JP2008538279A - LjunganVirusの検出方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、Ljunganウイルス(LV)を特異的に検出する方法に関する。特に、本発明は、定量的リアルタイム逆転写酵素PCRを使用してLVを検出する方法に関する。本発明はまた、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。
Description
本発明は、Ljunganウイルス(LV)を特異的に検出する方法に関する。特に、本発明は、定量的リアルタイム逆転写酵素PCRを使用してLVを検出する方法に関する。本発明はまた、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。
LVは、ピコルナウイルス科に属し、したがってRNAウイルスである。LVは、ハタネズミ(bank vole)(ヨーロッパヤチネズミ(Clethrionomys glareolus)で最初に同定され、多数の動物において疾患を引き起こすことが知られている。ウイルスの3つの単離株(87−012、174F及び145SL)が、国際特許出願WO98/11133号で開示されており、各単離株の部分配列がそこで開示されている。3つのLVの完全配列は、後に公表された(Johansson et al., J. Virol., 76, 8920-8930, 2002)。
LVプロトタイプ株である87−012、及び2つの他の血清学的に関連されるLV単離株である174F及び145SLの比較配列分析により、これらの新たに確定されたスウェーデンLV株のゲノムは、密接に関連され、以下の異常ピコルナウイルス様機構を有することが明らかとなった(Johansson et al., 2002, 上記):5’UTR−VP0−VP3−VP1−2A1−2A2−2B−2C−3A−3B−3C−3D−3’UTR。
系統発生分析により、LV単離株は、別個の単系統性群を構成し、これはパレコウイルス(Parechovirus)属とともに、ピコルナウイルス科(Picornaviridae)の他の成員から分離されることが示された(Johansson et al., 2002, 上記; Lindberg and Johansson, Virus Res., 85, 61-70, 2002)。さらに、米国オレゴン州で捕獲された別のハタネズミ種(サンガクハタネズミ(Microtus montanus))から単離された別のウイルスであるM1146の完全ゲノム配列により、このウイルスもまた、ピコルナウイルス科の成員であり、スウェーデンで単離されたLVに最も密接に関連され、別個のLVクラスター内の新たな遺伝子型であることが確証された(Johansson et al., J. Gen. Virol., 84, 837-844, 2003)。
LVは、ヒトで見出されており、様々な疾患を引き起こし得る。スウェーデン及び北アメリカのハタネズミにおけるLVの同定により、多数のハタネズミ集団全体にわたる広い地理的範囲に及ぶLVの連続した存在が示唆される。現在、LVの7つの既知の株、即ちスウェーデンに源を発する87−012(NC 003976;AF327920)、174F(AF327921)、145SL(AF327922)及び342SL(B. Niklasson, 未公開データ)、並びに米国に源を発するM1146(AF538689)、NY64−7855(未公開データ)及びNY64−7947(未公開データ)が存在する。NCBI Genbankアクセッション番号又は他の供給源が括弧内に示されている。
遺伝的に、LVゲノム及びコードされるポリタンパク質は、他のピコルナウイルスのVP1で通常見出されるものであって、VP0における保存配列決定因子であるVP0の予測成熟切断の非存在、並びに2つの未関連2Aタンパク質、即ち2A1及び2A2のクラスターのような幾つかの例外的な特徴を示す(Johansson et al., 2002, 上記)。2A1タンパク質は、カルジオウイルス、エルボウイルス、テスコウイルス及びアフトウイルスの2Aタンパク質に関連し、2A2タンパク質は、パレコウイルス、コブウイルス及び鳥類脳脊髄炎ウイルスの2Aタンパク質に関連する(Johansson et al., 2002, 上記; Lindberg and Johansson, Virus Research, 85, 61-70, 2002)。
LVは、そのげっ歯類宿主及び保有宿主において慢性感染又は長時間の感染を特徴とする。LVは、種々の種の動物並びにヒトに感染し、感染は、長時間の感染又は慢性感染をもたらし得る。LVは、多種多様な組織培養細胞において複製して、離散的細胞変性効果(CPE)及び低ウイルス産出量(上清1ml当たり1000〜1000000個程度のウイルス粒子)を伴う慢性感染を付与する。
研究室条件下でのウイルス培養により作成されるデータにより、LVは、種々の組織及び種々の種(例えば、ベロサル腎臓、ベロE6サル腎臓、MA−104サル腎臓、CV−1サル腎臓、GMKサル腎臓、A−549ヒト肺、ヒーラヒト子宮頸部組織、BHK 21ハムスター腎臓、RDヒト筋肉及びL−細胞マウス皮膚)に由来する多数の細胞系において増殖/複製することが示される。
動物及びヒトにおいて、LVは、心臓組織を含む筋肉組織で、脳を含む神経細胞で、並びに膵臓のベータ細胞、甲状腺及び副腎を含む内分泌腺で複製する。
ヒト、ハタネズミ、タビネズミ、実験用マウス、ウサギ、モルモット、ホッキョクギツネ及びヘラジカにおけるLV特異的免疫組織化学試験及び薄片電子顕微鏡法を使用したウイルスの検出に基づくデータにより、LVは、内分泌及び外分泌膵臓組織、血管内皮細胞、脳(神経組織を含む)の細胞、肝臓の細胞、胎盤及び臍帯の細胞、筋肉組織、心臓組織及び甲状腺の組織において見出されていることが示される(Niklasson et al., Ann NY Acad Sci, 1005, 170-175, 2003及び未公開データ)。
したがって、LVは、身体のほとんどの細胞種で成長することができ、その結果身体の全ての臓器に感染することができると結論付けることができる。
LVにとって最も密接に関連される動物ウイルスは、カルジオウイルス属のウイルスである。
類似性
カルジオウイルスは、ピコルナウイルス科に属する。
カルジオウイルスは、それらの自然保有宿主としてげっ歯類を有する。
カルジオウイルスは、多種多様な動物種において疾患を引き起こし得る。
カルジオウイルスは、LVと同じ臓器において感染し、疾患を引き起こし得る。
カルジオウイルスは、ピコルナウイルス科に属する。
カルジオウイルスは、それらの自然保有宿主としてげっ歯類を有する。
カルジオウイルスは、多種多様な動物種において疾患を引き起こし得る。
カルジオウイルスは、LVと同じ臓器において感染し、疾患を引き起こし得る。
差異
カルジオウイルス及びLVは、遺伝的に遠縁である。
LVの二重2Aは、カルジオウイルスでは存在しない。
カルジオウイルスは、血清学によりLVに関連しない。
カルジオウイルスは、げっ歯類以外の動物に感染すると急性疾患(長時間又は慢性ではない)を引き起こす。
カルジオウイルスは、適応なしで組織培養において培養しやすい一方で、LVは多くの場合、組織培養における盲目継代又は乳マウスにおける初代継代なしで、組織培養における乳マウス適応における数回の継代後に培養することは不可能である(Johansson et al., BBRC, 317, 1023-1029, 2004を参照)。
カルジオウイルス及びLVは、遺伝的に遠縁である。
LVの二重2Aは、カルジオウイルスでは存在しない。
カルジオウイルスは、血清学によりLVに関連しない。
カルジオウイルスは、げっ歯類以外の動物に感染すると急性疾患(長時間又は慢性ではない)を引き起こす。
カルジオウイルスは、適応なしで組織培養において培養しやすい一方で、LVは多くの場合、組織培養における盲目継代又は乳マウスにおける初代継代なしで、組織培養における乳マウス適応における数回の継代後に培養することは不可能である(Johansson et al., BBRC, 317, 1023-1029, 2004を参照)。
カルジオウイルスは概して、ヒトに感染しない(文献、例えば、Zimmerman, Encephalomyocarditis, In Handbook: Series of Zoonoses, G.B. Beran (Ed.), CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, USA, 1994及びTesh, Am. J. Trop. Med. Hyg., 27, 144-149, 1978においてほんの稀な事例報告)。
種々の大陸におけるLVの新たな変異体が同定される可能性がある。LVは、多数の疾患状態と関連付けられるため、LVを検出するための簡素な効率的且つ有効な試験を有することが望ましい。LVのみが検出されて、他のピコルナウイルスは検出されないように、試験は特異的である必要がある。さらに、試験は、全てのLV株を検出するのに使用することができ、高度に特異的であり、且つ高感度であることが望ましい。また、ウイルス負荷が確定され得るように、試験はLVの定量測定を可能にすることが望ましい。
国際特許出願WO2004/073710号では、LV感染により引き起こされる疾患を治療するための抗ウイルス剤の使用が開示されている。LVの存在に関して試験することが可能であることにより、特に試験が定量的である場合に、かかる治療の有効性をモニタリングすることができる。
LVの存在に関する現在の試験は、非常に面倒である(例えば、ウイルス培養/単離及び細胞変性効果(CPE)の検出)か、又は感度が十分高くなく(例えば、免疫組織化学試験)、これらは全てのLVを検出しないか、又はLVと他のピコルナウイルスとを有効に識別しない。
したがって、LVを特異的に検出するための簡素な有効な試験が必要である。
本発明は、配列:CTGCRYAGGTGGCTTTCACCTCTSGACAGYGC(配列番号1)の少なくとも13個の連続したヌクレオチドを含む核酸配列を検出することを含む、LVを検出する方法を提供する。
上記方法は、全てのLVを特異的に検出するように設計された。配列番号1又はその逆相補鎖の少なくとも13個の連続したヌクレオチドの存在を検出することにより、全てのLVが、特異的に検出され得る。特に、上記方法は、非Ljunganピコルナウイルスを検出しない。
配列番号1は、LVの5’UTRに存在し、全ての既知のLV株において保存される。この配列は、確実にLVのみが検出されるように、他の非Ljunganピコルナウイルスにおける相当する配列とは十分異なる。
LVという用語は上記で定義する通りであり、好ましくはそのゲノムにおいて2つの未関連2Aタンパク質をコードするピコルナウイルスを意味する。ウイルスが2つの未関連2Aタンパク質をコードするかどうかを確定する方法は、Lindberg et al., Virus Res.,
85, 61-70, 2002に記載されている。LVという用語は、全ての現在既知のLV並びに後に同定されるであろうLVを包含する。新たなLVを同定する方法は、国際特許出願第2004/073710号に記載されている。
85, 61-70, 2002に記載されている。LVという用語は、全ての現在既知のLV並びに後に同定されるであろうLVを包含する。新たなLVを同定する方法は、国際特許出願第2004/073710号に記載されている。
検出されるべき核酸配列は、DNA又はRNA配列であり得る。当業者に明らかであるように、RNA配列が検出された場合、配列におけるチミジンヌクレオチドは、ウラシルヌクレオチドである。好ましくは、cDNA配列が検出される。以下でさらに論述するように、LV RNAは、逆転写酵素を使用することによりcDNAへ逆転写され得る。
或いは、検出される核酸に応じて、配列番号1の逆相補鎖は、本発明の方法を使用して
検出され得る。
検出され得る。
配列番号1の逆相補鎖は、GCRCTGTCSAGAGGTGAAAGCCACCTRYGCAG(配列番号2)である。
検出される核酸配列は、配列番号1又はその逆相補鎖の少なくとも13個の連続したヌクレオチドを含む。好ましくは、検出される核酸配列は、少なくとも15個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも17個の連続したヌクレオチドを含む。検出される核酸配列は、以下の配列:GCTTTCACCTCTSGACA(配列番号3)又はその逆相補鎖を含むことが特に好ましい。
配列番号3の逆相補体は、TGTCSAGAGGTGAAAGC(配列番号4)である。
本発明のヌクレオチド配列において、標準的な命名法によれば、RはA又はGであり、YはC又はTであり、SはG又はCである。これらの用語の使用により配列へ導入されるわずかな変動は、確実に全てのLVが本発明の方法により検出されるために必要とされる。
核酸配列は、任意の適切な技法を用いて検出され得る。好ましくは、核酸配列は、核酸配列へ特異的に結合する1つ又はそれ以上のプローブを使用することにより検出される。特に、検出される核酸配列が配列の点で多様であり得る場合に、1つより多いプローブが使用され得る。例えば、検出される核酸配列が配列番号3を含む場合、2つのプローブが使用されることが好ましい。第1のプローブは、GCTTTCACCTCTGGACA(配列番号5)に特異的にアニーリングし、第2のプローブは、GCTTTCACCTCTCGACA(配列番号6)に特異的にアニーリングして、その結果、配列の両方のバージョンを検出することができる。好ましくは、第1のプローブは、配列TGTCCAGAGGTGAAAGC(配列番号7)を有し、第2のプローブは、配列TGTCGAGAGGTGAAAGC(配列番号8)を有する。或いは、配列番号5及び6の両方にアニーリングすることが可能である1つのプローブを使用することができる。配列番号1において多型が存在し、これはLV単離株を識別するのに使用することができることが既知である。例えば、配列番号1の残基番号24は、スウェーデンLV単離株に関してはGであるが、アメリカLV単離株に関してはCである。種々の配列に対してプローブを区別して標識することにより、どの型のLVが存在するかどうか、又はさらには単離株の型間での比を確定することが可能である。
好ましくは、1つ又はそれ以上のプローブは、検出される配列に対して相補的な配列を有する核酸プローブ(オリゴプローブ)である。「相補的な配列」という用語は、実質的に全て(好ましくは全て)の核酸塩基が、検出される核酸配列中のヌクレオチド塩基と塩基対を形成することが可能である配列を意味する。プローブは、任意の適切なサイズであり得るが、好ましくは25ヌクレオチド長未満、より好ましくは20ヌクレオチド長未満、最も好ましくは17ヌクレオチド長以下である。
プローブは、適切な多環式試薬を使用することにより検出される核酸の副溝で結合することが特に好ましい。副溝で結合することにより、プローブの融点は増大して、比較的短いプローブ(25ヌクレオチド長未満)を設計することを可能にさせる。LVと他のピコルナウイルスとの間の配列が類似しているため、LVの特有の配列が検出され得るように、比較的短いプローブを使用することが望ましい。
プローブは、プラス−センスRNAプローブ、マイナス−センスRNAプローブ及びア
ンチセンスRNAプローブを含む一本鎖又は二本鎖のDNA或いはRNAであり得る。
ンチセンスRNAプローブを含む一本鎖又は二本鎖のDNA或いはRNAであり得る。
核酸に適した標識としては、放射性標識及び非放射性標識(例えば、蛍光、間接的検出系及び化学発光)が挙げられる。
核酸は、標準的な研究室マニュアル(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning:A
Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor, 1989又はCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M., 定期的に更新される)に記載されるもののような技法を使用して、或いはPromega(Southampton, Hampshire, UK)、Roche(Lewes, East Sussex, UK)、Ambion(Huntingdon, Cambridgeshire, UK)及びBD Biosciences/Clontech(San Jose, CA, USA)により供給されるもののような多数の市販のキットの1つを使用して標識され得る。
Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor, 1989又はCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M., 定期的に更新される)に記載されるもののような技法を使用して、或いはPromega(Southampton, Hampshire, UK)、Roche(Lewes, East Sussex, UK)、Ambion(Huntingdon, Cambridgeshire, UK)及びBD Biosciences/Clontech(San Jose, CA, USA)により供給されるもののような多数の市販のキットの1つを使用して標識され得る。
放射性標識としては、32P、33P、35S、125I、3H又は任意の他の放射性同位体が挙げられる。核酸は、5’末端標識、3’末端標識、ニックトランスレーション及び例えば、ランダム6量体又はランダム8量体を使用したランダムプライマー標識を含む当業者に既知の多くの方法の1つを使用して、放射標識され得る。
蛍光標識としては、フルオレセイン、Cy5、Cy5.5及びFAM(6−カルボキシフルオレセイン)又は任意の他の蛍光色素(例えば、TET(テトラクロロ−6−カルボキシフルオレセイン)、JOE(2,7−ジメチルオキシ−4,5−ジクロロ−6−カルボキシフルオレセイン)及びHEX(ヘキサクロロ−6−カルボキシフルオレセイン)が挙げられる。
デンドリマーベースの標識系が存在する。この標識方法はデンドリマーを使用して、200個又はそれ以上の蛍光標識を結合させて、少数の標的分子の検出を可能にする。かかるデンドリマー技術は、例えば、Genisphere, Bala, Cynwyd, PA, USAにより生み出されている。
或いは、「Quantum Dots」又は「Luminex Beads」という名称の下で製造されるナノ粒子のような既知の粒子を適用させてもよい。Quantum Dotsは、例えば、Quantum Dot Corporation, Hayward, CA, USAから入手され得る。
国際公開第00/18965号は、突然変異又は多型の存在の検出を対象にする方法を開示している。特に、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)及び蛍光標識されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを使用して、ハイブリダイゼーションプローブの融解曲線分析に基づいて突然変異及び多型を同定する。使用されるフルオロフォアは、適切であると当該技術分野で既知の多数の種々の化合物(臭化エチジウム、YO−PRO−1及びSYBR Green Iを含む)の1つである。
蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)は、2つのハイブリダイゼーションプローブの隣接したアニーリングに依存する(Lay and Wittwer, Clin. Chem., 43, 2262-2267, 1997)。第1のプローブは、その3’末端にドナー色素を含有し、他方は、その5’末端にアクセプター色素を含有する。光が外部源から加えられると、ドナー色素は励起されて、蛍光共鳴エネルギー移動のプロセスでエネルギーをアクセプター色素へ移動させる。両方のプローブが近接近してアニーリングする場合のみ、エネルギー移動が可能である。したがって、かかる技法により、特異的配列への相補的なプローブの結合の検出が可能となる。
別の検出系は、エキソヌクレアーゼプローブを使用することを含む。かかるプローブは、レポーター及びクエンチャー色素を含み、ここでクエンチャーは、レポーター由来の任
意のシグナルを防止する。プローブは、標的配列を含有する領域がPCRにより増幅される方法で使用される。プローブは、所望の標的部位へ結合して、ポリメラーゼがプローブに至ると、ポリメラーゼは、プローブを障害として扱い、プローブを小さく切断することによりプローブを除去する。続いて、クエンチャーは、レポーターから分離されて、レポーターが検出され得る。
意のシグナルを防止する。プローブは、標的配列を含有する領域がPCRにより増幅される方法で使用される。プローブは、所望の標的部位へ結合して、ポリメラーゼがプローブに至ると、ポリメラーゼは、プローブを障害として扱い、プローブを小さく切断することによりプローブを除去する。続いて、クエンチャーは、レポーターから分離されて、レポーターが検出され得る。
間接的検出系は、内部組込み、末端標識又は化学修飾のいずれかによる、プローブ分子へのハプテン修飾されたヌクレオチドの組込みを含む。ハプテンの例としては、ジゴキシゲニン、ビオチン、スルホン化塩基及びジニトロフェノールが挙げられる。ハプテンは、いったんプローブへ組み込まれると、アルカリホスファターゼのようなシグナル伝達酵素に共有結合された親和性リガンドにより検出される。一般的に使用されるリガンドとしては、ストレプトアビジン、アビジン及び抗体(モノクローナル及びポリクローナル)が挙げられる。或いは、ビオチンへ共有結合された核酸挿入部分であるソラレンを使用することができる。ソラレン−ビオチンは、核酸(一本鎖又は二本鎖)内に挿入して、続いて、長波長UV光による照射により共有結合される。
直接的検出方法は、核酸プローブ、通常は合成オリゴヌクレオチドへのシグナル伝達酵素の直接的共有結合を使用する。この直接的結合は、二次試薬を添加する必要性を排除して、検出工程の数及びシグナル対ノイズの問題を低減させる。シグナル伝達酵素、例えばビオチンは、ビオチン化されたプライマーを用いた酵素重合により、又はビオチン化されたヌクレオチド三リン酸の存在下での重合により、直接的に核酸プローブへ組み込ませることができる。
フコース標識系は、任意のスルフィドリル反応性化合物を連結させることができる普遍的な光活性化可能部分又は熱活性化可能部分を結合させることにより、ハプテン、蛍光色素又は親和性リガンドを、任意の核酸へ結合させるのに使用され得る。FastTag核酸標識系のようなフコース標識キットが、Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA.
USAで市販されている。
USAで市販されている。
好ましくは、プローブは、一本鎖DNAプローブである。
LVはRNAウイルスであるため、核酸配列の検出に先立って、逆転写が実施されることが好ましい。逆転写は、当業者に既知の標準的な技法である。DNAプライマーは、RNA配列へアニーリングされて、プライマーは、逆転写酵素の作用により伸長される。プライマーの配列は、RNA配列に相補的でなくてはならない。プライマーは、配列番号1の少なくとも13個の連続したヌクレオチドを含むcDNA配列の生産を可能にする位置で、RNA配列へアニーリングしなくてはならない。当業者は、かかるDNA配列の生産を可能にする適切なプライマーを容易に確定することができる。
好ましくは、プライマーは、配列番号1に近いLVの保存配列へ(例えば、配列番号1を有する200個のヌクレオチド内で)アニーリングする。LVの保存配列へアニーリングすることにより、方法の特異性はさらに改善される。
特に好ましい実施形態では、配列GCCCAGAGGCTAGTGTTACCA(配列番号9)を含むプライマーが、LjunganウイルスRNAを逆転写させるのに使用される。
LjunganウイルスRNAを逆転写させることにより、ウイルスRNAへのプライマーアニーリングの特異性が、特異性のレベルを増大させるため、検出方法が改善される。ウイルスRNAがプライマーに相補的な配列を有さなくてはならないだけでなく、逆転
写されたDNA配列は、配列番号1の少なくとも13個の連続したヌクレオチドを含まなくてはならない。
写されたDNA配列は、配列番号1の少なくとも13個の連続したヌクレオチドを含まなくてはならない。
本発明の方法は以下の工程を含むことが特に好ましい。
(a)配列番号1の少なくとも13個の連続したヌクレオチドを含むDNA配列が得られるように、LV RNAを逆転写させる工程、
(b)上記DNA配列を増幅させる工程、及び
(c)上記増幅されたDNA配列の存在を検出する工程。
(a)配列番号1の少なくとも13個の連続したヌクレオチドを含むDNA配列が得られるように、LV RNAを逆転写させる工程、
(b)上記DNA配列を増幅させる工程、及び
(c)上記増幅されたDNA配列の存在を検出する工程。
上述するように、増幅されたDNA配列は、任意の既知の方法により検出され得る。好ましくは、増幅されたDNA配列は、プローブを使用することにより検出される。
LV RNAは、任意のRNAであり得るが、但し、逆転写されると、配列番号1の少なくとも13個の連続したヌクレオチドを含むDNA配列が得られる。LV RNAは、上述するように逆転写され得る。
逆転写により得られるDNA配列は、任意の適切な方法により増幅され得る。好ましくは、DNA配列は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅される。任意の適切なプライマーが、配列番号1の少なくとも13個の連続したヌクレオチドを含むDNA配列を増幅させるためにPCR反応で使用され得る。
特許請求される方法の特異性を増大させるために、配列番号1の少なくとも13個の連続したヌクレオチドを含むDNA配列を増幅させるのに使用されるプライマーは、LV RNAから逆転写されるDNAのみが増幅され、別のウイルスに由来するRNA又はDNAは増幅されないように選択することが好ましい。プライマー間の距離は、DNA配列を増幅させるのに使用されるTaqポリメラーゼの限界に依存する。好ましくは、DNA配列を増幅させるのに使用されるプライマー間の距離はは、200ヌクレオチド未満である。
好ましくは、配列番号1の少なくとも13個の連続したヌクレオチドを含むDNA配列を増幅するのに用いられるプライマーは、以下の:
配列TAGGGGCTGTACCCGGGCGGTCCCACTCTTCACAG(配列番号10)又はその少なくとも13個の連続したヌクレオチドを有する順方向プライマー、及び
配列GACATGCCTTTTGGGCCCAGAGGCTAGTGTTACCACTAGGGG(配列番号11)又はその少なくとも13個の連続したヌクレオチドを有する逆方向プライマー
を含む。
配列TAGGGGCTGTACCCGGGCGGTCCCACTCTTCACAG(配列番号10)又はその少なくとも13個の連続したヌクレオチドを有する順方向プライマー、及び
配列GACATGCCTTTTGGGCCCAGAGGCTAGTGTTACCACTAGGGG(配列番号11)又はその少なくとも13個の連続したヌクレオチドを有する逆方向プライマー
を含む。
好ましくは、順方向プライマーは、配列番号10の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む。好ましくは、逆方向プライマーは、配列番号11の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む。
特に好ましい実施形態では、順方向プライマーは、配列:
GCGGTCCCACTCTTCACAG(配列番号12)
を有する。
GCGGTCCCACTCTTCACAG(配列番号12)
を有する。
特に好ましい実施形態では、逆方向プライマーは、配列:
GCCCAGAGGCTAGTGTTACCA(配列番号9)
を有する。
GCCCAGAGGCTAGTGTTACCA(配列番号9)
を有する。
好ましくは、PCRで使用される逆方向プライマー及びLV RNAを逆転写させるのに使用されるプライマーは同一であり、それによりたった2つのプライマー、好ましくは上述した順方向プライマー及び逆方向プライマーを使用して、RT−PCRをLV RNAで実施することが可能となる。
サンプル中のLVの量を確定することを可能にする定量的PCRが実施されることが特に好ましい。さらに、サンプル中のLVの量を確定することが可能であることにより、Ljunganウイルス感染の進行又は後退が判定され得る。これにより、研究者が治療の有効性をモニタリングすることが可能となる。
定量的PCR手順は、当業者に既知である。特に、リアルタイムPCR手順及びカイネティックPCR手順。
実施されるPCR手順は、エキソヌクレアーゼプローブ(TaqManプローブとしても既知)を使用したリアルタイムPCR手順であることが特に好ましい。エキソヌクレアーゼプローブの使用は上述されている。
本発明の方法は、LVに感染されている疑いのある任意のサンプルで実施され得る。適切なサンプルとしては、組織サンプル及び体液サンプルが挙げられる。特に好ましいサンプルとしては、筋肉組織サンプル(特に心臓組織)、神経細胞サンプル(特に、脳細胞)、内分泌腺サンプル(例えば、膵臓のベータ細胞、甲状腺又は副腎サンプル)及び白血球(例えば、バフィコート)が挙げられる。白血球が最も好ましいサンプルである。RNAは、任意の標準的な手順を使用して、例えばQIAampウイルスRNAキット(Qiagen,
Hilden, Germany)を使用することによりかかるサンプルから抽出することができる。
Hilden, Germany)を使用することによりかかるサンプルから抽出することができる。
本発明の特に好ましい一実施形態では、サンプル中でLVを検出する方法であって、
(a)上記サンプルからRNAを単離する工程、
(b)配列番号1の少なくとも13個の連続したヌクレオチドを含むDNA配列を得るために上記RNAを逆転写させる工程、及び
(c)エキソヌクレアーゼプローブを使用した定量的PCRを実施する工程
を含む方法が提供される。
(a)上記サンプルからRNAを単離する工程、
(b)配列番号1の少なくとも13個の連続したヌクレオチドを含むDNA配列を得るために上記RNAを逆転写させる工程、及び
(c)エキソヌクレアーゼプローブを使用した定量的PCRを実施する工程
を含む方法が提供される。
本発明はまた、本発明の方法を実施するためのキットであって、配列番号1の少なくとも13個の連続したヌクレオチドへ特異的に結合する少なくとも1つの標識プローブを含むキットを提供する。
好ましくは、本発明のキットはまた、配列番号1の少なくとも13個の連続したヌクレオチドを含む核酸配列を増幅させるためのプライマー、及び上記核酸配列を増幅させるための必須試薬を含む。適切な試薬は、当業者に既知であり、緩衝液、Taqポリメラーゼ及びデオキシヌクレオチドが挙げられる。上記キットはまた、配列番号1の少なくとも13個の連続したヌクレオチドを含むDNA配列が得られるようにLV RNAを逆転写させるためのプライマー、及び上記RNAを逆転写させるための必須試薬を含んでもよい。適切な試薬は、当業者に既知であり、緩衝液、逆転写酵素及びデオキシヌクレオチドが挙げられる。
ここで、本発明は、以下の図面を参照するとともに以下の実施例を参照することにより記載される。
研究設計及びサンプル
LVは、これまでに記載されたようにAmerican Type Culture Collection(ATCC)からのハタネズミのBHK−21細胞において単離された(Niklasson et al., Virology,
255,86-93, 1999)。細胞培養上清は、ミドリザル腎臓細胞(ATCC)に対して継代し、又は1日齢乳マウスにおいて脳内注射することで増殖させた。設計したリアルタイムRT−PCRアッセイを試験するために、乳マウス脳(SMB)から調製されたLVプロトタイプ株87−012由来のRNAを、外部標準PCR対照として使用した(TCID50:6.2×103)。標準曲線は、インハウスLV挿入片組換えプラスミドの10倍段階希釈物を使用して作成した。特異性試験は、陽性対照として使用した6つの異なるLV株のストックから単離されたウイルスRNAを用いて実施したのに対して、種々のウイルスで感染させた19個の細胞培養上清、2つの臨床検体及び他のウイルス(最も密接に関連されるヒトパレコウイルス1型、脳心筋炎ウイルス−EMCV及びタイレルマウス脳脊髄炎ウイルス−TMEVを含む)の1つのDNA標準由来の核酸を陰性対照として使用した(表2を参照)。
LVは、これまでに記載されたようにAmerican Type Culture Collection(ATCC)からのハタネズミのBHK−21細胞において単離された(Niklasson et al., Virology,
255,86-93, 1999)。細胞培養上清は、ミドリザル腎臓細胞(ATCC)に対して継代し、又は1日齢乳マウスにおいて脳内注射することで増殖させた。設計したリアルタイムRT−PCRアッセイを試験するために、乳マウス脳(SMB)から調製されたLVプロトタイプ株87−012由来のRNAを、外部標準PCR対照として使用した(TCID50:6.2×103)。標準曲線は、インハウスLV挿入片組換えプラスミドの10倍段階希釈物を使用して作成した。特異性試験は、陽性対照として使用した6つの異なるLV株のストックから単離されたウイルスRNAを用いて実施したのに対して、種々のウイルスで感染させた19個の細胞培養上清、2つの臨床検体及び他のウイルス(最も密接に関連されるヒトパレコウイルス1型、脳心筋炎ウイルス−EMCV及びタイレルマウス脳脊髄炎ウイルス−TMEVを含む)の1つのDNA標準由来の核酸を陰性対照として使用した(表2を参照)。
LV株145SLで腹腔内的に感染させた6匹の研究室マウス、及び1週後に屠殺した4匹の非感染マウス由来の60個の異なる組織サンプル(脳、肝臓、肺、腎臓、膵臓及び心臓から収集)、妊娠中にLVに感染して、子宮内死(IUD)の症状を示した5匹の研究室マウスの胎盤サンプル、IHCによりLV陽性であると予めわかっている子癇前症を伴う4人のスウェーデン人患者の6つの異なるサンプル(胎盤/臍)、並びにセミネステッドRT−PCRによりLV陽性であると予めわかっているブタ(SMB 941)由来の1つのSMB単離株においてLV感染の存在を確認するために新たなPCRアッセイを適用した(サンプルは全て、Apodemus AB, Stockholm, Swedenによりご好意により提供された)。
オリゴヌクレオチド設計及び合成
プライマー及び副溝結合体(MGB)プローブを慎重に設計した。選択したプライマー組は、LVゲノムの5’非翻訳領域(5’−UTR)における187bpフラグメントを増幅する。以下のLVヌクレオチド配列(それぞれのNCBI GenBankアクセッション番号又は他の供給源を伴う)がプライマー及びプローブ設計に関するアラインメント研究に含まれた:LV 87−012(アクセッション番号NC 003976、AF327920)、174F(アクセッション番号 AF327921)、145SL(アクセッション番号 AF327922)、M1146(アクセッション番号 AF538689)及びNY64−7855(未公開データ)。
プライマー及び副溝結合体(MGB)プローブを慎重に設計した。選択したプライマー組は、LVゲノムの5’非翻訳領域(5’−UTR)における187bpフラグメントを増幅する。以下のLVヌクレオチド配列(それぞれのNCBI GenBankアクセッション番号又は他の供給源を伴う)がプライマー及びプローブ設計に関するアラインメント研究に含まれた:LV 87−012(アクセッション番号NC 003976、AF327920)、174F(アクセッション番号 AF327921)、145SL(アクセッション番号 AF327922)、M1146(アクセッション番号 AF538689)及びNY64−7855(未公開データ)。
使用したプライマーは、5'−GCGGTCCCACTCTTCACAG−3’(配列番号12)(順方向、nt255〜274)及び5'−GCCCAGAGGCTAGTGTTACCA−3’(配列番号9)(逆方向、nt 442〜424)であった。アンプリコン特異的MGBプローブは、5’末端で蛍光レポーター色素FAM(6−カルボキシフルオレセイン)及び3’末端でダーククエンチャーMGB(副溝結合体)で標識された5’−TGTCCAGAGGTGAAAGC−3’(配列番号7)(MGBc、nt 306〜290)並びに5’−TGTCGAGAGGTGAAAGC−3’(配列番号8)(MGBg、nt306〜290)であった。ヌクレオチド位置は、NCBI配列GenBankアクセッション番号NC 003976を参照する。プライマーは、TIB MOLBIOL(Berlin, Germany)から、またプローブは、Applied Biosystems(Warrington-Cheshire,
UK)から入手した。
UK)から入手した。
RNA抽出及びcDNA合成
サンプルからのRNAは、種々の商業用キット(例えば、Qiagen)により、或いは特に繊維組織サンプルに関しては、CsClクッションに通したグアニジニウムチオシアネー
ト溶解産物の超遠心に関するChirgwinのプロトコル(Chirgwin et al., Biochemistry, 18, 5294-5299, 1979)により単離され得る。汚染は、Schowengerdt et al., J. Heart Lung
Transplant., 15, 111-123, 1996によりこれまでに記載されているように、サンプルの均質化の間制御された。
サンプルからのRNAは、種々の商業用キット(例えば、Qiagen)により、或いは特に繊維組織サンプルに関しては、CsClクッションに通したグアニジニウムチオシアネー
ト溶解産物の超遠心に関するChirgwinのプロトコル(Chirgwin et al., Biochemistry, 18, 5294-5299, 1979)により単離され得る。汚染は、Schowengerdt et al., J. Heart Lung
Transplant., 15, 111-123, 1996によりこれまでに記載されているように、サンプルの均質化の間制御された。
cDNAを得るために、サンプルRNA5μlを、50mM トリス−HCl(pH 8.3)、75mM KCl、3.0mM MgCl2、0.125mM(それぞれ)dATP、dCTP、dGTP及びdTTP、10mM ジチオスレイトール、RNasin(Promega, Mannheim, Germany)10U、マウス白血病ウイルス逆転写酵素(Invitrogen,
Karlsruhe, Germany)50U並びに0.125μM 逆方向プライマーを含有する最終反応容量10μl中で逆転写させた。サイクルパラメータは、Biometra TRIOサーモブロックサイクラー(Biometra,Gottingen,Germany)上で60℃で5分、37℃で20分及び95℃で5分であった。
Karlsruhe, Germany)50U並びに0.125μM 逆方向プライマーを含有する最終反応容量10μl中で逆転写させた。サイクルパラメータは、Biometra TRIOサーモブロックサイクラー(Biometra,Gottingen,Germany)上で60℃で5分、37℃で20分及び95℃で5分であった。
リアルタイムPCR
TaqMan−PCRは、96ウェルマイクロタイタープレートフォーマット(ABgene,
Epsom-Surrey, UK)で実施した。PCRミックスは、cDNA鋳型2.5μl、50mM
トリス塩酸塩(pH9)、50mM KCl、4mM MgCl2、0.2mM(それぞれ)dATP、dCTP、dGTP及びdUTP、ウラシル−N−グリコシラーゼ(UNG)(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)0.5U、Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)1.25U、0.1μM(それぞれ)の順方向プライマー及び逆方向プライマー、0.1μM(それぞれ)の蛍光標識したMGBプローブ並びに受動的参照としての1.0μM ROXを含有する25μlの容量で構成させた。50℃で2分間のアンプリコン相互汚染を回避するためのUNG処理、及び95℃で10分間の初期変性後に、ABI Prism 7700配列検出器(Applied Biosystems, Foster City, Ca., USA)上で35回の2段階サイクル(95℃で15秒、60℃で30秒)により、DNAを増幅させた。
TaqMan−PCRは、96ウェルマイクロタイタープレートフォーマット(ABgene,
Epsom-Surrey, UK)で実施した。PCRミックスは、cDNA鋳型2.5μl、50mM
トリス塩酸塩(pH9)、50mM KCl、4mM MgCl2、0.2mM(それぞれ)dATP、dCTP、dGTP及びdUTP、ウラシル−N−グリコシラーゼ(UNG)(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)0.5U、Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)1.25U、0.1μM(それぞれ)の順方向プライマー及び逆方向プライマー、0.1μM(それぞれ)の蛍光標識したMGBプローブ並びに受動的参照としての1.0μM ROXを含有する25μlの容量で構成させた。50℃で2分間のアンプリコン相互汚染を回避するためのUNG処理、及び95℃で10分間の初期変性後に、ABI Prism 7700配列検出器(Applied Biosystems, Foster City, Ca., USA)上で35回の2段階サイクル(95℃で15秒、60℃で30秒)により、DNAを増幅させた。
臨床サンプルからのRNA調製物の品質は、Radonic et al., Biochem. Biophys. Res.Commun., 313, 856-862, 2004によりこれまでに記載されているように、ヒトグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)及びRNAポリメラーゼII(RPII)に特異的な2つの参照遺伝子定量的リアルタイムRT−PCRアッセイにより試験した。
インハウスLV挿入片コントロールプラスミドの生成
LV 87−012からの外部標準PCR対照のTaqポリメラーゼ増幅PCR産物を、アガロースゲル電気泳動により調べた。単一の分離している187bpバンドを、アガロースゲルから切除して、製造業者の指示書に従ってQIAquickゲル抽出キット(Qiagen, Hilden, Germany)で抽出した。
LV 87−012からの外部標準PCR対照のTaqポリメラーゼ増幅PCR産物を、アガロースゲル電気泳動により調べた。単一の分離している187bpバンドを、アガロースゲルから切除して、製造業者の指示書に従ってQIAquickゲル抽出キット(Qiagen, Hilden, Germany)で抽出した。
抽出したPCR産物を、ベクタープラスミドへクローニングして製造業者の指示書に従って(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)、pcDNA3.1/V5−His−TOPO TA発現キットで形質転換E.coli細胞へ伝播させた。187bpフラグメントの挿入片コントロールは、T7及びBGH逆方向シーケンシングプライマーを用いて行った。LV挿入片を有するプラスミドは、製造業者の指示書に従ってQIAGENプラスミドMiniキット(Qiagen, Hilden, Germany)を用いて、陽性E.coliコロニーから単離された。
配列分析
アンプリコンは、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen, Hilden, Germany)を使用
して精製して、377 DNA自動シーケンサー(Applied Biosystems, Foster City, Ca., USA)上でBig Dyeターミネーターサイクルシーケンシングキット(Applied Biosystems, Warrington-Cheshire, UK)を用いて直接配列決定して、NCBI BLASTソフトウェア(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)で分析した。
アンプリコンは、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen, Hilden, Germany)を使用
して精製して、377 DNA自動シーケンサー(Applied Biosystems, Foster City, Ca., USA)上でBig Dyeターミネーターサイクルシーケンシングキット(Applied Biosystems, Warrington-Cheshire, UK)を用いて直接配列決定して、NCBI BLASTソフトウェア(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)で分析した。
結果
本発明のインハウスLV挿入片プラスミドの10倍希釈物(希釈物1つ当たり6つの複製)を使用して、希釈物に対して閾値サイクル値(CT)をプロットする標準曲線を作成した(図1)。代表的な標準曲線は、10個のコピーの検出限界で、6桁、即ち1〜106個のコピー/アッセイにわたるリアルタイムPCRアッセイにおける高い線形相関を実証する(R2=0.9956)。アッセイ内の精度は、1回の実験(3シリーズ)において6回、インハウスLV挿入片プラスミドの3つのウイルス陽性対照調製物(101、102及び103個のコピー/アッセイ)を1人の作業者が加工処理することにより評価し、アッセイ間精度は、異なる作業者(それぞれ1シリーズ)により実施される3つの異なる実験において6回、同じ対照を加工処理することにより評価した。各アッセイに関する平均CT値及び標準偏差(SD)は、表1で比較されており、結果が非常に再現可能であることを示している。
本発明のインハウスLV挿入片プラスミドの10倍希釈物(希釈物1つ当たり6つの複製)を使用して、希釈物に対して閾値サイクル値(CT)をプロットする標準曲線を作成した(図1)。代表的な標準曲線は、10個のコピーの検出限界で、6桁、即ち1〜106個のコピー/アッセイにわたるリアルタイムPCRアッセイにおける高い線形相関を実証する(R2=0.9956)。アッセイ内の精度は、1回の実験(3シリーズ)において6回、インハウスLV挿入片プラスミドの3つのウイルス陽性対照調製物(101、102及び103個のコピー/アッセイ)を1人の作業者が加工処理することにより評価し、アッセイ間精度は、異なる作業者(それぞれ1シリーズ)により実施される3つの異なる実験において6回、同じ対照を加工処理することにより評価した。各アッセイに関する平均CT値及び標準偏差(SD)は、表1で比較されており、結果が非常に再現可能であることを示している。
上記方法の特異性は、陽性対照として6つの異なるLV株から精製されたRNAを、またさらに陰性対照として22個の異なるウイルスサンプル由来の核酸を使用して評価した。LV cDNAサンプルは全て、PCRで陽性であり、アンプリコンは配列分析から単離することができたのに対して、陰性対照はいずれも、リアルタイムPCR分析における偽陽性シグナルに寄与しなかった(表2)。陽性PCRの結果は、PCR産物の配列分析により確認することができ、「スウェーデン」LV株と「非スウェーデン」LV株とで識別され得る(データは示さず)。
新たな定量的リアルタイムRT−PCRアッセイを適用させて、げっ歯類及びヒトの両方由来の種々のサンプル型におけるLV感染の存在を確認した。LV株145SLで腹腔内的に感染させ、1週後に屠殺した6匹の研究室マウスの種々の臓器から収集した36個の組織サンプルのうち33個(92%)が、PCRスクリーニングでLV陽性であった。高いウイルス負荷は、初期サンプル重量に対して組織1mg当たり最大107個のウイルスコピーを有する脳組織サンプルで見出すことができる一方で、4匹の非感染研究室マウスはいずれも、試験した臓器のいずれにおいても陽性ではなかった(データは示さず)。さらに、妊娠中にLV感染されて、IUDの症状を示す5匹の研究室マウスの全ての胎盤サンプルにおいて、LVゲノム配列は、この新たな方法により検出することができ、組織1mg当たり2.4×103個のウイルスコピーと5.0×106個のウイルスコピーとの間のウイルス負荷(平均値1.8×106個のコピー)を示した(データは示さず)。さらに、IHCによりLVに関して陽性であると予めわかっている子癇前症を伴う4人のスウェーデン人の患者由来の6個の胎盤/臍サンプルのうち2個(33%)において、及びセミネステッドRT−PCRによりLV陽性であると予めわかっている1つのブタ単離株(SMB 941)において、LVゲノム配列は、この確立されたリアルタイムRT−PCRにより確認することができる(表3)。相対的に、全ての試験において使用されるLV 87−012のLV外部標準PCR対照におけるウイルス負荷(表2を参照)は、これらの弱い陽性サンプルよりも70倍高かった。それにもかかわらず、陽性PCRの結果は、LVプロトタイプ株87−012に対して98%を上回る配列相同性を有するPCR産物の配列分析により確認することができる(データは示さず)。
考察
LVは、げっ歯類に保因されるヒト疾患の原因物質とみなされるため、動物及びヒトの両方由来の様々な種類の組織又は液体においてウイルスを検出するための信頼性が高く且
つ高感度のアッセイが必要とされる。
LVは、げっ歯類に保因されるヒト疾患の原因物質とみなされるため、動物及びヒトの両方由来の様々な種類の組織又は液体においてウイルスを検出するための信頼性が高く且
つ高感度のアッセイが必要とされる。
3つの作業が、本明細書で提示される5’−UTR−PCRアッセイの設計に必須であった:
1.LVの全ての株に特異的であるが、ピコルナウイルスの他の考え得る型の検出を排除する5’−UTRにおける適切な/保存標的配列を見出すこと;
2.1回のアッセイで同時に、LVの全ての既知のスウェーデン株及びアメリカ株、並びにまた多岐にわたる株を検出すること;及び
3.動物及びヒト患者の両方由来の種々の型のサンプルにおいてLVゲノムの低いウイルス負荷でさえ定量化すること。
1.LVの全ての株に特異的であるが、ピコルナウイルスの他の考え得る型の検出を排除する5’−UTRにおける適切な/保存標的配列を見出すこと;
2.1回のアッセイで同時に、LVの全ての既知のスウェーデン株及びアメリカ株、並びにまた多岐にわたる株を検出すること;及び
3.動物及びヒト患者の両方由来の種々の型のサンプルにおいてLVゲノムの低いウイルス負荷でさえ定量化すること。
7個の既知のLV株のうちの5個に関する配列データに基づいて、本発明者等は、全ての既知のLV株(ヌクレオチド位置302で多型であるとみなされる、グアニジンは、スウェーデンLV株を表し、シトシンは、アメリカLV株を表す(NCBI配列GenBankアクセッション番号NC 003976を参照))を専ら検出することが可能な保存5’−UTRに特異的な2つのMGBプローブを包含する新たな定量的リアルタイムRT−PCRアッセイを開発した。標的配列におけるほんの短い一続きの保存DNAに起因して、本発明者等は、LV特異的核酸の検出用に従来のTaq−Man(登録商標)プローブ(およそ20〜30量体)に代わってMGB−プローブ(17量体)を使用することに決めた。使用されるプローブは、3’末端で非蛍光クエンチャーを有するため、MGB技術は、蛍光レポーター色素の正確な検出を容易にする。さらに、副溝結合体は、プローブの融点を増大させて、より短いプローブを設計することが可能であり、したがってそれらの標的配列に対するミスマッチの危険性を回避する(Kutyavin et al., Nucleic Acids Res., 28, 655-661, 2000)。1回のアッセイで全ての既知のLV株及び他の多岐にわたるLV株を検出するために、本発明者等は、2つの異なるMGB結合された蛍光原DNAプローブを適用した(整列されたLVゲノム配列において、配列番号1におけるヌクレオチド位置24でグアニン又はシトシンのどちらか一方の多型であるとみなされる)。一塩基多型に特異的であり、且つ同じ蛍光レポーター色素と結合された2つの異なるMGBプローブの同時適用は、新規であるとみなされる。プライマー及びプローブ設計に関するそれらの算出に基づいて、選択される標的配列及び確立されるアッセイは、上述の要求に応じてLVの5’−UTR特異的配列のスクリーニングに関する最適な適用を表す。5’−UTR内部の他の領域を使用することによる他の代替手段は、特にプローブを位置付ける際に困難を招く。
新たなアッセイは、10個のウイルスコピー/アッセイの検出限界で高感度を有し、サンプル材料から直接単離した6桁にわたるLV RNAの信頼性できる定量化を可能にする。LV陰性対照(最も密接に関連されるヒトパレコウイルス1型、EMCV及びTMEVを含む)はいずれも、特異性試験で陽性として検出されることはなかった。アッセイの高い特異性は、リアルタイムPCRに関して選択されるプライマー及びプローブにより、及びcDNA合成を開始させるのに使用される特異的プライマーにより保証される。さらに、アッセイ内精度及びアッセイ間精度に関する結果は、このアッセイが高い再現性を有することを示す。
このアッセイは、げっ歯類及びヒトの両方由来の種々の研究室サンプル並びに臨床サンプルで試験されて、LVゲノム配列に関して高い検出スコアをもたらした。IHCによりLVに関して陽性であると予めわかっている6個のヒト胎盤/臍プローブのうち2個、及びセミネステッドRT−PCRによりLV陽性であると予めわかっているブタ由来の1つのSMB単離株はまた、この新たなアッセイにより弱陽性と検出され、配列分析によりLVに関連すると確認することができた。
免疫組織学的に事前試験した胎盤/臍サンプルの33%のみが、この高感度ウイルス核酸検出技法により確認することができ、IHCによるウイルス抗原検出のような従来の検出方法は、概してこの方法に関して一般的な問題である他のピコルナウイルスとの交差反応に起因して幾つかの偽陽性の結果をもたらし得ることを示唆する。例えば細胞変性効果(CPE)のウイルス単離及び検出のような他の現在の試験は、非常に面倒であり、効率的にLVを検出しない(Johansson et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 317, 1023-1029, 2004)。しかしながら、この研究における結果により、定量的リアルタイムRT−PCRは、LV RNA負荷が低いものも含めて種々の型のサンプルに適用することができることが示された。
結論として、これらの結果により、ヒト疾患におけるLVの判定を達成することができることが示される。幾つかの人獣共通感染症で見られるように、ヒトは多くの場合、行き止まり宿主であり、患者からよりも、保有宿主又はベクターから病原体を単離することは、より容易であり得る。また、初期感染と疾患の発症との間の時間は、感染因子は非常に少量でのみ存在し得るか、或いは存在し得ない。しかしながら、本明細書で示されるように、本発明の方法の適用を使用して、種々の種類の組織及び液体において少量のウイルス核酸でさえ検出することができ、本発明の方法の適用は、血清学的分析及びIHCのほかに、多数の疾患に関するヒト病原体としてのLVの役割を解明するのを助ける。種々のげっ歯類集団及び臨床サンプル由来の大量の環境サンプルにおけるLVの同定は、幾つかの地理的領域におけるLVの分布に関するより正確な図画を導くはずであり、ヒト集団に関してもたらされる危険性を算出するのを助けるはずである。
非近交系CD1マウス(CD−1(ICR)Br Charles River laboratories, Germany)を、出生の1日後におよそ1000ID50を有するLV株145SL(GenBank acc番号.AF327922)で腹腔内的に感染させた。動物は、Astrid Fagraeus Laboratory, Swedish Institute for Infectious Disease Control (Stockholm, Sweden)で保持して、感染後の種々の時点で屠殺した。臓器を取り出して、それぞれ凍結させる(第1の部分)か、或いはRNAlater(登録商標)緩衝液(Ambion, USA)中に即座に入れた(第2の部分)。組織は、PCR分析のためにRobert Koch-Institute (Berlin,
Germany)へ発送した。RNA抽出は、上述のように実施した。抽出したRNAを逆転写して、ウイルス負荷は、上述したように判定した。抽出手順を確証するために、全ての臓器は、逆転写及びTaqMan(登録商標)PCR(TibMolBiol, Berlin, Germany)により、ハウスキーピング遺伝子としてのヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)mRNAに関して試験した。試験した臓器は全て、HPRT mRNAに関して陽性であった。
Germany)へ発送した。RNA抽出は、上述のように実施した。抽出したRNAを逆転写して、ウイルス負荷は、上述したように判定した。抽出手順を確証するために、全ての臓器は、逆転写及びTaqMan(登録商標)PCR(TibMolBiol, Berlin, Germany)により、ハウスキーピング遺伝子としてのヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)mRNAに関して試験した。試験した臓器は全て、HPRT mRNAに関して陽性であった。
研究の第1の部分では、未知の性の6匹の感染マウスを、感染の6日後(6dpi)に屠殺して、全てが、脳炎の臨床的徴候を有した。脳、心臓、膵臓、肺、腎臓及び肝臓は、組織学及びPCRにより分析した。組織学的観察により、脳において組織損傷が示された。最高のウイルス負荷は、脳(107個のコピー/μg(総RNA))、続いて心臓及び膵臓(およそ104,5個のコピー/μg(総RNA))で見られた。肺及び肝臓では、およそ104個のウイルスコピー/μg(総RNA)を検出することができた。最低のウイルス負荷は、腎臓(103個のコピー)で見られた(図2)。
4匹の非感染対照マウス由来の臓器は全て、LVに関して陰性であった。
この研究中、本発明者等は、性及びストレスが、研究室マウス並びにハタネズミにおいてLV感染の結末にとって重要な役割を果たし得るという研究室観察からの証拠を得た。性及びストレスが重要な要因であるか不明な研究の第1の部分と対比して、第2の部分で
は、雄マウスのみを包含して、ストレス下で保持した。すなわち、3〜4匹の動物を25日目から一緒に保持した。2〜4匹のマウスを種々の時点で屠殺して、脳、心臓、膵臓、肺、腎臓、肝臓、脾臓及び糞便を、上述したようにウイルスRNAに関して分析した(13dpi:n=4;17、27、56、98、130及び174 dpi:n=4)。膀胱及び胸腺サンプルは、可能である場合に収集した。
は、雄マウスのみを包含して、ストレス下で保持した。すなわち、3〜4匹の動物を25日目から一緒に保持した。2〜4匹のマウスを種々の時点で屠殺して、脳、心臓、膵臓、肺、腎臓、肝臓、脾臓及び糞便を、上述したようにウイルスRNAに関して分析した(13dpi:n=4;17、27、56、98、130及び174 dpi:n=4)。膀胱及び胸腺サンプルは、可能である場合に収集した。
感染の急性期に、動物は、同じ組織像により同様に脳炎の臨床的症状を有した。脳炎を生き延びた動物(死亡率 およそ30%)は糖尿病を発症した。
研究した臓器は全て、第1の研究と同様に感染の急性期において類似したウイルス負荷を伴ってLVに関して陽性であると試験された。最高のウイルスコピーは、同様に脳(106個のコピー/μg(総RNA) 13dpi)、続いて心臓(104個のコピー/μg(総RNA) 13dpi)で見られた。最低のウイルスコピーは、肝臓及び腎臓(約5×102個のコピー/μg(総RNA) 13dpi)で見られた。時間が経つにつれ、ウイルス負荷は、全ての臓器において減少して、低レベル(10〜103個のコピー/μg(総RNA))を持続した(図3)。胸腺では、ウイルス負荷は、他の臓器と比較して低かった(それぞれ、200個のコピー/μg(総RNA) 13dpi及び3個のコピー/μg(総RNA) 56dpi)。膀胱は、加齢動物から取り出すことができた(それぞれ、98及び130dpi)。これらの臓器における検出ウイルス負荷は、それぞれ300個のコピー/μg(総RNA)(98dpi)及び90個のコピー/μg(総RNA)(130dpi)であった。
本研究により、研究室マウスにおけるLV感染は、PCRを使用して検出することができることが示される。
本発明者等は、上述のPCR法を使用して1型糖尿病を最近発症した子供から得られた白血球サンプルにおいてLVを検出した(試験した8人のうち8人が陽性)。LVはまた、多発性硬化症を伴う12人の患者のうち12人において検出された。対照患者では、LVは、試験した30人の患者のうち1人で見られた。検体は全て、白血球サンプルであった。LV陽性PCRの結果は、PCR産物の配列分析により確証されている。
上記で引用した文献は全て、参照により本明細書に援用される。
Claims (30)
- CTGCRYAGGTGGCTTTCACCTCTSGACAGYGC(配列番号1)の配列又はその逆相補配列の少なくとも13個の連続したヌクレオチドを含む核酸配列を検出する工程を含む、LVを検出する方法。
- 検出されるべき前記核酸配列がRNA配列である、請求項1に記載の方法。
- 検出されるべき前記核酸配列がDNA配列である、請求項1に記載の方法。
- LV RNAをcDNAへ逆転写させる初期工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 検出される前記核酸配列は、配列番号1又はその逆相補配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 検出される前記核酸配列は、配列番号1又は逆相補配列の少なくとも17個の連続したヌクレオチドを含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 検出される前記核酸配列は、
GCTTTCACCTCTSGACA(配列番号3)
の配列又はその逆相補配列を含む、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。 - 前記核酸配列は、配列番号1又はその逆相補配列の少なくとも13個の連続したヌクレオチドへ特異的にハイブリダイズする少なくとも1つの標識プローブを使用することにより検出される、前記請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標識プローブは、25ヌクレオチド長未満である、請求項8に記載の方法。
- 前記標識プローブは、17ヌクレオチド長以下である、請求項8に記載の方法。
- 前記標識プローブは、検出される前記核酸の副溝で結合する、請求項8〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プローブは、一本鎖DNAプローブである、請求項8〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プローブは、エキソヌクレアーゼプローブである、請求項8〜11のいずれか1項に記載の方法。
- DNAプライマーは、配列番号1の少なくとも13個の連続したヌクレオチドを含むDNA配列の産生を可能にする位置で、前記RNA配列へアニーリングされ、該プライマーは、逆転写酵素の作用により伸長される、請求項4に記載の方法。
- 前記プライマーは、GCCCAGAGGCTAGTGTTACCA(配列番号9)の配列を有する、請求項14に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、
(a)配列番号1の少なくとも13個の連続したヌクレオチドを含むDNA配列が得られるように、LV RNAを逆転写させる工程、
(b)前記DNA配列を増幅させる工程、及び
(c)前記増幅されたDNA配列の存在を検出する工程
を含む方法。 - 前記増幅されたDNA配列は、プローブを使用することにより検出される、請求項16に記載の方法。
- 前記DNA配列は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅される、請求項16又は17に記載の方法。
- 前記PCR反応で使用されるプライマーは、配列番号1の少なくとも13個の連続したヌクレオチドを含むDNA配列を増幅させる、請求項18に記載の方法。
- 請求項19に記載の方法であって、
TAGGGGCTGTACCCGGGCGGTCCCACTCTTCACAG(配列番号7)の配列又はその少なくとも13個の連続したヌクレオチドを有する順方向プライマー、及び
CCCCTAGTGGTAACACTAGCCTCTGGGCCCAAAAGGCATGTC(配列番号8)の配列又はその少なくとも13個の連続したヌクレオチドを有する逆方向プライマー
を含む方法。 - 前記順方向プライマーは、
GCGGTCCCACTCTTCACAG(配列番号12)
の配列を有する、請求項20に記載の方法。 - 前記逆方向プライマーは、
TGGTAACACTAGCCTCTGGGC(配列番号9)
の配列を有する、請求項20又は21に記載の方法。 - 定量的PCRが実施される、請求項18〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 実施される前記PCR手順は、リアルタイムPCR手順であり、エキソヌクレアーゼプローブが、前記増幅されたDNA配列を検出するのに使用される、請求項18〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記LVは、組織サンプル又は体液サンプル中で検出される、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サンプルは、筋肉組織サンプル、神経細胞サンプル、内分泌腺サンプル又は白血球サンプルである、請求項25に記載の方法。
- サンプル中でLVを検出する方法であって、
(a)前記サンプルからRNAを単離する工程、
(b)前記RNAを逆転写させて、配列番号1の少なくとも13個の連続したヌクレオチドを含むDNA配列を得る工程、及び
(c)エキソヌクレアーゼプローブを使用した定量的PCRを実施する工程
を含む方法。 - 請求項1に記載の方法を実施するためのキットであって、配列番号1の少なくとも13個の連続したヌクレオチドへ特異的に結合する少なくとも1つの標識プローブを含むキッ
ト。 - 配列番号1の少なくとも13個の連続したヌクレオチドを含む核酸配列を増幅させるためのプライマー、及び該核酸配列を増幅させるために必要な試薬をさらに含む、請求項28に記載のキット。
- 配列番号1の少なくとも13個の連続したヌクレオチドを含むDNA配列が得られるようにLV RNAを逆転写させるためのプライマー、及び該RNAを逆転写させるために必要な試薬をさらに含む、請求項28又は29に記載のキット。
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