CN111647691A - 同时检测4种a组柯萨奇病毒亚型的核酸组合物及其试剂盒和检测方法 - Google Patents

同时检测4种a组柯萨奇病毒亚型的核酸组合物及其试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了同时检测4种A组柯萨奇病毒亚型的核酸组合物及其试剂盒和检测方法，属于体外分子检测领域。所述核酸组合物包括以下序列：CA2F:SEQ ID No：1；CA2R:SEQ ID No：2；CA2P:SEQ ID No：3；CA4F:SEQ ID No：4；CA4R:SEQ ID No：5；CA4P:SEQ ID No：6；CA5F:SEQ ID No：7；CA5R:SEQ ID No：8；CA5P:SEQ ID No：9；CA8F:SEQ ID No：10；CA8R:SEQ ID No：11；CA8P:SEQ ID No：12。本发明能够快速准确的对柯萨奇病毒四种亚型进行筛查，特异性好。

Description

同时检测4种A组柯萨奇病毒亚型的核酸组合物及其试剂盒和 检测方法
技术领域
本发明涉及体外分子检测技术领域，特别涉及一种同时检测4种A组柯萨奇病毒亚型的核酸组合物及其试剂盒和检测方法。
背景技术
柯萨奇病毒(coxsachie virus)是一种肠病毒，分为A和B两型，其中A型包含24种亚型，B型包含5种不同亚型。柯萨奇病毒A型感染表现为上呼吸道感染起病急，流涕、咳嗽、咽痛、发热，全身不适；柯萨奇病毒B型感染引起特征性传染性胸肋痛，可合并脑膜脑炎、心肌炎、发热、肝炎、溶血性贫血和肺炎。
目前对于体外病毒RNA的核酸检测方法主要包括一步法RT-PCR法，荧光染料RT-PCR法和荧光探针RT-PCR法。其中一步法RT-PCR法由于需要进行开盖电泳，容易导致实验室污染，不宜大范围使用；而荧光染料RT-PCR法由于其荧光显色原理导致其易出现假阳性结果，因此也不适合临床检测。荧光探针RT-PCR法由于其特异性高、灵敏度高等优势，目前是国内外应用最为广泛的技术方法之一。该方法的原理主要基于标记不同颜色Taq-Man荧光探针，结合相关荧光检测系统仪器，达到检测的目的。
现有的检测柯萨奇病毒相关的试剂盒大多采用单重或双重荧光探针方法实现对柯萨奇不同亚型的快速诊断，但是由于柯萨奇病毒亚型多，无法达到快速对柯萨奇病毒众多亚型进行分型检测的目的。另外，现有的柯萨奇病毒检测试剂盒大多针对CA16或CA10，很少有针对A2、A4、A5或A8型的柯萨奇病毒，给A2、A4、A5或A8型柯萨奇病毒的检测带来困难。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种同时检测4种A组柯萨奇病毒亚型的核酸组合物及其试剂盒和检测方法，本发明能够在一管反应中同时检测A2 型，A4型，A5型和A8型的靶基因，通量高，检测速度快。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种同时检测4种A组柯萨奇病毒亚型的核酸组合物，包括以下引物和探针序列：
CA2上游引物 ACAAGGATTCTTACGCAGCTTCGGCAG SEQ ID No：1
CA2下游引物 GCAGAGCGTCCAATACAG SEQ ID No：2
CA2探针 ACAAGGATTCTTACGCAGCTTCGGCAG SEQ ID No：3
CA4上游引物 AGTCCACCACCACAAGTG SEQ ID No：4
CA4下游引物 GACACTGCCCGTAGGATAG SEQ ID No：5
CA4探针 ATGTCACCAGCCAGTGCCTATCAGTGG SEQ ID No：6
CA5上游引物 GTGAGCAACAGAGCGATTG SEQ ID No：7
CA5下游引物 GTGGAGTTACCGACAGTGA SEQ ID No：8
CA5探针 ATCGCTGTATCCACATGCTTCCGCTGA SEQ ID No：9
CA8上游引物 GACAGAGTGGCACAACTAAC SEQ ID No：10
CA8下游引物 GCAGTGGCATCCTTATCG SEQ ID No：11
CA8探针 TCGACAATCACAACACAAGAAGCTGCC SEQ ID No：12
通过采用上述技术方案，本发明有效的解决了现有的单重荧光核酸检测试剂盒，检测靶标少，无法实现多靶标检测的问题。本发明设计了不同荧光标记Taq-Man探针，并筛选出最佳引物探针组合，防止不同引物探针组合因为相互抑制、竞争等原因而出现交叉扩增，导致特异性低，灵敏度低等问题。本发明的核酸组合物能够实现快速准确的对样本中柯萨奇病毒A2型、A4型、A5型和A8型的快速筛查。
本发明的目的二在于：提供一种同时检测4种A组柯萨奇病毒亚型的试剂盒，包括上述核酸组合物、dNTP、RT-PCR buffer、酶液和ddH2O。
通过采用上述技术方案，可以快速且方便的同时检测柯萨奇病毒A组中的4种亚型（A2型、A4型、A5型、A8型），且实验结果准确、特异性好，重复性好，操作简便。
本发明进一步设置为，所述RT-PCR buffer为10×RT-PCR buffer，包含400mMtris-base、0.5% TritonX-100、80mM MgCl2和5%甘油。
通过采用上述技术方案，RT-PCR buffer能够在PCR反应体系中起到缓冲作用，能够为酶液提供一个最适酶催化反应的条件。
本发明进一步设置为，所述酶液包含逆转录酶M-MLV、热启动化学修饰Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和Taq酶稀释液。
通过采用上述技术方案，逆转录酶M-MLV为点突变去除了RNase H的活性中心的逆转录酶，使RNase H的活性降低，减少了逆转录反应中RNA的降解，使cDNA第一链的得率增加，更容易获得全长cDNA。热启动化学修饰Taq DNA聚合酶可以抑制或将 PCR 反应中的非特异性 DNA 扩增最小化，而且激活时间更短，活性时间更长，短时间内就可以恢复 5’-3’聚合酶活性和 5’ 外切酶活性。RNA酶抑制剂能够抑制作为模板的RNA的降解，提高cDNA第一链的得率。
本发明进一步设置为，所述逆转录酶M-MLV、热启动化学修饰Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和Taq酶稀释液混合的体积比为1：3：2：4。
本发明的目的三在于：提供一种同时检测4种A组柯萨奇病毒亚型的方法，采用荧光探针RT-PCR法，荧光定量PCR扩增反应体系为：
2.5mM/mL dNTP 1-2μL；
10×RT-PCR buffer 2.5μL；
50pmol/μL权利要求1 CA2上游引物 0.1-0.2μL；
50pmol/μL权利要求1 CA2下游引物 0.1-0.2μL；
50pmol/μL权利要求1 CA4上游引物 0.1-0.2μL；
50pmol/μL权利要求1 CA4下游引物 0.1-0.2μL；
50pmol/μL权利要求1 CA5上游引物 0.1-0.2μL；
50pmol/μL权利要求1 CA5下游引物 0.1-0.2μL；
50pmol/μL权利要求1 CA8上游引物 0.1-0.2μL；
50pmol/μL权利要求1 CA8下游引物 0.1-0.2μL；
50pmol/μL权利要求1 CA2探针 0.03-0.08μL；
50pmol/μL权利要求1 CA4探针 0.1-0.15μL；
50pmol/μL权利要求1 CA5探针 0.05-0.1μL；
50pmol/μL权利要求1 CA8探针 0.1-0.15μL；
酶液 1-2μL；
核酸模板 0.5~5μL；
ddH2O 补至25μL。
通过采用上述技术方案，本发明构建了多重荧光PCR反应体系，并优化了体系中每一个成分的加入量，保证了检测结果的准确性和重复性。
本发明进一步设置为，荧光定量PCR扩增反应体系为：
2.5mM/mL dNTP 2μL；
10×RT-PCR buffer 2.5μL；
50pmol/μL权利要求1 CA2上游引物 0.1μL；
50pmol/μL权利要求1 CA2下游引物 0.1μL；
50pmol/μL权利要求1 CA4上游引物 0.2μL；
50pmol/μL权利要求1 CA4下游引物 0.2μL；
50pmol/μL权利要求1 CA5上游引物 0.1μL；
50pmol/μL权利要求1 CA5下游引物 0.1μL；
50pmol/μL权利要求1 CA8上游引物 0.2μL；
50pmol/μL权利要求1 CA8下游引物 0.2μL；
50pmol/μL权利要求1 CA2探针 0.05μL；
50pmol/μL权利要求1 CA4探针 0.12μL；
50pmol/μL权利要求1 CA5探针 0.08μL；
50pmol/μL权利要求1 CA8探针 0.12μL；
酶液 1μL；
核酸模板 2.5μL；
ddH2O 补至25μL。
本发明进一步设置为，荧光定量PCR反应程序为：42-50℃逆转录10-30min，1个循环；93~95℃预变性5~15min，1个循环；93~95℃变性10~20s， 55~60℃退火、延伸、信号采集30~60s，循环40~45次。
通过采用上述技术方案，本发明进一步确定了多重荧光PCR反应程序，本发明能够对将来可能爆发的A2，A4，A5，A8这4种亚型进行监测，同时可以作为一种技术储备，以备未来所需。
本发明进一步设置为，荧光定量PCR反应程序为：50℃逆转录15min；95℃预变性5min；95℃变性15s，55℃退火、延伸、信号采集40s，循环40次。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1、本发明设计的引物探针组合，可以防止不同引物探针组合因相互抑制、竞争而出现的交叉扩增，特异性、灵敏度高；
2、本发明通过采用四重荧光定量PCR技术，在同一反应体系中加入4条不同荧光标记的Taq-Man荧光探针，可以实现快速准确的对样本中柯萨奇病毒A2、A4、A5和A8型的快速筛查；
3、本发明准确性高、特异性好，重复性好，通量高，检测速度快，为实现科萨奇病毒的快速分型检测具有重大意义，符合临床需要，有利于在临床实践中推广应用。
附图说明
图1是本发明柯萨奇病毒A2型的FAM通道阳性标准品的梯度曲线图；
图2是本发明柯萨奇病毒A4型的VIC通道阳性标准品的梯度曲线图；
图3是本发明柯萨奇病毒A5型的TEXAS RED通道阳性标准品的梯度曲线图；
图4是本发明柯萨奇病毒A8型的CY5通道阳性标准品的梯度曲线图；
图5是本发明对比例1阳性标准品扩增曲线结果图；
图6是本发明对比例2阳性标准品扩增曲线结果图；
图7是本发明混合阳性标准品和阴性参考品的扩增结果图；
图8是本发明阴、阳对照组和12个临床样本的扩增检测结果图；
图9是本发明柯萨奇病毒A2型的FAM通道精密性阳性参考品10个复孔的扩增曲线图；
图10是本发明柯萨奇病毒A4型的VIC通道精密性阳性参考品10个复孔的扩增曲线图；
图11是本发明柯萨奇病毒A5型的TEXAS RED通道精密性阳性参考品10个复孔的扩增曲线图；
图12是本发明柯萨奇病毒A8型的CY5通道精密性阳性参考品10个复孔的扩增曲线图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明柯萨奇病毒A2 型，A4型，A5型，A8型病毒及12个样本均来源于深圳市龙华区疾控中心；
提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(DP315)；体外转录试剂盒购自Thermo Scientific TranscriptAid T7 High YieldTranscription Kit #K0441。
本发明的探针和引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
本发明用于检测柯萨奇病毒A2型、柯萨奇病毒A4型、柯萨奇病毒A5型、柯萨奇病毒A8型的四重荧光定量PCR仪包括但不限于：ABI系列、Bio-Rad系列（ICycler/MJ Opticon2）、Stratagene MX系列、Roche Lightcycler、Ccpheid smartcycler、Corbett Rortor-Gene、杭州博日系列。
1. 靶基因筛选
分别选择柯萨奇病毒A2 型，A4型，A5型，A8型特异性基因作为检测靶基因。
2.引物探针设计
本发明根据柯萨奇病毒A2型、A4型、A5型、A8型的核酸序列，分别设计了大量用于检测柯萨奇病毒A2型、A4型、A5型、A8型的四重荧光定量PCR的引物和探针。本发明经过大量筛选实验，筛选出一组灵敏度高和特异性强的引物和探针，序列如下：
CA2引物探针
CA2F ACAAGGATTCTTACGCAGCTTCGGCAG SEQ ID No：1
CA2R GCAGAGCGTCCAATACAG SEQ ID No：2
CA2P ACAAGGATTCTTACGCAGCTTCGGCAG SEQ ID No：3
CA2扩增靶片段：
ACAAGGATTCTTACGCAGCTTCGGCAGCCAAGCATGATTTCACTCAAGACCCTGGGAAATTTACTCAACCTGTATTGGACGCTCTGC SEQ ID No：13
CA4引物探针
CA4F AGTCCACCACCACAAGTG SEQ ID No：4
CA4R GACACTGCCCGTAGGATAG SEQ ID No：5
CA4P ATGTCACCAGCCAGTGCCTATCAGTGG SEQ ID No：6
CA4扩增靶片段：
AGTCCACCACCACAAGTGTCGGTACCCTTCATGTCACCAGCCAGTGCCTATCAGTGGTTCTACGATGGCTACCCCACCTTTGGGCCCCACTCAGAAACATCCAACCTATCCTACGGGCAGTGTC SEQ ID No：14
CA5引物探针
CA5F GTGAGCAACAGAGCGATTG SEQ ID No：7
CA5R GTGGAGTTACCGACAGTGA SEQ ID No：8
CA5P ATCGCTGTATCCACATGCTTCCGCTGA SEQ ID No：9
CA5扩增靶片段：
GTGAGCAACAGAGCGATTGTATACTCTTTTGTGGGTTTTGTGCCATTAAATCTTACTGTCCCCCACTAAAATCCCCTTCAGCGGAAGCATGTGGATACAGCGATAGGGTGGCACAGCTCACTGTCGGTAACTCCAC SEQ ID No：15
CA8引物探针
CA8F GACAGAGTGGCACAACTAAC SEQ ID No：10
CA8R GCAGTGGCATCCTTATCG SEQ ID No：11
CA8P TCGACAATCACAACACAAGAAGCTGCC SEQ ID No：12
CA8扩增靶片段：
GACAGAGTGGCACAACTAACTGTGGGGAATTCGACAATCACAACACAAGAAGCTGCCAACATAGTTCTTGCCTACGGGGAATGGCCCGAGTATTGCCCCGATAAGGATGCCACTGC SEQ ID No：16
PCR检测时，对不同的上述基因探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记，使其与柯萨奇病毒A6/A10/A16/肠道病毒71型基因探针上标记的荧光信号不相同。本发明选用的荧光基团标记包括但不限于FAM、VIC、TEXAS RED和CY5。本发明CA2采用FAM标记，CA4采用VIC标记， CA5采用TEXAS RED标记，CA8采用 CY5标记。
3、阳性标准品的制备
为了绘制四重荧光定量PCR的标准曲线，分别提取柯萨奇病毒A2型、柯萨奇病毒A4型、柯萨奇病毒A5型、柯萨奇病毒A8型的RNA核酸作为逆转录PCR模板，分别用相应扩增引物将对应的靶序列进行扩增，将扩增产物连入pUC57-Kan载体中，分别获得含柯萨奇病毒A2型、柯萨奇病毒A4型、柯萨奇病毒A5型、柯萨奇病毒A8型的靶基因序列的质粒，然后将质粒进行体外转录获得相应RNA，即柯萨奇病毒A2型、柯萨奇病毒A4型、柯萨奇病毒A5型、柯萨奇病毒A8型阳性标准品。
将上述柯萨奇病毒A2型、柯萨奇病毒A4型、柯萨奇病毒A5型、柯萨奇病毒A8型的阳性标准品进行10倍梯度稀释，获得浓度分别为106copies/ml、105copies/ml、104copies/ml、103copies/ml、102copies/ml、101copies/ml作为灵敏度检测标准品。
4. 阳性标准品的四重荧光定量PCR检测
实施例1
荧光定量PCR扩增反应体系为：
2.5mM/mL dNTP 1μL
10×RT-PCR buffer 2.5μL
50pmol/μL引物CA2-F 0.1μL
50pmol/μL引物CA2-R 0.1μL
50pmol/μL引物CA4-F 0.1μL
50pmol/μL引物CA4-R 0.1μL
50pmol/μL引物CA5-F 0.1μL
50pmol/μL引物CA5-R 0.1μL
50pmol/μL引物CA8-F 0.1μL
50pmol/μL引物CA8-R 0.1μL
50pmol/μL探针CA2-P 0.03μL
50pmol/μL探针CA4-P 0.1μL
50pmol/μL探针CA5-P 0.05μL
50pmol/μL探针CA8-P 0.1μL
酶液 1μL
阳性标准品 5μL
ddH<sub>2</sub>O 补至25μL
PCR扩增反应程序为：42℃逆转录30min；93℃预变性15min；93℃变性20s；55℃退火、延伸、信号采集60s；循环40次。
实施例2
荧光定量PCR扩增反应体系为：
2.5mM/mL dNTP 2μL
10×RT-PCR buffer 2.5μL
50pmol/μL引物CA2-F 0.2μL
50pmol/μL引物CA2-R 0.2μL
50pmol/μL引物CA4-F 0.2μL
50pmol/μL引物CA4-R 0.2μL
50pmol/μL引物CA5-F 0.2μL
50pmol/μL引物CA5-R 0.2μL
50pmol/μL引物CA8-F 0.2μL
50pmol/μL引物CA8-R 0.2μL
50pmol/μL探针CA2-P 0.08μL
50pmol/μL探针CA4-P 0.15μL
50pmol/μL探针CA5-P 0.1μL
50pmol/μL探针CA8-P 0.15μL
酶液 2μL
阳性标准品 0.5μL
ddH<sub>2</sub>O 补至25μL
PCR扩增反应程序为：50℃逆转录10min；95℃预变性5min；95℃变性10s；60℃退火、延伸、信号采集30s；循环45次。
实施例3
荧光定量PCR扩增反应体系为：
2.5mM/mL dNTP 2μL
10×RT-PCR buffer 2.5μL
50pmol/μL引物CA2-F 0.1μL
50pmol/μL引物CA2-R 0.1μL
50pmol/μL引物CA4-F 0.2μL
50pmol/μL引物CA4-R 0.2μL
50pmol/μL引物CA5-F 0.1μL
50pmol/μL引物CA5-R 0.1μL
50pmol/μL引物CA8-F 0.2μL
50pmol/μL引物CA8-R 0.2μL
50pmol/μL探针CA2-P 0.05μL
50pmol/μL探针CA4-P 0.12μL
50pmol/μL探针CA5-P 0.08μL
50pmol/μL探针CA8-P 0.12μL
酶液 1μL
阳性标准品 2.5μL
ddH<sub>2</sub>O 补至25μL
PCR扩增反应程序为：50℃逆转录15min；95℃预变性5min；95℃变性15s；55℃退火、延伸、信号采集40s；循环40次。
上述阳性标准品分别采用实施例1-3所述的荧光定量PCR扩增反应体系和PCR扩增反应程序进行反应。实验结果表明，实施例1-3的荧光定量PCR扩增反应体系和PCR扩增反应程序均能够扩增出目的条带。图1-4为本发明筛选出的最优荧光定量PCR扩增反应体系和PCR扩增反应程序（记载于实施例3中）的实验结果图。
图1为柯萨奇病毒A2型的FAM通道阳性标准品的梯度曲线图；图2为柯萨奇病毒A4型的VIC通道阳性标准品的梯度曲线图；图3为柯萨奇病毒A5型的TEXAS RED通道阳性标准品的梯度曲线图, 图4为柯萨奇病毒A8型的CY5通道阳性标准品的梯度曲线图。其中，图1-4中，从左到右的浓度依次为106~101copies/ml（图中由于101浓度太低，试剂盒检测灵敏度达不到，未在图中显示）。
实验结果显示，在101～106copies/ml范围内4种标准曲线均呈现良好的线性关系，FAM、VIC、TEXAS RED和CY5四个通道检测灵敏度分别达200copies/ mL, 400copies/mL,200copies/mL，300copies/mL。
上述结果说明，本发明含有柯萨奇病毒A2、A4、A5和A8型的特异性引物和Taqman基因探针，在反应体系中含有柯萨奇病毒A2、A4、A5和A8型基因模板的情况下，可以实现RT-PCR反应，并释放荧光信号。利用荧光定量PCR仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性、定量分析。
5.选用其它引物和探针组合对阳性标准品的四重荧光定量PCR检测
对比例1
选用柯萨奇病毒A2型引物CA2-F1替换实施例3中的引物CA2-F进行反应，CA2-F1的序列如下：
CA2-F1 GATCCACCATCAACTTCACC SEQ ID No：17
荧光定量PCR扩增反应体系和PCR扩增反应程序等其它参数与实施例3相同。
对比例2
选用柯萨奇病毒A5型探针CA5-P1替换实施例3中的探针CA5-P进行反应，CA5-P1的序列如下：
CA5-P1 ATCGCTGTATCCACATGCTTCCGCT SEQ ID No：18
荧光定量PCR扩增反应体系和PCR扩增反应程序等其它参数与实施例3相同。
实验结果如图5-6所示，对比例1中的CA2-F1组合会导致CA2通道出现非特异扩增，存在明显的柯萨奇病毒A2型的假阳性扩增；对比例2中的CA5-P1组合会导致线性倾斜，柯萨奇病毒CA4通道出现明显扩增延后，同时导致灵敏度降低。
6.样本检测
样本核酸提取：待提样品12例，包括6例阳性样本：2例CA2，1例CA4，2例 CA5，1例 CA8和6例阴性样本：2例CA6，2例 CA10，2例CA16。
以提取的核酸为模板进行四重荧光定量PCR扩增，荧光定量PCR扩增反应体系为：
2.5mM/mL dNTP 2μL
10×RT-PCR buffer 2.5μL
50pmol/μL引物CA2-F 0.1μL
50pmol/μL引物CA2-R 0.1μL
50pmol/μL引物CA4-F 0.2μL
50pmol/μL引物CA4-R 0.2μL
50pmol/μL引物CA5-F 0.1μL
50pmol/μL引物CA5-R 0.1μL
50pmol/μL引物CA8-F 0.2μL
50pmol/μL引物CA8-R 0.2μL
50pmol/μL探针CA2-P 0.05μL
50pmol/μL探针CA4-P 0.12μL
50pmol/μL探针CA5-P 0.08μL
50pmol/μL探针CA8-P 0.12μL
酶液 1μL
核酸模板 2.5μL
ddH<sub>2</sub>O 补至25μL
PCR扩增反应程序为：50℃逆转录15min；95℃预变性5min；95℃变性15s；55℃退火、延伸、信号采集40s；循环40次。
同时，设置阴性对照组和阳性对照组，其中阴性对照为不含有柯萨奇病毒A2型、柯萨奇病毒A4型、柯萨奇病毒A5型、柯萨奇病毒A8型基因组的生理盐水溶液。阳性对照组为同时含有柯萨奇病毒A2型、柯萨奇病毒A4型、柯萨奇病毒A5型和柯萨奇病毒A8型基因组的混合阳性标准品的溶液，该混合阳性标准品为各单一标准品106浓度按照等体积混合而成。
通过荧光扩增曲线图Ct值的大小来判断结果的阴阳性，确定样品中是否含有柯萨奇病毒A2型、柯萨奇病毒A4型、柯萨奇病毒A5型、柯萨奇病毒A8型。当扩增曲线图Ct值≤38,并呈现明显指数增长时，结果表现为阳性；当扩增曲线图Ct值>38或无Ct值,结果表现为阴性；因此，为了在判断阴阳性时具有参照，检测样本时需要给柯萨奇病毒A2型、柯萨奇病毒A4型、柯萨奇病毒A5型、柯萨奇病毒A8型的四重荧光定量PCR检测设置阴性对照液和阳性对照液。
检测结果如图7-8所示，其中图7为阳性对照和阴性对照扩增结果图；图8为阴、阳对照组和检测样本的扩增结果，其中检出2例CA2，1例CA4，2例 CA5，1例 CA8共6例，其余为阴性样本，2例CA6，2例CA10，2例CA16全部为阴性，无交叉扩增现象，测结果符合预期，准确率达100%。
7. 精密性阳性参考品的四重荧光定量PCR检测
本发明的精密性阳性参考品的制备方法与阳性标准品相同，精密性阳性参考品由混合阳性标准品稀释获得。精密性阳性参考品的浓度为2.5×105 copies/ml。
选择实施例3的荧光定量PCR扩增反应体系和PCR扩增反应程序，检测精密性阳性参考品各10个复孔，实验结果如图9-12所示，结果表明各通道精密性均小于2％。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳市艾伟迪生物科技有限公司
<120> 同时检测4种A组柯萨奇病毒亚型的核酸组合物及其试剂盒和检测方法
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
acaaggattc ttacgcagct tcggcag 27
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
gcagagcgtc caatacag 18
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
acaaggattc ttacgcagct tcggcag 27
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
agtccaccac cacaagtg 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
gacactgccc gtaggatag 19
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
atgtcaccag ccagtgccta tcagtgg 27
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
gtgagcaaca gagcgattg 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
gtggagttac cgacagtga 19
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 9
atcgctgtat ccacatgctt ccgctga 27
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 10
gacagagtgg cacaactaac 20
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 11
gcagtggcat ccttatcg 18
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 12
tcgacaatca caacacaaga agctgcc 27
<210> 13
<211> 87
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 13
acaaggattc ttacgcagct tcggcagcca agcatgattt cactcaagac cctgggaaat 60
ttactcaacc tgtattggac gctctgc 87
<210> 14
<211> 124
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 14
agtccaccac cacaagtgtc ggtacccttc atgtcaccag ccagtgccta tcagtggttc 60
tacgatggct accccacctt tgggccccac tcagaaacat ccaacctatc ctacgggcag 120
tgtc 124
<210> 15
<211> 136
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 15
gtgagcaaca gagcgattgt atactctttt gtgggttttg tgccattaaa tcttactgtc 60
ccccactaaa atccccttca gcggaagcat gtggatacag cgatagggtg gcacagctca 120
ctgtcggtaa ctccac 136
<210> 16
<211> 116
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 16
gacagagtgg cacaactaac tgtggggaat tcgacaatca caacacaaga agctgccaac 60
atagttcttg cctacgggga atggcccgag tattgccccg ataaggatgc cactgc 116
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 17
gatccaccat caacttcacc 20
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 18
atcgctgtat ccacatgctt ccgct 25

Claims (9)

1.一种同时检测4种A组柯萨奇病毒亚型的核酸组合物，其特征在于：包括以下引物和探针序列：
CA2上游引物序列SEQ ID No：1；
CA2下游引物序列SEQ ID No：2；
CA2探针序列SEQ ID No：3；
CA4上游引物序列SEQ ID No：4；
CA4下游引物序列SEQ ID No：5；
CA4探针序列SEQ ID No：6；
CA5上游引物序列SEQ ID No：7；
CA5下游引物序列SEQ ID No：8；
CA5探针序列SEQ ID No：9；
CA8上游引物序列SEQ ID No：10；
CA8下游引物序列SEQ ID No：11；
CA8探针序列SEQ ID No：12。
2.一种同时检测4种A组柯萨奇病毒亚型的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的核酸组合物、dNTP、RT-PCR buffer、酶液和ddH2O。
3.根据权利要求2所述的同时检测4种A组柯萨奇病毒亚型的试剂盒，其特征在于：所述RT-PCR buffer为10×RT-PCR buffer，包含400mM tris-base、0.5% TritonX-100、80mMMgCl2和5%甘油。
4.根据权利要求2所述的同时检测4种A组柯萨奇病毒亚型的试剂盒，其特征在于：所述酶液包含逆转录酶M-MLV、热启动化学修饰Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和Taq酶稀释液。
5.根据权利要求4所述的同时检测4种A组柯萨奇病毒亚型的试剂盒，其特征在于：所述逆转录酶M-MLV、热启动化学修饰Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和Taq酶稀释液混合的体积比为1：3：2：4。
6.一种同时检测4种A组柯萨奇病毒亚型的方法，其特征在于：采用荧光探针RT-PCR法，荧光定量PCR扩增反应体系为：
2.5mM/mL dNTP 1-2μL；
10×RT-PCR buffer 2.5μL；
50pmol/μL权利要求1 CA2上游引物 0.1-0.2μL；
50pmol/μL权利要求1 CA2下游引物 0.1-0.2μL；
50pmol/μL权利要求1 CA4上游引物 0.1-0.2μL；
50pmol/μL权利要求1 CA4下游引物 0.1-0.2μL；
50pmol/μL权利要求1 CA5上游引物 0.1-0.2μL；
50pmol/μL权利要求1 CA5下游引物 0.1-0.2μL；
50pmol/μL权利要求1 CA8上游引物 0.1-0.2μL；
50pmol/μL权利要求1 CA8下游引物 0.1-0.2μL；
50pmol/μL权利要求1 CA2探针 0.03-0.08μL；
50pmol/μL权利要求1 CA4探针 0.1-0.15μL；
50pmol/μL权利要求1 CA5探针 0.05-0.1μL；
50pmol/μL权利要求1 CA8探针 0.1-0.15μL；
酶液 1-2μL；
核酸模板 0.5~5μL；
ddH2O 补至25μL。
7.根据权利要求6所述的同时检测4种A组柯萨奇病毒亚型的方法，其特征在于：荧光定量PCR扩增反应体系为：
2.5mM/mL dNTP 2μL；
10×RT-PCR buffer 2.5μL；
50pmol/μL权利要求1 CA2上游引物 0.1μL；
50pmol/μL权利要求1 CA2下游引物 0.1μL；
50pmol/μL权利要求1 CA4上游引物 0.2μL；
50pmol/μL权利要求1 CA4下游引物 0.2μL；
50pmol/μL权利要求1 CA5上游引物 0.1μL；
50pmol/μL权利要求1 CA5下游引物 0.1μL；
50pmol/μL权利要求1 CA8上游引物 0.2μL；
50pmol/μL权利要求1 CA8下游引物 0.2μL；
50pmol/μL权利要求1 CA2探针 0.05μL；
50pmol/μL权利要求1 CA4探针 0.12μL；
50pmol/μL权利要求1 CA5探针 0.08μL；
50pmol/μL权利要求1 CA8探针 0.12μL；
酶液 1μL；
核酸模板 2.5μL；
ddH2O 补至25μL。
8.根据权利要求6或7所述的同时检测4种A组柯萨奇病毒亚型的方法，其特征在于：荧光定量PCR反应程序为：42-50℃逆转录10-30min，1个循环；93~95℃预变性5~15min，1个循环；93~95℃变性10~20s， 55~60℃退火、延伸、信号采集30~60s，循环40~45次。
9.根据权利要求8所述的同时检测4种A组柯萨奇病毒亚型的方法，其特征在于：荧光定量PCR反应程序为：50℃逆转录15min；95℃预变性5min；95℃变性15s，55℃退火、延伸、信号采集40s，循环40次。
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