとも1つのパターン、
   を含むペプチドナノアレイであって（ただし、前記パターン化合物が金属である場合を除く）、
   前記基材は、パターンを取り囲む基材上のタンパク質保護化合物を含み、該タンパク質保護化合物は11-メルカプトウンデシル-トリ（エチレングリコール）であり、
   前記パターンは、ディップペン（商標）ナノリソグラフプリンティングによって形成されたものであり、
   前記パターンは、奥行きを除いて、１ｎｍ〜３００ｎｍである少なくとも一つの次元を有し、
   前記ナノアレイは、生物活性を有し、実質的に非特異的吸着がない、
   ペプチドナノアレイ。
6. 未パターンの基材、
   基材に共有結合されたか、または化学吸着されたパターン化合物を含み、パターン化合物に吸着された粒子状の生体高分子を含む、前記未パターンの基材上の少なくとも1つのパターン、
   を含むナノアレイであって（ただし、前記パターン化合物が金属である場合を除く）、
   前記基材は、パターンを取り囲む基材上のタンパク質保護化合物を含み、該タンパク質保護化合物は11-メルカプトウンデシル-トリ（エチレングリコール）であり、
   前記パターンは、ディップペン（商標）ナノリソグラフプリンティングによって形成されたものであり、
   前記パターンは、奥行きを除いて、１ｎｍ〜３００ｎｍである少なくとも一つの次元を有し、
   前記ナノアレイは、生物活性を有し、実質的に非特異的吸着がない、
   ナノアレイ。
7. 粒子状の生体高分子がペプチドである、請求項６記載のナノアレイ。
8. 以下の工程を含む、タンパク質のナノスケールアレイを作製するための方法：
   パターン化合物を、ナノアレイ表面上にディップペン（商標）ナノリソグラフプリンティングによって沈着させる工程であって（ただし、該パターン化合物が金属である場合を除く）、前記パターン化合物は基材に化学吸着したか、または共有結合している、工程、
   表面の沈着されていない領域を保護化合物で保護する工程であって、該保護化合物は11-メルカプトウンデシル-トリ（エチレングリコール）であり、工程、
   パターン化合物を有する該表面およびパターン化合物を、少なくとも1つのタンパク質を含む溶液にさらす工程、
   該タンパク質の溶液から該表面を取り除く工程であって、ここで該表面は、生物活性を有し実質的に非特異的吸着がないタンパク質のナノスケールアレイを含む、工程。
9. 以下の工程を含む、試料中の標的の存在または非存在を検出するための方法：
   請求項５に記載のナノアレイ基材表面を試料にさらす工程であって、基材表面が、該基材表面に化学吸着したかまたは共有結合した、1つまたはそれ以上の化合物（ただし、該化合物が金属である場合を除く）上に組み入れられた複数の1つまたはそれ以上のペプチドを含む、工程、
   特性の変化が該さらす工程に際して生じるか否かを観察し、このことが試料中の標的の存在または非存在を示す工程。
10. 以下の工程を含む、試料中の標的の存在または非存在を検出するための方法：
    請求項５に記載のナノアレイ基材表面を、（i）標的を含んでもよいし、含まなくてもよい試料、および（ii）標的と相互作用し得る分子、にさらす工程であって、ここで、基材表面は、該基材表面に化学吸着したかまたは共有結合した、1つまたはそれ以上の化合物（ただし、該化合物が金属である場合を除く）上に組み入れられた1つまたはそれ以上のペプチドを含み、かつペプチドが標的に結合し得る、工程、
    分子の標的との相互作用に基づいて試料中の標的の存在または非存在を検出する工程であって、標的がペプチドに結合される、工程。
11. 以下の工程を含む、試料中の標的の存在または非存在を検出するための方法：
    請求項５に記載のナノアレイの表面上のペプチドの1つまたはそれ以上のナノスケール沈着の少なくとも1つの次元を測定する工程；
    該表面を該試料にさらす工程；および
    1つまたはそれ以上の、ペプチドのナノスケール沈着の次元において変化が生じるか否かを検出し、そのことが標的の存在または非存在を示す工程。

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