RU2640256C2 - Средства и способы предсказания ответа на лечение гепатита b - Google Patents
Средства и способы предсказания ответа на лечение гепатита b Download PDFInfo
- Publication number
- RU2640256C2 RU2640256C2 RU2014142009A RU2014142009A RU2640256C2 RU 2640256 C2 RU2640256 C2 RU 2640256C2 RU 2014142009 A RU2014142009 A RU 2014142009A RU 2014142009 A RU2014142009 A RU 2014142009A RU 2640256 C2 RU2640256 C2 RU 2640256C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hepatitis
- treatment
- carnitine
- patient
- hbv
- Prior art date
Links
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 183
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 60
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 title abstract description 10
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 title abstract description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 title description 11
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims abstract description 146
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 81
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 44
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 claims description 67
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 55
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 40
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 31
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 25
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 claims description 14
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 14
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 13
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims description 13
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 12
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 claims description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000009265 virologic response Effects 0.000 claims description 6
- 229940123014 DNA polymerase inhibitor Drugs 0.000 claims description 5
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 claims description 4
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims description 4
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 claims description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 142
- PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-N (R)-carnitine Chemical compound C[N+](C)(C)C[C@H](O)CC([O-])=O PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 81
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 71
- PHIQHXFUZVPYII-UHFFFAOYSA-N carnitine Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)CC([O-])=O PHIQHXFUZVPYII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 61
- RDHQFKQIGNGIED-MRVPVSSYSA-N O-acetyl-L-carnitine Chemical compound CC(=O)O[C@H](CC([O-])=O)C[N+](C)(C)C RDHQFKQIGNGIED-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 59
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 47
- UFAHZIUFPNSHSL-MRVPVSSYSA-N O-propanoyl-L-carnitine Chemical compound CCC(=O)O[C@H](CC([O-])=O)C[N+](C)(C)C UFAHZIUFPNSHSL-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 46
- 229960004203 carnitine Drugs 0.000 description 42
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 40
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 40
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 40
- WOZSCQDILHKSGG-UHFFFAOYSA-N adefovir depivoxil Chemical compound N1=CN=C2N(CCOCP(=O)(OCOC(=O)C(C)(C)C)OCOC(=O)C(C)(C)C)C=NC2=C1N WOZSCQDILHKSGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 229960001997 adefovir Drugs 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 14
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 12
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 10
- VCMJCVGFSROFHV-WZGZYPNHSA-N tenofovir disoproxil fumarate Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O.N1=CN=C2N(C[C@@H](C)OCP(=O)(OCOC(=O)OC(C)C)OCOC(=O)OC(C)C)C=NC2=C1N VCMJCVGFSROFHV-WZGZYPNHSA-N 0.000 description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 229960004556 tenofovir Drugs 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 229940002988 pegasys Drugs 0.000 description 7
- 108010092853 peginterferon alfa-2a Proteins 0.000 description 7
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 6
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 5
- JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N lamivudine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1O[C@@H](CO)SC1 JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 5
- 229960001627 lamivudine Drugs 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 5
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 5
- 229960003205 adefovir dipivoxil Drugs 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 229960000980 entecavir Drugs 0.000 description 4
- YXPVEXCTPGULBZ-WQYNNSOESA-N entecavir hydrate Chemical compound O.C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)C1=C YXPVEXCTPGULBZ-WQYNNSOESA-N 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 4
- 108010092851 peginterferon alfa-2b Proteins 0.000 description 4
- 229960003931 peginterferon alfa-2b Drugs 0.000 description 4
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 4
- 229960005311 telbivudine Drugs 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-CSMHCCOUSA-N telbivudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 3
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 3
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 101150068811 SLC16A9 gene Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 3
- -1 sexual contact Substances 0.000 description 3
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 229940127399 DNA Polymerase Inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229940123527 Nucleotide reverse transcriptase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229940097709 hepsera Drugs 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 229950000038 interferon alfa Drugs 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 2
- 208000018191 liver inflammation Diseases 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 2
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- PHIQHXFUZVPYII-LURJTMIESA-N (S)-carnitine Chemical compound C[N+](C)(C)C[C@@H](O)CC([O-])=O PHIQHXFUZVPYII-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- SUFNCOCCSOVPCQ-ORXWAGORSA-N 2-amino-9-[(2r,3r,4s,5r)-2-cyclopentyl-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3h-purin-6-one Chemical group C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@]1(C2CCCC2)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O SUFNCOCCSOVPCQ-ORXWAGORSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000713368 Bovine immunodeficiency virus (strain R29) Protein Tat Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108700024845 Hepatitis B virus P Proteins 0.000 description 1
- 206010019755 Hepatitis chronic active Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000582320 Homo sapiens Neurogenic differentiation factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010078049 Interferon alpha-2 Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 1
- 125000002066 L-histidyl group Chemical group [H]N1C([H])=NC(C([H])([H])[C@](C(=O)[*])([H])N([H])[H])=C1[H] 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102100027861 Monocarboxylate transporter 9 Human genes 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100030589 Neurogenic differentiation factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108091006606 SLC16A9 Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 101100082060 Xenopus laevis pou5f1.1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012072 active phase Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000004057 allelic distribution Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012098 association analyses Methods 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical class O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 1
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012073 inactive phase Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229960003507 interferon alfa-2b Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 108010046177 locteron Proteins 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003990 molecular pathway Effects 0.000 description 1
- 238000000491 multivariate analysis Methods 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 229940127073 nucleoside analogue Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000009984 peri-natal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 150000003856 quaternary ammonium compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 239000003419 rna directed dna polymerase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102200002697 rs1154510 Human genes 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- MIXCUJKCXRNYFM-UHFFFAOYSA-M sodium;diiodomethanesulfonate;n-propyl-n-[2-(2,4,6-trichlorophenoxy)ethyl]imidazole-1-carboxamide Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)C(I)I.C1=CN=CN1C(=O)N(CCC)CCOC1=C(Cl)C=C(Cl)C=C1Cl MIXCUJKCXRNYFM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004693 tenofovir disoproxil fumarate Drugs 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 239000003970 toll like receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5761—Hepatitis B
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2535/00—Reactions characterised by the assay type for determining the identity of a nucleotide base or a sequence of oligonucleotides
- C12Q2535/131—Allele specific probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа определения, имеется ли у пациента с гепатитом В (HBV) повышенная вероятность положительного результата лечения гепатита В по сравнению со средней вероятностью в популяции пациентов с гепатитом В. Представленный способ включает установление, содержит ли содержащий нуклеиновую кислоту образец указанного пациента с гепатитом В ассоциированный с положительным результатом G аллель SNP rs 12356193. Изобретение позволяет определить, будет ли пациент с HBV отвечать на HBV-терапию до начала такой терапии, и дает возможность избежать лишних расходов и появления побочных эффектов и осложнений при лечении. 8 з.п. ф-лы, 24 ил., 3 табл., 4 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение имеет отношение к области биологии, вирусологии и медицины. В частности, данное изобретение имеет отношение к лечению гепатита В.
Уровень техники
Гепатит В представляет собой инфекционное воспалительное заболевание печени, вызываемое вирусом гепатита В (HBV). В основном, передача вируса происходит в результате контакта с биологическими жидкостями, полового контакта, при переливании крови, гемодиализе, использовании наркозависимыми общих шприцов, в результате перинатальной инфекции и т.д.
HBV является членом семейства Hepadnavirus. Вирус является одним из самых маленьких вирусов с оболочкой, его диаметр составляет приблизительно 42 нм. Вирусная частица (вирион) состоит из внешней липидной оболочки (содержащей, главным образом, поверхностный антиген вируса гепатита В, HBsAg) и икосаэдрического нуклеокапсидного ядра (core), состоящего из корового антигена вируса гепатита В (HBcAg). В нуклеокапсид заключены вирусная ДНК и ДНК-полимераза, которая обладает активностью обратной транскриптазы. Внешняя оболочка содержит «встроенные» в нее белки, которые участвуют в связывании вируса с чувствительной клеткой и проникновении в нее.
Острая HBV-инфекция характеризуется воспалением печени, рвотой и желтухой. Как правило, симптомы продолжаются в течение нескольких недель и затем постепенно ослабевают, по мере того, как иммунная система устраняет инфекцию. Вероятность полного выздоровления и формирования защитного иммунитета увеличивается с возрастом: тогда как только 5% взрослых страдают от хронической инфекции, длящейся более шести месяцев, т.е. хронической инфекции HBV, этот показатель возрастает до 70% среди детей младшего возраста и до 95% среди новорожденных, инфицированных перинатально.
Длительное воспаление печени, обусловленное инфицированием HBV, может приводить к хроническому гепатиту В (СНВ) с прогрессированием до фиброза печени, цирроза и, в конечном итоге, гепатоклеточной карциномы (НСС) и смерти. По этой причине HBV классифицируется Международным агентством по изучению рака (МАИР) ВОЗ как канцерогенный фактор класса I, т.е. агент, канцерогенный для человека. Таким образом, действующие директивы рекомендуют проводить лечение пациентов с СHВ с активным воспалительным процессом в печени, например, руководства Американской ассоциации по изучению заболеваний печени (AASLD), рекомендуют проводить лечение пациентов, у которых наблюдаются уровни ДНК HBV в сыворотке более 2000 IU/мл и/или повышенный уровень аланинаминотрансферазы (ALT) (>2 раз относительно верхнего предела нормы).
СНВ можно разделить на четыре фазы. У лиц, зараженных перинатально, наиболее часто наблюдается фаза иммунной толерантности. Эта фаза характеризуется обнаружением "е антигена" гепатита В (HBeAg). В течение этой фазы Анти-НВе антитела не обнаруживаются. Плазматические уровни ДНК HBV превышают 20000 IU/мл и часто являются еще более высокими.
Вторая фаза представляет собой фазу активности иммунной системы. В продолжение этой фазы повышаются показатели ALT, у некоторых пациентов может наблюдаться исчезновение HBeAg и переход к анти-НВе антителам. После HBeAg/антиНВе сероконверсии количество ДНК HBV в плазме, как правило, снижается до уровня ниже 20000 IU/мл. Эта фаза носит название фазы HBeAg-отрицательного хронического неактивного гепатита В. Впоследствии может развиться фаза HBeAg-отрицательного хронического активного гепатита В, вследствие появления HBV-мутантов с мутациями в pre-соrе области; при этом уровни ДНК HBV в плазме снова превышают 20000 IU/мл, и возрастают показатели ALT (R.B. Takkenberg, thesis University of Amsterdam (2011), The Netherlands, chapter 2, ISBN 9789090263045).
По всему миру насчитывается около 400 миллионов больных хроническим гепатитом В, приблизительно 650000 человек ежегодно умирает от связанных с HBV осложнений. Хронический гепатит В (СНВ) представляет собой динамический процесс и, как описано выше, может находиться в активной и неактивной фазах. Стандартные схемы лечения включают интерферон альфа или аналоги нуклеотидов/нуклеозидов, ингибирующие вирусную ДНК-полимеразу. В исследованиях использовалась комбинированная терапия аналогами нуклеотидов/нуклеозидов и интерфероном альфа. Важным усовершенствованием стало введение в терапию пегилированного интерферона (например, Pegasys®), обеспечивающего пролонгированный период полувыведения интерферона. Обзор по эпидемиологии и лечению HBV-инфекции см. в J.L. Dienstag N Engl J Med 2008, 359; 1486-1500.
По-прежнему, несмотря на улучшенную терапию, лишь очень небольшой доле пациентов удается избавиться от инфекции (исчезновение HBsAg и ДНК HBV с или без образования анти-HBs антител) при проведении лечения, тогда как большинству других - нет. Таким образом, было бы желательно иметь возможность предсказания ответа пациента на HBV терапию, для того, чтобы правильно скорректировать стратегию лечения с самого начала.
Как было показано в многочисленных исследованиях, невозможность достижения элиминации вируса под действием иммунной системы при постоянных высоких уровнях вирусемии HBV связана с плохими клиническими результатами, включая цирроз печени и гепатоклеточную карциному. Результаты показывают, что индивидуумы, у которых происходит устранение инфекции HBV, имеют низкий риск такого неблагоприятного исхода. Однако значительное количество пациентов не достигает устранения вируса после терапии, кроме того, обычным явлением являются выраженные побочные действия интерферона. Было описано несколько подходящих маркеров элиминации вируса при СНВ (например, вирусные генотипы А и В, ранняя сероконверсия HBeAg, низкий исходный уровень HBsAg). Однако, принимая во внимание недостаточную эффективность доступных видов лечения, огромное практическое значение имеет установление большего количества (и предпочтительно более надежных) прогностических факторов ответа (или отсутствия ответа) до начала противовирусной терапии.
Раскрытие изобретения
Целью настоящего изобретения является предоставление дополнительных маркеров положительного или отрицательного результата лечения HBV.
Настоящее изобретение дает возможность понять, что результат лечения гепатита В коррелирует с полиморфизмами нуклеотидов, как в геноме инфицированного индивидуума, так и в геноме HBV, а также с уровнем экспрессии карнитина и производных карнитина у указанного индивидуума. Однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs) генома человека, имеющие отношение к результату лечения HBV, представлены на фиг. 1, a SNPs HBV-генома, имеющие отношения к результату лечения HBV, представлены на фиг. 2. Была использована номенклатура положений нуклеотидов, соответствующая Galibert et al. (Galibert F, et al. Nature. 1979 Oct 25; 281(5733): 646-50). До настоящего изобретения не было известно, что существуют корреляции между геномными + HBV нуклеотидными полиморфизмами и результатом лечения HBV. Также не было известно, что уровни экспрессии карнитина и производных карнитина служат прогностическим признаком результата лечения HBV. Теперь, когда настоящее изобретение дает возможность понять, что нуклеотидные полиморфизмы ассоциируются с результатом лечения, стало возможным типировать содержащий нуклеиновую кислоту образец индивидуума путем определения по меньшей мере одного из полиморфизмов, изображенных на фиг. 1 и/или 2. Один аспект изобретения, таким образом, предоставляет способ типирования содержащего нуклеиновую кислоту образца пациента с гепатитом В, включающий определение SNP, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2, в нуклеиновой кислоте указанного образца. Способы обнаружения нуклеиновокислотных полиморфизмов известны в данной области техники и, например, включают выделение нуклеиновой кислоты, амплификацию и обнаружение, например, с использованием стандартных способов, таких как ПЦР, мультиплексная амплификация лигированных зондов (MLPA), секвенирование и т.д. Такие хорошо известные методы не нуждаются в дополнительном объяснении.
Кроме того, стало возможным типировать образец пациента с гепатитом В путем определения уровня экспрессии карнитина и/или производного карнитина в указанном образце. В соответствии с настоящим изобретением относительно низкий уровень карнитина и/или производного карнитина является прогностическим признаком положительного результата лечения гепатита В, как более подробно указано ниже в этом описании. Один аспект изобретения, таким образом, предоставляет способ типирования образца пациента с гепатитом В, включающий определение уровня экспрессии карнитина и/или производного карнитина в указанном образце. Предпочтительно способ включает определение уровня карнитина и/или производного карнитина в указанном образце.
Карнитин представляет собой четвертичное аммонийное соединение, биосинтез которого происходит из аминокислот лизина и метионина. Карнитин вовлечен в метаболизм жирных кислот, поскольку он осуществляет транспорт длинноцепочечных ацильных групп жирных кислот в матрикс митохондрий. Производное карнитина определяется в этом описании как соединение на основе карнитина, отличное от собственно карнитина, которое содержит фрагмент карнитина, необязательно с модификациями, замещениями, введенными группами и/или делениями, который все еще обладает по меньшей мере одним свойством карнитина - участием в метаболизме жирных кислот. Предпочтительные производные карнитина представляют собой ацетил-L-карнитин и пропионил-L-карнитин. При использовании в этом описании термин «карнитин» включает L-карнитин и D-карнитин. L-карнитин, однако, является предпочтительным.
Способы согласно изобретению, в частности, пригодны для определения, является ли пациент с гепатитом В чувствительным к лечению гепатита В. При использовании в этом описании, пациент с гепатитом В является «чувствительным к лечению гепатита В» в том случае, если у пациента имеется повышенная вероятность положительного результата лечения гепатита В по сравнению средним значением в популяции пациентов с гепатитом В. Пациент с положительным результатом лечения называется пациентом, ответившим на лечение. С другой стороны, в случае если у пациента не наблюдается положительный результат лечения, такой пациент называется пациентом, не ответившим на лечение. Способы согласно изобретению позволяют определить, будет ли данный пациент с HBV отвечать на HBV-терапию, до начала такой терапии. Это обеспечивает преимущество, заключающееся в том, что пациенты, которые, не будут отвечать на лечение, могут быть отстранены от лечения, что позволит избежать излишних расходов, тяжести лечения и побочных эффектов. С другой стороны, это обеспечит более легкое включение в терапию пациентов с высокой вероятностью положительного результата лечения HBV, даже в том случае, когда состояние пациента не является оптимальным для осуществления такой терапии, поскольку известно, что для такого пациента вероятность положительного результата лечения значительно выше, чем средняя вероятность.
Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что вышеуказанные способы идентификации не претендуют на то, чтобы быть корректными для 100% подлежащих анализу субъектов. Тем не менее, оценка будет являться достоверной для статистически значимой доли подлежащих анализу субъектов. Является ли доля статистически значимой, специалист в данной области техники может определить с помощью различных хорошо известных методов статистической оценки, например, определения доверительных интервалов, определения р-значения, критерия Стьюдента, критерия Манна-Уитни и т.д. Подробную информацию можно найти в Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983. Предпочтительные доверительные интервалы составляют по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%. р-значения составляют предпочтительно 0,1; 0,05; 0,01; 0,005 или 0,0001. Предпочтительно предусматриваемая настоящим изобретением вероятность обеспечит правильное установление различий по меньшей мере для 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере для 90% субъектов данной когорты или популяции.
На фиг. 1 и 2 изображены SNPs геномов человека и HBV, связанные с результатом лечения HBV. Аллели, ассоциированные с положительным результатом лечения, изображены в шестом столбце фиг. 1а и lb и в четвертом столбце фиг. 2а. Таким образом, один аспект изобретения предоставляет способ определения, имеется ли у пациента с гепатитом В повышенная вероятность получения положительного результата лечения гепатита В, по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий определение, содержит ли содержащий нуклеиновую кислоту образец указанного пациента с гепатитом В по меньшей мере один ассоциированный с положительным результатом лечения аллель SNP, изображенный на фиг. 1 или 2. Пациент с гепатитом В определяется как имеющий повышенную вероятность получения положительного результата лечения гепатита В, исходя из наличия такого ассоциированного с положительным результатом лечения аллеля. Отсутствие одного или более ассоциированного с положительным результатом лечения аллеля(ей) SNP, как изображено на фиг. 1 или 2, указывает на более низкую вероятность получения положительного результата лечения гепатита В.
Термин «содержащий нуклеиновую кислоту образец» относится к образцу индивидуума, который содержит или нуклеиновую кислоту указанного индивидуума и/или нуклеиновую кислоту HBV. Термин нуклеиновая кислота охватывает соединения, содержащие цепь нуклеотидов, более предпочтительно ДНК и/или РНК. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный содержащий нуклеиновую кислоту образец представляет собой образец, содержащий ДНК. Мазок слюны или образец крови являются особенно предпочтительными, поскольку такой образец может быть взят без причинения большого дискомфорта пациенту или регулярно берется для других целей. В одном варианте осуществления используется образец сыворотки. Преимуществом образца сыворотки является тот факт, что, как показывает опыт, такой образец более часто хранят.
Настоящее изобретение дополнительно способствует пониманию того, что уровни (экспрессии) карнитина и производных карнитина у пациентов с гепатитом В, подвергающихся лечению от гепатита В, значительно ниже, чем уровни (экспрессии) карнитина и производных карнитина у пациентов с гепатитом В, не подвергающихся лечению гепатита В (см., например, фиг. 12 и 13). Теперь, когда это понимание существует, стало возможным определить, имеет ли конкретный пациент с гепатитом В повышенную вероятность положительного результата лечения гепатита В по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В. Например, уровень экспрессии карнитина или производного карнитина, такого как ацетил-L-карнитин и проопинил-L-карнитин, у данного пациента определяют с использованием любого подходящего метода, известного в данной области техники. Затем предпочтительно полученное значение сравнивают с эталонным. На основе указанного сравнения протестированного пациента относят к пациентом, которые будут отвечать на лечение, или к пациентам, которые не будут отвечать на лечение. В одном варианте осуществления полученное значение от протестированного пациента сравнивают с эталонным значением группы пациентов, отвечающих на лечение. Если полученное значение соответствует/ равно этому эталонному значению или является более низким, тестируемого пациента относят к «отвечающим на лечение». Если, однако, полученное значение значительно выше, тестируемого пациента относят к «не отвечающим на лечение». Альтернативно или дополнительно, полученное от тестируемого пациента значение сравнивают с эталонным значением группы пациентов, не отвечающих на лечение. В случае если полученное значение соответствует/равно этому эталонному значению или превышает его, тестируемого пациента относят к «не отвечающим на лечение». Если, однако, полученное значение значительно ниже, тестируемого пациента относят к «отвечающим на лечение».
В основном, любой образец, содержащий продукты экспрессии карнитина и/или производных карнитина является пригодным для осуществления способа в соответствии с данным изобретением. В предпочтительном варианте осуществления используется образец плазмы или крови, поскольку такой образец может быть взят без причинения большого дискомфорта пациенту или регулярно берется для других целей. В одном варианте осуществления используется образец сыворотки. Преимуществом образца сыворотки является тот факт, что такой образец, как показывает опыт, более часто хранят.
Предпочтительно «уровень экспрессии» карнитина и/или производного карнитина относится к уровню собственно карнитина или собственно производного карнитина в образце.
При использовании образца плазмы, как правило, пациента с гепатитом В, имеющего уровень экспрессии карнитина, равный или меньший чем 34 микромоль/л, предпочтительно равный или меньший чем 33,3 микромоль/л, относят к «отвечающим на лечение», тогда как пациента с гепатитом В, имеющего уровень экспрессии карнитина более 34 микромоль/л, предпочтительно более 33,3 микромоль/л, относят к «не отвечающим на лечение». Пациента, имеющего уровень экспрессии ацетил-L-карнитина равный или меньший чем 3,89 микромоль/л, относят к «отвечающим на лечение», тогда как пациента, имеющего уровень экспрессии ацетил-L-карнитина более 3,89 микромоль/л, относят к «не отвечающим на лечение». В одном варианте осуществления пациента, имеющего уровень экспрессии ацетил-L-карнитина, равный или меньший чем 3,0 микромоль/л, относят к «отвечающим на лечение», тогда как пациента, имеющего уровень экспрессии ацетил-L-карнитина более 3,0 микромоль/л, относят к «не отвечающим на лечение». Дополнительно, пациента, имеющего уровень экспрессии пропионил-L-карнитина, равный или меньший чем 0,4 микромоль/л, предпочтительно равный или меньший чем 0,43 микромоль/л, как правило, относят к «отвечающим на лечение», тогда как пациента, имеющего уровень экспрессии пропионил-L-карнитина более 0,4 микромоль/л, предпочтительно более 0,43 микромоль/л, относят к «не отвечающим на лечение».
В одном предпочтительном варианте осуществления значение, полученное от тестируемого пациента, сравнивают с эталонным значением группы, отвечающей на лечение, и с эталонным значением группы, не отвечающей на лечение, и определяют, какое эталонное значение является наиболее близким к полученному исследуемому значению. Затем тестируемого пациента относят к той группе, эталонное значение которой является наиболее близким к полученному исследуемому значению.
Таким образом, один аспект изобретения предоставляет способ определения, имеется ли у пациента с гепатитом В повышенная вероятность получения положительного результата лечения гепатита В по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий определение, содержит ли образец указанного пациента с гепатитом В уровень экспрессии карнитина или производного карнитина, который ассоциирован с положительным результатом лечения гепатита В. Предпочтительно определяют, содержит ли образец указанного пациента с гепатитом В уровень карнитина или производного карнитина, который ассоциирован с положительным результатом лечения гепатита В. В одном варианте осуществления указанное производное карнитина содержит ацетил-L-карнитин и/или пропионил-L-карнитин. Предпочтительно количество карнитина или производного карнитина сравнивают по меньшей мере с одним эталонным значением, как объясняется выше. В одном варианте осуществления определяют, является ли уровень экспрессии карнитина в образце плазмы равным или меньшим чем 34 микромоль/л («пациент, отвечающий на лечение»), или большим чем 34 микромоль/л («пациент, не отвечающий на лечение»). Предпочтительно определяют, является ли уровень экспрессии карнитина в образце плазмы равным или меньшим чем 33,3 микромоль/л («пациент, отвечающий на лечение») или большим чем 33,3 микромоль/л («пациент, не отвечающий на лечение»). В одном варианте осуществления, определяют, является ли уровень экспрессии ацетил-L-карнитина в образце плазмы равным или меньшим чем 3,0 микромоль/л («пациент, отвечающий на лечение») или большим чем 3,0 микромоль/л («пациент, не отвечающий на лечение»). Предпочтительно определяют, является ли уровень экспрессии ацетил-L-карнитина в образце плазмы равным или меньшим чем 3,89 микромоль/л («пациент, отвечающий на лечение») или большим чем 3,89 микромоль/л («пациент, не отвечающий на лечение»). В одном варианте осуществления определяют, является ли уровень экспрессии пропионил-L-карнитина в образце плазмы равным или меньшим чем 0,4 микромоль/л («пациент, отвечающий на лечение») или большим чем 0,4 микромоль/л («пациент, не отвечающий на лечение»). Предпочтительно определяют, является ли уровень экспрессии пропионил-L-карнитина в образце плазмы равным или меньшим чем 0,43 микромоль/л («пациент, отвечающий на лечение») или большим чем 0,43 микромоль/л («пациент, не отвечающий на лечение»). В дополнительном предпочтительном варианте осуществления определяют, является ли уровень экспрессии карнитина в образце плазмы равным или меньшим чем 29 микромоль/л («пациент, отвечающий на лечение») или большим чем 29 микромоль/л («пациент, не отвечающий на лечение»). Пациент с гепатитом В, имеющий уровень экспрессии карнитина в плазме, равный 29 микромоль/л или меньше обладает даже более высокой вероятностью получения положительного результата лечения гепатита В.
Пациент с хроническим гепатитом В определяется в качестве индивидуума, который будет диагностирован как имеющий инфекцию гепатита В (или HBV инфекцию) через более чем 7 месяцев.
Как правило, наличие HBV диагностируют путем обнаружения по меньшей мере одного вирусного полипептида в образце, взятом у субъекта, более предпочтительно обнаруживается по меньшей мере один из вирусных антигенов HBs (HBsAg, Genbank Асc. No.: AAL66340.1 GI:18252577, SEQ ID NO: 1), HBc (HBcAg, Genbank Acc. No.: CAA51257.1 GI:288930, SEQ ID NO: 2) и HBe (HBeAg, Genbank Acc. No.: AAM96930.1 GI:22530876, SEQ ID NO: 3). Специалисту ясно, что полипептиды HBV упоминаются в качестве биомаркеров, а не как специфические полипептиды, и что термин HBV охватывает различные штаммы HBV, которые могут содержать варианты последовательностей вышеуказанных полипептидов HBV. Соответственно, следует понимать, что вышеуказанные полипептиды, имеющие специфические последовательности, депонированные под учетными номерами в Genbank, являются иллюстративными последовательностями, представляя биомаркер. Поэтому, также возможно обнаружить «вариантные» (другие) полипептиды, измененные в результате добавления, замены, делеции и/или модификации по меньшей мере одной аминокислоты в упомянутых выше HBV полипептидах, при условии, что они также являются пригодными в качестве биомаркеров для HBV-инфекции, как обсуждалось выше. Предпочтительно «вариантные» полипептиды являются по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичными вышеуказанным специфическим полипептидам.
Термин «идентичный" при использовании в этом описании относится к идентичности последовательности, характеризующейся определением количества идентичных нуклеотидов или аминокислот между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот, соответственно, при этом последовательности выровнены так, что получено соответствие самого высокого порядка. Он может быть вычислено с помощью опубликованных методов или способов, имеющих вид компьютерных программ, таких как, например, BLASTP, BLASTN или FASTA (Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403). Процент идентичности, в одном аспекте, вычисляется относительно полной последовательности нуклеиновой кислоты или последовательности аминокислоты. Для сравнения различных последовательностей специалистами в данной области доступна серия программ на основе целого ряда алгоритмов. В этом контексте, в частности, дают надежные результаты алгоритмы Needleman и Wunsch или Smith и Waterman. Для проведения выравнивания последовательностей можно использовать программу PileUp (Higgins 1989, CABIOS 5,151) или программы Gap и BestFit (Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482), которые являются частью пакета программ GCG (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711). Значения идентичности последовательностей, в данном описании выраженные в процентах (%), в другом аспекте изобретения, определяют с помощью программы GAP относительно участка полной последовательности при использовании следующих параметров: Штраф за открытие гэпа: 50, штраф за продолжение гэпа: 3, Average Match: 10000 и Average Mismatch: 0000, которые, если не указано иное, всегда используются в качестве стандартных параметров при выравнивании последовательностей.
Кроме того, предпочтительно наличие HBV устанавливается путем обнаружения по меньшей мере одного вирусного полинуклеотида, предпочтительно вирусной ДНК, в образце, полученном от пациента. Последовательности нуклеотидов вирусных полинуклеотидов или полного HBV-генома хорошо известны в данной области техники. Предпочтительно последовательности нуклеотидов HBV размещены для хранения в Genbank под учетным номером NC 003977.1. Специалисту ясно, что HBV полинуклеотиды упоминаются в качестве биомаркеров, а не как специфические полинуклеотиды, и что термин HBV охватывает различные штаммы HBV, содержащие варианты нуклеотидных последовательностей. Соответственно, следует понимать, что вышеуказанные полинуклеотиды, имеющие специфические последовательности, депонированные под учетными номерами в Genbank, являются иллюстративными последовательностями, представляя биомаркер. Поэтому, также возможно обнаружить «вариантные» (другие) полинуклеотиды, измененные в результате добавления, замены, делении и/или модификации по меньшей мере одного нуклеотида в упомянутых выше HBV-полинуклеотидах, при условии, что они также являются пригодными в качестве биомаркеров для HBV-инфекции, как обсуждалось выше. Предпочтительно «вариантные» полинуклеотиды являются по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичными упомянутым выше специфическим полинуклеотидам. Идентичность может быть вычислена, как изложено выше.
Предпочтительно термин HBV-инфекция относится к хронической HBV-инфекции. Хроническая HBV-инфекция предпочтительно отличается обнаружимым наличием HBV у субъекта в течение периода более шести месяцев. Более предпочтительно упоминаемая в описании хроническая HBV-инфекция соответствует определению, опубликованному Центром по контролю заболеваемости (CDC), согласно которому хроническая HBV-инфекция характеризуется следующими лабораторными параметрами: IgM антитела к коровому антигену вируса гепатита В (IgM анти-НВс), отрицательным AND и положительным результатом на один из следующих тестов: поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg), е-антиген вируса гепатита В (HBeAg) или ДНК OR вируса гепатита В (HBV), положительный HBsAg или HBV ДНК положительный по меньшей мере при проведении два раза с интервалом 6 месяцев (допускается любая комбинация этих тестов, осуществленная с интервалом 6 месяцев).
Следовательно, один предпочтительный вариант осуществления предоставляет способ согласно изобретению, в котором указанный пациент с гепатитом В страдает от хронического гепатита В.
Последовательность нуклеиновой кислоты, в которой в популяции возможна более чем одна последовательность, называется в описании "полиморфным сайтом". Полиморфные сайты могут приводить к различиям последовательностей в результате замен, вставок или делеций. Такие замены, вставки или делеции могут приводить в результате к сдвигу рамки, образованию преждевременных стоп-кодонов, делеции или добавлению одной или более аминокислот, кодируемых полинуклеотидом, изменению сайтов сплайсинга и могут также влиять на стабильность или транспорт мРНК. В том случае, когда полиморфный сайт представляет собой один нуклеотид в длину, такой сайт называется однонуклеотидным полиморфизмом ("SNP").
Термин "SNP" относится к однонуклеотидному полиморфизму в конкретном положении в геноме млекопитающего, который варьирует в популяции индивидуумов. При использовании в данном описании SNP может отождествляться по его названию или расположению в конкретной последовательности. SNPs, представленные на фиг. 1b, показаны скобками. Например, SNP "[A/G]" в последовательности rs12356193 на фиг. 1b указывает, что нуклеиновое основание (или аллель) в этом положении в последовательности может быть или аденином или гуанином. Аллель, ассоциированный с положительным результатом лечения гепатита В (например, гуанин в rs12356193), указан в столбце шесть на фиг. 1а и 1b или столбце четыре на фиг. 2а. Нуклеотиды, фланкирующие SNPs на фиг. 1b, являются фланкирующими последовательностями, которые используются для идентификации положения SNP в геноме. При использовании в описании, нуклеотидные последовательности, упоминаемые в настоящей заявке, включают комплементарные цепи указанных нуклеотидных последовательностей. В дополнение к этому, при использовании в описании термин "SNP" рассматривает любой аллель из числа набора аллелей.
Термин "аллель" относится к специфическому нуклеотиду из числа «ассортимента» нуклеотидов, определяющих SNP.
Термин "ассоциированный с положительным результатом аллель" или "аллель положительного результата" имеет отношение к аллелю, связанному с положительным результатом лечения гепатита В. Предпочтительные виды лечения гепатита В и предпочтительные способы лечения для получения положительного результата перечисляются в описании далее. Шестые столбцы на фиг. 1а и 1b и четвертый столбец на фиг. 2а показывают ассоциированные с положительным результатом аллели согласно настоящему определению.
Термин "гаплотип" относится к комбинации определенных аллелей из двух или более SNPs.
Термин "гаплотип положительного результата" относится к гаплотипу, связанному с положительным результатом лечения гепатита В.
Термин "полинуклеотид" имеет отношение к полимерным формам нуклеотидов любой длины. Полинуклеотиды могут содержать дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и/или их аналоги. Полинуклеотиды могут иметь любую трехмерную структуру, включая одноцепочечную, двухцепочечную и тройную спиральную структуру молекулы, и могут осуществлять любую функцию, известную и неизвестную. Неограничивающими примерами полинуклеотидов являются следующие: ген или фрагмент гена, экзоны, интроны, мРНК, тРНК, рРНК, короткие интерферирующие молекулы нуклеиновых кислот (siNA), рибозимы, сДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, изолированные ДНК любой последовательности, изолированные РНК любой последовательности, зонды нуклеиновых кислот и праймеры. Полинуклеотид также может содержать модифицированные молекулы нуклеиновых кислот, такие как метилированные молекулы нуклеиновых кислот и аналоги молекул нуклеиновых кислот.
"Практически изолированный" или "изолированный" полинуклеотид - это полинуклеотид, практически свободный от последовательностей, с которыми он связан в природе. «Практически свободный» означает, что по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90% не содержит веществ, с которыми он связан в природе. "Изолированный полинуклеотид" также включает рекомбинантные полинуклеотиды, которые вследствие происхождения или манипуляции: (1) являются не связанными с полным или частью полинуклеотида, с которым они связаны в природе, или (2) являются связанными с полинуклеотидом, отличным от полинуклеотида, с которым они связаны в природе, или (3) не встречаются в природе.
Термин "вектор" имеет отношение к молекуле ДНК, которая несет ДНК, предназначенную для вставки и навсегда сохраняющуюся в клетке-хозяине. Векторы также известны как клонирующие векторы, клонирующие носители или носители. Термин "вектор" включает векторы, которые используются главным образом для вставки молекулы нуклеиновой кислоты в клетку, векторы репликации, которые используются главным образом для репликации нуклеиновых кислот, и векторы экспрессии, которые используются для транскрипции и/или трансляции ДНК или РНК. Также включаются векторы, обеспечивающие более чем одну из вышеупомянутых функций.
При помощи способа настоящего изобретения можно определить, имеется ли у пациента с гепатитом В повышенная вероятность получения положительного результата при лечении гепатита В. При использовании в описании термин «положительный результат» может иметь несколько клинических проявлений. В одном варианте осуществления положительный результат определяется как уменьшение HBsAg более чем на 1,5 log в крови указанного пациента. Предпочтительно указанное уменьшение HBsAg наблюдается на или до 24 недели лечения. Это означает, что количество обнаружимого HBsAg уменьшается быстрее, чем среднее значение HBsAg, наблюдаемое в популяции с гепатитом В, получающей тот же самый вид лечения. Быстрое уменьшение служит признаком более высокой вероятности подавления или излечения гепатита В, включая более высокую вероятность сероконверсии HBsAg, несмотря на то, что это происходит не всегда. Сероконверсия HBsAg определяется как отсутствие обнаружимого HBsAg в крови пациента и появление анти-HBs антител в крови. Таким образом, один вариант осуществления предоставляет способ определения, имеет ли пациент с гепатитом В повышенную вероятность уменьшения HBsAg более чем на 1,5 log, в его/ее крови на или до 24 недели лечения HBV, по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий установление, содержит ли содержащий нуклеиновую кислоту образец указанного пациента с гепатитом В по меньшей мере один аллель SNP, ассоциированный с положительным результатом, как показано на фиг. 1 и/или на фиг. 2, и/или установление, содержит ли образец указанного пациента с гепатитом уровень (экспрессии) карнитина или производного карнитина (предпочтительно ацетил-L-карнитина и/или проприонил-L-карнитина), который связывается с положительным результатом лечения гепатита В.
В предпочтительном варианте осуществления положительный результат лечения гепатита В определяется как устойчивый вирусологический ответ. Это означает, что получены уровни ДНК HBV равные или ниже чем 2000 IU/мл крови, а уровни аланин аминотрансферазы нормализуются в течение 2 лет дальнейшего наблюдения. Поэтому дополнительно предоставляется способ определения, имеется ли у пациента с гепатитом В повышенная вероятность устойчивого вирусологического ответа после лечения HBV по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий установление, содержит ли содержащий нуклеиновую кислоту образец указанного пациента с гепатитом В по меньшей мере один аллель SNP, ассоциированный с положительным результатом, как показано на фиг. 1 и/или на фиг. 2, и/или установление, содержит ли образец указанного пациента с гепатитом уровень (экспрессии) карнитина или производного карнитина (предпочтительно ацетил-L-карнитина и/или проприонил-L-карнитина), который ассоциируется с положительным результатом лечения гепатита В.
В отдельном предпочтительном варианте осуществления положительный результат лечения гепатита В определяется как отсутствие HBsAg. Это означает, что HBsAg исчезает из крови. Клиренс HBsAg является ближайшей к клиническому выздоровлению точкой и связан с увеличенной выживаемостью и более низким риском развития цирроза печени и гепатоклеточной карциномы. Как показано в примерах, настоящим изобретением предоставляются SNPs, которые сопряжены с этим наиболее благоприятным результатом. Кроме того, уровни карнитина и производных карнитина по-видимому коррелируют с этим наиболее благоприятным результатом. Поэтому дополнительно предоставляется способ определения, имеется ли у пациента с гепатитом В повышенная вероятность отсутствия HBsAg после лечения HBV по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий установление, содержит ли содержащий нуклеиновую кислоту образец указанного пациента с гепатитом В по меньшей мере один аллель SNP, ассоциированный с положительным результатом, как показано на фиг. 1 и/или на фиг. 2, и/или установление, содержит ли образец указанного пациента с гепатитом уровень (экспресмии) карнитина или производного карнитина (предпочтительно ацетил-L-карнитина и/или проприонил-L-карнитина), который ассоциируется с положительным результатом лечения гепатита В. Предпочтительно указанный пациент с гепатитом В имеет повышенную вероятность исчезновения HBsAg в сочетании с сероконверсией анти-НВ (что означает, что анти-HBs антитела обнаруживаются в крови индивидуума после лечения).
Таким образом, предпочтительный вариант осуществления предоставляет способ определения согласно изобретению, имеется ли у пациента с гепатитом повышенная вероятность положительного результата лечения гепатита В, при этом указанный положительный результат выбирают из группы, состоящей из отсутствия HBsAg, отсутствия HBsAg вместе с анти-HBs сероконверсией, устойчивого вирусологического ответа и уменьшение HBsAg более чем на 1,5 log в крови указанного пациента на или до 24 недели лечения. Предпочтительно любой из означенных способов осуществляется до начала указанного лечения гепатита В, для того чтобы предсказать результат лечения.
В одном предпочтительном варианте осуществления чувствительность пациента с гепатитом В для обеспечения положительного результата лечения гепатита В определяется с использованием способа в соответствии с изобретением, при этом указанное лечение гепатита В включает введение интерферона. Предпочтительно согласно изложенному в этом контексте, интерферон является интерфероном, ковалентно связанным с полиэтиленгликолем (PEG-интерферон). Более предпочтительно термин интерферон включает интерферон 2 альфа, наиболее предпочтительно интерферон 2 альфа, ковалентно связанный с полиэтиленгликолем (PEG-интерферон 2 альфа, коммерчески доступный как Pegasys®). Другими предпочтительными неограничивающими примерами известных сегодня терапевтических соединений интерферона являются PEG-интерферон альфа 2b (Peg-Intron), пег-интерферон лямбда, Locteron (который представляет собой интерферон альфа2b, присутствующий в биосферах), Консенсус интерферон (который является генно-инженерным интерфероном, на 88% гомологичным с IFN-альфа и на 30% Fс IN-бета) и IFN-гамма.
Лечение пациентов с гепатитом В интерфероном или другими иммуномодуляторами, например, такими как агонисты toll-подобных рецепторов, предпочтительно комбинируют с ингибитором вирусной ДНК-полимеразы с целью улучшения ответа на лечение. Предпочтительно ингибитором вирусной ДНК-полимеразы является аналог нуклеотида или аналог нуклеозида. Таким образом, предпочтительный способ согласно изобретению определяет, имеется ли у пациента с гепатитом В повышенная вероятность положительного результата лечения интерфероном в комбинации с аналогом нуклеотида или аналогом нуклеозида. Более предпочтительно указанное лечение включает лечение интерфероном 2 альфа в комбинации с аналогом нуклеотида или аналогом нуклеозида и даже более предпочтительно указанное лечение включает лечение PEG-интерфероном или PEG-интерфероном 2 альфа (например, pegasys®) или другими иммуномодуляторами в комбинации с аналогом нуклеотида или аналогом нуклеозида. Несколько аналогов нуклеотидов или нуклеозидов известно в данной области техники. Предпочтительными неограничивающими примерами являются ламивудин, адефовир, адефовир дипивоксил, энтекавир, тенофовир, тенофовир дизопроксил фумарат и телбивудин. Эти аналоги нуклеотидов/нуклеозидов хорошо известны в данной области техники. Кратко, ламивудин является аналогом цитидина. Он может ингибировать обратную транскриптазу гепатита В. Он фосфорилируется до активных метаболитов, которые конкурируют за включение в вирусную ДНК.
Адефовир является нециклическим фосфонатным аналогом нуклеотида, предназначенным для перорального приема, ингибирующим HBV-полимеразу терминацией цепи. Основное преимущество адефовира по сравнению с ламивудином (первый нуклеотидный ингибитор обратной транскриптазы (NRTI) разрешенный для лечения гепатита В) заключается в том, что до развития устойчивости вируса к адефовиру проходит более длительный период времени. Адефовир дипивоксил содержит две единицы пивалоилоксиметила, что делает его пролекарственной формой адефовира.
Энтекавир является циклопентильным аналогом гуанозина, предназначенным для перорального приема, ингибирующим ДНК-прайминг HBV. Транскрипция отрицательно-спирализованной HBV ДНК и синтез положительно-спириалзованной HBV ДНК является обратным.
Тенофовир является аналогом нуклеотида, блокирующим обратную транскриптазу. Тенофовир дизопроксил фумарат является пролекарственной формой тенофовира.
Телбивудин является L-изомером тимидина и вызывает терминацию цепи ДНК HBV.
Таким образом, отдельный предпочтительный вариант осуществления предоставляет способ установления, имеет ли пациент с гепатитом В повышенную вероятность положительного результата лечения гепатита В по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий определение, содержит ли содержащий нуклеиновую кислоту образец указанного пациента с гепатитом В по меньшей мере один аллель SNP, ассоциированный с положительным результатом, как показано на фиг. 1 и/или на фиг. 2, и/или установление, содержит ли образец указанного пациента с гепатитом уровень (экспрессии) карнитина или производного карнитина, ассоциированный с положительным результатом лечения гепатита В, при этом указанное лечение гепатита В включает введение интерферона (предпочтительно интерферона 2 альфа или пегилированного интерферона, более предпочтительно PEG-интерферона 2 альфа в комбинации с аналогом нуклеотида или нуклеозида, выбранным из группы, состоящей из ламивудина, адефовира, адефовир дипивоксила, энтекавира, тенофовира, тенофовир дизопроксил фумарата и телбивудина.
В отдельном предпочтительном варианте осуществления чувствительность пациента с гепатитом В для обеспечения положительного результата лечения гепатита В определяется способом согласно изобретению, при этом указанное лечение гепатита В включает введение интерферона (предпочтительно интерферона 2 альфа или пегилированного интерферона, более предпочтительно PEG-интерферона 2 альфа) в комбинации с адефовиром или тенофовиром. Наиболее предпочтительно указанное лечение включает лечение PEG-интерфероном 2 альфа, например, PEGasys®, в комбинации с адефовиром или тенофовиром, предпочтительно адефовиром. Как правило, лечение PEGasys® осуществляется путем подкожного введения (еженедельная подкожная инъекция) на протяжении 48 недель, тогда как ингибиторы вирусной ДНК-полимеразы (аналоги нуклеозидов/нуклеотидов) вводятся перорально в течение более длительного времени, т.е. на протяжении более чем одного года у 80% пациентов. Однако, в современных режимах комбинированной терапии лечение ингибиторами вирусной ДНК-полимеразы прекращают вместе с PEG-интерфероном после 48 недель. Подробности можно найти в работе J.L. Dienstag N Engl J Med 2008, 359; 1486-1500.
Фиг. 1 показывает несколько SNPs генома человека, которые связаны с результатом лечения HBV. В частности, одним предпочтительным ассоциированным с положительным результатом аллелем является G аллель SNP rs12356193. Как показано в примерах этот аллель rs12356193 был в значительной степени связан с исчезновением HBsAg по истечении последующего лечения HBV, с р-значением 2,61Е-09 и общей частотой минорного аллеля 0,11. В частности, поэтому предпочтительный вариант осуществления предоставляет способ установления согласно изобретению, имеется ли у пациента с гепатитом В повышенная вероятность положительного результата лечения гепатита В по сравнению с средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий определение, содержит ли содержащий нуклеиновую кислоту образец указанного пациента с гепатитом В по меньшей мере G аллель SNP rs12356193.
Другим предпочтительным ассоциированным с положительным результатом аллелем является T784G в геноме HBV, это означает, что в положении 784 HBV присутствует гуанидин вместо тимина. При использовании в описании положения нуклеотидов HBV определяются как положения в специфических для генотипа эталонных последовательностях adw2 (Х02763), aad (D00330), (АВ033556), ayw (Х02496) и (Х75657) для генотипов А, В, С, D и Е, соответственно, или положения, соответствующие им в других HBV штаммах. Для каждого отдельного штамма HBV специалист способен определить положения нуклеотидов, соответствующие положениям указанных выше эталонных штаммов, например, путем выравнивания с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей ClustalW Multiple Alignment in BioEdit (Hall, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor и analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp.Ser. 41:95-98). В Примерах показано, что аллель T784G в значительной степени ассоциирован с исчезновением HBsAg на неделе 96 после проведения поправки Бонферрони для множественных сравнений. Этот аллель встречается у 4 из 9 пациентов, у которых достигается исчезновение HBsAg на неделе 96, и не встречается ни у одного из пациентов, которые не достигли исчезновения HBsAg. Поэтому предпочтительный вариант осуществления предоставляет способ установления согласно изобретению, имеется ли у пациента с гепатитом В повышенная вероятность положительного результата лечения гепатита В по сравнению с средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий определение, содержит ли содержащий нуклеиновую кислоту образец указанного пациента с гепатитом В по меньшей мере аллель HBV T784G.
Для того чтобы увеличить прогностическое значение результата лечения HBV, полезно установить, присутствует ли более чем один ассоциированный с положительным результатом SNP аллель, показанный на фиг. 1 и/или фиг. 2, в образце, содержащем нуклеиновую кислоту. Поэтому согласно изобретению предоставляется способ, включающий установление, присутствует ли в данном образце по меньшей мере 2, предпочтительно по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ассоциированных с положительным результатом SNP аллелей, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2. Пациент с HBV, у которого содержится по меньшей мере два ассоциированных с положительным результатом SNP аллеля, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2, имеет так называемый "гаплотип положительного результата". Предпочтительно по меньшей мере один из упомянутых выше SNP аллелей подвергается проверке, так как эти аллели в значительной степени ассоциированы с результатом лечения HBV. Поэтому способ согласно изобретению, включающий обнаружение SNP rs12356193 и/или HBV SNP в положении 784, является предпочтительным. В одном предпочтительном варианте осуществления определяют и SNP rs12356193 и HBV SNP в положении 784. Предпочтительно определяют, присутствует ли G аллель SNP rs12356193 и/или HBV T784G аллель в содержащем нуклеиновую кислоту образце, предпочтительно в сочетании по меньшей мере с одним другим ассоциированным с положительным результатом аллелем SNP, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2. Наиболее предпочтительно определяют, присутствует ли G аллель SNP rs12356193 и HBV T784G аллель в содержащем нуклеиновую кислоту образце, необязательно в сочетании по меньшей мере с одним другим ассоциированным с положительным результатом аллелем SNP, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2.
Один вариант осуществления включает выявление полиморфизмов HBV нуклеотидов в положениях 784 и 1888 (или положениях соответствующих им в HBV штаммах, отличных от упомянутых выше консенсусных штаммов). Аллель G1888W также ассоциируется с отсутствием HBsAg на неделе 96 после начала лечения HBV, как показано в примерах. В связи с этим, проверка наличия полиморфизмов HBV нуклеотидов в положениях HBV 784 и 1888 (или положениях соответствующих им в HBV штаммах, отличных от упомянутых выше консенсусных штаммов) увеличивает прогностическое значение в отношении результата лечения HBV. Следует отметить, наличие SNP в генотипе HBV зависит от генотипа HBV, при использовании в качестве эталона специфического для генотипа эталонного штамма. Поэтому, например, аллель А1135Н был отмечен в генотипе А, и аллель C1135Н в генотипах В, С, D и Е.
В другом предпочтительном варианте осуществления исследуются HBV SNPs в положениях 784, 1888 и/или 97 (или положениях соответствующих им в HBV штаммах, отличных от упомянутых выше консенсусных штаммов). В примерах показано, что аллель G97A также ассоциируется с отсутствием HBsAg на неделе 96 после начала лечения HBV. В связи с этим, проверка наличия полиморфизмов нуклеотидов HBV в положениях 784 и 1888 или положениях 784 и 97 дополнительно увеличивает прогностическое значение в отношении результата лечения HBV.
Любой из вышеупомянутых аллелей HBV предпочтительно исследуется в сочетании по меньшей мере с SNP rs12356193, необязательно дополнительно в сочетании по меньшей мере с другим SNP, показанным на фиг. 1, для того, чтобы дополнительно увеличить прогностическое значение в отношении результата лечения HBV.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение также предоставляет интерферон или другой иммуномодулятор необязательно в комбинации с ингибитором вирусной ДНК-полимеразы (предпочтительно аналога нуклеозида или аналога нуклеотида) для использования при лечении гепатита В, при этом лечению подвергается пациент с гепатитом В, который при тестировании был определен, как позитивный в отношении по меньшей мере одного ассоциированного с положительным результатом SNP аллеля, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2, и/или который при проверке был определен как позитивный в отношении ассоциированного с положительным результатом уровня карнитина или производного карнитина.
Как объяснялось ранее, наличие такого ассоциированного с положительным результатом SNP аллеля и/или наличие такого ассоциированного с положительным результатом уровня карнитина или производного карнитина в образце данного пациента с HBV служит признаком наличия повышенной вероятности у указанного индивидуума оказаться пациентом, ответившим на лечение, по сравнению со средним значением в популяции с хроническим гепатитом В, в результате чего будет наблюдаться отсутствие HBsAg, устойчивый вирусологический ответ и/или уменьшение HBsAg более чем на 1,5 log в крови указанного пациента на или до 24 недели лечения. Соответственно, такому пациенту с HBV будет легко назначать лечение от HBV, несмотря на то, что состояние пациента может не быть оптимальным. С другой стороны, если у данного пациента при тестировании не обнаружен SNP аллель или гаплотип, ассоциированный с положительным результатом лечения, и/или не обнаружен уровень карнитина или производного карнитина, ассоциированный с положительным результатом, такое лечение может быть исключено для данного пациента, что дает возможность избежать липших расходов, тяжести лечения и побочных эффектов.
Предпочтительно HBV-терапию получает пациент с гепатитом В, при тестировании установленный как позитивный в отношении по меньшей мере аллеля G SNP rs12356193 и/или аллеля T784G генома HBV, необязательно в сочетании по меньшей мере с одним другим, связанным с положительным результатом SNP аллелем, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2, таким как например, HBV А/С1135Н аллель и/или HBV G1888W аллель.
В другом предпочтительном варианте осуществления HBV-терапию получает пациент с гепатитом В, у которого был исследован уровень карнитина в плазме, при этом установленный уровень карнитина был равен или составлял меньше чем 33,3 микромоль/литр, предпочтительно был равен или меньше чем 29 микромоль/литр.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления HBV-терапию получает пациент с гепатитом В, у которого был исследован уровень ацетил-L-карнитина в плазме, при этом установленный уровень ацетил-L-карнитина был равен или меньше чем 3,89 микромоль/литр.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления HBV-терапию получает пациент с гепатитом В, у которого был исследован уровень проприонил-L-карнитина в плазме, при этом установленный уровень проприонил-L-карнитина был равен или меньше чем 0,43 микромоль/литр.
Согласно описанию выше, указанное лечение HBV предпочтительно включает введение интерферона, предпочтительно интерферона 2 альфа или пегилированного интерферона, более предпочтительно PEG-интерферона 2 альфа. Другими предпочтительными неограничивающими примерами известных в настоящее время терапевтических соединений интерферона являются PEG-интерферон альфа 2b (ПегИнтрон), пег-интерферон лямбда, локтерон, Консенсус интерферон и IFN-гамма.
Указанное лечение интерфероном предпочтительно комбинируют с ингибитором вирусной ДНК-полимеразы, таким как аналог нуклеозида или нуклеотида. Такой аналог нуклеозида или нуклеотида наиболее предпочтительно выбирают из группы, состоящей из ламивудина, адефовира, адефовир дипивоксила, энтекавира, тенофовира, тенофовир дизопроксил фумарата и телбивудина.
Теперь, когда настоящее изобретение предоставляет понимание того, что результат лечения гепатита В ассоциируется с некоторыми SNP в геноме инфицированного индивидуума и в геноме HBV, становится возможным получение коллекции молекул нуклеиновых кислот, содержащих последовательности HBV, ассоциированные с результатом лечения. В частности, такая коллекция пригодна для тестирования HBV пациента в отношении результата лечения HBV. Соответственно, такая коллекция называется "коллекцией, предназначенной для предсказания результата лечения HBV" или "HBV-специализированной коллекцией". Разумеется, другие последовательности нуклеиновых кислот могут присутствовать в такой HBV-специализированной коллекции, такие как, например, эталонные нуклеиновые кислоты и калибровочные стандарты, при условии, что по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% полинуклеотидов HBV-специализированной коллекции содержат SNP, ассоциированный с результатом лечения HBV, предпочтительно выбранный из SNP, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2. HBV-специализированная коллекция может иметь, например, форму состоящего из частей набора или панели или микропанели или вектора.
Соответственно, дополнительно предоставляется состоящий из частей набор или панель или микропанель или вектор, состоящий по меньшей мере из двух полинуклеотидов, содержащих SNP, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2, и необязательно один или более эталонных полинуклеотидов, при этом по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% полинуклеотидов указанного состоящего из частей набора или панели или микропанели или вектора содержат SNP, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2.
В частности, такая специально сформированная коллекция HBV пригодна для тестирования содержащего нуклеиновую кислоту образца пациента с HBV с целью оценки, является ли указанный пациент восприимчивым к лечению гепатита В. Следовательно, также предоставляется применение состоящего из частей набора или панели или микропанели или вектора согласно изобретению для типирования содержащего нуклеиновую кислоту образца пациента с гепатитом В, а также применение состоящего из частей набора или панели или микропанели или вектора согласно изобретению для установления, имеется ли у пациента с гепатитом В повышенная вероятность положительного результата лечения гепатита В по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В. Как сказано ранее, указанный пациент с гепатитом В предпочтительно является пациентом с хроническим гепатитом В.
Состоящий из частей набор или панель или микропанель или вектор согласно изобретению предпочтительно содержит набор праймеров или зондов, каждый из указанных праймеров или зондов имеет в длину, независимо друг от друга, примерно от 8 до 50 нуклеотидов, предпочтительно от 8 до 30 нуклеотидов, более предпочтительно от 8 до нуклеотидов, и отличаются тем, что указанные праймеры или зонды являются комплементарными к последовательности, содержащей SNP, как показано на фиг. 1 или фиг. 2. В частности, такие праймеры и зонды пригодны для обнаружения и/или амплификации полиморфизмов нуклеотидов генома человека и/или HBV, ассоциированных с результатом лечения HBV, обеспечивая таким образом возможность типирования содержащего нуклеиновую кислоту образца пациента с гепатитом В. Следовательно, дополнительно предоставляется применение по меньшей мере одного изолированного полинуклеотида, содержащего SNP, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2, для типирования содержащего нуклеиновую кислоту образца пациента с гепатитом В. Длина такого изолированного полинуклеотида составляет предпочтительно в пределах от 8 до 50 нуклеотидов, более предпочтительно в пределах от 8 и 30 нуклеотидов, более предпочтительно в пределах от 8 до 25 нуклеотидов. Предпочтительно по меньшей мере один указанный полинуклеотид является по меньшей мере на 80% комплементарным с участком, по меньшей мере из 8, предпочтительно по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 12, более предпочтительно по меньшей мере из 15 нуклеотидов любой одной из последовательностей, представленных на фиг. 1 или 2. Разумеется, должно быть точно установлено для какой аллели указанный полинуклеотид является специфическим. Следовательно, нуклеотид, определяющий аллель SNP, не должен изменяться. Однако, фланкирующие последовательности указанных SNP могут изменяться до некоторой степени по сравнению с природными фланкирующими последовательностями. Более предпочтительно по меньшей мере используется полинуклеотид, комплементарный к G аллелю SNP rs12356193 и/или T784G аллелю HBV, поскольку эти аллели в значительной степени связаны с положительным результатом лечения НВV.
Изобретение дополнительно предоставляет способ анализа на наличие в образце нуклеиновой кислоты, содержащей ассоциированный с положительным результатом SNP аллель, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2, включающий контактирование указанного образца по меньшей мере с одним полинуклеотидом, содержащим SNP, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2, и установление, гибридизируется ли указанный полинуклеотид с нуклеиновой кислотой в образце. Указанный способ анализа предпочтительно включает анализ на основе ПЦР или анализ на основе мультиплексной амплификации лигированных зондов (MLPA). Предпочтительно определяют, гибридизируется ли указанный полинуклеотид с нуклеиновой кислотой в образце в строгих условиях. Термин "гибридизируется в строгих условиях" предназначается для описания условий гибридизации и отмывки, при которых нуклеотидные последовательности по меньшей мере на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% тождественные друг другу, как правило, остаются гибридизированными друг с другом. Подобные строгие условия известны специалистам в данной области техники, кроме того их можно найти в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y (1989), 6.3.1-6.3.6. Неограничивающими примерами строгих условий гибридизации являются гибридизация в 6х хлорид натрия/цитрат натрия (SSC) примерно при 45°С, с последующими одной или более промывками в 0,2 х SSC, 0,1% SDS при 50-65°С. И в этом случае определяющий SNP аллель нуклеотид должен быть строго установлен. Фланкирующие последовательности SNP по меньшей мере одного указанного полинуклеотида предпочтительно являются комплементарными по меньшей мере на 80% с любой одной из последовательностей, показанных на фиг. 1 или 2. Более предпочтительно используется полинуклеотид, у которого фланкирующие последовательности SNP по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно полностью комплементарны любой одной из последовательностей, показанных на фиг. 1 или 2. В отдельном предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере используется полинуклеотид, комплементарный к G аллелем SNP rs12356193 и/или T784G аллелем HBV.
Кроме того, изобретением предусматривается состоящий из частей набор или панель или микропанель или вектор или применение согласно изобретению, в котором, указанный по меньшей мере один полинуклеотид способен амплифицировать нуклеиновокислотную последовательность, длиной от 50 до 600 нуклеотидов, предпочтительно от 100 до 400 нуклеотидов, более предпочтительно 150-250 нуклеотидов, при этом указанная последовательность содержит SNP, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2.
Изобретение дополнительно предоставляет применение способов установления уровня экспрессии карнитина и/или производного карнитина (предпочтительно ацетил-L-карнитина и/или проприонил-L-карнитина) для типирования образца, полученного от пациента с гепатитом В.
В некоторых вариантах осуществления изобретение также предоставляет способ установления, имеет ли индивидуум генетическую предрасположенность к повышенной вероятности получения положительного результата лечения гепатита В по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий определение, содержит ли геномная нуклеиновая кислота указанного индивидуума по меньшей мере один связанный с положительным результатом SNP аллель, как показано на фиг. 1, предпочтительно по меньшей мере, G аллель SNP rs12356193, и/или определение, имеется ли в образце указанного индивидуума уровень (экспрессии) карнитина и/или производного карнитина, который ассоциируется с положительным результатом лечения гепатита В.
Другим применением текущего изобретения является специфическая идентификация гена, ассоциированного с повышенной вероятностью для пациента с гепатитом В положительного результата лечения гепатита В по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В. Это делается путем идентификации генов, связанных с SNP, в соответствии с изобретением. После того, как такой ген идентифицирован, предпочтительно сравнивают белковые последовательности и/или уровни экспрессии белков между пациентами с ответом на лечение и пациентами без ответа на лечение, например, для понимания молекулярных путей, связанных с повышенной вероятностью положительного результата лечения HBV. Соответственно, в одном варианте осуществления данное изобретение имеет отношение к способу идентификации гена, ассоциированного с повышенной вероятностью положительного результата лечения гепатита В у пациента с гепатитом В по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий:
- идентификацию гена, содержащего SNP, как показано на фиг. 1, и
- сравнение экспрессии указанного гена у индивидуума, имеющего ассоциированный с положительным результатом аллель SNP, как показано на фиг. 1, с экспрессией указанного гена у индивидуума, не имеющего ассоциированного с положительным результатом аллеля, на наличие различий, указывающих, что указанный ген связан с повышенной вероятностью положительного результата лечения гепатита В.
В еще одном варианте осуществления предоставляется способ согласно изобретению, с помощью которого также определяют, имеется ли у указанного индивидуума исходное содержание HBsAg в сыворотке менее чем 387 IU/мл, до начала лечения гепатита В. Исходное содержание HBsAg в сыворотке менее чем 387 IU/мл, может использоваться в качестве другого параметра, предсказывающего положительный результат лечения гепатита В (R.B. Takkenberg, thesis University of Amsterdam (2011), The Netherlands, chapter 2, ISBN 9789090263045). Следовательно, сочетание способа согласно изобретению и установления исходного содержания HBsAg имеет даже повышенное прогностическое значение в отношении результата лечения гепатита В.
Термины "индивидуум", "пациент", "хозяин" и "субъект" используются в описании взаимозаменяемым образом и относятся к позвоночному животному, предпочтительно млекопитающему, более предпочтительно человеку.
Настоящее изобретение использует, если не указано иное, общепринятые методы молекулярной биологии (включая рекомбинантные методы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые являются частью данной области техники.
При использовании в описании единственное число любого термина может также охватывать множественное число и наоборот.
При использовании в описании производное карнитина предпочтительно включает ацетил-L-карнитин и/или проприонил-L-карнитин.
Все приведенные в описании публикации и ссылки полностью включаются в данное описание путем отсылки с любой целью.
Данное изобретение дополнительно иллюстрируется следующими примерами. Эти примеры не ограничивают изобретение каким бы то ни было образом, а служат только для пояснения изобретения.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1: SNP, ассоциированные с результатом лечения HBV. Каждая соответствующая последовательность может быть найдена в dbSNP с помощью своего учетного номера RefSNP accession ID (rs номер). Например, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp?term=rs12356193. Аллель каждого SNP, который ассоциируется с соответствующим результатом лечения HBV, показан в отдельной колонке (колонка 6).
Фиг. 2: Ассоциированные с положительным результатом лечения аллели HBV. Аллель каждого SNP, который ассоциируется с соответствующим результатом лечения HBV, показан в отдельной колонке (колонка 4) фиг. 2а.
Фиг. 3: График GWA-анализа исчезновения HBsAg на неделе 96 (ось у: -log 10 р-значения с использованием теста тренда Кохрана-Армитажа, ось х: положение в геноме), rs12356193 изображен в круге.
Фиг. 4: Q-Q график исчезновения HBsAg на неделе 96.
Фиг. 5: Исчезновение HBsAg в процентах в разных rs12356193 генотипах.
Фиг. 6: rs12356193 распределение аллелей у пациентов с или без исчезновения HBsAg.
Фиг. 7: а). Распределение rs12356193 генотипов среди пациентов с вирусным генотипом A, D и Е.
b). Исчезновение HBsAg в процентах в разных rs12356193 генотипах у пациентов с вирусным генотипом A, D и Е.
Фиг. 8: Схематическое изображение места расположения SNP rs12356193 на хромосоме 10.
Фиг. 9: Последовательности ПЦР гибридных праймеров.
Фиг. 10: Комбинации праймеров и полученная длина репликона.
Фиг. 11: Схема процесса секвенирования.
Фиг. 12: Средние уровни DL-карнитина (С0), ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3) для разных rs12356193 генотипов.
Фиг. 13: Средние уровни DL-карнитина (С0), ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3) у пациентов с исчезновением HBsAg в течение 2-летнего периода наблюдения без лечения и у пациентов с персистенцией HBsAg в течение 2-летнего периода наблюдения без лечения.
Фиг. 14: Уровни DL-карнитина (С0) в плазме согласно rs12356193 генотипу у всех 84 пациентов (а); уровни DL-карнитина (С0) в плазме у пациентов с или без потери HBsAg на неделе 96 (b) и на неделе 144 (с).
Фиг. 15: ROC-кривая исходных уровней DL-карнитина (С0) в связи с исчезновением HBsAg на неделе 96 у всех пациентов.
Фиг. 16: Уровни DL-карнитина (С0) в плазме у пациентов в соответствии с этнической группой и полом.
Фиг. 17: а) Уровни DL-карнитина (С0) в плазме в соответствии с rs12356193 генотипом у пациентов-мужчин, не являющихся азиатами; b) Уровни DL-карнитина (С0) в плазме у пациентов-мужчин, не являющихся азиатами, с и без исчезновения HBsAg на неделе 96.
Фиг. 18: ROC-кривая исходных уровней DL-карнитина (С0) в связи с исчезновением cHBsAg на неделе 96 у пациентов-мужчин, не являющихся азиатами.
Фиг. 19: Уровни ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3) в плазме в соответствии с rs12356193 генотипом у всех 84 пациентов.
Фиг. 20: Уровни ацетил-L-карнитина (С2) в плазме у пациентов с и без исчезновения HBsAg на неделе 96 и на неделе 144.
Фиг. 21: Уровни пропионил-L-карнитина (С3) в плазме у пациентов с и без исчезновения HBsAg на неделе 96 и на неделе 144.
Фиг. 22: ROC-кривая исходных уровней ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3 в связи с исчезновением HBsAg на неделе 96 у всех пациентов.
Фиг. 23: (а) Уровни ацетил-L-карнитина (С2) в плазме в соответствии с rs12356193 генотипом, у пациентов-мужчин, не являющихся азиатами; (b) Уровни ацетил-L-карнитина (С2) в плазме у пациентов-мужчин, не являющихся азиатами, с и без исчезновения HBsAg на неделе 96.
Фиг. 24: (а) Уровни пропионил-L-карнитина (С3) в плазме в соответствии с rs12356193 генотипом у пациентов-мужчин, не являющихся азиатами; (b) Уровни пропионил-L-карнитина (С3) в плазме у пациентов-мужчин, не являющихся азиатами, с и без исчезновения HBsAg на неделе 96.
Примеры
Пример 1
Мы анализировали результаты полногеномного исследования ассоциаций у 84 пациентов с активным хроническим гепатитом В, которых лечили пегинтерфероном и адефовиром, с целью установления связей между однонуклеотидными полиморфизмами (SNP) и результатом лечения.
Пациенты-Методы
1. PEG/ADV метод исследования
В недавно проведенном клиническом испытании при АМС [(R.B. Takkenberg, thesis University of Amsterdam (2011), The Netherlands, chapter 2, ISBN 9789090263045)] 84 пациента с хроническим гепатитом В (40 HBeAg положительных; 44 HBeAg отрицательных) с содержанием HBV ДНК≥2×104 IU/мл получали лечение Peg INF альфа-2а (Pegasys®) и ADV-дипивоксилом (Hepsera®) в течение 48 недель, с последующим наблюдением в течение 24-недель (и вплоть до 5 лет) без лечения.
Критериями ответа были HBeAg сероконверсия (исчезновение HBeAg с появлением анти- НВе антител), SVR (уровни HBV ДНК≤2000 IU/мл и нормализация ALT), и HBsAg сероконверсия (исчезновение HBsAg с появлением анти-HBs антител) в течение последующего наблюдения.
2. Основные характеристики пациентов
Исследуемая популяция отличалась значительной гетерогенностью по происхождению, что было отражено в распределении генотипов А (26), В (14), С (12), D (23) и Е (9). Устойчивый вирусологический ответ (SVR) был достигнут у 32 пациентов. HBeAg сероконверсия наблюдалась в течение лечения у 14 HBeAg-положительных пациентов. Исчезновение в сыворотке поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg), определенное как HBsAg уровни на более низком пределе чувствительности при количественном определении (0,05 IU/мл) с использованием Abbot Architect, было достигнуто у 9 пациентов в конце периода наблюдения (11%).
Статистически значимых различий основных характеристик не было обнаружено при сравнении всех пациентов. Однако, у HbeAg-позитивных участников пожилого возраста наблюдалась положительная связь с HBsAg сероконверсией (OR увеличение 1,16 в 1 год при исходном [95% CI, 1,008-1,337] р=0,039). У HBeAg-негативных участников и низкий исходный HBsAg (OR 16,96 на Hog10 IU/мл уменьшение [95% CI, 2,85-101] р=0,002) и HBV ДНК (OR 2,36 на 1log10 IU/мл уменьшение [95% CI, 1,02-5,45] р=0,044) были связаны с повышенной вероятностью HBsAg сероконверсии. При многофакторном анализе HBsAg был только независимым предсказывающим показателем HBsAg сероконверсии (OR 17,00 на 1log10 IU/мл уменьшение [95% CI 2,27-127, р=0,006). [Как описано в (R.B. Takkenberg, thesis University of Amsterdam (2011), The Netherlands, chapter 2, ISBN 9789090263045)].
3. Генотипирование
Приготовление образца ДНК (введение ДНК 200 нг)
Генотипирование 84 индивидуумов проводили по Roche (Nutley) при использовании Illumina Human Omnil-Quad BeadChip (Illumina, Inc. San Diego, США).
Результаты измерения интенсивности зерен (гранул) были обработаны и нормализованы в BeadStudio (Illumina); результаты успешно генотипированных образцов извлекали и генотипам давали название в пределах коллекций, используя Illuminus.
4. Исследование, ассоциированное с изучением всего генома (GWAS) и статистика
Полногеномное исследование GWA было проведено с помощью пакета GenABEL* в R Statistical Software (программное обеспечения для статистики).
* Aulchenko YS, Ripke S, Isaacs A, van Duijn CM. GenABEL: an R library for genome-wide association analysis. Bioinformatics (2007) 23 (10): 1294-1296.
Всего 999,091 различных SNP было генотипировано у 84 человек. После проверки качества 204862 (20,5%) SNP были исключены, как имеющие низкую (<5%) частоту минорного аллеля, 86 (0,009%) SNPs вследствие низкого call rate (>5% недостающие данные) и 31 (0,003%) SNP, потому что они не подчинялись закону Харди-Вейнберга (Р<1е-10). Ни один пациент не был исключен из-за низкого (<95%) call rate, чрезмерной аутосомной гетерозиготности (FDR<1%) или слишком высокой IBS (>=0,95). Всего 794130 (79,5%) SNP и 84 (100%) человека были удовлетворительными по всем критериям и были использованы для дальнейшего исследования.
Был проведен ассоциативный анализ исчезновения HBsAg в течение одного года наблюдения после лечения (неделя 96) у всей исследуемой популяции. В дополнение к этому, ассоциативные анализы были проведены при получении других результатов лечения (HBeAg сероконверсия, SVR и HBsAg уменьшение на неделе 24) у всех пациентов в совокупности и у пациентов, сгруппированных по происхождению или вирусному генотипу отдельно.
Имело место некоторое чрезмерное увеличение сводной статистики, что могло быть признаком стратификации популяции (см. график Q-Q исчезновение HBsAg на неделе 96). Лямбда λ значения находились в пределах от 0,97 до 1,07, свидетельствуя о возможном влиянии на положительные ассоциации вследствие стратификации популяции.
Статистическую значимость связи с каждым SNP оценивали с использованием теста для тренда Кохрана-Армитажа с 1 степенью свободы (1-d.f.). Мы использовали консервативную поправку Бонферрони для контроля величины ошибки ложного обнаружения, происходящей в результате множественных сравнений, и поэтому рассматривали полногеномные ассоциации при значении Р<6,3×10Е-8 (=0,05/794,161) для достоверности по всему геному. Вероятность успешного исхода и доверительные интервалы вычисляли, используя основной аллель в качестве эталонного. HWE р-значения вычисляли в GenABEL.
Результаты
Фиг. 3 представляет график -log10 Р значений. Р значения вычисляли с использованием теста для тренда Кохрана-Армитажа с 1 степенью свободы (1-d.f.) Большая отмеченная кругом точка на хромосоме 10 показывает полногеномную значимую ассоциацию SNP rs12356193 при исчезновении HBsAg в течение одного года наблюдения после лечения (неделя 96).
Фиг. 4 показывает Q-Q график исчезновения HBsAg на неделе 96.
Фиг. 5 показывает исчезновение HBsAg в процентах в разных rs12356193 генотипах.
Фиг. 6 показывает rs12356193 аллельное распределение у пациентов с и без исчезновения HBsAg.
Фиг. 7 показывает распределение rs12356193 генотипов среди пациентов с вирусным генотипом A, D и Е и процент исчезновения HBsAg в разных rs12356193 генотипах у пациентов с вирусным генотипом A, D и Е.
Фиг. 8 показывает схематическое изображение расположения SNP rs12356193 на хромосоме 10.
Обсуждение
Минорный аллель одного SNP, rs12356193, был значимо ассоциирован с исчезновением HBsAg в первый год наблюдения (Фиг.) при р-значении 2.61Е-09 и общей частоте минорного аллеля 0,12. Этот SNP располагается на хромосоме 10 в гене SLC16A9.
Фиг. 1 также показывает другие SNP, ассоциированные с результатом лечения гепатита В, которые являются подходящими для увеличения прогностического значения. Аллели, ассоциированные с положительными результатами, показаны в колонке шесть.
Эти открытия имеют двойное клиническое значение;
1. Во-первых, выделение групп риска среди пациентов посредством SNP генотипирования помогает выбрать метод лечения. Выбор метода лечения с наибольшей вероятностью положительного результата, такого как исчезновение HBsAg, уменьшение SVR или HBsAg более чем на 1,5 log на неделе 24, будет способствовать решению - начинать или нет лечение на основе пегинтерферона.
2. Во-вторых, новая связь SLC16A9 локусов с хроническим гепатитом В говорит о важной роли этого гена в ответе на лечение HBV пегинтерфероном и адефовиром. Эта связь обеспечивает новый взгляд на иммунный ответ хозяина на инфекцию вирусом гепатита В и предоставляет новые возможные мишени для терапевтических препаратов.
Пример 2
Мы анализировали данные о последовательностях HBV у 84 пациентов с хроническим гепатитом В, которых лечили пегинтерфероном и адефовиром, чтобы установить связи между однонуклеотидными полиморфизмами (SNP) и результатом лечения.
Пациенты-Методы
1. PEG/ADF метод исследования
В недавно проведенном клиническом исследовании при АМС [В. Takkenberg et al. (R.B. Takkenberg, thesis University of Amsterdam (2011), The Netherlands, chapter 2, ISBN 9789090263045)] 84 пациента с активным хроническим гепатитом В (40 HBeAg положительных; 44 HBeAg отрицательных) получали лечение Peg INF альфа-2а (Pegasys®) и ADF-дипивоксилом (Hepsera®) в течение 48 недель, с последующим 24-недельным периодом наблюдения (и вплоть до 5 лет) без лечения.
2. Исходные характеристики пациентов
Исследуемая популяция отличалась заметной гетерогенностью по происхождению, что было отражено в распределении генотипов А (26), В (14), С (12), D (23) и Е (9). Устойчивый вирусологический ответ (SVR) был достигнут у 32 пациентов. HBeAg сероконверсия наблюдалась в течение лечения у 14 HBeAg-положительных пациентов. Исчезновение в сыворотке поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg), определенное как HBsAg уровни на более низком пределе чувствительности при количественном определении (0,05 IU/мл) с использованием Abbot Architect, было достигнуто у 9 пациентов в конце периода наблюдения (11%).
3. Приготовление образца
Было создано несколько наборов гибридных ПЦР-праймеров, чтобы амплифицировать 13 ампликонов и охватить HBV-геном. Были созданы праймеры со специфическими последовательностями с вырожденными основаниями в положениях, чтобы компенсировать изменения в HBV эталонных последовательностях для генотипов А, В, С, D и Е (Entrez identifiers Х02763, D00330, AY123041, J02203, Х75657 соответственно). Полученные ПЦР-фрагменты были иммобилизованы на ДНК-«захватывающих зернах» через уникальный однонитевой участок, чтобы обеспечить присоединение фрагментов к зернам в соотношении 1:1; т.е. каждый фрагмент был присоединен к отдельному зерну.
4. Эмульсионная ПЦР-амплификация и секвенирование
Связанную с зернами библиотеку эмульгировали с реактивами для амплификации в смеси вода-в-масле, получая в результате микрореакторы (microreactors), содержащие на одном зерне один уникальный образец-фрагмент библиотеки. Каждый уникальный образец-фрагмент библиотеки был амплифицирован параллельно в его собственном микрореакторе, исключая конкуренцию или загрязнение последовательностей. Несущие ДНК «захватывающие зерна» были загружены в устройство PicoTiterPlate для секвенирования каждого зерна в лунке.
После загрузки устройства PicoTiterPlate в прибор 454 Genome Sequencer FLX Instrument, отдельные нуклеотиды «протекали» в установленном порядке через открытые ячейки (open wells) и ДНК «захватывающие зерна». Добавление одного (или более) нуклеотида(ов) комплементарного к матричной цепи вызывало хемилюминесцентный сигнал, регистрируемый CCD камерой прибора Genome Sequencer FLX Instrument. Полный рабочий цикл ПЦР и секвенирование проводили с помощью 454 Life Sciences, Branford СТ.
Фиг. 9, 10 и 11 показывают праймеры, ампликоны и схематический план протокола секвенирования.
5. Выравнивание и статистика
Специфические HBV последовательности пациентов выравнивали с помощью ClustalW Multiple Alignment и программного обеспечения BioEdit для анализа последовательностей*.
* Hall, Т.А. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor и analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98.
Нуклеотиды в каждом положении у каждого пациента сравнивали с genotype specific reference sequence. В качестве эталонных последовательностей использовали А adw2 (X02763), Ba ad (D00330), С (AB033556), D ayw (X02496) и E (X75657) для генотипов А, В, С, D и E соответственно. Положения, в которых по меньшей мере три или более мутаций присутствовали у всех пациентов, были использованы для дальнейшего исследования. Всего было проанализировано 503 положения с использованием таблиц сопряженности частот (frequency cross tables) и критерия хи-квадрат для пропорций.
Мы использовали консервативную поправку Бонферрони для контроля величины ошибки ложного обнаружения, происходящей в результате множественных сравнений, и поэтому рассматривали ассоциации при значении Р<9,9×10Е-5 (=0,05/503) как статистически значимые.
Был проведен ассоциативный анализ исчезновения HBsAg в течение одного года наблюдения после лечения (неделя 96) у всей исследуемой популяции. В дополнение к этому, ассоциативные анализы были проведены при получении других результатов лечения (HBeAg сероконверсия, SVR и HBsAg уменьшение на неделе 24) у всех пациентов в совокупности и у пациентов, сгруппированных по происхождению или вирусному генотипу отдельно.
Результаты
Было обнаружено, что одна мутация HBV в значительной степени связана с исчезновением HBsAg на неделе 96 после применения поправки Бонферрони для множественных сравнений (фиг. 2). Эта мутация была обнаружена у 4 из 9 пациентов, у которых было достигнуто исчезновение HBsAg на неделе 96, и не была обнаружена ни у одного пациента без исчезновения HBsAg. Фиг. 2 показывает также другие мутации HBV, ассоциированные с результатом лечения гепатита В, которые являются подходящими для увеличения прогностического значения. Например, анализ наличия или T784G или G1888W мутации в сочетании намного улучшал связь (фиг. 2).
Обсуждение
Нуклеотид в положении 784 располагается на S и Открытой рамке считывания (ORF) гена полимеразы. В S ORF мутация в этом положении вызывает замену аминокислоты серина (S) на аргинин (R) (фиг. 2). Следовательно, эта мутация в вирусном геноме является маркером ответа на лечение.
Пример 3
В примере 1 мы установили сильную связь между минорным аллелем (G) однонуклеотидного полиморфизма (SNP) и исчезновением HBsAg в первый год наблюдения без лечения у этих пациентов. Этот SNP, rs12356193, располагается на хромосоме 10 в интронном участке SLC16A9 гена. Интересно, что наличие этого SNP, как было описано, является строго связанным с уровнями L-карнитина в других GWA-исследованиях (Kolz et al. 2009). Однако, не сообщалось об исследовании эффекта уровней L-карнитина на исчезновение HBsAg у пациентов с хроническим гепатитом В, которых лечили пегинтерфероном и/или адефовиром.
Поэтому мы хотели определить уровни L-карнитина у пациентов СНВ, которых лечили пегинтерфероном и адефовиром, и найти связи между rs12356193 генотипом и исчезновением HBsAg.
Пациенты
Был отобран 21 пациент для измерения DL-карнитина (С0), ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3) (см. раздел методы).
Основные характеристики пациентов, включенных в это исследование, показаны в таблице 1. В общем, 2 пациента имели GG генотип с SNP rs12356193, 10 пациентов с генотипом AG и 9 пациентов с генотипом АА. Существенных различий в исходных характеристиках между пациентами с генотипом AG или GG и пациентами с генотипом АА не наблюдалось.
Методы
Уровни L-карнитина и производного карнитина в исходных образцах плазмы были измерены в отделении Генетических метаболических нарушений (GMZ) при АМС с помощью тандемной масс-спектрометрии согласно стандартному протоколу.
Исчезновение HBsAg в этой выборке пациентов было определено как необнаружимые уровни HBsAg при использовании Abbott AxSYM (HBsAg<0,05 IU/мл). Уровни L-карнитина и производного карнитина показаны в микромолях на мл при этом различия между средними были проверены с помощью критерия Стьюдента для одной выборки. Значения Р ниже 0,05 считались статистически значимыми.
Результаты
Средние уровни DL-карнитина (С0), ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3) для разных rs12356193 генотипов показаны на фиг. 12 и в таблице 2. У пациентов с rs12356193 генотипом AG или GG наблюдались значимо более низкие уровни С0, С2 и С3, чем у пациентов с генотипом АА.
Средние уровни DL-карнитина (С0), ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3) у пациентов с исчезновением HBsAg в течение двух лет наблюдения после лечения и у пациентов с персистенцией HBsAg в течение двух лет наблюдения после лечения показаны на фиг. 13 и в таблице 2. У пациентов с исчезновением HBsAg наблюдались значимо более низкие уровни С0, С2 и С3, чем у пациентов с персистенцией HBsAg.
Заключение
В исследовании GWAS, когда 84 СНВ пациента получали лечение пегинтерфероном и адефовиром, мы установили строгую связь между минорным аллелем (G) SNP (rs12356193) и исчезновением HBsAg. Мы подтвердили, что уровни DL-карнитина (С0), ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3) были в значительной степени связаны с разными rs12356193 генотипами. Кроме того, мы показали, что у пациентов с исчезновением HBsAg наблюдались значимо более низкие уровни С0, С2 и С3, чем у пациентов с персистенцией HBsAg.
Пример 4
В примере 3, мы подтвердили, что уровни DL-карнитина (С0), ацетил-L-карнитина (C2) и пропионил-L-карнитина (C3) были в значительной степени связаны с разными rs12356193 генотипами и что у пациентов с исчезновением HBsAg наблюдались значимо более низкие уровни С0, С2 и С3, чем у пациентов с персистенцией HBsAg.
В этом примере, мы расширили исследуемую популяцию до 84 пациентов и кроме того, оценили уровни DL-карнитина (С0), ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3) в плазме как предсказывающих факторов исчезновения HBsAg и связи уровней С0, С2 и С3 с исчезновением HBsAg в субпополяции мужчин неазиатского происхождения..
Методы (измерение карнитин с помощью MS-MS)
Для оценки концентрации карнитина и производных карнитина в плазме использовали тройной квадрупольный масс-спектрометр Quattro II (Micromass, Manchester, UK) в режиме отрицательной ионизации электрораспылением (ESI) и систему сбора и обработки данных micromass MassLynx с использованием вводимого объема 50 микролитров в лаборатории Genetic Metabolic Disorders (АМС, Амстердам, Нидерланды), следуя описанному ранее методу (Chase et al. 1997).
Пациенты
Исходные характеристики пациента показаны в таблице 3.
Результаты
1. Связь уровней DL-карнитина (С0) в плазме с SNP rs12356193 и исчезновением HBsAg
SNP rs12356193 располагается на хромосоме 10 в интронной области SLC16A9 гена. Сообщалось, что этот SNP строго связан с уровнями DL-карнитина (С0) в плазме в других GWAS исследованиях (Kolz et al. 2009) (β-3,58, р=4,0×10-26). Эта связь была подтверждена в нашей полной исследуемой когорте (n=84), так как средние уровни DL-карнитина (С0) в плазме значительно различались у пациентов с GG, AG и АА генотипом (26,3 vs 33,7 vs 37,7 мкмоль/л соответственно, р=0,02, фиг. 14а и таблица 3). Уровни DL-карнитина (С0) в плазме также были более низкими у пациентов с исчезновением HBsAg на неделе 96, чем у пациентов с персистенцией HBsAg (31,1 vs 37,3 мкмоль/л, р=0,02, фиг. 14b). Предоставляются данные о результатах лечения всех пациентов, участвующих в нашем исследовании вплоть до 2 лет после завершения лечения (неделя 144). Уровни DL-карнитина (С0) в плазме были также более низкими у пациентов с исчезновением HBsAg на неделе 144, чем у пациентов с персистенцией (32,2 vs 37,4 мкмоль/л, р=0,02, фиг. 14 с).
2. Уровни DL-карнитина (С0) в плазме как прогностический фактор исчезновения HBsAg на неделе 96
Дискриминацию переменных, определенную как способность различать пациентов, которые достигли исчезновения HBsAg на неделе 96, от пациентов, которые не достигли исчезновения, оценивали с помощью площади (AUC) под Roc-кривой.
Фиг. 15 показывает AUC для прогнозирования исчезновения HBsAg на неделе 96, которая составляла 0,75 (95% CI, 0,54-0,96; р=0,01). При использовании исходных уровней DL-карнитина (С0)≤33.31 мкмоль/л в качестве предельных значений, положительная прогностическая значимость (PPV) составляла 24% и отрицательная прогностическая значимость (NPV) составляла 96%, при этом чувствительность составляла 78% и специфичность 71%.
3. Субанализ уровней DL-карнитина (С0) в плазме у мужчин неазиатского происхождения
Известно, что различные факторы влияют на уровень DL-Карнитина (С0) в плазме, например, пищевой рацион, пол, возраст и заболевание (Cederblad et al. 1976; Cederblad et al 1987; Flanagan 2010). В нашей когорте уровень DL-карнитина (С0) значительно варьировал у пациентов различного пола и этнической принадлежности (фиг. 16).
Поскольку происхождение и пол, по-видимому, являются вмешивающимися факторами для уровней DL-карнитина (С0) в нашем исследовании, в дополнение к обнаружению очень низкого распространения благоприятного SNP у уроженцев Азии, мы решили дополнительно оценить связь уровней DL-карнитина (С0) и исчезновения HBsAg в субпопуляции мужчин неазиатского происхождения (n=44).
4. Связь уровней DL-карнитина (С0) в плазме с SNP rs12356193 и исчезновением HBsAg у мужчин неазиатского происхождения
В целом, средний исходный уровень DL-карнитина (С0) у пациентов мужского пола неазиатского происхождения составлял 36,5 мкмоль/л (SD 7,0). У мужчин неазиатского происхождения средние уровни DL-карнитина (С0) в плазме достоверно различались у пациентов с GG, AG и АА генотипом (26,3 vs 33,7 vs 38,5 мкмоль/л, соответственно, р=0,01, фиг. 17а).
В дополнение к этому, уровни DL-карнитина (С0) в плазме были более низкими у мужчин неазиатского происхождения с исчезновением HBsAg на неделе 96, чем с персистенцией HBsAg (28,4 vs 38,3 мкмоль/л, соответственно, р<0,001, фиг. 17b). Следует отметить, что все пациенты неазиатского происхождения с исчезновением HBsAg были мужского пола (n=8), вследствие чего субанализ связи уровней DL-карнитина (СО) и исчезновения HBsAg у женщин неазиатского происхождения был невозможен.
5. Уровни DL-карнитина (С0) в плазме как прогностический фактор исчезновения HBsAg на неделе 96 у мужчин неазиатского происхождения
Фиг. 18 показывает AUC для прогнозирования исчезновения HBsAg, которое составляло 0,75 (95% CI, 0,54-0,96; р=0,01). При использовании исходных уровней DL-карнитина (С0)≤33,31 мкмоль/л в качестве предельных значений, положительная прогностическая значимость (PPV) составляла 50% и отрицательная прогностическая значимость (NPV) составляла 97%, при этом чувствительность составляла 88% и специфичность 81%.
6. Связь уровней ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3) в плазме с SNP rs12356193 и отсутствием HBsAg
Ацетил-L-карнитин (С2) и пропионил-L-карнитин (С3) представляют собой два сложных эфира DL-карнитина (С0) и также измеряются методом тандемной масс-спектроскопии. Для этих двух сложных эфиров были обнаружены подобные связи с SNP rs12345193 и исчезновением HBsAg, как у DL-карнитина (С0).
Средние уровни ацетил-L-карнитина в плазме достоверно различались у пациентов с генотипом GG, AG и АА (2,49 vs 3,51 vs 4,10 мкмоль/л, соответственно, р=0,03, фиг. 19а), однако, эта связь не была значимой в отношении уровня пропионил-L-карнитина (0,30 vs 0,42 vs 0,44 мкмоль/л соответственно, р=0,50, фиг. 19b).
Уровни в плазме ацетил-L-карнитина также были более низкими у пациентов с исчезновением HBsAg на неделе 96, чем у пациентов с персистенцией HBsAg (2,95 vs 4,08 мкмоль/л, р=0,004, фиг. 20а и таблица 3). Такая же связь была обнаружена для уровня пропионил-L-карнитина в плазме (0,30 vs 0,45 мкмоль/л, р=0,02, фиг. 21а и таблица 3). У пациентов с исчезновением HBsAg на неделе 144 также наблюдались значимо более низкие уровни и ацетил-L-карнитина (С2) (3,22 vs 4,09 мкмоль/л, р=0,009, фиг. 20b), и пропионил-L-карнитина (С3) (0,32 vs 0,46 мкмоль/л, р=0,009, фиг. 2lb).
7. Уровни ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3) в плазме как s прогностический фактор исчезновения HBsAg на неделе 96
Фиг. 22а показывает AUC для предсказания исчезновения HBsAg на неделе 96 при использовании ацетил-L-карнитина (С2), которое составляло 0,80 (95% CI, 0,65-0,94; р=0,003). При использовании исходных уровней ацетил-L-карнитина (С2)≤3,89 мкмоль/л в качестве предельных значений, положительная прогностическая значимость (PPV) составляла 19% и отрицательная прогностическая значимость (NPV) составляла 98%, при этом чувствительность составляла 89% и специфичность 53%.
Фиг. 22b показывает AUC для предсказания исчезновения HBsAg на неделе 96 при использовании пропионил-L-карнитина (С3), которое составляло 0,78 (95% CI, 0,64-0,92; р=0,006). При использовании исходных уровней пропионил-L-карнитина (С3)≤0.43 мкмоль/л в качестве предельных значений, положительная прогностическая значимость (PPV) составляла 18% и отрицательная прогностическая значимость (NPV) составляла 100%, при этом чувствительность составляла 100% и специфичность 47%.
8. Суб-анализ уровней ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3) в плазме у мужчин неазиатского происхождения
Суб-анализ мужчин неазиатского происхождения не повлиял на значение нашего открытия в отношении ацетил-L-карнитина (С2) и пропионил-L-карнитина (С3), как показано на фиг. 23 и 24.
Список литературы
Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403.
Aulchenko YS, Ripke S, Isaacs A, van Duijn CM. GenABEL: an R library for genome-wide association analysis. Bioinformatics (2007) 23 (10): 1294-1296.
Cederblad G. Plasma DL-carnitine (C0) и body composition. Clin Chim Acta. 1976 Mar 1; 67(2): 207-12.
Cederblad G. Effect of diet on plasma DL-carnitine (C0) levels и urinary DL-carnitine (C0) excretion in humans. Am J Clin Nutr. 1987 Apr; 45(4): 725-9.
Chace DH et al. Rapid diagnosis of MCAD deficiency: quantitative analysis of octanoylcarnitine и other acylcarnitines in newborn blood spots by tandem mass spectrometry. ClinChem. 1997 Nov; 43(11): 2106-13.
Dienstag J.L. N Engl J Med 2008, 359; 1486-1500.
Dowdy и Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983.
Flanagan JL et al. Role of DL-Carnitine (C0) in disease. Nutr Metab (Lond). 2010 Apr 16; 7:30. doi: 10.1186/1743-7075-7-30.
Galibert F et al. Nature. 1979 Oct 25; 281(5733): 646-50).
Hall, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor и analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98.
Kolz M et al. Meta-analysis of 28,141 individuals identifies common variants within five new loci that influence uric acid concentrations. PLoS Genet. 2009 Jun; 5(6):el000504.
Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2,482.
Takkenberg, R.B.. Thesis University of Amsterdam (2011) The Netherlands. Chapter 2, ISBN 9789090263045.
Wiley, John & Sons, Current Protocols in Molecular Biology N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.
Claims (9)
1. Способ определения, имеется ли у пациента с гепатитом В повышенная вероятность положительного результата лечения гепатита В по сравнению со средней вероятностью в популяции пациентов с гепатитом В, включающий установление, содержит ли содержащий нуклеиновую кислоту образец указанного пациента с гепатитом В ассоциированный с положительным результатом G аллель SNP rs 12356193, как показано на фиг. 1.
2. Способ по п. 1, в котором указанный пациент с гепатитом В страдает от хронического гепатита В.
3. Способ по п. 1, в котором содержащий нуклеиновую кислоту указанный образец является ДНК-содержащим образцом, мазком слюны, или образцом крови, или образцом сыворотки.
4. Способ по п. 1, включающий выявление G аллели SNP rs 12356193 в комбинации по меньшей мере с одним другим SNP, как показано на фиг. 1.
5. Способ по п. 1, в котором указанный положительный результат выбирают из группы, состоящей из исчезновения HBsAg, исчезновения HBsAg в сочетании с сероконверсией анти-НВ, устойчивого вирусологического ответа и уменьшения HBsAg более чем на 1,5 log, в крови указанного пациента на или до 24 недели лечения.
6. Способ по п. 1, в котором указанное лечение гепатита В включает введение интерферона или другого иммуномодулятора, необязательно в комбинации с ингибитором вирусной ДНК-полимеразы, предпочтительно аналога нуклеозида или аналога нуклеотида.
7. Способ по п. 1, дополнительно включающий определение, наблюдается ли у указанного индивидуума исходное содержание HBsAg менее чем 387 IU/мл до начала лечения гепатита В.
8. Способ по п. 1, в котором указанный ассоциированный с положительным результатом SNP аллель содержит HBV T784G аллель.
9. Способ по п. 1, включающий выявление SNP rs12356193 в положении 784.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP12160199.1 | 2012-03-19 | ||
EP12160199 | 2012-03-19 | ||
EP12186188.4 | 2012-09-26 | ||
EP12186188 | 2012-09-26 | ||
PCT/NL2013/050204 WO2013141705A2 (en) | 2012-03-19 | 2013-03-19 | Means and methods for response prediction of hepatitis b treatment |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2014142009A RU2014142009A (ru) | 2016-05-10 |
RU2640256C2 true RU2640256C2 (ru) | 2017-12-27 |
Family
ID=47997743
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014142009A RU2640256C2 (ru) | 2012-03-19 | 2013-03-19 | Средства и способы предсказания ответа на лечение гепатита b |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20150044167A1 (ru) |
EP (1) | EP2828401B1 (ru) |
BR (1) | BR112014023296A2 (ru) |
ES (1) | ES2657266T3 (ru) |
HK (1) | HK1206791A1 (ru) |
IN (1) | IN2014MN01989A (ru) |
MX (1) | MX2014011256A (ru) |
RU (1) | RU2640256C2 (ru) |
WO (1) | WO2013141705A2 (ru) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3083991B1 (en) * | 2013-12-17 | 2018-03-14 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Biomarkers for hbv treatment response |
EP3322820A1 (en) * | 2015-07-15 | 2018-05-23 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Biomarkers for hbv treatment response |
CN109504763B (zh) * | 2018-12-17 | 2020-09-04 | 北京三元基因药业股份有限公司 | 用于预测α干扰素治疗乙肝患者疗效的分子标记 |
BR112021010453A2 (pt) | 2018-12-19 | 2021-08-24 | Leo Pharma A/S | Composto, e, composição farmacêutica |
CN115267193B (zh) * | 2022-09-20 | 2022-12-27 | 北京大学 | 用于判断生物样本中HBsAg来源的方法及系统和用途 |
-
2013
- 2013-03-19 IN IN1989MUN2014 patent/IN2014MN01989A/en unknown
- 2013-03-19 BR BR112014023296A patent/BR112014023296A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2013-03-19 WO PCT/NL2013/050204 patent/WO2013141705A2/en active Application Filing
- 2013-03-19 ES ES13712387.3T patent/ES2657266T3/es active Active
- 2013-03-19 MX MX2014011256A patent/MX2014011256A/es unknown
- 2013-03-19 EP EP13712387.3A patent/EP2828401B1/en not_active Not-in-force
- 2013-03-19 US US14/386,176 patent/US20150044167A1/en not_active Abandoned
- 2013-03-19 RU RU2014142009A patent/RU2640256C2/ru not_active IP Right Cessation
-
2015
- 2015-07-27 HK HK15107184.4A patent/HK1206791A1/xx unknown
-
2017
- 2017-08-29 US US15/689,582 patent/US20180044735A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (7)
Title |
---|
ERIK H. C. J. BUSTER et al. Factors That Predict Response of Patients With Hepatitis B e Antigen-Positive Chronic Hepatitis B to Peginterferon-Alfa, GASTROENTEROLOGY, 2009, Vol.137, pp. 2002-2009. * |
LIFENG LIU et al. Effects of Variant rs346473 in ARHGAP24 Gene on Disease Progression of HBV Infection in Han Chinese Population, J Huazhong Univ Sci Technol [ Med Sci ] , 2011, Vol. 31, No.4, pp. 482-487. * |
LIFENG LIU et al. Effects of Variant rs346473 in ARHGAP24 Gene on Disease Progression of HBV Infection in Han Chinese Population, J Huazhong Univ Sci Technol [ Med Sci ] , 2011, Vol. 31, No.4, pp. 482-487. MILAN J. SONNEVELD et al. Polymorphisms Near IL28B and Serologic Response to Peginterferon in HBeAg-Positive Patients With Chronic Hepatitis B, GASTROENTEROLOGY, 2012, Vol.142, pp. 513-520. MELANIE KOLZ et al. Meta-Analysis of 28,141 Individuals Identifies Common Variants within Five New Loci That Influence Uric Acid Concentrations, PLoS Genetics, June 2009, Volume 5, Issue 6, e1000504. ERIK H. C. J. BUSTER et al. Factors That Predict Response of Patients With Hepatitis B e Antigen-Positive Chronic Hepatitis B to Peginterferon-Alfa, GASTROENTEROLOGY, 2009, Vol.137, pp. 2002-2009. M. BRION et al. New technologies in the genetic approach to sudden cardiac death in the young, Forensic Science International, 2010, Vol.203, pp. 15-24. Т.В. СИМАНКОВА и др. Полиморфизм гена ИЛ-28В как преди * |
M. BRION et al. New technologies in the genetic approach to sudden cardiac death in the young, Forensic Science International, 2010, Vol.203, pp. 15-24. * |
MELANIE KOLZ et al. Meta-Analysis of 28,141 Individuals Identifies Common Variants within Five New Loci That Influence Uric Acid Concentrations, PLoS Genetics, June 2009, Volume 5, Issue 6, e1000504. * |
MILAN J. SONNEVELD et al. Polymorphisms Near IL28B and Serologic Response to Peginterferon in HBeAg-Positive Patients With Chronic Hepatitis B, GASTROENTEROLOGY, 2012, Vol.142, pp. 513-520. * |
Т.В. СИМАНКОВА и др. Полиморфизм гена ИЛ-28В как предиктор ответа на противовирусную терапию хронического гепатита С, Клиническая фармакалогия и терапия. 2012, т. 21, No. 1, с. 1-6. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2828401B1 (en) | 2017-10-25 |
ES2657266T3 (es) | 2018-03-02 |
US20150044167A1 (en) | 2015-02-12 |
MX2014011256A (es) | 2015-07-14 |
US20180044735A1 (en) | 2018-02-15 |
HK1206791A1 (en) | 2016-01-15 |
IN2014MN01989A (ru) | 2015-07-10 |
RU2014142009A (ru) | 2016-05-10 |
BR112014023296A2 (pt) | 2019-09-24 |
WO2013141705A2 (en) | 2013-09-26 |
EP2828401A2 (en) | 2015-01-28 |
WO2013141705A3 (en) | 2013-12-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Halgand et al. | Hepatitis B virus pregenomic RNA in hepatocellular carcinoma: a nosological and prognostic determinant | |
US20180044735A1 (en) | Method of treating hepatitis b | |
Zhang et al. | Deep sequencing analysis of quasispecies in the HBV pre-S region and its association with hepatocellular carcinoma | |
US20220202770A1 (en) | Composition for treating hepatitis b, and method for evaluating replication activity of hepatitis b virus | |
Suppiah et al. | Drug-resistance associated mutations in polymerase (p) gene of hepatitis B virus isolated from malaysian HBV carriers | |
Khattab et al. | Analysis of HCV co-infection with occult hepatitis B virus in patients undergoing IFN therapy | |
Han et al. | Analysis of hepatitis B virus genotyping and drug resistance gene mutations based on massively parallel sequencing | |
Bayliss et al. | Advances in the molecular diagnosis of hepatitis B infection: providing insight into the next generation of disease | |
Hao et al. | Naturally occurring deletion/insertion mutations within HBV whole genome sequences in HBeAg-positive chronic hepatitis B patients are correlated with baseline serum HBsAg and HBeAg levels and might predict a shorter interval to HBeAg loss and seroconversion during antiviral treatment | |
Widasari et al. | A deep-sequencing method detects drug-resistant mutations in the hepatitis B virus in Indonesians | |
Rybicka et al. | High-Throughput Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry as an Alternative Approach to Monitoring Drug Resistance of Hepatitis B Virus | |
Xu et al. | New point mutations in surface and core genes of hepatitis B virus associated with acute on chronic liver failure identified by complete genomic sequencing | |
Wang et al. | Viral quasispecies of hepatitis B virus in patients with YMDD mutation and lamivudine resistance may not predict the efficacy of lamivudine/adefovir rescue therapy | |
CN115066505A (zh) | 生物标记物及其在治疗慢性乙型肝炎感染中的用途 | |
Chen et al. | Association of human leukocyte antigen-DR-DQ-DP haplotypes with the risk of hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma | |
Roque-Afonso et al. | Monitoring the Emergence of Hepatitis B Virus Polymerase Gene Variants during Lamivudine Therapy in Human Immunodeficiency Virus Coinfected Patients: Performance of Clip™ Sequencing and Line Probe Assay | |
Wei et al. | Genetic variation in FCER1A predicts peginterferon alfa‐2a‐induced hepatitis B surface antigen clearance in East Asian patients with chronic hepatitis B | |
JP4398379B2 (ja) | B型肝炎ウイルスの薬物抵抗性を識別する方法 | |
US20060194217A1 (en) | Method of genotyping and phenotyping hepatitis B viruses resistant to antiviral molecules | |
Li et al. | Detection of primary YMDD mutations in HBV-related hepatocellular carcinoma using hybridization-fluorescence polarization | |
JP2017502663A (ja) | Hbv治療反応に関するバイオマーカー | |
Wang et al. | A novel baseline hepatitis B virus sequencing-based strategy for predicting adefovir antiviral response | |
KR20130113208A (ko) | 만성 b형 간염 치료제의 약제내성 예측용 조성물 및 그 예측 방법 | |
Chen et al. | Locus 5p13. 1 may be associated with the selection of cancer-related HBV core promoter mutations | |
Xu et al. | The central nervous system is a potential reservoir and possible origin of drug resistance in HBV |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190320 |