JP2013534140A - 不死化ｂ細胞のリプログラミング - Google Patents

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Abstract

人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を提供するための方法および組成物を提供する。例えば、特定の態様では、エプスタイン・バーウイルスをベースとしたベクター等のエピソームベクターにより形質転換されたＢリンパ球をリプログラミングすること、を含む方法を記述する。さらに、本発明は、外来性要素を本質的に含まず、Ｂ細胞免疫グロブリン可変領域の再構成を有する人工多能性幹細胞を提供する。一実施形態において、不死化したＢ細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を作製する方法が提供され、この方法は：ａ）１つ以上の不死化させるエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）要素により不死化された不死化Ｂ細胞を取得することと、ｂ）前記不死化Ｂ細胞を、該細胞内で外来性リプログラミング因子の発現を起こすことによってリプログラミングし、それによりｉＰＳ細胞を作製することと、を含む。
【選択図】図１

Description

本願は、２０１０年８月４日に出願された米国特許出願第６１／３７０，６１５号および２０１１年２月１１日に出願された米国特許出願第６１／４４１，８８５号に対する優先権を主張するものであり、これらの米国特許出願の全文は、参照することにより本明細書に組み入れられる。
１．発明の分野
本発明は、概して、分子生物学および幹細胞の分野に関する。より詳細には、本発明は、体細胞、特に形質転換されたＢ細胞のリプログラミングに関する。
２．関連技術の説明
一般にｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略される人工多能性幹細胞は、非多能性細胞、典型的には成体の体細胞から人工的に誘導されるある型の多能性幹細胞である。人工多能性幹細胞は、ある幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンのメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラの形成、ならびに発生能および分化能の点に関して、多くの点で胚性幹細胞などの天然の多能性幹細胞と同一であると考えられるが、天然の多能性幹細胞に対するこれらの完全な関連性はなお評価中である。
ヒトでは、ｉＰＳ細胞は、一般に皮膚線維芽細胞から作製される。しかしながら、皮膚生検の必要と線維芽細胞を増大させてインビトロで数回継代する必要があるため、患者固有の幹細胞を作製するには扱いにくい供給源である。さらに、ヒト体細胞のリプログラミングの以前の方法は、体細胞をヒト被験体から直接得るか、または人手のかかる細胞培養系で細胞を維持する必要があるため不便である。したがって、単純で便利、かつ入手が容易な代替の供給源から多能性幹細胞を誘導する方法の開発が要望されている。
発明の概要
患者固有の人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）の作製は、再生医療の前途を大いに有望にする。エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）で不死化したリンパ芽球様Ｂ細胞株（ＬＣＳ）は、最小量の血液から作製することができ、純種実験母集団の免疫学的または遺伝学的解析用の細胞標準試料として、全世界で預託されている。実施例で実証する通り、フィーダーのないエピソーム法により、転写因子と小分子のカクテルを使用して、２種類のＬＣＬからｉＰＳＣを作製した（ＬＣＬ−ｉＰＳＣ）。ＬＣＬ由来のｉＰＳＣは、正常な核型を示し、多能性マーカーを発現し、ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ−１エピソームベクターを消失し、奇形腫を産生し、ドナー同一性を保持し、かつ造血細胞系、心臓細胞系、神経細胞系、および肝細胞系にインビトロで分化した。有意な点は、親ＬＣＬは自身の存続のためにウイルスＥＢＮＡ−１、および他のＥＢＶ潜伏関連要素を発現したが、ＬＣＬ−ｉＰＳＣでは、これらの存在が検出可能でなかったことである。よって、ＬＣＬのリプログラミングは、特にＥＢＶ関連疾患に対して、患者固有のｉＰＳＣの無限の供給源を提供できる可能性がある。
したがって、本明細書の特定の態様は、不死化した体細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を作製する新規の方法、および当該方法から得られるｉＰＳ細胞を提供することにより、当技術分野における主な欠点を克服する。ゆえに、第１の実施形態では、１つ以上のエピソームベクター要素により不死化された１つ以上の体細胞をリプログラミングし、それによりｉＰＳ細胞を作製することを含む方法が提供される。特定の態様では、不死化した体細胞は、リンパ芽球様細胞または不死化した末梢血単核細胞を含む。不死化した末梢血単核細胞は、リンパ球（様々な種類のＴ細胞および／またはＢ細胞）、単球、またはマクロファージに由来し得る。例えば、不死化した体細胞、特にリンパ芽球様細胞は、Ｂ細胞を含む細胞集団に由来し得る。例えばＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルス）の形質転換から派生し得る。本明細書で開示するいずれのエピソームベクターも、ＥＢＶ要素を含み得る。このＥＢＶ要素は、ｏｒｉＰ複製起点、および／または、ＥＢＮＡ−１もしくはその誘導体をコードする遺伝子を含み得る。
ある特定の態様では、不死化したＢ細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を作製する方法を提供し得る。本方法は、１つ以上の不死化させるエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）要素により不死化された、不死化Ｂ細胞を取得することを含み得る。本方法はさらに、不死化Ｂ細胞内で外来性リプログラミング因子の発現を起こすことにより不死化Ｂ細胞をリプログラミングし、よってｉＰＳ細胞を作製すること、を含み得る。長期的な増殖と貯蔵には、不死化させるＥＢＶ要素がｉＰＳ細胞中に存在することは不要であり得ることが明らかになっており、したがって、本方法は、ｉＰＳ細胞からＥＢＶ要素を除去すること、またはＥＢＶ要素を本質的に含まないｉＰＳ細胞を単離もしくは濃縮することを、さらに含み得る。このようにして、ＥＢＶ要素を本質的に含まないが、不死化Ｂ細胞に由来するｉＰＳ細胞が取得され得る。
不死化Ｂ細胞を取得するためのアプローチは、少なくとも２つあり得る。１つのアプローチは、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）要素を用いてＢ細胞を不死化させることであり得る。このような不死化の前のＢ細胞は、血液サンプルから取得したものであり得る。この血液サンプルは、少なくとも約０．０１〜約５ｍｌ、より好ましくは約０．１〜０．５ｍｌの容量を有し、あるいは、この中に導き出せる任意の数または範囲を有し得る。例えば、不死化させるＥＢＶ要素は、誘導性の外来性リプログラミング発現カセットを含み得る。したがって、不死化Ｂ細胞をリプログラミングすることは、誘導性の外来性リプログラミング発現カセットの発現を誘導することを含み得る。他の態様では、樹立リンパ芽球様細胞株から不死化Ｂ細胞を取得し得る。リプログラミングのため、本方法は、１つ以上のリプログラミングエピソームベクター要素、例えばＥＢＶ要素を、不死化Ｂ細胞に導入することを含み得る。
リプログラミング効率を高めるため、不死化Ｂ細胞を、フィーダー層の非存在下で培養し得る。さらなる態様では、本方法は、不死化Ｂ細胞と１つ以上のシグナル伝達阻害剤を接触させることを含み、この１つ以上のシグナル伝達阻害剤には、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ−３）阻害剤、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）受容体阻害剤、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｐ５３阻害剤、ＮＦ−κＢ阻害剤、またはこれらの組み合わせが含まれる。このリプログラミング方法は、不死化Ｂ細胞と線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）を接触させることも含み得る。本発明の特定の態様で記述されるリプログラミング方法は、成熟Ｂ細胞のリプログラミングにおけるＰａｘ−５の抑制またはＣ／ＥＢＰαの過剰発現を不要にし得る。したがって、リプログラミングは、Ｐａｘ−５に特異的な阻害性ヌクレオチドを不死化Ｂ細胞に導入すること、または不死化Ｂ細胞において外来性Ｃ／ＥＢＰαを発現させることを含まなくてもよい。本方法はさらに、ｉＰＳ細胞を心臓細胞、造血細胞、神経細胞、または肝細胞へとインビトロで分化させることを含み得る。
Ｂ細胞をリプログラミングしてｉＰＳ細胞を作製するために、Ｂ細胞を不死化し、不死化したＢ細胞中に１つ以上のリプログラミング因子の外来性発現を起こす方法が提供され得る。さらなる実施形態では、ａ）ＥＢＶをベースとしたエピソームベクターでＢ細胞を形質転換して、不死化した細胞株を作製するステップと、ｂ）不死化した細胞株中に１つ以上のリプログラミング因子の外来性発現を起こし、それによりｉＰＳ細胞を作製するステップと、を含むｉＰＳ細胞の作製方法も提供され得る。
不死化Ｂ細胞のリプログラミングは、不死化Ｂ細胞にリプログラミングエピソームベクターを導入することを含み得る。代替の実施形態では、リプログラミングは、不死化のためのエピソームベクターに含まれるリプログラミング発現カセットの発現を誘導することを含み得る。リプログラミング因子は、ＥＢＶをベースとした不死化のためのエピソームベクターとは異なる、別のエピソームベクターに含まれるリプログラミング発現カセットであってよい。あるいは、リプログラミング因子は、ＥＢＶをベースとしたエピソームベクターに含まれるリプログラミング発現カセットであってもよく、この場合、別のリプログラミングベクターを導入するステップが不要になり、プロセスが単純化される。リプログラミング発現カセットは、誘導性プロモーターの制御下に置かれてよい。この特定の態様では、リプログラミング因子の外来性発現を起こすことは、この誘導性プロモーターを活性化することを含み得る。
後述する通り、エピソームベクター要素（不死化、リプログラミングのどちらか一方もしくは両方のためのエピソームベクター）を本質的に含まないｉＰＳ細胞を単離もしくは濃縮すること、または、本発明により作製されたｉＰＳ細胞からエピソームベクター要素を除去することを含む方法が提供され得る。不死化またはリプログラミングのためのエピソームベクターは、同一の実体であってもよく、異なる実体であってもよい。
本発明の特定の態様は、少なくとも、最初の不死化細胞は長期的増殖のためにエピソームベクターの発現する遺伝子に依存し、持続的な細胞供給源となるという理由で新規であるが、ｉＰＳ細胞に転換した後、ｉＰＳ細胞は自然に増殖的かつ不死となるため、エピソームベクター要素は不要になる。したがって、特定の実施形態では、本発明により作製されたｉＰＳ細胞は、外来性遺伝的要素、特にエピソームベクター要素を本質的に含まない場合がある。例えば、このｉＰＳ細胞は、ＥＢＮＡ−１のＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはタンパク質、ＥＢＮＡ−２、ＬＭＰ−２ＡなどのＥＢＶ潜伏関連要素、ＢＺＬＦ−１などの溶菌遺伝子、および／またはＥＢＶがコードする小型ＲＮＡ（ＥＢＥＲ）を、本質的に含まない場合がある。
このようなｉＰＳ細胞は、リプログラミング時またはリプログラミング後の、エピソームベクターを本質的に含まない細胞を濃縮または選択する追加のステップを伴うか伴わずに作製され得る。例えば、エピソームベクター要素を本質的に含まないｉＰＳ細胞を濃縮または選択することは、エピソームベクター要素を除去して、外来性遺伝的要素の影響を最小化することを含み得る。他の態様では、長期間の増殖後、エピソームベクター要素はｉＰＳ子孫細胞から消失し得る。
ある実施形態では、エピソームベクター要素を本質的に含まないｉＰＳ細胞を単離または濃縮することを含む方法が存在し得る。例えば、本方法は、個々のｉＰＳ細胞をクローニングすることと、エピソームベクター要素が除去されたクローン性コロニーを選択することを含み得る。選択を促進するため、本方法は、エピソームベクター要素に含まれる選択マーカーおよび／またはスクリーニングマーカーの発現を起こすことを含み得る。いくつかの態様では、この選択および／またはスクリーニングマーカーは、誘導プロモーターなどの外部応答性の調節要素の制御下にある。このような選択および／またはスクリーニングマーカーは、エピソームベクター要素の存在を示すマーカーであり、エストロゲン、テトラサイクリンなどの誘発剤がマーカーの発現を起こし得る。
本発明の特定の態様では、種々の目的で選択マーカーおよび／またはスクリーニングマーカーを使用できる。当技術分野において公知の任意の選択マーカーおよび／またはスクリーニングマーカーが含まれる。選択マーカーはさらに、抗生物質耐性遺伝子または自殺遺伝子と定義され得る。スクリーニングマーカーはさらに、蛍光タンパク質、発光タンパク質、もしくは生物発光タンパク質を発現するレポーター遺伝子、または細胞表面マーカー、エピトープ、もしくはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を発現するレポーター遺伝子と定義され得る。例えば、抗生物質耐性遺伝子は、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ネオマイシン、テトラサイクリン、またはアンピシリンに対する耐性を与える遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）であり得る。レポーター遺伝子が発現するタンパク質の例として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ルシフェラーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼなどがある。
別の実施形態では、ｉＰＳ細胞からのエピソームベクター要素の消失を増加させるエピソーム突然変異遺伝子の発現を起こすことを含む方法により、ｉＰＳ細胞内のエピソームベクター要素を除去し得る。例えば、エピソーム突然変異遺伝子はＥＢＮＡ−１（エプスタイン・バーウイルス核抗原１）ドミナントネガティブ変異体である。例えば、ＥＢＮＡ−１ドミナントネガティブ変異体は、ＮＤ４５０−６４１、ＮＤ４５０−６１８などのＥＢＮＡ−１誘導体であり得る（ＫｉｒｃｈｍａｉｅｒおよびＳｕｇｄｅｎ、１９９７）。
特定の態様では、本方法は、エピソーム突然変異遺伝子を含む発現カセットをｉＰＳ細胞に導入することを含む。他の態様では、本方法は、エピソームベクター要素に含まれるエピソーム突然変異遺伝子の発現を起こすことを含み得る。例えば、エピソーム突然変異遺伝子は、誘導プロモーターの制御下に置かれてよい。エピソームの除去が所望される場合、本方法は、このようなプロモーターを活性化することを含み得る。これにより、エピソーム突然変異体が発現されると考えられる。
さらなる実施形態では、ｉＰＳ細胞を、エピソームベクター要素を除去できる１つ以上の薬剤と接触させることを含む方法により、ｉＰＳ細胞内のエピソームベクター要素を除去し得る。特に、エピソームベクター要素は、例えばＥＢＶ要素などのウイルス要素を含む。除去薬剤は抗ウイルス剤であり得、より特定的には抗ＥＢＶ剤であり得る。理論に拘束されるものではないが、抗ウイルス剤または抗ＥＢＶ剤は、エピソームベクター要素の複製または増殖を阻害し得る。あるいは、他の態様では、エピソームベクター要素は細胞の成長／分裂と共にｉＰＳ細胞から自然に消失し得るため、こうした薬剤のいくつかの例は、いまだベクター要素を保持している細胞を特異的に阻害または死滅し得る。これにより、ベクター要素を本質的に含まない細胞が濃縮される。
例えば、抗ウイルス剤は、核酸類似体またはＧ−四重鎖に特異的な化合物を含む。核酸類似体は、アシクロビル（［９−（２−ヒドロキシエトキシメチル）グアニン］）、Ｅ−５−（２−ブロモビニル）−２’−デオキシウリジン、１−（２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードシトシン、１−（２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウラシル、β−Ｌ−５−ヨードジオキソランウラシル、および／または３’−アジド−３’−デオキシチミジンであり得る。Ｇ−四重鎖に特異的な化合物はＴＭＰｙＰ３、ＴＭＰｙＰ４、および／またはＢＲＡＣＯ−１９であり得る。
例えば、抗ＥＢＶ剤は、Ｈｓｐ９０阻害剤、ｃ−Ｍｙｃ阻害剤、またはＥＢＮＡ−１阻害剤を含み得る。ＥＢＮＡ−１阻害剤はさらに、ＥＢＶベクター要素の消失を増加させるＥＢＮＡ−１変異タンパク質と融合したタンパク質形質導入ドメインを含む、融合タンパク質と定義され得る。融合タンパク質の特定的な例として、Ｔａｔタンパク質と融合してドミナントネガティブに機能し、タンパク質の形質導入を促進する、ＥＢＮＡ−１の誘導体が挙げられる。
上記の通り、不死化した体細胞は、Ｂ細胞を含む細胞集団に由来するリンパ芽球様細胞であり得る。このＢ細胞は、ＥＢＶ形質転換により不死化されたものであり得る。この細胞集団は、未熟Ｂ細胞を含み得る。さらなる態様では、この細胞集団は、成熟Ｂ細胞を含み得る。Ｂ細胞を含む細胞集団は、血液サンプル、血液成分、骨髄、リンパ節、脾臓、胎児肝臓、臍帯などの供給源から取得し得る。この供給源は、選択された被験体のもの、あるいは選択された集団のものであり得る。体細胞は、選択された疾患または障害を有する被験体、例えばＥＢＶ感染症を有する患者、または移植を必要とする患者に由来し得る。
本方法は、Ｂ細胞を含有する任意の供給源、例えば血液サンプルからＢ細胞を取得することをさらに含み得る。本方法はリプログラミング効率が高く、不死化細胞の増殖能も高いことから、ｉＰＳ細胞の産生方法は、選択された被験体から得た、前例のないほど少量の血液サンプルを使用することを伴い得る。例えば、少なくとも、約、もしくは多くとも、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＬ、またはこれらから導き出せる任意の範囲である。本方法は、被験体、特に患者を選択することも含み得る。選択された被験体または患者は、選択された任意の遺伝マーカーを有し得る。
特定の態様では、マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）などのフィーダー層の存在下において、ｉＰＳ細胞が産生され得、あるいはリプログラミングに細胞培養が含まれ得る。他の態様では、ＭＥＦの存在は不要な細胞の無制御な増殖を引き起こし得るため、フィーダー層の非存在下でリプログラミングすることが有利であり得る。例えば、マトリックス成分の存在下でｉＰＳ細胞を産生し得る。マトリックス成分は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、フィブロネクチン、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）（フィブロネクチンの断片）、ＣｅｌｌＳｔａｒｔ（商標）、コラーゲン、または、フィーダー層の代替となることのできる任意の成分を含み得る。
さらなる態様では、本発明は、不死化した体細胞をリプログラミングすることを伴う。例えば、リプログラミングは、細胞中に１つ以上のリプログラミング因子の発現を起こすこと、（例えば、リプログラミング因子は、不死化させるエピソームベクター要素に含まれるリプログラミング発現カセットであり得る）；および／または細胞に１つ以上のリプログラミング因子を導入すること（例えば、追加のエピソームベクター要素を介する）を含み得る。
リプログラミング因子は、例えば異所的発現またはタンパク質形質導入を使用することにより、ＳｏｘおよびＯｃｔの発現を起こし得る。ＳｏｘおよびＯｃｔは、ＥＳ細胞であることを指定する転写調節の階層の中心であると考えられる。例えばＳｏｘは、Ｓｏｘｌ、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５またはＳｏｘ１８、好ましくはＳｏｘ２であり得、Ｏｃｔは、Ｏｃｔ４であり得る。Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、またはＥｓｒｒｂのような追加の因子が、リプログラミング効率を高め得る。リプログラミング因子の具体的なセットは、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、および任意でＬｉｎ−２８を含むセット；またはＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ、および任意でｃ−Ｍｙｃを含むセット；または、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＳＶ４０ラージＴ抗原を含むセットであり得る。
特定の態様では、不死化のためのエピソームベクター要素は、Ｏｃｔ遺伝子およびＳｏｘ遺伝子を含む１つ以上のリプログラミング発現カセットを含み得る。このリプログラミング発現カセットはさらに、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｌｉｎ２８遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子、またはＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子を含み得る。このリプログラミング発現カセットは、外部から制御可能な調節要素、例えば誘導プロモーターまたは条件的オペレーター（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｏｐｅｒａｔｏｒ）の制御下に置かれてよい。本態様により、不死化の後にリプログラミング因子を導入するステップが不要になり得る。Ｍｙｃ遺伝子はｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、またはＬ−Ｍｙｃであり得る。
他の態様では、リプログラミング因子は、Ｏｃｔ遺伝子およびＳｏｘ遺伝子を含む１つ以上のリプログラミング発現カセットを含み得る。このリプログラミング発現カセットはさらに、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｌｉｎ２８遺伝子、またはＫｌｆ遺伝子を含み得る。
直接的なリプログラミングのため、リプログラミング因子は、Ｓｏｘタンパク質およびＯｃｔタンパク質を含む１つ以上のリプログラミングタンパク質を含み得る。このリプログラミングタンパク質はさらに、Ｎａｎｏｇタンパク質、Ｌｉｎ２８タンパク質、Ｋｌｆタンパク質、Ｍｙｃタンパク質、またはＳＶ４０ラージＴ抗原タンパク質を含み得る。細胞内輸送を支援する目的で、これらのリプログラミングタンパク質は、タンパク質形質導入ドメインと機能的に連結し得る。
リプログラミングの亢進のため、リプログラミングはさらに、細胞と、１つ以上の細胞シグナル伝達調節因子、例えばグリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ−３）阻害剤、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）受容体阻害剤、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｐ５３阻害剤、ＮＦ−κＢ阻害剤、またはこれらの組み合わせを接触させることを含み得る。このような調節因子には、小分子、阻害性ヌクレオチド、発現カセット、またはタンパク質因子が含まれ得る。特定の態様では、不死化した成熟Ｂ細胞のリプログラミングは、複数のシグナル伝達阻害剤の組み合わせの存在下でリプログラムし、同時に、Ｐａｘ−５阻害性ヌクレオチド分子の使用およびＣ／ＥＢＰαの外来性発現を不要にすることを含み得る。
Ｂ細胞（特に成熟Ｂ細胞）由来の不死化した細胞をリプログラミングする上では、リプログラミングにおいて、Ｃ／ＥＢＰαエンハンサーおよび／またはＰａｘ−５阻害剤などのＢ細胞発達調節因子を使用しても、使用しなくてもよい。重要な知見は、ＬＣＬのリプログラミングにＰａｘ−５の先制的阻害（ｐｒｅｅｍｐｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）は不要であることである。リプログラミングプロセス中、Ｐａｘ−５は自動的に阻害／ダウンレギュレートされるが、リプログラミングが発生するには、Ｐａｘ−５が先制的にダウンレギュレートされる必要はない。したがって、不死化Ｂ細胞のリプログラミング前またはリプログラミング中、外部から加えられるＰａｘ−５阻害剤またはＣ／ＥＢＰαエンハンサー（Ｃ／ＥＢＰαがＰａｘ−５をダウンレギュレートする）は使用されない場合がある。
例えば、Ｐａｘ−５阻害剤は任意の阻害性ヌクレオチドであってよく、例えばアンチセンスＲＮＡ、小分子干渉ＲＮＡ、リボザイム、または発現カセット（Ｐａｘ−５阻害ヌクレオチド分子を発現する発現カセット）であり得る。また、Ｐａｘ−５阻害剤は、Ｐａｘ−５発現をダウンレギュレートするため、グルココルチコイド様コハク酸プレドニゾロンナトリウム、ＳＮ３８、またはＳＵ１１２７４であってもよい。文献では、グルココルチコイドはＣ／ＥＢＰαの発現を誘導するとも記述されている。同様に、Ｂ細胞発達調節因子にはＢｌｉｍｐ１、Ｏｃｔ２、およびＢｏｂ−１の阻害剤が含まれ得るが、Ｂ細胞のリプログラミングにおいて、これらの阻害剤を使用しても使用しなくてもよい。
Ｃ／ＥＢＰαの過剰発現については、Ｃ／ＥＢＰα発現用の発現カセットを通じて過剰発現を達成するか、または小分子処置（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）により過剰発現を誘導し得る。Ｃ／ＥＢＰαは、直接的または間接的に（ＥＢＦを通じて）Ｐａｘ−５をダウンレギュレートすることも報告されているが、現在のところ正確なメカニズムは不明である。
これらのＢ細胞発達調節因子、例えばＣ／ＥＢＰαエンハンサーおよび／またはＰａｘ−５阻害剤のヌクレオチドをエピソームベクター要素に含めることができ、多能性が樹立した後に除去できる。
代替の実施形態では、Ｐａｘ−５に特異的な阻害性ヌクレオチドおよび／またはＣ／ＥＢＰαの外来性発現を使用せずに、リンパ芽球様細胞または不死化Ｂ細胞のリプログラミングを実施し得る。
上記方法のいずれかによれば、本発明の特定の態様は、ｉＰＳ細胞、またはｉＰＳ細胞に由来する分化した細胞、組織、もしくは器官を提供し得る。ｉＰＳ細胞の臨床応用または臨床研究のために、本方法は、ｉＰＳ細胞を分化細胞、例えば、心筋細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、線維芽細胞、脾臓細胞、肝細胞、または表皮細胞に分化させることをさらに含み得る。さらなる態様では、上記のようにｉＰＳ細胞集団から分化した分化細胞、組織、または器官が開示され得る。この組織には、神経、骨、消化管、上皮、筋肉、軟骨、または心臓組織が含まれ得る。また、この器官には、脳、脊髄、心臓、肝臓、腎臓、胃、腸、または脾臓が含まれ得る。特定の態様では、ｉＰＳ細胞および分化した細胞、組織、または器官は、組織移植、薬物スクリーニング、または胚性幹細胞の代替となるための開発研究に使用され得る。
ヒト細胞であり得る胚性幹細胞と比較して、免疫グロブリン可変領域遺伝子のＶ、Ｄ、およびＪセグメントの不完全なセットを含むゲノムを含むｉＰＳ細胞も提供され得る。特定の態様では、このｉＰＳ細胞は、組み込まれた外来性ウイルス要素を本質的に含まない場合がある。さらなる態様では、このｉＰＳ細胞は、エピソームベクター要素を本質的に含まない場合がある。さらなる態様では、このｉＰＳ細胞は、外来性遺伝的要素を本質的に含まない場合がある。特定の態様では、胚性幹細胞と比較して、Ｂ細胞免疫グロブリン領域遺伝子の不完全なセットを含むゲノムを有するヒトｉＰＳ細胞が提供され得る。このｉＰＳ細胞は、外来性遺伝的要素またはＥＢＶ要素を本質的に含まない場合がある。このｉＰＳ細胞のゲノムは、選択された遺伝マーカー、例えば、特定の癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、もしくはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、または神経疾患のような、選択された疾患の遺伝マーカーを含み得る。特定の態様では、このｉＰＳ細胞のゲノムは、不死化Ｂ細胞に由来し得る。特定の態様では、このｉＰＳ細胞は正常な核型を有するか、または有さない場合がある。このｉＰＳ細胞に由来する分化した細胞、組織、または器官が提供され得る。
さらに別の態様では、１つ以上のエピソームベクター要素によって不死化された体細胞に由来するゲノムを含むｉＰＳ細胞も、開示され得る。このような不死化細胞は、リンパ芽球様細胞であり得る。特に、このｉＰＳ細胞は、エピソームベクター要素を本質的に含まない場合がある。
胚性幹細胞と比較して、Ｂ細胞免疫グロブリン可変領域遺伝子の不完全なセットを含むゲノムを含み、外来性遺伝的要素を本質的に含まないｉＰＳ細胞も、提供され得る。このゲノムは、選択された遺伝マーカー、例えば選択された疾患の遺伝マーカーを含み得る。このようなｉＰＳ細胞は、不死性で、正常な核型を有し、外来的に導入された癌遺伝子およびテロメラーゼを持たず、Ｂ細胞の再構成を有し、かつ／または、１つ以上の疾患に対する特異的な遺伝マーカーを有し得る。このようなｉＰＳ細胞から分化した誘導体も、提供され得る。
本発明の方法および／または組成物に関連して論じられている実施形態は、本明細書に記載される任意の他の方法または組成物に関して利用することができる。したがって、１つの方法または組成物に関する一実施形態は、本発明の他の方法および組成物にも適用することができる。
本明細書で使用される、核酸に関する用語「コードする」または「コードしている」は、当業者が本発明を容易に理解できるように使用されるが、これらの用語はそれぞれ、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同義的に使用することができる。
本明細書で使用される「ある（ａ）」または「ある（ａｎ）」は、１つまたは複数を意味し得る。語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と共に請求項（複数可）で使用される場合、語「ある（ａ）」または「ある（ａｎ）」は、１つまたは２つ以上を意味し得る。
請求項における用語「または（ｏｒ）」の使用は、代替のみまたは代替が互いに排他的であると明確に述べられていない限り、「および／または」を意味するが、本開示は、代替のみおよび「および／または」を指す定義も支持する。本明細書で使用される「別の」は、少なくとも２番目またはそれ以降を意味する。
本出願の全体を通じて、用語「約」は、ある値が、その値を決定するために用いられるデバイスもしくは方法に固有の誤差のばらつき、または被試験体中に存在するばらつきを含むことを示すために使用される。
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、この詳細な説明から本発明の趣旨および範囲内の様々な変更および改良が当業者に明らかになるため、単なる例示として与えられることを理解されたい。
以下の図面は本明細書の一部を成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含められる。本明細書に示す具体的な実施形態の詳細な説明と共に、これらの図面の１つ以上を参照することによって、本発明をよりよく理解できる。
図１Ａ、図１Ｂ：ＥＢＶをベースとし、リプログラミング発現カセットを有する、例示的なエピソームベクターである。 図２Ａ、２Ｂ：トランスフェクション後４０日目のｉＰＳの状態を確認するための、Ｔｒａ−１−６０生細胞染色である。ＬＣＬをリプログラミング因子でトランスフェクトし、ＣＨＡＬＰ培地中のマトリックス（マトリゲルおよびレトロネクチン）上に１５日置き、次いでｍＴｅＳＲ−１培地に２５日置いた（図２Ａ）。図２ＢのＴｒａ−１−６０の染色により、ｉＰＳ細胞の存在が確認された。 図３Ａ、３Ｂ：トランスフェクション後４６日目のｉＰＳの状態を確認するための、Ｔｒａ−１−６０生細胞染色である。ＬＣＬをリプログラミング因子でトランスフェクトし、ＣＨＡＬＰ培地中のマトリックス（マトリゲル）上に１５日置き、次いでｍＴｅＳＲ−１培地に３１日置いた（図３Ａ）。図３ＢのＴｒａ−１−６０の染色により、ｉＰＳ細胞の存在が確認された。 図４Ａ、４Ｂ：トランスフェクション後２９日目のｉＰＳの状態を確認するための、Ｔｒａ−１−６０生細胞染色である。ＬＣＬをリプログラミング因子でトランスフェクトし、ＣＨＡＬＰ培地中のマトリックス（マトリゲル）上に２０日置き、次いでｍＴｅＳＲ−１培地に９日置いた（図４Ａ）。図４ＢのＴｒａ−１−６０の染色により、ｉＰＳ細胞の存在が確認された。 図５Ａ、５Ｂ：トランスフェクション後４８日目のｉＰＳの状態を確認するための、Ｔｒａ−１−６０生細胞染色である。ＬＣＬをリプログラミング因子でトランスフェクトし、ＣＨＡＬＰ培地中のマトリックス（マトリゲル）上に１５日置き、次いでｍＴｅＳＲ−１培地に３３日置いた（図５Ａ）。図５ＢのＴｒａ−１−６０の染色により、ｉＰＳ細胞の存在が確認された。 図６Ａ〜６Ｄ：リプログラミング因子のトランスフェクションがＰａｘ−５発現を阻害することを示す。図６Ａ：Ｐａｘ−５アイソタイプ対照である。ＰＥ結合Ｐａｘ−５抗体アイソタイプ対照を用いた、ＬＣＬ−２細胞の代表的フローサイトメトリー染色を示す。バックグラウンドの染色は約０．４％である。 図６Ｂ：トランスフェクトされていないＬＣＬ−１細胞のＰａｘ−５である。ＰＥ結合Ｐａｘ−５を用いた、ＬＣＬ−２トランスフェクション後対照（ＤＮＡなし）の代表的フローサイトメトリー染色を示す。Ｐａｘ−５発現染色は約５６．２％である。 図６Ｃ：リプログラミング因子によりトランスフェクトされたＬＣＬ−２細胞のＰａｘ−５染色である。リプログラミングプラスミドｐ３６−ｐ３４−ｐ３１でトランスフェクトされたＬＣＬ−２細胞に対する、ＰＥ結合Ｐａｘ−５抗体を用いた代表的フローサイトメトリー染色を示す。Ｐａｘ−５発現染色は約８．２％である。 図６Ｄ：複数のリプログラミング因子によるＰａｘ−５の阻害を示す。リプログラミングプラスミドの種々の組み合わせによりトランスフェクトされたＬＣＬ−１およびＬＣＬ−２細胞株の、Ｐａｘ−５の阻害レベルを示す。 図７Ａ〜７Ｆ：ＬＣＬ−ｉＰＳＣの誘導および特性評価を示す。図７Ａ：ヒトリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）のリプログラミング計画を表す図である。ＬＣＬ培養物の形態、リプログラミング中の細胞、およびＬＣＬ−ｉＰＳＣコロニーを示す。それぞれ４０ｘ、２０ｘ、１０ｘの倍率で画像を取得した。図７Ｂ：リプログラミング因子の種々の組み合わせでＬＣＬ−１（ｉ）およびＬＣＬ−２（ｉｉ）のヌクレオフェクションを行った後に形成された、Ｔｒａ−１−６０陽性コロニー数の平均を示す。リプログラミング因子に使われている略語は次の通りである。Ｏ＝ＯＣＴ４、Ｓ＝ＳＯＸ２、Ｎ＝ＮＡＮＯＧ、Ｋ＝ＫＬＦ４、ｃ−ｍ＝ｃ−ＭＹＣ、Ｌ−ｍ＝Ｌ−ＭＹＣ、Ｔ＝ＳＶ４０ラージＴ抗原、およびＬ＝ＬＩＮ２８。 図７Ｃ：ＬＣＬ−ｉＰＳ細胞系の特性評価を示す。ｉ．代表的なＬＣＬ由来ｉＰＳ細胞系（ＬＣＬ−ｉＰＳ２ａ）の明視野（左のパネル）およびＴｒａ−１−６０染色（右のパネル）により、多能性表面マーカーＴｒａ−１−６０の均一な発現が確認される。画像は１０ｘ倍率で取得した。ｉｉ．代表的なＬＣＬ由来ｉＰＳ細胞系であるＬＣＬ−ｉＰＳ１ｂの、ｈＥＳＣ多能性マーカーＯＣＴ４（左のパネル、ＯＣＴ４：黒線、アイソタイプ対照：赤線）、ＳＳＥＡ−４（中央のパネル、ＳＳＥＡ４：赤線、アイソタイプ対照：黒線）、およびＴｒａ−１−８１（右のパネル、Ｔｒａ−１−８１：赤線、アイソタイプ対照：黒線）のフローサイトメトリー分析を示す。ｉｉｉ．１１回継代した後の各ＬＣＬ−ｉＰＳ細胞系の核型分析が行われ（ＷｉＣｅｌｌ研究所）、正常であることが確認された。ＬＣＬ−ｉＰＳ２ｂの代表的画像を示す。ｉｖ．Ｈｌ（ｈＥＳＣ系）、ＬＣＬ−１、ＬＣＬ−２、および各ドナー系由来の２つの代表的ＬＣＬ−ｉＰＳクローンの、ｈＥＳ細胞マーカー遺伝子ＤＮＭＴ３Ｂ、ＬＥＦＴＢ、ＮＯＤＡＬ、ＲＥＸ１、ＥＳＧ１、ＧＤＦ３、およびＵＴＦ１の発現に関するＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。各サンプルの陽性負荷対照としてＧＡＰＤＨを使用した。逆転写酵素の非存在下（ＲＴなし）で作製されたｃＤＮＡを使用して、ゲノムＤＮＡがＲＮＡサンプルに混入していないことを確認した。 図７Ｄ：ＬＣＬ−ｉＰＳ２ａを注入された免疫欠損マウスに由来する奇形種のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は、３つの胎性胚葉、すなわち内胚葉（杯細胞、左のパネル）、外胚葉（神経ロゼット、中央のパネル）、および中胚葉（軟骨、右のパネル）のすべてを表す組織を示している。すべてのＨ＆Ｅ画像は４０ｘ倍率を用いて取得した。 図７Ｅ：ＬＣＬ−ｉＰＳＣから得たＲＮＡの、リプログラミングベクター遺伝子の発現に関するＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。目的の３つのリプログラミング遺伝子（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、およびｃ−Ｍｙｃ）用の順方向プライマーと、ＩＲＥＳ２用の逆方向プライマーを利用した。各サンプルの陽性負荷対照としてＧＡＰＤＨを使用した。逆転写酵素の非存在下（ＲＴなし）で作製されたｃＤＮＡを使用して、ゲノムＤＮＡがＲＮＡサンプルに混入していないことを確認した。各ＰＣＲ反応の陽性対照として、リプログラミングベクターを含めた（＋ｃｏｎｔｒｏｌ）。図７Ｆ：ゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析により、導入遺伝子の組み込みがないことが確認された。目的の３つのリプログラミング遺伝子（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、およびｃ−Ｍｙｃ）用の順方向プライマーと、ＩＲＥＳ用の逆方向プライマーを利用した。各サンプルの陽性負荷対照としてＧＡＰＤＨを使用し、各ＰＣＲ反応の陽性対照としてリプログラミングベクターを含めた（＋ｃｏｎｔｒｏｌ）。 図８Ａ〜８Ｅ：リプログラミングおよびウイルス要素に関するＬＣＬ−ｉＰＳＣの分析、ならびにＬＣＬ−ｉＰＳＣの３血球系分化を示す。図８Ａ：Ｈｌ（ｈＥＳＣ系）、ＬＣＬ−１、ＬＣＬ−２、および各ドナー系由来の２つの代表的ＬＣＬ−ｉＰＳクローンの、ＥＢＶ遺伝子：ＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−２、ＬＭＰ−２Ａ、およびＢＺＬＦ−１の発現に関するＲＴ−ＰＣＲ分析である。各サンプルの陽性負荷対照としてＧＡＰＤＨを使用した。逆転写酵素の非存在下（ＲＴなし）で作製されたｃＤＮＡを使用して、ゲノムＤＮＡがＲＮＡサンプルに混入していないことを確認した。図８Ｂ：ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）のＰＣＲ分析から、ＬＣＬ−ｉＰＳＣ中にＥＢＶ ＤＮＡが存在しないことが明らかである。Ｈｌ（ｈＥＳＣ系）、ＬＣＬ−１、ＬＣＬ−２、および各ドナー系由来の２つの代表的ＬＣＬ−ｉＰＳＣのｇＤＮＡ ＰＣＲ分析を行って、ＥＢＮＡ−１、ｏｒｉＰ、ＥＢＮＡ−２、およびＢＺＬＦ−１をコードするＥＢＶ配列を検出した。各サンプルの陽性負荷対照として、ＧＡＰＤＨを使用した。図８Ｃ：ＬＣＬ−１、ＬＣＬ−２、および各ドナー系由来の２つの代表的ＬＣＬ−ｉＰＳクローンに対して、抗ＥＢＮＡ−１抗体を使用した免疫組織化学検査を行い、ＥＢＮＡ−１タンパク質発現を検出した（茶色）。画像は４０ｘ倍率を用いて取得した。 図８Ｄ：インビトロの三血球系分化を示す。ｉ．α１アンチトリプシンを発現するＬＣＬ−ｉＰＳＣ由来肝細胞前駆体を、フローサイトメトリーで定量化した。ｉｉ．ＬＣＬ−ｉＰＳＣの心臓誘導を行い、１４日目に心筋トロポニンＴ（ｃＴＮＴ）陽性の心筋細胞をフローサイトメトリーで定量化した。ｉｉｉ．ＬＣＬ−ｉＰＳ２ｂ由来の神経培養物を免疫染色し、β３−チューブリンの存在を調べた。２０ｘ倍率を用いて画像を取得した。ｉｖ．神経誘導したＬＣＬ−ｉＰＳＣに由来する、β３−チューブリンおよびネスチンを共発現する神経前駆細胞をフローサイトメトリーで定量化した。ｖ．ＬＣＬ−ｉＰＳ２ａ細胞由来のＨＰＣのＭｅｇａｃｕｌｔ培養物を染色して、巨核球および血小板前駆体（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）の存在を調べ、４０ｘ倍率で画像を取得した（左のパネル）。ＬＣＬ−ｉＰＳ２ｂ由来のＨＰＣをＧＭ−ＣＳＦの存在下で増大させ、染色して、単球、好中球、およびマクロファージの存在を調べ、２０ｘ倍率で画像を取得した（右のパネル）。ｖｉ．コロニー形成単位（ＣＦＵ）を定量化することにより、４つの各ＬＣＬ−ｉＰＳＣに由来する、赤血球系（ＣＦＵ−Ｅ／ＢＦＵ−Ｅ）、マクロファージを含む骨髄系（ＣＦＵ−Ｍ）、顆粒球（ＣＦＵ−Ｇ）、顆粒球−マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）、および顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）を含む多能性コロニーの存在を実証した。ｖｉｉ．所定の無血清胚葉体（ＥＢ）分化プロトコルにより、１２日間、ＬＣＬ−ｉＰＳＣから造血前駆細胞（ＨＰＣ）へとインビトロで分化させた。ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４３、ＣＤ４１、ＣＤ２３５ａのシングルポジティブ細胞の割合、およびＣＤ３４／ＣＤ４３、ＣＤ４５／ＣＤ４３、ＣＤ３４／４５のダブルポジティブ細胞の割合を、フローサイトメトリーで定量化した。 図８Ｅ：各Ｂ細胞は、長さ、配列ともに他と重複しない、増殖性の免疫グロブリン遺伝子再構成を１つずつ有する。ＢＩＯＭＥＤ−２ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ Ａｃｔｉｏｎプロトコルに従い、連結領域および３つの全保存フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３）に対して特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを使用して、免疫グロブリン重鎖（ＩｇＧＨ）遺伝子再構成を増幅した。正常あるいはポリクローナルなＢ細胞集団から得たＤＮＡは、アンプリコン産物のベル型曲線（ガウス分布）を描くのに対し、クローン性再構成は顕著な単一サイズの産物であることが、キャピラリー電気泳動および遺伝子スキャニングにより特定されている。
Ｉ．はじめに
患者固有の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、病因を理解し新規な治療的介入の開発を促進するための、有用なモデルとして機能し得る（Ｙａｍａｎａｋａ、２００７）。近年、複数の方法によるリプログラミング因子の送達により、外来性ＤＮＡのないｉＰＳＣが作製されている。これらの方法には、ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ−１（エプスタインバー核抗原−１）をベースとしたエピソームプラスミド（Ｙｕら、２００９）、小分子（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の存在下もしくは非存在下（Ｌｉｎら、２００９；ＯｋｉｔａおよびＹａｍａｎａｋａ、２０１０；Ｏｋｉｔａら、２０１０）、ｐｉｇｇｙＢＡＣトランスポゾン（Ｗｏｌｔｊｅｎら、２００９）、ミニサークル（ｉａら、２０１０）、タンパク質（Ｚｈｏｕら、２００９）、主に線維芽細胞を使用するＲＮＡのカクテル（Ｗａｒｒｅｎら、２０１０）などが含まれる。しかし、これらの方法はいまだリプログラミング効率が比較的低いため、応用は限られている。
侵襲的な皮膚生検から取得する線維芽細胞と比べて、末梢血はリプログラミングの供給源として扱いやすい。わずか０．５ｍＬの血液から得たヒトＢ細胞を、ＥＢＶによりインビトロで形質転換して、リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）を作製することができる（Ａｍｏｌｉら、２００８）。現在では、国際研究集団向けに、いくつかの主要施設がＬＣＬのコレクションを管理している。Ｂリンパ球は、Ｐａｘ−５発現のダウンレギュレーションにより、マクロファージ（Cｏｂａｌｅｄａ、２０１０；ＣｏｂａｌｅｄａおよびＢｕｓｓｌｉｎｇｅｒ、２００８）、あるいは造血前駆細胞（ＨＰＣ）に分化形質転換できる（ＣｏｂａｌｅｄａおよびＢｕｓｓｌｉｎｇｅｒ、２００８）。Ｐａｘ−５阻害の存在下（Ｈａｎｎａら、２００８）または非存在下（Ｗａｄａら、２０１１）で、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、およびｃ−ＭＹＣのウイルス形質導入を介したリプログラミングにより、マウスＢ細胞からｉＰＳＣが作製されている。
本発明の特定の態様では、体細胞、特にエピソームベクター要素で不死化された体細胞をリプログラミングすることにより、ｉＰＳ細胞を作製する方法を提供する。例えば、リンパ芽球様細胞（例えば、ＥＢＶにより形質転換されたＢ細胞）のリプログラミング、および、この細胞に由来するｉＰＳ細胞が本発明に含まれる。リンパ芽球様細胞などの不死化体細胞は、長期的増殖のためにエピソームベクター要素に依存し得るが、リプログラミングにより多能性状態が樹立した後は、リプログラミングされた細胞は正常な核型を有し、エピソームベクター要素（特にＥＢＶが発現する遺伝子）に依存することなく増殖できるようになる。このような不死化細胞には、すでに入手可能となっているか保管されている任意のリンパ芽球様細胞株や、特定の生体に由来する不死化細胞が含まれ得る。
本発明の方法を使用した体細胞のリプログラミングにより多能性または多分化能を有する細胞を作製することは、少なくとも以下の利点を有する。第一に、本発明の方法を使用すれば、個々の患者に固有の細胞である自己多能性細胞を作製することが可能になる。細胞治療において自己細胞を使用すると、非自己細胞に優る大きな利点が得られる。非自己細胞の場合、免疫学的拒絶反応を起こす可能性がある。これに対して、自己細胞の場合、著しい免疫学的拒絶反応を起こすことはまずない（Ｍｕｎｓｉｅら、２０００を参照）。第二に、本発明の方法を使用すれば、胚、卵母細胞、および／または核移植技術を使用することなく、不死化体細胞の新規、持続可能、かつ簡便な供給源から多能性細胞を作製することが可能になる。本発明の範囲を限定することを意図するものではないが、本発明は、被験体から直接得たＢ細胞でなく、不死化した細胞、例えばＥＢＶで形質転換されたＢ細胞のリプログラミングを伴う。これにより、リプログラミングに必要な血液サンプルなどのサンプルの容量を低減する。
ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ−１を使用して不死化Ｂ細胞あるいはＬＣＬをリプログラムすることのさらなる利点として、Ｂ細胞が生来有する可塑性、ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ−１プラスミドに対するＢ細胞の受容性、ＬＣＬ作製の容易さ、および預託されているＬＣＬコレクションの入手のしやすさが挙げられる。実施例に示すように、ＬＣＬ由来のｉＰＳＣは、正常な核型を有する多能性幹細胞の特性を示し、親ＬＣＬの遺伝的同一性を保持し、再構成されたＩｇＧ遺伝子座のクローン的特徴（ｃｌｏｎａｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を維持し、かつエピソーム性リプログラミング遺伝子およびウイルス性ＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−２、ＬＭＰ−２Ａ、およびＢＺＬＦ−１遺伝子の発現を消失し、その結果、外来性リプログラミング要素およびウイルス要素を本質的に含まない自己持続性のＬＣＬ−ｉＰＳＣをもたらした。
追加的態様では、得られたｉＰＳ細胞は、細胞分裂中にエピソームベクター要素を除去または消失させ、このような外来性要素の影響を最小化し得る。したがって、正常な核型を有し、外来的に導入された癌遺伝子およびテロメラーゼがなく、かつ疾患に対する特定の遺伝マーカーを任意で保有する不死の細胞が提供され得る。本発明の時点までは、既存のＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株を利用して、ＥＢＶウイルス遺伝子が残った状態で特定の疾患の遺伝的素因を調査できる見込みはほとんど存在しない。その理由は、特定の組織を作製し調査する際、結果に干渉したり結果を混乱させる可能性があるためである。しかし、こうしたエピソーム要素を除去することにより、ｉＰＳ細胞由来の特定の細胞または組織において特定の疾患を調査する上で、Ｂ細胞株から作製されたｉＰＳ細胞は有用となると考えられる。
さらなる態様では、生体から体細胞を取得し、エピソームベクター要素により不死化した後、リプログラミングしてｉＰＳ細胞にし得る。例えば、少量の血液から得たＢ細胞を含む細胞集団をＥＢＶで形質転換してから、形質転換したＢ細胞をリプログラミングし得る。特定の態様では、ＥＢＶベクターのようなエピソームベクター要素は、誘導性リプログラミング発現カセットを含み得る。したがって、不死化細胞にリプログラミング因子を導入する代わりに、不死化細胞内のエピソームベクターに含まれるリプログラミングカセットを誘導してリプログラミングし得る。
本発明のいくつかの態様は、形質転換されたＢ細胞をリプログラミングする方法を提供し、このようなＢ細胞に由来するｉＰＳ細胞を提供する。さらなる態様では、こうしたｉＰＳ細胞は、外来的に組み込まれた遺伝因子を本質的に含まない場合がある。これらの態様の特定の利点は、外来遺伝子の組み込みのない、リプログラミングされた子孫細胞に保持され得る、Ｂ細胞由来の免疫グロブリン遺伝子の再構成され減少したＶ、Ｄ、Ｊ遺伝子セグメントである。このセグメントは、Ｂ細胞由来ｉＰＳ細胞の様々なクローン集団の固有の特性または「バーコード」として機能し、また、こうしたｉＰＳ細胞と、Ｖ（Ｄ）Ｊ組み換えを受けていない多能性幹細胞とを区別するのに役立ち得る。遺伝子組み込みがないことは、発癌性形質転換および機能障害の発達などのリスクなしにｉＰＳ細胞を将来使用する上で、重要である。本発明のさらなる実施形態および利点を以下に記述する。
「リプログラミング」は、リプログラミングなしの同一条件下よりも、培養下またはインビボで少なくとも１つの新たな細胞型の子孫を形成する、測定可能に増大した能力を細胞に与えるプロセスである。より具体的には、リプログラミングは、体細胞に多能性潜在能力を与えるプロセスである。すなわち、新規な細胞型の表現型特性を有する子孫がリプログラミングの前に本質的に形成できなくても、十分な増殖後には、このような子孫が計測可能な割合で形成され、あるいは、新規な細胞型の特質を有する子孫の割合が、リプログラミングの前よりも計測可能に多いことを意味する。特定の条件下で、新たな細胞型の特性を有する子孫の割合は、好ましさが増す順で少なくとも約１％、５％、２５％、またはそれより多くであり得る。
本明細書で使用される用語「〜に対応する」は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部もしくは一部と相同（すなわち、厳密には進化的に関連していないが、同一である）であること、またはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味する。反対に、本明細書で使用される用語「相補的」は、相補的な配列が、参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部と相同であることを意味する。例示として、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
特定のタンパク質を「コード」する「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」、「断片」、または「導入遺伝子」は、適切な調節配列の制御下に置かれると、インビトロまたはインビボで転写され、任意で遺伝子産物、例えば、ポリペプチドに翻訳もされる核酸分子である。コード領域は、ｃＤＮＡ型、ゲノムＤＮＡ型、またはＲＮＡ型のいずれかで存在し得る。ＤＮＡ型で存在する場合は、核酸分子は、一本鎖（すなわち、センス鎖）または二本鎖であり得る。コード領域の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。遺伝子には、ウイルス、原核生物、または真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ウイルス、原核生物、または真核生物のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列が含まれ得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常は、遺伝子配列の３’に位置する。
用語「細胞」は、当技術分野におけるその最も広い意味で本明細書で使用され、多細胞生物の組織の構造単位であり、外部から細胞を隔離する膜構造物によって取り囲まれ、自己複製する能力を有し、かつ遺伝情報およびそれを発現させる機構を有する生体を指す。本明細書で使用される細胞は、天然に存在する細胞または人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞など）であり得る。
本明細書で使用される用語「幹細胞」は、有糸分裂を通じて自己複製する能力、および様々な特殊細胞型に分化する能力（すなわち、多能性）を有する細胞を指す。典型的には、幹細胞は、傷害を受けた組織を再生することができる。本明細書の幹細胞は、限定されるものではないが、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または組織幹細胞（組織特異的幹細胞または体性幹細胞とも呼ばれる）であり得る。上記の能力を有し得る人工的に産生された任意の細胞（例えば、本明細書で使用される融合細胞、リプログラミングされた細胞など）は、幹細胞であり得る。
「胚性幹（ＥＳ）細胞」は、初期胚に由来する多能性幹細胞である。ＥＳ細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年からノックアウトマウスの作製にも利用されている。１９９８年にヒトＥＳ細胞が樹立され、現在は、再生医療で利用可能になっている。
組織幹細胞は、ＥＳ細胞とは異なり、分化能が制限されている。
組織幹細胞は、組織の特定の位置に存在し、未分化の細胞内構造を有する。したがって、組織幹細胞の多能性は、典型的には低い。組織幹細胞は、比較的高い核／細胞質比を有し、細胞内小器官をほとんど有さない。ほとんどの組織幹細胞は、低い多能性、長い細胞周期、および個体の寿命を超える増殖能を有する。組織幹細胞は、細胞が由来する部位、例えば、皮膚系、消化系、骨髄系、神経系などに基づいて分類される。皮膚系の組織幹細胞には、表皮幹細胞、毛包幹細胞などが含まれる。消化系の組織幹細胞には、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などが含まれる。骨髄系の組織幹細胞には、造血幹細胞、間葉幹細胞などが含まれる。神経系の組織幹細胞には、神経幹細胞、網膜幹細胞などが含まれる。
一般にｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略される「人工多能性幹細胞」は、ＥＳ細胞の特性に似た特性を有する幹細胞であり、特に多能性および増殖能力を有する細胞を指す。ｉＰＳ細胞は、非多能性細胞、典型的には成体の体細胞または最終分化した細胞、例えば、線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、または表皮細胞などから、リプログラミング因子と呼ばれる特定の因子を外来的に発現させることによって、人工的に作製される。
「多能性」は、１つ以上の組織または器官、または好ましくは、３つの胚葉：内胚葉（内側胃内壁、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、または外胚葉（表皮組織および神経系）のいずれかを構成するすべての細胞に分化する潜在能力を有する幹細胞を指す。本明細書で使用される「多能性幹細胞」は、３つの胚葉のいずれかに由来する細胞、例えば、全能性細胞または人工多能性細胞の直系の子孫に分化できる細胞を指す。
用語「体細胞」は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、その他、未分化で多能な状態を保持する細胞以外の、任意の細胞を指す。体細胞の具体例として、（i）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞などの組織幹細胞（体性幹細胞）、（ｉｉ）組織前駆細胞、および（ｉｉｉ）リンパ球、上皮細胞、筋細胞、線維芽細胞などの分化細胞が挙げられる。本発明の作製方法で使われる体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を好適に使用することができる。
「ベクター」または「構築物」（時には、遺伝子送達または遺伝子輸送「ビヒクル」または「カセット」と呼ばれる）は、インビトロまたはインビボのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む巨大分子または分子の複合体を指す。ベクターは、直鎖状分子または環状分子であり得る。
用語「エピソームベクター」は、自身を自律的に複製し維持する染色体外ＤＮＡ分子を指す。ある特定の場合、エピソームベクターは環状かつ二本鎖である。このような特性を有する任意のエピソームベクターを、特定の限定なく本発明の作製方法に使用することができる。
「発現構築物」または「発現カセット」は、転写を方向付けできる核酸分子を意味する。発現構築物には、少なくとも、プロモーター、またはプロモーターに機能的と等価な構造物が含まれる。追加の要素、例えば、エンハンサーおよび／または転写終結シグナルなども含まれ得る。
用語「外来性」は、細胞または生物におけるタンパク質、遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドに関連して使用される場合は、人工または天然の手段によって細胞または生物内に導入されたタンパク質、遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドを指し、細胞に関連して使用される場合は、単離されてから、人工または天然の手段によって他の細胞または生物に導入された細胞を指す。外来性核酸は、異なる生体もしくは細胞由来であってよく、または生体もしくは細胞中に天然に存在する核酸の１つ以上の追加的複製物であってよい。外来性細胞は、異なる生物に由来していても、同じ生物に由来していてもよい。非限定的な例として、外来性核酸は、天然の細胞の染色体位置とは異なる染色体位置にあるか、あるいは天然に見られるものとは異なる核酸配列に隣接する。
核酸分子に関して「機能的に連結する」とは、２つ以上の核酸分子（例えば、転写される核酸分子、プロモーター、およびエンハンサー要素）が、核酸分子の転写を可能とするように連結していることを意味する。ペプチドおよび／またはポリペプチド分子に関して「機能的に連結する」とは、２つ以上のペプチドおよび／またはポリペプチド分子が、融合の各ペプチドおよび／またはポリペプチド成分の少なくとも１つの特性を有する１本のポリペプチド鎖、すなわち融合ポリペプチドを生じるように連結していることを意味する。融合ポリペプチドは、好ましくはキメラポリペプチドであり、すなわち異種性分子で構成される。
用語「調節要素」は、レシピエント細胞においてコード配列の複製、転写、転写後プロセシング、および翻訳を集合的に提供する、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサー、スプライス部位などを集合的に指す。選択されたコード配列が、適切な宿主細胞において複製、転写、および翻訳されることが可能であれば、これらの制御要素のすべてが常に存在する必要はない。
用語「プロモーター」は、本明細書において通常の意味で使用され、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を指す。この調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合して下流（３’方向）のコード配列の転写を開始できる遺伝子に由来する。
「エンハンサー」は、プロモーターの近傍に位置すると、エンハンサードメインが存在しない場合のプロモーターによる転写活性と比較して、高い転写活性を与える核酸配列を意味する。
ＩＩ．リプログラミング用細胞の供給源
再生医療のための細胞のリプログラミングが有する医療的可能性は莫大であることから、最小量の操作で可塑性を示す理想的な細胞型を特定する努力が続けられている。本発明の特定の態様では、エピソームベクター要素、特にＥＢＶ要素により不死化された体細胞（例えば血液細胞、より特定的にはＢ細胞）のリプログラミングに使用する方法および細胞を提供する。リプログラミングされる細胞は、リンパ芽球様細胞であり得、例えば、血液サンプルから樹立または派生し、ＥＢＶで形質転換されたＢ細胞であり得る。Ｂ細胞の供給源は、生体または罹病した被験体、例えばヒトから得た少量の血液サンプルであり得る。
血液は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞作製のためのリプログラミングに適した、簡便で利用しやすいヒト由来物質である。多くの研究室が、例えば臍帯血からのｉＰＳ細胞の誘導に成功している。より具体的には、Ｔ細胞、単球、および骨髄系前駆細胞のプール（血液を構成するＣＤ３４＋細胞を含む）からｉＰＳ細胞が作製されてきた。残念ながら、現在のところ、レトロウイルスまたはレンチウイルスをベースとした系に依存しない方法では、ヒト血液細胞のリプログラミングは非効率である。このような方法の一例は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来のｏｒｉＰレプリコンに依存するプラスミドベースの方式を使用して、トランスフェクト先宿主細胞内でのプラスミドの保持と複製を促進する。例えば、リプログラミング因子の組み合わせをコードするｏｒｉＰベースのプラスミドを用いて、細胞をトランスフェクトすることができる。そして、ｏｒｉＰレプリコンにより、重要なリプログラミング因子を発現するための十分な時間が得られる。その後、細胞分裂１回あたり約５〜８％の割合でプラスミドが宿主細胞から自然に消失して、外来性ＤＮＡを含まないｉＰＳ細胞が作製される（Ｎａｎｂｏら、２００７）。
血液細胞の成熟状態と、その成熟状態とリプログラミングとの相関関係に関する議論が存在する。例えば、ｉＰＳクローンの作製効率を根拠として、ＣＤ３４を発現する造血幹細胞前駆体は望ましい候補だと認識されてきた。この仮説については、臍帯血、動員／非動員末梢血、および骨髄に集合的に由来するＣＤ３４＋細胞間の相違を含めた、入念な検証が行われていない。さらに、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の総集団のうち、ＣＤ３４＋細胞が占める割合はわずか（０．０１％）である。したがって、血液細胞にＤＮＡを組み込まないリプログラミング効率も低くなる（＜０．０１％）ため、複数のクローンを作製するに足る十分な出発物質を１ｍＬの血液から取得することは困難を伴う。他方、上記と比べて、Ｂ細胞はＰＢＭＣ集団の多くの割合（約２０％）を占め、リプログラミングに対する受容性が高い可能性があると考えられる。
本発明の特定の態様では、Ｂ細胞を含む細胞集団をエピソームベクター要素により不死化し、次いで、得られた不死化Ｂ細胞をリプログラミングする方法を提供し得る。リプログラミング発現カセットを別個に導入する必要をなくすため、エピソームベクター要素は、誘導性リプログラミング発現カセットを含み得る。特定の態様では、リンパ芽球様細胞のような樹立した形質転換Ｂ細胞をリプログラミングする方法を提供し得る。
Ａ．形質転換されたＢ細胞のリプログラミング
特定の態様では、形質転換されたＢ細胞のリプログラミングを、例えば、リプログラミング発現カセットまたはリプログラミングタンパク質を使用することにより提供し得る。Ｂ細胞の追加のリプログラミング因子、例えばＰａｘ−５阻害剤やＣ／ＥＢＰαエンハンサーを使用して、元のＢ細胞の系列特定化状態（ｌｉｎｅａｇｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ）に基づくリプログラミングを亢進させ得る。特定の実施形態では、成熟Ｂ細胞をリプログラミングする場合でも、Ｐａｘ−５阻害剤およびＣ／ＥＢＰαエンハンサーは不要であり得る。
造血幹細胞からのＢリンパ球の産生は、別個の発生側面を調節する複数の転写因子により制御される。イカロスとＰＵ．１は、複数の並行経路において、必須のシグナル伝達受容体（Ｆｌｔ３、ｃ−Ｋｉｔ、およびＩＬ−７Ｒα）の発現を調節することにより、リンパ球前駆細胞の発達を部分的に制御するように作用する。再早期のＢ細胞前駆体の産生は、転写因子Ｅ２ＡおよびＥＢＦの活性化に依存する。これらの転写因子は、Ｂ細胞遺伝子発現プログラムおよび免疫グロブリン重鎖遺伝子再構成を協調的に活性化して、Ｂリンパ球新生の開始を刺激する。
Ｐａｘ−５は、系列に不適切な遺伝子の転写を抑制すると同時に、Ｂリンパ系シグナル伝達分子の発現を活性化することにより、リンパ球前駆細胞の発達オプションをＢ細胞系列に制限する。Ｂ細胞発達の再早期の間、Ｂ細胞は可塑性を示す。Ｂ細胞の分化では、ＩＬ７が３つの転写因子：Ｅ２Ａ、ＥＢＦ１、およびＰａｘ−５と共に（ＫｉｒｃｈｍａｉｅｒおよびＳｕｇｄｅｎ、１９９７；Ｋｅｎｎｅｄｙら、２００３）重要な役割を果たす。Ｂ細胞の発達の開始時点で、Ｅ２ＡおよびＥＢＦ１がＢリンパ球遺伝子の発現を活性化するが、Ｂ細胞系列へのコミットメントを制御するのはＰａｘ−５である。Ｐａｘ−５は、Ｂ系列に不適切な遺伝子の転写を抑制し、かつＢ細胞に特異的な遺伝子の発現を活性化するという、二重の能力を有する（ＭａｃｋおよびＳｕｇｄｅｎ、２００８；Ｗｅｎｄｔｎｅｒら、２００３）。
細胞がＰａｘ−５を発現すると、プロＢ細胞は、各自の一方向経路に沿って成熟Ｂ細胞に分化すること以外はできなくなる。Ｐａｘ−５ −／−ノックアウトプロＢ細胞は、多能性前駆細胞として振る舞う。なぜなら、このプロＢ細胞は多系列遺伝子を発現して、適切な条件下で大部分の造血系列へとプログラムされることが可能になるからである。
近年、Ｐａｘ−５のダウンレギュレーションと転写因子Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃの強制発現の併用により、成熟Ｂ細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）への転換が行われており、この転換は、成熟細胞からの早期前駆細胞の産生を伴う分化転換プロセスとみなすことができる（Ｄｅｌｅｃｌｕｓｅら、１９９９）。この転換は、ある細胞状態への遷移を伴うプロセスであり、この細胞状態から、幹細胞の再生・維持に関連する遺伝子の再活性化、系列に特異的な転写因子の不完全な抑制、および不完全なエピジェネティックリモデリングが明らかにされる。
コミットされたＣＤ１９＋Ｂ細胞も、骨髄性サイトカインの存在下で、骨髄系転写因子Ｃ／ＥＢＰαのレトロウイルス発現によりマクロファージへと分化転換できる（Ｄｅｌｅｃｌｕｓｅら、１９９８；Ｈｅｔｔｉｃｈら、２００６）。コミットされたＢ細胞からマクロファージへのＣ／ＥＢＰα誘導による転換は、Ｂ細胞とマクロファージの両方に属するマーカーを発現する非生理的な細胞中間体を介して、古典的な分化転換方法で発生する。
Ｐａｘ−５の役割と同様の、Ｂ細胞発達時に遺伝子発現を調節する際に重要な役割を果たす他の転写因子として、Ｂｌｉｍｐ１、Ｏｃｔ２、Ｂｏｂ−１を含むいくつかの転写因子が特定されている。Ｂｌｉｍｐ１は、形質細胞の分化を調節する重要な転写調節因子であり、Ｂ細胞および単球／マクロファージの最終分化に必要な抑制因子である。Ｏｃｔ２は、後期のＢ細胞発達において重要な役割を果たす、Ｂ細胞に特異的な転写因子である。Ｂｏｂ−１は、Ｏｃｔ２とＰａｘ−５のコアクチベーターである（ＢＳＡＰ）。
Ｂ．リンパ芽球様細胞
リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）やＥＢＶ由来エピソームベクター要素などのエピソームベクター要素により、リンパ球（例えば任意の種類のＴ細胞またはＢ細胞）をインビトロで形質転換して樹立できる。エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）による末梢Ｂリンパ球の形質転換は、ＬＣＬの作製方法として特に適している。この方法は過去２０年間に渡って使用され、高い成功率を示している。リンパ芽球様細胞は、体細胞突然変異率が０．３％で、細胞維持が容易であり、患者の遺伝物質を貯蔵するには現在でも好ましい選択肢である。
リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）は、非ＥＢＶエピソームベクターでリンパ球を不死化することでも取得できる。例えば、Ｔ細胞（主としてＣＤ４＋細胞）のマレック病ウイルス（ＭＤＶ）の感染から、リンパ芽球様細胞を樹立できる（Ｐａｒｃｅｌｌら、１９９９）。
Ｃ．不死化細胞のさらなる供給源
生物学者たちは、ヘイフリック限界（ＤＮＡの損傷またはテロメアの短縮のため細胞がそれ以上分裂しなくなること）に制限されない細胞を指す語として、「不死」（ｉｍｍｏｒｔａｌ）を選択した。ヘイフリック限界とは、正常な細胞集団が細胞分裂を停止するまでの分裂回数をいう。細胞分裂が停止するのは、おそらくテロメアが臨界長に達するからだと考えられている。テロメア伸長酵素テロメラーゼを発現することによりアポトーシス（プログラム細胞死）を回避した細胞に対して、不死化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）という用語が適用された。また、正常な幹細胞および生殖細胞も、不死であると言える。
不死の細胞は、癌遺伝子を誘導するか、腫瘍抑制遺伝子を消失させることで作製できる。不死性を誘導する１つの方法は、ウイルスの介在によるラージＴ抗原の誘導であり、一般的にはサル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）を介して導入する。ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＳＶ４０ ＴＡｇ）は、ポリオーマウイルスＳＶ４０に由来する癌遺伝子であり、六量体のタンパク質である。ポリオーマウイルスＳＶ４０は、種々の細胞型を形質転換する能力を有する。
本発明の特定の態様では、エピソームベクター要素により不死化された体細胞が提供され得る。このようなエピソームベクター要素は、上記のようなリンパ球の形質転換のためにＥＢＶ遺伝子を発現し得、あるいは、任意の体細胞の不死化のために導入遺伝子（テロメラーゼなど）もしくは癌遺伝子を発現し得る。
体細胞は、限定されるものではないが、線維芽細胞、造血細胞、間葉細胞、角化細胞、造血細胞、肝細胞、胃細胞、または神経幹細胞を含む、最終分化した細胞または組織幹細胞であり得る。体細胞は、組織細胞バンク、または選択されたヒト被験者、特に生きているヒトから得たものであり得る。これらの体細胞の子孫由来のゲノムは、特定の供給源、例えば、選択されたヒト個人の体細胞に由来するとみなされる。
ＩＩＩ．エピソームベクター要素および除去
ｉＰＳ細胞樹立の成功により、ＥＳ細胞に起因する生命倫理上の問題が回避できるようになる。また、この成功は、免疫学的拒絶反応のない再生医療の実現に向けた大きな一歩である。しかしながら、従来のｉＰＳ細胞作製方法は、レトロウイルスベクターまたは別の類似のベクターであるレンチウイルスベクターを介した遺伝子導入を伴う。このようなウイルスベクターは、宿主細胞の染色体のランダム位置への遺伝子の組み込みを媒介するので、内在性遺伝子の突然変異または内在性癌遺伝子の活性化を引き起こし得る。再生医療において将来ｉＰＳ細胞が使われることを考慮すると、このようなウイルスベクターの使用は、発癌性形質転換、機能障害の発生などのリスクを伴うことになる。したがって、将来のｉＰＳ細胞の利用に向けた極めて重要な開発の１つは、リプログラミング因子を組み込むゲノムなしでｉＰＳ細胞を作製する方法である。
リンパ球などの体細胞を不死化する目的で、ＥＢＶ、またはその変異体を含むエピソームベクター要素が提供され得る。さらなる態様では、リプログラミングの後、ｉＰＳ細胞中のエピソームベクターが除去され得る。
このような特性を有する任意のエピソームベクターを、特定の限定なく本発明の作製方法に使用することができる。具体的には、エピソームベクターの例として、ウイルスをベースとしたエピソームベクター、例えばマウスポリオーマウイルスをベースとしたエピソームベクター（Ｇａｓｓｍａｎｎら、１９９５）；ヒトポリオーマウイルスの一種であるＢＫウイルスをベースとしたエピソームベクター（Ｄｅ ＢｅｎｅｄｅｔｔｉおよびＲｈｏａｄｓ、１９９１）；エプスタイン・バーウイルスをベースとしたエピソームベクター（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅら、１９８８）；およびウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）をベースとしたエピソームベクター（Ｏｈｅら、１９９５）が挙げられる。中でも、ＢＫウイルスをベースとしたエピソームベクターとエプスタイン・バーウイルスをベースとしたエピソームベクターは、ヒト細胞で好適に使われる。
これらのベクターの各々は、対応するウイルスに由来する複製起点（ｏｒｉ）を含む。この複製起点（ｏｒｉ）に「複製因子」が結合することにより、ベクターの複製が誘発される。本明細書で使用される用語「複製因子」は、複製に不可欠の因子であり、ｏｒｉに結合することにより、核酸の複製を誘発する因子をいう。ウイルスをベースとした上記エピソームベクターの各々に対応する「複製因子」は、それぞれ、マウスポリオーマウイルスのラージＴ抗原、ＢＫウイルスのラージＴ抗原、ＥＢＶウイルスのＥＢＮＡ−１、およびＢＰＶのＥ１とＥ２である。
Ｓ／ＭＡＲ（足場／マトリックス付着領域）と呼ばれる塩基配列を含むエピソームベクターも、本発明の作製方法で好適に使用できる。このエピソームベクターは、少なくとも１つのＳ／ＭＡＲと、ウイルスまたは真核生物の少なくとも１つの複製起点（ｏｒｉ）を含む。上述の他のエピソームベクターと異なり、このエピソームベクターは、複製のためのｏｒｉに対応する複製因子は一切不要である。具体的には、このようなエピソームベクターの代表例として、ヒトインターフェロンβ遺伝子上流領域（約２ｋｂ）をＳ／ＭＡＲとして含むエピソームベクターがあり、これについてはＰｉｅｃｈａｃｚｅｋら（１９９９）に記述されている。
加えて、細胞に導入された２種類のアデノウイルスベクターが、細胞内に環状のエピソームベクターを産生する系が知られている（Ｌｅｂｌｏｉｓら、２０００）。この系を使って取得したエピソームベクターも、本発明の作製方法に使用できる。この系はＣｒｅ−ｌｏｘＰ系をベースとしている。より具体的には、この系において、一方のアデノウイルスベクターがＣｒｅを発現し、他方のアデノウイルスベクターは、エピソームベクターとして機能するために必要な遺伝子構築物を格納する。この遺伝子構築物が、ベクターの２つのＬｏｘＰ部位と隣接する領域に挿入される。２つのｌｏｘＰ部位と隣接する領域がＣｒｅにより切除されて、環状ＤＮＡを形成する。２つのｌｏｘＰ部位と隣接する領域が、発現単位に加えて複製起点と複製因子遺伝子（例えば、エプスタイン・バーウイルスの複製起点であるｏｒｉＰ配列と、エプスタイン・バーウイルスの複製因子遺伝子であるＥＢＮＡ−１をコードする遺伝子）も保有するように設計されている場合、形成される環状ＤＮＡは細胞中のエピソームとして維持される。
Ｂ．エピソームベクターの骨格
これらのリプログラミング方法は、染色体外で複製するベクター（すなわちエピソームベクター）を利用することもできる。このベクターは、エピソーム複製して、外来性ベクターまたはウイルス要素を本質的に含まないｉＰＳ細胞を作製できるベクターである（参照することにより本明細書に組み入れられる米国特許公開第２０１００００３７５７号；Ｙｕら、２００９を参照）。アデノウイルス、サル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）、ＥＢＶもしくはウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）、または出芽酵母ＡＲＳ（自己複製配列）含有プラスミドなどの多数のＤＮＡウイルスは、哺乳動物細胞内で染色体外複製またはエピソーム複製する。これらのエピソームプラスミドは、組み込み型ベクターに関連したこれらすべての不都合を元来有さない（Ｂｏｄｅら、２００１）。例えば、上記に定義したＥＢＶ要素を含むリンパ球指向性ヘルペスウイルスをベースとしたベクターは、染色体外で複製し、体細胞へのリプログラミング因子の送達を支援し得る。
例えば、本発明で使用されるプラスミドをベースとするアプローチは、詳細が後述されるように、ＥＢＶ要素をベースとした系の臨床現場での取り扱いやすさを損なうことなく、この系の複製および維持の成功に必要な強い要素を引き出すことができる。必須のＥＢＶ要素は、ＯｒｉＰおよびＥＢＮＡ−１またはその変異体もしくは機能的等価物である。この系のさらなる利点は、これらの外来性要素が、細胞に導入された後で時間の経過とともに消失し、外来性要素を本質的に含まない自己持続性のｉＰＳ細胞をもたらすことである。
プラスミドまたはリポソームをベースとした染色体外ベクター、例えば、ｏｒｉＰをベースとしたベクター、および／またはＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするベクターの使用により、ＤＮＡの大きな断片が細胞に導入され、染色体外に維持され、細胞周期ごとに１回複製され、娘細胞に分割され、そして免疫応答を実質的に誘発しないことが可能となる。特に、ＯｒｉＰをベースとした発現ベクターの複製に必要な唯一のウイルスタンパク質であるＥＢＮＡ−１は、ＭＨＣクラスＩ分子にその抗原の提示を必要とするプロセシングを回避する効率的な機序を発達させたため、細胞性免疫応答を誘発しない（Ｌｅｖｉｔｓｋａｙａら、１９９７）。さらに、ＥＢＮＡ−１は、トランスで作用してクローン化遺伝子の発現を促進することができ、一部の細胞株において最大１００倍のクローン化遺伝子の発現を誘導する（Ｌａｎｇｌｅ−Ｒｏｕａｕｌｔら、１９９８；Ｅｖａｎｓら、１９９７）。最後に、このようなｏｒｉＰをベースとした発現ベクターの製造は低コストである。
他の染色体外ベクターとしては、リンパ球指向性ヘルペスウイルスをベースとした他のベクターが含まれる。リンパ球指向性ヘルペスウイルスは、リンパ芽球（例えば、ヒトＢリンパ芽球）で複製し、そしてその自然の生活環の一部のためにプラスミドになるヘルペスウイルスである。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、「リンパ球指向性」ヘルペスウイルスではない。例示的なリンパ球指向性ヘルペスウイルスには、限定されるものではないが、ＥＢＶ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、リスザルヘルペスウイルス（ＨＶＳ）、およびマレック病ウイルス（ＭＤＶ）が含まれる。また、酵母ＡＲＳ、アデノウイルス、ＳＶ４０、またはＢＰＶなどの、エピソームをベースとしたベクターの他の供給源も企図されている。
ウイルス遺伝子送達の潜在的な問題を回避するために、今年、２つのグループが、ウイルスベクターを用いずにトランスポゾンをベースとしたアプローチでヒト細胞に多能性をもたらすことに成功した共同研究について報告した（Ｗｏｌｔｊｅｎら、２００９；Ｋａｊｉら、２００９）。ウイルス由来２Ａペプチド配列を用いてリプログラミング因子を含むポリシストロニックベクターを作製し、これをｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターにより細胞に送達することによって、安定したｉＰＳ細胞がヒトおよびマウス両方の線維芽細胞で作製された。次いで、樹立したｉＰＳ細胞株には不要の２Ａ連結リプログラミング因子が除去された。本発明の特定の態様では、これらの戦略を体細胞の不死化および／またはリプログラミングに同様に適用し得る。
Ｃ．エプスタイン・バーウイルスをベースとしたベクター要素
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、ヒトヘルペスウイルス４（ＨＨＶ−４）とも呼ばれ、ヒトヘルペスファミリー（単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、およびサイトメガロウイルスを含む）のガンマヘルペスウイルスであり、ヒトにおける最も一般的なウイルスの１つである。
ＥＢＶは、そのゲノムを染色体外に維持し、効率的な複製と維持のために宿主細胞機構と協働し（ＬｉｎｄｎｅｒおよびＳｕｇｄｅｎ、２００７）、細胞分裂時には、細胞内で自身を複製および保持するための２つの必須の特徴にのみ依存する（Ｙａｔｅｓら、１９８５；Ｙａｔｅｓら、１９８４）。一方の要素は、一般にｏｒｉＰと呼ばれ、シスに存在し、複製の起点として機能する。他方の因子であるＥＢＮＡ−１は、ｏｒｉＰ内の配列に結合してプラスミドＤＮＡの複製および維持を促進することによって、トランスで機能する。したがって、ＥＢＮＡ−１タンパク質は、ウイルスのゲノムの維持に不可欠である。
Ｂリンパ球がインビトロでＥＢＶに感染すると、無限に成長可能なリンパ芽球様細胞株が最終的に現れる。この細胞株の増殖形質変換は、ウイルスタンパク質の発現の結果である。本発明の特定の態様では、形質転換のため、ＥＢＶベクターにＥＢＶ遺伝子、例えばＥＢＮＡ−２、ＥＢＮＡ−３Ａ、ＥＢＮＡ−３Ｃ、ＥＢＮＡ−ＬＰ、および／またはＬＭＰ−１が含まれ得る。
１．ＯｒｉＰ
ＯｒｉＰは、ＤＮＡの複製を開始する部位またはその近傍であり、反復ファミリー（ＦＲ）と二分子対称（ＤＳ）として知られる約１キロ塩基対離れた２つのシス作用性配列から構成されている。
ＦＲは、３０塩基対の反復の２１の不完全なコピーから構成され、２０の高親和性ＥＢＮＡ−１結合部位を含む。ＦＲがＥＢＮＡ−１によって結合されると、ＦＲは、最大１０キロ塩基対離れたシスにおけるプロモーターの転写エンハンサーとして機能し（ＲｅｉｓｍａｎおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｙａｔｅｓ、１９８８；ＳｕｇｄｅｎおよびＷａｒｒｅｎ、１９８９；ＷｙｓｏｋｅｎｓｋｉおよびＹａｔｅｓ、１９８９；ＧａｈｎおよびＳｕｇｄｅｎ、１９９５；ＫｅｎｎｅｄｙおよびＳｕｇｄｅｎ、２００３；Ａｌｔｍａｎｎら、２００６）、核の保持およびＦＲを含むプラスミドの忠実な維持に寄与する（Ｌａｎｇｌｅ−Ｒｏｕａｕｌｔら、１９９８；ＫｉｒｃｈｍａｉｅｒおよびＳｕｇｄｅｎ、１９９５；Ｗａｎｇら、２００６；Ｎａｎｂｏら、２００７）。ｏｒｉＰプラスミドの効率的な分割も、ＦＲによる可能性が高い。このウイルスは、ＦＲに２０のＥＢＮＡ−１結合部位を維持するように進化したが、効率的なプラスミドの維持には、これらの部位の７つのみが必要であり、合計１２のＥＢＮＡ−１結合部位を有するように、ＤＳの３つのコピーのポリマーによって再構築することができる（ＷｙｓｏｋｅｎｓｋｉおよびＹａｔｅｓ、１９８９）。
二分子対称要素（ＤＳ）は、ＥＢＮＡ−１の存在下でのＤＮＡ合成の開始に十分であり（Ａｉｙａｒら、１９９８；Ｙａｔｅｓら、２０００）、開始は、ＤＳまたはその近傍で起こる（ＧａｈｎおよびＳｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ、１９８９；Ｎｉｌｌｅｒら、１９９５）。ＦＲは、ＥＢＮＡ−１によって結合されると、２Ｄゲル電気泳動法によって観察されるように複製フォークの障壁として機能するため、ウイルスＤＮＡ合成の停止は、ＦＲで起こると考えられる（ＧａｈｎおよびＳｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ、１９８９；Ｅｒｍａｋｏｖａら、１９９６；Ｗａｎｇら、２００６）。ＤＳからのＤＮＡ合成の開始は、１細胞周期に１回許可され（Ａｄａｍｓ、１９８７；ＹａｔｅｓおよびＧｕａｎ、１９９１）、細胞複製系の成分によって調節される（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉら、２００１；Ｒｉｔｚｉら、２００３；Ｄｈａｒら、２００１；Ｓｃｈｅｐｅｒｓら、２００１；Ｚｈｏｕら、２００５；Ｍｉｅｎら、２００４）。ＤＳは、４つのＥＢＮＡ−１結合部位を含むが、ＲＦで見られるものよりも親和性が低い（Ｒｅｉｓｍａｎら、１９８５）。ＤＳのトポロジーは、４つの結合部位が、二対の部位として配置され、各対間で中心と中心が２１塩基対離隔し、対になっていない２つの内部結合部位間で中心と中心が３３塩基対離隔している（Ｂａｅｒら、１９８４；Ｒａｗｌｉｎｓら、１９８５）。
ＤＳ内の要素の機能的役割は、非効率的にＤＳの代替となることのできる要素として同定された、Ｒｅｐ＊と呼ばれる、ＥＢＶのゲノムの別の領域の研究によって確認された（ＫｉｒｃｈｍａｉｅｒおよびＳｕｇｄｅｎ、１９９８）。Ｒｅｐ＊を８回重合することにより、その複製の支援においてＤＳと同じ効率の要素が産生された（Ｗａｎｇら、２００６）。Ｒｅｐ＊の生化学的な分析により、その複製機能に極めて重要である、中心と中心が２１塩基対離隔した一対のＥＢＮＡ−１結合部位が同定された（上記）。Ｒｅｐ＊の最小のレプリケーターは、ポリマーにおけるすべての隣接配列がラムダファージ由来の配列で置換された後でも、複製機能が維持される一対のＥＢＮＡ１結合部位であることが分かった。ＤＳとＲｅｐ＊の比較により、共通の機構が明らかになった。すなわち、これらのレプリケーターは、ＥＢＮＡ−１によって曲げられて結合される一対の適切な離隔部位を介して細胞内複製機構を動員することによって、ＤＮＡ合成の開始を支援する。
ある点ではＥＢＶのＲａｊｉ株内の開始のゾーンに類似しているように見える、ＥＢＶに関連していない哺乳動物細胞内で複製する他の染色体外プラスミドが存在する。Ｈａｎｓ Ｌｉｐｐｓおよび彼の同僚らは、「核足場／マトリックス付着領域」（Ｓ／ＭＡＲ）および強い転写単位（Ｐｉｅｃｈａｃｚｅｋら、１９９９；Ｊｅｎｋｅら、２００４）を含むプラスミドを開発し研究した。このＳ／ＭＡＲは、ヒトインターフェロン−β遺伝子に由来し、Ａ／Ｔリッチであり、核マトリックスとのその関連と、低いイオン強度での、またはスーパーコイル状ＤＮＡに埋め込まれた時のその優先的な巻き戻しによって機能的に定義される（Ｂｏｄｅら、１９９２）。これらのプラスミドは、半保存的に複製し、複製開始点認識複合体（ＯＲＣ）タンパク質に結合し、かつそのＤＮＡ全体での効率的かつランダムなＤＮＡ合成の開始を支援する（Ｓｃｈａａｒｓｃｈｍｉｄｔら、２００４）。これらのプラスミドは、薬剤選択なしでも増殖中のハムスター細胞およびヒト細胞内で効率的に維持され、ブタ胎仔に導入されると動物胎仔のほとんどの組織におけるＧＦＰの発現を支援することができる（Ｍａｎｚｉｎｉら、２００６）。
２．ＥＢＮＡ−１
エプスタインバー核抗原１（ＥＢＮＡ−１）は、複製因子として、ｏｒｉＰまたはＲｅｐ＊のＦＲおよびＤＳに結合して、各細胞分裂中の細胞染色体と協調するが独立して、娘細胞へのＥＢＶプラスミドの複製および忠実な分割を促進するＤＮＡ結合タンパク質である。
ＥＢＮＡ−１の６４１のアミノ酸（ＡＡ）が、突然変異および欠失分析によって、その様々な機能に関連したドメインに分類された。ＡＡ４０〜８９とＡＡ３２９〜３７８との間の２つの領域は、ＥＢＮＡ−１によって結合されるとシスまたはトランスにおける２つのＤＮＡ要素を連結することができ、このため連結領域１および２（ＬＲ１、ＬＲ２）と命名された（ＭｉｄｄｌｅｔｏｎおよびＳｕｇｄｅｎ、１９９２；ＦｒａｐｐｉｅｒおよびＯ’Ｄｏｎｎｅｌｌ、１９９１；Ｓｕら、１９９１；Ｍａｃｋｅｙら、１９９５）。ＥＢＮＡ−１のこれらのドメインとＧＦＰとの融合により、ＧＦＰが有糸分裂染色体に戻る（Ｍａｒｅｃｈａｌら、１９９９；Ｋａｎｄａら、２００１）。ＬＲ１およびＬＲ２は、複製のために機能的に重複しており、いずれか一方が欠損すると、ＤＮＡの複製を支持できるＥＢＮＡ−１の誘導体が生じる（ＭａｃｋｅｙおよびＳｕｇｄｅｎ、１９９９；Ｓｅａｒｓら、２００４）。ＬＲ１およびＬＲ２は、アルギニンおよびグリシン残基が豊富であり、Ａ／ＴリッチＤＮＡに結合するＡＴフックモチーフに類似している（ＡｒａｖｉｎｄおよびＬａｎｄｓｍａｎ、１９９８）、（Ｓｅａｒｓら、２００４）。ＥＢＮＡ−１のＬＲ１およびＬＲ２のインビトロでの分析は、Ａ／ＴリッチＤＮＡに結合するそれらの能力を実証した（Ｓｅａｒｓら、２００４）。１つのこのようなＡＴフックを含むＬＲ１が、ＥＢＮＡ−１のＤＮＡ結合および二量体化ドメインに融合されると、このＬＲ１は、野生型ＥＢＮＡ−１よりも効率は低いが、ｏｒｉＰプラスミドのＤＮＡ複製には十分であることが分かった（上記）。
本発明の特定の実施形態では、エピソームベクターは、ｏｒｉＰと、細胞分裂の際のプラスミドの複製およびその適切な維持を支持する能力を持つあるバージョンのＥＢＮＡ−１の両方を含み得る。野生型ＥＮＢＮＡ−１のアミノ末端の３分の１以内の反復性の高い配列および様々な細胞で毒性を実証した２５のアミノ酸領域は、ｏｒｉＰに関連したＥＢＮＡ−１のトランス作用機能に必要ではない（Ｙａｔｅｓら、１９８５；Ｋｅｎｎｅｄｙら、２００３）。したがって、δＵＲ１として知られる例示的な誘導体である、短縮型のＥＢＮＡ−１は、このプラスミドをベースとした系内のｏｒｉＰと共に使用され得る。染色体外の鋳型からの転写を活性化できるＥＢＮＡ−１誘導体のさらなる例が公知である（例えば、参照することにより本明細書に組み入れられるＫｉｒｃｈｍａｉｅｒおよびＳｕｇｄｅｎ、１９９７ならびにＫｅｎｎｅｄｙおよびＳｕｇｄｅｎ、２００３を参照）。
本発明に使用されるＥＢＮＡ−１の誘導体は、対応する野生型ポリペプチドに対して改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。この改変には、ＥＢＮＡ−１におけるＬＲ１（残基約４０〜約８９）の固有領域（残基約６５〜約８９）に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸の欠失、挿入、置換が含まれ、そして、得られた誘導体が望ましい特性を有する限り、例えば、ｏｒｉＰに対応するｏｒｉを含むＤＮＡを二量体化し結合する、核に局在する、非細胞毒性である、染色体外ベクターからの転写は活性化するが組み込まれた鋳型からの転写は実質的に活性化しない、などの特性を有する場合に限り、ＥＢＮＡ−１の他の残基、例えば、残基約１〜約４０、残基約９０〜約３２８（「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ」反復領域）、残基約３２９〜約３７７（ＬＲ２）、残基約３７９〜約３８６（ＮＬＳ）、残基約４５１〜約６０８（ＤＮＡ結合および二量体化）、または残基約６０９〜約６４１に対応する領域における１つ以上のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換が含まれ得る。置換には、Ｌ型ではなくＤ型、ならびに他の周知のアミノ酸類似体、例えば、α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、および乳酸などの非天然アミノ酸などを利用する置換が含まれる。
３．他のＥＢＶ遺伝子
本発明の特定の態様では、エピソームベクター要素は１つ以上の形質転換遺伝子、例えば、ＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−２、ＥＢＮＡ−３Ａ、ＥＢＮＡ−３Ｃ、ＥＢＮＡ−ＬＰ、またはＬＭＰ−１などのＥＢＶ由来の形質転換遺伝子を含み得る。
インビトロでのＥＢＶの感染により、B初代ヒト細胞が、連続的に増殖するリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）に転換される。ＥＢＶに形質転換されたＬＣＬにおいて、ＥＢＶは、６つの核タンパク質［ＥＢＶ核抗原（ＥＢＮＡ）であるＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−２、ＥＢＮＡ−３Ａ、ＥＢＮＡ−３Ｂ、ＥＢＮＡ−３Ｃ、およびＥＢＮＡ−ＬＰ］、３つの内在性膜タンパク質（ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２Ａ、およびＬＭＰ−２Ｂ）、２つの小型の非ポリアデニル化ＲＮＡ（ＥＢＥＲ１およびＥＢＥＲ２）、ならびにＢａｍＡ右方向転写物を発現する。逆遺伝子実験により、これらのウイルス潜伏タンパク質のうち６つ、すなわちＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−２、ＥＢＮＡ−３Ａ、ＥＢＮＡ−３Ｃ、ＥＢＮＡ−ＬＰ、およびＬＭＰ−１が形質転換表現型に必要であることが示された。本発明の特定の態様において、形質転換用ＥＢＶベクターは、これらのＥＢＶ形質転換遺伝子の１つ以上を含み得る。
ＥＢＶ核抗原２（ＥＢＮＡ−２）は、エプスタイン・バーウイルスに関連するウイルスタンパク質である。ＥＢＮＡ−２がメインのウイルストランス活性化因子であり、感染後最初に使われるＷｐプロモーターからＣｐプロモーターへと転写を切り替える。ＬＭＰ−１およびＬＭＰ−２Ａ／２Ｂのプロモーターは、Ｂ細胞においてＥＢＮＡ−２に活性化される（Ｚｉｍｂｅｒ−Ｓｔｒｏｂｌら、１９９１）。ＥＢＮＡ−２は、Ｎｏｔｃｈ経路において重要な存在である宿主ＲＢＰ−Ｊκタンパク質と結合することが知られている。ｃ−Ｍｙｃ遺伝子の発現は、ＥＢＮＡ−２が介在する転写開始亢進により誘導されるものであり、ＥＢＮＡ−２は、ＥＢＶが介在する増殖形質転換に不可欠である。
ＥＢＮＡ−３Ａ、ＥＢＮＡ−３Ｂ、およびＥＢＮＡ−３Ｃは、ＥＢＶゲノムにおいて縦に配列され、類似構造の遺伝子にコードされる。このことから、ＥＢＮＡ−３遺伝子は、祖先遺伝子の縦の三重重複から生じた可能性があると提唱されている。ＥＢＮＡ−３Ａ、ＥＢＮＡ−３Ｂ、およびＥＢＮＡ−３ＣのＮ末端アミノ酸が、配列特異的なＤＮＡ結合タンパク質であるＲＢＰ−Ｊκとの相互作用を介在する。組み換えＥＢＶを用いた逆遺伝子実験では、ＥＢＶの介在により初代Ｂ細胞をＬＣＬに転換するにはＥＢＮＡ−３ＡとＥＢＮＡ−３Ｃが必須であるが、ＥＢＮＡ−３Ｂは必須ではないことが示されている。ＥＢＮＡ−３Ｃは、Ｒｂ（Ｐａｒｋｅｒら、１９９６）、サイクリンＡ（ＫｎｉｇｈｔおよびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ、２００４）を含む細胞周期タンパク質と結合して、これらのタンパク質を調節する。
潜伏膜タンパク質１（ＬＭＰ−１）は、Ｂ細胞の形質転換に必須のウイルス遺伝子産物の１つであり、ＬＣＬの増殖に不可欠であり（Ｋｉｌｇｅｒら、１９９８）、抗アポトーシス性、すなわちＮＦ−κΒ経路の活性化を通じた抗アポトーシス性を示す（Ｃａｈｉｒ−ＭｃＦａｒｌａｎｄら、２０００および２００４）。ＬＭＰ−１は、短い細胞質アミノ末端ドメイン、６つの疎水性膜貫通ドメイン、および細胞質カルボキシ末端ドメインから構成される内在性膜タンパク質である。ＬＭＰ−１は、腫瘍壊死因子受容体ファミリーのメンバーである活性化ＣＤ４０を模倣する、構成的に活性化した受容体の働きをすることが実証されている。ＬＭＰ−１の細胞質カルボキシ末端は、腫瘍壊死因子受容体関連因子（ＴＲＡＦ）および腫瘍壊死因子受容体関連デスドメイン（ＴＲＡＤＤ）タンパク質と結合することにより、ＥＢＶに誘導されるＢ細胞の形質転換において重要な役割を果たす。
ＬＭＰ−１（ＢＮＬＦ１）遺伝子は、ＥＢＶゲノムのＢａｍＨＩ−Ｎ領域内に位置する３つのエクソンを含む。ヌクレオチド配列、およびＢ９５−８株ＥＢＶのｍＲＮＡマッピングを基に、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が特定されている。第１エクソンの上流にＥＤ−Ｌ１プロモーターが位置し、このプロモーターから開始する転写物が第１のＯＲＦをコードする。このＯＲＦは、リンパ芽球様細胞株に大量発現する完全長ＬＭＰ−１（３８６アミノ酸）をコードする。ＬＭＰ−１遺伝子の第１イントロン内にＥＤ−Ｌ１Ａプロモーターが位置し、このプロモーターから開始する別の転写物が第２のＯＲＦをコードする。この第２のＯＲＦの翻訳開始点は完全長ＬＭＰ−１のメチオニン−１２９であり、よってこのＯＲＦは、ＬＭＰ−１タンパク質のアミノ末端切断型をコードする。切断されたＬＭＰ−１（２５８アミノ酸）は、完全長ＬＭＰ−１の第５および第６膜貫通ドメインと細胞質カルボキシ末端からなり、Ｂ細胞の溶解感染および再活性化時に発現する（Ｈｕｄｓｏｎら、１９８５）。
ＥＢＶ核抗原リーダータンパク質（ＥＢＮＡ−ＬＰ、またはＥＢＮＡ−４）は、ＥＢＶ誘導によるＢ細胞の形質転換で重要な役割を果たす。このタンパク質は、初代Ｂ細胞がＥＢＶに感染した後で最初に発現するＥＢＶ潜伏タンパク質の１つである。このことは、このタンパク質が細胞活性化に必要であり、その間の細胞周期進行にとって重要であることを示唆している。この主張を裏付けるさらなる証拠は、ＥＢＮＡ−ＬＰがＥＢＮＡ−２と共同でサイクリンＤ２の転写を活性化し（Ｓｉｎｃｌａｉｒら、１９９４）、また、ＬＭＰ−１を含むウイルスタンパク質を同時活性化する（ＨａｒａｄａおよびＫｉｅｆｆ、１９９７）ことである。
Ｄ．さらなるエピソームベクター要素
特定の態様では、本発明のエピソームベクターは、核リプログラミング因子をコードする遺伝子用、および／または複製因子をコードする遺伝子用の発現カセットを含む。この発現単位に使用されるプロモーターは、哺乳類細胞に使われる任意のプロモーターでよく、例として、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、βアクチンプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫプロモーター、およびＭｕＬＶ ＬＴＲプロモーターが挙げられる。このようなプロモーターの下流に、発現させる遺伝子（ＤＮＡ）を挿入することにより、遺伝子産物の発現が細胞内で達成される。ＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）を使用することにより、１つのプロモーターの制御下で複数の遺伝子を発現できる。使用するＩＲＥＳは特に限定されず、例えばヒトＨＣＶ由来ＩＲＥＳ、ピコルナウイルス由来ＩＲＥＳなどを使用できる。
さらなる態様では、エピソームベクター内の発現カセットは、外部的に制御可能な１つ以上のプロモーターの制御下に置かれてよい。特定の態様では、不死化の後にリプログラミング因子を発現させるようにリプログラミング発現カセットを誘導し得る。例えば、複製因子発現カセットを誘導して、不死化またはリプログラミングのための不死化遺伝子またはリプログラミング因子を含むエピソームベクター要素を複製してから、この発現カセットをオフにして、後でエピソームベクター要素を除去することにより、複製を禁止できる。エピソームベクターが複製因子のドミナントネガティブ変異体を含み、この変異体がエピソームベクターの複製に干渉することにより、最終的にエピソームベクターが宿主細胞から消失するようにしてもよい。エピソームベクターが自殺因子を含み、エピソームベクターを保持する細胞を死滅させるように、自殺因子が誘導されてもよい。
エピソームベクターが導入された細胞を単離もしくは濃縮するため、または後でベクターを除去するために、エピソームベクターにマーカー遺伝子を保有させることができる。エピソームベクターが導入された細胞を選択する目的で使用できるのであれば、マーカー遺伝子は特に限定されないが、薬剤耐性遺伝子が好適に使用される。細胞選択に使われる薬剤の例として、ネオマイシン（ジェネテシン（Ｇ４１８））、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）、およびブラストサイジンが挙げられる。
Ｅ．ベクターの消失または除去
特定の実施形態では、本方法は、エピソームベクター要素を消失した細胞を選択または濃縮するステップをさらに含み得る。例えば、ベクターを含む細胞の選択がなければ、ベクター要素は徐々に子孫細胞から消失すると考えられる。また、この選択は、マーカー遺伝子の発現に基づく選択または濃縮を含み得る。
さらなる実施形態では、本方法は、ベクター除去ステップを含み得る。ベクター除去ステップとは、ｉＰＳ細胞からエピソームベクターを除去することである。ベクター除去ステップは不要であり得る。その理由は、導入されたエピソームベクターの複製物は細胞増殖中にｉＰＳ細胞から次第に減少し、よってｉＰＳ細胞集団からエピソームベクターが除去されることになるからである。しかし、エピソームベクターがｉＰＳ細胞に残っていると、細胞の未分化状態が不安定となり得、または逆に、細胞が分化能力を失うことがあり得る。したがって、ベクター除去ステップを実施することが好ましい。さらに、エピソームベクターが長期間残っている場合、外来遺伝子が自然に染色体に組み込まれる可能性があり、結果として、レトロウイルスが介在する遺伝子組み込みに見られる問題と同様の問題が生じることになる。したがって、この場合も、外来遺伝子が自然に染色体に組み込まれる可能性を低減する目的で、ベクター除去ステップを実施することが好ましい。これにより、細胞の発癌性形質転換およびその後の細胞機能障害のリスクが低減される。エピソームベクターを排除する方法は特に限定されず、以下に非限定的な方法を示す。
１．限界希釈法によるクローニング
上記の通り、エピソームベクターの存在は、時間が経過するにつれて細胞分裂とともに自然に減少する。細胞分裂を可能にするように培養を継続し、限界希釈法を利用して単一クローンを選択することにより、エピソームベクターを含まずｉＰＳ細胞だけからなる集団を取得することができる。
２．レトロウイルスプロモーターの使用
レトロウイルスプロモーターは、未分化細胞において遺伝子発現を駆動しないことか多いが（Ｇｏｒｍａｎら、１９８５）、このようなプロモーターからの残存遺伝子発現（ｒｅｓｉｄｕａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が報告されている（Ｙｕら、２００９）。多くの報告で、レトロウイルスベクターは未分化細胞内で不活化することが示されている（例えば、Ｐａｎｎｅｌｌら、２０００）。したがって、例えば、テトラウイルスプロモーターの下流で複製因子をコードする遺伝子を保有するエピソームベクターを使用すれば、体細胞からｉＰＳ細胞へのリプログラミングの後、複製因子の発現が停止するか大幅に制限される。その結果、このようなエピソームベクターは複製能力を失い、ベクターを含まずｉＰＳ細胞だけからなる集団が徐々に形成される。レトロウイルスプロモーターの下流に連結される遺伝子は、複製因子をコードする遺伝子に限定されず、核リプログラミング因子をコードする遺伝子であり得るが、ベクター複製抑制の観点から言えば、複製因子をコードする遺伝子が好ましい。
３．薬剤調節遺伝子発現系の使用
特定薬剤の有無の間で培地条件を切り替えることにより、標的遺伝子産物の発現を調節することができる。この系を利用して、特定の薬剤を培地に加えることにより複製因子の発現が停止するようにした場合、複製因子の発現が阻害され、エピソームベクターが複製能力を失い、その後、エピソームベクターを含まずｉＰＳ細胞だけからなる集団が徐々に形成される。薬剤調節遺伝子発現系に用いる薬剤は特に限定されず、このような系の実現を支援できる限り、どの薬剤も好適に使用される。
非限定的な例として、公知の系であるＴｅｔ−Ｏｆｆシステムがある。Ｔｅｔ−Ｏｆｆシステムでは、複製因子をコードする遺伝子を保有しているエピソームベクターを、テトラサイクリン（またはその好適な類似体）を培地に加えると複製因子の発現が停止するように設計することができる。具体的には、例えば、例において使用する一次ベクターを改変して、ＣＭＶプロモーターの制御下でｔＴＡ（ｔｅｔ調節性転写活性化因子）を発現させ、かつｔＴＡ調節性ｔｅｔＯ（Ｔｅｔオペレーター配列）プロモーターの下流で複製因子（ラージＴ抗原）をコードする遺伝子を保有させることができる。このベクターの複製起点（ｏｒｉ）およびネオマイシン耐性遺伝子は不変である。このようなエピソームベクターを利用した場合、ｉＰＳ細胞選択の後で培地にテトラサイクリンを加えることにより、複製因子の発現が阻害され、エピソームベクターが複製能力を失い、その後、エピソームベクターを含まずｉＰＳ細胞だけからなる集団が徐々に形成される。
Ｔｅｔ−Ｏｎシステムを利用することも可能である。Ｔｅｔ−Ｏｎシステムは、Ｔｅｔ−Ｏｆｆシステムとは逆の方法で調節される。すわなち、培地からテトラサイクリンを除去すると、複製因子の発現が停止する。Ｔｅｔ−Ｏｎシステムを利用する場合は、ｉＰＳ細胞が形成されるまではテトラサイクリンを含む培地を使用し、ｉＰＳ細胞が形成された時点で、テトラサイクリンを含まない培地と交換すべきである。Ｔｅｔ−ＯｆｆシステムとＴｅｔ−Ｏｎシステムはクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から市販されている。
また、類似の薬剤調節性戦略を、自殺遺伝子、ドミナントネガティブ変異体、または、エピソームベクターからエピソーム除去する他の媒介物の条件的発現にも適用し得る。
４．ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼの使用
複製因子をコードする遺伝子および／または核リプログラミング因子をコードする遺伝子を保有するだけでなく、ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子を保有するように、エピソームベクターを作製する。この場合、ｉＰＳ細胞選択の後に培地にガンシクロビルまたはアシクロビルを加えることにより、エピソームベクター消失のためチミジンキナーゼの発現を停止するｉＰＳ細胞が選択的に残存するようになる。よって、エピソームベクターを含まずｉＰＳ細胞だけからなる集団を取得することができる。
ＩＶ．細胞のリプログラミング
本発明のある態様では、不死化体細胞をリプログラミングすることにより、ｉＰＳ細胞を作製することができる。リプログラミングには、１つ以上の内因性リプログラミング因子の発現を増加させること、或いは、核酸又はタンパク質の形で１つ以上のリプログラミング因子を導入することが含まれ得る。別の態様では、小分子などのシグナル調節因子を用いてリプログラミングの効率を高めることができる。また、フィーダーフリー条件などの培養条件もリプログラミングの促進に用いることができる。
Ａ．リプログラミング因子
ｉＰＳ細胞の生成は、リプログラミング因子の使用によって決定される。以下の因子又はそれらの組合せは、本発明に開示される方法において用いることができる。ある態様では、Ｓｏｘ及びＯｃｔ（好適にはＯｃｔ３／４）をコードする核酸が、リプログラミングベクターに組み入れられる。例えば、１つ以上のリプログラミングベクターは、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及び必要に応じてＬｉｎ２８をコードする発現カセット、又はＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、及び必要に応じてｃ−Ｍｙｃをコードする発現カセット、又はＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、及び必要に応じてＥｓｒｒｂをコードする発現カセット、又はＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、及び必要に応じてＳＶ４０ラージＴ抗原をコードする発現カセットを含み得る。これらのリプログラミング因子をコードする核酸は、同じ発現カセット、異なる発現カセット、同じリプログラミングベクター、又は異なるリプログラミングベクターの中に含まれ得る。
Ｏｃｔ４及びＳｏｘ遺伝子ファミリーのいくつかのメンバー（Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、及びＳｏｘ１５）は、誘導プロセスに関与する重要な転写調節因子として同定され、これらが存在しなければ誘導ができない。一方、Ｋｌｆファミリーのいくつかのメンバー（Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、及びＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（ｃ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、及びＮ−Ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８を含む別の遺伝子は、誘導効率を上げるものとして同定されている。
Ｏｃｔ４（Ｐｏｕ５ｆｌ）は、八量体（「Ｏｃｔ」）転写因子のファミリーの１つであり、多能性の維持において重要な役割を果たす。割球及び胚性幹細胞などのＯｃｔ４＋細胞にＯｃｔ４が存在しない場合、自然に栄養膜細胞への分化が起きるため、Ｏｃｔ４の存在により胚性幹細胞の多能性及び分化能がもたらされている。Ｏｃｔ４の類縁体、Ｏｃｔ１、及びＯｃｔ６を含む、「Ｏｃｔ」ファミリーの他の様々な遺伝子は、誘導を引き起こすことができず、これにより誘導プロセスに対するＯｃｔ４の特殊性が示されている。
Ｓｏｘファミリーの遺伝子は、Ｏｃｔ４と同様に多能性の維持に関連しているが、多能性幹細胞のみに発現されるＯｃｔ４とは対照的に、多能性及び単能性の幹細胞に関連している。Ｓｏｘ２は、Ｙａｍａｎａｋａら、Ｊａｅｎｉｓｃｈら、及びＴｈｏｍｐｓｏｎらによって導入に用いられた初期の遺伝子であるが、Ｓｏｘファミリーの他の遺伝子も、誘導プロセスで機能することが見出されている。Ｓｏｘ１は、Ｓｏｘ２と同様の効率でｉＰＳ細胞を産生し、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、及びＳｏｘ１８遺伝子も、低効率であるがｉＰＳ細胞を発生させる。
胚性幹細胞では、Ｎａｎｏｇは、Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２と共に、多能性の促進に必要である。そのため、Ｎａｎｏｇを因子の１つとしてｉＰＳ細胞の作製が可能であるとＴｈｏｍｓｏｎらが報告していたが、ｉＰＳ細胞の作製にＮａｎｏｇは不要であるというＹａｍａｎａｋａらの報告は驚くべきものであった。
Ｌｉｎ２８は、分化及び増殖に関連して胚性幹細胞及び胚性癌細胞で発現されるｍＲＮＡ結合タンパク質である。Ｔｈｏｍｓｏｎらにより、Ｌｉｎ２８はｉＰＳ作製における因子の１つであるが、不要であることが示されている。
Ｋｌｆファミリーの遺伝子のうちのＫｌｆ４は、Ｙａｍａｎａｋａらによって最初に同定され、ＪａｅｎｉｓｃｈらによってマウスｉＰＳ細胞の作製の因子の１つとして確認され、また、ＹａｍａｎａｋａらによってヒトｉＰＳ細胞の作製の因子の１つであることが示されている。しかし、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらは、Ｋｌｆ４はヒトｉＰＳ細胞の作製に不要であり、実際にヒトｉＰＳ細胞は作製できなかったと報告している。Ｋｌｆ２及びＫｌｆ４は、ｉＰＳ細胞を作製することが可能な因子であることが見出され、関連遺伝子Ｋｌｆ１及びＫｌｆ５も、低効率であるが同様である。
Ｍｙｃファミリーの遺伝子は、癌に関与するプロト癌遺伝子である。Ｙａｍａｎａｋａら及びＪａｅｎｉｓｃｈらにより、ｃ−ＭｙｃはマウスｉＰＳ細胞の作製に関与する因子であることが示され、また、Ｙａｍａｎａｋａらにより、ｃ−ＭｙｃがヒトｉＰＳ細胞の作製に関与する因子であることが示されている。しかし、Ｔｈｏｍｓｏｎら及びＹａｍａｎａｋａらにより、ｃ−ＭｙｃはヒトｉＰＳ細胞の作製に不要であることが報告されている。ｉＰＳ細胞の誘導における「Ｍｙｃ」ファミリーの遺伝子の使用については、ｃ−Ｍｙｃ誘導ｉＰＳ細胞を移植したマウスの２５％で致死的な奇形腫を発症しており、臨床治療としてはｉＰＳ細胞の最終的結果に問題がある。Ｎ−Ｍｙｃ及びＬ−ＭｙｃもｉＰＳ細胞の作製に寄与することができ、ｃ−Ｍｙｃと同様の効率が得られる。ＳＶ４０ラージＴ抗原は、ｃ−Ｍｙｃが発現された際に起こり得る細胞傷害性を軽減又は防止するために用いることができる。
本発明において使用されるリプログラミングタンパク質は、ほぼ同じリプログラミング機能をもつ相同タンパク質で置き換えることができる。これらの相同体をコードする核酸も、リプログラミングに用いることができる。保存的アミノ酸置換が好ましく、すなわち、例えば以下が挙げられる：極性酸性アミノ酸としてアスパラギン酸−グルタミン酸；非極性又は疎水性アミノ酸としてロイシン／イソロイシン／メチオニン／バリン／アラニン／グリシン／プロリン；極性塩基性アミノ酸としてリジン／アルギニン／ヒスチジン；極性又は非荷電親水性アミノ酸としてセリン／スレオニン。保存的アミノ酸置換には、側鎖に基づく分類も含まれる。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリン及びスレオニンであり；含アミド側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり；含硫黄側鎖を有するアミノ酸群は、システイン及びメチオニンである。例えば、ロイシンのイソロイシン又はバリンによる置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による置換、スレオニンのセリンによる置換、又は、同様にあるアミノ酸の構造的に関連したアミノ酸による置換は、得られるポリペプチドの特性に大きな影響を与えないと考えられる。アミノ酸の変化により機能性ポリペプチドが生じるかどうかは、ポリペプチドの比活性度を測定することで容易に決定することができる。
Ｂ．リプログラミングシグナル伝達阻害剤
本発明のある態様では、細胞は、リプログラミングプロセスの少なくとも一部の間で、シグナル伝達カスケードに関与するシグナル伝達物質を阻害する１つ以上のシグナル伝達阻害剤の存在下、例えば、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ−３阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＧＳＫ−３阻害剤の両方、ＧＳＫ−３阻害剤及びＴＧＦ−β受容体阻害剤の両方、ＭＥＫ阻害剤及びＴＧＦ−β受容体阻害剤の両方、これら３つの阻害剤すべての組み合わせ、又は、これらと同じ経路内の他のシグナル伝達物質の阻害剤の存在下に維持される場合がある。ある態様では、ＨＡ−１００若しくはＨ−１１５２などのＲＯＣＫ阻害剤、又はブレビスタチンなどのミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼ阻害剤を用いて、リプログラミングした細胞及び得られるｉＰＳ細胞のクローン増殖を促進することができる。
高濃度のＦＧＦを、ヒトＥＳ細胞条件培地又は無血清合成Ｎ２Ｂ２７培地などの特定のリプログラミング培地と組み合わせて用いることで、リプログラミング効率を高めることができる。本発明において用いられる、外部から加えるＦＧＦ、シグナル伝達阻害剤、又は他の薬品（β−メルカプトエタノールなど）の量は、少なくとも、およそ、又は最大で、０．１、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも、およそ、又は最大で、０．０５、０．１、０．２、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００μΜ、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＭ、若しくはその中から得られる任意の範囲、又はエピソーム性リプログラミングを向上するのに有効な濃度であってよい。特定の実施形態では、高濃度のＦＧＦを用いてもよく、例えば約４０〜２００ｎｇ／ｍＬであり、より具体的には約１００ｎｇ／ｍＬである。シグナル伝達阻害剤を用いた細胞のリプログラミングの方法に関する更なる詳細は、米国特許出願第６１，２５８，１２０号に開示されており、参照により本明細書に取り込まれる。
ある実施形態では、エピソームベクターの成分により１つ以上のリプログラミング因子（例えば、本明細書に記載するように、２つ、３つ、又はそれ以上）を細胞に導入することに加えて、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、ＧＳＫ−３阻害剤、及び必要に応じて白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含むリプログラミング培地によって、細胞を処理する。これらの分子を用いることで、リプログラミングの効率及び速度を向上することができ、これによりリプログラミングの初代培養におけるｉＰＳ細胞の確認が容易になり、したがってｉＰＳ細胞のクローン性を維持できる。
これらの態様及び実施形態では、同じシグナル伝達経路（例えばＥＲＫ１又はＥＲＫ２カスケード）のシグナル伝達成分を阻害する他のシグナル伝達阻害剤は、必要に応じて、ＭＥＫ阻害剤の代替となり得ることが理解される。これは、ＭＡＰＫ経路の上流の刺激の阻害、具体的にはＦＧＦ受容体を介した阻害（Ying, 2008）を含み得る。同様に、ＧＳＫ−３阻害剤は、必要に応じて、ＧＳＫ−３関連シグナル伝達経路（例えば、インスリン合成及びＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達）の他の阻害剤を代替することができる；ＬＩＦは、必要に応じて、Ｓｔａｔ３又はｇｐ１３０シグナル伝達の他の活性化因子の代替となり得る。
このようなシグナル伝達阻害剤、例えばＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ−３阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤は、少なくとも、又はおよそ、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、５００から約１０００μΜ、又はその中から得られる任意の範囲の有効濃度で用いることができる。
阻害剤は、当業者によって常法により得ることができ、又は一般的な供給者から提供され得る（国際公開第２００７１１３５０５号も参照）。
１．グリコーゲン合成酵素キナーゼ３阻害剤
グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ−３）は、特定の細胞基質中でセリン及びスレオニンアミノ酸へのリン酸分子の付加を媒介するセリン／スレオニンタンパク質キナーゼである。ＧＳＫ−３によるこれらのその他のタンパク質のリン酸化は、通常、標的タンパク質（「基質」とも呼ばれる）を阻害する。すでに述べたように、ＧＳＫ−３はグリコーゲン合成酵素をリン酸化し、それにより不活性化することで知られている。また、損傷したＤＮＡ及びＷｎｔのシグナル伝達に対する細胞応答の調節にも関与している。また、ＧＳＫ−３は、ヘッジホッグ（Ｈｈ）経路のＣｉをリン酸化し、それを不活性型へのタンパク質分解の標的とする。グリコーゲン合成酵素に加えて、ＧＳＫ−３はほかにも多くの基質を有する。しかし、通常、基質を最初にリン酸化するには「プライミングキナーゼ」を必要とし、この点で他のキナーゼ類とは異なっている。
通常、ＧＳＫ−３のリン酸化の結果、基質が阻害される。例えば、ＧＳＫ−３が、その基質の別のものである転写因子のＮＦＡＴファミリーをリン酸化すると、これらの転写因子は細胞核へ移行できなくなり、そのため阻害される。ＧＳＫ−３は、発生の過程での組織パターン形成の確立に必要なＷｎｔシグナル伝達経路における重要な役割に加えて、骨格筋肥大などの調節において誘導されるタンパク質合成に関しても重要である。また、ＮＦＡＴキナーゼとしての役割から、分化及び細胞増殖の両方における重要な制御因子としても位置付けられる。
ＧＳＫ−３の阻害とは、１つ以上のＧＳＫ−３酵素の阻害ということができる。ＧＳＫ−３酵素ファミリーはよく知られており、多くの変異体が報告されている（Schaffer et al., 2003参照）。特定の実施形態では、ＧＳＫ３−βが阻害される。ＧＳＫ３−α阻害剤も適合しており、ある態様では、本発明において用いられる阻害剤は、ＧＳＫ３−αとＧＳＫ３−βの両方を阻害する。
ＧＳＫ−３の阻害剤には、ＧＳＫ３に結合する抗体、ＧＳＫ３の優性阻害変異体、並びに、ＧＳＫ３を標的とするｓｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸が含まれる。ＧＳＫ−３阻害剤の例は、Bennett et al., (2002)及びRing et al., (2003)に記載されている。
ＧＳＫ−３阻害剤の具体的な例としては、これらに限定されないが、ケンパウロン、ｌ−アザケンパウロン、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＲ−Ａ０１４４１８（例えば、Gould et al., 2004を参照）、ＣＴ９９０２１（例えば、Wagman, 2004を参照）、ＣＴ２００２６（上記Wagmanを参照）、ＳＢ４１５２８６、ＳＢ２１６７６３（例えば、Martinet al., 2005を参照）、ＡＲ−Ａ０１４４１８（例えば、Noble et al., 2005を参照）、リチウム（例えば、Gould et al.,2003を参照）、ＳＢ４１５２８６（例えば、Frame et al., 2001を参照）、及びＴＤＺＤ−８（例えば、Chin et al., 2005を参照）などが含まれる。Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手可能な更なる例示的なＧＳＫ−３阻害剤としては（例えば、Daltonet al.、国際公開第２００８／０９４５９７号を参照；参照により本明細書に取り込まれる）、これらに限定されないが、ＢＩＯ（２’Ｚ，３’Ｌ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＧＳＫ−３阻害剤ＩＸ）；ＢＩＯ−アセトキシム（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム（ＧＳＫ−３阻害剤Ｘ）；（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−（２−フェニルキナゾリン−４−イル）アミン（ＧＳＫ−３阻害剤ＸＩＩＩ）；ピリドカルバゾール−シクロペンタジエニルルテニウム複合体（ＧＳＫ−３阻害剤ＸＶ）；ＴＤＺＤ−８ ４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン（ＧＳＫ−３β阻害剤Ｉ）；２−チオ（３−ヨードベンジル）−５−（ｌ−ピリジル）−［１，３，４］−オキサジアゾール（ＧＳＫ−３β阻害剤ＩＩ）；ＯＴＤＺＴ ２，４−ジベンジル−５−オキソチアジアゾリジン−３−チオン（ＧＳＫ−３β阻害剤ＩＩＩ）；α−４−ジブロモアセトフェノン（ＧＳＫ−３β阻害剤ＶＩＩ）；ＡＲ−ＡＯ１４４１８ Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）ウレア（ＧＳＫ−３β阻害剤ＶＩＩＩ）；３−（１−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−ピラジン−２−イル−ピロール−２，５−ジオン（ＧＳＫ−３β阻害剤ＸＩ）；ＴＷＳ１ １９ ピロロピリミジン化合物（ＧＳＫ−３β阻害剤ＸＩＩ）；Ｌ８０３ Ｈ−ＫＥＡＰＰ ＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ２又はそのミリストイル化物（ＧＳＫ−３β阻害剤ＸＩＩＩ）；２−クロロ−１−（４，５−ジブロモ−チオフェン−２−イル）−エタノン（ＧＳＫ−３β阻害剤ＶＩ）；ＡＲ−Ａ０１４４−１８；ＳＢ２１６７６３；及びＳＢ４１５２８６が含まれる。
ＧＳＫ−３阻害剤は、例えば、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を活性化することができる。β−カテニンの下流の遺伝子の多くは、多能性遺伝子のネットワークを同時制御している。例えば、ＧＳＫ−３阻害剤は、ｃ−Ｍｙｃの発現を活性化し、またそのタンパク質安定性及び転写活性を増強する。そのため、いくつかの実施形態では、ＧＳＫ−３阻害剤は、細胞内での内因性Ｍｙｃポリペプチドの発現を刺激するために用いることができ、それにより多分化能を誘導するために必要なＭｙｃの発現を省くことができる。
また、ＧＳＫ−３βの活性部位の構造は特徴付けられており、特異的及び非特異的な阻害剤と相互作用する鍵残基も同定されている（Bertrand et al., 2003）。この構造の特徴付けにより、その他のＧＳＫ阻害剤の同定を容易に行うことができる。
本発明において用いられる阻害剤は、好適には、標的とするキナーゼに特異的である。ある実施形態の阻害剤は、ＧＳＫ−３β及びＧＳＫ−３αに特異的で、ｅｒｋ２を実質的に阻害せず、またｃｄｃ２を実質的に阻害しない。好適には、阻害剤は、ＩＣ５０値の比率で、ヒトＧＳＫ−３に対してマウスｅｒｋ２及び／又はヒトｃｄｃ２の少なくとも１００倍、より好適には少なくとも２００倍、さらに好適には少なくとも４００倍の選択性を有する；ここで、ＧＳＫ−３のＩＣ５０値とは、ヒトＧＳＫ−３β及びＧＳＫ−３αの平均値を指す。ＧＳＫ−３に特異的なＣＨＩＲ９９０２１では、良好な結果が得られている。ＣＨＩＲ９９０２１の適切な使用濃度は、０．０１〜１００マイクロモル、好適には０．１〜２０マイクロモル、より好適には０．３〜１０マイクロモルの範囲である。
２．ＭＥＫ阻害剤
本発明のある態様では、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ又はＭＥＫ）又はそれに関連するＭＡＰＫカスケードなどのシグナル伝達経路の阻害剤を含む、ＭＥＫ阻害剤を用いることができる。マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ｓｉｃ）は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼをリン酸化するキナーゼ酵素である。また、ＭＡＰ２Ｋとしても知られる。細胞外刺激により、ＭＡＰキナーゼ、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ、ＭＫＫ、ＭＥＫＫ、又はＭＡＰ２Ｋ）、及びＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＫＫＫ又はＭＡＰ３Ｋ）からなるシグナル伝達カスケード（「ＭＡＰＫカスケード」）を通じて、ＭＡＰキナーゼが活性化される。
本明細書において、ＭＥＫ阻害剤とはＭＥＫ阻害剤全般を意味する。したがって、ＭＥＫ阻害剤とは、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２及びＭＥＫ５を含む、タンパク質キナーゼのＭＥＫファミリーのメンバーに対する任意の阻害剤を意味する。ＭＥＫ１、ＭＥＫ２及びＭＥＫ５についても言及される。当技術分野で周知の適切なＭＥＫ阻害剤の例としては、ＭＥＫ１の阻害剤であるＰＤ１８４３５２及びＰＤ９８０５９、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２の阻害剤Ｕ０１２６及びＳＬ３２７、並びにDavies et al., (2000)に記載されるものが含まれる。
特に、ＰＤ１８４３５２及びＰＤ０３２５９０１は、他の既知のＭＥＫ阻害剤と比較して、高い特異性と有効性を持つことが見出されている（Bain et al. , 2007）。その他のＭＥＫ阻害剤及びＭＥＫ阻害剤のクラスについては、Zhang et al., (2000)に記載されている。
ＭＥＫの阻害剤には、ＭＥＫの抗体、ＭＥＫの優性阻害変異体、ＭＥＫの発現を抑制するｓｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸が含まれ得る。ＭＥＫ阻害剤の具体的な例としては、これらに限定されないが、ＰＤ０３２５９０１（例えば、Rinehart et al., 2004を参照）、ＰＤ９８０５９（例えば、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能）、Ｕ０１２６（例えば、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能）、ＳＬ３２７（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）、ＡＲＲＹ−１６２（例えば、Ａｒｒａｙ Ｂｉｏｐｈａｒｍａから入手可能）、ＰＤ１８４１６１（例えば、Kleinet al., 2006を参照）、ＰＤ１８４３５２（ＣＩ−１０４０）（例えば、Mattingly et al., 2006を参照）、スニチニブ（例えば、Voss,et al.、米国特許出願第２００８００４２８７号を参照；参照により本明細書に取り込まれる）、ソラフェニブ（上記Vossを参照）、バンデタニブ（上記Vossを参照）、パゾパニブ（例えば、上記Vossを参照）、アキシチニブ（上記Vossを参照）、及びＰＴＫ７８７（上記Vossを参照）が含まれる。
現在、いくつかのＭＥＫ阻害剤について臨床試験の評価が行われている。ＣＩ−１０４０は、癌のフェーズＩ及びＩＩ臨床試験で評価が行われている（例えば、Rinehart et al., 2004を参照）。臨床試験で評価が行われている他のＭＥＫ阻害剤としては、ＰＤ１８４３５２（例えば、Englishet al., 2002を参照）、ＢＡＹ ４３−９００６（例えば、Chow et al., 2001を参照）、ＰＤ−３２５９０１（また、ＰＤ０３２５９０１）、ＧＳＫｌ １２０２１２、ＡＲＲＹ−４３８１６２、ＲＤＥＡｌ １９、ＡＺＤ６２４４（また、ＡＲＲＹ−１４２８８６又はＡＲＲＹ−８８６）、ＲＯ５１２６７６６、ＸＬ５１８、及びＡＺＤ８３３０（また、ＡＲＲＹ−７０４）。
ＭＥＫの阻害は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用することで簡便に達成することもできる。一般的には、ＭＥＫ遺伝子の全体又は一部に相補的な二本鎖ＲＮＡ分子を多能性細胞に導入することで、ＭＥＫをコードするｍＲＮＡ分子の特異的分解を促進する。この転写後の機構により、標的ＭＥＫ遺伝子の発現が減少又は失われる。ＲＮＡｉを利用してＭＥＫを阻害する適切な手法及びプロトコールは周知である。
ＧＳＫ−３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含むキナーゼ阻害剤を同定する多くの試験法が知られている。例えば、Davies et al., (2000)では、キナーゼをペプチド基質と放射性標識ＡＴＰの存在下でインキュベートする試験法が記載されている。キナーゼによる基質のリン酸化により、標識が基質に組み込まれる。各反応の一定分量をホスホセルロースペーパー上に固定し、リン酸中で洗い、遊離ＡＴＰを除去する。その後、インキュベーション後の基質の活性を測定し、キナーゼ活性の指標を得る。このような試験法により、キナーゼ阻害剤候補物質の存在及び非存在での相対キナーゼ活性を容易に測定することができる。また、Downeyet al., (1996)では、キナーゼ阻害剤の同定に用いることができるキナーゼ活性の試験法が記載されている。
３．ＴＧＦ−β受容体阻害剤
ＴＧＦ−β受容体阻害剤は、ＴＧＦシグナル伝達全般の任意の阻害剤、又はＴＧＦ−β受容体（例えば、ＡＬＫ５）阻害剤に特異的な阻害剤を含み、ＴＧＦ−β受容体（例えば、ＡＬＫ５）の抗体、その優性阻害変異体、並びにその発現を抑制するｓｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸が含まれ得る。ＴＧＦ−β受容体／ＡＬＫ５阻害剤の例としては、これらに限定されないが、ＳＢ４３１５４２（例えば、Inman et al., 2002を参照）、Ａ−８３−０１、別名３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド（例えば、Tojoet al., 2005を参照、また、例えば、Ｔｏｉｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅより入手可能）；２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン、Ｗｎｔ３ａ／ＢＩＯ（例えば、Dalton,et al.、国際公開第２００８／０９４５９７号参照；参照により本明細書に取り込まれる）、ＢＭＰ４（上記Daltonを参照）、ＧＷ７８８３８８（−（４−［３−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］ピリジン−２−イル｝−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）ベンズアミド）（例えば、Gellibertet al., 2006を参照）、ＳＭ１６（例えば、Suzuki et al., 2007を参照）、ＩＮ−１１３０（３−（（５−（６−メチルピリジン−２−イル）−４−（キノキサリン−６−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）ベンズアミド）（例えば、Kimet al., 2008を参照）、ＧＷ６６０４（２−フェニル−４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン）（例えば、deGouville et al., 2006を参照）、ＳＢ−５０５１２４（２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジンヒドロクロライド）（例えば、DaCostaet al., 2004を参照）、及びピリミジン誘導体（例えば、Stiefl et al.、国際公開第２００８／００６５８３号に挙げられるものを参照；参照により本明細書に取り込まれる）が含まれる。
また、「ＡＬＫ５阻害剤」は非特異的キナーゼ阻害剤を含むことを意図しないが、「ＡＬＫ５阻害剤」には、ＡＬＫ５に加えてＡＬＫ４及び／又はＡＬＫ７を阻害する阻害剤、例えば、ＳＢ−４３１５４２（例えば、Inman et al., 2002を参照）などが含まれる。本発明の範囲を限定するものではないが、ＡＬＫ５阻害剤は、間葉系から上皮系への転換／移行（ＭＥＴ）プロセスに作用すると考えられている。ＴＧＦ−β／アクチビン経路は、上皮系から間葉系への移行（ＥＭＴ）を推進する。ＴＧＦ−β／アクチビン経路を阻害することで、ＭＥＴ（すなわち、リプログラミング）プロセスが促進されると考えられている。
ＴＧＦ−β／アクチビン経路の阻害も同様の効果があると考えられている。そのため、本明細書に記載するように、ＴＧＦ−β／アクチビン経路の任意の阻害剤（例えば、上流又は下流）を、ＴＧＦ−β／ＡＬＫ５阻害剤と組み合わせて、又はその代わりに用いることができる。ＴＧＦ−β／アクチビン経路の阻害剤の例としては、これらに限定されないが、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、ＳＭＡＤ２／３リン酸化の阻害剤、ＳＭＡＤ２／３及びＳＭＡＤ４の相互作用の阻害剤、並びに、ＳＭＡＤ６及びＳＭＡＤ７の活性化因子／アゴニストが含まれる。また、本明細書に記載する分類は、単に体系化を目的としており、当業者においては、化合物は経路内の１つ以上の点に作用することができ、そのため、定義した分類の２つ以上において機能し得ることが理解される。
ＴＧＦ−β受容体阻害剤には、ＴＧＦ−β受容体の抗体、ＴＧＦ−β受容体の優性阻害変異体、並びにＴＧＦ−β受容体を標的とするｓｉＲＮＡ又はアンチセンス核酸が含まれ得る。阻害剤の具体的な例としては、これらに限定されないが、ＳＵ５４１６；２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジンヒドロクロライド（ＳＢ−５０５１２４）；レルデリムマブ（lerdelimumb）（ＣＡＴ−１５２）；メテリムマブ（metelimumab）（ＣＡＴ−１９２）；ＧＣ−１００８；ＩＤｌ １；ＡＰ−１２００９；ＡＰ−１１０１４；ＬＹ５５０４１０；ＬＹ５８０２７６；ＬＹ３６４９４７；ＬＹ２１０９７６１；ＳＢ−５０５１２４；ＳＢ−４３１５４２；ＳＤ−２０８；ＳＭ１６；ＮＰＣ−３０３４５；Κｉ２６８９４；ＳＢ−２０３５８０；ＳＤ−０９３；グリベック；３，５，７，２’，４’−ペンタヒドロキシフィアボン（pentahydroxyfiavone）（Ｍｏｒｉｎ）；アクチビン−Ｍ１０８Ａ；Ｐ１４４；可溶性ＴＢＲ２−Ｆｃ；及び、ＴＧＦ−β受容体を標的とするアンチセンストランスフェクト腫瘍細胞（例えば、Wrzesinskiet al., 2007；Kaminska et al., 2005；及びChang et al., 2007を参照）が含まれる。
Ｃ．リプログラミング細胞の培養
開示する方法を用いて、不死化体細胞にリプログラミング因子を導入した後、これらの細胞を多能性の維持に十分な培養液中で培養することができる。本発明において作製した誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞の培養には、霊長類多能性幹細胞、より具体的には胚性幹細胞の培養のために開発された様々な培養液や手法を用いることができ、これらは米国特許出願第２００７０２３８１７０号及び第２００３０２１１６０３号に記載されている。当業者において周知である、ヒト多能性幹細胞の培養及び維持のためのその他の方法も、本発明に使用し得ることが理解される。
ある実施形態では、非既知条件を用いることができる；例えば、幹細胞を未分化の状態に維持するために、多能性細胞を線維芽細胞フィーダー細胞で培養するか、又は線維芽細胞フィーダー細胞にさらした培養液で培養することができる。また、合成したフィーダー非依存培養系、例えばＴｅＳＲ培養液などを用いて、多能性細胞を本質的に未分化の状態で培養、維持することができる（Ludwig et al., 2006a；Ludwig et al., 2006b）。フィーダー非依存培養系及び培養液は、多能性細胞の培養、維持に用いることができる。これらの手法により、マウス線維芽細胞の「フィーダー層」を必要とせずに、ｉＰＳ細胞を本質的に未分化の状態に維持することができる。本明細書に記載するように、必要に応じてコストを削減するため、これらの手法に様々な変更を加えることができる。
例えば、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞のように、ｉＰＳ細胞は、８０％のＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃１０８２９−０１８又は＃１１９６５−０９２）、２０％の非熱失活合成ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（又はヒトＡＢ血清）、１％の非必須アミノ酸、１ｍＭのＬ−グルタミン、及び０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール中で維持することができる。また、ｉＰＳ細胞は、８０％のＫｎｏｃｋ−Ｏｕｔ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃１０８２９−０１８）、２０％の血清代替物（Ｇｉｂｃｏ ＃１０８２８−０２８）、１％の非必須アミノ酸、１ｍＭのＬ−グルタミン、及び０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノールからなる無血清培地中で維持することができる。使用直前に、ヒトｂＦＧＦを最終濃度約４ｎｇ／ｍＬで加えてもよく（国際公開第９９／２０７４１号）、又は、実施例に記載のように、ゼブラフィッシュｂＦＧＦを代わりに用いてもよい。
ヒト多能性幹細胞の培養及び維持においては、様々な基質成分を用いることができ、好適にはフィーダー細胞の代わりに用いることができる。例えば、Ludwig et al. (2006a; 2006b)（参照によりそれら全体が本明細書に取り込まれる）に記載されるように、多能性細胞の成長のための固体担体を提供する手段として、マトリゲル（登録商標）、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、及びビトロネクチンの組み合わせを用いて、培養表面をコーティングすることができる。特に、マトリゲル（登録商標）は、細胞培養及びヒト多能性幹細胞の維持のための基材を提供するために用いることができる。マトリゲル（登録商標）は、マウスの腫瘍細胞から分泌されるゼラチン状のタンパク質混合物で、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（米国、ニュージャージー州）から入手できる。この混合物は、多くの組織に見られる複雑な細胞外環境に似ており、細胞培養のための基材として細胞生物学者に用いられている。
ＥＳ細胞と同様に、ｉＰＳ細胞は特徴的な抗原を有しており、それらは免疫組織化学又はフローサイトメトリーによって、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３及びＳＳＥＡ−４に対する抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．）、並びにＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１（Andrews et al., 1987）を用いることで同定又は確認することができる。胚性幹細胞の多能性は、約０．５〜１０ｘ１０６個の細胞を８〜１２週齡の雄のＳＣＩＤマウスの後肢筋に注入することで確認できる。３つの胚葉それぞれの少なくとも１つの細胞型を示す奇形腫が発生する。
Ｖ．リプログラミング因子の発現及び形質導入
本発明のある態様では、リプログラミング因子は、１つ以上のベクターに含まれる発現カセットから発現される。ベクターは、組み込み型ベクター又はエピソームベクターでもよい。別の態様では、リプログラミングタンパク質を、タンパク質形質導入によって体細胞に直接導入することができる（米国特許出願第６１／１７２，０７９号を参照；参照により本明細書に取り込まれる）。
Ａ．組み込み型ベクター及びエピソームベクター
本発明において、ｉＰＳ細胞は、リプログラミングタンパク質をコードする特定の核酸又は遺伝子を、例えば形質転換Ｂ細胞などの非多能性細胞に組み込むことで、作製することができる。ＤＮＡデリバリーは、一般的に、現在の手法においてレトロウイルスなどのウイルスベクターを組み込むことで達成される。導入される遺伝子には、マスター転写調節因子Ｏｃｔ４（Ｐｏｕｆ５１）及びＳｏｘ２が含まれるが、他の遺伝子も誘導効率を高めることが示唆されている。臨界期の後、少数の形質導入細胞で、多能性幹細胞との形態学的及び生化学的な類似化が始まり、形態学的な選択、倍加時間、又はレポーター遺伝子及び抗生物質の選択によって単離することができる。
２００７年１１月に、２つの別個の研究チームによって、成人ヒト線維芽細胞からｉＰＳを作製するという画期的成果が達成された（Yu et al., 2007；Yamanaka et al., 2007）。Yamanakaは、これまでにマウスモデルで使用されたものと同じ原理により、レトロウイルス系を用いて同じ４つの中心的な遺伝子：Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃでヒト線維芽細胞を多能性幹細胞に形質転換することに成功したが、ｃ−Ｍｙｃは発癌性である。Thomsonらは、ｃ−Ｍｙｃを使用せず、レンチウイルス系によりＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及び異なる遺伝子Ｌｉｎ２８を用いている。
上述のように、ヒト皮膚線維芽細胞からの多能性幹細胞の誘導は、リプログラミング遺伝子の異所的発現のためのレトロウイルス又はレンチウイルスベクターを用いて達成されている。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）などの組換えレトロウイルスは、安定して宿主ゲノムに組み込むことができる。これらは、宿主ゲノムへの組み込みを可能にする逆転写酵素を含んでいる。レンチウイルスは、レトロウイルスのサブクラスである。レンチウイルスは、非分裂及び分裂細胞のゲノムに組み込む能力により、ベクターとして広く適用されている。ＲＮＡの形態のウイルスゲノムは、ウイルスが細胞に侵入すると逆転写されてＤＮＡを産生し、その後ＤＮＡはウイルスインテグラーゼ酵素によってランダムな位置でゲノムに挿入される。
リプログラミング因子遺伝子の導入は、トランスポゾン−転移酵素系を用いて達成することもできる。そのような使用可能なトランスポゾン−転移酵素系としては、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ系、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ系（後者の説明に関しては、欧州特許第１５０７８６５号を参照）、又はＴＴＡＡ特異的ｐｉｇｇｙＢａｃ系がある。
トランスポゾンは、単一細胞のゲノム内で異なる位置に移動することが可能なＤＮＡの配列で、このプロセスは転位と呼ばれる。このプロセスでは、トランスポゾンは変異を引き起こし、ゲノム内のＤＮＡの量を変化させることができる。トランスポゾンは、かつてジャンピング遺伝子と呼ばれていたこともあり、可動性遺伝因子の例である。
可動性遺伝因子には様々なものが存在し、転位のメカニズムに基づいて分類することができる。クラスＩ可動性遺伝因子、又はレトロトランスポゾンは、最初にＲＮＡに転写されてそれ自身をコピーし、続いて、逆転写酵素によってＤＮＡに逆転写され、その後、ゲノムの別の位置に挿入される。クラスＩＩ可動性遺伝因子は、転移酵素によってゲノム内で「切り貼り」を行うことで、ある位置から別の位置に直接移動する。
本明細書においてすでに述べたように、これらのリプログラミング方法は、染色体外複製ベクター（ずなわち、エピソームベクター）を用いることもでき、これらのベクターはエピソームとして複製することができ、ｉＰＳ細胞に外来のベクター又はウイルス成分を本質的に含まないようにすることができる（米国特許公開第２０１０／０００３７５７号を参照；参照により本明細書に取り込まれる；Yu et al., 2009）。
Ｂ．タンパク質形質導入
外来性遺伝子改変が標的細胞に導入されるのを防ぐための１つの考えられる方法は、送達される遺伝子の転写に依存するのではなく、リプログラミングタンパク質を直接細胞に導入することである。これまでの研究により、ＨＩＶ Ｔａｔやポリアルギニンなどのタンパク質形質導入を媒介する短ペプチドを結合させることで、様々なタンパク質をインビトロ及びインビボで細胞に送達できることが示されている。ある最近の研究では、組換えリプログラミングタンパク質を直接送達することで、マウス線維芽細胞を多能性幹細胞に完全にリプログラミングできることが示されている（Zhou et al., 2009）。タンパク質形質導入で細胞をリプログラミングする方法に関する更なる詳細は、米国特許出願第６１／１７２，０７９号に開示されている（参照により本明細書に取り込まれる）。
本発明のある態様では、タンパク質形質導入ドメインを用いて、リプログラミングタンパク質を不死化体細胞に直接導入することができる。タンパク質形質導入により、リプログラミングタンパク質の細胞への送達を促進することができる。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質に由来するＴａｔタンパク質のある領域を標的タンパク質に融合し、標的タンパク質の細胞への侵入を可能にすることができる。これらの形質導入ドメインの融合を用いる利点は、タンパク質の侵入が迅速で、濃度依存的であり、また様々な種類の細胞に働くとみられる点である。
本発明の別の態様では、核局在配列を用いて、リプログラミングタンパク質の核侵入を容易にすることもできる。核局在シグナル（ＮＬＳ）は、様々なタンパク質について説明されている。核へのタンパク質輸送は、核局在シグナルを含む標的タンパク質がカリオフェリンのαサブユニットに結合することによって起こる。これに続いて、標的タンパク質：カリオフェリン複合体が核孔を介して核へ輸送される。しかし、リプログラミングタンパク質は、内因性核局在配列を有する転写因子である場合が多い。したがって、核局在配列は、必ずしも必要ではない。
リプログラミングタンパク質の体細胞への直接導入を本発明に用いることができ、その場合、リプログラミングタンパク質はタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）に作用的に連結されており、この連結は、そのようなドメインを含む融合タンパク質を作製するか、又はリプログラミングタンパク質とＰＴＤを各分子上の官能基を介して化学的に架橋結合することによって行われる。
標準的な組換え核酸法を用いて、本発明で使用される１つ以上の形質導入可能なリプログラミングタンパク質を発現させることができる。ある実施形態では、形質導入可能なタンパク質をコードする核酸配列を、例えば、転写及び翻訳のための適切なシグナル及びプロセシング配列及び制御配列を有する核酸発現ベクターにクローニングする。別の実施形態では、タンパク質は、自動有機合成法を用いて合成することができる。
また、タンパク質の細胞への輸送にも役立ち得るいくつかの方法があり、これらの１つ以上の方法を単独で使用するか、又は、これらに限定されないが、微量注入、エレクトロポレーション、及びリポソームの使用を含むタンパク質形質導入ドメインを用いた方法と組み合わせて使用することができる。これらの方法の多くは、精製したタンパク質調製物を必要とする場合がある。多くの場合、組換えタンパク質の精製は、親和性タグを発現構築物に組み込むことで容易になり、精製工程が迅速かつ効率的になる。
ＶＩ．ベクターの構築及び送達
ある実施形態では、不死化及び／又はリプログラミングのためのベクターは、細胞内に、上述のような不死化遺伝子又はリプログラミング因子などの様々な成分をコードする核酸配列に加えて、他の要素を含むように構築することができる。これらのベクターの成分及び送達方法の詳細を以下に開示する。
Ａ．ベクター
当業者においては、標準的な組換え技術によってベクターを構築することができると考えられる（例えば、Maniatis et al., 1988及びAusubel et al., 1994を参照；ともに参照により本明細書に取り込まれる）。
ベクターは、遺伝子送達及び／又は遺伝子発現をさらに調節する、又は標的細胞に有利な特性を他の方法で付与する、その他の成分又は機能も含むことができる。このような他の成分には、例えば、細胞への結合又は標的化に影響を与える成分（細胞型又は組織特異的な結合を媒介する成分を含む）；細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を与える成分；取り込み後の細胞内のポリヌクレオチドの局在化に影響を与える成分（核局在化を媒介する作用物質など）；及び、ポリヌクレオチドの発現に影響を与える成分が含まれる。
また、このような成分には、ベクターによって送達された核酸を取り込んで発現している細胞の検出又は選択に用いることができる検出及び／又は選択マーカーなどのマーカーも含まれ得る。このような成分は、ベクターの天然の特徴として提供することができ（例えば、結合及び取り込みを媒介する成分又は機能性を有する特定のウイルスベクターの使用）、又は、ベクターをこのような機能性を提供するように改変することができる。このようなベクターは、様々なものが当技術分野で公知であり、一般に入手可能である。ベクターが宿主細胞に維持されている場合、ベクターは、自律構造物として有糸分裂の間に細胞によって安定的に複製されるか、宿主細胞のゲノム内に組み込まれるか、又は宿主細胞の核若しくは細胞質内に維持される。
Ｂ．調節要素
ベクターに含まれる真核生物発現カセットは、好適には、タンパク質コード配列、介在配列を含むスプライシングシグナル、及び転写停止／ポリアデニル化配列に作動可能に連結された真核生物転写プロモーターを含む（５’から３’方向）。
１．プロモーター／エンハンサー
「プロモーター」は、転写の開始及び速度を制御する核酸配列の領域である制御配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼや他の転写因子などの調節タンパク質及び分子が結合して核酸配列の特異的な転写を開始する遺伝子要素を含む場合がある。「作用的に配置された」、「作用的に連結された」、「制御下」及び「転写制御下」とは、プロモーターが核酸配列に対して正しい機能位置及び／又は向きにあって、その配列の転写開始及び／又は発現を制御することを意味する。
本発明のＥＢＮＡ−１をコードするベクターでの使用に適したプロモーターは、ＥＢＮＡ−１タンパク質をコードする発現カセットの発現を誘導して、ＥＢＮＡ−１タンパク質を十分な定常状態のレベルにし、ＥＢＶ ｏｒｉＰを含むベクターを安定的に維持するプロモーターである。また、プロモーターは、リプログラミング因子をコードする発現カセットの効率的な発現のためにも用いることができる。
プロモーターは、一般に、ＲＮＡ合成の開始部位の位置を決定する配列を含む。最もよく知られている例はＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを持たない一部のプロモーター、例えば、哺乳動物末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター及びＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなどでは、開始部位自体の上にある別個の要素が、開始位置の決定を補助する。別のプロモーター要素は、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の３０〜１１０塩基対上流の領域に位置するが、多数のプロモーターで、開始部位の下流でも機能要素を含むことが示されている。コード配列をプロモーター「の制御下」に置くためには、選択されたプロモーターの「下流」の（すなわち、３’側の）転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端の位置を決定する。「上流」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされたＲＮＡの発現を促進する。
プロモーター要素間の間隔は、柔軟である場合が多いため、要素が互いに対して逆転又は移動しても、プロモーターの機能は保たれる。例えば、ＨＳＶ−ｔｋプロモーターでは、プロモーター要素間の間隔は、活性が低下し始めるまでに５０塩基対まで広げることができる。プロモーターに応じて、個々の要素は協働又は独立して機能し、転写を活性化することができる。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用調節配列である「エンハンサー」と共に用いてもよい。
プロモーターは、核酸配列に天然に結合されたものでもよく、コードセグメント及び／又はエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することで得ることができる。このようなプロモーターは、「内因性」と呼ぶことができる。同様に、エンハンサーは、核酸配列に天然に結合され、その配列の下流又は上流に位置してもよい。また、自然環境では通常は核酸配列に結合されていないプロモーターを意味する組換え又は異種プロモーターの制御下にコード核酸セグメントを置くことによって、一定の利点が得られる。同様に、組換え又は異種エンハンサーは、自然環境では通常は核酸配列に結合していないエンハンサーを意味する。このようなプロモーター又はエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、及び任意の他のウイルス又は原核細胞若しくは真核細胞から単離されたプロモーター又はエンハンサー、及び、「天然に存在」していない、すなわち異なる転写調節領域の異なる要素及び／又は発現を変える変異を含むプロモーター又はエンハンサーが含まれ得る。例えば、組換えＤＮＡの構築に最も良く使用されるプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース、及びトリプトファン（ｔｒｐ）のプロモーター系が含まれる。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列は、合成による作製に加えて、本明細書に開示される組成物に関連した組換えクローニング及び／又はＰＣＲ（登録商標）を含む核酸増幅技術を用いて作製することができる（米国特許第４，６８３，２０２号及び第５，９２８，９０６号を参照；それぞれ参照により本明細書に取り込まれる）。さらに、ミトコンドリアや葉緑体などの非核細胞小器官内での配列の転写及び／又は発現を誘導する制御配列も利用できるということが考えられる。
当然ながら、発現のために選択される細胞小器官、細胞型、組織、器官、又は生物におけるＤＮＡセグメントの発現を効率的に誘導するプロモーター及び／又はエンハンサーを利用することが重要である。分子生物学の当業者においては、一般的に、タンパク質の発現のためのプロモーター、エンハンサー、及び細胞型の組合せの使用について知識を有する（例えば、Sambrook et al.. 1989を参照；参照により本明細書に取り込まれる）。利用されるプロモーターは、導入されるＤＮＡセグメントの高レベルの発現を誘導する適切な条件下で、本質的、組織特異的、誘導可能、及び／又は有用であり、組換えタンパク質及び／又はペプチドの大量生産などに有利である。プロモーターは、異種性又は内因性である。
また、任意のプロモーター／エンハンサーの組合せ（例えば、ワールドワイドウエブのepd.isb-sib.ch/にある真核生物プロモーターデータベースＥＰＤＢを参照）を使用して発現を起こすこともできる。Ｔ３、Ｔ７、又はＳＰ６細胞質発現系の使用は、別の可能な実施形態である。真核細胞では、適切な細菌ポリメラーゼが送達複合体の一部として又は別の遺伝子発現構築物として提供されると、特定の細菌プロモーターによる細胞質転写が利用できる。
プロモーターの非限定的な例としては、初期又は後期ウイルスプロモーター、例えば、ＳＶ４０初期又は後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーター；真核細胞プロモーター、例えば、βアクチンプロモーター（Ng, 1989；Quitsche et al., 1989）、ＧＡＤＰＨプロモーター（Alexander et al., 1988、Ercolaniet al., 1988）、メタロチオネインプロモーター（Karin et al., 1989；Richards et al., 1984）；及び連結応答要素プロモーター、例えば、サイクリックＡＭＰ応答要素プロモーター（ｃｒｅ）、血清応答要素プロモーター（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモーター（ＴＰＡ）、及び最小ＴＡＴＡボックス近傍の応答要素プロモーター（ｔｒｅ）などが挙げられる。また、ヒト成長ホルモンプロモーター配列（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋに記載されているヒト成長ホルモン最小プロモーター、受託番号Ｘ０５２４４、ヌクレオチド２８３〜３４１）、又はマウス乳腺腫瘍プロモーター（ＡＴＣＣから入手可能、カタログ番号ＡＴＣＣ４５００７）を使用することも可能である。具体的な例としては、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが考えられる。
２．開始シグナル及び内部リボソーム結合部位
コード配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要である。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン又は隣接配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む外来性翻訳制御シグナルが必要となる場合もある。当業者においては、容易にこれを決定し、必要なシグナルを提供することができると考えられる。周知のこととして、挿入断片全体を確実に翻訳するためには、開始コドンが所望のコード配列のリーディングフレームの「インフレーム」でなければならない。外来性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然又は合成のいずれかとすることができる。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素を含めることによって高めることができる。
本発明のある実施形態では、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）要素を用いて、多重遺伝子又は多シストロン性メッセージを生成する。ＩＲＥＳ要素は、５’メチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを回避して、内部部位で翻訳を開始することができる（Pelletier and Sonenberg, 1988）。ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオ及び脳心筋炎）由来のＩＲＥＳ要素（Pelletierand Sonenberg, 1988）、及び、哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳ（Macejak and Sarnow, 1991）については述べられている。ＩＲＥＳ要素は、異種オープンリーディングフレームに連結することができる。複数のオープンリーディングフレームはまとめて転写することができ、それぞれがＩＲＥＳによって分離され、多シストロン性メッセージを生成する。ＩＲＥＳ要素によって、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームにアクセス可能である。複数の遺伝子は、単一のプロモーター／エンハンサーを用いて１つのメッセージを転写することで効率的に発現させることができる（米国特許第５，９２５，５６５号及び第５，９３５，８１９号を参照；それぞれ参照により本明細書に取り込まれる）。
本発明のある実施形態では、多シストロン性転写のための、少なくとも１つのプロテアーゼ切断部位及び／又は自己切断ペプチドをコードする配列を用いることができる。例えば、ウイルス２Ａペプチドなどのいくつかの自己切断ペプチドが存在する。
３．マルチクローニング部位
ベクターは、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）を含むことができ、このＭＣＳは、複数の制限酵素部位を含む核酸領域であり、どの制限酵素部位も、標準的な組換え技術とともに使用してベクターを消化することができる（例えば、Carbonelli et al., 1999、Levenson et al., 1998、及びCocea., 1997を参照；参照により本明細書に取り込まれる）。「制限酵素消化」は、核酸分子の特定の位置でのみ機能する酵素を用いた核酸分子の触媒的切断を意味する。これらの制限酵素の多くは市販されている。このような酵素の使用は、当業者において広く知られている。しばしば、ベクターは、ＭＣＳ内で切断して外来性配列のベクターへのライゲーションを可能にする制限酵素を使用して、線状化又は断片化される。「ライゲーション」とは、２つの核酸断片間にホスホジエステル結合を形成するプロセスを意味し、これらの断片は互いに連続していても良いし、連続していなくても良い。制限酵素及びライゲーション反応を伴う技術は、組換え技術の当業者において周知である。
４．スプライシング部位
転写された真核生物ＲＮＡ分子の大部分は、一次転写物からイントロンを取り除くためのＲＮＡスプライシングを受ける。真核生物ゲノム配列を含むベクターは、タンパク質発現のための転写物の適切なプロセシングを行うために、ドナー及び／又はアクセプターのスプライシング部位を必要とする場合がある（例えば、Chandler et al., 1997を参照；参照により本明細書に取り込まれる）。
５．終結シグナル
本発明のベクター又は構築物は、一般に、少なくとも１つの終結シグナルを含む。「終結シグナル」又は「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写物の特異的な終結に関与するＤＮＡ配列から構成されている。したがって、ある実施形態では、ＲＮＡ転写物の産生を終了させる終結シグナルが考えられる。ターミネーターは、所望のメッセージレベルを達成するためにインビボで必要となる場合がある。
真核生物系では、ターミネーター領域は、ポリアデニル化部位を露出するために新たな転写物の部位特異的切断を可能にする特異的ＤＮＡ配列も含み得る。これは、特殊化された内因性ポリメラーゼに対して、約２００Ａ残基（ポリＡ）のストレッチを転写物の３’末端に付加するようにシグナルを出す。このポリＡ尾部で修飾されたＲＮＡ分子は、より安定であり、より効率的に翻訳される。したがって、真核生物に関する他の実施形態では、ターミネーターがＲＮＡの切断のためのシグナルを含むことが好ましく、また、ターミネーターのシグナルがメッセージのポリアデニル化を促進することがさらに好ましい。ターミネーター及び／又はポリアデニル化部位の要素は、メッセージレベルを強め、カセットから他の配列への通読を最小化する役割を果たすことができる。
本発明のある態様での使用が考えられるターミネーターは、本明細書に記載する公知の転写ターミネーター、又は当業者に周知のターミネーターが含まれ、例えば、これらに限定されないが、ウシ成長ホルモンターミネーターなどの遺伝子の終結配列、又はＳＶ４０ターミネーターなどのウイルス終結配列が含まれる。ある実施形態では、終結シグナルは、配列の切断などにより、転写又は翻訳可能な配列が欠失している場合がある。
６．ポリアデニル化シグナル
発現において、特に真核生物の発現では、通常、転写物の適切なポリアデニル化を生じさせるポリアデニル化シグナルが含まれる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明を実施する上で重要とは考えられず、任意のそのような配列を用いることができる。好ましい実施形態では、簡便で様々な標的細胞において十分に機能することが知られているＳＶ４０ポリアデニル化シグナル又はウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化は、転写物の安定性を向上させ、又は細胞質輸送を容易にすることができる。
７．複製起点
宿主細胞でベクターを増殖させるために、ベクターは、１つ以上の複製部位の起点（しばしば「ｏｒｉ」と呼ばれる）を含むことができ、例えば、複製が開始される特定の核酸配列であるｏｒｉＰに関して、上述のＥＢＶのｏｒｉＰ、又は分化プログラミングでの機能が同等又は向上した遺伝子組換えｏｒｉＰに対応する核酸配列がある。また、上述の他の染色体外複製ウイルスの複製起点又は自己複製配列（ＡＲＳ）を用いることもできる。
８．選択マーカー及びスクリーニングマーカー
本発明のある実施形態では、本発明の核酸構築物を含む細胞は、発現ベクターにマーカーを含めることによって、インビトロ又はインビボで同定することができる。このようなマーカーは、識別可能な変化を細胞に付与し、発現ベクターを含む細胞の容易な同定を可能にする。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するマーカーである。陽性選択マーカーは、そのマーカーの存在により選択を可能にするマーカーであり、陰性選択マーカーは、そのマーカーの存在により選択を妨げるマーカーである。陽性選択マーカーの例としては、薬剤耐性マーカーがある。
通常は、薬物選択マーカーを含むことで、形質転換体のクローニング及び同定がしやすくなり、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、及びヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子が、有用な選択マーカーとなる。条件を満たすことで形質転換体の区別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、基準が比色分析であるＧＦＰなどのスクリーニングマーカーを含む他の種類のマーカーも考えられる。また、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの陰性選択マーカーとしてスクリーニング可能な酵素を利用することができる。当業者においては、場合によりＦＡＣＳ分析と共に免疫学的マーカーを利用する方法も周知である。使用されるマーカーについては、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現可能である限り、重要であるとは考えられない。選択マーカー及びスクリーニングマーカーのさらなる例は、当業者において周知である。本発明の特徴の１つには、分化プログラミング因子がベクターを含まない細胞で所望の分化状態に変更した後に、選択マーカー及びスクリーニングマーカーを用いてそれらの細胞を選択することが含まれる。
Ｃ．ベクター送達
本発明を用いたリプログラミングベクターの細胞への導入では、本明細書に記載する（例えば、ウイルス形質導入）、又は当業者に周知であると考えられる、細胞に核酸を送達するための任意の適切な方法を使用することができる。このような方法としては、これらに限定されないが、エキソビボトランスフェクション（Wilson et al, 1989、Nabel et al, 1989）、微量注入（Harland and Weintraub,1985；米国特許第５，７８９，２１５号；参照により本明細書に取り込まれる）を含む注入（米国特許第５，９９４，６２４号、第５，９８１，２７４号、第５，９４５，１００号、第５，７８０，４４８号、第５，７３６，５２４号、第５，７０２，９３２号、第５，６５６，６１０号、第５，５８９，４６６号、及び第５，５８０，８５９号；それぞれ参照により本明細書に取り込まれる）；エレクトロポレーション（米国特許第５，３８４，２５３号、参照により本明細書に取り込まれる；Tur-Kaspaet al., 1986；Potter et al., 1984）；リン酸カルシウム沈殿（Graham and Van Der Eb, 1973：Chenand Okayama, 1987；Rippe et al., 1990）；ＤＥＡＥ−デキストランに続いてポリエチレングリコールの使用（Gopal, 1985）；直接超音波負荷（Fechheimeret al., 1987）；リポソーム媒介トランスフェクション（Nicolau and Sene, 1982；Fraley et al., 1979；Nicolauet al., 1987；Wong et al., 1980；Kaneda et al., 1989；Kato et al., 1991）、及び、受容体媒介トランスフェクション（Wuand Wu, 1987；Wu and Wu, 1988）；微粒子銃（国際公開第９４／０９６９９号及び第９５／０６１２８号；米国特許第５，６１０，０４２号、第５，３２２，７８３号、第５，５６３，０５５号、第５，５５０，３１８号、第５，５３８，８７７号、及び第５，５３８，８８０号；それぞれ参照により本明細書に取り込まれる）；炭化ケイ素繊維を用いた攪拌（Kaeppleret al., 1990；米国特許第５，３０２，５２３号及び第５，４６４，７６５号；それぞれ参照により本明細書に取り込まれる）；アグロバクテリウム媒介形質転換（米国特許第５，５９１，６１６号及び第５，５６３，０５５号；それぞれ参照により本明細書に取り込まれる）；プロトプラストのＰＥＧ媒介形質転換（Omirullehet al., 1993；米国特許第４，６８４，６１１号及び第４，９５２，５００号；それぞれ参照により本明細書に取り込まれる）；乾燥／阻害媒介によるＤＮＡ取り込み（Potrykuset al., 1985）、及びこれらの方法の任意の組み合わせなどによる、ＤＮＡの直接送達が含まれる。このような技術を用いることで、細胞小器官、細胞、組織、又は生物を安定的又は一過性に形質転換することができる。
１．リポソーム媒介トランスフェクション
本発明のある実施形態では、核酸は、例えばリポソームなどの脂質複合体の中に閉じ込めることができる。リポソームは、リン脂質二重層膜及び内部の水性媒体によって特徴付けられる小胞構造物である。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質が過剰の水溶液中で懸濁されると自然に生じる。脂質成分は、密閉構造物が形成される前に自己再構成され、脂質二重層間に水及び溶解した溶質を閉じ込める（Ghosh and Bachhawat, 1991）。また、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）又はＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）と複合体を形成した核酸も考えられる。使用するリポソームの量は、リポソームの性質や用いる細胞によって異なり、例えば、百万〜１千万個の細胞に対して約５〜約２０μｇのベクターＤＮＡが考えられる。
リポソームを媒介したインビトロでの外来性ＤＮＡの核酸送達及び発現は、非常に成功している（Nicolau and Sene, 1982；Fraley et al., 1979；Nicolau et al., 1987）。また、培養したニワトリ胚細胞、ＨｅＬａ細胞、及び肝細胞腫細胞における外来性ＤＮＡのリポソーム媒介送達及び発現の実行可能性も実証されている（Wonget al., 1980）。
本発明のある実施形態では、リポソームは、センダイウイルス（ＨＶＪ）と複合体を形成し得る。これは、細胞膜との融合を容易にし、リポソームカプセル化ＤＮＡの細胞侵入を促進することが示されている（Kaneda et al., 1989）。他の実施形態では、リポソームは、核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合体を形成するか、又はそれと共に利用することができる（Katoet al., 1991）。さらなる別の実施形態では、リポソームは、ＨＶＪ及びＨＭＧ−１の両方と複合体を形成するか、又はこれらと共に利用することができる。他の実施形態では、送達媒体は、リガンド及びリポソームを含み得る。
２．エレクトロポレーション
本発明のある実施形態では、核酸は、エレクトロポレーションによって細胞に導入される。エレクトロポレーションは、細胞及びＤＮＡの懸濁液を高電圧放電にさらすことを含む。レシピエント細胞は、機械的創傷によってさらに形質転換しやすくなる。また、使用するベクターの量は、用いる細胞の性質によって異なり、例えば、百万〜１千万個の細胞に対して約５〜約２０μｇのベクターＤＮＡが考えられる。
エレクトロポレーションを用いた真核細胞のトランスフェクションは、非常に成功している。この方法により、マウス前Ｂリンパ球にヒトκ免疫グロブリン遺伝子がトランスフェクションされ（Potter et al., 1984）、また、ラット肝細胞にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子がトランスフェクションされている（Tur-Kaspaet al., 1986）。
３．リン酸カルシウム
本発明の他の実施形態では、核酸は、リン酸カルシウム沈殿を用いて細胞に導入される。この技術を用いて、ヒトＫＢ細胞にアデノウイルス５ＤＮＡがトランスフェクションされている（Graham and Van Der Eb, 1973）。同様にこの方法により、マウスＬ（Ａ９）、マウスＣ１２７、ＣＨＯ、ＣＶ−１、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３、及びＨｅＬａ細胞に、ネオマイシンマーカー遺伝子がトランスフェクションされ（Chenand Okayama, 1987）、また、ラット肝細胞に様々なマーカー遺伝子がトランスフェクションされている（Rippe et al., 1990）。
４．ＤＥＡＥ−デキストラン
別の実施形態では、核酸は、ＤＥＡＥ−デキストラン、続いてポリエチレングリコールを用いて細胞に送達される。この方法により、レポータープラスミドが、マウス骨髄腫細胞及び赤白血病細胞に導入されている（Gopal, 1985）。
５．超音波負荷
本発明の別の実施形態では、直接超音波負荷による核酸の導入が含まれる。超音波負荷により、ＬＴＫ−線維芽細胞に、チミジンキナーゼ遺伝子がトランスフェクションされている（Fechheimer et al., 1987）。
６．受容体媒介トランスフェクション
さらに、核酸は、受容体媒介送達媒体によって標的細胞に送達することができる。これらは、標的細胞内で起こる受容体媒介エンドサイトーシスによる高分子の選択的取り込みを利用している。様々な受容体の細胞型特異的分布から考えれば、この送達方法は、本発明に別の段階の特異性をもたらす。
ある受容体媒介遺伝子標的媒介は、細胞受容体特異的リガンド及び核酸結合剤を含む。その他の媒体は、送達される核酸が作用的に結合された細胞受容体特異的リガンドを含む。いくつかのリガンドが、受容体媒介遺伝子輸送に使用され（Wu and Wu, 1987；Wagner et al, 1990；Perales et al, 1994；Myers,欧州特許第０２７３０８５号）、技術の操作性が確立されている。別の哺乳動物細胞型に関連した特異的送達についても述べられている（Wuand Wu, 1993；参照により本明細書に取り込まれる）。本発明のある態様では、リガンドは、標的細胞集団上で特異的に発現される受容体に対応して選択される。
他の実施形態では、細胞特異的核酸標的媒体の核酸送達媒体成分は、リポソームと組み合わされた特異的結合リガンドを含む場合がある。送達される核酸はリポソーム内に収容され、特異的結合リガンドがリポソーム膜内に機能的に取り込まれる。したがって、リポソームは、標的細胞の受容体に特異的に結合し、内容物を細胞に送達する。例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体の発現増加を示す細胞への核酸の受容体媒介送達にＥＧＦが用いられる系を用いることで、このような系が機能的であることが示されている。
さらなる実施形態では、標的化送達媒体の核酸送達媒体成分は、リポソーム自体であってもよく、好適には、これは細胞特異的な結合を誘導する１つ以上の脂質又は糖タンパク質を含む。例えば、ラクトシル−セラミド、ガラクトース末端アシアロガングリオシド（asialganglioside）が、リポソーム内に取り込まれ、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増加が観察されている（Nicolauet al., 1987）。本発明の組織特異的形質転換構築物が、同様の方法により標的細胞に特異的に送達可能であることも考えられる。
７．微粒子銃
微粒子銃技術は、少なくとも１つの細胞小器官、細胞、組織、又は生物に核酸を導入するために用いることができる（米国特許第５，５５０，３１８号；第５，５３８，８８０号；第５，６１０，０４２号；及び国際公開第９４／０９６９９号；それぞれ参照により本明細書に取り込まれる）。この方法は、ＤＮＡ被覆微粒子を高速に加速し、細胞を死滅させることなく、細胞膜を貫通して細胞内に侵入させるという手法による（Klein et al., 1987）。当技術分野で公知の様々な微粒子銃技術が存在し、その多くが本発明に適用可能である。
この微粒子銃では、１つ以上の粒子を少なくとも１つの核酸で被覆し、推進力によって細胞に送達することができる。小さな粒子を加速させるためのいくつかの装置が開発されている。このような装置の１つは、電流を生成する高電圧放電を用いて、これが順に動力を供給する（Yang et al., 1990）。使用される微粒子発射物は、タングステン又は金の粒子やビーズなどの生物学的に不活性な物質からなる。粒子の例には、タングステン、白金、及び好適には金からなる粒子が含まれる。場合によっては、金属粒子上へのＤＮＡ沈殿は、微粒子銃を使用するレシピエント細胞へのＤＮＡ送達に必要ではないことも考えられる。しかし、粒子は、ＤＮＡで被覆されるのではなく、ＤＮＡを含んでもよいと考えられる。ＤＮＡ被覆粒子は、粒子銃によるＤＮＡ送達のレベルを上げることができるが、ＤＮＡ被覆粒子自体は必ずしも必要ではない。
照射のためには、懸濁液中の細胞をフィルター又は固形培養培地上で濃縮する。また、未成熟胚又は他の標的細胞を、固形培養培地上に配置することもできる。照射される細胞は、微粒子発射物停止プレートよりも下の適切な距離に配置される。
ＶＩＩ．ｉＰＳ細胞の分化
本発明を用いて、例えばこれらに限定されないが、造血系細胞、筋細胞（例えば、心筋細胞）、神経細胞、線維芽細胞、及び上皮細胞、並びにそれらに由来する組織及び器官を含む細胞系列にｉＰＳ細胞を分化させるためには、様々な方法を用いることができる。ｉＰＳ細胞の造血系分化の方法の例としては、例えば、米国特許出願第６１／０８８，０５４号及び第６１／１５６，３０４号に開示される方法（ともに参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）、又は、胚様体（ＥＢ）を用いる方法（Chadwick et al., 2003；Ng et al., 2005）がある。Wang et al., 2007に例示されるように、フィブロネクチン分化方法も、血液系分化に用いることができる。ｉＰＳ細胞の心臓系分化の例示的方法としては、胚様体（ＥＢ）による（Zhang,et al., 2009）、ＯＰ９間質細胞による方法（Narazaki et al., 2008）、又は、成長因子／化学物質による方法（米国特許公開第２００８００３８８２０号、第２００８０２２６５５８号、第２００８０２５４００３号、及び第２００９００４７７３９号を参照；これらはすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に取り込まれる）が含まれる。
Ａ．肝細胞
米国特許第６，４５８，５８９号及び国際公開第０１／８１５４９号（Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に記載されるように、肝細胞は、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤を用いることで、ｈＥＳ細胞などの多能性幹細胞から分化することができる。未分化の多能性幹細胞は、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤の存在下で培養することが可能である。例示的な方法では、１％ＤＭＳＯ、次いで、２．５ｍＭのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤ｎ−ブチレートにより分化を開始する。得られた細胞は、ｎ−ブチレート、ＤＭＳＯ、及び成長因子（ＥＧＦ、肝細胞成長因子、及びＴＧＦ−αなど）を含む肝細胞培養液中で４日間培養することで、成熟させることができる。
ｈＥＳ細胞などの多能性幹細胞を肝細胞に分化させる段階的プロトコールが、米国特許出願第２００５／００３７４９３Ａ１号（Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）に記載されている。細胞は、いくつかの分化剤及び成熟化剤の組み合わせを順番に用いて培養し、ｈＥＳ細胞などの多能性幹細胞を最初に初期内胚葉又は肝細胞前駆体に分化させ、その後、肝細胞様細胞に成熟させる。
内胚葉様細胞への分化は、ブチレート、ＤＭＳＯ、又はウシ胎児血清を用いて、必要に応じて線維芽細胞成長因子と組み合わせることで、開始することができる。その後、分化は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、及び／又は骨形態形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−２、４、又は７）などを様々な組み合わせで含む市販の肝細胞培養液を用いて継続することができる。最終成熟は、デキサメタゾンやオンコスタチンＭなどの薬剤の存在により促進され得る。米国特許出願第２００５／００３７４９３Ａ１号の「ＤＭＳＯプロトコール」を本発明のレポーター肝細胞に応用したものの説明を、下記実施例３に示す。改良した肝細胞分化プロトコールでは、アクチビン活性を有するタンパク質を、典型的にはブチレート及び／又はＤＭＳＯなどの他の因子の存在下又はそれらと連続して用いて、分化を開始する（実施例６）。その後、細胞は、ＨＧＦ、ＥＧＦ、及び／又はＢＭＰを用いて段階的に成熟させることができ、デキサメタゾン次いでオンコスタチンＭの存在により増進される。
本発明のある態様では、肝細胞は、肝細胞プログラミング因子の細胞内レベルを細胞の肝細胞へのプログラミングを促進するのに十分なレベルに増加させる条件を満たす培養液中で、多能性幹細胞又は他の非肝細胞を培養することにより作製される（米国特許出願第６１／３２３，６８９号を参照；参照により本明細書に取り込まれる）。また、培養液は、様々な種類の成長因子など、１つ以上の肝細胞分化及び成熟化剤を含んでもよい。しかし、肝細胞プログラミング転写因子の細胞内レベルを増加させることで、本発明の態様では、各段階で培養液を変更せずに、成熟肝細胞へのほとんどの段階を省くことができる。
そのため、本発明がもたらす利点から見て、特定の様態では、肝細胞プログラミング下の細胞を培養する培養液は、１つ以上の肝細胞分化剤及び成熟化剤を本質的に含まないか、又はこれらの薬剤の異なる組み合わせを含む培養液を連続的に変更しなくてもよい。
これらの薬剤は、細胞をより成熟した表現型に誘導する、又は、選択的に成熟細胞の生存を促進するために役立つか、若しくはこれらの効果の組み合わせを有する。本明細書に記載する肝細胞分化剤及び成熟化剤は、肝細胞系の細胞の成長を促進することができる可溶性の成長因子（ペプチドホルモン、サイトカイン、リガンド−受容体複合体、及びその他の化合物）を含んでいてもよい。このような薬剤の非限定的な例としては、これらに限定されないが、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ヘパリン、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、ＩＬ−１、ＩＬ−６、インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２）、ヘパリン結合性成長因子１（ＨＢＧＦ−１）、並びにグルカゴンが含まれる。熟練の判読者においては、オンコスタチンＭが白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、及び毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）と構造的に関連していることがすでに理解される。
別の例としては、これまでの特許開示に記載されているように、ｎ−ブチレートがある（米国特許第６，４５８，５８９号、第６，５０６，５７４号、；国際公開第０１／８１５４９号）。同様の効果を持つｎ−ブチレート相同体は容易に同定することができ、本発明の実施において代替物として用いることができる。一部の相同体は、ｎ−ブチレートと同様の構造的及び物理化学的特性を有する：３〜１０個の炭素原子と、カルボン酸塩、スルホン酸塩、ホスホン酸塩及び他のプロトン供与体からなる群より選択される共役塩基とを含む、酸性炭化水素。例としては、イソ酪酸、ブテン酸、プロパン酸、他の短鎖脂肪酸、及びジメチルブチレートが含まれる。同様に含まれるものとして、プロパンスルホン酸及びプロパンホスホン酸などの炭化水素スルホン酸又はホスホン酸同配体、並びに、アミド、サッカライド、ピペラジン、及び環状誘導体などの複合物がある。ブチレート相同体の更なるクラスとしては、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤がある。非限定的な例としては、トリコスタチンＡ、５−アザシチジン、トラポキシンＡ、オキサムフラチン、ＦＲ９０１２２８、シスプラチン、及びＭＳ−２７−２７５が含まれる。薬剤の別のクラスとしては、ＤＭＳＯなどの有機溶媒がある。同様の特性を持つ代替物としては、これらに限定されないが、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ヘキサメチレンビスアセタミド、及び他のポリメチレンビスアセタミドが含まれる。このクラスの溶媒は、細胞の膜透過性を高めるという特性で、部分的に関連している。また、ニコチンアミドなどの溶質も関心がもたれる。
本開示において、「肝細胞」又は「肝細胞系細胞」とは、以下の特徴の１つ以上、好適には少なくとも３つ、より好適には５つ又は７つを有する細胞を意味する：α１−アンチトリプシン；アシアロ糖タンパク質、グリコーゲン貯蔵、シトクロムＰ４５０発現；グルコース−６−ホスファターゼ活性、低レベルから無視できるレベルのα-フェトプロテイン、及び肝細胞の形態学的特徴（立方細胞で、場合によりそれらの間に小管の間隙を持つ）。ヒト肝臓から単離した成熟肝細胞の他の特徴も存在し得るが、本定義において細胞を肝細胞として限定するためには必要ではない。細胞マーカーを同定する試験方法は、米国特許第６，４５８，５８９号に詳しく記載されている。本発明の「肝細胞」は、ヒト胚性幹細胞から分化させることで得ることができるが、明示的に必要とされない限り、必ずしもこれによるものではない。
薬物スクリーニングとの関連では、利用者においては、シトクロムＰ４５０酵素などの特定の薬物代謝酵素の活性を試験したいと希望する場合もある。シトクロムＰ４５０の活性を調べる簡便な方法としては、細胞を基質の「カセット」と結合させる：例えば、ミダゾラム（ＣＹＰ３Ａ４により代謝される）、トルブタミド（ＣＹＰ２Ｃ９により代謝される）、フェナセチン（ＣＹＰ１Ａ２）、及びブフラロール（ＣＹＰ２Ｄ６）。活性は、ＨｅｐＧ２細胞などの基準細胞株の約０．１倍、１倍、又は１０倍として定量化できる。カセット内の全薬剤の代謝産物を同時に観察する簡便な方法としては、ＧＣＭＳを用いる。必要であれば、薬物スクリーニングの前又はその間に、デキサメタゾンやリファンピシンなどの化合物で細胞を処理し、細胞内のシトクロムＰ４５０の発現又は活性を高めることができる。
Ｂ．神経細胞
神経細胞は、ｈＥＳ細胞などの多能性幹細胞から、米国特許第６，８３３，２６９号；Carpenteret al., 2001；及び国際公開第０３／０００８６８号（Geron Corporation）に記載される方法により作製することができる。未分化のｈＥＳ細胞又は胚様体細胞は、１つ以上のニューロトロフィン及び１つ以上のマイトジェンを含む培養液中で培養され、少なくとも〜６０％の細胞がＡ２Ｂ５、ポリシアル酸化ＮＣＡＭ、又はネスチンを発現し、培養中に少なくとも２０回倍加することができる細胞集団を作る。マイトジェンの例としては、ＥＧＦ、塩基性ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、及びＩＧＦ−１がある。ニューロトロフィンの例としては、ＮＴ−３及びＢＤＮＦがある。ＴＧＦ−βスーパーファミリーアンタゴニスト、又はｃＡＭＰとアスコルビン酸の組み合わせを用いることで、ドーパミン系神経細胞の特徴であるチロシンヒドロキシラーゼに対して陽性を示す神経細胞の比率を高めることができる。増殖性細胞は、その後、マイトジェンの非存在下でニューロトロフィンとともに培養することで、末端分化が生じる。
オリゴデンドロサイトは、ｈＥＳ細胞などの多能性幹細胞から、ＦＧＦなどのマイトジェン、並びにトリヨードチロニン、セレン、及びレチノイン酸などのオリゴデンドロサイト分化因子を含む培養液中に懸濁させた細胞集合体として培養することで作製することができる。細胞は、その後、固体表面上で培養し、レチノイン酸を取り除き、集団を増殖させる。末端分化は、ポリ−Ｌ−リジン上で培養し、すべての成長因子を取り除くことで生じる。得られる細胞集団では、細胞の８０％以上がＮＧ２プロテオグリカン、Ａ２Ｂ５、及びＰＤＧＦＲαなどのオリゴデンドロサイトマーカーに対して陽性で、神経細胞マーカーＮｅｕＮに対して陰性である。国際公開第０４／００７６９６号、及びKeirstead et al., 2005を参照。網膜色素上皮細胞の誘導についても、報告されている（Klimanskaya etal., 2004）。
Ｃ．心臓細胞
本明細書に記載するｉＰＳ細胞は、米国特許出願第２０１１／００９７７９９号（参照により本明細書に取り込まれる）に記載される方法により、心筋細胞に分化することができる。心筋細胞又は心筋細胞前駆体は、ｈＥＳ細胞などの多能性幹細胞から、国際公開第０３／００６９５０号に記載される方法によって作製することができる。同様にして、ｉＰＳ細胞は、ウシ胎児血清又は血清代替物、さらに必要に応じて、ＤＮＡのメチル化に影響を及ぼす５−アザシチジンなどの心臓作用因子（cardiotrophic factor）を含む懸濁液中で培養することができる。また、心筋細胞塊は、固体基質上でアクチビンＡとともに培養し、その後、ＢＭＰ４などの骨形態形成タンパク質とともに培養し、さらに必要に応じてＩＧＦ−１などのインスリン様成長因子とともに培養することで、得ることができる。必要であれば、密度遠心分離によって、集団中の自発的収縮細胞を他の細胞から分離することができる。
さらなる処理の工程としては、Ｃａｒｄｉａｃ Ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）として知られる集団を形成するように細胞を培養し、単一細胞を取り除き、その後、Ｃａｒｄｉａｃ Ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）を逐次反復で分散、再形成することが含まれる。得られた集団では、細胞の大部分が、ｃＴｎｌ、ｃＴｎＴ、心臓特異的ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、及び転写因子Ｎｋｘ２．５に対して染色陽性である。国際公開第０３／００６９５０号、Xu et al., 2002；及び米国特許出願第２００５／０２１４９３９Ａ１（Geron Corporation）を参照。
Ｄ．その他の細胞型
膵島細胞は、アクチビンＡ、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ブチレートなど）、マイトジェン（ｂＦＧＦなど）；及びＴＧＦ−βスーパーファミリーアンタゴニスト（ノギンなど）から選択されるいくつかの因子の組み合わせを含む培養液中で培養して分化を開始させることで、ｈＥＳ細胞などの多能性幹細胞から分化させることができる（国際公開第０３／０５０２４９号、Geron Corp.）。その後、細胞は、ニコチンアミドとともに培養して成熟させ、細胞の少なくとも５％がＰｄｘ１、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン及び膵臓ポリペプチドを発現する細胞集団を得ることができる。細胞塊は、インスリン生産細胞に富んだ芽を形成することができ、該細胞は濾過により回収することができる。国際公開第０３／０５０２４９号（GeronCorp.）を参照。
造血細胞は、ｈＥＳ細胞などの多能性幹細胞をマウス骨髄細胞と共培養することで作製することができ、又は卵黄嚢内皮細胞を用いて、造血細胞マーカーを有する細胞を作製する（米国特許第６，２８０，７１８号）。また、造血細胞は、米国特許出願第２００３／０１５３０８２Ａ１号及び国際公開第０３／０５０２５１号（Robarts Institute）に記載されるように、幹細胞を造血サイトカイン及び骨形態形成タンパク質とともに培養することでも作製することができる。本明細書に記載するｉＰＳ細胞から造血細胞への分化方法としては、米国特許出願第２０１０／０２１６１８１号及び２０１０／０２７９４０３号に記載されている（いずれも参照により本明細書に取り込まれる）。
間葉系前駆細胞及び線維芽細胞は、国際公開第０３／００４６０５号に記載の方法によって、ｈＥＳ細胞などの多能性幹細胞から作製することができる。ｈＥＳ由来間葉細胞は、その後、骨形態形成タンパク質（特にＢＭＰ４）などの骨形成因子、ヒトＴＧＦ−β受容体のリガンド、又はヒトビタミンＤ受容体のリガンドを含む培養液中で、さらに骨芽系細胞に分化することができる（国際公開第０３／００４６０５号、Sotile et al., 2003）。米国特許出願第２００４／０００９５８９Ａ１（Iskovitz-Elder et al.）及び第２００３／０１６６２７３Ａ１（Kaufmanet al., Wisconsin）では、ヒト胚性幹細胞由来の内皮細胞が報告されている。軟骨細胞又はその前駆細胞は、国際公開第０３／０５０２５０号（GeronCorp.）に記載される分化因子の有効な組み合わせを用いて、微細凝集塊で幹細胞を培養することで作製することができる。
当技術分野で公知の他の分化方法、又はその後に開発されたものを、本発明とともに用いて、他の組織に相応する人工細胞を作ることができる。
以下の実施例は、本発明の好適な実施形態を示す目的で記載される。当業者においては、以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが見出された技術を示しており、そのため、その実施のために好適な形態を構成すると考えられることが理解される。しかし、当業者においては、本開示を踏まえて、本発明の主旨及び範囲から逸脱することなく、開示された具体的な実施形態に多数の変更を加えることができ、その場合でも同じ又は同様の結果が得られることが理解される。
実施例１
リプログラミングのためのＭａｘｉ ＥＢＶ粒子の作製
ＥＢＶ陽性Ｂ細胞のリプログラミングへの受容性がより高いことが示されれば、ＥＢＶ陰性のＢ細胞は、リプログラミング因子をコードし得る人工ＥＢＶ粒子に感染させることで、より感受性を高めることができる。ＥＢＶは、ヒトヘルペスウイルスファミリーの一員で、非常に大きな量のＤＮＡ（≦１６５ｋｂ）を包含することが可能で、これは分子工学上の望ましい特徴である。ＥＢＶの特徴を利用して組換えＥＢＶ由来ベクターを作製することができ、これを、ヘルパー細胞株と組み合わせることで、リプログラミング、形質転換などに不可欠なタンパク質を送達する媒体として働くＭａｘｉ−ＥＢＶ粒子の作製に用いることができる（Wendtner et al., 2003；Delecluse et al., 1999；Delecluse et al., 1998；Hettichet al., 2006）。このような粒子を得るために必要となり得るプロセスの概要を以下に記載する：
最初に、感染Ｂ細胞株を作製するため、ウイルス欠陥ヘルパー細胞株を２９３細胞から作製する：完全長ＥＢＶゲノム（１６５ｋｂ）を、真核細胞プロモーター由来のマーカー遺伝子（８〜１０ｗｋｓ）を同時に含む原核細胞レプリコン上にクローニングする；ＴＲ配列を含まない染色体外ＥＢＶゲノムを２９３細胞に導入し、これによりＥＢＶベクターの全パッケージ機能を提供する；そして、トランスフェクションにより得られるクローン群を維持する。「非トランスフェクション」ミニＥＢＶプラスミドを、以下をコードするように作製する：セレクション（ハイグロマイシン、ＧＦＰ、など）、ＥＢＶ（ＴＲ）の末端反復、２つの複製起点（ｏｒｉＬｙｔ及びｏｒｉＰ）、ＥＢＮＡ−１。ミニＥＢＶプラスミドは、必要に応じて、ＥＢＮＡ−１のリプログラミング遺伝子及び／又は優性阻害誘導体を、場合によっては条件付きオペレーター又はプロモーターとともに、含んでいてもよい。パッケージングしたミニＥＢＶは以下により作製する：人工ウイルス欠陥細胞（上述）にミニＥＢＶプラスミド及びウイルストランス活性化因子を一時的にトランスフェクトする；上清を回収、精製、濃縮する；Ｈｙｇ抵抗性及び／又はＧＦＰ陽性のクローンの感染及びスクリーニングのための試験細胞株を樹立する；そして、より大規模な生産を確立し、ウイルス力価を決定する。その後、一次Ｂ細胞をミニＥＢＶとともにインキュベートして感染させ、次いで４８時間後の感染効率を評価する（蛍光指標を用いた場合）。
実施例２
リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）及び標準Ｂ細胞のリプログラミング
１）リプログラミング試験のための、成熟Ｂ細胞集団の前駆体状態への誘導、又はＰａｘ−５プロＢ細胞の前駆細胞型の単離
成熟Ｂ細胞集団を前駆細胞型に脱分化させるためには、Ｐａｘ−５、Ｂｌｉｍｐ１、Ｏｃｔ２、及びＢｏｂ−１の阻害、又はＣ／ＥＢＰαの発現上昇が必要となる場合がある。
Ｐａｘ−５の発現を低下させるためには、以下の試薬／処理が用いられる：
Ｐａｘ−５の発現を低下させるためには、コハク酸プレドニゾロンナトリウム又はＳＮ３８又はＳＵ１１２７４（Kanteti et al., 2009；Marie-Cardine et al., 2008）などのグルココルチコイド（ＧＣ）で細胞を処理する（Rahmanet al., 2001）。生存細胞をＩＬ−７含有培養液に入れ、プロＢ細胞を成長させる。
Ｂ細胞は、アンチセンスＲＮＡ、小分子干渉ＲＮＡ、リボザイムで処理するか、又はＰａｘ−５阻害オリゴヌクレオチド分子をコードする発現カセットをトランスフェクトする。同様の方法を、Ｂｌｉｍｐ１、Ｏｃｔ２及びＢｏｂ−１に対しても用いることができる。これらの遺伝子をさらにもう一度発現低下させることで、リプログラミングの促進が可能である。
Ｐａｘ−５、Ｂｌｉｍｐ１、Ｏｃｔ２又はＢｏｂ−１の発現低下の代わりに、又はそれに加えて、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子をコードするレトロウイルスに成熟Ｂ細胞を感染させる。Ｃ／ＥＢＰαの発現上昇によって、細胞を骨髄系前駆細胞様状態に誘導し、リプログラミング因子の受容性を高めることができる。この手法は、Jaenisch et al.に略述されている。また、Ｃ／ＥＢＰαの発現カセットは、エレクトロポレーションによって導入することができる。
２）リプログラミング試験のための、Ｐａｘ−５欠損プロＢ細胞前駆細胞型の同定と単離
この方法では、ＣＤ３４、ＣＤ３８及びＣＤ１０抗原を共発現するリンパ球前駆細胞の単離と精製が含まれ得る。
ＣＤ３４＋、ＣＤ１０＋、ＣＤ１９−前駆Ｂ細胞は、Ｐａｘ−５の発現が欠損している。そのため、この細胞集団はリプログラミングの標的細胞型となり得る。
プロＢ細胞は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、Ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ）、及び胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）の組み合わせを用いて、培養液中で増殖させることができる。
第２の方法では、末梢血液から移行Ｂ細胞を単離することを含む。移行Ｂ細胞は、ＣＤ１９（＋）、ＣＤ２４（高）、ＣＤ３８（高）の発現細胞として同定される骨髄（ＢＭ）未成熟Ｂ細胞と末梢成熟Ｂ細胞の重要な関連を特徴づける。これらの細胞は、正常な成人末梢血液中のＢ細胞の約４％を占める（Chung et al., 2003）。
移行Ｂ細胞の発生頻度は、免疫異常及びＨＩＶ患者において増加している。この細胞型は疾患特異的なドナーからｉＰＳ細胞を作製するための標的細胞になり得る。
未成熟Ｂ細胞（Ｐａｘ−５−）細胞、若しくはリンパ球前駆細胞又は移行Ｂ細胞に、リプログラミング因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ又はＫｌｆ４、必要に応じてＬｉｎ２８又はｃ−Ｍｙｃ；図１Ａ〜１Ｂを参照）を含むプラスミドをトランスフェクトする方法を用いて、ｉＰＳＣを作製することができる。
３）ＥＢＶで形質転換した一次Ｂ細胞のリプログラミング
一次Ｂ細胞に対するＥＢＶの効率的な形質転換能力は、リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）を樹立、貯蔵するためにインビボで日常的に用いられている。ウイルスタンパク質ＥＢＮＡ−２及びＬＭＰ−１によって引き起こされるエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）のＩＩＩ型潜伏感染プログラムが、インビボでのＢ細胞の形質転換に直接的に関与している。
ＬＣＬは、上昇したレベルのｃ−Ｍｙｃを発現し、これはＥＢＶに誘導されるＢ細胞増殖に少なくとも部分的に関与している。また、ＬＣＬはＮＦ−κＢの誘導も示し、これは次にアポトーシスからの保護に関与している。
ｃ−Ｍｙｃはリプログラミング因子の１つである。ｃ−Ｍｙｃ又はＳＶ４０−Ｔ抗原を持たないリプログラミング因子をＬＣＬにトランスフェクトすることで、ｉＰＳＣを作製することができる。
ＮＦ−κＢ及びｐ５３の阻害剤は、ＬＣＬのリプログラミング試験の補助剤として用いることができる。
４）受容細胞のトランスフェクション後のケア
受容Ｂ細胞は、Ｂ細胞が生存できる培養液中に置くことができる。トランスフェクション後の最初の数日間では、ＢＬｙＳ、ＢＡＦＦ（Ｂ細胞の必須生存因子である、サイトカインのＴＮＦファミリーのメンバー）、又はＣＤ４０リガンドを加えることで、リプログラミング因子を含むＢ細胞の増殖を増加させることができる（Fu et al., 2009）。
ＬＣＬを用いたリプログラミング試験は、無血清条件で実施することができる。細胞を放射線照射ＭＥＦ又はマトリゲル上に置き、ＭＥＦからの馴化培養液を用いて、又は小分子を含む強化培養液によるＭＥＦフリー条件で、３０日間培養することができる。
化学的なＭＥＦフリーのリプログラミング方法を容易にするいくつかの条件も含まれ得る。
実施例３
Ｐａｘ−５の予防的阻害又はＣ／ＥＢＰα−Ｒ遺伝子の過剰発現を含まない、既知のフィーダーフリー条件を用いたリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）のリプログラミング
一次ＬＣＬは、１０−２０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中で得て増殖させた。培養したＬＣＬに、以下のリプログラミング因子を含むＥＢＶ由来エピソームベクターを、エレクトロポレーションによりトランスフェクションした。
リプログラミングは、以下の３セットのリプログラミング因子を形質導入した３つのＬＣＬ細胞株を用いて実施した：７個のリプログラミング因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２；Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＳＶ４０ラージＴ抗原）、５個のリプログラミング因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２；Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８及びＳＶ４０ラージＴ抗原）、又は４個のリプログラミング因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２；Ｎａｎｏｇ及びＳＶ４０ラージＴ抗原）。
リプログラミングに最適なＤＮＡ濃度は、１〜２μｇであった。トランスフェクションの効率は、ＧＦＰなどの蛍光マーカーを含む関連するプラスミドのバックボーンを用いて評価した。
ＧＦＰ含有プラスミドのトランスフェクション効率は、４０〜９５％であった。ＧＦＰとともにリプログラミング因子を含むプラスミドのトランスフェクション効率は、２〜２０％であった。ＬＣＬは、ｏｒｉＰ含有プラスミドに対して非常に適した細胞型である。
ＭＥＦが存在することで、トランスフェクションしていない細胞の増殖が制御できなくなった。そのため、プロセス全体をフィーダーフリー条件で行った。トランスフェクション後、結合を促進するために細胞をフィーダーフリーの基質上に置いた。基質成分は、マトリゲル（登録商標）、フィブロネクチン、レトロネクチン（登録商標）（フィブロネクチンの断片）、レトロネクチンとマトリゲルとの組み合わせ、ＣｅｌｌＳｔａｒｔ（登録商標）、コラーゲン、又は支持細胞層に代わる任意の成分を含んでいてもよい。トランスフェクション後の細胞の生存率は、約５〜５０％であった。
トランスフェクションした細胞は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２補助剤、Ｂ２７補助剤、１％ＮＥＡＡ、１％グルタマックス、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１００ｎｇ／ｍＬのゼブラフィッシュ塩基性線維芽細胞成長因子（ｚｂＦＧＦ）、０．５μΜのＰＤ０３２５９０１、３μΜのＣＨＩＲ９９０２１、０．５μΜのＡ−８３−０１、１０００Ｕ／ｍＬのヒト組み換えＬＩＦ、及び１０μΜのＨＡ１００（ＣＨＡＬＰ培地）を含む培養液中に置いた。トランスフェクション後の第１週は、１日おきに新しい培養液を細胞に供給した。第２週では、各ウェルから使用済み培養液の半分を穏やかに取り除き、１日おきに新しい培養液を細胞に供給した。培養液の交換は、培養容器表面に付着している細胞が取り除かれないよう、非常に穏やかに行った。トランスフェクションから２〜３週間後、培養液を徐々にｍＴｅＳＲ１又はＴｅＳＲ２に移行した。続く２〜３週間では、１日おきに新しいＴｅＳＲ培地を供給した。
Ｐａｘ−５の発現レベルは、トランスフェクションしていないＬＣＬとトランスフェクションしたＬＣＬで測定した。Ｐａｘ−５のレベルは、トランスフェクションから４〜６日後に、フローサイトメトリーにより定量化した。未トランスフェクションのＬＣＬにおけるＰａｘ−５の発現は、６０〜８５％であった。リプログラミングプラスミドをトランスフェクションしたＬＣＬでは、Ｐａｘ−５の発現が減少した（１０〜６０％）。様々な組み合わせのプラスミドで、異なるレベルのＰａｘ−５発現の低下が見られた（図６Ａ〜６Ｄ）。Ｐａｘ−５発現の阻害が最も高い組み合わせで、ｉＰＳＣが発生した。リプログラミング因子がＰａｘ−５の発現を低下させる正確な仕組みはわかっていない。小分子の存在下でのエピソームによるフィーダーフリーのリプログラミングは、内因性Ｐａｘ−５発現の低下をもたらし、そしてこれによりＬＣＬ由来ｉＰＳＣの発生を促進することができる。さらに詳細な分析により、リプログラミングプロセスに適切なＰａｘ−５発現の閾値が１０〜３０％であることが明らかとなった。６５〜９０％のＰａｘ−５阻害をもたらすリプログラミング条件によりｉＰＳＣが得られるが、次善の阻害である２０〜５０％では、ＬＣＬからｉＰＳＣへのリプログラミングに適切ではなかった。
ＬＣＬの培養細胞に、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子をコードするプラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクションした遺伝子の存在はＰＣＲで確認した。Ｃ／ＥＢＰαの過剰発現細胞の選択は、細胞をＧ４１８含有培養液中に置くことで行った。選択後、細胞にリプログラミング因子をトランスフェクションした。別の方法では、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子をコードするプラスミドをリプログラミング因子とともにＬＣＬにトランスフェクションした。
接着したコロニーがウェル内に出現し、ＬＣＬの形態が懸濁した細胞型から接着細胞型に変化した。接着したコロニーを取り、マトリゲルでコーティングしたプレート上で増殖させた。コロニーは、徐々にｉＰＳ様コロニーの標準的形態を獲得し始めた。Ｔｒａ−１−６０による生染色を行い、コロニーのｉＰＳ状態を確認した（図２Ａ〜２Ｂ、３Ａ〜３Ｂ、４Ａ〜４Ｂ、及び４Ａ〜５Ｂ）。リプログラミング因子のみをトランスフェクションしたＬＣＬが、ｉＰＳコロニーであることが確認された。リプログラミング以前のＣ／ＥＢＰα遺伝子の過剰発現、又はＰａｘ−５の発現抑制は、ＬＣＬのリプログラミングに必須ではなかった。
トランスフェクションしたＬＣＬを、ｈＥＳＣ培養液又はＭＥＦ馴化培地の存在下で、放射線照射したＭＥＦ上に置くことにより、未トランスフェクションＬＣＬの増殖が見られた。フィーダー及びＫＯＳＲ含有培養液の存在下では、トランスフェクション後、急速に培養細胞が増殖した。Ｂ細胞のリプログラミングでは、フィーダーフリー条件が適切であった。
実施例４
ｉＰＳコロニーから残留ＥＢＶを取り除く方法
ＥＢＶはＢ細胞に選択的に感染し（例えば、リンパ芽球株を産生する）、細胞から失われないため、宿主細胞に選択的優位性をもたらす。そのため、可能性の１つとして、ＥＢＶのｏｒｉＰレプリコンを有するプラスミドが、他の細胞型に比べて、これらの細胞内でより有利に遺伝子発現及びプラスミド保持を促進することができる。例えば、これらの感染細胞にすでに存在するＥＢＮＡ−１は、リプログラミング因子をコードする新たに導入されたｏｒｉＰプラスミドの保持を促進することで補完し、リプログラミングが確実に行われるように発現のための十分な時間を確保すると考えられる。一旦ｉＰＳ細胞への移行が起きると、内因性ＥＢＶ及びトランスフェクションしたｏｒｉＰ由来プラスミドは、細胞に選択的優位性をもたらさないため、自然に細胞から失われると考えられる。一方、これらのエピソームが失われる速度は、望ましい速度からは非常に遅い場合がある。
これらの可能性のいずれかを目的として、ＥＢＶ及びその関連するｏｒｉＰ由来ＤＮＡを細胞から強制的に取り除く方法としては、３つの考えられる方法がある。第１に、トランスフェクションしたｏｒｉＰ由来プラスミドは、得られるｉＰＳクローンに選択的優位性をもたらさないと考えられるため、細胞分裂の過程で細胞から徐々に自然に失われる。プラスミドを含まないことに成功したクローンを同定するには、分子スクリーニングを用いることが考えられる。第２に、薬剤耐性、蛍光、又は細胞表面マーカー（例えば、ハイグロマイシン、ＧＦＰ、ＣＤ４など）などの選択マーカーをコードすることで、トランスフェクションしたｏｒｉＰ由来プラスミドを保持し続けている細胞を選択するカセットに、プラスミドを組み込むことができる。しかし、この方法では、宿主細胞に存在し続けている可能性のある内因性ＥＢＶを取り除くことができない。
そのため、第３の方法として、野生型ＥＢＮＡ−１の機能を阻害する優性阻害体として作用するＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするカセットに、トランスフェクションしたＤＮＡを組み込む。あるいは、ＥＢＮＡ−１の優性阻害体であるＴａｔ融合タンパク質（Ｔａｔはタンパク質形質導入ドメイン）を作製して、ｉＰＳ細胞に加えることができる。
アミノ末端側半分を欠損しながら、核に局在してＤＮＡに結合する能力を保持しているＥＢＮＡ−１の誘導体は、細胞からｏｒｉＰ含有プラスミドの除去を促進する、よく研究されたＥＢＮＡ−１の阻害剤である（Kirchmaier and Sugden, 1997；Kennedy et al., 2003；Mack and Sugden,2008）。このＥＢＮＡ−１のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）変異体は、ヘテロ二量体を形成することで野生型ＥＢＮＡ−１と競合し、ｏｒｉＰ ＤＮＡ内の部位に結合し、ｏｒｉＰ含有プラスミドの複製を補助するＥＢＮＡ−１の能力を阻害することで、プラスミドＤＮＡが除去される。ｏｒｉＰレプリコンは野生型ＥＢＶプラスミドにも見られることから、これらもＤＢＤタンパク質の存在下で細胞から除去される。そのため、一旦リプログラミングに成功すれば、初期トランスフェクションからの残留ｏｒｉＰ由来プラスミドを誘導してＥＢＮＡ−１のＤＢＤドメインを発現させる（図１Ａ〜１Ｂ）か、又は別のプラスミドから導入することができる。
ＥＢＮＡ−１の選択又は優性阻害誘導体をコードするカセットの発現は、条件的プロモーターによって誘導される（図１Ａ〜１Ｂ）。このプロモーターは、エストロゲン、テトラサイクリン、又は、Ｎａｎｏｇ若しくはＯｃｔ４タンパク質の存在に対して反応する。エストロゲン受容体は転写調節因子として働き、エストロゲンに反応して核に移動し、そこでＤＮＡ内の応答配列に結合する。これは、漏出の可能性があるが、テトラサイクリン系と比べて素早く応答する。Ｔｅｔ系は、調節が高度であり、漏出しにくい点で有利である。例えば、本発明の所望の遺伝子の発現レベルは、系に加えるドキシサイクリンの量と相関する。条件的にＮａｎｏｇ又はＯｃｔ４の存在に基づく発現系は、細胞が多能性に関連する性質を獲得したことを確実にする。Ｏｃｔ４又はＮａｎｏｇのレベルが高いほど、ＥＢＮＡ−１の薬剤選択又は優性阻害誘導体をコードするカセットからの発現レベルが高くなると考えられる。
実施例５
ｉＰＳコロニーから残留ＥＢＶを取り除く別の方法
ｉＰＳコロニーが形成された後、残留ＥＢＶは、試薬を含む培養液を供給し、以下に詳述する方法を用いる第４の方法で取り除くこともできる。生存クローンを選別することで、ＥＢＶが存在しないことを示すことができる。
ｉＰＳコロニーから残留ＥＢＶを取り除くために、以下の方法を用いることができる：
アシクロビル［９−（２−ヒドロキシエトキシメチル）グアニン］、ＥＢＶの溶解的複製に対して効果を持つ臨床的に有用な最初の薬剤。
３つのヌクレオシド類似体であるＥ−５−（２−ブロモビニル）−２’−デオキシウリジン、１−（２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードシトシン、及び１−（２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウラシルは、インビトロで効果を有するＥＢＶ複製阻害剤である（Lin et al., 1983）。
β−Ｌ−５−ヨードジオキソランウラシルは、強い抗エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）活性を有し（５０％有効濃度＝０．０３μＭ）、細胞毒性が低い（５０％細胞毒性濃度＝１，０００μＭ）。これは、複製可能なＥＢＶのＤＮＡとウイルスタンパク質の合成を抑制することで抗ウイルス活性を発現する（Kira et al., 2000）。
３’−アジド−３’−デオキシチミジンと、α及びγインターフェロンとの組み合わせを用いて、ＥＢＶを受容細胞から取り除くことができる。
グアニン四重鎖特異的化合物であるＴＭＰｙＰ３、ＴＭＰｙＰ４、及びＢＲＡＣＯ−１９の培養液への添加を用いることができる。これらの化合物は、ＥＢＶの増殖を阻害し、ＥＢＮＡ−１が分裂中期の染色体に結びつく能力を妨げる（Norseen et al., 2009）。
Ｈｓｐ９０阻害剤は、正常細胞に対しては無害な投与量で、樹立したＥＢＶ−転換リンパ芽球様細胞株の細胞死を誘導し、そして、Ｇｌｙ−Ａｌａ反復配列を欠損した機能性ＥＢＮＡ−１変異体を発現するレトロウイルスにリンパ芽球様細胞を安定的に感染させた場合、この効果は実質的に逆転する（Sun et al., 2010）。ＥＢＶと野生型ＥＢＮＡ−１を保持するｉＰＳ細胞は、特異的に標的化及び選択される。
ＬＣＬはｃ−Ｍｙｃを過剰発現するため、残りのリプログラミングされていない細胞及び部分的にリプログラミングされたｉＰＳコロニーは、ｃ−Ｍｙｃを発現し続ける。化学阻害剤（１００５８−Ｆ４）によるｃ−Ｍｙｃの不活性化、又は優性阻害ｃ−Ｍｙｃの条件的発現を用いて、ｃ−Ｍｙｃを発現する細胞を取り除くことができる。
実施例６
ＥＢＶフリーの誘導多能性幹細胞にリプログラミングされたリンパ芽球様Ｂ細胞株
簡単に述べると、リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）はＣｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓより入手し、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を用いて維持した。細胞は、前述のｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ−１由来のエピソームベクターを用いてトランスフェクションした（Yu et al., 2009；Yu et al., 2007）。トランスフェクション後、マトリゲルでコーティングした組織培養プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、細胞をリプログラミング培養液（ＲＭ）中に２〜３週間置き（Yuet al.,；２０１０年１２月に提出された文献）、次いで、ＴｅＳＲ−２培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でさらに２週間維持した。ｉＰＳＣ様コロニーを最初に手動で選択し、マトリゲルコーティングプレート上でＴｅＳＲ−２培地を用いて増殖させた。フローサイトメトリー、ＰＣＲ、及びテラトーマ分析により、４つのＬＣＬ−ｉＰＳＣの特性評価を行った（Yuet al., 2009）。ｉＣｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ（登録商標）、ｉＣｅｌｌ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ（登録商標）、及びｉＣｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ（登録商標）（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の開発において確立されたプロトコールに従って、神経系、造血系、心臓系、及び肝細胞系へのインビトロでの分化を行った。ＥＢＶの存在を、ＲＴ−ＰＣＲ、ゲノムＤＮＡ ＰＣＲ、及び免疫組織化学的試験により評価し、ＥＢＮＡ−１タンパク質の検出を行った。ＬＣＬ−ｉＰＳＣの核型をＧバンド法（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）により分析した。親系統との遺伝的同一性を、短反復配列（ＳＴＲ）分析（Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）により確認した。ＩｇＧＨ受容体再配列分析を、親系統及びＬＣＬ−ｉＰＳＣに対して行った（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃｓ）。
ＬＣＬは、Yu et al.（２０１０年１２月に提出された文献）に記載されるフィーダーフリー条件で、リプログラミング遺伝子をコードするｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ−１プラスミドの単一トランスフェクションによって、リプログラミングした。ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ−１−ＧＦＰプラスミドをトランスフェクションしたＬＣＬでは、トランスフェクション効率は５０〜８０％で、生存率は５０〜７０％であった（データ掲載せず）。ＬＣＬは、トランスフェクション後、速やかにマトリゲルコーティングプレート上に置き、リプログラミング培養液で２〜３週間培養した。トランスフェクション後およそ２週間で、接着性コロニーが観察され（図７Ａ）、その後、培養液をＴｅＳＲ−２に移行した。ＴｅＳＲ−２培地中で約２週間培養した後、Ｔｒａ−１−６０発現の生細胞染色によって、コロニーの多能性状態を確認した（図７Ｃｉ）。様々な用量及び組み合わせのリプログラミングプラスミドで、ＬＣＬのリプログラミングが可能である（図７Ｂ）。Ｌ−Ｍｙｃ及びｃ−Ｍｙｃでは、ＬＣＬからのｉＰＳＣ発生で同等の効率が示された。Ｔｒａ−１−６０染色により、接着性コロニー全体の３〜１１％がｉＰＳＣであることが確認された。７週目の時点で確認されたＴｒａ−１−６０陽性コロニーの数は、トランスフェクション後５週目の時点のコロニー数よりも多く、標準的ｉＰＳＣへの接着性コロニーの転換を裏付けている。これはさらに、アルカリホスファターゼ染色によっても確認された（データ掲載せず）。この方法によるＬＣＬ−ｉＰＳＣの作製は、エピソームリプログラミングによる線維芽細胞及びケラチン生成細胞からのｉＰＳＣ作製（Okitaet al., 2010；Carey et al., 2009；Okita et al., 2008）や、ウイルスを用いてリプログラミングした高分化型マウスＢ細胞（Hannaet al., 2008）の平均的効率よりも効率が高いが、臍帯血のエピソームリプログラミングほどは効率的ではない（Yu et al.,；２０１０年１２月に提出された文献）。最近の発見によれば、「オープン」なクロマチンの状態が、多能性の維持に寄与することが示されている（Gaspar-Maiaet al., 2011）。ＥＢＮＡ−１は、クロマチン構造を維持してウイルス複製を調節する細胞性転写因子の広範な再配列を調整することが示されている。Ｂ細胞の形質転換及び他のウイルスタンパク質の発現中に誘導されるＥＢＮＡ−１の多面効果は、一次細胞に比べてＬＣＬにおけるリプログラミングプロセスを好む可能性がある（Sompallaeet al., 2010）。
各ＬＣＬから得られた２つのクローンについて、詳細な特性評価を行った。ＬＣＬ−１から得られたｉＰＳＣを、ＬＣＬ−ｉＰＳ１ａ及び１ｂと呼び、ＬＣＬ−２から得られたものをＬＣＬ−ｉＰＳ２ａ及びｉＰＳ２ｂと呼ぶ。すべてのＬＣＬ−ｉＰＳクローンで、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−８１及びＯＣＴ３／４の発現が９０％を超え（図７Ｃｉｉ）、正常な核型を有していた（図７Ｃｉｉｉ）。ＲＴ−ＰＣＲ分析では、多能性関連転写物の強い発現が示され（図７Ｃｉｖ）、またリプログラミング因子が存在しないことが示された（図７Ｅ−７Ｆ）。４つすべてのＬＣＬ−ｉＰＳＣで、高分化の奇形腫が発生し、中胚葉（軟骨組織）、杯状細胞（内胚葉）、及び神経ロゼット（外胚葉）の存在が見られた（図７Ｄ）。ＬＣＬ−ｉＰＳＣのインビトロ分化は、３Ｄ懸濁培養液を用いて行った。内胚葉のポテンシャルは、肝細胞様細胞を作製し、α１−アンチトリプシン陽性細胞を定量化することで確認した（図８Ｄｉ）。外胚葉のポテンシャルは、β３−チューブリン／ネスチン二重陽性神経前駆細胞の発生、及びβ３−チューブリン陽性神経培養細胞の存在で確認した（図８Ｄｉｉｉ〜ｉｖ）。中胚葉のポテンシャルは、心筋細胞及び多能性ＨＰＣを作製することで確認した。ＬＣＬ−ｉＰＳＣは、分化１４日目に、２〜１５％の心筋トロポニンＴ陽性細胞を発現し、拍動する凝集塊が発生した（図８Ｄｉｉ）。ＬＣＬ−ｉＰＳＣは、ＨＰＣを発現して、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ４３＋、ＣＤ４１＋及びＣＤ２３５ａを発生し、メチルセルロースを用いたコロニー形成アッセイでコロニーを形成し、その後、巨核球、マクロファージ、及び顆粒球などの既知の細胞型を発生した（図８Ｄｖ〜ｖｉｉ）。このように、ＬＣＬ−ｉＰＳＣは、高分化の細胞系を発生することができる。ＬＣＬ−ｉＰＳＣは、親ＬＣＬとの同一性を保持し、少なくとも５０代まで継代が可能である。ＬＣＬ−ｉＰＳＣは、親ＬＣＬと同様のクローンＩｇＧＨ再配列特性を示した（図８Ｅ）。ＩｇＧＨスペクトルは、ＬＣＬ−ｉＰＳＣのクローン追跡手段として用いることができる（Kuppers, 2009；van Dongen et al., 2003）。
ＥＢＮＡ−１は、エピソームの潜伏感染の確立、ＬＣＬの長期生存（Leight andSugden, 2000；Altmann et al., 2006）に必要であり、また、宿主細胞内でのＥＢＶ感染の持続に不可欠な唯一のウイルスタンパク質である。ＬＣＬ−ｉＰＳＣは、初期継代及び後期継代において、ＥＢＮＡ−１の存在を検査した。２５継代以降のＬＣＬ−ｉＰＳＣにおいて、ゲノム／エピソームレベル、転写レベル（図８Ａ〜８Ｂ）、及びタンパク質レベル（図８Ｃ）で、ＥＢＮＡ−１の発現は検出されなかった。しかし、ＥＢＶは、静止細胞において、潜在型０で、ＥＢＮＡ−１の検出可能な発現なしに存在し続けることができる（Thorley-Lawsonand Gross, 2004）。そのため、ＥＢＮＡ−１の発現が見られない（図８Ａ）ということだけで、ＥＢＶの消失を明確に示すことはできない。検出可能なＥＢＮＡ−１及びｏｒｉＰ配列が存在しないこと、並びに別のウイルス潜在遺伝子ＥＢＮＡ−２及びＬＭＰ−２Ａ、また溶菌遺伝子ＢＺＬＦ−１が存在しないこと（図８Ａ〜８Ｂ）で、リプログラミングプロセスの結果、ウイルス性成分が失われたことを確認した。ＬＣＬ−ｉＰＳＣ中のＥＢＶが完全に失われたことを実証するには詳細な分析が必要であるが、ＥＢＶを含まないＬＣＬ−ｉＰＳＣ、又はＥＢＶを含まないＬＣＬ−ｉＰＳＣに由来する既知の細胞型の作製により、これらの細胞の将来的な移植研究に向けた臨床応用の可能性が考えられる。
ｉＰＳＣの細胞培養と維持
リンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）は、１５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベータ内で維持した。ＬＣＬからのｉＰＳＣの誘導は、マトリゲルでコーティングした組織培養プレート上で行った。トランスフェクションの１２時間後に、細胞をリプログラミング培養液に移行した。リプログラミング培養液は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２に、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、グルタマックス、Ｎ２、Ｂ２７（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１００ｎｇ／ｍＬのゼブラフィッシュ塩基性線維芽細胞成長因子（ｚｂＦＧＦ）、０．５μΜのＰＤ０３２５９０１、３μΜのＣＨＩＲ９９０２１、０．５μΜのＡ−８３−０１（すべてＳｔｅｍｇｅｎｔから）、１０００ユニット／ｍＬのｈＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、及び１０μΜのＨＡ−１００（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を加えたものからなる。２週間は、１日おきに新しい培養液を細胞に供給した。１４〜２０日で、培養液をＴｅＳＲ２に移行した。トランスフェクション後１４〜２０日では、ｉＰＳコロニーと同様の形態のコロニーが容易に観察された。正確なｉＰＳコロニーの存在を、形態学的に、及びＴｒａ−１−６０抗体による生細胞染色により確認した。すべてのＬＣＬ由来ｉＰＳ細胞を、マトリゲルでコーティングした組織培養皿上で、ＴｅＳＲ−２完全培地（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で維持した。
エピソームベクター
ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ−１由来エピソームベクターの構築は、Ｙｕらにより述べられている（Yuet al., 2009）。ＬＣＬ−ｉＰＳＣの作製には、６つのリプログラミングプラスミドを用いた。簡単に述べると、ＯＳＮＫは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ２）を媒介したＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＫＬＦ４の発現を利用するｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ−１プラスミドである。以下のプラスミドは、発現のために同じバックボーンを利用する：ＯＳＴＫは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＳＶ４０ラージＴ抗原及びＫＬＦ４をコードし、ＯＳＮＬは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬｉｎ２８をコードし、ＯＳＴＮは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＳＶ４０ラージＴ抗原及びＮＡＮＯＧをコードし、ｃ−ｍＬはｃ−ＭＹＣ及びＬＩＮ２８をコードし、Ｌ−ｍＬはＬ−ＭＹＣ及びＬＩＮ２８をコードする。
ＬＣＬのリプログラミング
上述及び図８Ｂに記載するエピソームベクターの様々な組み合わせを用いたＬＣＬのリプログラミングは、ヒトＢ細胞９６ウェルＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ｌｏｎｚａ）及びプログラムＥ０〜１００を用いたヌクレオフェクションにより、１反応当たり１〜２μｇのＤＮＡを用いて実施した。ヌクレオフェクションを行った細胞（１条件当たり〜１．０Ｅ＋０６個の細胞）は、数時間回復させ、マトリゲルでコーティングした６ウェルプレートでリプログラミング培養液中に直接蒔いた。
免疫蛍光、免疫ペルオキシダーゼ、及びアルカリホスファターゼ染色
細胞を、１０μｇのＴｒａ−１−６０一次抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とともに１時間インキュベートして、ＤＭＥＭ／Ｆ１２で簡単に３回洗い、その後、ＩｇＭ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８複合二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１：１００で希釈したものとともに、３０分間インキュベートして、Ｔｒａ−１−６０生細胞染色を行った。染色された細胞を洗い、Ｔｒａ−１−６０コロニーを蛍光顕微鏡で可視化した。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色は、Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｌｕｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ ＩＩＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、製造者の指示に従って実施した。
サイトスピン細胞調製物は、親ＬＣＬ及びＬＣＬ−ｉＰＳＣの細胞懸濁物から作製し、アセトンで固定した。次に、スライドグラスをＰＢＳ中で再水和し、０．５％トリトンのＰＢＳ溶液で透過処理し、そして１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて室温で１時間ブロックした。抗ＥＢＮＡ−１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、クローン０２１１）を用いて、サイトスピンを４℃で一晩染色した。切片を洗い、ヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ又は関連するイソタイプ対照抗体で染色した。ジアミノベンジジンでシグナルを可視化し、スライドグラスを対比のためにヘマトキシリンで対比染色した。
画像は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ−７１とＯｌｙｍｐｕｓ ＤＰ−７０カメラにより記録した。
ＲＴ−ＰＣＲ
各試料の全ＲＮＡ及びｃＤＮＡは、それぞれ、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｐｌｕｓキット（Ｑｉａｇｅｎ）とＩｍｐｒｏｍ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、製造者の指示に従って調製した。導入遺伝子及び内因性ｍＲＮＡの発現を分析するＲＴ−ＰＣＲは、Ｙｕら（２００７）によって述べられたプライマーを用いて実施した。追加されたＥＢＶ遺伝子の検出に用いられたプライマーは以下である：ＥＢＮＡ−２ Ｆ ５’−ＣＡＴ ＡＧＡ ＡＧＡ ＡＧＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＴＧＡ ＡＧＡ −３’（配列番号１）及びＥＢＮＡ−２ Ｒ ５’−ＧＴＡ ＧＧＧ ＡＴＴ ＣＧＡ ＧＧＧ ＡＡＴ ＴＡＣ ＴＧＡ−３’（配列番号２）、ＬＭＰ−２Ａ Ｆ ５’−ＡＧＧ ＡＡＣ ＧＴＧ ＡＡＴ ＣＴＡ ＡＴＧ ＡＡＧ Ａ−３’（配列番号３）及びＬＭＰ−２Ａ Ｒ ５’−ＡＡＧ ＴＧＡ ＣＡＡ ＣＣＧ ＣＡＧ ＴＡＡ ＧＣＡ−３’、ＢＺＬＦ−１ Ｆ ５’（配列番号４）−ＣＡＣ ＧＧＴ ＡＧＴ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＴＴ ＧＣ−３’（配列番号５）及びＢＺＬＦ−１ Ｒ ５’−ＣＣＣ ＡＧＡ ＡＴＣ ＡＡＣ ＡＧＡ ＣＴＡ ＡＣＣ ＡＡＧ ＣＣＧ−３’（配列番号６）。ＰＣＲは、１μＬの希釈ｃＤＮＡテンプレート（１：２）を用いて、３０〜３５サイクルで、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒により行った。
ゲノム／エピソームＤＮＡのＰＣＲ
全細胞性ＤＮＡ及びウイルスＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従って単離した。エピソームリプログラミングベクター及びウイルスＤＮＡを検出するＰＣＲを、前述のプライマー（Yu et al., 2009；Yu et al., 2007）又は上述のプライマーセットを用いて実施した。ＰＣＲは、１反応当たり１５０ｎｇのｇＤＮＡを用いて、３０〜３５サイクルで、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒により行った。
インビトロ分化
すべてのインビトロ分化試験では、マトリゲル上で２５継代を超えて維持されているＬＣＬ−ｉＰＳＣを用いた。
ＴｒｙｐＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、内胚葉、神経、心臓、及び造血系培養細胞を解離して単一細胞懸濁液とし、第１の工程には、超低接着表面フラスコ中で、ｒｏｃｋ阻害剤Ｈ１１５２（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で、凝集塊を２４時間形成させることを含む。
造血系の分化は、ＮＥＡＡ、Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２％のＳＲ３（Ｓｉｇｍａ）を添加したＩＭＤＭ培養液中に細胞を置き、２５ｎｇ／ｍＬのｚｂＦＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＶＥＧＦ、２５ｎｇ／ｍＬのｒｈＦｌｔ−３リガンド、２５ｎｇ／ｍＬのｒｈＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−３、及び２５ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−６（すべてＰｒｏＳｐｅｃ−Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．から）の存在下で、１２日間行った。細胞を回収し、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ４１及びＣＤ２３５ａの存在に対して染色し、フローサイトメトリーで分析した。個別化した細胞を、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培養液中に置き、製造者の指示に従って、コロニー形成率を定量化した。
ＬＣＬ−ｉＰＳＣから得たＨＰＣを、ＭｅｇａＣｕｌｔ（登録商標）−Ｃコラーゲン系培養液（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に置き、巨核球前駆細胞を検出した。１０日後にＭｅｇａｃｕｌｔ培養物を染色し、巨核球上のＭｋ特異的抗原ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＣＤ４１）の存在を、製造者の指示に従って検出した。
ＬＣＬ−ｉＰＳＣから得たＨＰＣを１０日間増殖させ、骨髄系細胞を増やした。１％Ｅｘｃｙｔｅ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、モノチオグリセロール（４５０μΜ、Ｓｉｇｍａ）、ＮＥＡＡ（０．１ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ、ＰｒｏＳｐｅｃ−Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．）を加えたＳＦＥＭ培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に置いた。サイトスピンにライト染色を行い、異なる細胞型の存在を検出した。また、フローサイトメトリーにより、培養細胞をマクロファージ（ＣＤ６８）、顆粒球（ＣＤ１５）及び単球（ＣＤ１４）に特異的な抗原に対して染色した（データ掲載せず）。
心臓系の分化は、１０％ＦＢＳ及びｚｂＦＧＦ−２を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２中に凝集塊を７日間置き、続いて１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２に移行して８日間置くことで行った。分化１４日目に、拍動する凝集塊を解離し、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）（Ａｂｃａｍ）の存在に対して染色した。
神経系の分化は、１％のＮ２添加剤、０．５〜１μΜのドルソモルフィン、及び５μΜのＳＢ４３１５４２（ともにＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２中に凝集塊を１週間置き、続いて、Ｎ２及びＢ２７添加剤のみを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２に移行してさらに２週間置くことで、誘導した。神経凝集塊は、分化のおよそ２０日目に個別化し、マトリゲルコーティングプレート上でさらに１〜２週間培養した。β３−チューブリン及びネスチンの発現をフローサイトメトリーにより定量化した。また、細胞は、免疫蛍光によりβ３−チューブリンの存在を検出するために染色し、核は、ＤＮＡ染色のためにヘキストで対比染色した。抗チューブリン抗体及び抗ネスチン抗体は、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎより購入した。
内胚葉の分化は、２％のＮ２添加剤及び５０〜１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培養液中に、凝集塊を最初の３〜４日間置き、その後２週間、１０〜５０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ｚｂＦＧＦ−２及びＨＧＦ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を加えることで、誘導した。肝細胞様細胞は、オンコスタチンＭ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）の存在下で成熟させ、培養細胞を分化３３日目に回収した。
奇形腫形成
マトリゲルコーティングプレート上でＴｅＳＲ−２の存在下で維持したＬＣＬ−ｉＰＳＣを、コラゲナーゼＩＶを用いて回収し、ＳＣＩＤ／ベージュマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ウィスコンシン州マディソン）の後肢に筋肉内投与した。１細胞株につき３個体のマウスにそれぞれ６ウェルプレートの細胞を投与した。投与前に、細胞懸濁液に総体積の１／３のマトリゲルを加えた。８〜１０週目に腫瘍が形成され、ウィスコンシン大学マディソン校に設置されたＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ＳｕｒｇｅｒｙのＩｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｅ Ｓｅｒｖｉｃｅによって、ヘマトキシリン及びエオシン染色、並びに組織学的解析のための処理が行われた。動物実験は、すべて、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに認可された関連する国内及び国際ガイドラインに従って実施した。
ＤＮＡフィンガープリント法
ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＬＣＬ−ｉＰＳＣ及び親ＬＣＬからゲノムＤＮＡを単離した。試料は、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ及びＣｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓに送り、短反復配列（ＳＴＲ）分析を行った。８つのＳＴＲ遺伝子座の遺伝子型について、親ＬＣＬ及びＬＣＬ−ｉＰＳＣで分析を行った。
核型分析
ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって、Ｇバンド分析が行われた。
ＩｇＧＨ再配列分析
製造者のプロトコールに従って（ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅキットを用いて）、親ＬＣＬ及びＬＣＬ−ｉＰＳＣからゲノムＤＮＡを単離した。３つの免疫グロブリン重鎖フレームワーク領域の特徴的なモノクローナルアンプリコンを検出するため、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃｓにより、多重ＰＣＲ反応を用いたＩｇＧ重鎖遺伝子再配列アッセイが実施された。
フローサイトメトリー分析
マトリゲル上で維持したＬＣＬ−ｉＰＳＣを回収し、Ｔｒａ−１−８１（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８複合ＴＲＡ−１−８１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、及びＳＳＥＡ−４（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、クローンＭＣ８１３−７０）の存在に対して染色を行った。ヨウ化プロピジウムで染色した死細胞は、分析から除外した。２％パラホルムアルデヒドで固定化し、ＰＢＳ＋０．１％サポニンで透過処理した細胞に、細胞内ＯＣＴ３／４（ＢＤ、クローン４０／ＯＣＴ−３）染色を行った。細胞は一晩かけて行い、翌日にフローサイトメーター（Ａｃｃｕｒｉ）で分析した。イソタイプの抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を対照として用いた。
インビトロ分化試験のため、ＬＣＬ−ｉＰＳＣは、多クローン性のα１−アンチトリプシン抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて染色し、肝細胞様細胞の定量化を行った。ＬＣＬ−ｉＰＳＣから得た神経前駆細胞は、抗チューブリン（ＴＵＪ１）及びネスチン（２５ ＮＥＳＴＩＮ）、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎを用いて染色した。心臓の分化では、細胞は抗心筋トロポニンＴ抗体（Ａｂｃａｍ、クローン１Ｃ１１）を用いて染色した。ＬＣＬ由来ＨＰＣは、造血前駆細胞を、ｐａｎＣＤ４５（クローンＨＩ３０）；ＣＤ４３（クローン１Ｇ１０）；ＣＤ３４（クローン５８１）；ＣＤ４１（クローンＨＩＰ８）；ＣＤ２３５ａ（クローンＨＩＲ２）抗体（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）で表面染色することで定量化した。
本明細書において開示及び請求するすべての方法は、本開示に照らして過度の実験を行うことなく実施し、達成することができる。本発明の組成物及び方法は、好適な実施形態という観点で記載されているが、当業者においては、本発明の概念、主旨、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載する方法、及びそれらの工程又は工程の順番を変更可能であることが容易に理解される。より具体的には、本明細書に記載する薬剤に代えて、化学的かつ生理学的に関連している特定の薬剤を用いて、同じ又は同様の結果が達成されることが容易に理解される。このような、当業者に容易に理解される類似した代替物及び変更は、すべて、別紙の特許請求の範囲により定義される本発明の主旨、範囲、及び概念に含まれるものとみなされる。
（参考文献）
以下の参考文献は、本明細書に記載するものを補足する例示的な方法又は他に関する詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に明示的に取り込まれる。

Claims (22)

  1. 不死化したＢ細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を作製する方法であって、
    ａ）１つ以上の不死化させるエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）要素により不死化された不死化Ｂ細胞を取得することと、
    ｂ）前記不死化Ｂ細胞を、該細胞内で外来性リプログラミング因子の発現を起こすことによってリプログラミングし、それによりｉＰＳ細胞を作製することと、
    を含む、前記方法。
  2. 前記ｉＰＳ細胞から前記ＥＢＶ要素を除去することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＥＢＶ要素を本質的に含まないｉＰＳ細胞を単離または濃縮することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  4. 不死化前の前記Ｂ細胞が血液サンプルから取得されている、請求項１に記載の方法。
  5. 前記血液サンプルが約０．０１ｍＬ〜約５ｍＬの容量を有する、請求項４に記載の方法。
  6. 前記血液サンプルが約０．１ｍＬ〜約０．５ｍＬの容量を有する、請求項５に記載の方法。
  7. 前記不死化Ｂ細胞が、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）要素を使用してＢ細胞を不死化することにより取得される、請求項１に記載の方法。
  8. 前記不死化させるＥＢＶ要素が、誘導性の外来性リプログラミング発現カセットを含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記不死化Ｂ細胞が、樹立リンパ芽球様細胞株から取得される、請求項１に記載の方法。
  10. リプログラミングは、１つ以上のリプログラミングエピソームベクター要素を前記不死化Ｂ細胞に導入することを含む、請求項１に記載の方法。
  11. リプログラミングは、前記不死化Ｂ細胞をフィーダー層の非存在下で培養することを含む、請求項１に記載の方法。
  12. リプログラミングは、前記不死化Ｂ細胞と１つ以上のシグナル伝達阻害剤を接触させることをさらに含み、該シグナル伝達阻害剤には、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ−３）阻害剤、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）受容体阻害剤、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｐ５３阻害剤、ＮＦ−κＢ阻害剤、またはこれらの組み合わせが含まれる、請求項１に記載の方法。
  13. リプログラミングは、前記不死化Ｂ細胞を線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  14. リプログラミングは、Ｐａｘ−５に特異的な阻害性ヌクレオチドを前記不死化Ｂ細胞に導入することを含まない、請求項１に記載の方法。
  15. リプログラミングは、前記不死化Ｂ細胞内における外来性Ｃ／ＥＢＰαの発現を含まない、請求項１に記載の方法。
  16. 前記ｉＰＳ細胞を心臓細胞、造血細胞、神経細胞、または肝細胞にインビトロで分化させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  17. 胚性幹細胞と比較して不完全なＢ細胞免疫グロブリン可変領域遺伝子セットを含むゲノムを有するヒトｉＰＳ細胞であって、外来性遺伝的要素を本質的に含まないヒトｉＰＳ細胞。
  18. 前記ゲノムが、選択された遺伝マーカーを含む、請求項１７に記載のヒトｉＰＳ細胞。
  19. 前記選択された遺伝マーカーが、選択された疾患の遺伝マーカーである、請求項１８に記載のヒトｉＰＳ細胞。
  20. 前記ゲノムが不死化Ｂ細胞に由来する、請求項１７に記載のヒトｉＰＳ細胞。
  21. 正常な核型を有する、請求項２０に記載のヒトｉＰＳ細胞。
  22. 請求項１７に記載のヒトｉＰＳ細胞に由来する、分化した細胞、組織、または器官。
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