CN104878125B - 一种针对乙型肝炎病毒多耐药位点的高通量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种针对多样本多位点的乙型肝炎病毒多耐药位点检测方法，包括提取HBV基因组DNA、PCR扩增、PCR产物混合纯化、再次PCR扩增、文库质检定量、上机测序及数据分析等步骤。本发明的方法能够在同一个文库中同时检测分析多个HBV样品的多个耐药位点突变状态。使得通过高通量测序技术检测临床HBV病毒耐药突变成为可能，该流程具有起始样本量小、针对性强、成本低、通量高，准确性高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种针对乙型肝炎病毒多耐药位点的高通量检测方法及其相关的试剂盒及装置。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性分布，全球约有3.6亿感染者，每年约有100万人死于与HBV相关的肝脏疾病。
目前，核苷(酸)类似物(NA)已成为抗HBV感染的主要方法之一。核苷类似物主要有拉米夫定(LVD)、阿德福韦酯(ADV)、恩曲他滨(FTC)、恩替卡韦(ETV)、替诺福韦酯(TDV)、替诺福韦酯(TDV)等。
随着核苷类似物临床治疗方案的不断优化，核苷类似物对慢性乙型肝炎的疗效已得到肯定。因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的肝病患者，是长期治疗的合理选择。但随着治疗时间的延长，往往会出现病毒耐药株，从而导致治疗的失败，给乙肝的治疗带来了极大的困难。因此，非常有必要对HBV耐药位点进行检测，作为临床用药及治疗的参考。目前，临床检测HBV耐药位点突变常用技术有DNA一代测序以及荧光定量PCR技术等，这类方法灵敏度低、准确性差，具有一定的局限性。
发明内容
针对HBV病毒的多耐药位点突变检测的技术现状，本发明提出一种针对多样本的HBV多耐药位点高通量检测方法，该方法能够在一个文库中同时分析多个样本的多个位点的突变状况。该方法具有灵敏度高、针对性强、成本低、通量大，准确性高等优点。
本发明提供了一种针对乙型肝炎病毒多耐药位点的高通量检测方法，包括以下步骤：
步骤1：提取检测对象各个样本中的HBV基因组DNA；
步骤2：针对不同样本使用不同的PCR引物进行PCR扩增；
步骤3：将步骤2中所得到不同样本的的PCR产物按照相同的摩尔数混合，得到混合后的PCR产物；
步骤4：将混合后的PCR产物使用通用引物进行第二次PCR扩增，获得测序文库并进行文库质检定量；
步骤5：上机测序及数据分析得到耐药位点相关信息。
为进一步优化上述技术方案，本发明的技术方案还包括：
上述步骤2的PCR扩增中使用的引物为针对乙型肝炎病毒基因组RT区域的多个耐药位点进行设计。
上述步骤4还包括使用第二次PCR扩增的引物对扩增产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳以确认产物情况的步骤，以及随后进行的对扩增产物纯化的步骤。
上述步骤4中的通用引物包括一条通用的上游引物，和一条带有标签序列的下游引物，所述步骤4中的PCR循环次数为4-10轮。
对扩增产物的纯化方法包括磁珠纯化、纯化柱纯化、琼脂糖凝胶电泳纯化。
对扩增产物的纯化方法为磁珠纯化。
上述步骤5中的上机测序通过二代测序平台进行；步骤5中的数据分析通过对所得测序数据与乙型肝炎病毒的参考序列进行对比，最终对所测片段每个突变位点的突变情况进行分析，得到耐药位点相关信息。
上述乙型肝炎病毒基因组RT区域的多个耐药位点为选自V173L、L180M、M204V/I、A181T/V、N236T、S202G、M250V、T184G、I169T、A194T中的至少一种。
本发明还提供了一种利用上述的方法检测乙型肝炎病毒耐药位点突变状态的试剂盒。
本发明还提供一种检测乙型肝炎病毒耐药位点突变状态的系统，包括：
核酸抽提装置，所述核酸抽提装置适用于从乙型肝炎病毒宿主分离乙型肝炎病毒核酸样本；
基因扩增装置，所述的基因扩增装置用于对核酸样本进行扩增，以便得到第一扩增产物；
测序装置，所述测序装置与所述扩增装置相连，并且适于对所述扩增产物进行测序，以便得到测序结果；以及
分析装置，所述分析装置与所述测序装置相连，用于基于所述测序结果，确定所述HBV核酸样本中是否存在突变。
为了优化上述系统，还可以采用以下技术方案：
分析装置进一步包括比对单元，所述比对单元中存储有参考序列，用于将所述测序结果与参照序列进行比对，以便确定所述核酸样本是否存在突变。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：本发明针对HBV病毒的多耐药位点突变检测，提供了一种针对多样本的HBV多耐药位点高通量检测方法，该方法能够在一个文库中同时分析多个样本的多个位点的突变状况。该方法具有灵敏度高、针对性强、成本低、通量大，准确性高等优点。
附图说明
图1是根据本发明一个实施例的确定HBV核酸样本中突变位点类型的方法的流程示意图：以及
图2是根据本发明一个实施例的确定HBV核酸样本中突变位点类型的系统的结构示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种本发明提供了一种针对乙型肝炎病毒多耐药位点的高通量检测方法，包括以下步骤：
步骤1：提取检测对象各个样本中的HBV基因组DNA；
步骤2：针对不同样本使用不同的PCR引物进行PCR扩增；
步骤3：将步骤2中所得到不同样本的的PCR产物按照相同的摩尔数混合，得到混合后的PCR产物；
步骤4：将混合后的PCR产物使用通用引物进行第二次PCR扩增，获得测序文库并进行文库质检定量；
步骤5：上机测序及数据分析得到耐药位点相关信息。
本发明提供了一种针对多样本多位点的乙型肝炎病毒多耐药位点检测方法，主要技术流程：提取HBV基因组DNA、第一轮PCR、PCR产物混合、第二轮PCR、文库质检定量、上机测序及数据分析。具体如下：
根据本发明的一个实施例，将核酸标签引入到测序文库中的方法并不受特别限制。既可以在构建文库的过程中，按照常规方法，将标签引入到测序文库中。根据本发明的一个实施例，可以在对待测序的核酸样品进行预处理，通过PCR扩增的方法，将标签引入到扩增产物中，之后通过常规的构建文库的方法，针对所得到的含有标签的扩增产物构建测序文库，从而得到含有标签的测序文库。由此，可以在对多个核酸样品进行扩增之后，就可以混合在一起，进行文库构建，从而容易获得含有各自核酸标签序列的多种核酸样本的测序文库。
根据本发明的一个实施例，HBV核酸样本的来源并不受特别限制。根据本发明的一些具体实施例，HBV核酸样本是从HBV的宿主中分离的。根据本发明的进一步的实施例，优选HBV核酸样本是从乙肝患者血清样本中分离的。由此，可以有效地对乙肝患者的HBV核酸样本进行检测。
根据本发明的一个实施例，第一轮PCR的引物针对HBV基因组的多个耐药位点设计，包含部分Illumina接头序列。
根据本发明的一个实施例，将区分样本的引物组合设计好以后，以提取的HBV基因组DNA为模板进行PCR扩增，其中所使用的聚合酶包括但不限于常规的taq酶、pfu高保真酶或其它聚合酶，优先选用pfu高保真酶。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认扩增情况。
根据本发明的一个实施例，将PCR产物纯化回收，纯化方法包括但不限于琼脂糖凝胶回收、磁珠纯化和纯化柱纯化。
根据本发明的一个实施例，将纯化回收的产物定量，使用的荧光定量分析仪定量包括但不限于Qubit 2.0，然后将不同样本的产物按照相同的摩尔数混合，得到混合的PCR产物。
根据本发明的一个实施例，使用Illumina公司通用的建库PCR引物，包括一条通用的上游引物，和一条带有标签(Index)序列的下游引物，使用高效的PCR扩增酶进行PCR，其中PCR循环数选择6轮。使用带有标签(Index)序列的引物进行PCR以后，可以将不同来源的文库进行混合，然后上机测序。
PCR引物序列如下：
TrueSeq Universal Primer:
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’
TrueSeq Primer-Index X:
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
其中，下划线N部分的碱基可以依据Illumina的官方说明使用多种碱基组合，从而产生更多的、不同标签的引物，用于不同的文库的区分。
根据本发明的一个实施例，为了有效提高建库各步骤中的产物纯度、减少杂志干扰、有利于后续步骤的进行，可以对文库制备中各步骤的产物进行纯化回收，纯化方法包括但不限于磁珠纯化、纯化柱纯化、琼脂糖胶电泳纯化、优选磁珠纯化。
根据本发明的一个实施例，使用Q-PCR的方法对测序文库进行质检定量，其中以Ilumina P5、P7作为引物，使用Illumina phix control kit v3作为标准品。
根据本发明的一个实施例，通过二代测序平台进行测序，优选Illumina Miseq平台，并进行数据分析，确定是否存在突变。
下面将结合实施例1具体地对本发明的方案进行解释。
实施例1
本实施例是采用Miseq测序技术对病人血清中HBV样品进行检测的，具体操作步骤如下:
1、按照说明书操作，用TIANamp病毒基因组DNA提取试剂盒提取乙肝患者血清样本中的HBV基因组DNA。
2、针对不同的样品使用带有不同barcode的引物进行PCR扩增。
本实例中，采用两对引物进行扩增，列表如下：
本实例中，针对108个样品检测上述两个片段所包含的多个耐药相关突变位点，采用3个碱基的标签序列区分样本，因此，上下游分别有11个标签序列，每个样本有唯一的上下游标签序列组合。所使用的标签序列如下表：
| 上游标签序列 | 下游标签序列 |
| ACA | AGT |
| ACG | AGA |
| TAC | TGC |
| TAG | TGA |
| CAT | CTG |
| ATC | ACT |
| ATG | AGC |
| TCA | TGT |
| TCG | CGT |
| CAG | CGC |
| CTA | CAC |
| ACA | AGT |
| ACG | AGA |
PCR扩增体系为
| 成分 | 体积(μl) |
| DNA | 5 |
| 2×Gold Star Master Mix | 10 |
| 1μM F | 1 |
| 1μM R | 1 |
| DNase-Free water | 3 |
PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s,58℃退火30s,72℃延伸
1min，共扩增30个循环；最终72℃延伸5min。由此，获得PCR产物。
3、PCR扩增产物采用1.5％的琼脂糖胶电泳确认产物情况，其中使用PCR扩增产物5μl,电压120V，电泳30min，采用凝胶成像系统拍照检测。
4、之后PCR产物回收采用AxyPrepTM PCR Clean-up Kit(Axygen)试剂盒进行回收。步骤如下：
5、取1μl回收产物使用2.0(Invitrogen)定量，然后将不同样本的产物按照相同的摩尔数混合，得到混合后的PCR产物。
6、取混合后的PCR产物20ng，进行第二轮PCR，使用Illumina公司通用引物进行扩增，循环数为6轮，获得测序文库；
将上一步得到的DNA按照下表在0.2ml离心管中配制PCR反应体系：
| 成分 | 体积(μl) |
| DNA | 20 |
| TrueSeq Universal Primer(1μl) | 1.25 |
| TrueSeq Primer-Index4(1μl) | 1.25 |
| 2×HiFi PCR Master Mix | 25 |
| Water | 2.5 |
| 总体系 | 50 |
7、反应条件：
备注：PCR引物序列如下：
TrueSeq Universal Primer:
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’
TrueSeq Primer-Index4:
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
8、反应完后使用Agencourt AMPure XP beads纯化，具体步骤如下：
9、文库质检定量。
将上一步得到的文库2.0(Invitrogen)进行定量，Q-PCR进行质检。
10、上机测序及数据分析。
将样本使用Illumina Miseq PE-300程序进行双末端测序，以便获得测序结果，具体操作流程详见Miseq操作说明书。
11、数据分析。
Miseq产出的测序结果是fastq形式的DNA序列，通过测序文库标签(Index)、样本标签序列(barcode)将测序序列对应到每个样本，然后将所得DNA序列与HBV的参考序列进行对比，最终对所测片段每个突变位点的突变情况进行分析，具体结果如下：
在本法命中所使用术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖他核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA。利用根据本发明实施例的核酸标签，通过将核酸标签与DNA相连，可以精确第表征DNA样品来源。在上下游PCR引物的5’端分别加上3个碱基以上的标签序列，含不同标签的上下游引物分别组合用来区分不同的样本。需要说明的是此处的标签是人为设计的碱基序列，一般由3个碱基以上构成，其目的是使每一个核酸样本的PCR产物两端都有唯一的序列标签，从而有效地将不同样本相同的PCR产物区分开来。由此，利用上述核算标签，可以同时构建多个样品的DNA文库，充分发挥测序深度的优势，同时检测多个样本的突变状态。例如利用Miseq测序技术，同时对多种DNA进行测序的高通量，提高DNA测序的效率和通量，降低了DNA测序成本。
高通量测序技术，例如Miseq测序技术具有以下优势：(1)高灵敏度：高通量测序，例如Miseq的测序通量大，目前一个实验流程下来可以产生10G碱基数据，高的数据通量可以再测序序列数确定的情况下，使得每条序列获得高的测序深度，所以可以检测到含量更低的突变，同时因其测序深度高，其测序结果也更为可靠。(2)高通量，低成本：利用根据本发明实施例的标签序列，通过一次测序可以检测上万份样本，从而大大降低了成本。
在本文中所使用的术语“高通量测序技术”指的是第二代测序技术及之后发展的更高通量的测序方法。第二代测序平台包括但不限于Illumina-Solexa(Miseq、Hiseq-2000、Hiseq-2500、Hiseq X ten等)、ABI-Solid和Roche-454测序平台等。随着测序技术的不断发展，本领域技术人员能够理解的是还可以采用其他方法的测序方法和装置进行本检测。根据本发明的具体示例，可以将根据本发明实施例的核酸标签用于Illumina-Solexa、ABI-Solid和Roche-454测序平台等的至少一种进行测序。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
<110> 上海昂朴生物科技有限公司
<120> 一种针对乙型肝炎病毒多耐药位点的高通量检测方法
<160> 6
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR扩增引物
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 2
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR扩增引物 n =a或g或c或t
<400> 2
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atct 64
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR扩增引物
<400> 3
gactcgtggt ggacttctct ca 22
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR扩增引物
<400> 4
grgcaacggg gtaaaggk 18
<210> 5
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR扩增引物
<400> 5
caagcagaag acggcatacg agattggtca gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atct 64
Claims (6)
1.一种针对乙型肝炎病毒本身的多耐药位点的高通量检测方法，其是非诊断方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：提取检测对象各个样本中的HBV基因组DNA；
步骤2：针对不同样本使用不同的PCR引物进行PCR扩增，所述步骤2的PCR扩增中使用的引物为针对乙型肝炎病毒基因组RT区域的多个耐药位点进行设计，所述乙型肝炎病毒基因组RT区域的多个耐药位点为选自V173L、L180M、M204V/I、A181T/V、N236T、S202G、M250V、T184G、I169T、A194T中的至少一种，所述引物是在上下游PCR引物的5’端分别加上3个碱基标签序列，其中，上游PCR引物序列是GACTCGTGGTGGACTTCTCTCA，下游PCR引物序列是GRGCAACGGGGTAAAGGK，所使用的标签序列如下表：
步骤3：将步骤2中所得到不同样本的PCR产物按照相同的摩尔数混合，得到混合后的PCR产物；
步骤4：将混合后的PCR产物使用通用引物进行第二次PCR扩增，其中PCR引物序列如下：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’，
获得测序文库并进行文库质检定量；
步骤5：上机测序及数据分析得到耐药位点相关信息。
2.根据权利要求1所述的一种针对乙型肝炎病毒多耐药位点的高通量检测方法，其特征在于，所述步骤4还包括使用第二次PCR扩增的引物对扩增产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳以确认产物情况的步骤，以及随后进行的对扩增产物纯化的步骤。
3.根据权利要求1所述的一种针对乙型肝炎病毒多耐药位点的高通量检测方法，其特征在于，所述步骤4中的PCR循环次数为4-10轮。
4.根据权利要求2所述的一种针对乙型肝炎病毒多耐药位点的高通量检测方法，其特征在于，对扩增产物的纯化方法包括磁珠纯化、纯化柱纯化、琼脂糖凝胶电泳纯化。
5.根据权利要求4所述的一种针对乙型肝炎病毒多耐药位点的高通量检测方法，其特征在于，对扩增产物的纯化方法为磁珠纯化。
6.根据权利要求1所述的一种针对乙型肝炎病毒多耐药位点的高通量检测方法，其特征在于，所述步骤5中的上机测序通过二代测序平台进行；所述步骤5中的数据分析通过对所得测序数据与乙型肝炎病毒的参考序列进行对比，最终对所测片段每个突变位点的突变情况进行分析，得到耐药位点相关信息。
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