CN105586410B - 一种土壤微生物耐药性基因的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种土壤微生物耐药性基因的检测方法。所述方法包括：确定耐药性基因、内源标准基因和外源标准基因；制备多重扩增引物；向待测样品中加入外源核酸，得到混合样品并提取基因组；向基因组中加入外源标准基因，获得混合核酸；扩增混合核酸，利用扩增产物构建高通量测序文库并进行高通量测序，得到测序片段组；分析所述测序片段组，并根据获得的外源标准基因和内源标准基因的测序片段的数量，判断实验是否成功；若实验成功，则计算耐药性基因的含量；根据耐药性基因的含量判定待测样品是否含有耐药性基因。所述方法可以一次性定量检测任意微生物中的任意多种希望检测的耐药性基因，且检测不需要培养与纯化微生物，速度快，结果准确可靠。

Description

一种土壤微生物耐药性基因的检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种土壤微生物耐药性基因的检测方法。

背景技术

抗生素类药物在动植物疾病的防治中应用较为普遍，但是滥用抗生素类药物会导致微生物进化出耐药性基因。监控土壤中微生物耐药性基因可以反应环境中抗生素使用的情况，同时，可以为抗生素的有效使用提供依据。

现有的检测耐药性基因的方法包括：预估待测样品上携带的需要检测的耐药性基因的病原菌，分离并纯化该病原菌，通过PCR(Polymease Chain Reaction，聚合酶链式反应)引物扩增该耐药性基因，利用电泳或实时定量PCR方法逐一判断待测样品中是否存在需要检测的耐药性基因。

在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题中的一种：

需要培养、分离和纯化病原菌，使得检测的时间较长，延误治疗时机；无法检测不可培养的耐药菌中的耐药性基因；一次只能针对一种或少数几种病原菌进行检测；一次只能检测一种或少数几种耐药性基因，不能检测到待测样品中所有的耐药性基因，不能给予用药所需的全面信息；不能实现耐药性基因的定量检测。

发明内容

为了解决现有技术中检测耐药性基因的方法有待提高的问题，本发明实施例提供了一种土壤微生物耐药性基因的检测方法。所述技术方案如下：

本发明实施例提供了一种土壤微生物耐药性基因的检测方法，所述方法包括：

确定待测样品中需要检测的微生物的耐药性基因、所述待测样品中的内源标准基因和所述待测样品的外源标准基因，所述待测样品为土壤；

制备用于扩增所述耐药性基因、所述内源标准基因和所述外源标准基因的测试区域的多重扩增引物；

向所述待测样品中加入所述多重扩增引物不能扩增的外源核酸，得到混合样品；

提取所述混合样品的基因组；

向所述混合样品的基因组中加入所述外源标准基因，获得混合核酸；

利用所述多重扩增引物对所述混合核酸进行扩增，得到扩增产物，利用所述扩增产物构建高通量测序文库；

对所述高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；

分析所述测序片段组，获得所述待测样品中所述耐药性基因的测序片段的数量、所述内源标准基因的测序片段的数量和所述外源标准基因的测序片段的数量；

根据所述外源标准基因的测序片段的数量和所述内源标准基因的测序片段的数量，判断实验是否成功；

若所述实验成功，则计算所述待测样品中所述耐药性基因的含量；

根据所述耐药性基因的含量判定所述待测样品是否含有耐药性基因。

具体地，所述耐药性基因至少为1个，所述内源标准基因至少为1个，所述外源标准基因至少为1个。

具体地，所述内源标准基因为所述待测样品的微生物中的基因。

具体地，所述外源标准基因不存在于已知基因组的生物中。

具体地，用于扩增所述耐药性基因的引物的设计区域或扩增区域与所述待测样品中的生物的基因组的其它区域的所有生物的基因组上除耐药性基因外的其它区域的同源性低于98％。

具体地，所述判断实验是否成功的方法为：当所述外源标准基因的测序片段的数量和所述内源标准基因的测序片段的数量均≥α1时，则实验成功；当所述外源标准基因的测序片段的数量或所述内源标准基因的测序片段的数量<α1时，则实验失败；其中，α1为判定阈值。

具体地，计算所述待测样品中所述耐药性基因的含量的方法为：第m种所述耐药性基因的含量的计算公式为其中，i为第m种所述耐药性基因的第i个测试区域，n1为所述第m种所述耐药性基因的测试区域的个数，bi为所述第m种耐药性基因的第i个测试区域的测序片段的数量，k为第k种所述内源标准基因，n3为所述内源标准基因的个数，j为第k种所述内源标准基因的第j个测试区域，n2为第k种所述内源标准基因的测试区域的个数，aj为第k种所述内源标准基因的第j种测试区域的测序片段的数量；N为所有所述内源标准基因的测试区域的总数。

具体地，判定所述待测样品中是否含有所述耐药性基因的方法为：所述耐药性基因的含量≥α2时，判定所述待测样品含有所述耐药性基因；当所有所述耐药性基因的含量<α2时，判定所述待测样品不含有所述耐药性基因；其中，α2为判定阈值。

具体地，所述外源标准基因的质量与所述混合样品的基因组的总质量的比例大于1/100000。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的方法可以在不需要培养与纯化的前提下，一次性的、定量的、快速的、准确的检测任意数量和类型的微生物中的任意多种希望检测的耐药性基因。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例

土壤微生物的耐药性基因检测

土壤微生物来源于自然环境，其中耐药性基因在一定程度上反应了抗性素类药物在环境中释放的情况。本实施例中的待测样品为土壤，该土壤取自于湖北武汉沌口开发区的水稻田。本实施例包括如下步骤：

步骤1、确定待测样品中需要检测的微生物的耐药性基因、待测样品中的内源标准基因和待测样品的外源标准基因，具体方法如下：

其中，耐药性基因至少为1个，内源标准基因至少为1个，外源标准基因至少为1个。内源标准基因为待测样品的微生物中的基因。外源标准基因不存在于已知基因组的生物中。

本实施例中的耐药性基因抗青霉素、β-内酰胺酶、头孢菌素酶、卡那霉素和新霉素，其中，耐药性基因APH(3')-Ia同时抗卡那霉素和新霉素。本实施例中内源标准基因为1种，具体地，内源标准基因为核糖体rRNA基因，该核糖体rRNA基因存在于绝大部分生物中且具有保守区域。在本实施例中，外源标准基因为1种，具体地，外源标准基因为ERCC-00004基因，其在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行同源比对时，未发现其在已知生物参考基因组中存在同源序列，即外源标准基因不存在于已知的生物基因组中。表1为本实施例中被检测基因相关信息与检测结果，在表1中耐药性基因名称与序列编号与抗生素耐药性数据库(CRAD：The Comprehensive Antibiotic Resistance Datab ase，网址为http://arpcard.mcmaster.ca/)中的名称与序列编号一致。

表1为本实施例中被检测基因相关信息与检测结果

表1中“/”表示无。

步骤2、制备用于扩增耐药性基因、内源标准基因和外源标准基因的测试区域的多重扩增引物，具体方法如下：

选择耐药性基因的保守区域设计多重扩增引物；用于扩增耐药性基因的引物的设计区域或扩增区域与待测样品中的生物的基因组的其它区域的同源性低于98％，这一要求确保了耐药性基因的检测不受待测样品中的生物的基因组的其它区域的干扰。具体地，耐药性基因的引物的设计区域在不同变体间是保守的，这样才能保证用相同的引物可以扩增出相同的耐药性基因的不同变体，若耐药性基因的引物的设计区域与待测样品中的生物的基因组的其它区域的同源性低于98％，则该引物不会扩增其它区域，因此，不会干扰耐药性基因的检测。否则，要求耐药性基因的引物的扩增区域与待测样品中的生物的基因组的其它区域的同源性低于98％，这样，获得的扩增产物可以与耐药性基因相区分，同样不会干扰耐药性基因的检测。同时，多重扩增引物中每对引物的扩增效率均在95％～105％之间。

具体地，在抗生素耐药性数据库中下载表1中的耐药性基因的序列，每一个下载的耐药性基因的序列的编号见表1。利用同源比对获得同一耐药性基因的不同序列间的保守区域，作为多重扩增引物的设计区域。若耐药性基因只包含一种序列，那么该序列的全部区域作为保守区域和多重扩增引物的设计区域。将以上获得的多重扩增引物的设计区域通过NCBI与所有生物的基因组上除耐药性基因外的其它区域进行同源比对，保留同源性低于98％的多重扩增引物的设计区域。核糖体rRNA基因的V5区以及外源标准基因ERCC-00004基因的全部序列作为保守区域和多重扩增引物的设计区域。

多重扩增引物获取过程如下：登录赛默飞世尔公司多重PCR引物在线设计网页https://ampliseq.com/，在“Application type”选项选择“DNA Hotspot designs(single-pool)”。将获得的多重扩增引物的设计区域用100个N连接起来，形成一个人工参考基因组，并在“Select the genome you wish to use”选项中选择“Custom”后，上传人工参考基因组。DNA Type选项选择“Standard DNA”。在多重扩增引物的设计区域内，随机挑选3个以上的不重叠的区域作为扩增区域，并填入Add Hotspot选项中，最后点击“Submittargets”按钮提交，获得用于扩增耐药性基因、内源标准基因和外源标准基因的多重扩增引物。由生工生物工程(上海)股份有限公司逐一合成多重扩增引物序列的每一重引物、以及由多重扩增引物的每一重引物所扩增的模板序列，模板序列是指上述多重扩增引物在填入Add Hotspot选项的扩增区域，按照美国赛默飞世尔公司的StepOne实时定量PCR仪的操作手册(Part Number 4376784Rev.E)检测每一多重扩增引物的扩增效率，仅保留扩增效率在95％～105％的多重扩增引物，在本实施例中，为节省成本，在满足条件的多重扩增引物中，仅选取最接近100％的一个引物作为最终入选的多重扩增引物，结果见表1。多重扩增引物由美国赛默飞世尔公司合成并以混合液体的形式提供使用。本实施例采用美国赛默飞世尔公司提供的多重PCR技术，其能够同时扩增多至12000个测试区域，因此，本发明有能力一次性检测现有的所有希望检测的耐药性基因。

步骤3、向待测样品中加入多重扩增引物不能扩增的外源核酸，将外源核酸与待测样品的基因组一同提取，得到混合样品，具体方法如下：

由于待测样品中基因组的含量较低，基因组提取困难，需要向待测样品中加入多重扩增引物不能扩增的外源核酸后，可以方便提取待测样品中的基因组，一般情况下，需要加入1ug左右的外源核酸，即可保证待测样品中的基因组的正常提取。加入的外源核酸的量根据核酸的提取方法可以作适当调整，例如，大量提取时，加入量应有所增加，超微量提取时，可以适当地减少，在现有的基因组提取技术水平下，一般最少不得少于1ng。由于多重扩增引物不能扩增外源核酸，因此，所加入的外源核酸并不影响耐药性基因的检测。在本实施例中，外源核酸为ERCC-00024基因，外源核酸ERCC-00024基因的序列如序列表中SEQ IDNO:13所示，ERCC-00024基因由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本实施例中，土壤中基因组含量较低，在采用按土壤DNA试剂盒提取基因组时，向400mg的待测样品中加入的外源核酸1ug后混匀，即得到混合样品，即可保证混合样品中的基因组的正常提取。

步骤4、提取混合样品的基因组，具体方法如下：

按土壤DNA试剂盒(生产公司：美国MP公司，产品货号：116570200，产品英文名：FastDNA SPIN kit for feces)的操作说明书提取混合样品的基因组，提取出的为混合样品的基因组核酸。利用分光光度计(美国Quawell公司生产，型号为Q5000)中的双链DNA程序，检测获得的混合样品的基因组的量。本实施例中，混合样品的基因组的总量为2350ng。

步骤5、向混合样品的基因组中加入外源标准基因，外源标准基因的质量与混合样品的基因组的总质量的比例大于1/100000，获得混合核酸，具体方法如下：

在本实施例中，外源标准基因的质量与混合样品的基因组的总质量的比例为1/1000，由于混合样品的基因组的总量为2350ng，因此，需要加入2.350ng外源标准基因，获得混合核酸。

步骤6、利用多重扩增引物对混合核酸进行扩增，得到扩增产物，利用扩增产物构建高通量测序文库，具体方法如下：

利用文库构建试剂盒2.0(由美国赛默飞世尔公司生产，货号为4475345)构建高通量测序文库。该文库构建试剂盒包括以下试剂：5×Ion AmpliSeq^TM HiFi Mix、FuPa试剂、转换试剂、测序接头溶液和DNA连接酶。文库构建的方法按该文库构建试剂盒的操作手册《IonAmpliSeq^TM Library Preparation》(出版号：MAN0006735，版本：A.0)进行。多重PCR的扩增体系如下：5×Ion AmpliSeq^TM HiFi Mix 4μl、制备的多重扩增引物的混合液体4μl、混合核酸10ng和无酶水11μl。多重PCR的扩增程序如下：99℃，2分钟；(99℃，15秒；60℃，4分钟)×25个循环；10℃保温。利用FuPa试剂消化掉多重PCR扩增产物中多余的引物后，再进行磷酸化，具体方法为：向多重PCR的扩增产物中加入2μl FuPa试剂，混匀后，在PCR仪上按如下程序反应：50℃，10分钟；55℃，10分钟；60℃，10分钟；10℃保存，得到混合物a，混合物a为含有经过磷酸化的扩增产物溶液。将磷酸化的扩增产物连接上测序接头，具体方法为：向混合物a中加入转换试剂4μl、测序接头溶液2μl和DNA连接酶2μl，混匀后，在PCR仪上按如下程序反应：22℃，30分钟；72℃，10分钟；10℃保存，得到混合液b。利用标准的乙醇沉淀方法纯化混合液b后溶解于10μl无酶水中。利用美国Invitrigen公司生产的

dsDNA HS AssayKit(货号为Q32852)并按照其说明书进行检测，获得混合液b的质量浓度后，将纯化后的混合液b稀释至15ng/ml，得到浓度约100pM的高通量测序文库。

步骤7、对高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组，具体方法如下：

利用获得的高通量测序文库和试剂盒Ion PI Template OT2 200Kit v2(美国invirtrigen公司生产，货号为4485146)进行测序前的ePCR(Emulsion PCR，乳化聚合酶链反应)扩增，操作方法按该试剂盒的操作手册进行。利用ePCR产物和试剂盒Ion PISequencing 200Kit v2(美国invirtrigen公司生产，货号为4485149)在Proton二代高通量测序仪上进行高通量测序，操作方法按该试剂盒的操作手册进行。在本实施例中，高通量测序量设置为1M测序片段(1M＝100万)，测序长度设置为500cycle(循环)，测序结束后，获得测序片段组。

步骤8、分析测序片段组，获得待测样品中耐药性基因的测序片段的数量、内源标准基因的测序片段的数量和外源标准基因的测序片段的数量，具体方法如下：

根据测序片段的引物，利用blastall(version 2.2.26)软件，按其默认的参数设置，将测序片段组比对到表1中的多重扩增引物对应的耐药性基因、内源标准基因和外源标准基因的检测区域上，保留与检测区域的同源性高于98％的测序片段(同源于低于98％的测序片段可能由非特异性扩增获得)，它们分别代表待测样品中耐药性基因的测序片段的数量、内源标准基因的测序片段的数量和外源标准基因的测序片段的数量，其结果见表1。

步骤9、根据外源标准基因的测序片段的数量和内源标准基因的测序片段的数量，判断实验是否成功，具体方法如下：

判断实验是否成功的方法为：当外源标准基因的测序片段的数量和内源标准基因的测序片段的数量均≥α1，则实验成功；当外源标准基因的测序片段的数量或内源标准基因的测序片段的数量<α1时，则实验失败；其中，α1为判定阈值。若外源标准基因的量过低，可能是高通量文库构建或高通量测序不成功，若内源标准基因量过低，可能是核酸提取不成功，若实验不成功则针对具体情况进行调整，直至实验成功为止。本实施例中，α1取10条测序片段，从表1可以看出，外源标准基因的测序片段的数量和内源标准基因的测序片段的数量均≥10条，因此，本实施例提供的实验是成功的。

步骤10、若实验成功，则计算待测样品中耐药性基因的含量，具体方法如下：

第m种耐药性基因的含量的计算公式为

其中，i为第m种耐药性基因的第i个测试区域，n1为第m种耐药性基因的测试区域的个数，bi为第m种耐药性基因的第i个测试区域的测序片段的数量，k为第k种内源标准基因，n3为内源标准基因的个数，j为第k种内源标准基因的第j个测试区域，n2为第k种内源标准基因的测试区域的个数，aj为第k种内源标准基因的第j种测试区域的测序片段的数量；N为所有内源标准基因的测试区域的总数。本发明采用平均数计算耐药性基因的含量，是为了减少扩增效率等因素对结果的影响，若检测了每一个多重扩增引物的扩增效率且保证扩增效率在95％-105％之间，那么扩增效率对结果的影响不大，因此，可以仅采用一个多重扩增引物扩增的检测区域来代表耐药性基因、内源标准基因和外源标准基因。

从表1可以看出，本实施例中，共检测了4种耐药性基因，所以m＝4，每一种耐药性基因检测了1个测试区域，所以，n1＝1，共检测了1个内源标准基因，所以n3＝1，每个内源标准基因共检测了1个测试区域，所以，n2＝1，N＝1，表1列出了每一种耐药性基因与每一个内源标准基因的测序片段的数量，将它们代入耐药性基因的含量的计算公式中可得到每一种耐药性基因的含量，其结果见表1。

步骤11、根据耐药性基因的含量判定待测样品是否含有耐药性基因，具体方法如下：

判定待测样品含有耐药性基因的方法为：耐药性基因的含量≥α2时，判定待测样品含有耐药性基因；当所有耐药性基因的含量<α2时，判定待测样品不含有耐药性基因；其中，α2为判定阈值。α2是根据要求的严格程度人为设定，当少量耐药性基因存在即可导致抗生素无效时，α2值应该偏低，相反，可偏高。当缺乏耐药性基因的量与抗生素效果关系时(大部分情况如此)，可将α2值设定为0.1％，以便于在统计误差与灵敏度间获得平衡。在本实施例中，将α2值设定为0.1％。从表1可以看出，本实施例子中，除耐药性基因cepS和APH(3')-Ia外，其它2种耐药性基因的含量均≥α2＝0.1％，因此，判定待测样品为含有耐药性基因为CTX-M-14和blaNDM-1，这2种耐药性基因在环境中存在，采用对应的抗生素类药物进行土壤中生长的植物病害防治可能效果不佳。本实施例通过4对多重扩增引物，一次性地定量检测了4种所耐药性基因的含量。在本实施例的基础上，只需要设置更多的多重扩增引物，即可实现一次定量检测任意多种希望检测的耐药性基因的含量。

验证本实施例的检测结果，具体方法如下：

人工合成表1中的多重扩增引物，逐一利用每一个多重扩增引物对待测样品的DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行琼脂糖电泳检测，发现耐药性基因CTX-M-14和blaNDM-1存在扩增条带，判断为阳性，同时，内源标准基因和外源标准基因均有明显的扩增条带，判定为阳性，cepS和APH(3')-Ia的引物的扩增产物无明显的条带，判定为阴性，该结果与本实施例的检测结果一致。

本发明实施例提供的方法可以检测不同的待测样品，且通用性强，主要不同点在于需要根据待测样品的不同，选择相应的基因组提取方法进行基因组的提取。测序是核酸检测的终极标准，因此本发明实施例检测结果准确度高；测序可以区分单碱基差异，因此本发明实施例耐药性基因检测的分辨高。本发明实施例提供的方法可以在不需要培养与纯化的前提下进行检测，因此，检测是快速的，这对于病情的及时诊断和及时用药十分重要，同时，为不可培养病原物的检测提供了可能。本发明实施例可以检测任意多种耐药性基因，为寻找一种有效预防或治疗疾病的抗生素提供了全面信息。因此，本发明实施例可以一次性的、定量的、快速的、准确的检测任意数量和类型的微生物中的任意多种希望检测的耐药性基因，其效果是现有技术达不到的。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种土壤微生物耐药性基因的检测方法，其特征在于，所述方法包括：

确定待测样品中需要检测的微生物的耐药性基因、所述待测样品中的内源标准基因和所述待测样品的外源标准基因，所述待测样品为土壤；

制备用于扩增所述耐药性基因、所述内源标准基因和所述外源标准基因的测试区域的多重扩增引物；

向所述待测样品中加入所述多重扩增引物不能扩增的外源核酸，得到混合样品；

提取所述混合样品的基因组；

向所述混合样品的基因组中加入所述外源标准基因，获得混合核酸；

利用所述多重扩增引物对所述混合核酸进行扩增，得到扩增产物，利用所述扩增产物构建高通量测序文库；

对所述高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；

分析所述测序片段组，获得所述待测样品中所述耐药性基因的测序片段的数量、所述内源标准基因的测序片段的数量和所述外源标准基因的测序片段的数量，所述外源标准基因的质量与所述混合样品的基因组的总质量的比例大于1/100000；

根据所述外源标准基因的测序片段的数量和所述内源标准基因的测序片段的数量，判断实验是否成功，所述判断实验是否成功的方法为：当所述外源标准基因的测序片段的数量和所述内源标准基因的测序片段的数量均≥α1时，则实验成功；当所述外源标准基因的测序片段的数量或所述内源标准基因的测序片段的数量<α1时，则实验失败；其中，α1为判定阈值；

若所述实验成功，则计算所述待测样品中所述耐药性基因的含量，计算所述待测样品中所述耐药性基因的含量的方法为：第m种所述耐药性基因的含量的计算公式为

其中，i为第m种所述耐药性基因的第i个测试区域，n1为所述第m种所述耐药性基因的测试区域的个数，bi为所述第m种耐药性基因的第i个测试区域的测序片段的数量，k为第k种所述内源标准基因，n3为所述内源标准基因的个数，j为第k种所述内源标准基因的第j个测试区域，n2为第k种所述内源标准基因的测试区域的个数，aj为第k种所述内源标准基因的第j种测试区域的测序片段的数量；N为所有所述内源标准基因的测试区域的总数；

根据所述耐药性基因的含量判定所述待测样品是否含有耐药性基因，判定所述待测样品中是否含有所述耐药性基因的方法为：所述耐药性基因的含量≥α2时，判定所述待测样品含有所述耐药性基因；当所有所述耐药性基因的含量<α2时，判定所述待测样品不含有所述耐药性基因；其中，α2为判定阈值。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述耐药性基因至少为1个，所述内源标准基因至少为1个，所述外源标准基因至少为1个。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述内源标准基因为所述待测样品的微生物中的基因。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述外源标准基因不存在于已知基因组的生物中。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，用于扩增所述耐药性基因的引物的设计区域或扩增区域与所述待测样品中的生物的基因组的其它区域的同源性低于98％。