JP2002537835A - 合成遺伝子エレメントを同定する方法及び試薬 - Google Patents

合成遺伝子エレメントを同定する方法及び試薬

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、トランスフォームされた細胞等の特定の細胞型の増殖を選択的に阻害する(例えば、細胞増殖抑制性又は細胞障害性である)機能的遺伝子断片の迅速な回収及び同定を可能にする選択方法に関係する。そのストラテジーは、部分的に、小さい遺伝子断片の、優性に作用する合成遺伝子エレメント(ＳＧＥ)(例えば、それらが由来した遺伝子の機能に干渉する分子)をコードする能力に依存している。主題の方法により同定することのできるＳＧＥには、阻害性アンチセンスＲＮＡ分子、リボザイム、核酸デコイ及び小ペプチドが含まれるが、これらに限らない。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 不活性化すべき遺伝子の全部又は一部を含む合成遺伝子エレメントの発現によ
る遺伝子の機能的不活性化は、当分野で公知である。かかる特異的な遺伝子エレ
メントの発現がそれらの対応する遺伝子の不活性化を生じる少なくとも４つの機
構が存在する。これらは、阻害すべきタンパク質又はその一部の非機能的又は部
分的に非機能的な類似体を含むポリペプチドによるタンパク質機能に対する干渉
であり、ｍＲＮＡの翻訳に対する相補的なアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡによる
干渉であり、リボザイムと結合したアンチセンスＲＮＡによるｍＲＮＡの破壊で
あり、そしてｍＲＮＡに対する重要な調節配列を表すｍＲＮＡの一部に対して相
同なＲＮＡ配列による干渉である。
【０００２】 遺伝子の抑制は遺伝子機能の科学的研究に極めて有用であり、病気の治療並び
に植物及び動物の遺伝子改変におけるある種の応用のために相当有望であるが、
有効な合成遺伝子エレメント(ＳＧＥ)を同定するための現在の方法は、時間を浪
費し、骨の折れるものである。優性ネガティブ変異型タンパク質による干渉は、
例えば、適度に有望な候補の変異型タンパク質を製造し得るようにタンパク質の
機能的ドメイン構造に関する広範囲の知識を必要とし、又は個別の製造及び多く
の候補の変異型タンパク質のスクリーニングを必要とする。アンチセンスＲＮＡ
及び競争的相同ＲＮＡは、同様に、広範な個別の製造及び候補の阻害性配列のス
クリーニングを必要とする(そのＲＮＡ内の重要な特異的配列に関する相当の知
識がない場合)。
【０００３】 それ故、過度の実験又は広範囲の構造／機能の知識がなくても、有効なエレメ
ントの簡単な測定を可能にする、ＳＧＥを同定して単離するための一般化された
方法に対する要求がある。理想的方法は、複数の可能な候補のＳＧＥを、それら
の作用機構によらずに、同時に分析することを可能にするものである。
【０００４】発明の要約 本発明は、下記を含む、所望の表現型を標的細胞に選択的に与える薬剤を同定
する方法を提供することにより、薬物の発見を容易にする： (ｉ)潜在的な合成遺伝子エレメント(ＳＧＥ)のコード配列の多彩な集団を含む発
現ベクターのライブラリーでサブトラクティブ細胞をトランスフェクトし； (ｉｉ)所望の表現型又はその検出と干渉する表現型をこれらのサブトラクティブ
細胞に与えるＳＧＥライブラリーのＳＧＥベクターを単離し； (ｉｉｉ)標的細胞を、ステップ(ｉｉ)で単離したＳＧＥベクターのサブポピュレ
ーションでトランスフェクトし；そして (ｉｖ)所望の表現型を標的細胞に与えるＳＧＥベクターを単離する。
【０００５】 主題の方法の一つの面は、下記を含む、標的細胞に対する選択的な抗増殖活性
を有する薬剤を同定する方法に関係する： (ｉ)潜在的な合成遺伝子エレメント(ＳＧＥ)のコード配列の多彩な集団を含む発
現ベクターのライブラリーでサブトラクティブ細胞をトランスフェクトし； (ｉｉ)これらのサブトラクティブ細胞に対して致死的でないＳＧＥライブラリー
のＳＧＥベクターを単離し； (ｉｉｉ)標的細胞を、ステップ(ｉｉ)で単離した非致死的ＳＧＥベクターでトラ
ンスフェクトし；そして (ｉｖ)標的細胞に対して致死的であるＳＧＥベクターを単離する。
【０００６】 好適具体例において、この方法は、標的細胞及びサブトラクティブ細胞を用いて
実施し、該細胞は、真核細胞であり、好ましくは哺乳動物細胞である。ある具体
例においては、標的細胞とサブトラクティブ細胞の一方又は両方は、ヒトの細胞
である。
【０００７】 ある具体例においては、標的はトランスフォームされた細胞であり、サブトラ
クティブ細胞はトランスフォームされてない細胞である。
【０００８】 他の具体例においては、標的はウイルスに感染した細胞であり、サブトラクテ
ィブ細胞は感染してない細胞である。
【０００９】 好適具体例において、発現ベクターは、ウイルスベクターであり、一層好まし
くはレトロウイルスベクターである。
【００１０】 このＳＧＥライブラリーは、標準化ｃＤＮＡライブラリー、サブトラクティブ
ｃＤＮＡライブラリー又はこれらの組合せから生成することができる。
【００１１】 ランダムな組み込み又は位置指定のクローニングによって、このライブラリー
を、ペプチドをコードするセンスの向きの配列及び／又はアンチセンスＲＮＡを
コードするアンチセンスの向きの配列を有するＳＧＥを含むように生成すること
ができる。
【００１２】 この発明の他の面は、主題の方法により同定されたＳＧＥの配合物に関係する
。例えば、本発明は、主題の方法により同定されたＳＧＥによりコードされるア
ンチセンスＲＮＡのヌクレオチド配列の約１２ヌクレオチドから全部にまで至る
ヌクレオチド配列を有する合成オリゴヌクレオチドを提供する。他の具体例にお
いて、この発明は、主題の方法により同定されたＳＧＥによりコードされる単離
されたペプチド又はそのペプチド模倣物を提供する。
【００１３】好適具体例の詳細な説明 ｉ．概観 一面において、本発明は、細胞型選択的様式で所望の表現型を与える核酸配列
を同定する方法を提供することにより薬物送達を促進する。そのストラテジーは
、優性に作用する合成遺伝子エレメント(ＳＧＥ)例えばそれらが由来した遺伝子
と干渉する分子(アンタゴニスト)又はかかる遺伝子の優性の構成的に活性な断片
である分子(アゴニスト)をコードする小さい遺伝子断片の能力に部分的に依存し
ている。主題の方法により同定することのできるＳＧＥには、ポリペプチド、阻
害性アンチセンスＲＮＡ分子、リボザイム、核酸デコイ及び小さいペプチドが含
まれるが、これらに限らない。
【００１４】 例えば、医薬としての潜在的な直接的な治療上の価値に加えて、本発明により
同定されるＳＧＥは、潜在的な診断及び他の治療上の価値をも有する内因性遺伝
子を同定する。例えば、同定されたＳＧＥにより活性が不活性化される遺伝子自
体を、薬物開発のために、例えばやはり内因性遺伝子の機能を阻害することので
きる他の薬剤例えば小分子及び天然抽出物を同定するために、標的として利用す
ることができる。従って、本発明の他の面は、適宜、選択したＳＧＥに対応する
遺伝子(又は、その遺伝子産物)のアゴニスト又はアンタゴニストを検出するため
の薬物スクリーニングアッセイを提供する。同様にして、特定の病理的表現型を
阻害することのできるＳＧＥの同定は、適宜、対応する内因性遺伝子の機能の喪
失又は機能変異の獲得を評価することのできる診断用アッセイを示すであろう。
【００１５】 一般に、主題の方法は、少なくとも一つの「サブトラクティブ」細胞株及び「
標的」細胞株を利用する。ここで用いる場合、「所望の表現型」は、主題の方法
のユーザーが求めて、ＳＧＥの発現に際して標的細胞に選択的に与えられる特定
の表現型をいう。即ち、所望の表現型は、ＳＧＥの発現に依存しており、そのＳ
ＧＥの標的細胞株における発現に際して選択的に与えられるが、サブトラクティ
ブ細胞株では与えられない。サブトラクティブ細胞株は、ＳＧＥを、これらのＳ
ＧＥが標的細胞における所望の表現型の検出に干渉することに基づいて多彩なＧ
ＳＥライブラリーから排除するために用いられる(例えば、ＳＧＥは、所望の表
現型を与えることについて標的細胞株に対して選択的でないので排除される)。
【００１６】 図１は、一般的なアプローチ方法を説明している。主題の方法は、多彩なＳＧ
Ｅライブラリーを例えば標的細胞から用意する第一のステップを含む。標的細胞
における所望の表現型の検出に干渉しないライブラリーのＳＧＥを、サブトラク
ティブ細胞からレスキューする。このサブライブラリー例えば「サブトラクテッ
ドライブラリー」を、次いで、標的細胞株にトランスフェクトする。標的細胞に
所望の表現型を与えるＳＧＥを同定することができ、例えば単離して配列決定す
ることができる。この点において、「サブトラクテッドＳＧＥライブラリー」は
、ＳＧＥの２つのクラスからなる。第一のクラスは、ＳＧＥ活性を有しない(遺
伝子機能を阻害せず／干渉しない)か又はそのＳＧＥが阻害してもスクリーニン
グにおける関連表現型を有しない遺伝子の活性を阻害するＤＮＡ断片を含む。我
々は、大部分のライブラリーがこのクラスに属すると予想している。第二のクラ
スは、阻害すると所望の表現型を与える遺伝子の機能に干渉する機能的ＳＧＥを
含む。我々は、富化ＳＧＥライブラリーの小さい画分がこのクラスに属すると予
想している。ＳＧＥの第二のグループを富化させるために、われわれは、反復す
るトランスフェクション――＞選択――＞増幅のサイクルを利用する。このサイ
クルの結果は、所望の表現型を有するＳＧＥは増幅されるが、無関係の表現型を
有するＳＧＥはライブラリーから消失するというものである。このトランスフェ
クション――＞選択――＞増幅サイクルを、実質的にすべてのトランスフェクト
された細胞が所望の表現型を示すまで続ける。これらのＳＧＥは、富化ステップ
によって、選択的に(少なくとも、富化ステップに用いた様々なサブトラクティ
ブ細胞株に関して選択的に)、所望の表現型を標的細胞集団に与えるであろう。
【００１７】 例えば、一具体例において、本発明は、特定の細胞型例えばトランスフォーム
された細胞の増殖を選択的に阻害する(例えば、特定の細胞型に対して細胞増殖
抑制性の又は細胞障害性の)機能的遺伝子断片の迅速な回収及び同定を可能にす
る選択方法を提供する。主題の方法の利点は、ある細胞型の増殖に臨界的である
が他の細胞型の増殖には臨界的でない遺伝子の優性の不活性化により、致死的Ｓ
ＧＥの表現型選択を可能にすることである。例えば、主題の方法を用いて、腫瘍
細胞に致死的であるが正常細胞の増殖又は生存力には実質的に干渉しないＳＧＥ
を同定することができる。
【００１８】 図２は、トランスフォームされた細胞例えば腫瘍細胞の増殖を阻止するＳＧＥ
を同定するために本発明の方法を実施するための典型的方法を説明している。Ｓ
ＧＥライブラリーを、発現ベクターのライブラリーの形態で提供する(即ち、そ
れは、ライブラリーの個々のベクターにおいて与えられるＳＧＥの配列に関して
多彩である)。この説明の図式において、ＳＧＥライブラリーを、腫瘍細胞から
単離された核酸から生成する。このＳＧＥライブラリーを、サブトラクティブ細
胞(例えば、ＳＧＥライブラリーを生成した腫瘍細胞に対応するトランスフォー
ムしてない細胞)にトランスフェクトする。説明のために、このＳＧＥライブラ
リーを、基底細胞癌から単離したｃＤＮＡから生成することができ、サブトラク
ティブ細胞は正常ケラチノサイトであってよい。
【００１９】 これらのＳＧＥ発現ベクターは、ＳＧＥが発現する条件下での数回の分裂の後
に生存し得るサブトラクティブ細胞からレスキューされる。この富化ステップの
理論的解釈は、少なくとも部分的に、多くのＳＧＥ配列がハウスキーピング遺伝
子を阻害するという理解である(正常細胞及びトランスフォームされた細胞の両
方に対して細胞障害性であろう事象)。正常細胞に対して致死的であるＳＧＥを
トランスフェクトされた細胞は死ぬであろうし、それらのＳＧＥ配列はライブラ
リーから失われるであろう。ライブラリーのレスキューされた部分は、サブトラ
クティブ細胞に対して致死的でないＳＧＥ配列について富化される。
【００２０】 このサブトラクテッドライブラリーを、次いで、標的腫瘍細胞にトランスフェ
クトする。アポトーシスを受けるトランスフェクトされた細胞を単離し、ＳＧＥ
発現構築物を、それらの細胞からレスキューする。これらのレスキューされたＳ
ＧＥ配列は、サブトラクティブ細胞に対して致死的でないが標的細胞に対しては
最終的に致死的であるものに相当する。これらの致死的ＳＧＥ配列は、富化ステ
ップの一方又は両方により、例えば特異的且つ高度に浸透性のＳＧＥを更に富化
させるために再利用され得る。
【００２１】 一般に、このアプローチは、ＳＧＥ及びそれらの対応する標的遺伝子(その活
性が、病気の細胞の生存及び／又は病気の表現型の維持に必須であるもの)を同
定するのに有用である。これらの「病気特異的遺伝子」の病気の細胞における阻
害は、それらの病気の細胞の死又は病気の細胞の正常な表現型への復帰を生じる
。対照的に、正常細胞における同じ機能の阻害は、正常細胞の生理に対して如何
なる不可逆的効果も有しない。
【００２２】 この方法により同定されたＳＧＥ及び標的遺伝子は、病気の選択的治療に用い
ることができ、又は有用な薬物療法の発見のための手段として利用することがで
きる。これらのコードされたタンパク質は、そのコードされたタンパク質の機能
と干渉することにより標的遺伝子の機能を阻害する低分子量の薬物を同定するた
めの薬物スクリーニングアッセイにおいて用いることができる。これらの薬物の
治療領域が広いことは、この遺伝子の阻害が正常細胞には影響しないが病気の細
胞には致死的であるので、ありそうなことである(これらの遺伝子の同定に用い
たＳＧＥの選択性により示されるように)。
【００２３】 「病気特異的遺伝子」を見つけるための一般的計画を、以下に記し、図３に説
明してある。ＳＧＥライブラリーを、病気の細胞から作成する。先ず、このＳＧ
Ｅライブラリーを、対応する正常細胞にトランスフェクトする。数回の細胞分裂
の後に、正常細胞に対して致死的なＳＧＥに感染した細胞は、死んで、ライブラ
リーから失われる。このサブトラクテッドライブラリーを、正常細胞から回収し
て、病気の細胞をトランスフェクトするために用いる。ＳＧＥを、死につつある
病気の細胞からレスキューし、増幅して、病気の細胞に再トランスフェクトする
。このサイクルを、富化ＳＧＥライブラリーのトランスフェクション後、実質的
にすべての病気の細胞が死ぬまで続ける。この時点で、個々のＳＧＥが、レスキ
ューされ、それらの富化ＳＧＥライブラリーにおける冗長性を、ハイブリダイゼ
ーションにより測定する。これらのＳＧＥの配列決定後、それらの内因性遺伝子
標的を測定する。これらのＳＧＥの特異性を、正常細胞及び他の病気の細胞のパ
ネルへのトランスフェクション後に、更に調べることができる。
【００２４】 他の具体例において、このアッセイを、ウイルス感染細胞の増殖を選択的に阻
害するが例えば正常細胞の増殖は阻害しないＳＧＥを同定するために誘導するこ
とができる。例えば、このＳＧＥライブラリーを、正常Ｔリンパ球の増殖又は生
存力を阻害しないがＨＩＶ感染Ｔリンパ球に対しては細胞障害性又は増殖抑制性
であるＳＧＥについて富化させることができる。かかるＳＧＥは、ヒトの治療応
用(例えば、抗ウイルス療法)に有用であり得る。これらの選択的に致死的なＳＧ
Ｅに対応する内因性遺伝子も又、下記のように、ＳＧＥを真似る選択的抗ウイル
ス活性を有する他の薬剤を同定するための薬物スクリーニングアッセイの標的で
あり得る。
【００２５】 同様に、主題の方法を用いて、特定の細胞型における病原性ウイルスの複製を
阻害するＳＧＥを同定することができ、次いで、そのＳＧＥを用いて細胞を遺伝
的に改変することができる。この発明により遺伝的に改変された細胞は、生細胞
を用いるバイオテクノロジー工程において並びにウイルス耐性細胞から得られる
食用作物において又は農業上重要なトランスジェニック動物において商業的に重
要であり得る利益例えば細胞特異的なウイルス耐性を与えることができる。
【００２６】 他の具体例において、改良された農業用植物を、望ましくない性質例えば農薬
に対する感受性、自殖植物の他家受粉又は他の農業上重要な特性の原因の遺伝子
を抑制するＳＧＥを同定することにより遺伝的改変によって生成することができ
る。従って、これらのＳＧＥを用いて、望ましくない特性を欠いたトランスジェ
ニック植物を造り、又はかかる特性を与えるＳＧＥの能力を(例えば、対応する
内因性遺伝子又は遺伝子産物の活性を調節することにより)真似る小分子若しく
は他の薬剤を開発することができる。
【００２７】 図４は、植物において農薬耐性に必要な遺伝子を抑制するＳＧＥを単離する計
画を説明している。この応用のためには、ＳＧＥライブラリーを、植物発現ベク
ター系において農薬耐性細胞から作成する。その多彩なＳＧＥライブラリーを、
農薬の非存在下で耐性細胞(サブトラクティブ細胞)に感染させて、正常な致死的
ＳＧＥを排除する。感染した生き残り細胞を、農薬と共にインキュベートし(こ
の場合、サブトラクテッドライブラリーのレスキューの必要はない)、死細胞を
集める。ＳＧＥをレスキューし、増幅して再感染させ、再び死細胞から、農薬の
存在下で〜１００％の感染細胞が死ぬまでレスキューする。これらのＳＧＥは、
植物において、その機能が農薬耐性に必要である遺伝子を抑制する。
【００２８】 更に別の具体例において、主題の方法を用いて、細胞分化を調節することので
きるＳＧＥを同定し、その結果、内因性遺伝子を同定することができる。例えば
、富化ステップは、サブトラクティブ細胞として、ある細胞型を生じさせる様々
な前駆細胞及び／又は条件を利用することができる。それらのプロセスと干渉し
ないＳＧＥを富化させ、このサブライブラリーを、標的細胞が普通に一層成熟し
た表現型に分化する条件下で標的細胞にトランスフェクトする。標的細胞におい
て(又は、標的条件下で)分化のプロセスを阻害するがサブトラクティブ細胞(又
は、サブトラクティブ条件)においては阻害しないＳＧＥを、このステップにお
ける選択によって同定することができる。従って、例えば、Thomson等、(1988) Science 282:1145及びShamblott等、(1998) PNAS 95:13726に開示されたような
胚性幹細胞の肝細胞系統への分化を与えるが膵臓、肺その他の原腸に由来する組
織への分化を阻止するＳＧＥを同定することができる。同様に、主題の方法を用
いて、神経冠幹細胞のニューロンの表現型への分化を阻止するが上皮又は平滑筋
への分化は阻止しないＳＧＥを同定することができる。上記のように、幹細胞の
分化を選択的様式で達成するＳＧＥは、機能の小分子アゴニスト又はアンタゴニ
ストを開発するために、自身が薬物スクリーニングの標的であり得る内因性遺伝
子のアイデンティティーを示す。
【００２９】 他の具体例において、主題の方法を用いて、成長因子、サイトカイン又は他の
パラクリン若しくはオートクリン因子などの細胞外シグナルに対する細胞性応答
を阻害するＳＧＥを同定することができる。例えば、ＴＧＦαは、悪性細胞にお
ける重要な陽性成長エフェクターであり、悪性の進行において重要な役割を演じ
ている。一具体例において、主題の方法は、先ず、ＴＧＦα応答性細胞のＴＧＦ
α非存在下での増殖を阻害しないＳＧＥを富化させ、又はＴＧＦα非依存的様式
で増殖する細胞の増殖を阻害しないＳＧＥを富化させる。次いで、このサブトラ
クテッドＳＧＥライブラリーをＴＧＦα応答性細胞(好ましくは、トランスフォ
ームされた細胞)にＴＧＦαの存在下でトランスフェクトし、これらの条件下で
増殖を阻害するＳＧＥを同定する。類似のアッセイ形式を用いて、正常細胞又は
トランスフォームされた細胞の他の成長因子、サイトカイン、屈性因子等に対す
る応答性を改変するＳＧＥを同定することができる。
【００３０】 この主題の方法を用いて、薬物に対する感受性を与えるＳＧＥを同定すること
もできる。例えば、この方法を用いて、化学療法剤に対する感受性を与えるＳＧ
Ｅを生成することができ、これは、薬物耐性癌細胞の診断及び治療へのアプロー
チの両方へ導くことができる。他の具体例においては、主題の方法は、薬物に対
する感受性を病原体例えば薬物耐性の細菌又はカビに与えるＳＧＥを同定するた
めに用いられる。
【００３１】 図５は、化学療法剤に対する感受性を通常この薬物に耐性である細胞において
与えるＳＧＥを見つけるためのアプローチを描いている。この例において、この
ＳＧＥライブラリーは、薬物耐性の癌細胞から構築される。この多彩なＳＧＥラ
イブラリーを、この薬物の非存在下でこの細胞(サブトラクター細胞)に導入して
、正常な致死的ＳＧＥを排除する。次に、生き残った耐性細胞を、この薬物の存
在下で生育させ(標的細胞)、死細胞を集める。これらのＳＧＥをレスキューし、
再感染させて、死細胞から、感染細胞の〜１００％が化学療法剤の存在下で死ぬ
まで再度レスキューする。これらのＳＧＥは、その機能が化学療法剤に対する耐
性の発達に必要とされる遺伝子を同定する。
【００３２】 同じアプローチを適用して、薬物耐性微生物の薬物に対する感受性を回復させ
るＳＧＥを同定することができる。この例において、この初期ＳＧＥライブラリ
ーは、適当な発現ベクターシステムにおいて、薬物耐性株から構築する。次いで
、この多彩なＳＧＥライブラリーを、薬物耐性細胞に導入して、非特異的な、正
常な致死的ＳＧＥを、これらの細胞をこの薬物の非存在下で生育させることによ
り、このライブラリーから排除する(サブトラクター細胞)。次に、生き残った細
胞を、この薬物の存在下で生育させて、死細胞を集める。同じステップを、これ
らの富化ＳＧＥライブラリーでトランスフェクトされた薬物耐性細胞の〜１００
％がその薬物の存在下で死ぬまで反復する。これらのＳＧＥは、この薬物に対す
る耐性を発達させるのに必須の機能を有する遺伝子に干渉するので、感受性を与
えるであろう。
【００３３】 本発明の他の面は、トランスフォームされた細胞の生育を選択的に阻害し、又
はトランスフォームされた細胞の抗増殖性薬剤に対する感受性を増大させる主題
の方法により同定された核酸及び／又はペプチドを提供する。かかる薬剤は、治
療に用いることができ又は細胞培養において用いることができる。例えば、主題
のＳＧＥを、トランスフォームした細胞の生育を阻止し又は一緒に投与した抗増
殖性薬剤の効果を増大させるために、動物に投与することができる。
【００３４】 同定されたＳＧＥが一のペプチド又はタンパク質をコードするある具体例にお
いては、そのＳＧＥのコード配列を用いて、発現構築物を生成する。このペプチ
ドが十分に短い他の具体例においては、そのペプチドを、ペプチド模倣物に変換
することができる。ＳＧＥがアンチセンス分子又はデコイとして機能する核酸で
ある更に別の具体例においては、そのＳＧＥを、そのＳＧＥに対応するＲＮＡに
転写される発現構築物として与えることができる。或は、核酸として阻害性であ
るＳＧＥを、加水分解可能でない類似体として与えることができる。
【００３５】 本発明の更に別の面は、本発明の方法により同定される選択的ＳＧＥの源とし
て同定された内因性遺伝子産物の活性を阻害し又は増強する(所望であれば)薬剤
を同定するための薬物スクリーニングアッセイを提供する。この発明は又、かか
る化合物の調製物、及びそれらの細胞培養添加物、医薬製剤、原料サプリメント
及び農業用配合物等の応用における利用方法をも提供する。
【００３６】 ｉｉ．定義 便宜のために、本明細書、実施例及び添付の請求の範囲で用いているある用語
をここに集めた。
【００３７】 ここで用いる場合、用語「ベクター」は、それに結合した他の核酸を輸送する
ことのできる核酸分子をいう。ベクターの一つの型は、ゲノム組込み型ベクター
又は「組込み型ベクター」であり、これは、宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込ま
れ得るものである。ベクターの他の型は、エピソーム型ベクター即ち染色体外で
複製可能な核酸である。機能的に結合された遺伝子の発現を指示することのでき
るベクターを、ここでは、「発現ベクター」と呼ぶ。本明細書中では、「プラス
ミド」及び「ベクター」は、文脈から明らかな場合を除いて、交換可能に用いる
。
【００３８】 ここで用いる場合、用語「核酸」は、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)及び適宜リボ
核酸(ＲＮＡ)等のポリヌクレオチドをいう。この用語は、記載の実施例に適用可
能であれば、一本鎖(センス又はアンチセンス等)及び二本鎖のポリヌクレオチド
を包含するものと理解されるべきである。
【００３９】 ここで用いる場合、用語「遺伝子」又は「組換え遺伝子」は、本発明のポリペ
プチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸をいい、エキソン
と(適宜)イントロンの両方を含む。「組換え遺伝子」は、調節性ポリペプチド等
をコードし、適宜染色体ＤＮＡに由来するイントロン配列を含むことのできる核
酸をいう。用語「イントロン」は、所定遺伝子中に存在するタンパク質に翻訳さ
れないＤＮＡ配列をいい、一般に、エキソンの間に見出される。ここで用いる場
合、用語「トランスフェクション」は、核酸媒介の遺伝子トランスファーによる
レシピエント細胞への、核酸例えば発現ベクターの導入を意味する。
【００４０】 「タンパク質コード配列」又は特定のポリペプチド若しくはペプチドを「コー
ドする」配列は、適当な調節配列の制御下に置かれたときに、イン・ビトロ又は
イン・ビボで、転写される(ＤＮＡの場合)及びポリペプチドに翻訳される(ｍＲ
ＮＡの場合)核酸配列である。コード配列の境界は、５’(アミノ)末端の開始コ
ドンと３’(カルボキシ)末端の翻訳停止コドンにより決定される。このコード配
列には、原核又は真核生物のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、原核又は真核生物の
ＤＮＡに由来するゲノムＤＮＡが含まれ、合成ＤＮＡ配列さえも含まれるが、こ
れらに限らない。転写終結配列が、通常、コード配列の３’側に位置される。
【００４１】 しかしながら、下記のように、包括的な用語「コード配列」は、状況が許すな
らば、自身から翻訳されるポリペプチドに対抗してそれ自身が(潜在的ＳＧＥと
して)活性なＲＮＡを生成するように転写される配列をいうことができる。
【００４２】 同様に、「コードする」は、状況から明らかな場合を除いて、ポリペプチドを
コードするＤＮＡ配列(この用語の典型的使用)並びに阻害的アンチセンス分子に
転写されるＤＮＡ配列を含むことを意味する。
【００４３】 「初期ＳＧＥライブラリー」は、潜在的な合成遺伝子エレメントのコード配列
のライブラリーである。
【００４４】 「サブトラクテッドＳＧＥライブラリー」は、元のＳＧＥライブラリーのサブ
ライブラリーであり、活性が標的細胞におけるＳＧＥライブラリーのスクリーニ
ングに干渉するであろうＳＧＥを排除するために、元のライブラリーのサブトラ
クター細胞への感染により生成される。
【００４５】 「富化ＳＧＥライブラリー」は、標的細胞において、所望の表現型を与えるＳ
ＧＥのコレクションである。この富化ライブラリーは、反復するトランスフェク
ション――＞選択――＞標的細胞におけるサブトラクテッドライブラリーの増幅
により生成する。
【００４６】 「サブトラクティブ細胞」は、多彩なＳＧＥライブラリーから、望ましくない
表現型を与えるＳＧＥを排除するために用いられる細胞である。
【００４７】 「標的細胞」は、ＳＧＥライブラリーから、所望の表現型を標的細胞に与える
ＳＧＥを同定するために用いる細胞である。
【００４８】 「正常致死的ＳＧＥ」は、少なくとも一つのサブトラクティブ細胞型に対して
致死的である合成遺伝子エレメントである。
【００４９】 「選択的致死的遺伝子」は、標的細胞型に対しては致死的であるがサブトラク
ティブ細胞型に対しては致死的でない合成遺伝子エレメントである。
【００５０】 用語「機能の喪失」は、ＳＧＥをいう場合には、遺伝子の発現を阻害し又は対
応する野生型遺伝子産物の機能の少なくとも一つと比較して実質的に減じた活性
を有し若しくは活性を有しないその遺伝子産物を与えるＳＧＥをいう。
【００５１】 遺伝子配列に関して、用語「発現」は、その遺伝子の転写及び、適宜、その結
果生成したｍＲＮＡ転写物のタンパク質への翻訳をいう。従って、状況から明ら
かとなるであろうが、タンパク質コード配列の発現は、そのコード配列の転写及
び翻訳から生じる。他方、アンチセンス配列又はリボザイムの「発現」は、直接
活性なのがＲＮＡ転写物であるので、組換え遺伝子配列の転写をいうと理解され
よう。
【００５２】 「細胞」、「宿主細胞」又は「組換え宿主細胞」は、ここでは、交換可能に用
いられる用語である。かかる用語が、特定の主題の細胞をいうだけでなく、かか
る細胞の子孫又は潜在的子孫をもいうことは理解されよう。ある種の改変が、突
然変異又は環境の影響により次の世代において生じ得るので、かかる子孫は、実
際は、親の細胞と同一でないかもしれないが、ここで用いる場合には、やはりこ
の用語の範囲内に含まれる。
【００５３】 「組換えウイルス」とは、例えば異種性核酸構築物を粒子内に付加又は挿入す
ることにより遺伝的に変化されたウイルスを意味する。
【００５４】 ここで用いる場合、用語「トランスダクション」及び「トランスフェクション
」は、当分野で認められており、核酸例えば発現ベクターのレシピエント細胞へ
の核酸媒介の遺伝子トランスファーによる導入を意味する。「トランスフォーメ
ーション」は、ここで用いる場合、外因性ＤＮＡ又はＲＮＡの細胞への取込みの
結果として、細胞の遺伝子型が変化されるプロセスをいい、例えば、トランスフ
ォームされた細胞は、組換え型のポリペプチドを発現し、又はアンチセンスの発
現がトランスファーされた遺伝子から起きる場合には、天然型のタンパク質の発
現は破壊される。
【００５５】 「一時的トランスフェクション」は、外因性ＤＮＡがトランスフェクトされた
細胞のゲノムに組み込まれない場合をいい、例えば、その場合、エピソームＤＮ
Ａは、ｍＲＮＡに転写されてタンパク質に翻訳される。
【００５６】 細胞は、核酸構築物が娘細胞に遺伝され得る場合には、その核酸構築物により
「安定にトランスフェクトされる」。
【００５７】 ここで用いる場合、「レポーター遺伝子構築物」は、少なくとも一つの転写調
節配列に機能的に結合された「レポーター遺伝子」を含む核酸である。レポータ
ー遺伝子の転写は、それらが結合された配列により制御される。これらの制御配
列の少なくとも一つの活性を、標的レセプタータンパク質によって直接又は間接
に調節することができる。典型的な転写制御配列は、プロモーター配列である。
レポーター遺伝子は、細胞中で異種的に発現されるプロモーター−レポーター遺
伝子構築物を包含することを意味する。
【００５８】 ここで用いる場合、「トランスフォームされた細胞」は、無制限的生育状態に
自然に変換された細胞をいう(即ち、それらは、培養において無限回分裂して生
育する能力を獲得している)。トランスフォームされた細胞は、それらの生育制
御の喪失に関して、新生物、未分化及び／又は過形成などの用語により特徴付け
られ得る。この発明の目的のために、用語「悪性哺乳動物細胞のトランスフォー
ムされた表現型」及び「トランスフォームされた表現型」は、哺乳動物細胞の細
胞トランスフォーメーションに関連する次の表現型の特徴の何れかを包含するこ
とを意図しているが、これらに限らない：不死化、形態又は生育上のトランスフ
ォーメーション、及び腫瘍形成性(細胞培養における延長された生育、半固体培
地における生育、又は免疫不全又は同系の動物における腫瘍形成により検出され
る)。
【００５９】 ここで用いる場合、「増殖性」及び「増殖」は、有糸分裂を受けることをいう
。
【００６０】 ここで用いる場合、「不死化細胞」は、化学的、遺伝的及び／又は組換え手段
によって、これらの細胞が培養において無限回分裂して生育する能力を有するよ
うに変化された細胞をいう。
【００６１】 細胞の「生育状態」は、細胞の増殖速度及び細胞の分化状態をいう。
【００６２】 ｉｉｉ．単離方法の典型的具体例 本発明の方法により同定されたＳＧＥは、核酸のレベルで、例えばアンチセン
ス若しくはデコイ機構により又は、タンパク質レベルでの干渉機構により阻害性
であるポリペプチド(例えば、ネイティブなタンパク質の優性ネガティブ断片)を
コードすることにより、内因性遺伝子の機能を阻害するように機能し得る。他方
において、あるＳＧＥは、対応する内因性遺伝子の対生物活性の少なくとも一部
を保持するポリペプチドをコードすることにより内因性遺伝子の機能を増強する
ように機能する(模倣を含む)ことができ、特定の例においては、構成的に活性で
あり得る。
【００６３】 一具体例において、初期ＳＧＥライブラリーを、全ｃＤＮＡから生成し、これ
を更に断片化して発現ライブラリーの形態で与えることができる。好ましくは、
このライブラリー中のインサートは、約１００〜７００ｂｐの大きさに及び、一
層好ましくは、約２００〜５００ｂｐの大きさに及ぶ。
【００６４】 ｃＤＮＡ由来のライブラリーに関しては、その核酸ライブラリーは、それが由
来した細胞型において発現される各遺伝子に対応するほぼ同数のクローンを含む
標準化ライブラリーであってよい(何れの遺伝子の発現レベルも問わない)。
【００６５】 これらの初期ＳＧＥライブラリーを、センス及びアンチセンスコード配列の両
方(及び非コード配列)を含むように生成することができる。このＳＧＥ配列のサ
ブトラクティブ細胞及び標的細胞における転写は、対応する内因性遺伝子の転写
を阻害し得るアンチセンスＲＮＡを造る。転写されたＲＮＡ中の適当なタンパク
質コード配列の翻訳は、完全長の及び切り詰められた形態の内因性タンパク質並
びに短いペプチドを生成することができ、その様々な生物学的効果は、これらの
サブトラクティブ細胞及び標的細胞において評価される。
【００６６】 米国特許第５，７０２，８９８号は、一本鎖環に変換され得る及びそれらの一
本鎖環に対する相補的核酸分子を生成し得るベクター中に構築されたｃＤＮＡラ
イブラリーを標準化する方法であって：(ａ)一本鎖環においてｃＤＮＡを変換し
；(ｂ)それらの一本鎖環に対する相補的核酸分子を生成し；(ｃ)ステップ(ａ)で
変換された一本鎖環をステップ(ｂ)の相補的核酸分子とハイブリダイズさせて、
適当なＣｏｔまで部分的二本鎖を生成し；(ｅ)未ハイブリダイズ一本鎖環をハイ
ブリダイズした一本鎖環から分離し、それにより、標準化ｃＤＮＡライブラリー
を生成することを含む当該方法を記載している。
【００６７】 ある具体例において、初期ＳＧＥライブラリーは、サブトラクティブｃＤＮＡ
ライブラリーであってよい。多くのストラテジーが、サブトラクティブライブラ
リーを造るために用いられてきており、それらは、本発明の方法における使用の
ために容易に適合させることができる。一つのアプローチは、出発材料として、
指向的にクローン化したｃＤＮＡライブラリーの利用に基づいている(Palazzolo
及びMeyerowitz,(1987)Gene 52:197；Palazzolo等、(1989)Neuron 3:527；Palaz
zolo等、(1990)Gene 88:25)。このアプローチにおいて、第一の起源の組織又は
細胞株から調製したｃＤＮＡを、ベクター内のバクテリオファージＴ７プロモー
ターの直ぐ下流に向きを指定して挿入する。全ライブラリーＤＮＡを調製し、イ
ン・ビトロでＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写させて、第一の起源の組織に
由来する元のｍＲＮＡに対応する多量のＲＮＡを生成する。この起源の組織と他
の組織又は細胞(例えば、正常組織)の両方に存在する配列を、下記のようにサブ
トラクトする。この第一の起源から調製したイン・ビトロ転写したＲＮＡを、第
二の起源の組織に由来するネイティブなｍＲＮＡ又はライブラリーＲＮＡから調
製したｃＤＮＡとハイブリダイズさせる。このｃＤＮＡのＲＮＡに対する相補性
は、それらが互いにアニールするので、共通配列を除去することを可能にし、そ
の後の未ハイブリダイズｃＤＮＡ(おそらく、組織特異的)の単離を可能にする。
このアプローチは、指向性ｃＤＮＡライブラリーを用いてのみ可能であるが、何
故なら、非指向性ライブラリーでは、何れのｃＤＮＡ配列も、「アンチセンス」
の向きであるのと同じくらい「センス」の向きであり得るからである(センスと
アンチセンスは、互いに相補的である)。組織にユニークなｃＤＮＡ配列は、セ
ンスとアンチセンスコピーの両者が存在したならば、ハイブリダイゼーション手
順中に完全に取り出される。
【００６８】 初期ＳＧＥライブラリーの生成に用いることのできる一つの指向性クローニン
グストラテジーにおいては、特異的な制限エンドヌクレアーゼ認識部位(通常、
６〜１０塩基)をコードするＤＮＡ配列を、オリゴ(ｄＴ)プライマーの５’末端
に与える。この比較的短い認識配列は、１２〜２０塩基のオリゴ(ｄＴ)プライマ
ーのｍＲＮＡへのアニーリングに影響を与えず、それ故、ｃＤＮＡの第一鎖テン
プレートから合成された第二鎖は、コード配列の元の３’末端に付加された新た
な認識部位を含む。第二鎖ｃＤＮＡ合成の後に、第二の制限部位を含む鈍端化リ
ンカー分子(又は、第二の制限部位に適合性の突出端を含む部分的に二本鎖のリ
ンカーアダプター)を、このｃＤＮＡの両端に連結する。このリンカーによりコ
ードされた部位が、今や、ｃＤＮＡ分子の両端にあるが、ｃＤＮＡの３’末端の
みが、改変プライマーにより導入された部位を有する。リンカー連結ステップの
後に、その生成物を、両制限酵素により(又は、もし部分的に二本鎖のリンカー
アダプターをｃＤＮＡに連結したならば、改変プライマー配列を認識する酵素の
みを用いて)消化する。ｃＤＮＡ分子の集団が生じ、それらは、すべて、それら
の５’末端に一の規定された配列を有し且つ３’末端に異なる規定された配列を
有する。
【００６９】 Meissner等、(1987)PNAS 84:4171により開発された関連する指向性クローニン
グストラテジーは、配列特異的な改変プライマーを必要としない。Meissner等は
、配列ｄ(ＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣ)を有する二本鎖の回文的ＢａｍＨＩ／
ＨｉｎｄＩＩＩ指向性リンカーを記載しており、それをオリゴ(ｄＴ)プライムし
たｃＤＮＡの集団に連結してから、それらの連結生成物をＢａｍＨＩ及びＨｉｎ
ｄＩＩＩで消化している。この回文的リンカーは、二本鎖形態にアニールした場
合に、ＨｉｎｄＩＩＩ部位(ＡＡＧＣＴＴ)を規定する６塩基の４つに隣接する内
部ＢａｍＨＩ部位(ＧＧＡＴＣＣ)を含む。ＨｉｎｄＩＩＩ部位を完成するのに必
要な失われた塩基は、５’末端のｄ(ＡＡ)又は３’末端のｄ(ＴＴ)である。この
指向性リンカーが連結する配列にかかわらず、内部ＢａｍＨＩ部位は、存在する
。しかしながら、ＨｉｎｄＩＩＩは、もしそれがｄ(ＡＡ)：ｄ(ＴＴ)ジヌクレオ
チド塩基対の隣りに連結すれば、このリンカーを切断することができるだけであ
る。オリゴ(ｄＴ)プライムされるストラテジーにおいては、ＨｉｎｄＩＩＩ部位
は、この指向性リンカーへの連結の後に、常に、ｃＤＮＡの３’末端に生成され
る。５’末端に配列ｄ(ＴＴ)を有するｃＤＮＡについては(統計的に、１６分子
の内の１つ)、リンカー付加は、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位をも生じる。し
かしながら、ｃＤＮＡの５’末端は、逆転写酵素のプロセッシビティーの欠如の
ために不均一であるので、各遺伝子セグメントからのｃＤＮＡ産物は、このライ
ブラリー中で表されるであろう。
【００７０】 他の具体例においては、ＳＧＥライブラリーを、ゲノムＤＮＡ断片から生成す
る。好ましくは、このライブラリー中のインサートは、約１００〜７００ｂｐ、
一層好ましくは約２００〜５００ｂｐの大きさに及ぶ。かかるＳＧＥライブラリ
ーは、この試験方法において機能的ＳＧＥであり得るポリペプチド及びアンチセ
ンス分子をコードすることに加えて、デコイ分子例えば遺伝子の調節エレメント
に相当する核酸配列であって、例えば転写因子を封鎖し、それにより内因性遺伝
子の発現に必要な成分について競争することにより遺伝子の発現を阻害すること
のできる核酸配列をも「コードする」ことができる。
【００７１】 更に別の具体例においては、ＳＧＥライブラリーを、単一遺伝子をランダムに
断片化して、関心ある遺伝子に専ら由来するランダム断片発現ライブラリーを得
ることにより生成する。実際的問題として、かかるライブラリーは、全ｃＤＮＡ
から調整したランダム断片ライブラリーよりずっと多くの関心ある遺伝子に由来
する様々なＳＧＥを含むであろう。従って、単一遺伝子ランダム断片ライブラリ
ーから、本発明の方法によって、差次的活性を有する最適化ＳＧＥを得る見込み
は、ずっと高い。
【００７２】 一具体例において、抑制すべき遺伝子又はゲノムに対応する精製ＤＮＡを、先
ず、酵素的、化学的又は物理的手順によってランダムに断片化する。好適具体例
において、ＤＮＡのランダムな断片を、そのＤＮＡをヌクレアーゼ例えばＤＮア
ーゼＩによって処理することにより生成する。これらのランダムなＤＮＡ断片を
ＳＧＥライブラリー中にインサートとして組み込む。ＤＮアーゼＩ部分消化及び
ライブラリー構築の一般的原理に関しては、Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, Sambrook等編、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
NY(1989)を参照されたい。ある具体例においては、挿入した断片は、融合タン
パク質の部分として発現され得る。他の具体例においては、挿入した断片は、単
独で発現され得る。他の具体例においては、リボザイムをコードする配列を、こ
のインサートの直ぐ隣に挿入して、最も効率的なリボザイム−アンチセンスクロ
ーンの選択を可能にすることができる。更に別の具体例においては、遺伝子抑制
エレメントライブラリーを、当分野で公知のランダム突然変異誘発手順により、
更に改変することができる。これらの挿入した断片は、構成的プロモーターによ
って発現させることも誘導性プロモーターによって発現させることもできる。
【００７３】 更に別の具体例においては、主題の方法を、小さいペプチド例えば４〜２５ア
ミノ酸残基長のペプチドの多彩な集団をコードするＳＧＥライブラリーをもちい
て実施する。このライブラリーは、全ｃＤＮＡ又は単一遺伝子のコード配列から
生成することができ、又は配列においてランダムであってもセミランダムであっ
てもよい。タンパク質の微細な部分にのみ対応する小さいペプチド断片は、イン
・ビボでのそのタンパク質の機能を阻害することができる。
【００７４】 本発明の方法において主題のＳＧＥを発現させるのに用いることのできる広範
囲の発現用構築物がある。好適具体例において、このＳＧＥライブラリーは、ト
ランスフェクトすることのできるベクターにて与えることができ、このライブラ
リーは、標的細胞及びサブトラクティブ細胞の両方において発現され得る。
【００７５】 これらのＳＧＥは、組換えにより、例えば、少なくとも１つの転写調節配列に
操作可能に結合されたＳＧＥコード配列を含む発現ベクターを用いて発現させる
ことができる。操作可能に結合されたは、ヌクレオチド配列が調節配列に、その
ヌクレオチド配列の発現を可能にするような仕方で結合されていることを意味す
ることを意図している。調節配列は、当分野で認められており、サブトラクティ
ブ及び標的細胞におけるＳＧＥ配列の発現を指示するように選択する。従って、
用語転写調節配列には、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメン
トが含まれる。かかる調節配列は、Goeddel; Gene Expression Technology: Met
hods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されて
いる。例えば、広範囲の発現制御配列の何れでも、主題の発現ベクターにおいて
用いることができ、例えば、ウイルスＬＴＲ(例えば、モロニーマウス白血病ウ
イルスのＬＴＲ)、ＳＶ４０の初期及び後期プロモーター、アデノウイルス又は
サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)最初期プロモーター、３−ホスホグリセレートキ
ナーゼのプロモーター又は他の解糖酵素、酸性ホスファターゼのプロモーター例
えばＰｈｏ５、酵母のα接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系のポリヘ
ドロンプロモーター及び原核細胞若しくは真核細胞又はそれらのウイルスにおけ
る遺伝子の発現を制御することが知られた他の配列並びにこれらの組合せがある
。発現ベクターのデザインが、トランスフェクトされる宿主細胞の選択及び／又
は発現させることを所望するタンパク質の種類等の因子に依存し得るということ
は、理解されるべきである。その上、ベクターのコピー数、コピー数を制御する
能力及びベクターによりコードされる任意の他のタンパク質の発現(例えば、抗
生物質マーカー)も又、考慮すべきである。
【００７６】 サブトラクティブ及び標的細胞におけるＳＧＥライブラリーの発現へのアプロ
ーチは、ＳＧＥコード配列のウイルスベクター(組換えレトロウイルス、アデノ
ウイルス、アデノ随伴ウイルス及び１型単純ヘルペスウイルスを含む)又は組換
えの細菌若しくは真核生物プラスミドへの挿入を含む。ウイルスベクターは、細
胞に直接トランスフェクトし；プラスミドＤＮＡは、例えば、カチオン性リポソ
ーム(リポフェクチン)、ポリリジン結合体、グラミシジンＳ、人工ウイルスエン
ベロープ又は他のかかる細胞内キャリアーの助成により並びに遺伝子構築物の直
接的注射又はイン・ビボで実施するリン酸カルシウム沈殿により送達され得る。
これらの標的及びサブトラクティブ細胞のトランスダクションの効率ＳＧＥライ
ブラリーのサンプリングにおける臨界的ステップに相当するので、特定のトラン
スフェクション系の選択が意図する標的の表現型等の因子に依存するということ
は、認められよう。
【００７７】 ＳＧＥライブラリーのサブトラクティブ又は標的細胞への導入のための好適な
アプローチは、ウイルスベクターの利用によるものである。ウイルスベクターの
細胞への感染は、標的細胞の大きい割合がその核酸を受容することができるとい
う利点を有する。加えて、ウイルスベクターに含まれるＳＧＥコード配列は、ウ
イルスベクター核酸を取り込んだ細胞において、効率的に発現させることができ
る。
【００７８】 レトロウイルスベクターは、ＳＧＥ構築物を哺乳動物細胞(特に、ヒト細胞)に
送達するための好適な組換え送達システムである。これらのベクターは、遺伝子
の細胞への効率的な送達を与え、トランスファーされた核酸は、宿主の染色体Ｄ
ＮＡ中に安定に組み込まれる。
【００７９】 レトロウイルスの好適な利用において(例えば、それらの利用の安全性を確実
にするために)、これらのベクターを、複製欠損レトロウイルスのみを生成する
特殊化された細胞株(「パッケージング細胞」と呼ばれる)と共に用いる(総説と
しては、Miller, A.D.(1990)Blood 76:271を参照されたい)。従って、レトロウ
イルスコード配列(ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ)の部分が置換された組換えレトロウ
イルスを構築することができる。次いで、複製欠損レトロウイルスをビリオン中
にパッケージし、これは、ヘルパーウイルスの利用によって、標準的技術により
、標的細胞に感染させるために用いることができる。組換えレトロウイルスを生
成し、かかるウイルスをイン・ビトロで細胞に感染させるためのプロトコールは
、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M.等、(編)Greene Pu
blishing Associates, (1989), 第9.10-9.14節及び他の標準的実験室用マニュア
ル中に見出すことができる。適当なレトロウイルスの例には、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ
、ｐＷＥ及びｐＥＭが含まれ、これらは、当業者に周知である。環境栄養性及び
両栄養性レトロウイルスシステムの両方を調製するための適当なパッケージング
ウイルス株の例には、Ｃｒｉｐ、Ｃｒｅ２及びＡｍが含まれる。レトロウイルス
は、様々な遺伝子を、多くの異なる細胞型にイン・ビトロで導入するために用い
られてきた(例えば、Eglitis等(1985)Science 230:1395-1398；Danos及びMullig
an(1988)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:6460-6464；Wilson等(1988)Proc.Natl.Ac
ad.Sci. USA 85:3014-3018；Armentano等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87:61
41-6145；Huber等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88:8039-8043；Ferry等(1991
)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88:8377-8381；Chowdhury等(1991)Science 254:1802
-1805；van Beusechem等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:7640-7644；Kay等(
1992)Human Gene Therapy 3:641-647；Dai等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89
:10892-10895；Hwu等(1993)J.Immunol.150:4104-4115；米国特許第４，８６８，
１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６
；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５；及びＰ
ＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３を参照されたい)。
【００８０】 ある好適具体例において、ＳＧＥライブラリーを、レトロウイルス発現ベクタ
ー中にクローン化して、多彩なベクターライブラリーを造る。本発明の方法にお
いて用いるための典型的なベクターは、例えば、米国特許第５，７５３，４３２
号、５，６６５，５５０号、５，２０６，３５２号及びＰＣＴ公開ＷＯ９８／１
２３３９に記載されている。
【００８１】 このＳＧＥライブラリーは、サブトラクティブ細胞を例えばこのライブラリー
をそれらの細胞内に、選択した当分野で周知のベクターに適当した手段によって
導入することによりトランスフェクトするために用いられる。例えば、Keown等
、Methods Enzymol. 185:527-536(1990)を参照されたい。ＳＧＥを含む遺伝的に
改変されたサブトラクティブ細胞を、様々な方法につきスクリーニングし又は選
択することができる。
【００８２】 これらのトランスフェクトしたサブトラクティブ細胞を、それらの細胞が、少
なくとも所望の表現型を発達させ又はその検出に干渉する表現型を発達させるの
に十分な一定の期間にわたって培養する(かかる表現型を示さないＳＧＥ発現細
胞の選択を可能にするため)。
【００８３】 例えば、所望の表現型が致死的である場合、ＳＧＥライブラリーの発現後に生
存可能な細胞を培養において増幅させ、正常な致死的ＳＧＥがそれらの宿主細胞
を殺すのに十分な継代回数を経た後に単離する。これらの生存可能な細胞は、培
養上清から、例えば遠心分離によって分離することができ、それらの無傷の細胞
からＳＧＥベクターを単離することができる。しかしながら、これらの細胞を、
致死的ＳＧＥを発現する細胞の死及び溶解が起きる前に分離することは望ましい
であろう。かかる具体例において、細胞を、例えば、蛍光活性化セルソーター(
ＦＡＣＳ)、アフィニティー精製又は他の周知のマーカーによって、差次的にソ
ートすることができる。例えば、生存可能な細胞のＢｒｄＵを取り込む能力は、
ＦＡＣＳ用選択マーカーたり得る。
【００８４】 選択致死性の説明のための例を続けるが、ある具体例においては、サブトラク
ティブ細胞を、増殖を引き起こすために、有糸分裂促進物質で又は再継代により
刺激することが必要であり得る。増殖シグナル(これに対するＳＧＥライブラリ
ーの抗増殖能が選択される)を与えることに加えて、かかる刺激は、細胞マーカ
ー例えば細胞表面タンパク質の変化(ＦＡＣＳにより検出可能)又はレポーター遺
伝子の発現の変化を生じさせることができる。
【００８５】 ある具体例においては、異種性レポーター遺伝子構築物を用いて、指標遺伝子
の機能を与えることができる。レポーター遺伝子構築物は、レポーター遺伝子を
少なくとも一つの転写調節エレメント(例えば、有糸分裂促進シグナルにより活
性化されるエレメント)に機能的に結合することにより調製する。多くのレポー
ター遺伝子及び転写調節エレメントが、当業者に知られており、他のものは、当
業者に公知の方法によって同定し又は合成することができる。
【００８６】 レポーター遺伝子の例には、ＣＡＴ(クロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ)(Alton及びVapnek(1979), Nature 282:864-869)ルシフェラーゼ及び
他の酵素検出システム例えばベータ−ガラクトシダーゼ；ホタルルシフェラーゼ
(deWet等(1987), Mol.Cell.Biol.7:725-737)；細菌ルシフェラーゼ(Engebrecht
及びSilverman(1984), PNAS 1:4154-4158；Baldwin等(1984), Biochemistry 23:
3663-3667)；アルカリホスファターゼ(Toh等(1989) Eur.J.Biochem.182:231-238
、Hall等(1983) J.Mol.Appl.Gen.2:101)、ヒト胎盤分泌性アルカリホスファター
ゼ(Cullen及びMalim(1992) Methods in Enzymol.216:362-368)；β−ラクタマー
ゼ又はＧＳＴが含まれるが、これらに限らない。
【００８７】 レポーター遺伝子構築物において用いるための又は指標遺伝子のゲノム遺伝子
座を改変するための転写制御エレメントには、プロモーター、エンハンサー並び
にリプレッサー及びアクチベーター結合部位が含まれるが、これらに限らない。
再び、選択致死性の説明のための具体例を用いて、適当な転写調節エレメントを
、発現が迅速に(一般に、細胞の有糸分裂促進剤との接触から数分以内に)誘導さ
れる遺伝子の転写調節領域から誘導することができる。かかる遺伝子の例には、
最初期遺伝子(Sheng等(1990) Neuron 4:477-485参照)例えばｃ−ｆｏｓが含まれ
るが、これらに限らない。最初期遺伝子は、有糸分裂促進性刺激に際して迅速に
誘導される遺伝子である。これらの遺伝子構築物において用いるのに好適な転写
制御エレメントには、最初期遺伝子に由来する転写制御エレメント、最初期遺伝
子の特徴の幾つか又はすべてを示す他の遺伝子に由来するエレメント、又は機能
的に結合した遺伝子がかかる特徴を示すように構築された合成エレメントが含ま
れる。これらの転写制御エレメントが由来する好適な遺伝子の特徴には、休止細
胞における低発現又は検出不能な発現、有糸分裂促進刺激の数分以内での転写レ
ベルでの迅速な誘導、一時的で新たなタンパク質合成に依存しない誘導(その後
の転写の停止は、新たなタンパク質合成を必要とし、これらの遺伝子から転写さ
れたｍＲＮＡは、短い半減期を有する)及びアポトーシス細胞における発現の欠
如が含まれるが、これらに限らない。これらの特性のすべてが存在することが必
要な訳ではない。
【００８８】 上記のものにくわえて、他のプロモーター及び転写制御エレメントには、血管
作用性小腸ペプチド(ＶＩＰ)遺伝子プロモーター(ｃＡＭＰ応答性；Fink等(1988
)Proc.Natl.Acad.Sci.85:6662-6666)；ソマトスタチン遺伝子プロモーター(ｃＡ
ＭＰ応答性；Montminy等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.8.3:6682-6686)；プロエン
ケファリンプロモーター(ｃＡＭＰ、ニコチンアゴニスト及びホルボールエステ
ル応答性；Comb等(1986)Nature 323:353-356)；ホスホエノールピルベートカル
ボキシキナーゼ遺伝子プロモーター(ｃＡＭＰ応答性；Short等(1986)J.Biol.Che
m.261:9721-9726)；ＮＧＦＩ−Ａ遺伝子プロモーター(ＮＧＦ、ｃＡＭＰ及び血
清応答性；Changelian等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.86:377-381)；及びその他の
当業者に公知であるか又は当業者により調製され得るものが含まれる。
【００８９】 サイクリックＡＭＰを調節するレセプターの場合には、例えば、転写ベースの
読出しを、サイクリックＡＭＰ応答性エレメント結合性タンパク質、ＣＲＥＢ(
特定のセリン(Ｓ１３３)でのリン酸化によって活性が調節される転写因子)を用
いて構成することができる。このセリン残基がリン酸化されたときに、ＣＲＥＢ
は、上昇したｃＡＭＰレベルに応答性であることが知られているプロモーターの
５’側に見出されるＣＲＥ(ｃＡＭＰ応答性エレメント)として公知の認識配列に
結合する。リン酸化ＣＲＥＢのＣＲＥへの結合に際して、このプロモーターから
の転写が増大する。
【００９０】 それ故、転写ベースの読出しを、少なくとも一つのＣＲＥを含む基本プロモー
ターにより発現が駆動されるレポーター遺伝子を含む細胞において構成すること
ができる。細胞内Ｃａ++濃度の変化(例えば、成長因子の進入に際しての成長因
子レセプターの活性の変化の結果)は、もしａ）ＣＲＥＢも又その細胞内で同時
発現されて、ｂ）内因性若しくは異種性ＣａＭキナーゼが、カルシウムの増加に
応答してＣＲＥＢをリン酸化するか又は外因的に発現されたＣａＭキナーゼＩＩ
が同じ細胞内に存在するならば、レポーター遺伝子の発現レベルの変化を生じる
であろう。言い換えれば、この細胞の有糸分裂促進性刺激は、ＣＲＥＢのリン酸
化及びＣＲＥ構築物からの増大した転写を生じ得るが、ＰＬＣ活性の阻害は、Ｃ
ＲＥ応答性構築物からの減少した転写を生じ得る。
【００９１】 成長因子を選択的に阻害し又は増強するＳＧＥの評価のための主題の方法の典
型的具体例において、レポーター遺伝子の読み出しを、上記のように、用いるこ
とができ、それは、二次メッセンジャーの形成の検出を指示することができる。
【００９２】 最終的方法が何であれ、ＳＧＥの発現に際して所望の表現型を発生しないサブ
トラクティブ細胞が分離され、それらの細胞を代表するＳＧＥサブライブラリー
が、標準的プロトコールによって分離される。これらの分離されたベクターを、
次いで、標的細胞(選択的ＳＧＥが望まれる細胞)にトランスファーする。
【００９３】 上記のように、これらの標的細胞を、所望の表現型が検出可能なシグナルとし
て生じるのに十分な時間培養する。例えば、アポトーシスによる細胞の溶解が起
きる選択致死性の具体例の一つにおいて、致死的ＳＧＥをコードするベクターを
、これらの細胞残査から(例えば、培養上清から)単離することができる。しかし
ながら、一層実際的なアプローチは、細胞溶解前に、致死的表現型を同定して、
ＳＧＥベクターを比較的無傷の細胞(たとえ死んでいても)から単離することであ
る。
【００９４】 従って、一具体例において、致死的ＳＧＥを発現する細胞を、アポトーシスの
初期マーカーの発現に基づいて分離する。説明のために、このＳＧＥライブラリ
ーのアポトーシス活性を、市販のキットのアポトーシスデテクションキット(R &
D SYSTEMS, Minnesota)を用いて検出することができ、該キットでは、カルシウ
ム及びリン脂質結合性タンパク質のメンバーであるアネキシンＶを用いてアポト
ーシスを検出する(例えば、製造業者の勧めるプロトコールに従う)。蛍光標識し
たアネキシンＶ及びプロピジウムイオダイドをこれらの細胞に加える。細胞膜の
外側リーフレット上にホスファチジルセリンを発現している細胞は、アネキシン
Ｖに結合し、傷ついた細胞膜を有する細胞は、プロピジウムイオダイドを細胞Ｄ
ＮＡに結合させる。その結果生成した細胞は、フローサイトメトリーにより直接
分析した際に、３つの潜在的な細胞集団を与えることができる：何れの蛍光色素
でも染色されない生細胞、両蛍光色素で染色される壊死細胞、及びアネキシンＶ
−ＦＩＴＣ試薬でのみ染色されるアポトーシスを受けている細胞。分析及び細胞
分離を、単一のレーザー(４８８ｎｍの励起光を放射する)を備えたサイトメータ
ーにて行うことができる。従って、アポトーシスを選択的に誘導するＳＧＥを、
壊死による細胞死を引き起こすものから区別することができる。
【００９５】 致死的ＳＧＥを発現する細胞を分離する他の潜在的アプローチは、「浮遊」細
胞を集めて、それらの細胞からＳＧＥをレスキューすることである。
【００９６】 或は、これらの細胞に、小さい、細胞透過性の、螢光原カスパーゼ基質を加え
ることができる。このアポトーシスカスパーゼの活性化は、蛍光を増大させる基
質の開裂によって、イン・ビボで検出することができる。蛍光性の細胞を、ＦＡ
ＣＳによって同定して分離することができる(Packard BZ等、Proc.Natl.Acad.Sc
i. 93:11640-11645, 1996)。
【００９７】 主題の方法において、ＳＧＥは、最終的に、選択したサブトラクティブ細胞又
は標的細胞から当分野で公知の手順によって得られる。一具体例において、この
ＳＧＥは、選択した細胞から得られたＤＮＡとベクター上のインサートに隣接す
る部位に相同なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応の利用により単離され
る。他の具体例において、このＳＧＥ発現ライブラリーは、シャトルベクター中
に製造することができ、ＳＧＥを含むシャトルベクターの効率的な回収を可能に
する。最終的に、ＳＧＥは、当分野で公知のベクター特異的プローブを用いる標
準的クローニング技術によって単離することができる(もっとも、これは、ここ
に記載の他の具体例よりも面倒であろうが)。
【００９８】 この方法の標的細胞フェーズにおける同定の後に、発現ライブラリーの単離し
たＳＧＥインサートを、配列決定することができる。或は、好ましくは、レスキ
ューしたライブラリークローンを、ヌクレオチド配列決定前に、更に、別の選択
アッセイにおいて、所望の表現型を選択的に与える能力について試験することが
できる。ヌクレオチド配列の決定は、勿論、ＳＧＥの同定を与える。
【００９９】 Ａ．ＨＩＶ感染ＣＤ４＋Ｔリンパ球の選択的破壊： ＨＩＶ感染の直後のウイルス複製の最初のバースト後に、比較的長い潜伏期(
８〜１２年)がある。この期間中、ウイルス負荷は比較的安定であり、これは、
新たな感染と感染細胞の死の比較的一定の割合を反映している。これらのウイル
ス感染ＣＤ４＋細胞は、減じたＴ細胞機能(即ち、コロニー形成、ＩＬ−２レセ
プターの発現等)、抗原特異的な応答、有糸分裂誘起物質／抗原誘導された細胞
増殖又はシグナル変換を示す。これらの細胞変化は、発現されたウイルスの調節
タンパク質例えばｎｅｆ、ｔａｔ、ｖｐｕ、ｅｎｖにより引き起こされ、ウイル
スの要求に対する感染細胞の一層の適合を与える。ＨＩＶ−１感染ＣＤ４＋Ｔリ
ンパ球の生理は、正常細胞の生理と異なっているので、これらの差異を利用して
、ウイルス感染細胞の生存に必須であるが正常細胞の生存には必須でない遺伝子
を同定することができる。
【０１００】 この応用のためには、ＳＧＥライブラリーをＨＩＶ−１感染したＣＤ４＋Ｔリ
ンパ球から作成する。このライブラリーをサブトラクター、正常ＣＤ４＋Ｔリン
パ球にトランスフェクトし、それらのトランスフェクトされた細胞を少なくとも
２回細胞分裂させる。このステップは、このライブラリーからの「正常な致死的
ＳＧＥ」のサブトラクションへと導く。生細胞をパーコール勾配にて死細胞から
分離する。ＳＧＥをこれらの生細胞からレスキューし、標的細胞、ＨＩＶ−１感
染ＣＤ４＋Ｔリンパ球のトランスフェクトに用いる。ＳＧＥを、上記の方法の一
つにより分離された初期アポトーシス細胞からレスキューする。この富化ＳＧＥ
ライブラリーを用いて、分離サイクルを繰り返す。これらの分離サイクルを、ト
ランスフェクトされた細胞の〜１００％がアポトーシスを受けるまで続ける。こ
の時点において、個々のＳＧＥを単離し、正常Ｔリンパ球及びＨＩＶ−１感染Ｃ
Ｄ４＋Ｔリンパ球における選択的表現型の確認に用いる。このＳＧＥの選択性を
、正常細胞のパネルにおいて更に試験する。理想的ＳＧＥは、機能が正常細胞の
何れにおいても必須でない細胞性遺伝子を阻害する。この遺伝子の小分子量イン
ヒビターは、ＨＩＶ−１感染ＣＤ４＋細胞を、細胞性標的(ウイルス性ではない)
を標的とすることにより選択的に殺す。
【０１０１】 Ｂ．細胞分化の調節： ラットのＰＣ１２クロム親和性細胞腫(奇形癌腫)細胞は、細胞分化の研究に広
く用いられている。ＥＧＦ(上皮成長因子)存在下で、これらの細胞は、増殖する
が、ＮＧＦ(神経成長因子)の添加は、それらのニューロン性分化を誘導し、それ
らは、ニューロンになる。ＰＣ１２細胞のＮＧＦ誘導されるニューロン性分化に
干渉するＳＧＥを単離するために、多彩なＳＧＥライブラリーを、ＮＧＦ処理し
たＰＣ１２細胞からニューロン性分化の様々なステージにおいて作成する。この
ＳＧＥライブラリーを、ＥＧＦの存在下で増殖するＰＣ１２細胞(サブトラクタ
ー細胞)に導入する。これらの感染細胞を少なくとも２回細胞分裂させる。この
ステップは、ＳＧＥライブラリーからの「正常の致死的ＳＧＥ」のサブトラクシ
ョンへと導く。ＰＣ１２細胞のニューロンへの分化をＥＧＦの存在下で引き起こ
し得るＳＧＥも又、ＦＡＣＳ又はマグネットビーズ並びにニューロン細胞特異的
表面マーカー例えばボルテージゲーテッドＮａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋チャンネル、
又はグルタメートレセプター又は他の神経伝達物質レセプターに対する抗体を用
いてこのライブラリーから涸渇させられる。この時点で、サブトラクテッドＳＧ
Ｅライブラリーを、如何なるニューロン細胞特異的な表現型も示さない涸渇細胞
からレスキューしてＰＣ１２細胞に導入する。このサブトラクテッドＳＧＥライ
ブラリーでトランスフォームされたＰｃ１２細胞の分化は、ＮＧＦにより誘導さ
れる。ニューロン細胞特異的な表面マーカーを示す細胞を涸渇させて、ＳＧＥを
、如何なるニューロン性表現型も示さない細胞からレスキューする。この富化ラ
イブラリーをＰＣ１２に再導入し、感染細胞をニューロンへ分化誘導する。再び
、ＳＧＥを、如何なるニューロン特異的な表現型も示さない細胞からレスキュー
する。再感染、選択及びＳＧＥレスキューのサイクルを、トランスフェクトされ
たＰＣ１２細胞の〜１００％のＮＧＦ誘導される分化が阻害されるまで繰り返す
(図６)。
【０１０２】 図７は、胚性幹(ＥＳ)細胞のニューロン性分化に干渉するＳＧＥを単離する他
の例を説明している。マウスのＥＳ細胞は、ニューロン細胞及び筋肉細胞に分化
誘導することができる。それらの分化したニューロン細胞は、ニューロン細胞特
異的マーカー(上記参照)を、ＥＳ細胞を凝集して(胚様体)培養してレチノイン酸
にさらした場合に示す。これらの細胞のニューロン性の分化を誘導するために、
急速に生育する未分化ＥＳ細胞を穏やかにトリプシン処理する。その細胞懸濁液
を２日間インキュベートし、その間に、浮遊凝集物が形成される。これらの凝集
物を、更に２日間インキュベートしてから、新鮮な培地を５×１０−７Ｍのオー
ルトランスレチノイン酸(ＲＡ)と共に加える。これらの凝集物を、ＲＡの存在下
で４日間インキュベートする(新鮮な培地を２日後に加える)。この８日間インキ
ュベーション期間の終わりまでに、ニューロン細胞が形成され、更なる分析のた
めに、単一細胞懸濁を、トリプシン処理により生成することができる。
【０１０３】 ＥＳ細胞の筋細胞への分化及び最終的には筋管への分化を誘導するために、Ｅ
Ｓ細胞を、２日間にわたって、懸滴培養(８００細胞／２０μｌ)する。発生した
胚様体を、更に３日間、懸濁培養し、その時点で、単一の胚様体を付着を促進す
るために２４ウェル組織培養プレートに移す。分化した筋細胞を、トリプシン処
理により、５日後に分離することができる。
【０１０４】 このＳＧＥライブラリーを、分化したニューロン細胞から構築して、ＥＳ細胞
のニューロンへの分化を阻害するＳＧＥを単離する。次いで、多彩なＳＧＥライ
ブラリーをＥＳ細胞に導入し、感染細胞を筋細胞(サブトラクター細胞)に分化さ
せる。次いで、分化した筋細胞を集めて、そのサブトラクテッドＳＧＥライブラ
リーをレスキューする。このサブトラクテッドＳＧＥライブラリーを、再び、Ｅ
Ｓ細胞に導入して、ニューロン性分化を誘導する。分化したニューロン性細胞を
ニューロン細胞特異的表面マーカーに対する抗体を用いて涸渇させ、ＳＧＥを未
分化細胞からレスキューする。この富化ＳＧＥライブラリーをＥＳ細胞に再導入
して、感染細胞をニューロンへ分化誘導する。ＳＧＥを、未分化細胞からレスキ
ューして、新鮮なＥＳ細胞に再導入する。このサイクルを、ニューロンへ分化誘
導されるトランスフェクトされたＥＳ細胞の〜１００％が未分化のままになるま
で繰り返す。これらのＳＧＥは、ＥＳ細胞のニューロン性分化において必須の役
割を演じる遺伝子の機能に干渉する。
【０１０５】 Ｃ．プリオン感染したニューロン細胞の選択的破壊： プリオンは、様々な哺乳動物の、一般に伝染性海綿状脳症と呼ばれる神経退行
性疾患(例えば、クロイツフェルト−ヤコブ病)に広く関係する感染性因子である
。感染した患者の脳において、プラーク形成、複屈折ロッドの付着及び原繊維構
造があり、これらは、宿主のニューロンを破壊して、最終的に死に至らしめる。
プリオンの感染性は、主として、宿主タンパク質、プリオンタンパク質(プリオ
ン自身により誘導される)の異常型コンホメーションと関係する。細胞性プリオ
ンタンパク質は、細胞性ＰｒＰ遺伝子によりコードされ、その正常機能は、未知
である。
【０１０６】 図８は、プリオン感染したニューロンを選択的に殺すＳＧＥを単離するための
治療用アプローチを描いている。この応用のために、ＳＧＥライブラリーを、プ
リオン感染したニューロンから構築する。この多彩なＳＧＥライブラリーを、正
常な致死的ＳＧＥをこのライブラリーからサブトラクトするために、正常ニュー
ロン(サブトラクター細胞)に導入する。そのサブトラクテッドＳＧＥライブラリ
ーを、次いで、プリオン感染したニューロン(標的細胞)に導入し、死につつある
細胞を集める。この死につつある細胞からレスキューしたＳＧＥをプリオン感染
したニューロンに再導入して、死につつある細胞を集める。このサイクルを、プ
リオン感染した細胞の〜１００％が富化ＳＧＥライブラリーの導入後に死ぬまで
繰り返す。これらのＳＧＥは、プリオン感染した細胞の生存に必須であるが正常
細胞の生存には必須でない遺伝子を同定する。
【０１０７】 上記のようにそれ自体が抗増殖性であるＳＧＥを単離するための方法であるこ
とに加えて、主題の方法は、それ自体が急性致死性であるのではなく、他の薬剤
例えば細胞障害性薬剤に対する増大した感受性を与えるＳＧＥを同定するために
デザインされた仕方で実施することができる。腫瘍細胞の化学療法剤に対する感
受性を選択的に増大させるＳＧＥの同定は、望ましいことである。
【０１０８】 説明のための具体例において、化学療法剤を標的細胞培養物に加え、適宜、サ
ブトラクティブ細胞培養物に加える。化学療法剤のサブトラクティブ細胞培養物
への添加に際して、分離される細胞は、ＳＧＥを発現して、化学療法剤の存在下
で例えばトランスフェクトしてない細胞のＴ1/2を超えて生存するものである。
同様に、標的細胞培養物においては、トランスフェクトされてない標的細胞につ
いてのＴ1/2より短い期間に殺される細胞が分離される。例えば、トランスフェ
クトされてない細胞のＴ1/2より小さい１又は２σのＴ1/2でアポトーシスを受け
る細胞集団を分離することは、標的細胞の化学療法剤に対する感受性を増大させ
るＳＧＥを富化させよう。
【０１０９】 ｉｖ．薬物スクリーニングアッセイ この発明の他の面は、細胞特に標的細胞又は類似の細胞の表現型を選択的に調
節することのできる薬物の同定に向けられている。例えば、主題の方法は、同定
されたＳＧＥの細胞の生育状態(例えば、分化及び増殖)に対する効果及び選択性
を、同定されたＳＧＥに対応する内因性遺伝子又は遺伝子産物(「標的遺伝子」
及び「標的遺伝子産物」)を標的とすることにより真似る薬剤が開発され得るこ
とを企図している。これらの薬剤には、標的遺伝子産物又は標的遺伝子産物を含
む複合体の固有の酵素活性を増強し又は阻害する化合物、標的遺伝子産物と他の
タンパク質又は核酸との相互作用に干渉する化合物、及び優性の機能喪失又は機
能獲得活性を与えるように変化される(変異される)標的遺伝子産物の形態を含む
化合物が含まれるが、これらに限らない。特定の活性は、主題の方法において同
定された標的遺伝子及び／又は標的遺伝子産物の特徴に依存する。
【０１１０】 このスクリーニングにより同定される潜在的標的は、下記の通りである： １．公知の「ドラッガブル」標的：公知の生化学的実体 − 直接「アッセイ可能な」：公知の酵素／基質対、好ましくは、ＨＴ
Ｓ用 − 公知の化学 ２．未知であるが「ドラッガブル」：公知でないが配列が生化学的活性を示唆
する標的 − 直接アッセイ可能でない／公知でない基質 − 公知の化学 ３．「ドラッガブルでない」：自明でない生化学的活性 − 「アッセイ可能」でない − 化学でない − 遺伝子治療で利用可能でない
【０１１１】 この点において、本発明は、標的遺伝子産物の正常の細胞機能のアゴニスト又
はアンタゴニストである薬剤を同定し又は、標的遺伝子産物の、正常若しくは異
常な細胞機能(例えば、増殖及び／又は分化)及びそれに関係する病気の病因にお
ける役割を同定するためのアッセイを提供する。本アッセイにより同定された化
合物を、例えば、かかる病気の治療において利用することができる。
【０１１２】 標的遺伝子産物のアゴニスト又はアンタゴニストとして作用する能力について
試験すべき薬剤を、例えば、細菌、酵母若しくはその他の微生物により生成し(
例えば、天然産物)、化学的に生成し(例えば、ペプチド模倣物を含む小分子)、
又は組換えによって生成することができる。好適具体例において、この試験薬剤
は、約２，０００ダルトン未満の分子量を有する小さい有機分子である。標的遺
伝子産物に直接結合する薬剤の高速スクリーニングは、例えば、小型有機分子の
固定化又は「タグ付き」コンビナトリアルライブラリー(或は、容易にデコンボ
ルートされ得るライブラリー)を用いることができる。
【０１１３】 薬物スクリーニングアッセイにおいて活性であるとして同定された薬剤は、イ
ン・ビトロ又はイン・ビボで、全細胞又は組織に変化をもたらす能力について試
験すべき候補である。
【０１１４】 様々なアッセイ形式が、十分であろうし、本願の開示に照らして、ここに特に
記載しなかったものでも当業者によって理解されるであろう。例えば、このアッ
セイは、多くの異なる形式で生成することができ、無細胞系に基づくアッセイ(
例えば、精製したタンパク質又は細胞溶解物)並びに無傷の細胞を利用する細胞
ベースのアッセイを包含することができる。単純な結合アッセイを用いて、タン
パク質−タンパク質又はタンパク質−ＤＮＡ相互作用(標的遺伝子産物又は標的
遺伝子を含む)を増強し又は破壊することのできる化合物を検出するような薬剤
を検出することもできる。
【０１１５】 化合物及び天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプ
ログラムにおいて、高スループットアッセイは、所定時間内に調べられる化合物
の数を最大にするために望ましい。無細胞系で実施される本発明のアッセイ(例
えば、精製若しくは半精製されたタンパク質又は溶解物を用いて誘導され得るも
の)は、それらが、試験化合物により媒介される分子標的の変化の迅速な生成及
び比較的容易な検出を可能にするように生成し得る点において、しばしば、「一
次」スクリーニングと称される。その上、試験化合物の細胞障害性及び／又はバ
イオアベイラビリティーの効果は、一般に、イン・ビトロシステムでは、無視さ
れるが、このアッセイは、そうではなく、主として、薬物の分子標的に対する効
果(他のタンパク質との結合親和性の変化又は分子標的の酵素的特性の変化にお
いて明らかであり得る)に集中している。
【０１１６】 従って、本発明の典型的スクリーニングアッセイにおいて、反応混合物を、「
標的タンパク質」(例えば、標的遺伝子産物の一形態)、試験化合物、及び「結合
パートナー」例えば標的タンパク質と相互作用するタンパク質又は核酸(又はそ
れは、標的タンパク質の酵素活性の基質である)を含むように生成する。標的タ
ンパク質の結合パートナーとの相互作用又は基質変換(適宜) の検出及び定量は
、標的タンパク質と結合パートナーとの間の相互作用を阻害し又は増強する化合
物の効力を測定する手段を与える。この化合物の効力を、様々な濃度の試験化合
物を用いて得られたデータから投与量応答曲線を生成することにより評価するこ
とができる。その上、対照用アッセイを実施して、比較用の基線を与えることも
できる。対照用アッセイにおいて、標的タンパク質と結合パートナーとの相互作
用を、試験化合物の非存在下で定量する。
【０１１７】 標的タンパク質と結合パートナーとの間の相互作用は、様々な技術によって検
出することができる。複合体形成の調節は、例えば、検出可能に標識したタンパ
ク質(例えば、放射性標識、蛍光標識又は酵素標識したタンパク質)を用いて、イ
ムノアッセイ、クロマトグラフィー検出により又はアセチラーゼの固有の活性の
検出によって定量することができる。
【０１１８】 典型的には、標的タンパク質又は結合パートナーを固定化して、非複合体化形
態のタンパク質一方又は両方からの複合体の分離を容易にすることは望ましいで
あろう。標的タンパク質の結合パートナーへの、候補の薬剤の存在下及び非存在
下での結合は、反応物を含有するのに適した任意の容器中で達成することができ
る。例には、ミクロ滴定プレート、試験管、及び微小遠沈管が含まれる。一具体
例においては、タンパク質をマトリクスに結合させるドメインを加えた融合タン
パク質を与えることができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
／標的タンパク質(ＧＳＴ／標的タンパク質)融合タンパク質を、グルタチオンセ
ファロースビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)又はグルタチオン誘導体化
ミクロ滴定プレート上に吸着させることができ、次いで、それらを例えば35Ｓ標
識した細胞溶解物及び試験化合物と結合させ、この混合物を、複合体形成へと導
く条件下で例えば塩及びｐＨについて生理的条件下でインキュベートする(もっ
とも、もう少し厳しい条件が望まれ得るが)。インキュベーション後に、これら
のビーズを、洗って、如何なる未結合標識をも洗い去り、固定化マトリクス及び
放射性標識を直接測定し(例えば、ビーズをシンチラント中に置く)、又はその後
複合体を解離させてから上清中の放射性標識を測定する。或は、これらの複合体
を、マトリクスから解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、ビーズ画分中
に見出される結合パートナーのレベルを、標準的電気泳動技術を用いてゲルから
定量することができる。
【０１１９】 タンパク質及び他の分子をマトリクス上に固定化するための他の技術も又、主
題のアッセイにおいて利用することができる。例えば、標的タンパク質又は結合
パートナーを、ビオチンとストレプトアビジンの結合体を利用して固定化するこ
とができる。例えば、ビオチン化標的タンパク質分子を、ビオチン−ＮＨＳ(Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミド)から当分野で周知の技術を用いて製造することが
でき(例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, IL)、ストレプ
トアビジンコートした９６ウェルプレート(Pierce Chemical)のウェル中に固定
化することができる。或は、標的タンパク質と反応性であるが、標的タンパク質
と結合パートナーとの間の相互作用に干渉しない抗体を、このプレートのウェル
に誘導体化して、標的タンパク質を抗体結合によりそれらのウェル中にトラップ
することができる。上記のように、結合パートナーと試験化合物の調製物を、標
的タンパク質を提示するプレートのウェル中でインキュベートし、ウェルにトラ
ップされた複合体の量を定量することができる。かかる複合体を検出するための
、ＧＳＴ固定化複合体につき上記したもの以外の典型的な方法には、結合パート
ナーと反応性の(又は、標的タンパク質と反応性で、結合パートナーと競争する)
抗体を用いる複合体の免疫検出；並びに標的タンパク質又は結合パートナーと結
合した酵素活性(固有の活性又は外来的な活性)の検出に依存する酵素結合アッセ
イが含まれる。後者の例においては、酵素を、標的タンパク質若しくは結合パー
トナーと化学的に結合させ又は標的タンパク質若しくは結合パートナーとの融合
タンパク質として与えることができる。説明のために、結合パートナーを、西洋
ワサビペルオキシダーゼと化学的に架橋させ又は遺伝子工学的に融合させる(ポ
リペプチドの場合)ことができ、複合体中にトラップされたポリペプチドの量を
酵素の色原体基質例えば３，３’−ジアミノ−ベンザディンテラヒドロクロリド
又は４−クロロ−１−ナフトールを用いて評価することができる。同様に、ポリ
ペプチドとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含む融合タンパク質を用意
して、複合体形成を、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンを用いてＧＳＴ活
性を検出することにより定量することができる(Habig等(1974) J Biol Chem 249
:7130)。
【０１２０】 複合体中にトラップされたタンパク質を定量するために免疫検出に依存する方
法のために、このタンパク質に対する抗体例えば抗標的タンパク質抗体を用いる
ことができる。例えば、複合体中の検出すべきタンパク質は、融合タンパク質の
形態において、「エピトープタグ付け」されていてよく、該融合タンパク質は、
標的タンパク質配列に加えて、容易に抗体を入手できる(例えば、市販されてい
る)第二のポリペプチドを含む。例えば、上記のＧＳＴ融合タンパク質も又、Ｇ
ＳＴ部分に対する抗体を用いる結合の定量において用いることができる。他の有
用なエピトープタグには、ｃ−ｍｙｃ由来の１０残基の配列を含むｍｙｃエピト
ープ(例えば、Ellison等(1991) J Biol Chem 266:21150-21157参照)並びにｐＦ
ＬＡＧシステム(International Biotechnologies, Inc)又はｐＥＺＺ−プロテイ
ンＡシステム(Pharmacia, NJ)が含まれる。
【０１２１】 本発明の典型的な薬物スクリーニングアッセイは、(ａ)(ｉ)結合パートナー、
(ｉｉ)標的タンパク質及び(ｉｉｉ)試験化合物を含む反応混合物を形成するステ
ップ；及び(ｂ)結合パートナーと標的タンパク質との相互作用を検出するステッ
プを含む。試験化合物の存在下での標的タンパク質の相互作用における、試験化
合物の非存在下での相互作用と比べての統計的に有意の変化(増強又は阻害)は、
その試験化合物について、潜在的なアゴニスト(模倣物又は相乗因子)又はアンタ
ゴニスト(インヒビター)を示す。この反応混合物は、無細胞タンパク質調製物例
えば再構成されたタンパク質混合物又は細胞溶解物であってよく、又はそれは、
組換えにより標的タンパク質を発現する異種性核酸を含む組換え細胞であってよ
い。
【０１２２】 標的タンパク質がレセプターである場合又はオリゴマーレセプター複合体(例
えば、他のタンパク質サブユニットを含む)の部分として関係する場合には、無
細胞系は、例えば細胞膜調製物、再構成されたタンパク質混合物又はレセプター
を再構成するリポソームであってよい。例えば、標的タンパク質を含むレセプタ
ー複合体のタンパク質サブユニットを、真正の起源及び組換えの起源からのデタ
ージェント抽出物から精製することができ、人工的脂質小胞(例えば、ホスファ
チジルコリンリポソーム)中で又は細胞膜由来の小胞中で再構成することができ
る(例えば、Bear等(1992) Cell 68:809-818；Newton等(1983) Biochemistry 22:
6110-6117；及びReber等(1987) J Biol Chem 262:11369-11374参照)。ラメラ構
造及びその結果のリポソームの大きさを、電子顕微鏡観察を用いて特性決定する
ことができる。再構成した膜中のレセプターの外部配向を、例えば免疫電子顕微
鏡観察により示すことができる。リガンド又は試験化合物の、かかる標的タンパ
ク質複合体を含むリポソーム及びこのタンパク質を含まないリポソームとの相互
作用を、レセプターの潜在的なモジュレーターを同定するために比較することが
できる。
【０１２３】 更に別の具体例においては、この薬物スクリーニングアッセイを、標的タンパ
ク質を発現する全細胞を含むように誘導する。例えば、標的タンパク質の生物学
的活性のアゴニスト又はアンタゴニストを、細胞の生育又は分化(表現型)の変化
について評価することにより検出することができる。各々の検出のための一般的
技術は、周知であり、任意所定のアッセイにおいて用いられる特定の試薬細胞の
起源につき変化する。ヒトの細胞において同定された標的遺伝子に基づく細胞ベ
ースのアッセイのために、組換え細胞は、好ましくは、後生動物細胞例えば哺乳
動物細胞、例えば昆虫細胞、例えばアフリカツメガエル細胞であり、成体細胞、
胚細胞又は卵母細胞であってよい。他の具体例において、標的タンパク質は、レ
セプターであり、このレセプターは、酵母又は細菌細胞内で再構成することがで
きる。
【０１２４】 形態学的研究に加えて、標的タンパク質に依存する活性に応答する細胞内第二
メッセンジャーのレベルの変化を検出することができる。例えば、種々の具体例
において、このアッセイは、試験薬剤の、リン酸化パターン、アデニレートシク
ラーゼ活性(ｃＡＭＰ生成)、ＧＴＰ加水分解、カルシウム代謝及び／又はリン脂
質の加水分解(ＩＰ3、ＤＡＧ生成)の変化を引き起こす能力を評価することがで
きる。二次メッセンジャーの変化等の細胞内シグナル又は遺伝子発現の変化を検
出することにより、標的タンパク質依存性のシグナル伝達に対する候補のアゴニ
スト及びアンタゴニストを同定することができる。
【０１２５】 標的タンパク質は、リン脂質の活性を調節することができる。イノシトール脂
質を、標準的脂質抽出技術を用いて抽出して分析することができる。３つのすべ
てのイノシトール脂質(ＩＰ1、ＩＰ2、ＩＰ3)の水溶性誘導体も又、放射性標識
技術又はＨＰＬＣを用いて定量することができる。
【０１２６】 細胞内カルシウムの可動化又は細胞外からのカルシウムの流入は、標的タンパ
ク質に依存し得る。試薬細胞へのカルシウムの流入は、標準的技術を用いて測定
することができる。適当なカルシウム指標、蛍光、生物ルミネッセント、金属指
示薬又はＣａ++感応性微小電極の選択は、細胞型及び研究する事象の規模及び時
定数に依存する(Borle(1990) Environ Health Perspect 84:45-56)。Ｃａ++検出
の典型的方法として、細胞に、Ｃａ++感応性の蛍光性染料のフラ−２又はインド
−１を標準的方法を用いて充填し、フルオロメーターを用いて測定される如何な
るＣａ++の変化をも測定することができよう。
【０１２７】 このアッセイのある具体例において、細胞性リン酸化の変化についてスクリー
ニングすることは望ましいことであり得る。化合物のセリン／スレオニンキナー
ゼ又はチロシンキナーゼ活性化を調節する能力を、リン酸化されたセリン、スレ
オニン又はチロシン残基に対する抗体を用いるコロニーイムノブロッティング(L
yons及びNelson(1984) PNAS 81:7426-7430)を用いてスクリーニングすることが
できよう。かかるアッセイを実施するための試薬は、市販されており、例えば、
これらの残基のリン酸化の増加を測定するホスホセリン及びホスホスレオニン特
異的な抗体を、購入することができる。
【０１２８】 ある種の標的タンパク質は、下流のエフェクターの活性化及び阻害を含むカス
ケードを推進することができ、その最終結果は、幾つかの場合には、遺伝子の転
写又は翻訳の検出可能な変化である。かかる標的遺伝子に由来する転写調節配列
(例えば、これらの遺伝子のアップ又はダウンレギュレーションの原因であるも
の)を選択することにより、及びかかるプロモーターをレポーター遺伝子に機能
的に結合することにより、本発明は、標的タンパク質に依存するシグナリング経
路に影響を及ぼす特異的な試験化合物の能力に感応性の転写ベースのアッセイを
提供する。
【０１２９】 典型的具体例において、主題のアッセイは、標的タンパク質によるシグナリン
グに応答性の転写調節配列により制御される遺伝子の発現レベルの変化を細胞ベ
ースのアッセイにおいて検出することを含む。この発明のレポーター遺伝子ベー
スのアッセイは、上記の事象例えば転写調節のカスケードの最後の段階を測定す
る。従って、このアッセイの一具体例の実施において、標的タンパク質によるシ
グナリングに依存性の検出シグナルを生成するためにレポーター遺伝子構築物を
試薬細胞に挿入する。このレポーター遺伝子の発現は、従って、標的タンパク質
依存性のシグナリングのアゴニスト又はアンタゴニストとして作用する化合物の
開発のための価値あるスクリーニングツールを提供する。
【０１３０】 このアッセイの一具体例の実施において、レポーター遺伝子構築物を、標的タ
ンパク質により生成される二次メッセンジャーに依存する検出シグナルを生成す
るために試薬細胞に挿入する。典型的には、このレポーター遺伝子構築物は、レ
ポーター遺伝子を、標的タンパク質からのシグナル変換に応答性の少なくとも一
つの転写調節エレメントと機能的に結合して含み、そのレポーター遺伝子の発現
レベルが検出シグナルを与える。このレポーター遺伝子からの転写の量は、適当
であることが当業者に公知の任意の方法を用いて測定することができる。例えば
、このレポーター遺伝子からのｍＲＮＡの発現を、ＲＮアーゼ防護又はＲＮＡベ
ースのＰＣＲを用いて検出することができ、又はレポーター遺伝子のタンパク質
産物を特徴的染色又は固有の活性により同定することができる。レポーター遺伝
子からの発現の量を、次いで、同じ細胞における試験化合物の非存在下での発現
の量と比較し、又はそれを、標的レセプタータンパク質を欠く実質的に同じ細胞
における転写の量と比較することができる。転写量の統計的に(又は、それ以外
の)有意の差異は、試験化合物が何らかの仕方で標的タンパク質の誘導活性を変
化させたことを示す。
【０１３１】 上記のように、好適具体例において、レポーターの遺伝子産物は、その産物と
結合した固有の活性により検出される。例えば、レポーター遺伝子は、酵素活性
により、色、蛍光又はルミネセンスに基づく検出シグナルを生じさせる遺伝子産
物をコードすることができる。他の好適具体例においては、レポーター又はマー
カー遺伝子は、選択的な生育の利点を与え、例えば、レポーター遺伝子は、細胞
の生存力を増進させ、細胞の栄養要求を軽減し、及び／又は薬物に対する耐性を
与えることができる。多くのレポーター遺伝子は、当業者に公知であり、他のも
のは、当業者に公知の方法により同定し若しくは合成することができる。レポー
ター遺伝子は、検出可能な遺伝子産物(ＲＮＡであってもタンパク質であっても
よい)を発現する任意の遺伝子を含むことができる。
【０１３２】 薬物スクリーニングの更に別の具体例においては、標的タンパク質と結合パー
トナーを用いて、ツーハイブリッドアッセイを生成することができる。その相互
作用の薬物依存性の阻害又は増強を評価することができる。当分野で記載された
ツーハイブリッドアッセイの形式は、容易に、かかる薬物スクリーニングの具体
例に適合させることができる。例えば、米国特許第５，２８３，３１７号、５，
５８０，７３６号及び５，６９５，９４１号；Zervos等(1993) Cell 72:223-232
；Madura等(1993) J Biol Chem 268:12046-12054；Bartel等(1993) Biotechniqu
es 14:920-924；及びIwabuchi等(1993) Oncogene 8:1693-1696を参照されたい。
【０１３３】 例えば上記の薬物スクリーニングアッセイにより同定され得る小分子に加えて
、標的遺伝子産物の活性を調節することのできる他の薬剤には、標的タンパク質
のペプチドドメイン(断片)が含まれ得る。「変異体」は、ここで用いる場合、天
然のペプチド又はタンパク質と少なくとも一アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を
有するペプチドをいう。変異体は、天然のタンパク質と同じ生物学的及び免疫学
的活性を有することができる。しかしながら、変異体の生物学的又は免疫学的活
性は、異なってもよいし、欠いていてもよい。例えば、タンパク質変異体は、天
然のタンパク質の機能のアゴニスト、アンタゴニスト(競争的又は非競争的)又は
部分的アゴニストとして作用することができる。
【０１３４】 例えば、標的タンパク質の同族体(アゴニストとアンタゴニスト型の両者)を、
例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発等(Ruf等(1994)Biochemistry 33:15
65-1572；Wang等(1994)J.Biol.Chem. 269:3095-3099；Balint等(1993)Gene 137:
109-118；Grodberg等(1993)Eur.J.Biochem.218:597-601；Nagashima等(1993)J.B
iol.Chem.268:2888-2892；Lowman等(1991)Biochemistry 30:10832-10838；及びC
unningham等(1989)Science 244:1081-1085)を用いて、リンカースキャニング突
然変異誘発(Gustin等(1993)Virology 193:653-660；Brown等(1992)Mol.Cell Bio
l.12:2644-2652；McKnight等(1982)Science 232:316)により；飽和突然変異誘発
(Meyers等(1986)Science 323:613)により；ＰＣＲ突然変異誘発(Leung等(1989)M
ethod Cell Mol Biol 1:11-19)により；又はランダム突然変異誘発(Miller等(19
92) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor
, N.Y.；及びGreener等(1994)Strategies in Mol Biol 7:32-34)によって生成す
ることができる。リンカースキャニング突然変異誘発は、特に伝統的セッティン
グにおいて、切り詰められた型(例えば、構成的に活性な又は優性ネガティブ)の
標的タンパク質を同定するための魅力的な方法である。
【０１３５】 この発明は又、細胞に対する真正標的タンパク質の効果に干渉し、模倣し得る
模倣物(例えば、ペプチド又は非ペプチド性薬剤)を生成するための主題の標的タ
ンパク質の還元をも企図している。かかるペプチド模倣物は、スムースな細胞分
化の調節のための薬物として作用し得る。
【０１３６】 ペプチド模倣物は、一般に、製薬工業において、模造ペプチドに類似の特性を
有する非ペプチド性の薬物を含むと理解されている。ペプチド模倣物のデザイン
の原理と実際は、当分野で公知であり、例えば、Fauchere, Adv.Drug Res.15:29
(1986)；及びEvans等、J.Med.Chem.30:1229(1987)に記載されている。治療上有
用なペプチドに対する構造類似性を有するペプチド模倣物を用いて、同等の治療
又は予防効果を生成することができる。典型的には、かかるペプチド模倣物は、
少なくとも一つのペプチド結合が、適宜、望ましい特性(例えば、イン・ビボで
の化学的分解に対する耐性)を変更することのできる結合により置換されている
。これらの結合には、−ＣＨ2ＮＨ−、−ＣＨ2Ｓ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−、−ＣＨ
＝ＣＨ−、−ＣＯＣＨ2−、−ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ2−、及び−ＣＨ2ＳＯ−が含まれ
得る。ペプチド模倣物は、増進された薬理学的特性(生物学的半減期、吸収速度
等)、異なる特異性、増大した安定性、生産経済性、軽減された抗原性等を示す
ことができ、これらは、それらの治療剤としての利用を特に望ましいものにする
。
【０１３７】 上記のような突然変異誘発技術は又、標的タンパク質のタンパク質−タンパク
質相互作用に関与するデターミナントのマッピングにも特に有用である。説明の
ために、他の細胞性タンパク質(又は核酸)の分子認識に関与する標的タンパク質
の臨界的残基を決定することができ、それらを用いて、結合活性の少なくとも一
部分を保持するペプチド模倣物を生成することができる。例えば、結合に関与す
るアミノ酸残基をマップするスキャニング突然変異誘発を用いて、キナーゼへの
結合における残基を模倣するペプチド模倣物化合物(例えば、ジアゼピン又はイ
ソキノリン誘導体)を生成することができる。例えば、かかる残基の加水分解可
能でないペプチド類似体を、ベンゾジアゼピン(例えば、Freidinger等[Peptides : Chemistry and Biology , G.R. Marshall編、ESCOM Publisher: Leiden, オラ
ンダ、1988]参照)、アゼピン(例えば、Huffman等[Peptides: Chemistry and Bio logy , G.R. Marshall編、ESCOM Publisher: Leiden, オランダ、1988]参照)、置
換されたガンマラクタム環(Garvey等[Peptides: Chemistry and Biology, G.R.
Marshall編、ESCOM Publisher: Leiden, オランダ、1988])、ケト−メチレンシ
ュードペプチド(Ewenson等(1986)J.Med.Chem.29:295；及びEwenson等[Peptides:
Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposi
um)Pierce Chemical Co. Rockland, Ill., 1985])、β−ターンジペプチドコア(
Nagai等(1985)Tetrahedron Lett 26:647；及びSato等(1986)J Chem Soc Perkin
Trans 1:1231)、及びβ−アミノアルコール(Gordon等(1985)Biochem Biophys Re s Commun 126:419；及びDann等(1986) Biochem Biophys Res Commun 134:71)を
用いて生成することができる。
【０１３８】 この発明による標的遺伝子の活性の調節は、標的タンパク質を構成するペプチ
ドドメインをコードするヌクレオチド配列の全部若しくは部分に相補的な特異的
アンチセンスポリヌクレオチド又は標的遺伝子の３’若しくは５’非コード領域
の全部若しくは部分に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドを用いる方法を含
む。かかる相補的アンチセンスポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの付加、欠失
、置換及び転移を含み得るが、但し、標的配列への特異的ハイブリダイゼーショ
ンは存続する。
【０１３９】 ここで用いる場合、「アンチセンス」療法は、細胞性条件下で標的タンパク質
をコードする細胞性ｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズ
する(例えば、結合する)オリゴヌクレオチドプローブ又はそれらの誘導体の投与
又はイン・シトゥー生成をいう。このハイブリダイゼーションは、そのタンパク
質の発現を、例えば転写及び／又は翻訳を阻害することによって阻害するはずで
ある。この結合は、伝統的な塩基対相補性により、又は例えば二本鎖ＤＮＡへの
結合の場合には、二重らせんの大きな溝における特異的相互作用によるものであ
ってよい。一般に、「アンチセンス」療法は、当分野で一般に用いられる範囲の
技術をいい、オリゴヌクレオチド配列への特異的結合に依存する治療法を包含す
る。
【０１４０】 分子レギュレーターを含むタンパク質をコードするｍＲＮＡ種に特異的にハイ
ブリダイズし得て、それらのｍＲＮＡ種の転写及び／又はコードされるポリペプ
チドの翻訳を阻害することのできる可溶性アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドが、この発明により、相補的アンチセンスポリヌクレオチドとして
企図される。
【０１４１】 本発明のアンチセンス構築物は、例えば、発現用プラスミドとして送達するこ
とができ、細胞内で転写された際に、標的の細胞性ｍＲＮＡの少なくとも一つの
ユニークな部分に相補的であるＲＮＡを生成する。或は、このアンチセンス構築
物は、エキソ・ビボで生成されるオリゴヌクレオチドプローブであり、細胞に導
入された際に、標的遺伝子のｍＲＮＡ及び／又はゲノム配列とハイブリダイズす
ることにより発現の阻害を引き起こす。かかるオリゴヌクレオチドプローブは、
好ましくは、内因性ヌクレアーゼ(例えば、エキソヌクレアーゼ及び／又はエン
ドヌクレアーゼ)に対して耐性であり、それ故イン・ビボで安定である改変され
たオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしての利用の
ための典型的な核酸分子は、ＤＮＡのホスホルアミデート、ホスホチオエート及
びメチルホスホネート類似体である(米国特許第５，１７６，９９６号；５，２
６４，５６４号；及び５，２５６，７７５号も参照されたい)。加えて、アンチ
センス療法において有用なオリゴマーの構築への一般的アプローチは、Van der
Krol等(1988)Biotechniques 6:958-976；及びStein等(1988)Cancer Res 48:2659
-2668により総説されている。
【０１４２】 この発明の方法で用いるためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを構築する際
には、次の幾つかのことがらが考慮されるべきである：(１)オリゴは、５０％以
上のＧＣ含量を有するべきであり；(２)３つ以上のＧのストレッチを有する配列
を避けるべきであり；そして(３)オリゴヌクレオチドは、２５〜２６量体以下の
長さであるべきである。アンチセンスオリゴヌクレオチドを試験する場合には、
ミスマッチした対照を構築することができる。これらの対照を、同じ塩基の比を
保存するために、対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列順序を逆にす
ることにより生成することができる。
【０１４３】 標的タンパク質のコンピューター補助による分子モデリングを用いて、三次元
構造を、コンピューター視覚化技術を用いて研究することができる。次いで、低
分子量のインヒビター又はオリゴヌクレオチドの新規なデザインを、選択的阻害
について分析することができる。標的の薬物のデザインの説明は、Kunz,「Struc
ture-Based Strategies for Drug Design and Discovery」Science,257:1078-10
82(1992)及びDixon,「Computer-Aided Drug Design: Getting the Best Results
」Trends in Biotechnology, 10:357-363(1992)に見出すことができる。コンピ
ューターモデリングを用いるインヒビターの標的への結合の特殊な応用が、Pipe
r等「Studies Aided by Molecular Graphics of Effects of Structural Modifi
cations on the Binding of Antifolate Inhibitors to Human Dihydrofolate R
eductase」Proc.Am.Assoc.Cancer Res.Annual Meeting, 33:412(1992)；Hibert
等「Receptor 3D-Models and Drug Design」Therapie(Paris),46:445-451(1991)
(セロトニンレセプター認識部位)に記載されている。三次元の分子モデリングを
行うために利用することのできるコンピュータープログラムは、Klopman,「Mult
icase 1: A Hierarchical Computer Automated Structure Evaluation Program
」Quantitative Structure-Activity Relationships, 11:176-184(1992)；Pasto
r等「The Edisdar Programs Rational Drug Series Design」Quantitative Stru cture-Activity Relationships 10:350-358(1991)；Bolis等「A Machine Learni
ng Approach to Computer-Aided Molecular Design」J.Computer Aided Molecul ar Design , 5:617-628(1991)；及びLawrence及びDavis「CLIX: A Search Algori
thm for Finding Novel Ligands Capable of Binding Proteins of Known Three
-Dimensional Structure」Protein Structure Functional Genetics, 12:31-41(
1992)に記載されている。
【０１４４】 更に別の具体例においては、これらの分子レギュレーターに特異的な低分子量
インヒビターを、分子モデリングにより予想して、標準的な有機化学の技術によ
って合成することができる。コンピューターモデリングは、平滑筋細胞の分化を
増進させ又はそれらの分化をブロックするオリゴペプチドを同定することができ
る。同定されたオリゴペプチドを製造する技術は、周知であり、アミノ酸の有機
合成により、遺伝子工学的技術により又はＰＣＲベースの増幅により進めること
ができる。Silverman, The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Actio n , Academic Press (1992)。この発明のインヒビターは、平滑筋細胞分化を選択
的に阻害するインヒビターとして同定することができる。
【０１４５】 ｖ．同定された薬剤の医薬製剤 ある試験ＳＧＥの同定(又は、上記の薬物スクリーニングアッセイによる化合
物の同定)の後に、主題のアッセイの実務者は、選択した薬剤の効力及び特異性
をイン・ビトロ及びイン・ビボの両方で試験を続けるであろう。引き続くイン・
ビボ試験用に又は動物への認可された薬物としての投与のために、主題のアッセ
イにおいて同定されたＳＧＥ及びその他の化合物を、動物(好ましくは、ヒト)へ
のイン・ビボ投与用の医薬製剤に配合することができる。ポリペプチドとして活
性なＳＧＥは、ペプチド模倣物に変えることができる。同様に、アンチセンスＳ
ＧＥを、加水分解可能でない類似体(例えば、ヌクレアーゼ消化に耐性)として生
成して、直接投与用に配合することができ、又は、適宜、アンチセンス分子を転
写物として生成する発現ベクターの形態で与えることもできる(例えば、遺伝子
治療用に)。ポリペプチドとして活性なＳＧＥも又、例えば遺伝子治療における
使用のために発現ベクターの形態で与えることができる。
【０１４６】 主題のアッセイで選択されたペプチド、タンパク質及びアンチセンス、又はか
かる分子をコードする遺伝子治療用ベクターは、従って、投与のために、生物学
的に許容し得る媒質例えば水、緩衝塩溶液、ポリオール(例えば、グリセロール
、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等)又はこれらの混合物
と配合することができる。活性成分の選択した媒質における最適濃度は、医薬品
化学で周知の手順によって、経験的に決定することができる。ここで用いる場合
、「生物学的に許容し得る媒質」には、医薬製剤の所望の投与経路に適した任意
の及びすべての溶剤、分散媒質等が含まれる。かかる媒質の医薬的に活性な物質
への利用は、当分野で公知である。何れの伝統的な媒質又は薬剤も、この化合物
の活性に不適合でない限り、その本発明の医薬製剤における利用が企図される。
適当なビヒクル及びそれらの配合物(他のタンパク質を含む)は、例えば、書籍Re
mington's Pharmaceutical Scineces (Remington's Pharmaceutical Sciences.
Mack Publishing Company, Easton, Pa., 米国、1985)に記載されている。これ
らのビヒクルには、注射用「デポジット配合物」が含まれる。上記に基づいて、
かかる医薬配合物は、専らではないが、この化合物の溶液又は凍結乾燥粉末を、
少なくとも一の製薬上許容し得るビヒクル又は希釈剤と共に含有し、適当なｐＨ
に緩衝され且つ生理的液体と等張の媒質中に含まれる。好適具体例において、こ
のＳＧＥ化合物は、局所投与及び／又は全身投与のために、無菌的調製物中に配
置することができる。凍結乾燥調製物の場合には、支持賦形剤例えばマンニトー
ル又はグリシン(これらに限らない)を用いることができ、所望のｐＨの適当な等
張の緩衝溶液を得るために、所望の容積の適当な緩衝溶液を与える。類似の溶液
は、所望の容積の等張溶液中の化合物の医薬組成物にも用いることができ、専ら
ではないが、すべての時点で所望のｐＨ(例えば、中性のｐＨ)の等張の医薬調製
物を得るためにホスフェート又はシトレートを適当な濃度で有する緩衝塩溶液の
利用を含む。
【図面の簡単な説明】
【図１】 主題のアッセイの典型的具体例を説明する流れ図である。
【図２】 主題のアッセイの典型的具体例を説明する流れ図である。
【図３】 主題のアッセイの典型的具体例を説明する流れ図である。
【図４】 主題のアッセイの典型的具体例を説明する流れ図である。
【図５】 主題のアッセイの典型的具体例を説明する流れ図である。
【図６】 主題のアッセイの典型的具体例を説明する流れ図である。
【図７】 主題のアッセイの典型的具体例を説明する流れ図である。
【図８】 主題のアッセイの典型的具体例を説明する流れ図である。
【図９】 コロニー形成アッセイを示す写真である。
【図１０】 ＡＳ−ＨＤＭ２の発現は細胞死を誘導することを示す写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 ４Ｃ０８６ Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ｚ ４Ｈ０４５ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 4B024 AA01 AA08 CA02 CA11 DA02 EA02 GA11 HA01 HA17 4B063 QA05 QA08 QA13 QA18 QQ08 QQ09 QQ20 QQ43 QQ52 QQ91 QR33 QR40 QR41 QR51 QR59 QR77 QR79 QR80 QS05 QS38 4B065 AA87X AA87Y AA90X AA90Y AB01 BA02 BA30 BD39 CA23 CA24 CA46 4C084 AA13 NA14 ZB26 4C086 AA01 EA16 MA01 MA04 ZB26 4H045 AA10 AA30 EA05 EA20 EA50 FA74

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 所望の表現型を標的細胞に選択的に与える薬剤を同定する方
    法であって、下記： (ｉ)サブトラクティブ細胞に、潜在的な合成遺伝子エレメント(ＳＧＥ)のコード
    配列の多彩な集団を含む発現ベクターのライブラリーをトランスフェクトし； (ｉｉ)これらのサブトラクティブ細胞から、標的細胞における所望の表現型の検
    出に干渉するＳＧＥライブラリーのＳＧＥベクターを単離し； (ｉｉｉ)標的細胞に、ステップ(ｉｉ)で単離したＳＧＥベクターのサブポピュレ
    ーションをトランスフェクトし；そして (ｉｖ)標的細胞に所望の表現型を与えるＳＧＥベクターを単離する ことを含む当該方法。
  2. 【請求項２】 標的細胞に対する選択的な抗増殖活性を有する薬剤を同定す
    る方法であって、下記： (ｉ)サブトラクティブ細胞に、潜在的な合成遺伝子エレメント(ＳＧＥ)のコード
    配列の多彩な集団を含む発現ベクターのライブラリーをトランスフェクトし； (ｉｉ)これらのサブトラクティブ細胞に対して抗増殖性でないＳＧＥライブラリ
    ーのＳＧＥベクターを単離し； (ｉｉｉ)標的細胞に、ステップ(ｉｉ)で単離した抗増殖性でないＳＧＥベクター
    をトランスフェクトし；そして (ｉｖ)標的細胞に対して抗増殖性であるＳＧＥベクターを単離する ことを含む当該方法。
  3. 【請求項３】 標的細胞及びサブトラクティブ細胞が、真核生物細胞である
    、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 標的細胞及びサブトラクティブ細胞が、哺乳動物細胞である
    、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 標的細胞とサブトラクティブ細胞の少なくとも一方が、ヒト
    の細胞である、請求項３に記載の方法。
  6. 【請求項６】 標的細胞が、トランスフォームされた細胞であり、サブトラ
    クティブ細胞が、トランスフォームされてない細胞である、請求項２に記載の方
    法。
  7. 【請求項７】 標的細胞が、ウイルスに感染しており、サブトラクティブ細
    胞が、該ウイルスに感染していない、請求項２に記載の方法。
  8. 【請求項８】 発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項２に記載
    の方法。
  9. 【請求項９】 ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、請求
    項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 ＳＧＥライブラリーを、標準化ｃＤＮＡライブラリーから
    生成する、請求項２に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 ＳＧＥライブラリーを、サブトラクティブｃＤＮＡライブ
    ラリーから生成する、請求項２に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 ＳＧＥが、ペプチドをコードするセンスの向きの配列であ
    る、請求項２に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 ＳＧＥが、アンチセンスＲＮＡをコードするアンチセンス
    の向きの配列である、請求項２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１に記載の方法により同定された、単離されたＳＧ
    Ｅ。
  15. 【請求項１５】 請求項１３に記載の方法により同定されたＳＧＥによりコ
    ードされるアンチセンスＲＮＡのヌクレオチド配列の約１２ヌクレオチドから全
    部にまで至るヌクレオチド配列を有する合成のオリゴヌクレオチド。
  16. 【請求項１６】 請求項１２に記載の方法により同定されたＳＧＥによりコ
    ードされる単離されたペプチド。
  17. 【請求項１７】 請求項１２に記載の方法により同定されたＳＧＥによりコ
    ードされるペプチドに対応するペプチド模倣物。
  18. 【請求項１８】 標的細胞に対して致死的であるとして同定された少なくと
    も一のＳＧＥを医薬製剤中に配合する更なるステップを含む、請求項１に記載の
    方法。
  19. 【請求項１９】 標的細胞に対する選択的な生物学的活性を有する化合物を
    同定する方法であって、下記、 (ｉ)請求項１に記載の方法により同定されたＳＧＥに対応する標的遺伝子又は標
    的遺伝子の産物の機能を阻害し又は増強する薬剤を検出するための薬物スクリー
    ニングアッセイを用意し；そして (ｉｉ)この薬物スクリーニングアッセイにおいて、試験化合物の、標的遺伝子又
    は標的遺伝子の産物の機能を調節する試験化合物の能力を試験する ことを含む、当該方法。
  20. 【請求項２０】 標的遺伝子又は標的遺伝子の産物の機能を調節することが
    できるとして同定された少なくとも一つの薬剤を含む医薬製剤を配合する更なる
    ステップを含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 標的細胞の表現型を調節する方法であって、標的細胞を、
    標的遺伝子又は標的遺伝子産物の機能を調節することのできる請求項１９に記載
    の方法により同定された薬剤と接触させることを含む、当該方法。
  22. 【請求項２２】 抗増殖活性が、細胞死の結果である、請求項２に記載の方
    法。
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