KR101781546B1 - 뎅기 바이러스 세로타입 1 e 프로틴에 특이적인 인간 단일클론 항체 및 그들의 용도 - Google Patents

Abstract

본 명세서는 척추 동물에서 뎅기 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 명세서는 뎅기 감염으로부터 회복한 환자로부터 유래된 EBV로 불멸화된 B 세포로부터 분리된 뎅기 바이러스에 대한 인간 중화 단일클론 항체를 개시한다. 본 명세서는 감염으로부터의 재발을 감소, 제거, 또는 예방하는데 유효한 양으로 척추동물에 이러한 항체를 투여하는 방법을 제공한다.

Description

뎅기 바이러스 세로타입 1 E 프로틴에 특이적인 인간 단일클론 항체 및 그들의 용도 {HUMAN MONOCLONAL ANTIBODY WITH SPECIFICITY FOR DENGUE VIRUS SEROTYPE 1 E PROTEIN AND USES THEREOF}

본 명세서는 2010년 12월 14일 출원된 미국 가출원 No.61/423,085호를 우선권으로 주장하며, 상기 가출원은 모든 목적에 대해 본 명세서에 그 전체가 인용문헌으로 통합되어 있다.

본 명세서는 뎅기 바이러스, 특히 세로타입 1에 대한 인간 중화 단일클론 항체(human neutralizing monoclonal antibodies)에 관한 것이다. 또한 본 명세서는 척추동물에서 뎅기 바이러스에 의한 감염의 치료 또는 예방을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 명세서는 감염으로부터의 재발을 감소, 제거, 또는 예방하는데 유효한 양으로 척추동물에 항체를 투여하는 방법을 제공한다.

뎅기(Dengue)는 인간에게 영향을 미치는 가장 중요한 모기-매개 바이러스성 질병이다. 현재 열대/아열대 벨트의 100개가 넘는 뎅기 풍토성 국가에 살고 있는 25억명에 다다르는 사람들은 뎅기 감염의 위험에 처해있는 것으로 고려된다. 도시 거주 모기 종들, 아에데스 애집티(Aedes aegypti)는 인간에게 바이러스의 주된 전달자이다. 뎅기 바이러스에 의한 감염은 범위가 무증상 감염(asymptomatic infection)을 통한 뎅기열(DF), 급성 열병(acute febrile disease)부터 심각한 뎅기 출혈열(dengue haemorrhagic fever, DHF) 및 뎅기 쇼크 증후군(DSS), 혈관 누출이 전형적인 삶을 위협하는 합병증에 이르는 임상 징후의 스펙트럼을 초래할 수 있다. 최근 치료는 증상을 완화하는 진통제의 사용에 제한되어 있고, 사용 가능한 백신이 존재하지 않는다. 뎅기 질병은 빈번하고 반복되는 전염병으로, 매년 5천만 명에게 영향을 미친다. 1990년도에는 엄격한 모기 통제에도 불구하고 세계의 다양한 지역에서 뎅기 질병의 회귀가 나타났었고, 2005년 싱가포르에서 가장 큰 발병으로 정점을 찍었다. 보고된 케이스 중 80%이상은 그들의 업무 능력 뿐 아니라 그들의 치료를 위한 상당한 치료비에 영향을 주는 것과 관련된 청장년층이었다. 이러한 이유로 즉각적인 기간에 질병과 관련된 뎅기를 통제하는데 도움이 되는 수동 항체(passive antibody) 치료법 및/또는 항바이러스제와 같은 뎅기 백신 대체제들이 급히 필요하다. 이러한 제안된 치료법은 비록 오직 질병의 심각한 형태가 진행중인(전체의 약 10%) 위험에 처한 개체에만 적용될 수 있더라도 감염된 개체의 많은 수를 도울 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 남부 미국 및 호주와 같은 선진국에서 뎅기 유행의 증가와 항체와 같은 백신의 부재로 인해 유용한 약물이 제공될 것이다. 본 명세서는 이러한 필요와 다른 필요들을 만족시키는 완전 인간 단일클론 항체(fully human monoclonal antibodies)를 제공한다.

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본 명세서는 척추동물 개체에서 뎅기 바이러스 감염의 예방 및 치료를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

특히, 본 명세서는 뎅기 세로타입 1의 감염으로부터 새롭게 회복된 환자들에게서 얻어진 완전 인간 중화 단일클론 항체(fully human neutralizing monoclonal antibodies)의 생성의 예시에 관한 것이다. 항체는 신체 내 및 시험관 내에서 뎅기 세로타입 1을 차단하는 예방적 및 치료적 활성을 모두 나타내며 새로운 약물의 기반을 형성할 수 있다. 본 발명은 감염에서 회복 된지 60일이 지난 환자에게서 채취한 혈액 샘플에서 그들의 CD22 양성 세포를 정제하는 것에 의해 회복 중인 환자로부터 얻어진 불멸화된 기억 B 세포를 제조하는 방법을 이용한다. 그런 뒤, 정제된 B 세포는 엡스타인 바 바이러스(EBV) 감염을 사용하여 불멸화 된다. 이 방법은 뎅기 바이러스에 특이적인 것으로 스크린 될 수 있는 완전 인간 항체를 생산할 수 있는 불멸화된 기억 B 세포주의 패널(panel)을 생성한다. 그런 뒤, 이러한 B 세포주는 신체 내 및 시험관 내에서 뎅기 바이러스에 중화 활성을 갖는 재조합 단일 클론 항체의 클로닝(cloning) 및 식별을 위한 면역글로불린 주형의 강화된 재료(source)로서 사용될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 대로, 우리는 뎅기 바이러스 세로타입 1에 특이적인 제 1 완전 인간 단일클론 항체의 시험관내/신체내 특징, 클로닝, 스크리닝 및 분리를 기재한다.

본 발명의 일 측면은 뎅기 바이러스 세로타입 1 외막 프로틴(envelope protein) 또는 그들의 단편에 결합하는 분리된 항체 또는 그들의 단편을 제공하며, 상기 항체는 중화 활성을 갖는 인간항체이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 항체 또는 그들의 단편은 (a) 전체(whole) 면역글로불린 분자; (b) scFv; (c) Fab 단편; (d) F(ab')2; 및 (e) 이황화 결합 Fv일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 항체 또는 그들의 단편은 (a) 인간 IgM 불변 도메인; (b) 인간 IgG1 불변 도메인; (c) 인간 IgG2 불변 도메인; (d) 인간 IgG3 불변 도메인; (e) 인간 IgG4 불변 도메인; 및 (f) 인간 IgA1/2 불변 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된 헤비 체인 면역글로불린 불변 도메인을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 항체 또는 그들의 단편은 (a) 인간 Ig 카파 불변 도메인; 및 (b) 인간 Ig 람다 불변 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된 라이트 체인 면역글로불린 불변 도메인을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 항체 또는 그들의 단편은 도 4(B)에 나타난 CDR 서열 군으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하는 헤비 체인을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 항체 또는 그들의 단편은 도 4(B)에 나타난 CDR 서열 군으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하는 라이트 체인을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 항체 또는 그들의 단편은 도 4(B)에 나타난 세 개의(three) CDR 서열을 포함하는 헤비 체인을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 항체 또는 그들의 단편은 도 4(B)에 나타난 세 개의 CDR 서열을 포함하는 라이트 체인을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 항체 또는 그들의 단편은 도 4(B)에 나타난 하나 이상의 CDR 서열 및 IGHV1-2^*02의 헤비 체인 프레임워크(framework)를 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 항체 또는 그들의 단편은 도 4(B)에 나타난 하나 이상의 CDR 서열 및 IGKV3-20^*01의 라이트 체인 프레임워크를 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 항체 또는 그들의 단편은 도 4(B)에 나타난 헤비 체인 서열을 포함한다.

본 발명의 다른 일 구체예에 있어서, 항체 또는 그들의 단편은 도 4(B)에 나타난 라이트 체인 서열을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 항체는 14c10,클론8이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 항체 또는 그들의 단편은 1 x 10^-8 M 미만의 친화상수(K_D)로 항원에 결합한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 항체 또는 그들의 단편은 1 x 10^-9 M 미만의 친화상수(K_D)로 항원에 결합한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 항체는 뎅기 바이러스 감염으로부터 회복된 환자의 B 세포로부터 유래된다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 항체는 바이러스에서 두 개의 외막 프로틴을 가로질러 결합한다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 두 개의 외막 프로틴을 가로질러 결합하는 것은 하나의 E 프로틴 상의 DI 및 II 사이의 경첩 및 DI 및 인접한(neighboring) E 프로틴의 DIII 에 결합하는 것을 포함한다.

본 발명의 일 측면은 14c10, 클론8의 결합 특이성(binding specificity)을 갖는 뎅기 바이러스에 결합하는 항체 또는 그들의 단편을 제공한다.

본 발명의 다른 일 측면은 개체에서 뎅기 바이러스 감염을 감소 또는 예방하는데 유효한 약제학적으로 허용되는 담체 및 상기 구체예 및 관련된 측면 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그들의 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 몇몇 구체예에 있어서, 약제학적 조성물은 예를 들어, 항바이러스 약물(drug) 또는 진통제 약물과 같은 2차 제제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일 측면은 상기 구체예 및 관련된 측면 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그들의 단편을 유효한 양으로 개체에 투여하는 것을 포함하는 수동 면역화(passive immunization) 방법을 제공한다.

또한 본 발명의 일 측면은 질병을 예방 또는 감소하는데 유효한 양의 상기 구체예 및 관련된 측면 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그들의 단편을 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 뎅기 바이러스 감염의 치료방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 항체는 정맥 내(IV), 피하 내(SC), 근육 내(IM), 경피 (transdermally), 또는 경구로 투여된다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 항체는 개체 체중의 킬로그람 당 1 내지 100 밀리그람의 양으로 투여된다.

상기 투여는 항바이러스 약물 또는 진통제 약물일 수 있는 2차 제제의 투여를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일 측면은 (a) 최근 뎅기 바이러스 감염으로부터 회복된 개체를 식별하는 단계;(b) 상기 개체로부터 B-세포를 수득하는 단계; (c) (b)로부터 얻은 B-세포를 불멸화시키는 단계; 및 (d) (c)로부터 얻은 불멸화된 B-세포의 뎅기 바이러스 중화 여부를 검정하는 단계에 의한 뎅기 바이러스에 대항하는 중화 항체의 생성 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, B 세포는 CD 22+이다. 본 발명의 다른 구체예에 있어서, B 세포는 EBV에 의해 불멸화된다.

본 발명의 다른 일 측면은 상기 구체예 및 관련된 측면 중 어느 하나에 따른 항체 및 그들의 단편을 인코딩(encoding) 하는 분리된 핵산을 제공한다. 상기 핵산은 발현 벡터에 포함될 수 있다. 상기 발현 벡터는 박테리아 세포, 진핵 세포, 포유류 세포와 같은 숙주세포에 포함될 수 있다.

도 1: 항체 스크리닝, 발현 및 분석방법의 순서도. 국립 대학 병원(NUH)에서 승인 받은 뎅기 감염 환자로부터 얻어진 CD22+ B 세포를 분리하였다. 이러한 B세포를 불멸화의 효율을 향상시키기 위해 첨가된 다클론성(polyclonal) B 세포 활성제(2.5μg/ml의 CpG 서열, IL2 및 IL4)가 존재하는 상태에서 EBV에 의해 불멸화하였다. B 세포를 연막(buffy coats)로부터 얻은 동종 이계(allogenic)이고 조사된(irradiated) 1x10⁵의 PBMCs를 갖는 96 웰의 둥근 바닥 웰에 30 cells/well의 농도로 분주하였다. 2주 후, 이러한 클론으로부터 얻은 상층액을 결합/중화 활성이 있는지 ELISA, PRNT 및 CPE로 스크리닝 하였다. 양성 B 세포주의 mRNA를 추출하였고 항체의 헤비 및 라이트 체인 서열을 인하우스(in-house) pCMV 벡터 속으로 클로닝 하였고, 높은 농도의 재조합 항체를 생산하기 위해 Freestyle^® 293F 세포 속으로 트랜스펙션 하였다. 원하는 특이성을 갖는 재조합 항체를 식별하고 분석하였다.
도 2: CPE 및 PRNT 검정에 의한 불멸화된 B세포 클론으로부터 얻은 상층액의 뎅기 중화 활성에 대한 스크리닝. (A) BHK-21 세포를 EBV 불멸화된 B-세포주로부터 유래된 상층액이 존재하는 상태에서 DV로 접종하였다(chanllenged).(환자 당 2000개의 세포주를 이 접근법으로 스크리닝 하였다). 세포 변성 효과를 남아 있는 온전한 세포를 아세트산의 크리스탈 바이올렛 용리로 염색하는 것과 595nm 흡광도에서 확인에 의해 평가하였다. 검정 종점(assay endpoint)을 50%의 세포 변성 효과로서 결정하였고, 바이러스 농도를 최적화 하였다. 실험 상층액을 1/4로 희석하여 처음에 스크리닝 하였다. 클론의 상위 10%를 PRNT로 재실험하였다. (B) 뎅기에 대항하는 중화 인간 항체를 분비하는 인간 B 림프구 세포주의 생성. 80%의 컨플루언시(confluency)인 BHK세포를 3일동안 뎅기 바이러스로 감염시켰다. 바이러스성 플라크(plaque)를 생존 세포에 결합하는 크리스탈 바이올렛 염색(시그마-알드리치, 싱가포르)을 사용하여 시각화 하였다. B 세포 클론(회복기인 뎅기 1 감염 환자로부터 유래한)으로부터 얻은 상층액이 중화 활성이 있는지 실험하였다. 뎅기 1(50 pfu)을 BHK 세포에 첨가하기 전에 세포 배양 상층액(1/4로 희석된)으로 배양하였다. 세포주 14c10이 플라크 숫자를 상당히 감소시키는 항체를 분비하는 것을 발견하였다.
도 3: 관련된 CDR 아미노산 서열 및 B 세포주 14C10에 의해 발현된 항체 주형. (A) 제한 효소 부위를 입증하고 및 14c10에서 얻은 식별된 주형을 사용하여 재조합 인간 IgG1 항체의 생성을 위해 삽입되는 헤비 및 라이트 체인을 클로닝하는 플라스미드 맵(map). (B) 그들의 CDR 부위(각각 CDR 1, CDR 2 및 CDR 3)뿐 아니라 서로 다른 재조합 항체를 만들기 위한 헤비 및 라이트 체인 조합의 12개 순열(permutation)을 갖는 모든 식별되고 클로닝 된 14c10의 헤비(각각 나온 순서대로 SEQ ID NOS 13-24) 및 라이트 체인(각각 나온 순서대로 SEQ ID NOS 1-12).
도 4: 뎅기 세로타입 1에 대해 결합 활성을 갖는 재조합 항체를 인코딩하는 항체 주형 14c10.8. (A) 293F의 상층액에서 발현되고 정제된 B 세포주 14c10으로부터 유래된 모든 재조합적으로 발현된 항체를 테스트하기 위해 샌드위치 ELISA(sandwiched ELSISA)를 사용하였다. 주형 넘버 8은 깨끗하게 뎅기 바이러스 세로타입 1에 대한 양성 신호를 제공한다. (B) CDR부위를 갖는 14c10.8 헤비(각각, SEQ ID NOS 25 및 17) 및 라이트 체인(각각, SEQ ID NOS 26 및 27)의 아미노산 서열 및 전체 뉴클레오티드는 강조되어있다.
도 5: PRNT 및 ELISA에 의한 재조합 14c10.8 항체의 세로타입 특이성. (A) 샌드위치 ELISA는 생존한 전체 뎅기 바이러스 세로타입 1에 대항하는 재조한 IgG1 14c10 항체의 특이성을 나타낸다. 뎅기 세로타입 2, 3 또는 4에 대한 결합 활성은 관찰되지 않는다. (B) PRNT 데이터는 웨스트팩(Westpac) 74 뎅기 바이러스 세로타입 1에 대항하는 재조합 14c10.8 항체의 특이성을 나타낸다. 뎅기 세로타입 2, 3 또는 4에 대한 상당한 중화 활성은 관찰되지 않았다. (C) PRNT의 미가공 데이터(raw data)는 뎅기 바이러스 세로타입 1에 대한 14c10.8의 세로타입 특이성을 나타낸다.
도 6: 14c10.8은 동형 항체 의존성 강화(homotypic antibody dependent enhancement, ADE)를 나타내나, 시험관에서 뎅기 감염에 대한 이형 항체 의존성 강화(heterotypic antibody dependent enhancement)는 나타내지 않는다. 연속적으로 희석된 14c10.8 항체를 동일 부피의 바이러스(1의 MOI)와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였고, 그런 뒤 인간 골수단핵구(myelomonocytic cell) 세포주 K562(ADE 검정법에서 흔히 사용되는 세포주)에 트렌스펙션 하였고, 37℃에서 4일 동안 배양하였다. 그런 뒤 감염된 K562 세포로부터 상층액을 수득하였고, 그 결과인 바이러스 가(viral titre)를 PRNT로 평가하였다. ADE는 항체가 첨가되지 않은 상황에서 대조군에 비해 바이러스 가가 증가하는 것으로 확인되었다(푸른 점선). 데이터는 뎅기 바이러스 세로타입 1에서 ADE의 존재를, 세로타입 2, 3 및 4에서는 존재 하지 않음을 입증한다. 이 관찰은 14c10.8은 농도를 강화하는 것보다 중화하는 것을 제공 받은 뎅기 1 감염 환자들에게 제공되기 위한 안전한 항체인 것을 제시한다.
도 7: 서로 다른 인간 IgG 서브-클래스로의 14c10.8의 전환은 그 동형 강화 활성에 영향을 미친다. 우리는 인간 IgG1으로부터 얻은 14c10을 인간 IgG3 및 인간 IgG4로 아웃라인된(outlined) 구조체를 사용하여 전환하였다. 이들은 293F 세포에서 재조합 항체로 발현되었고, 그런 뒤 추가 실험을 위해 프로틴-A 세파로오스 컬럼에서 정제되었다. 우리는 도 6에 기재된 대로 K562 세포주를 사용하여 동형 강화를 실험하였다. IgG3는 IgG1이 중간체 이고 IgG4가 가장 낮은 강화 활성을 가질 때 최대 강화 활성을 나타낸다.
도 8: 14c10.8 은 뎅기 바이러스 E-프로틴에 특이적이다. (i) 세포들을 2일 동안 DV로 감염시켰다. 감염된 세포를 용해시켰고, 방사성 화합물을 포함시키기 위해 S³² 메티오닌을 바이러스 혼합물에 첨가하였다. 항체를 혼합물에 첨가하였고, 그 후에 프로틴 A-아가로스 비드를 첨가하였으며, 이를 1시간 동안 4℃에서 배양하였다. 세척 후, 프로틴을 비-환원성 로딩 버퍼(non-reducing loading buffer)로 용리하였고, 이를 15% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 걸어놓았으며 제조 프로토콜(SliverQuest 염색 키트, 인비트로젠)에 따라 은으로 염색하였다. 56 Kd 밴드는 뎅기 바이러스의 E 프로틴에 상응하는 것이다. (ii) 정제된 전체 뎅기 바이러스(변성 및 비-변성)를 비-변성 겔에 로딩하였고 14C10 항체로 블로팅 된(blotted) 막으로 옮겼다. 그 결과는 14C10이 뎅기 E 프로틴의 선형 에피톱에 약한 결합력을 가진다는 것을 나타낸다.
도 9: 다양한 뎅기 세로타입 1 유전자형(genotype)에 대항하는 재조합 14c10 항체의 중화 활성. 항체의 증가하는 농도를 뎅기 바이러스 세로타입 1의 다양한 유전자형(바이러스성 유전자형 이름은 괄호에 제공된다)의 50 플라크-형성 단위(p.f.u.)에 첨가하였고 1 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 100μl 의 혼합물을 24 웰 플레이트에 있는 BHK-21 세포의 단일층(monolayer)에 첨가하였고 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 상층액을 제거하였고 RPMI 배지에 있는 2%(w/v) 카프복시 메틸 셀룰로오즈(carboxyl methyl cellulose) 1ml와 2% FBS가 감염된 세포 위에 층을 형성하게(layered) 하였다. 4일 동안 37℃에서 추가적인 배양 후에, 플라크를 시각화 하기 위해 웰을 25%(v/v) 포름알데하이드에 녹인 0.5%(w/v) 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 도 9는 각각, 나온 순서대로, SEQ ID NOS 28-32를 개시한다.
도 10: 14c10은 생체 내에서 예방 및 치료 활성 모두를 나타낸다: (A) 14c10.9의 예방 활성을 뎅기 세로타입 1로 감염되기 24시간 전에 다양한 농도의 항체를 AG129(n=6) 마우스들에게 접종하는 것에 의해 관찰하였다. 뎅기 바이러스 감염 후 24시간이 지난 단일 집단(single cohort)(n=6)으로부터 250μg/마우스인 항체의 단일 치료 용량(single therapeutic dose)을 정하였다. 바이러스 혈증 결과를 감염 4일 후 감염된 마우스들의 혈청으로 PRNT에 의해서 정량화 하였다. (B) 14c10.8은 1-5μg/마우스의 농도에서 예방 활성을 나타낸다. 낮은 농도의 항체에서는 강화된 감염의 증거가 있다.
도 11: HM14c10은 DENV1에 특이적인 인간 항체이다. (A) HM14c10은 각각 0.328μg/ml 및 1.313μg/ml의 50% 및 90% PRNT 값(value)으로 DENV1에 특이적인 중화활성을 나타낸다. (B) HM14c10은 서브-중화(sub-neutralizing) 농도에서 DENV1에 대해 동형 ADE를 유도하나, DENV2, DENV3 또는 DENV4에 대한 동형 ADE는 유도하지 않는다. HM4G2는 모든 4개의 세로타입에 대해 ADE활성을 유도한다. (C)(a) Fab 단편 또는 HM14c10의 IgG1 Fc 부위의 돌연변이(N297Q)는 동형 ADE를 상당히 감소시킨다. (b) 인간 IgG(HM14c10)의 서로 다른 서브클래스들은 동형 HM4G2의 차등적 수준(differential level)을 매개한다. (D) HM14c10은 HM4G2에 비하여 많은 DENV1 유전자형을 매우 중화한다. 상기 유전자형은 바이러스 명칭 옆의 괄호에 나타냈다. 에러 바(error bars)는 3배 샘플의(triplicate samples) 표준편차를 나타내고, 모든 실험을 적어도 3번 이상 수행하였다.
도 12: HM14c10는 바이러스 4차 구조-의존적 에피톱에 결합한다. (A) Fab 14c10의 CryoEM 맵: DENV1 복합체는 바이러스 표면(청록색)에 있는 180 E 프로틴에 결합하는 120 Fab(파란색)을 나타낸다. 검은 삼각형은 비대칭 단위를 나타낸다. (B) E 프로틴 에피톱(보라색 구)에 대한 Fab HM14c10(I)의 밀도를 연결하는 그림. E 프로틴 E-DI, E-DII, E-DIII는 각각 빨강, 노랑, 파랑색으로 표시되었다. (C) 두 개의 비대칭 단위에서 E 프로틴 Cα 체인에 대한 Fab 분자의 밀도. Fab HM14c10(I) 및 HM14c10(II)는 비대칭 단위에서 독립적인 두 개의 분자이다. (D) 비대칭 단위에서 3개의 E 프로틴(회색으로 칠해진)에 있는 Fab HM14c10(I)(보라색 구) 및 HM14c10(II)(청록색 구)의 에피톱.
도 13: HM14c10은 BHK 세포에 대한 DENV1 부착을 차단하고 생체 내에서 잠재적 방어 활성을 나타낸다. (A) 시간 경과 공초점 현미경 관찰법(Time lapse confocal microscopy)은 (a) 이소타입 대조군 mAb(Isotype control mAb), (b) HM4G2 및 (c) HM14c10 mAb의 존재 상태에서 BHK 숙주세포의 DENV1 감염을 증명한다. 왼쪽 패널: DENV1 및 Mabs를 각각 Alexafluor-647 (빨강) 및 Alexafluor-488 (초록)으로 표지하였다. 오른쪽 패널은 세포 경계(하얀 점선) 및 세포에서 DENV1의 분포를 나타낸다. (B) 살아있는 감염 이벤트(infection events)의 근접촬영. DENV1은 이소타입 대조군의 18분 사진과 HM4G2와 함께한 것의 28분 사진의 BHK 세포에서 관찰된다. HM14c10: DENV1 복합체는 BHK 세포에 붙을 수 없다. (C) 1시간 동안 바이러스 내재화의 측정으로서 정량화된 임의로 선택된 120개 세포의 내부 붉은 형광 강도(Internal red fluorescence intensity). 3 그룹의 비교를 위해 일원 변량 분석(1-way ANOVA)을 이용하였다. **pp<0.001. (D) HM14c10가 예방 및 치료제로서 용도가 있는지 실험하였다; 항체를 DENV 감염된 AG129 마우스들에 0 일 및 감염 후 2일에 각각 투여하였다. HM14c10는 (a) 피하(sub-cutaneously) 또는 (b) 복강내(intraperitoneally) 어느 쪽으로 주입되든 보호 반응을 나타냈다. 바이러스 혈증 수준을 플라크 검정에 의해서 각각 감염 후 3일 또는 4일에 검정한다. 두 모델 모두에서 N=5 이고, 샘플 세트의 비교를 위해 T-test가 사용되었고, PBS 대조군과 비교하여 **p<0.0001, *p<0.05 이다.
도 14: 뎅기 바이러스에 중화 활성을 갖는 완전 인간 단일클론 항체의 재조합 발현 및 식별. (A)(a) DENV1 감염 환자로부터 2000개의 EBV-B-세포주를 생성하였으며 DENV2, 3 또는 4가 아닌 DENV1에 대한 결합 활성에 대해 상층액을 ELISA로 스크리닝했다. 7개의 양성 EBV-BCL 세포주가 식별되었다. (b) 플라크 감소 중화 시험(plaque reduction neutralization test, PRNT)을 중화활성이 있는지 시험하기 위해 수행하였다. 데이터를 최고 희석 인자(highest dilution factor)에서 PRNT100(예를 들어, 완전 중화)로서 표현하였고, 데이터는 3 회 실험의 평균 값이다. (B)(a) HEK293 세포에 있는 EBV-BCL 로부터 유래된 항체 헤비 체인 및 라이트 체인 주형을 발현시키기 위해 사용된 pTT5 벡터의 도식(schematic). (b) EBV-BCL 14c10 세포주 로부터 12개의 재조합 인간 IgG1 mAbs를 클로닝 및 발현시켰으며 ELISA에 의해 DENV1 결합 활성이 있는지 실험하였다. 인간화된 마우스 단일클론 4G2 항체(HM4G2)를 양성 대조군으로 사용하였다. 재조합 항체 주형 넘버 8(HM14c10로 정의된)은 DENV1에 대한 결합 활성을 나타냈다. (C)(a) DENV1, 2, 3 및 4에 대한 HM14c10의 PRNT 활성. (b) HM14c10가 DENV1, 2, 3, 및 4에 결합 활성이 있는지 ELISA로 실험하였다. 이러한 데이터는 3회 실험의 평균과 에러 바가 3배 샘플 세트의 평균으로부터 얻은 표준편차와 동일함을 나타낸다.
도 15: HM14c10은 많은 DENV1 임상분리주(clinical isolates)에 대해 결합 활성을 나타낸다. 여러 DENV1 분리주에 대한 HM14c10 결합 활성을 판매되는 ELISA 프로토콜을 사용하여 다양한 농도에서 인간화된 마우스 단일클론 항체 HM4G2와 비교하였다. 모든 DENV1 분리주들을 1x10⁶ pfu/ml로 사용하였고 포획제(capture reagent)로 쓰인 HB112로 4℃에서 하룻밤 동안(overnight) 코팅하였다. HM14c10 또는 HM4G2 항체를 5μg/ml로 첨가하였고 항-인간 IgG HRPP 접합체(conjugates)를 결합 활성의 발견을 위해 사용하였다.
도 16: 뎅기 1 바이러스와 복합체를 형성한 Fab HM14c10의 cryoEM 맵 안에서 DENV1 E 프로틴의 후-융합 크리스탈 구조의 피트(fit). (A) 피팅된(fitted) 뎅기 1 E 프로틴의 탑 뷰(top view). cryoEM 맵은 5.5σ의 높은 윤곽 수준(contour level)에서 표시되도록 E 프로틴 밀도의 선명한 외곽선이 관찰될 수 있었다. 이러한 윤곽 수준에서, Fab 밀도는 사라지고, 이는 모든 이용 가능한 E 프로틴 에피톱들이 바이러스 표면에서 Fab 문자에 의해 채워지지 않는다는 것을 나타낸다. 바이러스 표면의 전자 밀도를 DENV1 E 프로틴(18)의 후-융합 구조의 크리스탈 구조에 있는 피팅(fitting)에 의해 해석하였다. DENV1 후-융합 E 프로틴의 크리스탈 구조가 cryoEM 맵에 리지드 바디(rigid body)로서 적합하지 않으므로, E 프로틴의 세 도메인은 별개로 피팅되어야 했다. E 프로틴의 도메인 I, II 및 III은 각각 빨강, 노랑, 파랑색으로 표시되었다. 두 비대칭 단위에서 온 E 프로틴을 본 도면에 삼각형으로 표시된 하나의 비대칭 단위로 나타내었다. (B) DENV1의 표면에 있는 피팅된 E 프로틴의 사이드뷰(side view). Fab 분자, E 프로틴 엑토도메인 및 막관통(Tm) 헬릭스(helices)들의 밀도가 관찰될 수 있다. 두 인접한 E 프로틴에 있는 위치 (position) Asn159에 글리칸(glycan)에 상응하는 밀도는 화살표로 표시되었으며 지질 2중층의 바깥쪽 및 안쪽 리플릿(leaflet)의 위치가 표시되었다. cryoEM 맵은 2.5σ의 윤곽 수준으로 나타낸다.
도 17: HM14c10 및 E 프로틴 결합 인터페이스(interface)의 스테레오-다이어그램(stereo-diagram). Fab HM14c10(II)의 밀도는 바이러스 표면 위의 E 프로틴에 대한 깨끗한 결합을 보여준다. 접촉 잔기(contact residues)를 구로 나타낸다. CryoEM 밀도는 2.5σ의 윤곽 수준으로 나타낸다.
도 18: 인간 단일클론 항체(PDB 코드 2GHW)(파랑)를 참고로 한 HM14c10(초록)의 상동성 모델(homology model)의 가변부의 중첩. 도면은 항체 가변부(variable regions)의 사이드 뷰(A) 및 탑 뷰(B)를 나타낸다.
도 19: HM14c10:DENV1 cryoEM 밀도 맵 안의 HM14c10 가변부의 상동성 모델의 피팅. (A) 항체 가변부의 개개의 체인(a 및 b)에 상응하는 밀도는 cryoEM 맵에 동그라미로 나타낸다. 피팅된 E 프로틴의 접촉 잔기는 청록색 구로 나타낸다. E-DI, E-DII 및 E-DIII는 각각 빨강, 노랑 및 파랑으로 표시한다. (B) 상동성 모델 라이트 및 헤비 체인은 Fab cryoEM 밀도의 가변부안에 개별적으로 피팅되었다. ^a도 12의 Fab 위치의 명칭을 위한 것. ^b(A)의 Fab 밀도의 명칭을 위한 것. ^c HM14c10:DENV1 cryoEM 안의 상동성 모델의 피트(3σ의 윤곽 수준에서의 세트)룰 키메라(35)에서 피트-인-맵(fit-in-map) 기능을 사용하여 최적화하였다. (C) 피팅된 HM14c10 가변부 상동성 모델(초록)은 마젠타(magenta)에서 CDRs를 나타낸다. 나타낸 피트는 Fab 밀도 a에서 라이트 체인을, Fab 밀도 b에서 헤비 체인을 갖는다.
도 20: (A) 다른 DENV1 유전자형(각각, 나온 순서대로, SEQ ID NOS 33-38) 의 에피톱과 및 뎅기 세로타입 1(유전자형 PVP159)에 있는 HM14c10 에피톱의 비교 및 (B) 뎅기 세로타입들 및 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus, WNV)(각각, 나온 순서대로, SEQ ID NOS 34 및 39-42)에 있는 에피톱의 비교. 비대칭 단위에 있는 Fab HM14c10(I) 및 Fab HM14c10(II)에 의해 인식된 에피톱 사이의 공통적인 아미노산 잔기는 초록으로 표시되었다. Fab HM14c10(I) 또는 Fab HM14c10(II)에 의해 특별히 인식된 잔기는 보라 및 청록으로 각각 표시되었다. Fab HM14c10에 의해 인식된 에피톱의 아미노산 서열은 DENV1 유전자형들 안에는 보존되어 있으나, 뎅기 세로타입들 또는 웨스트 나일 바이러스 가로질러서는 그렇지 않다. 이는 Fab HM14c10이 대부분의 뎅기 1 유전자형과 결합하나, (a) 위치 X1 및 II 또는 (b) 위치 X2 및 I에 가려진 항체 족문(footprints)이 있는 다른 뎅기 세로타입 또는 플라비바이러스(flaviviruses)와는 교차반응하지 않는다는 관찰과 일치한다.
도 21: 표지된 DENV1의 생체 내 효능 및 감염성. (A) 살아있는 DENV 표지(labelling)를 이전에 기재된 대로 수행하였다(22). 표지된 바이러스의 감염성 및 생존성을 BHK 세포에 적정(titration)하는 것을 통한 플라크 검정에 의해 실험하였다. (B) HM14c10의 생체 내 효능을 서로 다른 스트레인(strain)/농도의 DENV1 바이러스 뿐 아니라 서로 다른 모델의 바이러스성 전달체(viral delivery)를 사용하여 두 개의 생체 내 모델에서 실험하였다. (a) 모델 1에서, 1x10⁶ pfu의 EHID1 스트레인은 피하로(S.C.) 주입되었고, 혈청 바이러스 혈증(serum viremia)을 4일 뒤에 플라크 검정으로 모니터하였다. 예방은 DENV1 감염 24시간 전에 주어져야 하고, 치료적 적용은 감염 후 2일 뒤여야 한다. (b) 더욱 공격적인 DENV1 감염 모델 두 번째도 또한 사용되었다. 1.25x10⁷ pfu의 DENV1의 웨스트팩 스트레인(Westpac strain)을 마우스들의 복강내로 주입하였다. 바이러스 감염에 더하여 예방 및 치료적 처치들을 모델 1과 동일한 시간 지점에 복강 내(I.P.) 주입을 통해 투여하였다. 이 모델에서 혈장 바이러스 혈증(plasma viremia)은 감염 후 3일 뒤에 최고점에 도달하고, 이는 혈장 바이러스 혈증에 투여된 항체의 효과가 측정되는 시점이다. 대조군은 두 그룹 모두에서 멸균 식염수의 동일한 부피로 주어졌다.
도 22: 웨스트 나일 바이러스 항체 CR4354 및 뎅기 1 특이적 HM14c10에 결합된 에피톱의 비교. (A) 각각 WNV(왼쪽)(25) 및 DENV(오른쪽)에서 E 프로틴에 대한 HM CR4354 및 HM14c10 의 피트(fit). CryoEM 밀도는 2.8σ (CR4354:WNV) 또는 2.5σ (HM14c10:DENV1) 윤곽 수준으로 표시되었다. (B) 구로 나타난 항체 CR4354 or HM14c10 족문을 갖는 WNV(왼쪽) 및 DENV1(오른쪽)의 비대칭 단위. 비대칭 단위에 있는 두 개의 독립적인 결합 부위에 있는 에피톱은 보라 및 청록으로 표시되었다. 비대칭 단위에 있는 세 개의 E 프로틴은 회색으로 표시되었다. 비대칭 단위는 검은 삼각형으로 표시되었다. (C) CR4354(WNV에 있는) 및 HM14c10(DENV에 있는) 사이의 두 개의 독립적 에피톱(a(각각, SEQ ID NOS 33 및 42) 및 b(각각, SEQ ID NOS 33 및 42))에 있는 잔기들의 비교. 두 개의 독립적 에피톱에 있는 잔기들은 (B)에서의 색과 마찬가지로 표시되었다.

본 명세서는 일반적으로 척추동물 개체에서 뎅기 바이러스 감염의 예방 및 치료를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 우리는 국립 대학 병원(NUH)의 전염성 질병부에서 승인 받은 뎅기 감염 환자로부터 얻어진 CD22+ B세포를 분리하였다. 이러한 B 세포를 시험관 내에서 EBV를 갖는 다클론성 세포주로서 불멸화하였다. 다클론성 B 세포 활성제(CpG 서열)를 인간 B 세포 성장 인자인, 인터루킨 2 및 인터루킨 4(각각 1000U/ml)와 함께 B 세포 불멸화의 효율을 향상시키기 위해 첨가하였다. 인간 B 세포주를 96 웰의 둥근 바닥 웰에 만들었다. 이 주 후에, 이러한 클론으로부터 얻은 상층액을 뎅기 바이러스에 대해 결합/중화 활성이 있는지 분석하기 위해 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 플라크 감소 중화 시험(PRNT) 및 세포병변 효과 검정(CPE)에 의해 스크리닝 하였다. 양성 항체를 생산하는 B 세포주를 항체 헤비 및 라이트 체인 유전자 증폭을 위한 mRNA의 소스(source)로서 사용하였다. 항체의 헤비 및 라이트 체인 서열을 인하우스(in-house) pCMV 벡터 속으로 클로닝 하였고, 높은 농도의 재조합 항체를 생산하기 위해 Freestyle^® 293F 세포 속으로 트랜스펙션 하였다. 이러한 방법을 사용하여, 우리는 뎅기 세로타입 1에 정교하게 특이적이고 다양한 뎅기 세로타입 1 유전자형에 넓은 특이성을 갖는 재조합 항체를 클로닝시키고 발현시켰다. 있다. 이 항체는 플라비바이러스 속의 다른 바이러스들에는 결합하지 않으며, 그러한 것으로서 뎅기 세로타입 1에 대해 예상되는 것들 것 넘어서는 다른 플라비바이러스에 대한 마이크로파지 감염의 강화를 적게 나타내거나 혹은 아예 나타내지 않는다. 생체 내 실험들은 뎅기 감염의 마우스 모델에서 현저한 예방 및 치료 효능을 나타낸다. 그러한 것으로서, 이 항체는 존재하는 것 중 뎅기 1 감염에 대한 최고의 이용 가능한 치료제 후보임을 나타낸다.

정의

본 발명이 당연히, 달라질 수 있는 특정 방법, 시약(reagents), 화합물, 조성물 또는 생물학적 시스템(biological system)에 제한되지 않는다는 것은 이해되어야 한다. 또한 본 명세서에서 쓰인 용어들은 오직 특정 측면을 설명하기 위한 목적일 뿐, 제한하고자 하는 의도는 아니라는 것도 이해되어야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구항에서 쓰인, 단수형태들은 그 문맥에서 명확하게 지칭하지 않으면 복수 형태를 포함하는 것이다.

본 명세서에서 양, 일시적 기간 및 기타 같은 종류의 것과 같은 측정 가능한 값들을 지칭할 때 사용되는 "약"이라는 용어는 명시된 값들로부터 ±20% 또는 ±10%, 바람직하게는 ±5%, 더 바람직하게는 ±1%, 더욱더 바람직하게는 ±0.1%의 편차(variations)를 망라하는 것을 의미하며, 그러한 것으로서 편차는 개시된 방법을 수행하기에 적절한 것이다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 발명이 존재하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에 의해 흔히 이해될 수 있는 것과 같은 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 방법 및 물질(material)과 비슷하거나 또는 동등한 임의의 것들이 본 발명의 시험을 위한 실험에서 사용될 수 있으나, 바람직한 물질 및 방법은 본 명세서에 기재되어 있다.

"척추 동물(vertebrate)", "포유류(mammal)", "개체(subject)", "포유류 개체(mammalian subject)", 또는 "환자(patient)"는 교환적으로 쓰일 수 있고 인간 환자 및 비-인간 영장류와 같은 포유류뿐만 아니라 토끼(rabbits), 랫츠(rats), 및 마우스, 소, 말, 염소, 및 다른 동물들과 같은 실험 동물을 나타낸다. 동물들은 예를 들어, 마우스, 양, 개, 소, 조류 종(avian species), 오리, 거위, 돼지, 닭, 양서류, 파충류와 같은 포유류 및 비-포유류인 모든 척추동물을 포함한다.

"치료하는(treating)" 또는 "치료(treatment)"는 (i) 예를 들어, 예방(prophylaxis)과 같은 감염 또는 재감염의 예방(prevention), 혹은 (ii) 예를 들어, 치료와 같은 관심 질병의 증상의 제거 또는 감소를 나타낸다. 본 발명에 따른 조성물로 개체를 치료하는 것은 뎅기 바이러스, 특히 세로타입 1로부터의 감염에 대한 위험을 줄이거나 예방할 수 있다. 치료는 질병의 징후가 나타난 뒤의 증상의 완화 또는 치료적 진압 또는 예방적 진압(질병의 시작을 예방하거나 늦추는 것, 또는 그들의 임상적 또는 무증상적 증상의 징후를 예방하는 것)일 수 있다.

"예방하는(preventing)" 또는 "예방(prevention)"은 본 발명에 따른 조성물로 하는 예방적(prophylactic) 투여를 나타낸다.

"치료적으로-유효한 양(Therapeutically-effective amount)" 또는 "감염을 감소 또는 제거하는데 유효한 양(an amount effective to reduce or eliminate infection) 또는 "유효한 양(an effective amount)"은 뎅기 바이러스성 감염을 예방하거나 이러한 감염과 관련된 증상 중 적어도 하나 이상을 완화하는(예를 들어, 경감하고, 줄이고, 감소하는)데 충분한 항체 조성물의 양을 나타낸다. 조성물 투여의 이득이 손상보다 더 큰 한, 조성물의 투여가 뎅기 감염의 증상을 제거할 필요까지는 없다. 이와 마찬가지로, 본 명세서에서 사용된 것으로 뎅기 바이러스에 관련한 "치료하다(treat)" 및 "치료하는(treating)"라는 용어는 개체가 필연적으로 감염이 치유되거나 또는 그들의 임상적 징후가 모두 제거되어야 하는 것을 의미하고자 하는 의도는 아니며, 단지 개체의 상태에서 몇몇 완화 또는 개선이 조성물의 투여에 의해 영향을 받는 것을 의미한다.

"수동 면역(Passive immunity)"은 일반적으로 한 개체로부터 다른 개체로 미리-만들어진 항체의 형태로 능동적 체액성 면역의 전달을 나타낸다. 따라서, 수동 면역은 예를 들어 인간 또는 동물 혈장 또는 혈청, 정맥으로 주입하거나(IVIG) 근육으로 주입하는(IG) 용도(use)를 위한 인간 또는 모아진 동물(pooled animal)의 면역글로불린, 질병으로 부터 회복한 기증자(donors) 또는 면역된 개체로부터 얻은 높은-역가(high-titer) 동물 또는 인간 IVIG 또는 IG, 및 단일클론 항체와 같은 몇몇 가능한 형태로 투여될 수 있는, 항체의 전달에 의해 달성될 수 있는 단기간 면역화(short-term immunization)의 형태이다. 수동 전달은 질병 발생의 예방을 위해 예방적으로 쓰일 수 있을 뿐 아니라, 급성 감염의 여러 타입의 치료에서도 사용될 수 있다. 전형적으로, 수동 면역화로 유래된 면역력은 단기간 동안만 지속되고, 즉각적인 보호를 제공하나, 신체는 기억을 개발하지 못하므로, 환자는 나중에 동일한 병원균으로 감염되는 위험에 처해있다.

항체

본 명세서에서 "항체"는 특정한 에피톱에 결합하는 임의의 면역글로불린 또는 온전한 분자뿐 아니라 그들의 단편을 나타낸다. 이러한 항체는 다클론성, 단일클론성, 키메라, 인간화, 단일 체인, Fab, Fab', F(ab)'단편 및/또는 전체 항체의 F(v) 부분 및 그들의 변이체(variants)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 모든 이소타입은 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM을 포함하는 이 용어에 의해 망라된다.

본 명세서에서 사용된, "항체 단편"은 특히 부모 항체의 항원 결합 기능을 보유하는 항체의 전체 서열의 불완전 또는 분리된 부분을 나타낸다. 항체 단편의 예들은 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디(diabodies); 선형 항체; 단일-체인 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 생성된 다중특이적 항체를 포함한다.

온전한 "항체"는 적어도 디설파이드(disulfide) 결합에 의해 서로 연결된두 개의 헤비(H) 체인 및 두 개의 라이트(L) 체인을 포함한다. 각 헤비 체인은 헤비 체인 가변부(본 명세서에서는 HCVR 또는 V_H로 축약됨) 및 헤비 체인 불변부를 포함한다. 헤비 체인 불변부는 CH1, CH2 및 CH3인 세개의 도메인을 포함한다. 각 라이트 체인은 라이트 체인 가변부(본 명세서에서는 LCVR 또는 V_L로 축약됨) 및 라이트 체인 불변부를 포함한다. 라이트 체인은 C_L인 하나의 도메인을 포함한다. V_H 및 V_L부는 , 프레임워크부위(framework regions, FR)로 정의되고, 더 보존되는 부위속에 배치되고, 상보성 결정 부위(complementarity determining regions, CDR)로 정의되는, 과변이(hypervariability)부로 더 세분될 수 있다. 각 V_H 및 V_L 은 하기의 순서로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 배열된 세 개의 CDRs 및 네 개의 FRs를 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 헤비 체인과 라이트 체인의 가변부는 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변부는 면역 시스템의 다양한 세포(예를 들어, 작동 세포), 기존 보체계(classical complement system)의 제1성분(Clq)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개한다. 항체라는 용어는 결합 능력을 보유하는 온전한 항체의 항원-결합 부분을 포함한다. 결합의 예들은 (i) Fab 단편, V_L, V_H, C_L 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편; (ii) F(ab')₂ 단편, 경첩 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일-암(single-arm)의 V_L 및 V_H 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(워드 등., Nature, 341:544-546 (1989)); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 부위(CDR)를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 "단일 체인 항체" 또는 "단일 체인 Fv(scFv)"라는 용어는 V_L and V_H 인 Fv 단편의 두 도메인의 항체 융합 분자를 나타낸다. V_L and V_H 인 Fv 단편의 두 도메인이 분리된 유전자에 의해 코딩 되었더라도, 그들은 재조합 방법을 사용하여, 그들을 V_L and V_H 부위가 쌍을 이루어 1가 분자를 형성한 단일 프로틴 체인으로 만드는 것을 가능하게 하는 합성 링커(synthetic linker)에 의해서 결합될 수 있다(단일 체인 Fv(scFv)로 알려진 것; 예를 들어, 버드 등., Science, 242:423-426 (1988); 및 휴스턴 등., Proc Natl Acad Sci USA, 85:5879-5883 (1988)을 인용한다). 이러한 단일 체인 항체는 "항체" 단편이라는 용어에 참조로 포함되고 온전한 항체들의 효소적 또는 화학적 분리(cleavage) 또는 재조합 기술에 의해서 제조될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "인간 서열 항체"라는 용어는 인간 생식계열(germline) 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변부 및 불변부(존재 한다면)를 갖는 항체를 포함한다. 본 발명에 따른 인간 서열 항체는 인간 생식계열 면역 글로불린 서열(예를 들어, 체내에서의 체세포 돌연변의에 의해 또는 시험관에서 무작위 또는 위치-특이적 돌연변이 유발에 의해 도입된 돌연변이)에 의해 인코딩 되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 항체는 예를 들어, PCT App. Pub. Nos. WO 01/14424 및 WO 00/3750 에 기재된 것과 같은 비-인간 형질전환 동물에서 생성될 수 있다. 그러나, 본 명세서에서 쓰인 "인간 서열 항체"라는 용어는 인간 프레임워크 서열에 접합된 것으로서(예를 들어, 인간화된 항체), 마우스와 같은 다른 포유류종의 생식 계열로부터 유래된 CDR 서열인 항체를 포함하고자 하는 의도는 아니다.

또한, 재조합 면역글로불린들은 생산될 수 있다. 인용된 카빌리, U.S. Patent No. 4,816,567는 모든 목적을 위해 및 그 전체가 참조로 본 명세서에 통합되어있으며; 퀸 등., Proc Natl Acad Sci USA, 86:10029-10033 (1989)을 인용한다.

본 명세서에서 사용된 "단일클론 항체"라는 용어는 단일(single) 분자 조성물의 항체 분자의 제조를 나타낸다. 단일클론 항체 조성물은 특정한 에피톱에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 따라서, "인간 단일클론 항체"라는 용어는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변부 및 불변부(존재 한다면)를 갖는 단일 결합 특이성을 보이는 항체를 나타낸다. 일 측면에 있어서, 인간 단일클론 항체는 예를 들어 형질 전환 마우스와 같은 형질전환 비-인간 동물로서 불멸화된 세포로 융합된 인간 헤비 체인 이식유전자(transgene) 및 라이트 체인 이식유전자를 갖는 것으로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마(hybridoma)로부터 생성될 수 있다.

본 명세서에서 "항원"이라는 용어는 항체의 생성을 촉진하고 면역 반응을 일으킬 수 있는 물질을 나타낸다. 이는 본 명세서에서 "면역원(immunogen)"과 교환적으로 사용될 수 있다. 엄밀하게, 면역원은 면역 시스템으로부터 반응을 끌어내는 물질이나, 항원은 특정한 항체와 결합하는 물질로 정의된다. 항원 또는 그들의 단편은 특정한 항체와의 접촉을 만드는 분자(예를 들어, 에피톱)일 수 있다. 프로틴 또는 프로틴의 단편이 숙주 동물을 면역화 하는데 사용되는 때에는, 프로틴의 수많은 부위들이 항원(프로틴에 있는 3차원 구조 또는 주어진 부위)에 특이적으로 결합할 수 있는 항체(예를 들어, 면역 반응을 끌어내는)의 생산을 유도할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "인간화 항체"는 비-항원 결합 부위 및/또는 항원-결합 부위에 있는 아미노산 서열이 항체가 인간 항체에 더 가깝게 닮고 여전히 그것의 본래 결합 능력을 보유하게 하기 위해서 변화된 하나 이상의 항체 분자를 나타낸다.

게다가, 적절한 항원 특이성의 마우스 항체 분자로부터 얻은 유전자와 적절한 생물학적 활성의 인간 항체 분자로부터 얻은 유전자를 서로 스플라이싱하는(splicing)것에 의한 "키메라 항체"(모리슨, 등., Proc Natl Acad Sci, 81:6851-6855 (1984), 그 전체가 본 명세서에 통합되어있다)의 생산을 위해 개발된 기술들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 오토인듀서(autoinducer)에 대해 특이적인 마우스 항체 분자로부터 얻은 유전자는 적절한 생물학적 활성의 인간 항체 분자로부터 얻어진 유전자와 서로 스플라이싱 될 수 있다. 키메라 항체는 인간 면역글로불린 불변부 및 쥐과의(murine) mAb로부터 유래된 가변부를 갖는, 서로 다른 동물 종으로부터 유래된 서로 다른 부분인 분자이다.

게다가, 기술들은 인간화 항체의 생산을 위해 개발되어져 왔다(예를 들어, 본 명세서에 그 전체가 참조로 통합된 U.S. Patent No. 5,585,089 및 U.S. Patent No. 5,225,539을 인용한다). 면역글로불린 라이트 또는 헤비 체인 가변부는 상보성 결정 부위(CDRs)로 나타내지는 세 개의 고변이부위(hypervariable region)에 의해 방해되는 "프레임워크"부위로 구성된다. 간략하게는, 인간화 항체는 하나 이상의 인간 면역글로불린 분자로부터 얻은 프레임워크 부위와 비-인간 종으로부터 얻은 CDRs를 갖는 비-인간 종으로부터 얻은 항체 분자이다.

다르게는, 단일 체인 항체의 생성을 위해 기재된 기술은 본 명세서의 면역원성 접합체에 대항하는 단일 체인 항체를 생성하기 위해 적합화 될 수 있다. 단일 체인 항체는 단일 체인 폴리펩티드를 야기하는, 아미노산 브릿지를 통한 Fv 부위의 헤비 및 라이트 체인 단편을 연결하는 것에 의해 형성된다. 항체 분자의 Fab 및 F(ab')2 부분은 잘 알려진 방법에 의한 대체로 온전한 항체 분자에서 각각, 파파인 및 펩신의 단백질 가수분해 반응에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, U.S. Patent No. 4,342,566를 인용한다. Fab' 항체 분자 부분은 또한 잘 알려져 있고 F(ab')2 부분, 그 후 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)과 마찬가지로 두 개의 헤비 체인 부분을 연결하는 디설파이드 결합의 감소, 및 그 후에 요오드아세트아미드(iodoacetamide)와 같은 시약과 함께 결과 프로틴 메르캅탄의 알킬화로부터 생산된다.

항체 검정

그들의 특이성 및 친화성을 확인하고 이러한 항체가 다른 프로틴과 교차 반응 하는지 측정하는 것으로서 관심 항체를 검정하기 위한 많은 스르리닝 검정법이 본 발명의 기술분야에 알려져 있다.

"특이적 결합(specific binding)" 또는 "특이적으로 결합하는(specifically binding)"이라는 용어는 항원과 그들의 상응하는 항체간의 상호작용을 나타낸다. 상호작용은 결합 분자(예를 들어, 항원 또는 에피톱)에 의해 인식된 프로틴의 특정한 구조의 존재에 의존한다. 결합이 특이적으로 되기 위해서는, 항원의 배경 부분이 아닌 관심 에피톱(들)에 결합하는 항체를 포함해야 한다.

한번 항체가 생성되면, 그들이 관심 항원에 대해 특이적인지 확인하고 그들이 다른 항원과 어떤 교차 반응성을 나타내는지 측정하기 위해 검정된다. 이러한 검정을 수행하는 한가지 방법은 U.S. App. Pub. No. 2004/0126829에 기재된 혈청들의 스크린 검정이며, 이 내용은 참조로서 본 명세서에 분명히 통합되어 있다. 그러나, 정성 조설(quality control)을 위한 다른 검정 방법은 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자의 지식에 포함되고 그러므로 또한 본 명세서의 범위에 포함된다.

본 발명에 따른 항체들, 또는 항원-결합 단편들, 변이체들, 또는 그들의 유도체들은 또한 항원에 대한 그들의 결합 친화력의 관점에서 기재되거나 명시될 수 있다. 항원에 대한 항체의 친화력은 임의의 적절한 방법을 사용하여 실험적으로 측정도리 수 있다.(예를 들어, 베르조프스키 등., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992); 및 본 명세서에 기재된 방법을 인용한다). 특정한 항체-항원 상호작용의 측정된 친화력은 다른 조건하에서(예를 들어, 염 농도, pH) 측정하면 달라질 수 있다. 따라서, 친화력 및 다른 항원-결합 파라미터(예를 들어, K_D, K_a, K_d)의 측정은 표준화된 항체 및 항원 용액, 및 표준화된 버퍼(buffer)로 바람직하게 만들어졌다.

친화성 결합 상수(affinity binding constant, K_aff)는 하기 식을 이용해 측정될 수 있다.

여기에서:

[mAb]는 자유 항원 부위(free antigen sites)의 농도이며, [mAg]는 서로 다른 두 항원 농도(예를 들어, [mAg]_t 및 [mAg']_t)(비티 등., J Imm Meth, 100:173-179 (1987))에서 측정된 자유 단일클론 결합 부위의 농도이다.

항체에 대한 "높은 친화력"이라는 용어는 약 1 x 10⁷ 리터/몰 이상, 또는 약 1 x 10⁸ 리터/몰 이상, 또는 약 1 x 10⁹ 리터/몰 이상, 또는 약 1 x 10¹⁰ 리터/몰 이상, 또는 약 1 x 10¹¹ 리터/몰 이상, 또는 약 1 x 10¹² 리터/몰 이상, 또는 약 1 x 10¹³ 리터/몰 이상, 또는 약 1 x 10¹⁴ 리터/몰 이상 또는 그보다 큰 평형 연합 상수(equilibrium association constant, K_aff) 를 나타낸다. "높은 친화력" 결합은 항체 이소타입에 따라 변화할 수 있다. K_D, 평형 연합 상수는 또한 항체 친화력을 설명하는데 쓰일 수 있고, K_aff의 역수이다.

K_D, 평형 연합 상수는 또한 항체 친화력을 설명하는데 쓰일 수 있고, K_aff의 역수이다. K_D가 사용되었으면, 항체에 대한 "높은 친화력"이라는 용어는 약 1 x 10^-7 몰/리터 미만, 또는 약 1 x 10^-8 몰/리터 미만, 또는 약 1 x 10^-9 몰/리터 미만, 또는 약 1 x 10^-10 몰/리터 미만, 또는 약 1 x 10^-11 몰/리터 미만, 또는 약 1 x 10^-12 몰/리터 미만, 또는 약 1 x 10^-13 몰/리터 미만, 또는 약 1 x 10^-14 몰/리터 미만 또는 그보다 낮은 농도의 평형 연합 상수(K_D)를 나타낸다.

본 명세서에 따른 항체의 생산은 예를 들어, 오직 인간 면역 시스템에서만 선택될 수 있는 항체 특이성과 같은 생리적 인간 면역 반응의 코스에서 생산된 것들의 특성을 갖는 항체를 제공한다. 현재의 경우, 이것은 인간 병원균 뎅기 바이러스, 세로타입 1에 대한 반응을 포함한다. 본 발명의 어떤 구체예에 있어서, 본 명세서에 따른 항체는 뎅기 바이러스에 의한 감염에 대한 반응의 코스에서 생산되는 것들의 특성을 갖는다. 이러한 항체는 적절한 제형으로 예방 또는 치료제로서 사용될 수 있다.

특정한 병원균에 관하여, "중화 항체(neutralizing antibody)","광범위하게 중화하는 항체(broadly neutralizing antibody)", 또는 "중화 단일클론 항체(neutralizing monoclonal antibody)", 이 모두는 본 명세서에서 교환적으로 사용될 수 있고, 숙주 안에서 감염을 영속 및/또는 시작하게 하는 병원균의 능력을 중화할 수 있는 것이다. 본 발명의 어떤 구체예에 있어서, 본 발명에 따라 생성된 단일클론 항체는 중화 활성을 갖고, 항체는 10^-9M 또는 그 보다 낮은 농도(예를 들어 10^-10M, 10^-11M, 10^-12M 또는 그 보다 낮은 농도)에서 중화할 수 있다.

본 발명의 면역글로불린 분자는 임의의 타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2), 또는 면역글로불린 분자의 서브클래스일 수 있다. 본 발명에 따른 어떤 구체예에 있어서, 항체는 항원-결합 항체 단편(예를 들어, 인간)이고, Fab, Fab'및 F(ab')₂, Fd, 단일-체인 Fvs(scFv), 단일-체인 항체, 디설파이드-연결 Fvs(sdFv) 및 V_L 혹은 V_H 도메인을 포함하는 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 단일-체인 항체를 포함하는 항원-결합 항체 단편은 가변부(들)를 단독으로 또는 경첩 부위, CH1, CH2, 및 CH3 도메인의 전체 또는 부분의 조합으로 된 것을 포함할 수 있다. 또한 본 명세서는 경첩 부위, CH1, CH2, 및 CH3 도메인을 갖는 가변부(들)의 임의의 조합을 포함하는 항원-결합 단편을 포함한다.

B 세포 분리

본 명세서에서 사용된 "B 세포", "B 기억 세포", "B 림프구", "B 기억 림프구", "기억 세포", "기억 B 세포", 및 그들의 변이체는 교환적으로 사용되고 체액성 면역 반응의 B 세포를 나타낸다. 당업계에 공지된 바처럼, B 세포는 체액성 면역 반응에서 역할을 수행하는(T 세포의 지배를 받는 세포-매개성 면역 반응과는 반대로) 림프구이다. B 세포의 적어도 한가지 기능은 항원에 대항하는 항체를 만들고, 항원 제공 세포(Antigen Presenting Cells, APCs)의 역할을 수행하고 결국 항원 상호작용에 의한 활성화 후에 기억 B 세포를 개발하는 것이다. B 세포는 후천성 면역 시스템의 요소이다.

어떤 구체예에서 "프라이머리 B 세포(primary B cell)"라는 문구는 살아있는 유기체(예를 들어, 인간)로부터 직접 채취한 B 세포를 나타낼 수 있다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 프라이머리 B 세포는 프라이머리 세포 배지에서 배양될 수 있다. 프라이머리 B 세포는 본 발명의 기술분야에 알려저 있는 임의의 방법으로 개체로부터 수거(collected), 수득(obtained), 유래(derived)될 수 있다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 프라이머리 B 세포는 관심 항원을 소유하거나 그것으로 감염된 개체로부터 수득된다.

본 명세서의 방법은 예를 들어, 뎅기 바이러스와 같은 감염성 인자(infective agent)에 노출된 환자와 같은 기증자로부터 선택된 인간 B 세포에 의해 발현되는 단일클론 항체의 식별에 대해 사용될 수 있다. 따라서, 기증자는 실험 당하지 않은(naㅿve), 백신 접종한(vaccinated), 하나 이상의 질병 또는 감염에 의해 병이 발생한, 이미 노출되거나 및/또는 특정 치료 처치에 저항을 가진, 특정 임상적 지수(index) 또는 상태를 나타내는, 병원균에 우연히 노출되는 것 등일 수 있다.

후천성 면역 반응의 장기간 유지 및 특이성(심지어 이 항원에 마지막으로 노출된 지 몇 년 후에도)이 기증자를 선택하는데 충분한 정성적 측정을 가능하게 할 수 있으므로 기증자의 혈청들은 항원에 대한 그들의 혈청 양성 반응(seropositivity)의 초기 측정을 위해 사용될 수 있다. 사용된 스크리닝 검정의 민감도(sensitivity) 및 특성(nature)은 적절한 기증자를 식별하는데 중요하며, 바람직하게는, 기증자 혈청을 스크리닝 하는데 사용되는 검정법은 불멸화된 항체-분비 B 세포로부터 얻은 상층액을 스크리닝 하는데 사용된 것 그리고 원하는 기능적 활성(예를 들어, 중화 활성)을 갖는 항체를 찾기 위해 디자인된 것과 같은 것이어야 한다.

그로부터 세포가 정제되는 조직 또는 기관의 선택은 충분한 양으로 적절한 세포의 유용성(availability)에 의해 좌우될 수 있다. 세포는 신선한 또는 냉동된 샘플 및/또는 충분한 시작 물질을 제공하기 위해 모아져온 많은 개체로부터 얻어진 샘플로부터 수득될 수 있다.

예비 스크린은 항체-분비 세포(총 말초 혈액 또는 혈청과 같은)를 포함하는 샘플을 사용하여 후보 기증자의 패널에 대해서 수행될 수 있다. 특히, 단핵세포는 구배 원심법(gradient centrifugation)과 같은 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)를 분리하는 일반적인 분리 기술을 사용하여 혈액 또는 림프 조직으로부터 분리 할 수 있다. 이 분리 단계 이후 및/또는 이전에, 혈청들(또는 혈장)의 샘플, 세포 배양 상층액, 또는 세포(서로 다른 환자, 서로 다른 조직, 및/또는 서로 다른 시간점에서 얻은)는 항체 및 항체-분비 세포의 존재를 탐지하기 위한 일반적인 기술(예를 들어, ELISA, BIACORE, Western blot, FACS, SERPA, 항원 어레이, 세포 배양 시스템에서 바이러스성 감염의 중화, 또는 ELISPOT 검정)을 사용하여 미리-스크리닝 될 수 있다.

본 발명의 기술분야의 실시예들은, 예를 들어, 백신접종 된 기증자에서 면역 반응의 분석을 위한 ELISPOT의 사용(Crotty S et al., 2004), 새롭게 감염된 환자에 대한 진단 도구로서 항원 마이크로어레이의 사용(Mezzasoma L et al., 2002), 및 항원-특이적 면역 반응들을 측정하기 위한 다른 기술들(Kern F et al., 2005)을 포함한다.

치료적 타겟에 대한 항체 반응의 이러한 예비 정성적 분석은 원하는 정제된 항원(예를 들어, 특이적 재조합 바이러스성 프로틴), 관련된 항원의 혼합물(예를 들어, 부분적으로 정제된 바이러스성 제조물로부터 얻은 것), 또는 바이오에세이(bioassay)(예를 들어, 바이러스성 감염가의 중화)에 관한 더 높은 항체 역가를 나타내는 B세포를 가지고 있는 기증자의 식별을 가능하게 한다.

일단 하나 이상의 기증자가 선택되면, B 세포의 소스는 비장, 혈액, 림프절, 골수, 종양-침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocytes), 만성 감염/염증 부위로부터 얻은 림프구일 수 있다. 그러나, 말초 혈액이 흔히 기증자로부터 얻고, 저장하고, 정해진 기간을 넘어서 항원에 대항하는 혈청학적 반응에 대해 모니터하기 쉽다.

예를 들어, 5-50ml의 말초 혈액, 대략 1000만-1억 개의 PBMCs(말초 혈액 단핵 세포)으로부터 시작하여 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 불멸화된 후에 스크리닝 되는 항체-분비 세포의 충분히 큰 집단을 허용하는 다수의 세포들이 정제될 수 있다.

생물학적 샘플로부터 PBMCs를 분리한 뒤, 본 발명의 기술분야에서 알려진 방법을 사용하여 그들의 표면상의 세포 표면 마커 및, 적절 하다면, 다른 프로틴들의 발현뿐 아니라 증식 활성, 물질대사 및/또는 세포의 형태학상의 상태를 기반으로 항체-분비 세포의 특이적 선택이 수행될 수 있다.

특히, 인간 샘플로부터 얻은 항체-분비 세포의 정제를 위한 다양한 기술들은 양성 또는 음성 선택에 대한 서로 다른 방법 및 상태를 이용한다. 이러한 세포는 항체(예를 들어, 인간 B 세포)를 분비하고 발현하는 세포에 특이적인 세포 표면 마커를 발현시키는 것들을 물리적으로 분리하는 것에 의해서 유효하게 선택될 수 있다. 특정 프로토콜은 본 발명의 기술분야에서 발견될 수 있다(예를 들어, Callard R and Kotowicz K "Human B-cell responses to cytokines" in Cytokine Cell Biology: A practical Approach. Balkwill F. (ed.) Oxford University Press, 2000, pg. 17-31 를 인용한다).

이러한 세포 표면 프로틴 중 하나에 특이적으로 결합하고 고체 받침(solid supports)에 연결될 수 있고(예를 들어, 마이크로비드 또는 플라스틱 플레이트) 또는 형광-활성화 세포 분류기(fluorescence-activated cell sorters, FACS)를 사용하여 탐지될 수 있는 형광 색소로 표지될 수 있는 항체를 사용해서 선택은 수행될 수 있다. 예를 들어, 인간 B 세포는 EBV 불멸화에 앞선 특정 이소타입에 대해 특이적인 항체에 대한 결합 친화력의 결핍에 대한 그들의 친화력, 또는 CD19, CD27, 및/또는 CD22 마이크로비드에 결합하는 받침(마이크로비드와 같은)에 대한 그들의 친화력을 기반으로 하여 선택되어 왔다(Li H et al., 1995, Bemasconi N et al., 2003; Traggiai E et al., 2004).

본 명세서에 나타난 대로, B 세포 활성 및 항원 인식에 관한 신호 전달 경로를 조절하는 막관통 프로틴으로 제한된 B-세포인(Nitschke L, 2005) CD22는 초기 B 세포 선택을 위해 사용될 수 있다. CD22 양성 집단이 서로 다른 이소타입 및 특이성을 갖는 항체들을 발현하는 세포를 포함하므로, 다른 세포 표면 마커들은 또한 세포를 선택하는데 사용될 수 있다.

대안적 또는 추가적으로, 항체-분비 세포의 특정한 강화는 CD22-기반 선택 뿐만 아니라 CD27-기반 선택을 적용해는 것에 의해 얻어질 수 있다. CD27은 체세포적으로(somatically) 돌연변이 된 가변부 유전자를 갖는 인간 B 세포에 대한 마커로 알려져 있다(Borst J et al., 2005). CD5, CD24, CD25, CD86, CD38, CD45, CD70, or CD69와 같은 추가적인 마커들은 세포의 원하는 집단을 줄이거나 혹은 늘리는데 사용될 수 있었다. 따라서, 기증자의 항원(예를 들어, 바이러스성, 박테리아성, 기생충성)에 대한 노출 기록에 따라서, 항체 역가, 총 B 세포, CD22가 강화된 B 세포, 또는 CD27 양성 B 세포와 같이 더 강화된 B 세포 부분모집단이 사용될 수 있다.

B 세포의 EBV 형질전환

특정한 이소타입을 갖는 항체를 발현시키는 세포의 선택되고 촉진된 집단은 바이러스성 불멸화제(immortalizing agents)를 사용하여 불멸화 될 수 있다. 서로 다른 불멸화제는 불멸화된 항체-분비 세포를 얻기 위해 항체-분비 세포에 사용될 수 있다.

바이러스성 불멸화제 중에, 항체-분비 세포를 감염시키고 불멸화시키는 바이러스는 바람직하게는 발명의 실험에서 사용될 수 있다. 흔히 사용된 바이러스는 헤르페스바이러스의 감마 클래스로 그룹화된 림프친화(lymphotropic) 바이러스이다. 이 바이러스 패밀리의 구성원은 종-특이적 방법으로 림프구를 감염시키고, 림프증식성질환(lymphoproliferative disorders) 및 여러가지 암(malignancies)의 성장과 관련된다(Nicholas J, 2000; Rickinson A, 2001).

EBV(엡스타인-바 바이러스, 헤르페스바이러스4 로도 알려짐), 및 HHV-8(인간 헤르페스바이러스 8, KSHV로도 알려짐, 카포시 육종-관련 헤르페스바이러스)는 인간 림프구를 감염시키고 불멸화시킨다. MHV-68(쥣과 헤르페스바이러스 68), HVS(헤르페스바이러스 사미리), RRV(레수스 라디노바이러스), LCV(영장류 림포크립토바이러스), EHV-2(말 헤르페스 바이러스2), HVA(헤르페스바이러스 거미원숭이), 및 AHV-1(알셀라파인 헤르페스바이러스 1)은 그들 사이에서 보존된 공통적인 유전적 특징 및 다른 포유류 숙주 세포에서 비슷한 병원성 효과를 갖는 다른 종양형성(oncogenic), 림프친화 헤르페스바이러스이다. 이러한 바이러스들은 본 발명의 실험에서 사용될 수 있다.

온전한 바이러스의 사용 뿐 아니라, 특정한 바이러스성 프로틴을 포함하는 재조합 DNA 구조체는 B 세포를 불멸화 하는데 성공적으로 사용되어 왔다(Damania B 2004; Kilger E et al., 1998). 바이러스성 유전자를 포함하는 벡터는, 때때로 바이러스-유사 입자의 형성을 위해 필요한 인자들을 트랜스 형태로 제공하는 세포주를 팩킹(packaging) 하거나 레트로바이러스 시스템의 사용을 만드는, 세포 안으로 형질 도입(transduced)될 수 있고 또한 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.

EBV-매개 불멸화는 EBV에 의해 발현되는 프로틴에 기인하는 B 세포의 불멸화를 포함하는 복잡한 과정이며, 숙주 세포 프로틴과 EBV 사이의 상호작용에 의해 조절된다(Sugimoto M et al., 2004; Bishop G E, and Busch L K, 2002). 만약 원한다면, 불멸화 과정 후에 EBNA2, EBNA1, LMP2, LMP1, 또는 EBERs 와 같은 전사물 및 특정 EBV 프로틴의 발현을 측정하는 것이 가능하다(Thorley-Lawson D A, 2001). 이러한 프로틴은 PCR, 면역형광법(immunofluorescence), 웨스턴 블롯, 또는 감염된 세포에서 EBV DNA 및 프로틴의 탐지를 가능하게 하는 다른 방법들에 의해서 탐지될 수 있다(Schlee M et al., 2004; Park C H et al., 2004; Humme S et al., 2003; Konishi K et al., 2001; Haan K et al., 2001).

형질전환된 B 세포의 분리 및 스크리닝

본 발명의 어떤 구체예에서, 형질전환 및/또는 활성화된 B 세포는 원하는 항원 특이성을 가진 것들인지 스크리닝될 수 있고, 그런 뒤 개개의 B 세포 클론은 양성 세포로부터 생성될 수 있다. 스크리닝 단계는 ELISA, 조직 또는 세포(트렌스펙션된 세포를 포함)의 염색, 중화 검정, 및/또는 원하는 항원 특이성을 식별하기 위한 본 발명의 기술분야에서 알려진 많은 방법들 중 하나에 의해 수행될 수 있다. 검정은 간단한 항원 인식을 기반으로 선택할 수 있고, 또는 예를 들어 단지 항원-결합 항체 보다는 중화 항체와 같은 원하는 기능을 추가적 기반으로 하여 선택할 수 있다.

본 발명의 어떤 구체예에서, 양성 세포의 혼합물로부터 개개의 클론을 분리하기 위한 클로닝 단계는 한계 희석(limiting dilution), 미세조작(micromanipulation), 세포 분류에 의한 단일세포 침착, 및/또는 발명의 기술분야에서 알려진 임의의 다른 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 클로닝은 한계 희석을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 클로닝된 B 세포는 활성제-매개 증식성 신호에 대한 숙주 선천적 반응의 억제와 결부되어 있는 EBV-형질전환을 사용하여 불멸화 되어있는 B 세포로부터 유래한 것이다.

본 발명의 어떤 구체예에서, 본 명세서는 원하는 항원 특이성을 가진 항체를 생산하는 불멸화된 B 세포의 생산을 제공한다. 이러한 B 세포는 예를 들어, 단일클론 항체의 소스, 관심 단일클론 항체를 인코딩하는 핵산의 소스(DNA 또는 mRNA), 세포성 치료를 위해 개체에 전달하기 위한, 치료적 또는 약제학적과 같은 다양한 방법으로 사용될 수 있다.

본 발명의 어떤 구체예에서, 배지에 있는 활성화된 B 세포로부터 얻은 상층액은 발명의 기술분야에 알려진 방법을 사용하여 관심 항체가 있는지 스크리닝 될 수 있다. 스크리닝은 관심 항원에 결합할 수 있는 능력이 있는 하나 이상의 단일클론 항체를 식별하기 위해 수행된다. 이러한 스크리닝은 배양 상층액 및/또는 정제된 항체에 대해 수행될 수 있다. 대안적으로, 스크리닝은 활성화 및/또는 불멸화된 B 세포로부터 얻어진 정제된 항체 및/또는 배지 상층액을 사용하여 수행될 수 있다. 게다가, 교차-반응성 항체가 관심 있는 곳에서, 둘 이상의 서로 다른 항원과 교차 반응하는 단일클론 항체의 능력은 측정될 수 있다. 게다가, 본 발명의 어떤 구체예에서, 특정한 기능적 특성(예를 들어, 중화 활성)을 가지고 있는 항체인지 스크리닝하는 것이 바람직 할 수 있다.

본 명세서에 따라 생산된 단일클론 항체의 결합 특이성은 예를 들어, 면역침강(immunoprecipitation) 또는 방사면역측정법(radioimmunoassay) 또는 효소결합면역측정검정(ELISA)와 같은 다른 실험관 내 결합 검정과 같은 면역검정법에 의해 측정될 수 있다.

사용될 수 있는 스크리닝 방법의 대표적이고 일반적인 클래스는 (a) 항체 포획 검정(antibody capture assay); (b) 항원 포획 검정(antigen capture assays); 및 (c) 기능적 스크린(functional screens)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

항체 포획 검정에 있어서, 항원은 고체상과 결합할 수 있고, 실험하고자 하는 단일클론 항체는 항원에 결합하는 것을 가능하게 하고, 결합되지 않은 항체들은 세척에 의해 제거되고, 그런 뒤 결합된 항체들을 예를 들어, 특이적으로 항체를 인식하는 표지된 항체와 같은 2차 시약에 의해 탐지할 수 있다.

항원 포획 검정에 있어서, 항원은 직접적으로 표지될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 실험하고자 하는 단일클론 항체는 고체상에 결합될 수 있고, 그런 뒤 선택적으로 표지된 항원과 반응한다. 대안적으로, 항체-항원 복합체는 실험하고자 하는 단일클론 항체의 고체상에 대한 결합 이전에 면역침강에 의해 형성하는 것이 가능하게 할 수 있다. 일단 항체-항원 복합체가 고체상에 결합되면, 결합되지 않은 항원은 세척으로 제거되고 양성들은 항원을 탐지하는 것에 의해 식별될 수 있다.

원하는 활성들을 갖는 단일클론 항체를 식별하기 위한 다양한 기능적 스크린이 존재한다. 본 명세서에 있어서, 실시예에 기재된 것과 같은, 이러한 스크린은 중화 검정이다.

재조합 발현

본 명세서의 방법은 또한 선택된 B 세포 클론으로부터 얻은 항체에 대한 핵산을 시퀀싱(sequencing) 및/또는 수득하는 방법; 및 관심 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포를 생성하기 위해 핵산을 이용하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 원하는 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 시퀀싱될 수 있고, 그 후에 예를 들어 293 세포 또는 CHO 세포와 같은 이종 발현 시스템(heterologous expression system)에서 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 항체는 관심 항체를 인코딩하는 B 세포 클론으로부터 얻은 하나 이상의 핵산(예를 들어, 헤비 및/또는 라이트 체인 유전자)을 수득하는 것 및 숙주 안에서 관심 항체의 발현을 허용하기 위해 숙주 세포 안으로 핵산을 삽입하는 것에 의해 재조합적으로 발현될 수 있다.

재조합 DNA 방법을 사용한 항체의 생산이, 예를 들어 U.S. Pat. No. 4,816,567에 기재되어 있다. 항체의 재조합 생성을 위해, 그것을 코딩하는 핵산을 분리하고 추가적인 클로닝(DNA 증폭) 또는 발현을 위해 클로닝 가능한 벡터로 삽입된다. 단일클론 항체를 인코딩하는 DNA는 통상적인 방법을 사용하여 쉽게 시퀀싱되거나 분리된다(예를 들어 항체의 헤비 및 라이트 체인을 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것에 의하는 것). 사용될 수 있는 벡터는 일반적으로 하기의 것 중 하나이상을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 신호 서열(signal sequence), 복제 기점(origin of replication), 하나 이상의 마커 유전자, 증강인자 요소(enhancer element), 프로모터(promoter), 및 전사 종료 서열(transcription termination sequence). 이러한 발현 시스템 구성요소의 예들은 예를 들어 U.S. Pat. No. 5,739,277에 개시되어 있다. 본 명세서에 따른 벡터에서 DNA 발현 또는 클로닝에 적합한 숙주 세포는 원핵 세포, 효모, 고등 진핵 세포(예를 들어, U.S. Pat. No. 5,739,277을 인용한다)이다.

약제학적 조성물

본 명세서에 개시된 주제는 본 명세서에 따라 생산된 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 형질전환 및/또는 활성화된 B 세포를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 생산된 하나 이상의 단일클론 항체를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 단일클론 항체 뿐 아니라 현재 개시된 주제의 형질전환 및/또는 활성화된 B 세포 모두 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 명세서에 따라 생산된 단일클론 항체의 패널은 약제학적 조성물에 포함될 수 있따. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 단일클론 항체 및/또는 본 명세서에 따라 생산된 B세포는 항바이러스 약물 또는 진통제와 같은 하나 이상의 추가적인 제제(additional agents)에 포함될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 항체의 투여를 위한 보조제를 포함할 수 있다. 담체 또는 보조제는 조성물을 받는 개체에 위험한 항체의 생산을 그 자신이 유도하지 않아여 하며, 독성이 없어야 한다. 적합한 담체는 프로틴, 폴리펩티드, 리포솜, 폴리사카라이드, 폴리락틱 산, 폴리글리콜 산, 폴리머릭 아미노산(polymeric amino acids), 아미노산 공중합체(ammo acid copolymers) 및 불활성 바이러스 입자와 같은 크고 느리게 물질대사 되는 거대분자일 수 있다.

약제학적으로 허용되는 담체는 염산염(hydrochlorides), 브롬화수소산염(hydrobromides), 인산염, 황산염과 같은 무기산 염(mineral acid salts) 또는 아세트산염, 프로피온산염, 말산 및 벤조산염과 같은 유기산의 염이 쓰일 수 있다.

치료적 조성물에 있는 약제학적으로 허용되는 담체는 추가적으로 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올 과 같은 액체를 포함할 수 있다. 추가적으로, 습윤제, 유화제 또는 pH 완충제와 같은 보조제(auxiliary substances)들은 상기 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 담체는 약제학적 조성물이 환자에 의해 섭취되기 위해 정제, 환제(pills), 당제(dragees), 캡슐제, 액체, 겔, 시럽, 현탁제(slurries) 및 서스펜션의 제형으로 제조되게 할 수 있다.

본 명세서에 개시된 조성물은 조성물 제조 및 투여가 가능하도록 하는 담체를 더 포함할 수 있다. 임의의 적합한 운반체(delivery vehicle) 또는 담체가 사용될 수 있으며, 예를 들어 마이크로스피어(microsphere) 또는 나노스피어(nanosphere)(Manome et al. (1994) Cancer Res 54:5408-5413; Saltzman & Fung (1997) Adv Drug Deliv Rev 26:209-230), 글리코사미노글리칸(U.S. Pat. No. 6,106,866), 지방산 (U.S. Pat. No. 5,994,392), 지방 에멀젼 (U.S. Pat. No. 5,651,991), 지질 또는 지질 유도체 (U.S. Pat. No. 5,786,387), 콜라겐 (U.S. Pat. No. 5,922,356), 폴리사카라이드 또는 그들의 유도체 (U.S. Pat. No. 5,688,931), 나노서스펜션 (U.S. Pat. No. 5,858,410), 폴리머릭 미셀(polymeric micelle) 또는 접합체 (Goldman et al. (1997) Cancer Res 57:1447-1451 및 U.S. Pat. Nos. 4,551,482, 5,714,166, 5,510,103, 5,490,840, 및 5,855,900), 및 폴리솜 (U.S. Pat. No. 5,922,545)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

항체 서열은 카르보디이미드 접합화(carbodiimide conjugation), 에스테르화, 나트륨 과요오드산염 산화 후 환원적 알킬화(sodium periodate oxidation followed by reductive alkylation), 및 글루타르알데하이드 가교화(glutaraldehyde crosslinking)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 발명의 기술분야에서 알려진 방법을 사용하여 활성제 또는 담체와 커플링될 수 있다(Goldman et al. (1997) Cancer Res. 57:1447-1451; Cheng (1996) Hum. Gene Ther. 7:275-282; Neri et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15:1271-1275; Nabel (1997) Vectors for Gene Therapy. In Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, New York; Park et al. (1997) Adv. Pharmacol. 40:399-435; Pasqualini et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15:542-546; Bauminger & Wilchek (1980) Meth. Enzymol. 70:151-159; U.S. Pat. No. 6,071,890; and European Patent No. 0 439 095).

본 발명의 치료적 조성물은 본 발명의 일 구체예에 따른 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 적합한 제형은 수성(aqueous) 및 항산화제, 완충제, 정균제(bacteriostats), 살균항생제(bactericidal antibiotics)를 포함할 수 있는 비-수성 멸균 주입 용액 및 의도된 수용자(recipient)의 체액과 등장인 제형을 만드는 용질; 및 서스펜션화제(suspending agents) 및 농조화제(thickening agents)를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 서스펜션을 포함한다. 제형들은 예를 들어 밀봉된 앰플(ampoules) 및 바이알(vials)과 같은 단위-용량(unit-dose) 또는 멀티-용량(multi-dose) 컨테이너로 나타내질 수 있고, 예를 들어 사용 바로 직전에 주입을 위한 물과 같은 오직 멸균 액체 캐리어(sterile liquid carrier)의 첨가를 필요로 하는, 냉동 또는 동결-건조(lyophilized) 환경에서 저장될 수 있다. 몇몇 예시적인 성분들은 일 구체예에서 0.1 내지10 mg/ml의 범위인, 일 구체예에서 약 2.0 mg/ml 인 SDS; 및/또는 일 구체예에서 10 내지 100 mg/ml의 범위인, 일 구체예에서 약 30 mg/ml인 만니톨 또는 다른 당; 및/또는 인산-완충 식염수(PBS)이다. 문제되는 제형의 타입을 유념하는 발명의 기술분야에서 통상적인 그 밖의 제제들이 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 담체는 약제학적으로 허용되는 것이다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 담체는 인간에게 사용되기 위해 약제학적으로 허용되는 것이다.

본 명세서의 약제학적 조성물은 5.5 내지 8.5의 pH, 바랍직 하게는 6 내지 8, 더 바람직 하게는 약 7의 pH를 가질 수 있다. pH는 완충제를 사용하는 것에 의해 유지될 수 있다. 조성물은 멸균 및/또는 무 발열원(pyrogen free)일 수 있다. 조성물은 인간에 대해 등장성인 것일 수 있다. 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 용봉된 컨테이너(hermetically-sealed containers)로 공급될 수 있다.

약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 항체의 유효한 양을 포함할 수 있다.본 발명의 일 구체예에 있어서, 약제학적 조성물은 탐지 가능한 치료 효과(Therapeutic effects)를 나타내기에, 또는 원하는 질병 또는 질환을 예방, 개선(ameliorate), 또는 치료하기에 충분한 양을 포함할 수 있다. 또한 치료 효과는 신체적 증상에서의 감소를 포함한다. 임의의 특정 개체에 대한 정확한 유효양은 그들의 크기 및 건강, 질환의 정도 및 특성, 투여를 위해 선택된 치료의 조합 또는 치료(therapeutics)에 의존하게 될 것이다. 주어진 조건에 대한 유효양은 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에 의해 실행되는 것으로서 일반적 실험에 의해 측정된다.

치료 계획( treatment regimens ): 약물동력학( pharmacokinetics )

본 발명의 약제학적 조성물은 투여 방법에 따라 다양한 단위 용량 형태로 투여될 수 있다. 전형적 항체 약제학적 조성물에 대한 용량은 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 이러한 용량은 전형적으로 특성에 따라 권고되며(advisory) 환자의 내성 또는 특정한 치료적 맥락에 따라서 조절된다. 이를 달성하는데 적절한 항체의 양은 "치료적으로 유효한 용량"으로 정의된다. 이러한 사용에 대해 유효한 복용량 스케줄 및 양, 즉 "복용 계획(dosing regimen)"은 질환 또는 질병의 단계를 포함하는 인자의 다양성, 질환 또는 질병의 심각성, 환자 건강의 일반적인 상태, 환자의 신체적 상태, 나이, 약제학적 제형 및 활성제의 농도, 및 기타 같은 종류의 것에 의존하게 될 것이다. 환자를 위한 복용 계획을 계산하는 것에 있어서, 투여 방식은 또한 고려되어야 한다. 복용 계획은 또한 약물동력학, 즉 약제학적 조성물의 흡수 속도, 생체이용률(bioavailability), 물질대사, 제거율(clearance), 및 기타 같은 종류의 것을 고려해야만 한다. 예를 들어, the latest Remington's; Egleton, Peptides 18: 1431-1439, 1997; Langer, Science 249: 1527-1533, 1990를 인용한다.

본 발명의 목적을 위해, 항체를 포함하는 조성물의 치료적으로 유효한 양은 약 0.05 내지 1500 μg 프로틴, 바람직하게는 약 10 내지 1000 μg프로틴, 더욱 바람직하게는 30 내지 500 μg 및 가장 바람직하게는 약 40 내지 300 pg, 또는 이러한 값들 사이의 임의의 정수인 프로틴을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 약0.1 μg 내지 약 200 mg, 예를 들어, 약 0.1 μg 내지 약 5 μg, 약 5μg 내지 약 10μg, 약 10μg 내지 약 25μg, 약 25μg 내지 약 50μg, 약 50μg 내지 약 100μg, 약 100μg 내지 약 500μg, 약 500μg 내지 약 1 mg, 약 1 mg 내지 약 2 mg의 용량으로, 예를 들어 1주, 2주, 3주, 4주, 2달, 3달, 6달 및/또는 1년 뒤에 주어지는 선택적인 추가 접종(boosters)과 함께 개체에 투여될 수 있다. 임의의 특정한 환자에 대한 특정 용량 수준은 사용된 특이적 항체의 활성, 나이, 체중, 일반적 건강상태, 성별, 식이(diet), 투여 시간, 투여 주기, 배설 주기, 약물 조합, 치료가 수행되는 특정 질환의 심각성을 포함하는 다양한 인자들에 의존한다는 것은 이해되어야 한다.

투여 경로는 경구, 국소(topical), 피하(subcutaneous), 근육 내(intramuscular), 정맥 내(intravenous), 피하(subcutaneous), 피내(intradermal), 경피(transdermal), 피하(subdermal)로 투여되는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 투여 경로에 따라서, 용량 당 부피는 바람직하게는 약 0.001 내지 10 ml, 보다 바람직하게는 약 0.01 내지 5 ml, 및 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 3 ml이다. 조성물은 개체의 나이, 상태 및 무게에 적합한 주기, 사용된 특정한 항체 제형, 및 투여 경로 및 스케줄에 따라 단일 용량 치료 또는 다중 용량 치료로 투여될 수 있다.

키트

본 발명은 예를 들어, 위에서 기재된 치료적 용도를 위한 것처럼 사용되는 본 명세서에 따라 생산된 항체를 포함하는 키트를 제공한다. 제조품(article of manufacture)은 라벨이 붙은 컨테이너를 포함한다. 적합한 컨테이너는 예를 들, 보틀(bottles), 바이알, 및 시험 튜브(test tube)를 포함한다. 컨테이너는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 만들어진 것일 수 있다. 컨테이너는 상기에 기재된 것과 같은 치료적 용도에 유효한 활성제를 포함하는 조성물을 갖는다. 조성물에 있는 활성제는 항체를 포함할 수 있다. 컨테이너의 라벨은 조성물이 특정한 치료 또는 비-치료적 용도로 사용될 수 있음을 나타내며, 또한 상기에 기재된 것과 같이 생체 내 혹은 시험관 내 용도에 대한 지시를 나타낸다.

본 발명을 수행하기 위한 특정한 측면의 하기의 실시예들은 오직 예시적인 목적을 위해 제안된 것이며, 어떤 방법으로는 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니다.

실시예

방법 및 재료

윤리 선언(Ethics Statement)

고지에 입각한 동의(Informed consent)가 얻어졌으며 모든 과정은 국립 대학 기관 감사 위원회(National University Institutional Review Board, NUS-IRB 넘버는 06-196이다)로부터 승인된 프로토콜에 따라서 수행되었다.

세포 및 바이러스

C6/36 세포 및 BHK-21 세포를 이전에 기재한 대로 배양하였다(28). EHI 및 PVP 159 스트레인을 제외한 모든 뎅기 스트레인을 싱가포르의 열대 질병의 노바티스 기관(Novartis Institute of Tropical Diseases, NITD)으로부터 수득하였다. EHI 스트레인을 싱가포르의 환경 건강 기관(Environmental Health Institute, EHI)으로부터 수득하고, PVP 159를 (DENV1/SG/07K3640DK1/2008) EDEN 환자 집단으로부터 수득하였다(29).

B 세포의 클로닝

B 세포의 분리 및 불멸화를 이전에 기재된 대로 수행하였다(10). 배양 15일 후, 상층액을 ELISA 및 PRNT에 의해 DENV-특이적 항체가 있는지 스크리닝하였다.

ELISA 결합 검정

96 웰의 평평한 바닥 플레이트(Maxisorp plates, Nunc)를 5 μg/ml의 마우스 4G2항체로 하룻밤 동안 코팅하였다. 플레이트를 PBS/Tween-20 0.01%으로 3번 세척하였다. 서로 다른 DENV 스트레인을 웰 마다 1x10⁵ pfu 의 50 μl을 첨가하였고, 그 후에 2시간 동안 배양하였다. 플레이트를 PBS/Tween-20 0.01%으로 3번 세척하였다. HM14C10을 플레이트에 첨가하고 추가로 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 PBS/Tween-20 0.01%으로 3번 세척하였다. HRP 접합된 항-인간 IgG(Pierce, Singapore)를 첨가하고, 1시간 동안 배양하였다. TMB 기질(GE healthcare, Singapore)을 첨가하고 반응을 정지시키기 위해 0.1M의 황산을 사용하였다.

재조합 HM14c10의 생산

B 세포로부터 얻은 RNA를 RNA 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 추출하였다. 재조합 항체의 클로닝 및 발현을 이전에 기재된 대로 수행하였다(30).

항체-의존성 강화 검정(Antibody-dependent enhancement assay)

뎅기 바이러스(5 X 10² pfu/ml)를 개개의 단일클론 항체(HM4G2, HM14c10 또는 HM14c10 N297Q) 또는 HM14c10 단일클론 항체의 서브클래스(IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4), 배지로 사전-배양하고 그런 뒤 10⁵ 의 K562 세포에 첨가하였다. 한시간 뒤에, 결합되지 않은 바이러스 및 단일클론 항체를 제거하기 위해 세포를 광범위 하게 PBS로 세척하였다. 추가 48시간 후에, 상층액을 수확하고 BHK-21 세포에 대한 플라크 검정으로 바이러스성 역가를 측정하였다.

생체 내 마우스 실험

AG129 마우들은 IFN-α/β 및 -γ수용체들이 결핍된 것이다(31). 마우스들을 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee recommendations, IACUC 프로토콜 no: 018/11)에 따라 처리하였다. PBS 처리 대조군 대 HM14c10의 예방적 및 치료적 용도를 상세히 열거한 개념도(schematic diagram)는 도 21에 제공되어 있다. 마우스들을 희생시키고 시판된 플라크 검정(32)에 의해 바이러스 혈증을 정량화 하였다.

시간 경과 공초점 생존 세포 이미징(Time-lapse Confocal Live Cell Imaging)

모든 시간 시간 경과 생존 세포 현미경 관찰법을 플라나포크로마트(Plan-Apochromat ) 100X 1.4 개구수 (N.A.) 렌즈를 사용하는 반전된 A1Rsi 공초점 현미경(Nikon, Japan)으로 수행하였다. 생존 세포 이미징을 챔버 홀더(chamber holder)( Nikon, Japan) 위에 올려진 25mm 유리 커버슬립(coverslips)( Marienfeld GmbH, Germany)에서 기른 살아있고 고정되지 않은 BHK세포로 수행하였다. 세포를 실험 1일 전에 4 × 10⁴/웰 의 밀도로 분주(seeded)하였고 10% FCS이 추가된 RPMI 1640배지에서 배양하였다. Alexa Fluor-488 표지된 항체와 Alexa Fluor-647 표지된 DEN1 바이러스의 동시 탐지를 위해, 아르곤 이온 레이저의 488nm 라인 및 633-nm 헬륨 네온 레이저의 빛을 HFT UV/488/633 빔 스플리터(beam splitter)로 탐지하였고, Alexa Fluor-488 탐지를 위한 505-530 대역필터 및 650 Alexa Fluor-647 탐지를 위한 롱 패스 필터(long pass filter)와 결합한 NFT 545 빔 스플리터를 사용하여 형광성을 탐지하였다. 이미지를 1 초당 프레임 수(fps)에서 30 초 간격으로 30 내지 60분 동안 포착하였다. 모든 생존 세포 이미징 실험을 37℃, 5% CO₂의 현미경 케이지 배양기 시스템(OkoLab, Italy)에서 배양된 세포를 사용하여 수행하였다. 이미지를 니콘 이미징 소프트웨어(NIS) 엘레멘트 C 소프트웨어(64 bit, version 3, SP7/build 547)[Nikon, Japan]에 의해 분석 및 가공하였다.

세포 내 형광의 정량화

DENV1의 엔도시토시스에 대한 항체의 효과를 살아있는 세포 내에서 형광의 상대적 수준을 측정하는 것에 의해 평가하였다. 개별적인 항체로 치료한 뒤에, 적어도 100개 세포의 이미지를 세 번의 독립적인 실험으로부터 A1Rsi 공초점 현미경을 사용하여 무작위로 얻었다. 그런 뒤 세포의 세포 내 부위를 NIS 엘레멘트 소프트웨어(Nikon, Japan)의 "관심 부위"[ROI] 기능을 사용하여 개별적으로 수동으로 경계를 표시하였고 각 세포 내에서 Alexa Fluor-488의 상대적 형광 수준은 소프트웨어의 ROI 통계 기능을 사용하여 측정하였다. 평균, 표준 편차 및 스튜던트 t-테스트를 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 각 세포 집단에 대해 계산하였다. DEN1으로 감염된 비처리 세포 집단으로부터 얻은 형광을 100%로 표준화 하고 항체-처리 감염 세포와의 비교로서 사용하였다.

CryoEM

뎅기 바이러스(스트레인 PVP 159)를 전에 기재된 대로 제조하였다(3). 바이러스를 Fab HM14c10와 1:1의 몰비 로 혼합하였고, 37℃에서 30분 동안 배양하였고, 그런 뒤 4℃에서 2시간 동안 배양하였다. 그런 뒤 복합체를 연속적 탄소(continuous carbon)의 얇은 층으로 코팅되어있는 레이시(lacey) 탄소 그리드(grids)의 액체 에탄에서 급속 냉동 하였다. 바이러스 입자들을 하기 조건에서 300 kV FEI Titan Krios 로 이미지화 하였다: 16 e^-/Ų의 전자 용량, 47,000의 배율, 1 μm 내지 3 μm의 디포커스(defocus) 범위. 이미지들을 픽셀 크기가 픽셀 당 1.9 Å이 되도록 4K Gatan CCD 카메라에 의해서 4K로 기록하였다. 총 5,566 입자들을 상자에 넣었고(boxed), 대조 전이 기능 파라미터(contrast transfer function parameters)를 EMAN (33) 프로그램 묶음(program suite)에 있는 프로그램 복서(boxer) 및 씨티핏(ctfit)을 각각 사용하여 측정하였다. 입자의 방향(Orientation)을 멀티-패스 시뮬레이티드 어닐링(multi-path simulated annealing, MPSA) 프로토콜(34)을 사용하여 측정하였다. 웨스트 나일 바이러스를 초기 모델(26)로 사용하였다. 3차원적 맵을 EMAN의 프로그램 make3d를 사용하여 생성하였다. 최종 맵의 해상도를 0.5의 파울러 쉘 계수 컷오프(fourier shell coefficient cutoff)에 의해 측정된 대로 7 Å 해상도가 되도록 하였다. DENV1 후-융합 E 프로틴 크리스탈 구조(18)는 리지드 바디로서 cryoEM 밀도 맵 안에 잘 맞지 않으며, 따라서 E 프로틴의 도메인을 분해한 후 따로따로 피팅하였다. 그런 뒤 cryoEM 맵(4σ 윤곽 수준으로 맞춘)내의 분자의 피트(fit)를 키메라의 "피트-인-맵(fit-in-map)" 기능을 사용하여 최적화 하였다. HM14c10 가변부의 상동성 모델을 형성하기 위해, 베스트 서열 매치(sequence match)를 갖는 구조를 선택하였고(PDB 코드 2GHW), 상동성 모델을 Moddller(19)를 사용하여 형성하였다. 상동성 모델의 헤비 및 라이트 체인을 Fab의 두 개의 가능한 방향으로 cryoEM 맵(3σ 윤곽 수준으로 맞춰진) 안에 각각 피팅하였다.

실시예 1: 강하게 중화하는, 회복중인 DENV1 감염 환자로부터 얻은 DENV1 특이적 항체 14c10의 분리.

DENV1에 대해 세로타입-특이적 결합 및 중화 활성을 갖는 항체를 분비하는 B-림프구 세포주의 그룹을 식별하였고, 서브-클로닝 및 확장하였다(expanded). 이러한 세포주들중 하나인, BCL-14c10은 다른 것들에 비해 현저히 강한 결합 및 중화 활성을 갖는 IgG를 생산했다(도 14A). 이 세포주를 PCR 증폭에 대한 면역글로불린 유전자 주형 및 재조합 인간 IgG1s의 발현의 소스로 사용하였다(도 14B(a)). 하나의 재조합 인간 항체 (HM) 14c10은 부모 BCL-14c10와 비슷한 DENV1에 대한 결합 활성을 가졌다. HM14c10은 DENV1에 결합하였고 중화하였으나 DENV2, 3, 또는 4에는 그렇지 않고(도 14C), 시험관 내 0.328 μg/ml 의 PRNT₅₀에서 강한 중화 활성을 나타내었다(도 11A).

DHF 및 DSS의 성장과 관련된 ADE 활성은 DENV 및 항체의 서브-중화 농도가 Fc 수용체-지지 세포(Fc receptor-bearing cells)에 결합하는 복합체를 형성할 때 발생하는 것으로 제안되어져왔다. 이는 바이러스 활용 및 전-염증성 사이토카인 및 케모카인(11)의 분비의 증가를 이끌었다. 우리는 골수단구(myelomonocytic) 세포주 K562를 발현하는 FcγR를 사용한 시판된 시험관 내 검정을 사용하여 인간화된 항-플라비바이러스 단일클론 항체 HM4G2와 HM14c10의 ADE 활성을 비교하였다. HM4G2는 교차-세로타입 결합 활성을 가지고, DENV1-4에 있는 E-DII의 보존된 융합 루프를 타겟으로 한다(13). 우리는 HM14c10이 서브-중화 농도에서 DENV1 감염의 동형 강화를 약간 나타내나, DENV 2, 3, 또는 4에 대해서는 그것에 결합하지 않으므로 강화 활성이 없음을 관찰하였다. 반면, HM4G2은 서브-중화 농도에서 모든 네 개의 세로타입의 강화를 매개한다(도 11B). HM14c10의 관찰된 동형 ADE 활성에 대한 K562 FcγRs의 기여를 조사하기 위해, 우리는 Fab 단편으로서 항체를 발현시키거나 또는 글루타민(Q)에 대한 위치 297에서 아스파라진 잔기(N)의 치환을 통해 인간 IgG1의 당화 부위(glycosylation site)를 제거함으로써 FcγR 결합을 감소시켰다(14). HM14c10Fab 및 N297Q 돌연변이 둘 모두 전체 IgG1 조절(controls)에 대해 그들의 동형 ADE 활성의 감소를 나타내었다(도 11C(a)). 우리는 다음으로 ADE 활성에 대한 IgG 서브-클래스의 영향을 비교하였고 K562에서 FcγRIIA에 대한 보고된 결합 활성과의 편상관 관계(partial correlation)를 관찰하였다. ADE 활성은 하기와 같이 순위가 매겨질 수 있다: IgG3>IgG1>IgG2>IgG4, IgG3가 가장 높고 IgG4가 가장 낮다(도 11C(b)). 따라서 이러한 중화 항-DENV 항체의 ADE 활성은 바이러스 중화에 대한 보체 성분 및 높은 친화성 FcγR1의 영향이 본 실험에서 다루어지지 않았더라도 FcγR 결합에 대해 의존하고 있는 것을 나타낸다(16).

DENV에서 추가적인 복합성은 단일 세로타입 내에 있는 다중 유전자형(multiple genotypes)의 존재이다. DENV1 유전자형은 그들의 아미노산 조성에 있어서 3%까지 변화할 수 있으며 마우스 항-DENV 항체들에 대한 이전의 보고들은 유전자형 사이에서 보호활성이 변화할 수 있다는 것을 제시해 왔다(17). 우리는 HM4G2를 갖는 두 이질적인 DENV1 유전자형(I 및 IV)을 나타내는 많은 DENV1 임상적 고립(clinical isolates)에 대한 HM14c10의 결합 활성을 비교하였다. HM14c10 및 HM4G2 모두 실험된 유전자형에 대해 결합 활성을 나타냈으며, 모든 케이스에서 HM4G2가 더 나은 결합 특성을 보였다(도 15). 반면, HM14c10은 실험된 모든 고립(isolates)/유전자형에 대해 HM4G2에 비하여 우수한 중화 활성을 나타내었다(도 11D).

실시예 2: HM14c10은 4차 구조 의존 에피톱에 결합한다.

주어진 항체와 DENV간의 상호작용의 정확한 특성은 중화를 설명하는 실마리(key)를 가지고 있어야 한다. 이를 측정하기 위해, Fab HM14c10:DENV1 복합체의 크라이오-전자 현미경 관찰(cryoEM) 구조를 7 Å 해상도로 나타내었다(도 12A). 모두 거주한 상태에서(At full occupancy), 120 카피(copies)의 Fab HM14c10은 바이러스 표면에 있는 모든 이용 가능한 180카피의 E 프로틴에 결합한다. E 프로틴에서 HM14c10의 족문을 식별하기 위해, DENV1 E 프로틴의 크리스탈 구조(18)를 cryoEM 밀도 맵으로 피팅하였다(도 16 및 표 1). 7 Å의 해상도 cryoEM 맵은 상호작용하는 인터페이스에서 E 프로틴 잔기의 식별을 가능하게 하는, E 프로틴 및 HM14c10 Fab 간의 깨끗한 밀도 결합을 나타냈다(도 12B 및 도 17). HM14c10에 의해 인식되는 에피톱은 바이러스의 4차 구조에 의존한다. HM14c10의 두 Fab는 바이러스 비대칭 단위에서 세 개의 E 프로틴에 결합한다(도 12C 및 D). 각 항체는 E-DIII상의 에피톱의 반 및 E-DI상의 다른 나머지 에피톱의 반 및 인접한 E 프로틴의 E-DI-E-DII 경첩을 갖는 두 개의 인접한 E 프로틴을 가로질러 결합한다.

E 프로틴과 Fab의 상호작용을 이해하기 위해, HM14c10 가변부의 상동성 모델을 레퍼런스(reference) 인간 항체 구조에 기반을 두고 모델러(Modeller)를 사용하여(19) 형성하였다(도 18). 그런 뒤, 상동성 모델의 라이트 및 헤비 체인의 가변부를 cryoEM 밀도로 피팅하였다. 두 체인의 구조가 서로 비슷함에도 불구하고, 밀도와 더 나은 상관관계를 보이는 독특한 피트가 있다. Fab-E 프로틴 인터페이스의 분석은 헤비 및 라이트 체인의 모든 상보성 결정 부위(CDR)는 상호작용에 관련되어 있음을 제시한다(도 S6C).

HM14c10 : DENV1 cryoEM 밀도안에서 DENV 1 E 프로틴 도메인의 피팅.

비대칭 유닛에서 E 프로틴a	E 프로틴 도메인	피팅된 원자의 개수	원자 위치에서 피팅 전b/후c 평균 맵 값	피팅 전b/후c 윤곽 밖에 있는 원자의 갯수	이전 위치로부터의 변화(Å)	이전 위치로부터의 회전(°)
A	I	889	3.790 / 4.291	447 / 362	2.63	16.1
	II	1,260	4.635 / 5.212	533 / 424	2.16	3.02
	III	1,522	3.592 / 4.141	816 / 695	2.98	6.07
B	I	889	4.126 / 4.368	403 / 368	1.37	12.7
	II	1,260	4.715 / 5.359	539 / 409	2.30	4.51
	III	1,522	4.185 / 4.380	685 / 648	1.48	4.75
C	I	889	4.033 / 4.261	407 / 379	1.93	10.2
	II	1,260	4.744 / 5.098	499 / 428	1.06	7.37
	III	1,522	4.100 / 4.345	739 / 668	1.64	6.03

^a E 프로틴 위치의 지정을 위함, 도 12를 인용.

^b 뎅기 1 E 프로틴 도메인을 성숙한 뎅기 2 바이러스의 cryoEM 구조의 E 프로틴 위치에서 먼저 겹치게 하였다. (27).

^c HM14c10:DENV1 cryoEM 맵 안의 뎅기 1 E 프로틴 도메인의 피트를 (4σ의 윤곽수준으로 맞춘) 키메라의 피트-인-맵 기능을 이용하여 최적화하였다(35).

비대칭 단위에 있는 두 HM14c10 Fab의 결합 족문은 둘 모두의 인터페이스에 공통된 12개의 아미노산과 동일하지 않으나(도 12D), 4개는 독특하다(표 2). 서로 다른 DENV1 분리주 간의 에피톱 잔기의 서열 비교는 HM14c10의 관찰된 중화 활성과 일치하는, 대부분의 잔기는 보존된다는 것을 나타낸다(도 20A). 반면, 이러한 잔기는 다른 DENV 세로타입 또는 웨스트 나일 바이러스(WNV)에서는 보존되지 않는다(도 20B).

DENV 1 E proteins 에서 Fab HM14c10 에피톱

Fab	비대칭 단위에 있는 E 프로틴 분자	E 프로틴 도메인	E 프로틴 잔기*
HM14c10(I)	A	I	T51, L135, K136, G159, T160, T165, P166, Q167, E172, I173, T275
	A	II	N52, G274
	B	III	K310, E384, K385
HM14c10(II)	B	I	T51, Q131, Y132, G159, T160, T165, P166, Q167, E172, I173, L175, T275
	B	II	N52, G274
	C	III	L308, K310

^* Fab HM14c10(I) 및 HM14c10(II)에 의해 결합된 두 에피톱에 공통되는 잔기는 굵은 글씨로 나타내었다.

실시예 3: 시간 경과 공초점 현미경 관찰법은 HM14c10의 중화 메커니즘을 드러낸다.

항체는 바이러스 부착 또는 엔도조말(endosomal) 막으로의 합성의 억제, 또는 표면 글리코프로틴(glycoproteins)의 바이러스-유도 구조적 변화(virally-induced)를 차단하는 것을 통하는 것을 포함하는 다양한 메커니즘에 의해 바이러스성 감염을 중화한다(20, 21). DENV1의 HM14c10 중화의 메커니즘을 이해하고자, 살아있고, 형광으로 태그된(tagged) DENV에 의해 세포의 감염을 추적하기 위해 시간 경과 공초점 현미경 관찰법을 사용하였다(22)(도 13 및 21A). BHK 세포를 DENV1 및 이소타입 대조군 Mabs(비-DENV 결합)과 함께 배양하였을 때, 바이러스는 다중으로, 대부분 핵주위에(perinuclear), 세포 내 구획(intra-cellular compartments)으로 병합되었다(coalesced)(도 14A(a)). HM4G2의 중화 농도는 세포 밖에 있는 바이러스성 무리(aggregates)의 형성을 유도하나, 이들은 또한 성공적으로 내재되어 있으며(internalized), HM4G2가 바이러스 부착/내재화를 억제하지 않는다는 것을 확인한다(도 13A(b)). 반면, HM14c10은 더 작은 무리의 형성을 유도하나, 1시간 후에 세포 밖 공간에 남아있는 작은 바이러스성 입자의 대부분과의 부착을 효과적으로 차단한다. HM4G2는 이소타입 대조군과 비교하여 세포 내 바이러스들의 축적을 지연시킨다(도 13B, 위 및 중간 패널). HM14c10:DENV1 복합체는 세포에 들어가는데 실패하였으나, 그들의 표면으로부터 편향되는 것으로 보인다(도 13B, 아래 패널). 모든 세가지 상황에 내재된 형광 DENV1 의 정도를 정량화 하였다(도 13C). 이 데이터는 HM14c10에 의한 DENV 1 억제의 주된 모드는 숙주세포에 바이러스의 부착을 차단하는 것을 통한다는 것을 제시한다.

실시예 4: HM14c10는 생체내에서 대단한 예방적, 치료적 활성을 나타낸다.

DENV는 면역 능력이 있는 설치류(rodents)에서 자연적인 병원균이 아니며, Type I/II IFN에 대한 수용체가 결핍된 AG129 마우스들에서 복용-의존 바이러스혈증을 유도하는 것이 가능하다. 우리는 변경되지 않은 DENV1을 이러한 마우스들에게 피하(모델 I, 도 21B(a)) 또는 복강내(모델 II, 도 21B(b))로 주입하였고, 그런 뒤 각각 3-4일 뒤에 바이러스혈증을 정량화 하였다(20). 이질적인 유전자형(EHI-D1 유전자형 I 대 웨스트팩 유전자형 IV)을 나타내는 두 DENV1 임상적 분리주를 HM14c10의 생체 내 효능을 측정하기 위해 사용하였다. 두 모델 모두에서, HM14c10은 DENV1감염 전 24시간 또는 감염 후 48시간에 마우스들에게 주어졌을 때 질병을 예방하였다(도 13D). 바이러스 혈증에서 현저한 감소가 관찰됐던 HM14c10의 가장 낮은 농도는 마우스당 0.6μg 이며(또는 160pM), 보고되었던 다른 어떤 항-DENV 치료 제형(formulation)과는 맞지 않는 생체 내 효능을 나타낸다.

고찰(discussion)

DENV 감염에 의해 야기된 체액성 반응에 대한 최근의 보고들은(23, 24) 약한 중화 활성을 갖는 것으로 대부분 DENV 세로타입 교차-반응성인 항체의 우위가 존재한다는 것을 제시한다. 인간 항체 레파토리에서의 결핍에 불구하고, E-DIII 항체는 DENV 감염에 대항하여 보호하는 것으로 제시되고(23, 24), 이는 DENV에 대한 쥣과 항체 반응에 대한 연구들과 일치한다(7). 분석된 인간 항체는 주로 바이러스 E 프로틴의 DI 및 DII에 대해 특이성이 있어왔다. 분석된 항체의 작은 숫자가 4차 구조 의존 에피톱을 제시하는 재조합 E 프로틴이 아닌 전체 바이러스에 결합하는 것이 관찰되었다(23). 본 연구에서, 우리는 DENV 세로타입 1에 대항하는 잠재적 중화 항체를 철저히 분석하고 분리하였다. 이 항체는 체내 및 시험관 내 환경 모두에서 매우 중화시킨다. 이것이 오직 DENV1에만 결합하므로, 다른 DENV 세로타입에 의한 골수단구 세포의 강화된 감염을 야기하지 않는다.

DENV1과 복합체를 형성한 Fab HM14c10의 7Å 해상도 cryoEM 구조는 Fab와 E 프로틴 간의 결합의 디테일(details)을 보여준다. 이 디테일의 수준은 이전에 항체-플라비바이러스 복합체의 cryoEM 구조에서는 관찰되지 않아왔다. HM14c10의 족문은 인접한 E 프로틴으로부터 온 E-DII: E-DI 및 E-DIII를 가로질러 걸친다(도 12D). WNV에 대해 특이적인 인간 항체 CR4354에 대한 보고는 또한 이러한 부위를 면역성에 대한 표적으로 시사하여왔다(25). Fab CR4354와 복합체를 형성한 WNV의 cryoEM 구조가 더 낮은 해상도로 해결되었고(14Å 해상도)(도 22A), Fab CR4354 크리스탈 구조의 피팅은 가원자(pseudo-atomic) 해상도 구조를 만들었다. 이는 상호작용하는 잔기의 식별을 허용케하였다. WNV에 있는 CR4354 에피톱 및 DENV1에 있는 HM14c10 에피톱의 비교는 CR4354가 E-DIII에 대해 더 큰 족문 비율을 가지는 반면 HM14c10는 E-DI에 대한 대부분의 상호작용 잔기를 가진다는 것을 보여줬다. 에피톱의 서열비교는 오직 대략 20%의 CR4354가 HM14c10 에피톱과 겹치고, 겹치는 잔기들은 대부분 비-보존적이라는 것을 보여줬다(도 22C).

CR4354 및 HM14c10 에피톱이 일치하지 않는다 해도, 이러한 항체의 결합은 인접한 E 프로틴을 함께 붙잡아야 했고, 그렇게 함으로써 바이러스 구조를 잠그고 생산적인 감염(productive infection)에 필수적인 구조 변화, 즉 숙주 수용체에 대한 바이러스 부착 및 숙주 세포 엔도사이틱 경로(endocytic pathway)내에서 융합을 방지한다. 시간 경과 생존 이미징 공초점 현미경 관찰은 HM14c10가 숙주세포에 대한 DENV의 부착을 억제한다는 것을 나타낸다. 반면 CR4354는 하나 이상의 억제 메커니즘의 결과를 낳는 항체에 의한 이 지역을 표적화 하는 것을 제시하는 WNV 융합을 우선적으로 억제하는 것으로 나타났다.

DENV 의 표면 프로틴은 생리학적 조건에서 계속되는 변화(constant change)를 겪는 것으로 제시되어왔다-이는"호흡(breathing)"으로 정의된다(21). 호흡이 세포에 대한 바이러스의 부착을 가능하게 하는 역할을 수행할 수 있다는 것이 가능하다. HM14c10이 표면 E 프로틴에 교차결합 하므로, 호흡을 수행하는 것으로부터 표면 프로틴을 예방하는 것에 의해 부착을 억제할 수 있다. 대안적으로, E-DIII는 숙주 세포 부착에 중요한 것으로 나타내어져 왔고, 따라서 E-DIII에 대한 HM14c10의 결합은 이러한 과정을 입체적으로 방해할 수 있다. 비록 HM14c10과 유사한 부위로 결합하더라도, HMAb CR4354는 WNV 부착을 억제하지 않는다. 이것은 WNV를 유발하는 뇌염 및 DENV를 유발하는 열성병(febrile illness)이 동일한 수용체 결합 결정인자를 공유하지 않는다는 것을 시사한다.

HMAb CR4354는 낮은 pH에서 엔도조말 막으로의 바이러스 융합을 예방하는 것으로 나타났다(25). HM14c10이 또한 인접한 E 프로틴을 가로질러 결합하므로, 융합 도중에 HM14c10이 이합체 E 에서 삼량체로의 재배열을 억제할 수 있다는 가능성을 배제할 수 없다. 수용체 결합 및 융합 모두를 억제할 가능성은 생체 내에서 특출난 HM14c10의 효능을 설명할 수 있다.

대부분의 플라비바이러스 E-프로틴은 WNV(26) 및 DENV(27)의 cryoEM 구조 사이에서 높은 유사도에 기반하여 비슷한 4차 구조를 갖는다. 그러므로, 모든 플라비바이러스 표면 E 프로틴은 그들의 감염 주기 동안에 비슷한 구조적 재배열을 겪을 수 있다. 그러므로 다른 플라비바이러스에서 HM14c10 또는 CR4354와 비슷한 부위를 표적으로 하는 항체는 보호적일 수 있다. HM14c10 및 CR4354 항체들은 오직 이러한 결합 활성이 특징화된 두 항체이며 그 둘은 인간 소스로부터 유래되었으므로, 이는 이러한 에피톱의 타입이 아마도 일반화된 플라비바이러스 면역성에 대한 결정인자라는 것을 나타낸다. 이는 미래 백신의 평가(evaluation) 및 디자인에 대해서 중요한 영향을 갖는다.

마지막으로, HM14c10이 대부분의 임상적인 DENV1 분리주에 대항하는 강한 중화 프로파일 및 생체 내에서 훌륭한 효능을 갖는다는 것에 비추어 볼 때, 이 항체는 DENV1 감염 환자의 치료에 대한 좋은 치료적 후보임을 나타낸다.

본 발명의 특정 측면이 기재되고 설명된 반면, 이러한 측면들은 오직 본 발명의 예시일 뿐, 아래 수반되는 청구항에 따른 해석으로 본 발명을 제한하려는 것이 아님이 고려되어야 한다.

본 명세서에서 인용된 모든 공보 및 특허 출원들은 각각의 개별적인 공보 또는 특허 출원이 명확하고 개별적으로 모든 목적을 위해서 인용문헌에 통합된 것을 나타내는 것처럼, 모든 목적을 위해 그 전부가 본 명세서의 인용문헌에 통합된다.

상기 발명이 이해의 명확성의 목적을 위해 설명 및 예시로 상세하게 기재되어왔음에도 불구하고, 특정한 변화 및 변경이 첨부된 청구항의 범위 및 취지로부터 멀리 떨어지지 않은 그것에 만들어 질 수 있다는 것은 본 발명의 교시에 비추어 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에게 쉽게 명백할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> NATIONAL UNIVERSITY OF SINGAPORE DSO NATIONAL LABORATORIES <120> HUMAN MONOCLONAL ANTIBODY WITH SPECIFICITY FOR DENGUE VIRUS SEROTYPE 1 E PROTEIN AND USES THEREOF <130> IF13P120/US <140> PCT/SG2011/000436 <141> 2011-12-14 <150> 61/423,085 <151> 2010-12-14 <160> 42 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asp Gly Arg Thr Ser Leu Asp Trp Phe Leu Leu Arg Pro Gly Gln Phe 35 40 45 Pro Gln Val Lys Ile Ser Glu Leu Ser Arg Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Val Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Gly Glu Ala Glu Asp Val Arg Ala Phe Tyr Cys Ile Tyr Gly 85 90 95 Ile Tyr Val Gly Arg Ser Ala Lys Gly Pro Ser Trp Arg Ser Asn 100 105 110 <210> 2 <211> 111 <212> PRT <213> 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gag tgg gtg 144 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca gtg ata tgg tat gat gga agt aaa acg tat tat gga gac tcc gtg 192 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc atc tcc aaa gac aat tcc aag aaa atg gtg aat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Lys Met Val Asn 65 70 75 80 ctc caa atg gac agc ctg gga gtc gag gac acg gct ttt tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asp Ser Leu Gly Val Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga ggg ata gcc ggt ggc tgg gcg ttt tgg ggg att gac ctc tgg 336 Ala Arg Gly Ile Ala Gly Gly Trp Ala Phe Trp Gly Ile Asp Leu Trp 100 105 110 ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 366 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 26 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 26 gat gtt gtg atg act cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48 Asp Val Val 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polypeptide <400> 27 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Arg Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Gly Val Thr Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Gly Ser Ala Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 28 <211> 495 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 28 Met Arg Cys Val Gly Ile Gly Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser 1 5 10 15 Gly Ala Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Lys Asp Lys Pro Thr Leu Asp Ile Glu Leu Leu Lys Thr 35 40 45 Glu Val Thr Asn Pro Ala Val Leu Arg Lys Leu Cys Ile Glu Ala Lys 50 55 60 Ile Ser Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala 65 70 75 80 Thr Leu Val Glu Glu Gln Asp Thr Asn Phe Val Cys Arg Arg 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Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val 305 310 315 320 Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro 325 330 335 Phe Ser Ser Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Val 340 345 350 Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Ile Asn Ile Glu 355 360 365 Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Val Gly Ala Gly Glu 370 375 380 Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser 385 390 395 <210> 36 <211> 396 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 36 Met Arg Cys Val Gly Ile Gly Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser 1 5 10 15 Gly Ala Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Lys Asp Lys Pro Thr Leu Asp Ile Glu Leu Leu Lys Thr 35 40 45 Glu Val Thr Asn Pro Ala Val Leu Arg Lys Leu Cys Ile Glu Ala Lys 50 55 60 Ile Ser Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala 65 70 75 80 Thr Leu Val Glu Glu Gln Asp Thr Asn Phe Val Cys Arg Arg Thr Phe 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser 100 105 110 Leu Ile Thr Cys Ala Lys Phe Lys Cys Val Thr Lys Leu Glu Gly Lys 115 120 125 Ile Val Gln Tyr Glu Asn Leu Lys Tyr Ser Val Ile Val Thr Val His 130 135 140 Thr Gly Asp Gln His Gln Val Gly Asn Glu Thr Thr Glu His Gly Thr 145 150 155 160 Thr Ala Thr Ile Thr Pro Gln Ala Pro Thr Ser Glu Ile Gln Leu Thr 165 170 175 Asp Tyr Gly Ala Leu Thr Leu Asp Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp 180 185 190 Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Thr Met Glu Lys Lys Ser Trp Leu Val 195 200 205 His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Thr Ser Gly Ala 210 215 220 Ser Thr Ser Gln Glu Thr Trp Asn Arg Gln Asp Leu Leu Val Thr Phe 225 230 235 240 Lys Thr Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val Val Val Leu Gly Ser Gln 245 250 255 Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Thr 260 265 270 Ser Gly Thr Thr Thr Ile Phe Ala Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys 275 280 285 Met Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly 290 295 300 Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val 305 310 315 320 Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro 325 330 335 Phe Ser Ser Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile 340 345 350 Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu 355 360 365 Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Val Gly Ala Gly Glu 370 375 380 Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser 385 390 395 <210> 37 <211> 396 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 37 Met Arg Cys Val Gly Ile Gly Ser Arg Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser 1 5 10 15 Gly Ala Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Lys Asp Lys Pro Thr Leu Asp Ile Glu Leu Leu Lys Thr 35 40 45 Glu Val Thr Asn Pro Ala Val Leu Arg Lys Leu Cys Ile Glu Ala Lys 50 55 60 Ile Ser Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala 65 70 75 80 Thr Leu Val Glu Glu Gln Asp Ala Asn Phe Val Cys Arg Arg Thr Phe 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser 100 105 110 Leu Ile Thr Cys Ala Lys Phe Lys Cys Val Thr Lys Leu Glu Gly Lys 115 120 125 Ile Val Gln Tyr Glu Asn Leu Lys Tyr Ser Val Ile Val Thr Val His 130 135 140 Thr Gly Asp Gln His Gln Val Gly Asn Glu Ser Thr Glu His Gly Thr 145 150 155 160 Thr Ala Thr Ile Thr Pro Gln Ala Pro Thr Thr Glu Ile Gln Leu Thr 165 170 175 Asp Tyr Gly Ala Leu Thr Leu Asp Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp 180 185 190 Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Thr Met Lys Glu Lys Ser Trp Leu Val 195 200 205 His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Thr Ser Gly Ala 210 215 220 Ser Thr Ser Gln Glu Thr Trp Asn Arg Gln Asp Leu Leu Val Thr Phe 225 230 235 240 Lys Thr Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val Val Val Leu Gly Ser Gln 245 250 255 Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Thr 260 265 270 Ser Gly Thr Thr Thr Ile Phe Ala Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys 275 280 285 Met Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly 290 295 300 Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val 305 310 315 320 Leu Val Gln Ile Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro 325 330 335 Phe Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile 340 345 350 Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu 355 360 365 Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Ile Gly Ala Gly Glu 370 375 380 Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser 385 390 395 <210> 38 <211> 396 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 38 Met Arg Cys Val Gly Ile Gly Ser Arg Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser 1 5 10 15 Gly Ala Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Lys Asp Lys Pro Thr Leu Asp Ile Glu Leu Leu Lys Thr 35 40 45 Glu Val Thr Asn Pro Ala Val Leu Arg Lys Leu Cys Ile Glu Ala Lys 50 55 60 Ile Ser Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala 65 70 75 80 Thr Leu Val Glu Glu Gln Asp Ala Asn Phe Val Cys Arg Arg Thr Phe 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser 100 105 110 Leu Ile Thr Cys Ala Lys Phe Lys Cys Val Thr Lys Leu Glu Gly Lys 115 120 125 Ile Val Gln Tyr Glu Asn Leu Lys Tyr Ser Val Ile Val Thr Val His 130 135 140 Thr Gly Asp Gln His Gln Val Gly Asn Glu Ser Thr Glu His Gly Thr 145 150 155 160 Thr Ala Thr Ile Thr Pro Gln Ala Pro Thr Thr Glu Ile Gln Leu Thr 165 170 175 Asp Tyr Gly Ala Leu Thr Leu Asp Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp 180 185 190 Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Thr Met Lys Glu Lys Ser Trp Leu Val 195 200 205 His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Thr Ser Gly Ala 210 215 220 Ser Thr Ser Gln Glu Thr Trp Asn Arg Gln Asp Leu Leu Val Thr Phe 225 230 235 240 Lys Thr Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val Val Val Leu Gly Ser Gln 245 250 255 Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Thr 260 265 270 Ser Gly Thr Thr Thr Ile Phe Ala Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys 275 280 285 Met Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly 290 295 300 Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val 305 310 315 320 Leu Val Gln Ile Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro 325 330 335 Phe Leu Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile 340 345 350 Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu 355 360 365 Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Ile Gly Ala Gly Glu 370 375 380 Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser 385 390 395 <210> 39 <211> 394 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 39 Met Arg Cys Val Gly Val Gly Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser 1 5 10 15 Gly Ala Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Ile Glu Leu Gln Lys Thr 35 40 45 Glu Ala Thr Gln Leu Ala Thr Leu Arg Lys Leu Cys Ile Glu Gly Lys 50 55 60 Ile Thr Asn Ile Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala 65 70 75 80 Ile Leu Pro Glu Glu Gln Asp Gln Asn Tyr Val Cys Lys His Thr Tyr 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser 100 105 110 Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Gln Cys Leu Glu Ser Ile Glu Gly Lys 115 120 125 Val Val Gln His Glu Asn Leu Lys Tyr Thr Val Ile Ile Thr Val His 130 135 140 Thr Gly Asp Gln His Gln Val Gly Asn Glu Thr Gln Gly Val Thr Ala 145 150 155 160 Glu Ile Thr Ser Gln Ala Ser Thr Ala Glu Ala Ile Leu Pro Glu Tyr 165 170 175 Gly Thr Leu Gly Leu Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn 180 185 190 Glu Met Ile Leu Leu Thr Met Lys Asn Lys Ala Trp Met Val His Arg 195 200 205 Gln Trp Phe Phe Asp Leu Pro Leu Pro Trp Thr Ser Gly Ala Thr Thr 210 215 220 Lys Thr Pro Thr Trp Asn Arg Lys Glu Leu Leu Val Thr Phe Lys Asn 225 230 235 240 Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly 245 250 255 Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Thr Ser Gly 260 265 270 Gly Thr Ser Ile Phe Ala Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp 275 280 285 Lys Leu Lys Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr Phe 290 295 300 Val Leu Lys Lys Glu Val Ser Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Ile 305 310 315 320 Lys Val Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser 325 330 335 Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys Ala His Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala 340 345 350 Asn Pro Val Val Thr Lys Lys Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu 355 360 365 Pro Pro Phe Gly Glu Ser Asn Ile Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala 370 375 380 Leu Lys Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Gly Ser 385 390 <210> 40 <211> 396 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 40 Met Arg Cys Ile Gly Ile Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ser Trp Val Asp Ile Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr 35 40 45 Glu Ala Lys Gln Pro Ala Thr Leu Arg Lys Tyr Cys Ile Glu Ala Lys 50 55 60 Leu Thr Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro 65 70 75 80 Ser Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe Val Cys Lys His Ser Met 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly 100 105 110 Ile Val Thr Cys Ala Met Phe Thr Cys Lys Lys Asn Met Lys Gly Lys 115 120 125 Val Val Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Ile Val Ile Thr Pro His 130 135 140 Ser Gly Glu Glu His Ala Val Gly Asn Asp Thr Gly Lys His Gly Lys 145 150 155 160 Glu Ile Lys Ile Thr Pro Gln Ser Ser Ile Thr Glu Ala Glu Leu Thr 165 170 175 Gly Tyr Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp 180 185 190 Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Gln Met Glu Asn Lys Ala Trp Leu Val 195 200 205 His Arg Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Leu Pro Gly Ala 210 215 220 Asp Thr Gln Gly Ser Asn Trp Ile Gln Lys Glu Thr Leu Val Thr Phe 225 230 235 240 Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val Leu Gly Ser Gln 245 250 255 Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Met 260 265 270 Ser Ser Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Arg 275 280 285 Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly 290 295 300 Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile 305 310 315 320 Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro 325 330 335 Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile 340 345 350 Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu 355 360 365 Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro 370 375 380 Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser 385 390 395 <210> 41 <211> 395 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 41 Met Arg Cys Val Gly Val Gly Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ala Trp Val Asp Leu Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Gln Gly Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr 35 40 45 Thr Ala Lys Glu Val Ala Leu Leu Arg Thr Tyr Cys Ile Glu Ala Ser 50 55 60 Ile Ser Asn Ile Thr Thr Ala Thr Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro 65 70 75 80 Tyr Leu Lys Glu Glu Gln Asp Gln Gln Tyr Ile Cys Arg Arg Asp Val 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly 100 105 110 Val Val Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Ser Gly Lys Ile Thr Gly Asn 115 120 125 Leu Val Gln Ile Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Val Val Val Thr Val His 130 135 140 Asn Gly Asp Thr His Ala Val Gly Asn Asp Ile Pro Asn His Gly Val 145 150 155 160 Thr Ala Thr Ile Thr Pro Arg Ser Pro Ser Val Glu Val Lys Leu Pro 165 170 175 Asp Tyr Gly Glu Leu Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Ile Asp 180 185 190 Phe Asn Glu Met Ile Leu Met Lys Met Lys Lys Lys Thr Trp Leu Val 195 200 205 His Lys Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Ala Ala Gly Ala 210 215 220 Asp Thr Ser Glu Val His Trp Asn Tyr Lys Glu Arg Met Val Thr Phe 225 230 235 240 Lys Val Pro His Ala Lys Arg Gln Asp Val Thr Val Leu Gly Ser Gln 245 250 255 Glu Gly Ala Met His Ser Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Val Asp Ser 260 265 270 Gly Asp Gly Asn His Met Phe Ala Gly His Leu Lys Cys Lys Val Arg 275 280 285 Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly 290 295 300 Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr 305 310 315 320 Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro 325 330 335 Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys Val Gly Arg Ile Ile Ser 340 345 350 Ser Thr Pro Phe Ala Glu Tyr Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu Leu 355 360 365 Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Asp Ser 370 375 380 Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly Ser 385 390 395 <210> 42 <211> 402 <212> PRT <213> West nile virus <400> 42 Phe Asn Cys Leu Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Leu Glu Gly Val Ser 1 5 10 15 Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Val Thr 20 25 30 Ile Met Ser Lys Asp Lys Pro Thr Ile Asp Val Lys Met Met Asn Met 35 40 45 Glu Ala Ala Asn Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Leu Ala Thr 50 55 60 Val Ser Asp Leu Ser Thr Lys Ala Ala Cys Pro Thr Met Gly Glu Ala 65 70 75 80 His Asn Asp Lys Arg Ala Asp Pro Ala Phe Val Cys Arg Gln Gly Val 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser 100 105 110 Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Thr Lys Ala Ile Gly Arg 115 120 125 Thr Ile Leu Lys Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Ala Ile Phe Val His 130 135 140 Gly Pro Thr Thr Val Glu Ser His Gly Asn Tyr Ser Thr Gln Val Gly 145 150 155 160 Ala Thr Gln Ala Gly Arg Leu Ser Ile Thr Pro Ala Ala Pro Ser Tyr 165 170 175 Thr Leu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Glu Val Thr Val Asp Cys Glu Pro 180 185 190 Arg Ser Gly Ile Asp Thr Asn Ala Tyr Tyr Val Met Thr Val Gly Thr 195 200 205 Lys Thr Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe Met Asp Leu Asn Leu Pro 210 215 220 Trp Ser Ser Ala Gly Ser Thr Val Trp Arg Asn Arg Glu Thr Leu Met 225 230 235 240 Glu Phe Glu Glu Pro His Ala Thr Lys Gln Ser Val Ile Ala Leu Gly 245 250 255 Ser Gln Glu Gly Ala Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Pro Val 260 265 270 Glu Phe Ser Ser Asn Thr Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys 275 280 285 Arg Val Lys Met Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Val 290 295 300 Cys Ser Lys Ala Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His 305 310 315 320 Gly Thr Val Val Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys 325 330 335 Lys Val Pro Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val 340 345 350 Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn 355 360 365 Ala Lys Val Leu Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile 370 375 380 Val Val Gly Arg Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser 385 390 395 400 Gly Ser

Claims (37)

1. 뎅기 바이러스 세로타입 1 외막(envelope, E) 프로틴 또는 그들의 단편에 특이적으로 결합하는 분리된 중화 단일클론 항체 또는 그들의 단편으로서, 상기 항체는 바이러스 내의 두 개의 E 프로틴을 가로질러 결합하는 광범위 중화 활성을 갖는 인간항체이고,
   상기 두 개의 E 프로틴을 가로질러 결합하는 것은 하나의 E 프로틴 상의 DI 및 DII 사이의 경첩 및 DI 및 인접한(neighboring) E 프로틴의 DIII에 결합하는 것을 포함하고,
   상기 항체 또는 그들의 단편은 DI 중 서열번호 33의 아미노산 T51, G159, T160, T165, P166, Q167, E172, I173, 및 T275; DII 중 서열번호 33의 아미노산 N52 및 G274; 및 DIII 중 서열번호 33의 아미노산 K310에 결합하는, 항체 또는 그들의 단편.
2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그들의 단편은: (a) 전체(whole) 면역글로불린 분자; (b) scFv; (c) Fab 단편; (d) F(ab')2; 및 (e) 이황화 결합으로 연결된 Fv로 구성된 군으로부터 선택된 것인 항체 또는 그들의 단편.
3. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그들의 단편은: (a) 인간 IgM 불변 도메인; (b) 인간 IgG1 불변 도메인; (c) 인간 IgG2 불변 도메인; (d) 인간 IgG3 불변 도메인; (e) 인간 IgG4 불변 도메인; 및 (f) 인간 IgA1/2 불변 도메인;으로 구성된 군으로부터 선택된 헤비 체인 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는 것인 항체 또는 그들의 단편.
4. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그들의 단편은 (a) 인간 Ig 카파 불변 도메인; 및 (b) 인간 Ig 람다 불변 도메인;으로 구성된 군으로부터 선택된 라이트 체인 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는 것인 항체 또는 그들의 단편.
5. 뎅기 바이러스 세로타입 1 외막 프로틴(envelope protein) 또는 그들의 단편에 결합하는 항체 또는 그들의 단편으로서,
   상기 항체 또는 단편은 CDR 서열 SYGMH (서열번호 20의 31-35번째 아미노산 잔기), VIWYDGSKTYYGDSVKG (서열번호 20의 50-66번째 아미노산 잔기), 및 GIAGGWAFW (서열번호 20의 99-107번째 아미노산 잔기)를 포함하는 헤비 체인 서열; 및 CDR 서열 RASQNVYSYLG (서열번호 27의 24-34번째 아미노산 잔기), GVTSRAT (서열번호 27의 50-56번째 아미노산 잔기), 및 QQYAG (서열번호 27의 89-93번째 아미노산 잔기)를 포함하는 라이트 체인 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그들의 단편.
6. 제5항에 있어서, 상기 항체 또는 그들의 단편은 서열번호 27 또는 서열번호 8을 포함하는 라이트 체인 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그들의 단편.
7. 제5항에 있어서, 상기 항체 또는 그들의 단편은 서열번호 20을 포함하는 헤비 체인 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그들의 단편.
8. 제5항에 있어서, 상기 항체 또는 그들의 단편은 서열번호 20을 포함하는 헤비 체인 서열, 및 서열번호 27 또는 서열번호 8을 포함하는 라이트 체인 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그들의 단편.
9. 제5항에 있어서, 상기 항체 또는 그들의 단편은 세로타입 1 뎅기 바이러스를 특이적으로 중화시키는 것인 항체 또는 그들의 단편.
10. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그들의 단편은 세로타입 1 뎅기 바이러스를 특이적으로 중화시키는 것인 항체 또는 그들의 단편.
11. 삭제
12. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그들의 단편은 1 x 10^-8 M 미만의 친화상수(K_D)로 항원에 결합하는 것인 항체 또는 그들의 단편.
13. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그들의 단편은 1 x 10^-9 M 미만의 친화상수(K_D)로 항원에 결합하는 것인 항체 또는 그들의 단편.
14. 제1항에 있어서, 상기 항체는 뎅기 바이러스 감염으로부터 회복된 환자의 B 세포로부터 유래된 것인 항체 또는 그들의 단편.
15. 개체에서 뎅기 바이러스 감염을 감소 또는 예방하는데에 유효한 제1항에 따른 항체 또는 그들의 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
16. 제15항에 있어서, 2차 제제(second agent)를 더 포함하는 약학 조성물.
17. 제16항에 있어서, 상기 2차 제제는 항바이러스제 또는 진통제인 것인 약학 조성물.
18. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그들의 단편은 CDR 서열 SYGMH (서열번호 20의 31-35번째 아미노산 잔기), VIWYDGSKTYYGDSVKG (서열번호 20의 50-66번째 아미노산 잔기), 및 GIAGGWAFW (서열번호 20의 99-107번째 아미노산 잔기)를 포함하는 헤비 체인 서열; 및 CDR 서열 RASQNVYSYLG (서열번호 27의 24-34번째 아미노산 잔기), GVTSRAT (서열번호 27의 50-56번째 아미노산 잔기), 및 QQYAG (서열번호 27의 89-93번째 아미노산 잔기)를 포함하는 라이트 체인 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그들의 단편.
19. 제18항에 있어서, 상기 항체 또는 그들의 단편은 서열번호 20을 포함하는 헤비 체인 서열, 및 서열번호 27 또는 서열번호 8을 포함하는 라이트 체인 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그들의 단편.
20. 삭제
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