KR20100080450A

KR20100080450A - 핵산 염색제를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응을 통한 ｈｃｖ 검출방법

Info

Publication number: KR20100080450A
Application number: KR1020090133176A
Authority: KR
Inventors: 이동환; 강진석; 이재성; 박영석; 김동현
Original assignee: 주식회사 엘지생명과학
Priority date: 2008-12-29
Filing date: 2009-12-29
Publication date: 2010-07-08
Also published as: KR101755037B1; US20100173284A1; US8258283B2

Abstract

본 발명은 특정 프라이머 및 프로브를 포함하는 단단계 반응 (single step) 수행을 위한 HCV 검출용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 서열번호 1 및 2의 프라이머 서열을 포함하는 단단계 반응 수행을 위한 HCV 검출용 조성물, 상기 프라이머 서열 및 서열번호 5 또는 서열번호 9의 프로브를 동시에 포함하는 단단계 반응 수행을 위한 HCV 검출용 조성물, 개체로부터 시료를 수득하는 단계 및 상기 프라이머 및 프로브를 이용한 증폭 및 검출 단계를 포함하는 단단계 반응을 특징으로 하는 HCV 검출방법, 및 상기 프라이머 및 프로브를 포함하는 키트에 관한 것이며, 상기 HCV 검출방법은 단단계 반응임을 특징으로하는 HCV 검출방법에 관한 것이다.

HCV, 검출, 프라이머, 프로브, 단단계 반응

Description

핵산 염색제를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응을 통한 ＨＣＶ 검출방법 {Method for detection of HCV at the real time PCR with intercalating dye}

본 발명은 특정 프라이머 및 프로브를 포함하는 단단계 반응 수행을 위한 HCV 검출용 조성물에 관한 것으로서, 서열번호 1 및 2의 프라이머 서열을 포함하는 단단계 반응 수행을 위한 HCV 검출용 조성물, 서열번호 5 또는 서열번호 9의 프로브를 포함하는 단단계 반응 수행을 위한 HCV 검출용 조성물을 이용하여 혈액에서 HCV를 검출하는 방법에 관한 것이다.

C형 간염 바이러스 (Hepatitis C virus, HCV)는 간염의 원인 바이러스로 급성 간염에서 만성 간염, 간경변 및 간암으로 진행되는 매우 위험한 질병을 일으키는 요인으로서, 주로 수혈과 체액에 의해 감염되는 것으로 알려져 있다. 상기 바이러스는 전세계적으로 약 4억 명 가량이 감염되어 있는 것으로 추정되는데, 유럽, 부미, 일본 등의 선진국에서는 전 인구의 0.2-2%, 남미, 아시아 등에서는 2-5%, 대부분의 아프리카 국가에서는 5% 이상이 감염되고 있으며, 우리나라에서도 전 인구 의 1.6%인 80만 명 가량이 HCV에 감염되어 있는 것으로 추정되고 있다 (Park et al, J. Viral hepa., 2:195-202, 1995). 또한 B형 간염 바이러스와는 달리, 감염자의 50-85%가 만성 간염으로 진행될 정도로 예후가 좋지 않은 바이러스이며, RNA 바이러스라는 특성 때문에 아직까지 적절한 치료제 및 백신 개발은 물론 기초적인 연구도 확립되지 못한 실정이다.

HCV는 약 9,500개의 염기와 3,000여개의 아미노산으로 이루어진 양성-가닥 RNA (positive-strand RNA) 바이러스로 3개의 구조 단백질과 6개의 비구조 단백질을 생성하는 하나의 ORF (open reading frame)으로 이루어져 있다.

일반적으로 HCV의 감염 여부를 측정할 때, HCV의 혈중내 농도가 매우 낮고 RNA 바이러스라는 특성 때문에 항원 검사를 할 수가 없어 항체 검사법만을 시행하고 있다. 그러나 이 방법은 HCV의 잠복기간을 감안하면 바이러스 감염 후 6개월이 경과되어야 정확한 항체 검사가 가능할 뿐만 아니라 감염자의 10%는 항체가 발견되지 않아 HCV 양성 혈액을 수혈에 사용할 위험성 등이 매우 높은 단점이 존재한다. 이와 같이 항체 검사법은 정확성이 떨어지므로 HCV RNA를 직접 확인할 수 있는 역전사 PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)법을 이용하여 정확한 감염 여부를 판단하고 있는데, 이러한 RT-PCR법은 역전사 및 PCR을 분리해서 실험해야 되는 등 실험과정이 복잡하여 많은 노동력과 시간이 소요될 뿐만 아니라, 기존의 방법으로 두 효소를 동시 사용하여 실시했을 경우 특이도 및 민감도가 떨어지고 정량성이 부족하다는 단점이 있어 왔다.

즉, 특정 핵산이나 유전자의 존재의 유무를 조사하고자 하는 경우에 이용하는 PCR법 등의 핵산 증폭방법은, 시료에서 핵산을 추출할 필요가 있다. 이 핵산을 추출하는 과정에서, 핵산의 손실이 생기는 것을 피하기가 어렵다. 예를 들어, 시료 중에 증폭하기 위한 주형으로서 필요한 양의 표적 핵산이 포함되어 있었다고 해도, 핵산 추출과정의 손실에 의해 주형으로서 필요한 양이 회수되지 않은 경우에는 증폭 효율이 저하되기 때문에 표적 핵산을 충분히 증폭할 수 없고, 시료 중의 표적핵산을 검출할 수 없는 경우가 생길 수 있다. 이러한 경우는, 위음성이 되어 정확한 결과가 얻어지지 않는다. 또 동일한 시료를 이용한 경우라도, 핵산 추출과정의 손실 정도에 따라 다른 결과가 얻어질 가능성이 있고, 재현성이 부족하게 된다. 즉, 핵산의 추출을 필요로 하는 핵산 증폭방법에 있어서, 시료 중에 포함되는 표적의 핵산이 매우 미량인 경우에, 핵산 추출과정의 핵산의 손실에 의해 증폭효율의 저하에 따라 검출감도의 저하를 초래한다는 문제점이 있다. 또한, 증폭반응을 저해하는 물질 (예를 들면, 헤파린, 게면 활성제, 단백질 변성제, 유기 용매 등)이 시료 용액 내에 포함되어 있는 경우가 있고, 상기와 마찬가지로 증폭효율의 저하에 기인하는 검출감도의 저하를 초래한다는 문제도 있다.

본 발명자들은 이러한 문제점에 착안하여 예의 노력한 결과, 시료 중에 포함되어 있는 표적핵산인 미량의 HCV를 이용하여 정확하고 신속하게 HCV 핵산을 검출함으로써, HCV 감염 의심 개체에 대한 감염 여부를 정확하게 진단할 수 있는 단단계 반응으로의 HCV 핵산 검출방법을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 서열을 포함하는 HCV (Hepatitis C virus) 검출용 조성물 또는 서열번호 5 또는 서열번호 9의 프로브 서열을 추가로 포함하는 단단계 반응 (single step) 수행을 위한 HCV 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 개체로부터 시료를 수득하는 단계; 및 상기 프라이머 및 프로브를 이용한 증폭 및 검출 단계를 포함하는 단단계 반응임을 특징으로하는 HCV 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 및 프로브를 포함하는 HCV 검출용 키트를 제공하는 것이다.

따라서 하나의 양태로서 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 서열을 포함하는 단단계 반응 수행을 위한 HCV (Hepatitis C virus) 검출용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어, "프라이머 (primer)"란 짧은 자유 3말단 수산화 기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형 (template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 HCV 5'-UTR에 특이적인 신규의 프라이머로서, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 센스 프라이머 및/또는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 안티센스 프라이머이며, 본 발명은 상기 프라이머 및 서열번호 5 또는 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프로브를 포함하는 HCV 검출용 조성물을 제공한다. 바람직하게 본 발명은 상기와 같은 5'-UTR에 특이적인 프라이머 및 프로브를 이용하여 HCV의 혈중 내 검출에 대한 뛰어난 민감도 및 특이도를 제공할 수 있다. 구체적인 프라이머의 서열은 하기 표 1과 같다.

프라이머의 염기서열

이름	염기서열	길이	서열번호
CVFOR	CCC CTG TGA GGA ACT WCT GTC TTC	24	1
CVREV	GCA GAC CAC TAT GGC TCT CC	20	2
ICFOR-1	CGA TGG CCC TGT CCT TTT ACA TTT A	25	3
ICREV-1	CTT TTC GTT GGG ATC TTT GAT TAA A	25	4
ICFOR-2	CCT CCG TTC GCG TTT ACG	18	7
ICREV-2	TTG GCC CCA GTC GAG TTA A	19	8

상기 표 1의 CVFOR은 HCV 5'-UTR에 특이적인 신규의 정방향 프라이머로 그 염기 서열은 서열번호 1에 기재되어 있고, CVREV는 HCV 5'-UTR에 특이적인 신규의 역방향 프라이머로 그 염기 서열은 서열번호 2에 기재되어 있다. ICFOR-1은 GFP에 특이적인 내부 대조군 정방향 프라이머로 그 염기 서열은 서열번호 3에 기재되어 있고, ICREV-1은 GFP에 특이적인 내부 대조군 역방향 프라이머로 그 염기 서열은 서열번호 4에 기재되어 있다. ICFOR-2는 MS2 박테리오 파지에 특이적인 내부 대조군 정방향 프라이머로 그 염기 서열은 서열번호 7에 기재되어 있다. ICREV-2는 MS2 박테리오 파지에 특이적인 내부 대조군 역방향 프라이머로 그 염기 서열은 서열번호 8에 기재되어 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "HCV (Hepatitis C virus)"란 C형 간염을 의미하고, 주로 혈액을 통하여 전염되는 간염의 일종으로, 1989년 처음으로 발견되었으며, 크게 급성과 만성으로 구분된다. 급성의 경우, 증상은 A형 또는 B형 간염과 비슷하며, 대부분 아무런 증상 없이 지나가고 독감과 같은 증상이 나타나기도 하는데 별도의 치료 없이도 호전되기도 한다. 만성의 증상도 B형 간염과 유사한데, 쉽게 피곤하거나 열이 나며, 구역질, 근육통 또는 관절통 증상이 나타난다. 증세가 장기간 지속되면 간경화증이나 간암으로 발전할 가능성이 높으므로 지속적인 검사가 필요한 질병으로서, 진단방법으로는 PCR을 이용한 방법이 있으나, 상기 PCR을 이용한 진단 방법은 시료 채취 후 증폭 및 검출 단계를 별개로 수행하여야 하는 바 불편이 존재하였다. 본 발명은 상기와 같은 진단 방법에 있어서, 5'-UTR 부위의 프라이머 및 프로브를 사용하고, 증폭 및 검출 단계를 하나의 반응 용기 내에서 단단계 반응으로 수행함으로써 진단의 편리성을 증대시키는 한편, 민감도 및 특이도가 높은 진단률을 제공할 수 있다.

바람직한 양태로서 본 발명은 상기 프라이머 서열에 의해 증폭되는 핵산을 검출하기 위하여 프로브(probe) 서열을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "프로브 (probe)"란, 올리고뉴클레오타이드 (즉, 뉴클레오타이드 서열)를 말하는 것으로, 자연적으로 발생하거나, 합성적으로, 재조합적으로, 또는 PCR 증폭에 의해 생산되는 것으로, 목적하는 다른 올리고뉴클레오타이드에 대해 최소 부분에 결합할 수 있다. 프로브는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 프로브는 특정 서열의 검출, 정의 및 분리에 유용하다. 바람직한 양태로서, 본 발명에 사용된 프로브는 형광성, 방사성, 및 발광성 시스템을 포함할 수 있고, 다른 검출 시스템에서 검출할 수 있도록 "리포트 분자"로 표지될수 있다. 본 발명은 특별한 검출 시스템 또는 라벨에 제한되지 않는다. 바람직하게 본 발명의 프로브는 서열번호 5 또는 서열번호 9로 제시되는 프로브이며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 프라이머 및 프로브를 사용하여 HCV의 존부에 대해 민감도 및 특이성이 높은 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다.

바람직한 하나의 양태로서 본 발명은 상기 프로브의 5' 말단 및 3' 말단에 형광 물질을 포함하는 프로브일 수 있다. 하나의 바람직한 양태로서, 상기 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에 각각 형광물질이 표지되어 있고, 5' 말단에 표지된 형광 물질(reporter)과 3' 말단에 표지된 형광물질(quencher)은 상호 간섭 현상을 나타내는 것일 수 있다. 이에 따라, 프로브가 시료에 존재하는 5'-UTR에 결합된 상태에서는 발색이 제한되고, 중합효소 연쇄반응의 수행시 프로브가 분해되면서 5' 말단에 표지된 형광 물질은 소실되는 반면 3' 말단에 표지된 형광물질이 발색 반응을 하게 된다. 이와 같은 상기 발색 반응에 의하여 시료로 부터 HCV의 존부를 판단할 수 있게 된다.

상기 5' 말단에 표지될 수 있는 형광 물질 당업계에서 통상적으로 사용되는 형광물질이 제한없이 사용될 수 있으며, 예를 들면, 6-카르복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein,FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인 (hexachloro-6-carboxyfluorescein,HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인 (tetrachloro-6-carboxyfluorescein), Cyanine-5(Cy5) 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 5' 말단 형광물질이 제한되는 것은 아니다.

3' 말단에 표지될 수 있는 형광물질 또한 당업계에서 통상적으로 사용되는 형광물질이 제한없이 사용될 수 있으며, 그 예로, 6-카르복시테트라메틸-로다민 (6-carboxytetramethyl-rhodamine, TAMRA), BHQ-1,2,3 (black hole quencher-1,2,3) 등이 있으나 상기 예에 의해 본 발명에서 사용될 수 있는 형광물질이 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 서열번호 5의 프로브, 서열번호 6의 프로브, 및 서열번호 9의 프로브의 염기서열은 하기 표 2와 같다.

프로브의 염기서열

이름	5'	염기서열(5'->3')	3'	길이	서열번호
CVFAM-1	FAM	CTA GCC ATG GCG TTA GTA YGA GTG TCG	TAMRA	27	5
CVFAM-2	FAM	CTA GCC ATG GCG TTA GTA YGA GTG TYG	TAMRA	27	9
ICCy5	Cy5	ATT ACC TGT CCA CAC AAT CTG CCC TT	BHQ3	26	6

표 2의 CVFAM-1 및 CVFAM-2는 HCV 바이러스 5'-UTR 부위를 표적으로 하는 프로브로 그 염기서열은 각각 서열번호 5 및 서열번호 9에 기재되어 있으며, 5' 말단은 FAM으로 3' 말단은 TAMRA로 표지되어 있다. 또한, ICCy5는 GFP를 표적으로 하는 프로브로 그 염기서열은 서열번호 6에 기재되어 있으며 5' 말단은 Cy5로 3' 말단은 BHQ3으로 표지되어 있다.

본 발명에서 상기 서열번호 1의 프라이머, 서열번호 2의 프라이머 및 서열번호 5 또는 서열번호 9의 프로브는 HCV 바이러스의 5'-UTR 부위를 표적으로 하는 프라이머 및 프로브이다. 상기 5'-UTR은 약 340 bp로 HCV 유전자에서 가장 보존이 잘 되어 있는 부위로써 스템-루프 (Stem-loop) 구조로 되어 있으며 IRES (internal ribosomal entry site)를 지니고 있다 (Tsukiyama-Kohara 등, 1992).

상기 HCV 유전자에 특이적인 프라이머 및 프로브는 실시간 중합효소 연쇄반응에 적합한 100bp 정도의 길이를 갖는 PCR 증폭 산물을 형성할 수 있으며, 특히, 5'-UTR에 특이적인 프로브는 테크만 분석법(taqman assay) 또는 분자 비콘 분석법 (molecular beacon assay)에 의한 PCR 정량 분석시 유용하게 사용될 수 있다.

이와 같은 프라이머 및 프로브 서열은, 본 발명자들은 염기서열 분석을 통하여 위양성 및 위음성의 위험이 적은 부위를 연구한 결과, HCV 유전자만을 증폭할 수 있는 프라이머 염기서열이고, NIBSC에서 제공하는 공인된 Genotype Panel (code 02/202)을 이용한 시험에서 100% 양성 예측률을 나타냄으로써 위양성 및 위음성의 위험이 극히 적다는 것을 확인하였다. 따라서, 서열번호 1의 프라이머, 서열번호 2의 프라이머 및 서열번호 5 또는 서열번호 9의 프로브를 사용하는 경우 매우 신뢰성 있게 혈액 내에서 HCV 감염을 검출할 수 있다.

바람직한 양태로서 본 발명은, 위양성 및 위음성을 최소화 하기 위하여 내부 대조군으로써 추가 프라이머 및 프로브를 포함할 수 있다. 내부 대조군은, 비교를 위하여 내부에 대조군을 설정함으로써 위양성 및 위음성을 방지하기 위한 표지자로 작용한다.

바람직하게 상기 내부 대조군은 식물로부터 유래한 GFP (Green Fluorescence Protein) 또는　RNA 바이러스, 특히 MS2 박테리오파지일 수 있으며, 더욱 바람직하게 상기 GFP 프라이머 서열이 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 프라이머 또는 상기 MS2 프라이머 서열이 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재되는 프라이머를 포함할 수 있다 (표 1 참조).

이와 같은 위음성을 방지하기 위한 내부 대조군 프라이머 및 프로브는 식물 유래의 유전자인 GFP (Green Fluorescence Protein) 유전자 또는 MS2 박테리오파지에 특이적인 프라이머 및 프로브로써, 상기 HCV 유전자에 특이적인 프라이머 및 프로브의 실시간 중합효소 연쇄반응을 저해하지 않고 별개로 PCR 증폭 산물을 형성함으로써 특히 낮은 농도의 HCV 검출에 있어서 내부 대조군의 PCR 증폭 산물 형성으로 인해 HCV PCR 증폭 산물 형성이 저해되지 않아, 위음성을 보다 효과적으로 방지할 수 있게 된다. 더욱이 RNA 바이러스를 내부 대조군으로 사용하는 경우 naked RNA 혹은 DNA가 아닌 전체 바이러스 입자를 내부 대조군으로 사용하는 것이므로 사용 물질의 안정성을 확보함과 동시에, RNA 추출과정, 역전사 과정(Reverse Transcription) 및 PCR 과정에 대한 보다 정확한 검증을 할 수 있다. 내부 대조군에 대한 프로브의 염기서열은 상기 표 2와 같다.

바람직한 양태로서 본 발명은, 하나의 반응 용기 내에서 HCV의 존부를 검출하기 위하여 PCR에 필요한 효소를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게 추가되는 효소는 MMLV 및 HS-Taq일 수 있다.

MMLV는 역전사 효소 (Reverse transcriptase)중 하나로서, MMLV (Moloney Murine Leukiemia Virus) 역전사 효소로부터 코딩된 RNA-의존성 DNA 폴리머레이즈 (polymerase)이다. 상기 MMLV 역전사 효소는 프라이머와 하이브리다이제이션 (hybridization)함으로써 단일-가닥 RNA 주형으로부터 보완적인 DNA를 합성할 수 있다. 본 발명의 MMLV는 HCV RNA 주형을 DNA로 전환시킴으로서 이후의 증폭반응을 가능하게 하여 시료로부터 HCV의 존부를 검출할 수 있게 한다.

HS-Taq은 열 처리에 의해 활성화되는 Taq DNA 폴리머레이즈로부터 변형된 것으로서 활성 부위에 효소가 부착되어 실온에서는 효소가 불활성을 나타내게 되므로, 증폭 과정에서 잘못된 프라이머가 신장 (extend)되지 않아, 일반적인 DNA 폴리머레이즈와 비교하여 높은 특이성과 높은 수율을 나타낼 수 있다.

기존 MMLV와 HS-Taq을 사용하는 RT-PCR의 경우 MMLV를 이용한 역전사 반응을 실시하여 형성된 산물을 일부를, 다른 반응 용기에 옮겨 HS-Taq을 이용한 PCR을 분리 수행하여야 했는 바, 1차로 역전사 반응을 수행한 산물의 양에 따라 정량적인 결과가 달라지게 되고, 그 양에 따라 PCR이 저해되는 현상 등이 발생하기도 하여 HCV 검출이 어려웠을 뿐만 아니라 2번의 반응을 수행해야 함으로써 시험자에게 불편을 초래하는 문제점이 있어 왔다.

이에 반하여 본 발명은, MMLV과 HS-Taq 조성 조절 및 완충용액의 조성을 조절함으로써 특정 유전자 검출에 있어 정량성을 갖추고 단일 반응용기내에서 1회의 반응 (단단계 반응)으로 효과적으로 특정 유전자를 검출할 수 있는 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 조성물을 사용하면, 역전사 반응 및 PCR을 동시에 수행하여 실험과정에 불필요한 노동력과 시간 소요를 줄임으로써 실험자에게 편의를 제공함과 동시에 높은 특이도와 민감도 및 정량성을 제공할 수 있다.

본 발명의 상기 프라이머, 프로브, MMLV, HS-Taq 및 완충용액 등의 구체적인조성은 하기 표 3과 같다.

	첨가물	투입량 (㎕)
프라이머	100 μM CVFOR	0.25
	100 μM CVREV	0.25
	100 μM ICFOR	0.25
	100 μM ICREV	0.25
프로브	100 μM CVFAM	0.15
프로브	100 μM ICCy5	0.15
PCR 반응물	5X MMLV Buffer	10
	200U MMLV	0.625
	2.5U HS-Taq	1
	2mM dUNTP	3.5
	40U Rnasin	0.2
추출된 RNA		20
Milli-Q Water		13.375
합계		50

상술한 바와 같이 MMLV 및 HS-Taq의 두가지 효소를 이용하면, 단일 반응용기 내에서 역전사 반응 (Reverse Transcription) 및 증폭 반응을 동시에 수행함으로써, 1회의 반응으로 HCV를 검출할 수 있는 정성 분석 방법을 제공할 수 있다. 본 발명은 단회 반응 용기에서 증폭반응을 제공하고, 바람직하게 상기 표적 증폭반응은 PCR 반응일 수 있으며, PCR 반응의 수행조건은 하기 표 4와 같다.

실시간 PCR 반응 조건

온도/시간	반복 회수
46℃/45분 또는 42℃/30분	1
95℃/10분	1
95℃/15초 62℃/60초 72℃/20초	45

또 하나의 바람직한 양태로서 본 발명은 완충용액, DNA 중합효소, dNTP 및 멸균 증류수를 추가로 포함하는 단단계 반응 수행을 위한 HCV 검출용 조성물일 수 있다.

상기 완충용액, DNA 중합효소, dNTP 및 멸균 증류수는 당업계에서 통상적으로 사용되는 용액, 효소등이 제한없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 표 3의 조성에 따른 HCV 검출용 조성물 일 수 있다.

다른 하나의 양태로서 본 발명은 개체로부터 시료를 수득하는 단계; 및 상기 프라이머를 이용한 증폭 및 상기 프로브를 이용한 검출 단계를 포함하는 단단계 반응을 특징으로하는 HCV의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 시료는 HCV의 서열이 포함되어 있을 것이라고 예상하는 시료이면 제한없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 HCV 의심 개체의 혈액으로부터 수득되는 시료임이 바람직하다.

바람직하게 본 발명의 증폭 단계는 당업계에서 통상적으로 사용될 수 있는 핵산 서열을 증폭시킬 수 있는 방법이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 PCR 반응일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물을 이용하여 임상검체로부터 추출한 RNA와 함께 하나의 반응 용기 내에서 HCV 유전자를 RNA에서 DNA로 변환 시키는 동시에, 변환된 DNA를 증폭시키고 생성된 산물을 실시간으로 분석 검출하는 실시간 중합효소 연쇄반응(real time PCR) 분석을 수행할 수 있다.

이러한 실시간 중합효소 연쇄반응(real time PCR) 분석은 시판되고 있는 실시간 중합효소 연쇄반응기기를 사용하여 수행될 수 있는 바, 실시간 중합효소 연쇄반응기기의 예를 들면, SLAN real time PCR detection system (LG 생명과학, 한국), LightCyclerTM (Roche, Germany), ABI PRISMTM 7000/7700 (Applied Biosystems, USA), iCyclerTM (Bio-Rad, USA), Rotor-GeneTM(Corbett, Australia), OpticonTM (PharmaTech, USA) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게 본 발명의 증폭 단계 및 검출 단계는 하나의 반응 용기 안에서 이루어지며, 단단계 반응으로 수행될 수 있다.

상기 서술한 바와 같이, 기존의 방법은 역전사 반응으로 생성된 DNA 산물의 일부를, 다른 반응 용기에 옮겨 PCR을 분리 수행함으로써 특정 유전자를 검출하는 방법이어서 1차로 역전사 반응을 수행한 산물의 양에 따라 정량적인 결과가 달라질 뿐만 아니라, 그 수득량에 따라 PCR이 저해되는 현상 등이 발생하기도 하여 HCV 검출이 어려운 문제점이 있었으며, 2번의 반응을 수행해야 함으로써 시험자에게 불편을 초래하였다. 그러나 본 발명은 MMLV과 HS-Taq 조성 조절 및 완충용액의 조성을 조절함으로써 특정 유전자 검출에 있어 정량성을 갖추고 단일 반응용기내에서 1회의 반응으로 효과적으로 특정 유전자를 검출할 수 있는 조성물을 제공하며, 그 조성은 상기 표 3에 나타낸 바와 같다.

또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 프라이머 및 프로브를 포함하는 HCV 검출용 키트에 관한 것이다.

바람직하게 키트의 구성으로는, 본 발명의 서열을 갖는 프라이머 및 프로브, 및 내부 대조군으로서의 프라이머 서열 및 프로브를 포함하는 키트로 제조될 수 있으며, HCV의 검출을 위하여 완충용액, KCl, MgCl₂, dNTP를 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 표 3의 조성을 가진 키트를 사용함으로써, 하나의 반응 용기 내에서 단단계 반응으로, HCV의 증폭 및 검출이 가능한 키트를 제조할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기와 같은 조성을 갖는 조성물을 제조하여 높은 민감도 및 특이도를 갖고 HCV 검출될 수 있음을 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하고, 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 실시간 중합 PCR 법을 이용하면 HCV 바이러스 감염에 대한 검출을 기존 방법과 비교하여 동등한 수준의 민감도와 특이도로 수행할 수 있다. Abbott와 같은 기존 HCV Real Time PCR 의 경우 Tth와 같은단일 효소가 역전사 및 PCR을 수행하는 고가의 효소를 사용하는 방식인데 비해 본 발명에서는 MMLV와 HS-Taq과 같이 저렴한 효소를 이용하여 동등이상의 진단 결과를 수행할 수 있어 HCV 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

실시예 1. 프라이머 및 프로브의 제작

본 발명에서 사용하는 HCV 특이 프라이머와 프로브는 미국립보건원 산하 NCBI에서 운영하는 유전자은행 (www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록되어 있는 겐뱅크 (genebank) NC000962 염기서열을 hitachi 소프트웨어사의 DNAsis 프로그램을 이용하여 분석한 다음 그 염기서열을 결정하고, 이를 다시 BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)로 분석하여 HCV 바이러스 (HCV Virus)의 유전자만을 증폭할 수 있는 프라이머 염기서열임을 확인하였다.

RNA 바이러스 또는 식물 유래 유전자 특이 프라이머와 프로브는 염기서열을 확보한 후 MMLV와 HS-Taq를 이용하여 단일 반응 용기 내에서 역전사 및 PCR을 동시에 수행하여 HCV를 검출하는 조성물내에서 CV 특이 프라이머와 프로브와 경쟁적으로 저해하지 않는 염기서열을 실험을 통해 결정하였다.

실시예 2. 상기 프라이머 (primer)의 합성

실시예 1에서 분석한 프라이머는 molecular cloning 3판 (sambrook 및 rusell, cold spring harbor laboratory press, New York, USA, 2001년)의 10.42에 기술된 올리고뉴클레오타이드 합성과 같은 방법을 이용하여 메타비온사 (metabion, 독일)에 의뢰하여 합성하였다. 합성된 프라이머의 염기 서열은 표 1에 나타낸 바와 같고 합성된 프로브의 염기 서열은 표 2에 나타낸 바와 같다.

실시예 3. 임상검체로부터의 HCV RNA 추출

HCV 감염이 의심되는 환자 혈액으로부터 혈청 (Serum) 또는 EDTA-플라즈마 (EDTA-Plasma)를 분리해 내고, 이를 Qiagen사의 QIAamp MineElute Virus Spin Column과 같은 실리카 막 (Silica Membrane) 기반의 스핀 컬럼 (Spin Column)을 이용하여 추출하였다.

실시예 4. 상기 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 다중 PCR 반응 분석

(1) 표 3과 같은 PCR 반응 조성으로 PCR 반응 조성물을 제조하고, 표 4와 같은 조건으로 PCR 반응을 SLAN real time PCR detection system (LG 생명과학, 한국)에서 시행하였다.

(2) 실시간으로 반응 산물을 측정하였으며, 반응이 완료된 후 결과를 SLAN 8.0 프로그램을 이용하여 분석하였다.

(3) 표 5 는 NIBSC에서 제공하는 공인된 Genotype Panel (code 02/202)에 대한 양성, 도 1에서 도시하고 있는 바와 같이 서열번호 1및 2의 HCV 특이 프라이머 및 서열번호 5의 프로브는 내부 대조군(서열번호 3및 서열번호 4의 프라이머 및 서열번호 6의 프로브 사용)과 경쟁적으로 저해하지 않고 양성 검출할 수 있음을 판단할 수 있었다. 아울러, 도 2에서 도시하고 있는 바와 같이, 서열번호 1및 2의 HCV 특이 프라이머 및 및 서열번호 9의 프로브는 내부 대조군(서열번호 3 및 4의 프라이머와 서열번호 9의 프로브)과 경쟁적으로 저해하지 않고 양성 검출할 수 있음을 판단할 수 있었다. 또한, 서열번호 3및 서열번호 4의 내부 대조군 프라이머는naked RNA 혹은 DNA가 아닌 전체 바이러스 입자를 내부 대조군으로 사용하는 것이므로 사용 물질의 안정성을 확보함과 동시에, RNA 추출과정, 역전사 과정(Reverse Transcription) 및 PCR 과정에 대한 보다 정확한 검증을 할 수 있었다.

HCV RNA Genotype Panel for NAT, NIBSC Code 02/202

Panel member	HCV Genotype	Ct value by AdvanSure HCV
NIBSC-1	1	32.24
NIBSC-2	2	33.00
NIBSC-3	3	33.27
NIBSC-4	4	32.52
NIBSC-5	5	32.07
NIBSC-6	6	33.81

실시예 5. 본 발명 키트의 HCV 대한 비교 임상 시험 결과

서열번호 1의 프라이머, 서열번호 2의 프라이머, 및 서열번호 5의 프로브를 포함하는 본 발명의 키트를 이용하여 HCV 감염에 대한 진단효과를 Abbott사 제품과 비교 임상시험을 통해 살펴보았다. 임상 시험의 결과는 아래 표 6 내지 8과 같다.

검출한계 시험 결과표

IU/mL	# Tested	# Detected	% Detected
100	24	24	100
50	24	24	100
25	24	23	96
12.5	24	23	96
6.25	24	6	25
Probit 95% Hit rate	18.5 IU/mL

검출한계를 확인하기 위해 시행한 검사에서 AdvanSure HCV Real-Time PCR은 12.5 IU/mL의 HCV RNA를 95% 이상 검출할 수 있었다. Probit 분석 결과 95% 검출한계는 16.7 IU/mL이었고, 50% 검출한계는 7.9 IU/mL이었다. 비고) Abbott사의 Probit 95% Hit rate은 23.8 IU/mL 이다.

진단 민감도 시험 결과표

		검체수	판정
진단민감도		100	99개 양성
진단특이도		50	모두 음성
분석특이도	HAV 양성	13	모두 음성
	HBV 양성	20	모두 음성
	HIV-1 양성	10	모두 음성

비고) Abbott HCV Real-Time PCR에서 양성을 보였던 만성 C형 간염환자 100검체 중 99검체에서 양성이어서 진단민감도는 99%이었다. Abbott HCV Real-Time PCR의 정량 결과 30IU/mL이하를 보였던 건강검진자 검체 50개에 대해서는 모두 음성결과를 보여 진단특이도는 100%이었다. HAV, HBV, HIV-1 양섬검체에 대해서도 모두 음성결과를 보여 좋은 분석특이도를 나타내었다.

정밀성 시험 결과표

	Day1	Day2	Day3	Day4	Day5	Day6	Day7	Day8	Day9	Day10	AVG	STDEV	CV(%)
High	24.00	24.01	24.00	24.08	24.01	24.13	24.38	23.70	24.04	24.87	24.25	0.65	2.67
High	24.00	24.27	24.00	24.50	23.75	23.55	26.30	23.82	24.08	25.50	24.25	0.65	2.67
Middle	28.81	28.39	28.58	28.32	28.67	28.80	28.68	28.73	29.08	29.13	28.84	0.28	0.97
Middle	29.41	28.82	28.64	28.72	28.65	29.00	29.14	29.09	29.11	29.09	28.84	0.28	0.97
Low	33.21	33.20	33.63	32.40	33.45	33.66	34.66	34.18	35.18	35.04	33.65	0.92	2.73
Low	33.45	32.42	33.51	32.26	33.00	32.50	34.27	35.17	34.34	33.54	33.65	0.92	2.73
HPC	20.06	20.66	20.00	19.38	20.28	20.31	21.24	22.00	21.82	22.00	20.78	0.93	4.49
LPC	35.78	36.59	35.47	34.06	37.53	37.87	37.06	37.43	38.64	37.82	36.83	1.37	3.72
NC	NT	NT	NT	NT	NT	NT	NT	NT	NT	NT

상기에서, '민감도(sensitivity)'는 질병이 있는 사람을 양성으로 검출할 수 있는 능력, 즉 특정 역치에서 질병이 있음을 정확히 판별해 낼 수 있는 능력을 의미한다.

'특이도(specificity)'는 건강한 사람을 음성으로 검출하는 능력, 즉 특정 역치에서 질병이 없음을 정확히 판별해 낼 수 있는 능력을 의미한다.

도 1은 GFP에 특이적인 내부 대조군의 경쟁적 저해 없이 HCV 특이적 프라이머 및 프로브를 이용한 양성 검출을 정렬한 결과를 나타낸다.

도 2는 MS2 박테리오 파지에 특이적인 내부 대조군의 경쟁적 저해 없이 HCV 특이적 프라이머 및 프로브를 이용한 양성 검출을 정렬한 결과를 나타낸다.

<110> LG Life Sciences, Ltd. <120> METHOD FOR DETECTION OF HCV AT THE REAL TIME PCR WITH INTERCALATING DYE <130> PA090554/KR <150> KR10-2008-0136112 <151> 2008-12-29 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for CV <400> 1 cccctgtgag gaactwctgt cttc 24 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for CV <400> 2 gcagaccact atggctctcc 20 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 1 for IC <400> 3 cgatggccct gtccttttac attta 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 1 for IC <400> 4 cttttcgttg ggatctttga ttaaa 25 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 1 for CVFAM <400> 5 ctagccatgg cgttagtayg agtgtcg 27 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for ICCy5 <400> 6 attacctgtc cacacaatct gccctt 26 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 2 for IC <400> 7 cctccgttcg cgtttacg 18 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 2 for IC <400> 8 ttggccccag tcgagttaa 19 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 2 for CVFAM <400> 9 ctagccatgg cgttagtayg agtgtyg 27

Claims

서열번호 1의 프라이머, 서열번호 2의 프라이머, 및 서열번호 5의 프로브; 또는 서열번호 1의 프라이머, 서열번호 2의 프라이머, 및 서열번호 9의 프로브를 포함하는 단단계 반응 (single step) 수행을 위한 HCV (Hepatitis C virus) 검출용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 내부 대조군으로써 서열번호 3의 프라이머, 서열번호 4의 프라이머 및 서열번호 6의 프로브; 또는 서열번호 7의 프라이머, 서열번호 8의 프라이머, 및 서열번호 6의 프로브를 추가로 포함하는 단단계 반응 수행을 위한 HCV 검출용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 조성물은 MMLV 및 HS-Taq를 추가로 포함하는 단단계 반응 수행을 위한 HCV 검출용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 내부 대조군은 검출하고자 하는 특이유전자의 증폭을 저해하지 않는 것을 특징으로 하는 HCV 검출용 조성물.
제3항에 있어서, 완충용액, DNA 중합 효소, dNTP 및 멸균 증류수를 추가로 포함하는 단단계 반응 수행을 위한 HCV 검출용 조성물.
제5항에 있어서, 각각 100μM의 프라이머, 각각 100μM의 프로브, 5x MMLV 완충액, 200U MMLV, 2.5U HS-Taq, 2mM dUTP, 40U Rnasin를 포함하는 단단계 반응 수행을 위한 HCV 검출용 조성물.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에 형광물질을 포함하는 단단계 반응 수행을 위한 HCV 검출용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 5' 말단의 형광 물질은 6-카르복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인 (hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인 (tetrachloro-6-carboxyfluorescein), FAM (5-carboxy fluorescein), HEX (2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 및 Cy5 (cyanine-5)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광물질이고, 상기 3' 말단의 형광물질은 6-카르복시테트라메틸-로다민 (6-carboxytetramethyl-rhodamine), TAMRA (5-Carboxytetramethylrhodamine), 및 BHQ3 (black hole quencher 3)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광물질인 단단계 반응 수행을 위한 HCV 검출용 조성물.
개체로부터 시료를 수득하는 단계;및

제6항에 따른 조성물을 이용한 증폭 및 프로브를 이용한 검출단계를 포함하는 단단계 반응임을 특징으로하는 HCV 검출방법.
제9항에 있어서, 상기 시료는 혈액이고, 상기 증폭은 PCR에 의한 것인 단단계 반응임을 특징으로하는 HCV 검출방법.
제1항의 프라이머 및 프로브 서열을 포함하는 HCV 검출용 키트.
제11항에 있어서, 상기 HCV 검출용 키트는 서열번호 3 및 서열번호 4의 내부 대조군 프라이머, 및 서열번호 6의 내부 대조군 프로브; 또는 서열번호 7 및 서열번호 8의 내부 대조군 프라이머, 및 서열번호 6의 내부 대조군 프로브를 추가로 포함하는 HCV 검출용 키트.
제12항에 있어서, 상기 키트는 각각 100μM의 프라이머, 각각 100μM의 프로브, 5x MMLV 완충액, 200U MMLV, 2.5U HS-Taq, 2mM dUTP, 40U Rnasin를 포함하고, 단단계 반응에 의해 HCV를 검출하는 것을 특징으로하는 HCV 검출용 키트.