ES2644236T3 - Anticuerpo humano monoclonal con especificidad para el virus Dengue serotipo 1 E proteína y usos de la misma - Google Patents

Anticuerpo humano monoclonal con especificidad para el virus Dengue serotipo 1 E proteína y usos de la misma Download PDF

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Description

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Anticuerpo humano monoclonal con especificidad para el virus Dengue serotipo 1 E protema y usos de la misma
Descripcion
CAMPO
La invencion se refiere a anticuerpos humanos monoclonales neutralizantes para el virus del Dengue, en particular, el serotipo 1. La invencion se refiere ademas a composiciones y metodos para el tratamiento o la prevencion de la infeccion por virus del Dengue en un sujeto vertebrado. Se proporcionan metodos para administrar anticuerpos al sujeto vertebrado en una cantidad eficaz para reducir, eliminar o prevenir la recafda de la infeccion.
FONDO
El Dengue es la enfermedad viral transmitida por mosquitos mas significativa que afecta a seres humanos. En la actualidad, cerca de 2.500 millones de personas que viven en mas de 100 pafses endemicos del Dengue en el cinturon tropical/subtropical se consideran en riesgo de infeccion por Dengue. Las especies de mosquitos residen en zonas urbanas, Aedes aegypti es el principal transmisor del virus a los seres humanos. La infeccion con el virus del Dengue puede dar lugar a un espectro de manifestaciones clmicas que van desde la infeccion asintomatica a traves de la fiebre del Dengue (DF), una enfermedad febril aguda, a la fiebre hemorragica del Dengue y el smdrome de shock del Dengue que son complicaciones graves para la vida, tipificadas por fuga vascular. El tratamiento actual se limita al uso de analgesicos para aliviar los smtomas y no hay vacunas disponibles. Las enfermedades del Dengue afectan a 50 millones de personas anualmente, con epidemias frecuentes y recurrentes. la decada de 1990 vio un regreso de las enfermedades del Dengue en diversas areas del mundo a pesar de los estrictos controles de mosquitos, culminando con el brote mas grande jamas en 2005 en Singapur. Mas del 80% de los casos reportados fueron adultos jovenes con un impacto asociado en su capacidad para trabajar, mas costos de atencion medica significativos para su tratamiento. Por lo tanto, se necesitan urgentemente alternativas a las vacunas contra el Dengue, como las terapias con anticuerpos pasivos y/o antivirales para ayudar a controlar las enfermedades asociadas al Dengue en el plazo inmediato. Estas terapias propuestas tienen el potencial de ayudar a un gran numero de individuos infectados, aunque solo se aplique a individuos con riesgo de desarrollar formas graves de enfermedad (alrededor del 10% del total). Con el aumento de la prevalencia del Dengue en los pafses desarrollados, como el sur de los Estados Unidos, mas Australia, y la ausencia de una vacuna, un anticuerpo podna proporcionar una medicacion util. La presente invencion proporciona anticuerpos monoclonales completamente humanos para satisfacer estas y otras necesidades.
RESUMEN
Se describen aqrn composiciones y metodos para el tratamiento o prevencion de la infeccion por virus del Dengue en un sujeto vertebrado.
En particular, se describe aqrn un ejemplo de la generacion de anticuerpos neutralizantes monoclonales completamente humanos de pacientes recien recuperados de la infeccion con el serotipo de Dengue 1. El anticuerpo exhibe actividad tanto profilactica como terapeutica en el bloqueo de la infeccion de serotipo de Dengue 1 in vitro e in vivo y puede formar la base de un nuevo medicamento. La invencion utiliza un metodo para preparar celulas B de memoria inmortalizadas de pacientes convalecientes purificando sus celulas CD22 positivas de una muestra de sangre tomada 60 dfas despues de que el paciente se ha recuperado de la infeccion. Las celulas B purificadas se inmortalizan despues, empleando la infeccion por el virus Epstein Barr (EBV). Este metodo genera un panel de lmeas de celulas B de memoria inmortalizadas capaces de producir anticuerpos totalmente humanos que pueden ser examinados en cuanto a especificidad para el virus de Dengue. Estas lmeas de celulas B a continuacion, se pueden utilizar como una fuente enriquecida de plantillas de inmunoglobulina para la identificacion y clonacion de anticuerpos monoclonales recombinantes con actividad neutralizante para el virus de Dengue in vitro e in vivo. Como se describe en este documento, se describe el aislamiento, la deteccion, la clonacion y caracterizacion in vitro/in vivo del primer anticuerpo monoclonal totalmente humano espedfico para serotipo de Virus de Dengue 1.
La invencion proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une espedficamente a una proteina de envoltura (E) de serotipo de virus de Dengue 1 o fragmento de la misma, en la que el anticuerpo es un anticuerpo humano con la actividad neutralizante que se une a traves de dos protemas E en un virus, en el que la union a traves de dos protemas E comprende la union a DI y la bisagra entre DI y II sobre una protema E y DIII de una protema E vecina.
En diversas realizaciones de este aspecto, el anticuerpo o fragmento del mismo puede ser (a) una molecula de inmunoglobulina entera; (b) un scFv; (c) un fragmento Fab; (d) un F(ab')2; o (e) un Fv unido a disulfuro.
En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender una cadena pesada de inmunoglobulina de dominio constante seleccionada del grupo que consiste en: (a) un dominio constante de IgM humana; (b) un dominio constante de IgG1 humana; (c) un dominio constante de IgG2 humana; (d) un dominio
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constante de IgG3 humana; (e) un dominio constante de IgG4 humana; o (f) un dominio constante de IgA1/2 humana.
En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender un dominio constante de inmunoglobulina de cadena ligera que puede ser: (a) un dominio constante de Ig kappa humana; o (b) un dominio constante de Ig lambda humana.
En realizaciones adicionales, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una cadena pesada que comprende al menos una CDR seleccionada del grupo de secuencias de CDR se muestra en la Figura 4 (B).
En realizaciones adicionales, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una cadena ligera que comprende al menos una CDR seleccionada del grupo de secuencias CDR mostradas en la Figura 4 (B).
En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una cadena pesada que comprende tres secuencias de CDR como se muestra en la Figura 4 (B).
En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una cadena ligera que comprende tres secuencias CDR como se muestra en la Figura 4 (B).
En realizaciones adicionales, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un marco de cadena pesada de IGHV1-2 * 02 y al menos una de las secuencias de CDR, como se muestra en la Figura 4 (B).
En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un marco de cadena ligera de IGKV3-20 * 01 y al menos una de las secuencias de CDR, como se muestra en la Figura 4 (B).
En una realizacion, el anticuerpo comprende la secuencia de cadena pesada mostrada en la Figura 4 (B).
En otra realizacion, el anticuerpo comprende la secuencia de cadena ligera mostrada en la Figura 4 (B).
En aun otra realizacion, el anticuerpo es 14c10, clon 8.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une a un antfgeno con una constante de afinidad (Kd) de menos de 1 x 10-8 M.
En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une a un antfgeno con una constante de afinidad (Kd) de menos de 1 x 10-9 M.
En realizaciones adicionales, el anticuerpo o fragmento del mismo se deriva de una celula B de un paciente que se ha recuperado de la infeccion por virus de Dengue.
En una realizacion, el anticuerpo o fragmento del mismo que se une a un virus de Dengue que tiene la especificidad de union de 14c10, clon 8.
En una realizacion adicional, la invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones relevantes anteriores y un vehnculo farmaceuticamente aceptable eficaz para reducir o prevenir la infeccion por virus de Dengue en un sujeto. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica puede comprender ademas un segundo agente, por ejemplo, un farmaco antiviral o un farmaco analgesico.
En una realizacion adicional, la invencion proporciona el uso del anticuerpo en un metodo de inmunizacion pasiva que comprende la administracion a un sujeto de una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones relevantes anteriores.
En una realizacion adicional, la invencion proporciona el uso del anticuerpo en un metodo de tratamiento de la infeccion por virus de Dengue que comprende la administracion a un sujeto en necesidad del mismo de una cantidad de anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones relevantes anteriores, eficaz para reducir o prevenir la enfermedad.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se administra por via intravenosa (IV), subcutanea (SC), intramuscular (IM), transdermica, o por via oral.
En otras realizaciones, el anticuerpo se administra en una cantidad en el intervalo de 1 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal del sujeto.
Tal administracion puede comprender ademas la administracion de un segundo agente, que puede, por ejemplo, ser un farmaco antiviral o un farmaco analgesico.
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En otras realizaciones, la invencion proporciona un acido nucleico aislado que codifica el anticuerpo o
fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de los aspectos y formas de realizacion pertinentes anteriores.
Dichos acidos nucleicos aislados pueden estar contenidos en un vector de expresion. Tales vectores de expresion
pueden estar contenidos dentro de una celula huesped, tal como una celula bacteriana, eucariotica o de mairnfero.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
Figura 1: Diagrama de flujo del proceso de examen, expresion y cromatografia de anticuerpos. Se aislaron celulas B CD22+ de pacientes infectados con Dengue ingresados en el Hospital Universitario Nacional (NUH). Estas celulas B se inmortalizan con EBV en presencia de un activador de celulas B policlonales (2,5 pg/ml de secuencias CpG, IL2 e IL4) que se anadieron para mejorar la eficiencia de la inmortalizacion. Las celulas B se colocaron en placas a 30 celulas/pocillo en 96 pocillos de pocillos de fondo redondo con 1x105 alogenico, PBMCs irradiadas obtenidas a partir de capas leucocitarias. Despues de dos semanas, los sobrenadantes de estos clones se rastrearon mediante ELlSA, PRNT y CPE para la actividad de union/neutralizacion. ARNm de las lmeas de celulas B positivas se extrajeron y las secuencias de cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo clonado en un vector pCMV en casa y transfectadas en celulas Freestyle® 293F para producir altas concentraciones de anticuerpos recombinantes. Se identificaron y caracterizaron los anticuerpos recombinantes con la especificidad deseada.
Figura 2: Seleccion de sobrenadantes de lmeas de celulas B inmortalizadas con CPE y PRNT para la actividad de neutralizacion del Dengue. Celulas BHK-21 (A) fueron desafiadas con DV en presencia de sobrenadantes derivados de lmeas de celulas B imortalizadas por EBV. (2000 lmeas celulares por paciente se seleccionaron utilizando este enfoque). El efecto citopatico se evaluo mediante tincion de las celulas restantes intactas con elucion de violeta cristal con acido acetico y determinacion de la absorbancia a 595 nm. El punto final del ensayo se definio como un efecto citopatico de 50% y se optimizo la concentracion viral. Los sobrenadantes de la prueba se rastrearon inicialmente a una dilucion de 1 en 4. El 10% superior de los clones se volvio a probar por PRNT. (B) Generacion de lmea celular de linfocitos B humana que secretan anticuerpos neutralizantes humanos contra el Dengue. Las celulas BHK al 80% de confluencia fueron infectadas con el virus de Dengue durante 3 dfas. Las placas virales se visualizaron utilizando tinte violeta cristal (Sigma-Aldrich, Singapur) que se une a celulas viables. Los sobrenadantes de clones de celulas B (derivados de un individuo infectado con Dengue 1 convaleciente) se ensayaron en cuanto a la actividad neutralizante. Dengue 1 (50 pfu) se incubo con sobrenadantes de cultivo celular (diluido 1/4) durante 1 hora antes de la adicion a celulas bHk. Se encontro que la lmea celular 14c10 secretaba anticuerpos que reducen significativamente el numero de placas. Figura 3: Plantillas de anticuerpos expresadas por la lmea de celulas B 14C10 y las secuencias de aminoacidos CDR asociadas. (A) La mapa de plasmido que demuestra sitios de enzimas de restriccion y la clonacion de insertos de cadenas pesada y ligera para la generacion de un anticuerpo humano IgG1 recombinante utilizando plantillas identificadas a partir de 14c10. (B) Todas las secuencias identificadas y clonadas de cadena pesada y ligera de 14c10 con sus regiones CDR (CDR 1, CDR 2 y CDR 3 respectivamente) mas 12 permutaciones de combinaciones de cadena pesada y ligera para hacer diferentes anticuerpos recombinantes.
Figura 4: El modelo del Anticuerpo 14c10.8 codifica un anticuerpo recombinante con la actividad de union para el serotipo del Dengue 1. (A) ELISA intercalado empleado para ensayar todos los anticuerpos expresados de manera recombinante derivados de la lmea celular B 14c10 expresada y purificada a partir de sobrenadantes de 293F. El modelo numero 8 claramente da una senal positiva para el serotipo del virus de Dengue 1. (B) Nucleotidos completos y la secuencia de aminoacidos de 14c10.8 cadenas pesada y ligera con regiones CDR resaltados.
Figura 5: La especificidad del serotipo del anticuerpo 14c10.8 recombinante con PRNT y ELISA. (A) ELISA intercalado que muestra la especificidad del anticuerpo IgG1 recombinante 14c10 contra serotipo de virus de Dengue 1 entero vivo. Ninguna actividad de union observable para serotipos de Dengues 2,3 o 4. (B) Datos de PRNT que muestran especificidad de anticuerpo recombinante 14c10.8 contra Westpac 74 serotipos de virus de Dengue 1. No se detecto actividad neutralizante significativa para serotipo de Dengue 2,3 o 4. (C) Datos crudos de PRNT que muestran especificidad de serotipo de 14c10.8 para el serotipo de virus de Dengue 1.
Figura 6: 14c10.8 exhibe mejora dependiente de anticuerpo homotfpico (ADE), pero no mejora dependiente de anticuerpos heterotfpicos para la infeccion por Dengue in vitro. Se incubo el anticuerpo 14c10.8 diluido en serie con un volumen igual de virus (MOI de 1) durante 1 h a 37°C y luego se transfirio a la lmea celular mielomonocftica humana K562 (la lmea celular usualmente empleada para los ensayos de ADE) y se incubo a 37°C durante 4 dfas. Los sobrenadantes se recogieron despues de las celulas K562 infectadas y el tftulo viral resultante se evaluo mediante PRNT. La ADE se define como el aumento de los tftulos vmcos en comparacion con los controles en los que no se anade anticuerpo (lmea azul punteada). Los datos demostraron la presencia de ADE en el serotipo de virus de Dengue 1, pero no en los serotipos 2, 3 y 4. Esta observacion sugiere que 14c10.8 debe ser un anticuerpo seguro para dar a los pacientes infectados con Dengue 1 siempre que se administre a concentraciones neutralizantes en lugar de aumentarlas. Figura 7: Conversion de 14c10.8 a diferentes subclases de IgG humanas tiene un impacto en su actividad de mejora homotipica. Convertimos 14c10 de una IgG1 humana a una IgG3 humana y IgG4 humana usando las construcciones esbozadas. Estas se expresaron como anticuerpos recombinantes en celulas 293F y despues se purificaron en columnas de sefarosa de Protema-A para ensayos adicionales. Hacemos la prueba de mejora homotipica utilizando las lmeas celulares K562 como se describe en la FIG. 6. IgG3 exhibe maxima actividad potenciadora,
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mientras que IgG1 es intermedia y IgG4 tiene los niveles mas bajos de la actividad de aumento.
Figura 8: 14c10.8 es especifico para la proteina E del virus de Dengue. (i) Las celulas se infectaron con DV durante dos d^as. Despues, las celulas se lisaron y se anadio metionina S32 a la mezcla del virus para incorporar el compuesto radiactivo. Se anadio anticuerpo a la mezcla seguido de la adicion de perlas de proteina A-agarosa y se incubaron durante 1 hora a 4°C. Despues del lavado, las protemas se eluyeron con tampon de carga no reductor y se aplicaron en un gel de SDS-poliacrilamida al 15% seguido de tincion con plata de acuerdo con el protocolo de fabricacion (kit de tincion SilverQuest, Invitrogen). Una banda de 56 Kd corresponde a la proteina E del virus Dengue. (ii) Virus de Dengue purificado entero (desnaturalizado y no desnaturalizado) se cargo en gel no desnaturalizante y se transfirio a una membrana que se borro con anticuerpo 14C10. Los resultados mostraron que 14C10 tiene union debil a un epttopo lineal sobre la proteina E de Dengue.
Figura 9: Actividad de neutralizacion del anticuerpo 14c10 recombinante contra varios genotipos del serotipo 1 del Dengue. Se anadieron concentraciones crecientes de anticuerpo a 50 unidades formadoras de placas (pfu) de varios genotipos de serotipo de virus de Dengue 1 (el nombre del genotipo viral se proporciona entre parentesis) y se incubaron a 37°C durante 1 h. 100 pl de mezcla se anadio a una monocapa de celulas BHK-21 en una placa de 24 pocillos y se incubo durante 1 hora a 37°C. Se separo el sobrenadante y se coloco una capa de 1 ml de carboxilmetilcelulosa al 2% (p/v) en RPMI mas FBS al 2% sobre las celulas infectadas. Despues de una incubacion adicional a 37°C durante 4 dfas, los pocillos se tineron con violeta cristal al 0,5% (p/v) disuelto en formaldelddo al 25% (v/v) para visualizar las placas.
Figura 10: 14c10 exhibe la actividad tanto profilactica como terapeutica in vivo: (A) La actividad profilactica de 14c10.8 se observo mediante la inyeccion de ratones de GA129 (n = 6) con diversas concentraciones de anticuerpo 24 horas antes de la infeccion con el serotipo del Dengue 1. Una unica dosis terapeutica de 250 pg/raton de anticuerpo fue administrada a una sola cohorte (n = 6) 24 horas despues de la infeccion del virus de Dengue. La viremia resultante se cuantifico en el suero sangumeo de ratones infectados por PRNT 4 dfas despues de la infeccion. (B) 14c10.8 exhibe actividad profilactica a concentraciones de 1-5 pg/raton. A concentraciones mas bajas de anticuerpo hay alguna evidencia de infeccion mejorada.
Figura 11: HM14c10 es un anticuerpo humano especifico para DENV1. (A) HM14c10 exhibe actividad de neutralizacion espedfica para DENV1 con 50% y 90% de los valores PRNT de 0.328 pg/ml y 1,313 pg/ml, respectivamente. (B) HM14c10 induce ADE homotipica para DENV1 a concentraciones sub-neutralizantes pero no ADE heterotfpicos para DENV2, DENV3 o DENV4. HM4G2 induce la actividad de ADE para los 4 serotipos (C) (a) El fragmento Fab o mutacion (N297Q) de la region Fc de IgG1 de HM14c10 redujeron significativamente ADe homotfpica. (b) Las diferentes subclases de IgG humana (HM14c10) median niveles diferenciales de ADE homotfpica. (D) HM14c10 es altamente neutralizante para multiples genotipos DENV1 en comparacion con HM4G2. Los genotipos se indican entre parentesis al lado de la designacion del virus. Las barras de error representan desviaciones estandar de muestras triplicadas y todos los experimentos se realizaron al menos tres veces.
Figura 12: HM14c10 se une a un epftopo dependiente de estructura cuaternaria de virus. (A) Mapa cryoEM de complejo Fab 14c10:DENV1 que muestra union de 120 Fab (azul) a protemas 180 E en la superficie del virus (cian). El triangulo negro representa una unidad asimetrica. (B) Vista de densidades de conexion de Fab HM14c10 (I) a epftopo de proteina E (esferas de color purpura). Proteina E, E-DI, DII-E y E-DIII son de color rojo, amarillo y azul, respectivamente. (C) Las densidades de moleculas Fab en cadenas Ca de proteina E en dos unidades asimetricas. Fab HM14c10(I) y HM14c10(II) son las dos moleculas independientes en una unidad asimetrica. (D) Los epttopos de Fab HM14c10 (I) (esferas de color purpura) y HM14c10 (II) (esferas cian) en las tres protemas E (sombreadas en gris) en una unidad asimetrica.
Figura 13: HM14c10 bloquea la fijacion de DENV1 a celulas BHK y exhibe actividad protectora potente in vivo. (A) Microscopfa confocal de tiempo de lapso que demuestra la infeccion de DENV1 de celulas huesped BHK en presencia de (a) mAb de control de isotipo, (b) HM4G2 y (c) HM14c10 mAb. Paneles izquierdos: DeNv1 y Mabs se marcaron con Alexafluor-647 (rojo) y Alexafluor-488 (verde), respectivamente. Paneles derechos que muestran los lfmites celulares (lmeas punteadas blancas) y la distribucion de DENV1 en las celulas. (B) Primer plano de eventos de infeccion en vivo. DENV1 se observan dentro de celulas BHK de 18 min en el isotipo de los controles y de 28 min con HM4G2. HM14c10: Complejos DENV1 no pueden unirse a las celulas BHK. (C) Intensidad de fluorescencia roja interna de 120 celulas seleccionadas al azar cuantificadas como una medida de internalizacion de virus durante 1 h. ANOVA unidireccional utilizado para la comparacion de 3 grupos. ** p<0,0001. (D) HM14c10 se ensaya para su uso como profilaxis y agente terapeutico; el anticuerpo se administra a ratones AG129 infectados con DENV1 el dfa 0 y el dfa 2 despues de la infeccion, respectivamente. HM14c10 mostro respuesta protectora ya sea cuando el virus se inyecta (a) por via subcutanea o (b) por via intraperitonaal. El nivel de viremia sangumea se analiza al dfa 3 o 4 respectivamente despues de la infeccion mediante el ensayo de placa. N = 5 en ambos modelos y prueba T empleada para la comparacion de conjuntos de muestras, ** p <0,0001, * p <0,05 en comparacion con los controles de PBS.
Figura 14: Identificacion y expresion recombinante de un anticuerpo completamente humano con actividad neutralizante para el virus de Dengue. (A) (a) Dos mil lmeas de celulas B EBV se generaron a partir de un paciente infectado DENV1 y sobrenadantes examinados por ELISA para la actividad de union a DENV1 pero no DENV2, 3 o 4. Se identificaron siete lmeas celulares EBV BCL positivas. (b) una prueba de neutralizacion de reduccion de placas (PRNT) se llevo a cabo para ensayar para neutralizar la actividad. Los datos se expresan como un PRNT100 (es decir, neutralizacion completa) en el factor de dilucion mas alto y es el valor medio de 3 experimentos. (B) (a) Esquema de vector pTT5 utilizado para expresar modelos de cadena pesada y ligera de anticuerpo derivados de EBV-BCL en celulas HEK293. (b) Doce IgG1 mAbs humanas
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recombinantes se clonaron y se expresaron a partir de la lmea celular EBV 14c10-BCL y se ensayaron para la actividad de union a DENVl por ELISA. Se empleo un anticuerpo monoclonal 4G2 humanizado de raton (HM4G2) como control positivo. El modelo de anticuerpo recombinante numero 8 (denominado HM14c10) mostro actividad de union para DENV1. (C) (a) Actividad PRNT de HM14c10 en DENV1, 2, 3 y 4. (b) HM14c10 se ensayo para determinar la actividad de union a DENV1, 2, 3 y 4 por ELISA. Estos datos representan la media de 3 experimentos y las barras de error iguales a la desviacion estandar de la media de conjuntos de muestras triplicados.
Figura 15: HM14c10 exhibe la actividad de union para multiples aislados clinicos de DENV1. La actividad de union de HM14c10 para varios aislados de DENV1 se comparo con un anticuerpo monoclonal humanizado HM4G2 de raton en varias concentraciones usando un protocolo ELISA establecido. Se emplearon todos los aislados DENV1 en 1x106 pfu/ml y se revistieron durante la noche a 4°C con HB112 utilizado como un reactivo de captura. El anticuerpo de HM14c10 o HM4G2 se anadieron a 5 pg/ml y se utilizaron conjugados de IgG HRP anti-humanos para la deteccion de actividad de union.
Figura 16: Ajuste de estructura cristalina post fusion de las protemas DENV1 E en el mapa cryoEM de Fab HM14c10 complejado con virus de Dengue 1. (A) Vista superior de las protemas E de Dengue 1. El mapa cryoEM se visualiza en un nivel de contorno alto de 5,5a de manera que se puede observar esquema claro de densidades de protemas E. A este nivel de contorno, desaparecieron las densidades de Fab, lo que indica que no todos los epftopos de protema E disponibles estan ocupados por la molecula Fab en la superficie del virus. Las densidades de electrones de la superficie del virus fueron interpretadas por ajuste en la estructura cristalina de la estructura despues de la fusion de la protema DENV1 E (18). Dado que la estructura cristalina de la protema E de DENVl despues de la fusion no encaja bien en el mapa cryoEM como un cuerpo ngido, los tres dominios de la protema E teman que ajustarse por separado. Los dominios I, II y III de la protema E se colorean en rojo, amarillo y azul, respectivamente. Protemas E de dos unidades asimetricas se muestran aqrn con una unidad asimetrica indicada con un triangulo. (B) La vista lateral de las protemas E colocadas en la superficie de DENV1. Se pueden observar densidades de las moleculas Fab, ectodominio de la protema E y helices de transmembrana (Tm). Las densidades correspondientes a glicanos en la posicion Asn159 en dos protemas E adyacentes estan marcadas con puntas de flecha y se indica la posicion del foftolo externo e interno de la bicapa lipfdica. El mapa cryoEM se muestra en el nivel de contorno de 2,5 a.
Figura 17: Esquema estereoscopico de la interfaz de union de Fab HM14c10 y protema E. La densidad de Fab HM14c10 (II) muestra conexiones claras con protemas E en la superficie del virus. Residuos de contacto se indican con las esferas. La densidad de cryoEM se muestra en nivel de contorno de 2,5 a.
Figura 18: Superposicion de las regiones variables de modelo de homologia de HM14c10 (verde) con anticuerpo de referencia humano monoclonal (PDB codigo 2GHW) (azul). La Figura muestra el lado (A) y vista superior (B) de las regiones variables de anticuerpos.
Figura 19: Adaptacion del modelo de homologia de la region variable HM14c10 en mapa de densidad HM14c10:DENV1 cryoEM. (A) Las densidades correspondientes a las cadenas individuales (a y b) de la region variable de anticuerpo tienen un cftculo desde el mapa cryoEM. Los residuos de contacto de la protema E ajustada se indican con esferas cian. E-DI, E-DII y E-DIII se colorean en rojo, amarillo y azul, respectivamente. (B) Las cadenas ligeras y pesadas de modelo de homologfa se colocaron separadamente en la region variable de las densidades de Fab cryoEM. aPara la designacion de la posicion de Fab vease la FIG. 12. bPara la designacion de densidad de Fab vease (A). cLos ajustes del modelo de homologfa en el mapa HM14c10:DENV1 cryoEM (establecido a un nivel de contorno de 3a) se optimizaron usando la funcion de ajuste en mapa en Chimera (35). (C) El modelo de homologfa de region variable HM14c10 (verde) que muestra las cDr en magenta. El ajuste mostrado tiene una cadena ligera en la densidad de Fab a, y la cadena pesada en la densidad de Fab b.
Figura 20: Epitopo HM14c10 en el serotipo de Dengue 1 (genotipo PVP159) y comparacion del epftopo con (A) otros genotipos DENV1 y (B) serotipos de Dengue y virus del Nilo Occidental (VNO). Los restos de aminoacidos comunes entre los epftopos reconocidos por Fab HM14c10 (I) y Fab HM14c10 (II) en una unidad asimetrica se colorean en verde. Los residuos que son reconocidos de forma unica por Fab HM14c10 (I) o Fab HM14c10 (II) se colorean en purpura y cian, respectivamente. Las secuencias de aminoacidos de los epftopos reconocidos por Fab HM14c10 se conservan dentro de los genotipos DENV1, pero no a traves de serotipos de Dengue o virus del Nilo Occidental. Esto es consistente con la observacion de que Fab HM14c10 se une a la mayona de los genotipos de Dengue 1, pero no reaccionan de forma cruzada con otros serotipos de Dengue o flavivirus con huellas de anticuerpos sombreadas (a) en la posicion X1 y II o (b) la posicion X2 y I.
Figura 21: Infectividad y eficacia in vivo de DENV1 etiquetado. (A) Etiquetado DENV vivo se llevo a cabo como se describio previamente (22). La infectividad y viabilidad del virus marcado se ensayo mediante ensayo en placa mediante titulacion en celulas BHK. (B) Eficacia in vivo de HM14c10 se ensayo en dos modelos in vivo empleando diferentes cepas/concentraciones de virus DENV1 mas diferentes modos de administracion viral. Se muestra un esquema de ambos modelos. (a) En el modelo 1, 1x106 pfu de la cepa EHID1 se inyecta por via subcutanea (SC) y la viremia serica monitoreada por ensayo de placa 4 dfas mas tarde. Los profilaxis se administran 24 horas antes de la infeccion con DENV1 y las aplicaciones terapeuticas al dfa mas 2 post infeccion. (b) Tambien se empleo un segundo modelo de infeccion DENV1 mas agresivo. Los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con 1,25x107 pfu de la cepa Westpac de DENV1. La infeccion vftica mas los tratamientos profilacticos y terapeuticos se administraron via inyeccion intraperitonaal (I.P.) en los mismos puntos de tiempo que en el modelo 1. En este modelo, la viremia plasmatica alcanza picos al dfa 3 despues de la infeccion y aqrn es donde se miden los efectos del anticuerpo administrado en el suero viremia. Los controles en
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ambos grupos recibieron un volumen igual de solucion salina esteril.
Figura 22: Comparacion del epitopo unido por un anticuerpo CR4354 del virus del Nilo Occidental y HM14c10 especifico del Dengue 1. (A) Colocacion de HM CR4354 y HM 14c10 a protemas E en WNV (izquierda) (25) y DENV (derecha), respectivamente. La densidad de cryoEM se visualiza en 2,8a (cR4354:WnV) o 2,5a (nivel de contorno Hm14c10:DENV1 (B) Una unidad asimetrica de WNV (izquierda) y DENV1 (derecha) con huellas de anticuerpo de CR4354 o HMl4c10 mostradas en esferas de epftopos en los dos sitios de union independientes en una unidad asimetrica se colorean en purpura y cian. Las tres protemas E en una unidad asimetrica estan sombreadas en gris. Una asimetrica se muestra como triangulo negro. (C) La comparacion de los residuos en los dos epftopos independientes (a y b) entre CR4354 (en WNV) y HM 14c10 (en DENV). Los residuos en los dos epftopos independientes son de color como en (B).
DESCRIPCION DETALLADA
La presente invencion se refiere en general a composiciones y metodos para la prevencion o tratamiento de la infeccion por virus de Dengue en un sujeto vertebrado. En particular, hemos aislado CD22 + celulas B de pacientes infectados por Dengue admitidos a la Division de Enfermedades Infecciosas del Hospital Universitario Nacional (NUH). Estas celulas B se inmortalizaron como lmeas celulares policlonales con EBV in vitro. Se anadio el activador de celulas B policlonales (secuencias CpG) para aumentar la eficacia de la inmortalizacion de celulas B junto con los factores de crecimiento de celulas B humanas, interleuquina 2 e interleuquina 4 (1000 U/ml de cada uno). Se hicieron lmeas de celulas B humanas en pocillos de fondo redondo de 96 pocillos. Despues de dos semanas, los sobrenadantes de estos clones se examinaron mediante ensayo de inmunoabsorcion enzimatica (ELISA), ensayo de neutralizacion de reduccion de placa (PRNT) y ensayo de efecto citopatico (CPE) para analizar la actividad de union/neutralizacion para el virus de Dengue. Las lmeas de celulas B que producen anticuerpos positivos se usaron como una fuente de ARNm para la amplificacion de genes de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos. Las secuencias de cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo se clonaron en un vector pCMV en casa y se transfectaron en celulas de Freestyle® 293F para producir altas concentraciones de anticuerpo recombinante. Utilizando esta metodologfa, hemos clonado y expresado un anticuerpo recombinante que es exquisitamente serotipo de Dengue 1 espedfico y tiene amplia especificidad para varios genotipos de serotipo de Dengue 1. Este anticuerpo no se une a otros virus en el genero Flavivirus y, como tal, exhibe poca o ninguna mejora de la infeccion de los macrofagos a otros flavivirus mas alla de los que se espera para el serotipo del Dengue 1. Los experimentos in vivo han demostrado una notable eficacia profilactica y terapeutica en un modelo de raton de la infeccion por Dengue. Como tal, este anticuerpo representa el mejor candidato disponible terapeutico para la infeccion del Dengue 1 en existencia.
DEFINICIONES
Se ha de entender que esta invencion no se limita a metodos particulares, reactivos, compuestos, composiciones o sistemas biologicos, que pueden, por supuesto, variar. Tambien se debe entender que la terminologfa usada en la presente memoria se dirige al proposito de describir unicamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitativa. Como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "el" y "ella" incluyen referencias plurales a menos que el contenido indique claramente lo contrario.
El termino "aproximadamente" tal como se usa en el presente documento cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duracion temporal, y similares, se entiende que abarca variaciones de + 20% o + 10%, mas preferiblemente + 5%, aun mas preferiblemente + 1%, y aun mas preferiblemente + 0,1% del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para llevar a cabo los metodos descritos.
A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en este documento tienen el mismo significado que se entiende comunmente por un experto ordinario en la tecnica a la que pertenece la invencion. Aunque en la practica se pueden usar metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria para ensayar la presente invencion, se describen los materiales y procedimientos preferidos.
"Vertebrado," "mairnfero", "sujeto," "sujeto mairftfero," o "paciente" se usan indistintamente y se refieren a mamferos tales como pacientes humanos y primates no humanos, asf como animales experimentales tales como conejos, ratas y ratones, vacas, caballos, cabras y otros animales. Los animales incluyen todos los vertebrados, por ejemplo., Mamferos y no mamfferos, tales como ratones, ovejas, perros, vacas, especies aviares, patos, gansos, cerdos, pollos, anfibios, y reptiles.
"Tratar" o "tratamiento" se refiere generalmente a cualquiera de (i) la prevencion de infeccion o reinfeccion, por ejemplo, profilaxis, o (ii) la reduccion o eliminacion de los smtomas de una enfermedad de interes, por ejemplo, la terapia. El tratamiento de un sujeto con las composiciones de la invencion puede prevenir o reducir el riesgo de infeccion por el virus Dengue, particularmente el serotipo 1. El tratamiento puede ser profilactico (para prevenir o retrasar la aparicion de la enfermedad o para prevenir la manifestacion de smtomas subclimcas de la misma) o supresion terapeutica o mitigacion de smtomas tras la manifestacion de la enfermedad.
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"Prevenir" o "prevencion" se refiere a la administracion profilactica con composiciones de la invencion.
"Cantidad terapeuticamente eficaz" o "una cantidad eficaz para reducir o eliminar la infeccion" o "una cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de una composicion de anticuerpo que es suficiente para prevenir la infeccion viral de Dengue o para aliviar (por ejemplo, mitigar, disminuir, reducir) por lo menos uno de los smtomas asociados con una infeccion de este tipo. No es necesario que la administracion de la composicion de eliminar los smtomas de la infeccion por Dengue, siempre que los beneficios de la administracion de la composicion sean mayores que los perjuicios. Del mismo modo, los terminos "tratar" y "tratamiento", en referencia a la infeccion por Dengue, como se usa en este documento, no se pretende en el sentido de que el sujeto esta necesariamente curado de la infeccion o que todos los signos clmicos de la misma se eliminan, solo que cierto alivio o mejora en la condicion del sujeto se realiza por administracion de la composicion.
"Inmunidad pasiva" se refiere generalmente a la transferencia de inmunidad humoral activa en la forma de anticuerpos pre-hechos de un individuo a otro. Por lo tanto, la inmunidad pasiva es una forma de inmunizacion a corto plazo que se puede lograr por la transferencia de anticuerpos, que se puede administrar en varias formas posibles, por ejemplo, como plasma sangumeo o suero humano o animal, como inmunoglobulina animal o humana agrupada para uso intravenoso (IVIG) o intramuscular (IG), como animales de tftulo alto o IVIG humana o IG de sujetos inmunizados o de donantes que se recuperan de una enfermedad, y como anticuerpos monoclonales. La transferencia pasiva se puede utilizar profilacticamente para la prevencion de la aparicion de la enfermedad, asf como, en el tratamiento de varios tipos de infeccion aguda. Por lo general, la inmunidad derivada de la inmunizacion pasiva dura solo por un corto penodo de tiempo, y proporciona una proteccion inmediata, pero el cuerpo no desarrolla la memoria, por lo que el paciente esta en riesgo de ser infectado por el mismo patogeno mas tarde.
ANTICUERPOS
Tal como se utiliza aqrn, el termino "anticuerpo" se refiere a cualquier molecula de inmunoglobulina o intacta asf como a fragmentos de los mismos que se unen a un epttopo espedfico. Tales anticuerpos incluyen, pero no se limitan a anticuerpos policlonales, monoclonales, quimericos, humanizados, de cadena sencilla, fragmentos Fab, Fab', F(ab)' y/o porciones de F(v) de todo el anticuerpo y variantes de los mismos. Todos los isotipos estan abarcados por este termino, incluyendo IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM.
Tal como se utiliza aqrn, el termino "fragmento de anticuerpo" se refiere espedficamente a una parte incompleta o aislada de la secuencia completa del anticuerpo que retiene la funcion de union al antfgeno del anticuerpo parental. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos de Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moleculas de anticuerpo de cadena unica; y anticuerpos multiespedficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
Un "anticuerpo" intacto comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por disulfuro cautiverio. Cada cadena pesada esta compuesta de una region variable de cadena pesada (abreviada en este documento como HCVR o Vh) y una region constante de cadena pesada. la region constante de cadena pesada se compone de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera esta compuesta de una region variable de cadena ligera (abreviada en este documento como LCVR o Vl) y una region constante de cadena ligera. La region constante de cadena ligera esta compuesta por un dominio, Cl. Las regiones de Vh y Vl pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que estan denominadas regiones marco mas conservadas (FR). Cada Vh y Vl se compone de tres CDR y cuatro Fr, dispuestas desde el extremo amino-terminal al extremo carboxilo terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de union que interacciona con un antfgeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la union de la inmunoglobulina a tejidos del huesped o factores, incluyendo varias celulas del sistema inmunitario (por ejemplo, celulas efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clasico. El termino anticuerpo incluye partes de union a antfgeno de un anticuerpo intacto que conservan la capacidad de unirse. Ejemplos de union incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en Vl, Vh, Cl y los dominios CH1; (ii) un F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos de Fab unidos por un puente disulfuro en la region de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al, Nature, 341: 544-546 (1989)), que consiste en un dominio VH; y (vi) una region determinante de complementariedad aislada (CDR).
Como se usa en el presente documento, el termino "anticuerpos de cadena sencilla" o "Fv de cadena sencilla (scFv)" se refiere a una molecula de fusion de anticuerpo de los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh. Aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, estan codificados por genes separados, pueden unirse, usando metodos recombinantes, por un enlazador sintetico que les permite hacerse como una sola cadena proteica en la que las regiones Vl y Vh se emparejan para formar moleculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); vease, por ejemplo, Bird et al, Science, 242: 423-426 (1988); y Huston et al, Proc Natl Acad Sci. EE.UU., 85: 5879-5883 (1988)). Tales anticuerpos de cadena sencilla estan incluidos mediante referencia al termino fragmentos "de anticuerpo" y se pueden preparar mediante tecnicas recombinantes o escision enzimatica o qmmica de
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anticuerpos intactos.
Tal como se utiliza aqrn, el termino "anticuerpo de secuencia humana" incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes (si estan presentes) derivadas de secuencias de inmunoglobulina de lmea germinal humana. Los anticuerpos de secuencia humana de la invencion pueden incluir residuos de aminoacidos no codificados por secuencias humanas de lmea germinal de inmunoglobulina (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagenesis aleatoria o espedfica de sitio in vitro o por mutacion somatica in vivo). Tales anticuerpos pueden generarse en animales transgenicos no humanos, por ejemplo, como se describe en el documento Sol. de Pub. de PCT Nos. WO 01/14424 y WO 00/37504. Sin embargo, el termino "anticuerpo de secuencia humana", como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que secuencias CDR derivadas de la lmea germinal de otra especie de mairnfero, como un raton, se han injertado en las secuencias de marco humanas (por ejemplo, anticuerpos humanizados).
Ademas, las inmunoglobulinas recombinantes se pueden producir. Vease, Cabilly, patente de EE.UU. n° 4.816.567; y Queen et al, Proc Natl Acad Sci EE.UU., 86: 10029-10033 (1989).
Tal como se utiliza aqrn, el termino "anticuerpo monoclonal" se refiere a una preparacion de moleculas de anticuerpo de composicion molecular unica. Una composicion de anticuerpo monoclonal muestra una sola especificidad de union y afinidad para un epftopo particular. Por consiguiente, el termino "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que muestran una sola especificidad de union que tienen regiones variables y constantes (si estan presentes) derivadas de secuencias de inmunoglobulina de lmea germinal humana. En un aspecto, los anticuerpos monoclonales humanos se producen por un hibridoma que incluye una celula B obtenida de un animal no humano transgenico, por ejemplo, un raton transgenico, que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada humana y un transgen de cadena ligera fusionado a una celula inmortalizada.
Tal como se utiliza aqrn, el termino "antigeno" se refiere a una sustancia que induce la generacion de anticuerpos y puede causar una respuesta inmune. Se puede utilizar de forma intercambiable en la presente descripcion con el termino "inmunogeno". En el sentido estricto, los inmunogenos son aquellas sustancias que provocan una respuesta del sistema inmune, mientras que los antfgenos se definen como sustancias que se unen a anticuerpos espedficos. Un antfgeno o fragmento del mismo puede ser una molecula (es dear, un epftopo) que entra en contacto con un anticuerpo particular. Cuando se usa una protema o un fragmento de una protema para inmunizar un animal huesped, numerosas regiones de la protema pueden inducir la produccion de anticuerpos (es dear, provocar la respuesta inmunitaria), que se unen espedficamente al antfgeno (regiones dadas o estructuras tridimensionales en la protema).
Tal como se utiliza aqrn, el termino "anticuerpo humanizado" se refiere a al menos una molecula de anticuerpo en la que la secuencia de aminoacidos en las regiones de union no-antfgenas y/o las regiones de union a antfgenos se ha alterado de modo que el anticuerpo se parece mucho mas a un anticuerpo humano, y todavfa conserva su capacidad de union original.
Ademas, pueden usarse tecnicas desarrolladas para la produccion de "anticuerpos quimericos" (Morrison, et al, Proc Natl Acad Sci., 81: 6851-6855 (1984)) por corte y empalme de los genes de una molecula de anticuerpo de raton de especificidad de antfgeno apropiada junto con genes de una molecula de anticuerpo humano de actividad biologica apropiada. Por ejemplo, los genes de una molecula de anticuerpo de raton espedfica para un autoinductor pueden empalmarse junto con genes de una molecula de anticuerpo humano de actividad biologica apropiada. Un anticuerpo quimerico es una molecula en la que diferentes porciones se derivan de diferentes especies animales, tales como las que tienen una region variable derivada de un mAb murino y una region constante de inmunoglobulina humana.
Ademas, se han desarrollado tecnicas para la produccion de anticuerpos humanizados (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 5.585.089 y la Patente de Estados Unidos N° 5.225.539). Una region variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina se compone de una region "marco" interrumpida por tres regiones hipervariables, denominadas como regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Brevemente, los anticuerpos humanizados son moleculas de anticuerpo de especies no humanas que tienen una o mas CDR de las especies no humanas y una region marco de una molecula de inmunoglobulina humana.
Alternativamente, las tecnicas descritas para la produccion de anticuerpos de cadena sencilla se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla contra un conjugado inmunogenico de la presente descripcion. Los anticuerpos monocatenarios se forman uniendo los fragmentos de cadena pesada y ligera de la region Fv mediante un puente aminoacido, resultando en un polipeptido de cadena sencilla. Porciones de Fab y F(ab')2 de moleculas de anticuerpo se pueden preparar mediante la reaccion proteolftica de papama y pepsina, respectivamente, sobre moleculas de anticuerpo sustancialmente intactas mediante metodos que son bien conocidos. Vease, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 4.342.566. Porciones de molecula de anticuerpo Fab' son tambien bien conocidas y se producen a partir de porciones F(ab')2 seguido de la reduccion de los enlaces de disulfuro que unen las dos porciones de cadena pesada como con mercaptoetanol, y seguido de alquilacion del mercaptano de protema resultante con un reactivo tal como yodoacetamida.
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ENSAYOS DE ANTICUERPOS
Un numero de ensayos de seleccion son conocidos en la tecnica para el ensayo de anticuerpos de interes para confirmar su especificidad y afinidad y para determinar si estos anticuerpos reaccionan en forma cruzada con otras protemas.
Los terminos "union espedfica" o "se unen espedficamente" se refieren a la interaccion entre el antfgeno y sus anticuerpos correspondientes. La interaccion depende de la presencia de una estructura particular de la protema reconocida por la molecula de union (es dedr, el antigeno o epftopo). Para que la union sea espedfica, se debe involucrar la union de anticuerpos del epftopo de interes y no antfgenos de fondo.
Una vez que se producen anticuerpos, que se ensayan para confirmar que son espedficos para el antfgeno de interes y para determinar si presentan reactividad cruzada con otros antfgenos. Un metodo de llevar a cabo tales ensayos es un ensayo de pantalla de sueros como se describe en la Sol. de Pub. de EE.UU. N° 2004/0126829. Sin embargo, otros metodos de ensayo para el control de calidad estan dentro de la habilidad de una persona de experiencia ordinaria en la tecnica y por lo tanto estan tambien dentro del alcance de la presente descripcion.
Los anticuerpos, o fragmentos de union a antigeno, variantes o derivados de los mismos de la presente descripcion tambien pueden describirse o especificarse en terminos de su afinidad de union a un antigeno. La afinidad de un anticuerpo para un antigeno se puede determinar experimentalmente usando cualquier metodo adecuado. (Vease, por ejemplo, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed, Raven Press: Nueva York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: Nueva York, NY (1992); y metodos descritos en este documento). La afinidad medida de una interaccion anticuerpo- antfgeno particular puede variar si se mide en diferentes condiciones (por ejemplo, concentracion de sales, pH). Por lo tanto, mediciones de afinidad y otros parametros de union a antfgeno (por ejemplo, Kd, Ka, Kd) se realizan preferiblemente con soluciones normalizadas de anticuerpo y antfgeno, y un tampon estandarizado.
La constante de union de afinidad (Kaff) se puede determinar usando la siguiente formula:
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en el cual:
[mAg]t
n =----------------------L
[mAg']!
[mAb] es la concentracion de sitios de antfgeno libre, y [mAg] es la concentracion de sitios de union como se determina en dos concentraciones de antfgeno diferentes monoclonal libre (es dedr, [mAg]t y [mAg]t) (Beatty et al., J Imm Meth, 100: 173-179 (1987)).
El termino "alta afinidad" para un anticuerpo se refiere a una asociacion constante de equilibrio (Kaff) de al menos aproximadamente 1 x 107 litros/mol, o al menos aproximadamente 1 x 108 litros/mol, o al menos aproximadamente 1 x 109 litros/mol, o al menos aproximadamente 1 x 1010 litros/mol, o al menos aproximadamente 1 x 1011 litros/mol, o al menos aproximadamente 1 x 1012 litros/mol, o al menos aproximadamente 1 x 1013 litros/mol, o al menos aproximadamente 1 x 1014 litros/mol o mayor. "La alta afinidad" de union puede variar para los isotipos de anticuerpos. Kd, la constante de disociacion en equilibrio, es un termino que tambien se utiliza para describir la afinidad del anticuerpo y es la inversa de Kaff.
Kd, la constante de disociacion en equilibrio, es un termino que se utiliza tambien para describir la afinidad del anticuerpo y es la inversa de Kaff. Si Kd se utiliza, el termino "alta afinidad" para un anticuerpo se refiere a una constante de equilibrio de disociacion (Kd) de menos de aproximadamente 1 x 10'7 moles/litros, o menos de
aproximadamente
1 x 10-8 moles/litros, o menos de aproximadamente 1 x 10-9 moles/litros, o menos de
aproximadamente
1 x 10-io moles/litros, o menos de aproximadamente 1 x 10-11 moles/litros, o menos de
aproximadamente
1 x 10-12 moles/litros, o menos de aproximadamente 1 x 10-13 moles/litros, o menos de
aproximadamente 1 x 10'14 moles/litros o mas bajas.
La produccion de anticuerpos de acuerdo con la presente descripcion proporciona anticuerpos con las caractensticas de los producidos en el curso de una respuesta inmune humana fisiologica, es decir, especificidades de anticuerpos que solo pueden ser seleccionados por el sistema inmunitario humano. En el presente caso, esto incluye una respuesta al patogeno humano de virus de Dengue, serotipo 1. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente descripcion poseen las caractensticas de los producidos en el curso de una respuesta a
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la infeccion por el virus de Dengue. Estos anticuerpos se pueden utilizar como agentes profilacticos o terapeuticos de la formulacion apropiada.
En relacion a un patogeno particular, un "anticuerpo neutralizante", "anticuerpo ampliamente neutralizante", o "anticuerpo neutralizante monoclonal", todos los cuales se usan de forma intercambiable en el presente documento, es uno que puede neutralizar la capacidad de ese patogeno para iniciar y/o perpetuar una infeccion en un huesped. En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales producidos de acuerdo con la presente descripcion tienen actividad neutralizante, en donde el anticuerpo puede neutralizar a una concentracion de 10-9 M o inferior (por ejemplo 10-10 M, 10-10 M, 10-12 M o menor).
Las moleculas de inmunoglobulina de la presente invencion pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2) o subclase de molecula de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpo de union a antigeno (por ejemplo, humanos) e incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fvs de cadena sencilla (scFv), anticuerpo de cadena unica, Fvs unida a disulfuro (sdFv) y fragmentos que comprenden un dominio de Vl o Vh. Fragmentos de anticuerpos de union a antfgeno, incluyendo anticuerpos de cadena unica, pueden comprender la region variable sola o en combinacion con la totalidad o una porcion de los siguientes: region de bisagra, dominios CH1, CH2, y CH3. Tambien se incluyen en la presente descripcion fragmentos de union a antfgeno que comprenden cualquier combinacion de region variable con una region bisagra, dominios de CH1, CH2 y CH3.
AISLAMIENTO DE CELULAS B
Como se usa en el presente documento, los terminos "celula B", "celulas de memoria B", "linfocitos B", "linfocitos B de memoria", "celulas de memoria", "celulas B de memoria", y variantes de los mismos se utilizan de manera intercambiable y se refieren a las celulas B de la respuesta inmune humoral. Tal como se entiende en la tecnica, las celulas B son linfocitos que juegan un papel en la respuesta inmune humoral (en oposicion a la respuesta inmune mediada por celulas, que se rige por las celulas T). Al menos una funcion de las celulas B consiste en hacer anticuerpos contra antfgenos, desempenar el papel de celulas presentadoras de antfgeno (APCs) y, finalmente, convertirse en celulas B de memoria despues de la activacion por la interaccion de antfgeno. Las celulas B son un componente del sistema inmune adaptativo.
La frase "celula B primaria" puede referirse en algunas realizaciones a una celula B tomada directamente de un organismo vivo (por ejemplo, un humano). En algunas realizaciones, una celula B primaria puede ser cultivadoa en un cultivo celular primario. Una celula B primaria se puede derivar, obtener o recoger de un sujeto de cualquier manera conocida por los expertos en la tecnica. En algunas realizaciones, una celula B primaria se obtiene de un sujeto infectado con o que posee un antfgeno de interes.
Los metodos de la presente divulgacion se pueden aplicar para la identificacion de anticuerpos monoclonales expresados por celulas B humanas seleccionadas de los donantes, tales como los pacientes expuestos a un agente infeccioso, por ejemplo, virus de Dengue. Asf, el donante puede ser ingenuo, vacunado, afectado por una o mas enfermedades o infecciones, ya expuesto y/o resistente a los tratamientos terapeuticos espedficos, presentando un mdice clmico espedfico o el estado, inadvertidamente expuesto a un patogeno, etc.
Sueros de donantes se pueden utilizar como tales para una determinacion inicial de su seropositividad a un antfgeno, ya que la especificidad y mantenimiento a largo plazo de las respuestas inmunitarias adaptativas (incluso anos despues de la ultima exposicion a este antfgeno) puede permitir una determinacion cualitativa que es suficiente para la seleccion de los donantes. La naturaleza y la sensibilidad del ensayo de deteccion utilizada es cntica en la identificacion del donante mas adecuado y, preferiblemente, el ensayo utilizado para examinar el suero del donante debe ser el mismo que el utilizado para examinar los sobrenadantes a partir de celulas B inmortalizadas que secretan anticuerpo y disenadas para detectar un anticuerpo con la actividad funcional deseada (es decir, la actividad de neutralizacion).
La eleccion del tejido o el organo del que se purifican las celulas puede ser dictada por la disponibilidad de celulas apropiadas en cantidad suficiente. Las celulas pueden ser obtenidas a partir de muestras frescas o congeladas y/o a partir de muestras obtenidas a partir de un numero de individuos que han sido agrupados para proporcionar material de partida suficiente.
Un examen preliminar se puede realizar en un panel de donantes de candidatos, utilizando muestras que contienen celulas secretoras de anticuerpos (tales como sangre periferica total o suero). En particular, las celulas mononucleares se pueden aislar de sangre u otros tejidos linfaticos usando tecnicas estandar de separacion para aislar las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs), tales como centrifugacion en gradiente. Despues de y/o antes de esta etapa de separacion, las muestras de suero (o plasma), los sobrenadantes de cultivo de celulas, o las celulas (obtenidas a partir de diferentes pacientes, de diferentes tejidos, y/o en diferentes puntos de tiempo) pueden ser pre-seleccionados utilizando tecnologfas estandar para detectar la presencia de anticuerpos y celulas secretoras de anticuerpos (por ejemplo ELISA, BIACORE, Western blot, FACS, SERPA, matrices de antfgeno, la neutralizacion de la infeccion viral en un sistema de cultivo de celulas, o ensayos ELISPOT).
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Ejemplos en la tecnica incluyen, por ejemplo, el uso de ELISPOT para la caracterizacion de la respuesta inmune en los donantes vacunados (Crotty S et al., 2004), el uso de micromatrices de antfgeno como herramientas de diagnostico para los pacientes recientemente infectados (Mezzasoma L et al., 2002), y otras tecnologfas para la medicion de las respuestas inmunes espedficas de antfgeno (Kern F et al., 2005).
Este analisis cualitativo preliminar de respuesta de anticuerpos a la diana terapeutica debena permitir la identificacion de donantes que tienen celulas B que expresan mayores tftulos de anticuerpos dirigidos contra el antigeno purificado deseado (por ejemplo, una protema viral recombinante espedfica), una mezcla de antigenos relacionados (por ejemplo obtenida a partir de la preparacion viral parcialmente purificada), o un bioensayo (por ejemplo, la neutralizacion de la infectividad viral).
Una vez que se seleccionan uno o mas donantes, la fuente de las celulas B puede ser el bazo, sangre, ganglios linfaticos, medula osea, linfocitos infiltrantes de tumor, los linfocitos de los sitios de infeccion/inflamacion cronica. Sin embargo, la sangre periferica es generalmente mas facil de obtener de los donantes, de almacenar, y para monitorear la respuesta serologica frente a un antfgeno durante un periodo de tiempo definido.
Por ejemplo, a partir de 5-50 ml de sangre periferica, aproximadamente 10-100 millones de los PBMCs (celulas mononucleares de sangre periferica) se pueden purificar, un numero de celulas que permitina que una poblacion suficientemente grande de celulas secretoras de anticuerpo se examinara despues de haber sido inmortalizada usando los metodos descritos en este documento.
Despues del aislamiento de PBMCs a partir de muestras biologicas, una seleccion espedfica de celulas que secretan anticuerpo se puede realizar, usando procedimientos conocidos en la tecnica, sobre la base de la expresion de marcadores de superficie celular en su superficie y, si procede, de otras protemas, asf como la actividad de proliferacion, el metabolismo y/o el estado morfologico de las celulas.
En particular, varias tecnologfas para la purificacion de celulas secretoras de anticuerpos a partir de muestras humanas utilizan diferentes medios y condiciones para la seleccion positiva o negativa. Estas celulas se pueden seleccionar de manera eficiente por la separacion ffsica de las que expresan marcadores de superficie celular espedfica para celulas que expresan y secretan anticuerpos (por ejemplo celulas B humanas). Los protocolos espedficos se pueden encontrar en la tecnica (vease, por ejemplo, Callard R y Kotowicz K "Human B-cell responses to cytokines" en Cytokine Cell Biology: A Practical Approach. Balkwill F. (ed) Oxford University Press, 2000, pg. 17-31).
La seleccion se puede realizar utilizando anticuerpos que se unen espedficamente a una de estas protemas de la superficie celular y que puede vincularse a soportes solidos (por ejemplo, microperlas o placas de plastico) o marcados con un fluorocromo que se puede detectar usando clasificadores de celulas activadas por fluorescencia (FACS). Por ejemplo, las celulas B humanas se han seleccionado sobre la base de su afinidad por soportes (tales como microperlas) union CD 19, CD27, y/o microperlas CD22, o por la falta de afinidad de union para anticuerpos espedficos para determinados isotipos antes de inmortalizacion de EBV (Li H et al, 1995, Bemasconi N et al, 2003; Traggiai E et al, 2004).
Como se muestra en el presente documento, CD22, que es una protema de transmembrana restringida de celulas B que controla vfas de transduccion de senal relacionada con reconocimiento de antfgeno y la activacion de las celulas B (Nitschke L, 2005), se puede utilizar para la seleccion inicial de celulas B. Dado que la poblacion positiva CD22 contiene celulas que expresan anticuerpos que tienen diferentes isotipos y especificidades, otros marcadores de superficie celular tambien se pueden usar para la seleccion de las celulas.
Alternativamente o adicionalmente, un enriquecimiento espedfico de celulas secretoras de anticuerpos se pueden obtener mediante la aplicacion de una seleccion basada en CD27 ademas de la seleccion basada en CD22. CD27 se sabe que es un marcador de celulas B humanas que han mutado somaticamente genes de region variable (Borst J et al., 2005). Marcadores adicionales tales como CD5, CD24, CD25, CD86, CD38, CD45, CD70, o CD69 se podnan utilizar para agotar o enriquecer para la poblacion deseada de celulas. Por lo tanto, dependiendo de la historia del donante de la exposicion al antfgeno (por ejemplo, viral, bacteriano, parasito), el tttulo de anticuerpos, celulas B totales, celulas B enriquecidas CD22, o subpoblaciones de celulas B enriquecidas adicionalmente tales como las celulas B positivas CD27 pueden utilizarse.
TRANSFORMACION EBV DE CELULAS B
La poblacion seleccionada y estimulada de celulas que expresan anticuerpos que tienen isotipos espedficos se pueden immortalizar utilizando un agente de inmortalizacion viral. Diferentes agentes de inmortalizacion se pueden utilizar en las celulas secretoras de anticuerpos para obtener celulas inmortalizadas que secretan anticuerpo.
Entre los agentes de inmortalizacion viral, un virus que infecta y inmortaliza las celulas secretoras de anticuerpos se pueden utilizar preferiblemente en la practica de la invencion. Virus comunmente usados son virus
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linfotropico de celulas, agrupadas en la clase gamma del herpesvirus. Los miembros de esta familia de virus infectan los linfocitos de una manera espedfica de la especie, y estan asociados con trastornos linfoproliferativos y el desarrollo de varios tumores malignos (Nicholas J, 2000; Rickinson A, 2001).
EBV (virus Epstein-Barr, tambien conocido como herpesvirus 4), y HHV-8 (herpesvirus humano 8, tambien conocido como HVSK, Herpervirus asociado con Sarcoma de Kaposi) infectan e inmortalizan linfocitos humanos. MHV-68 (herpesvirus murino 68), HVS (herpesvirus Samiri), RRV (Rhesus Rhadinovirus), LCV (linfocriptovirus de primate), EHV-2 (herpesvirus equino 2) HVA (herpesvirus de ateles), y AHV-1 (herpesvirus de alcelafina 1) son otros herpesvirus oncogenicos, linfotropicos teniendo caractensticas geneticas comunes conservadas entre ellos y efectos patogenos similares en diferentes celulas huesped de mairnferos. Estos virus se pueden utilizar en la practica de la presente invencion.
Ademas de la utilizacion de virus intactos, los constructos de ADN recombinante que contienen protemas virales espedficas se han utilizado con exito para inmortalizar celulas B (Damania B 2004; Kilger E et al, 1998). Los vectores que contienen genes virales pueden ser transducidos en las celulas, a veces haciendo uso de sistemas retrovirales o lmeas celulares de empaquetamiento que proporcionan todos los factores necesarios para la formacion de tales partmulas similares a virus, tambien se pueden utilizar en los metodos descritos en el presente documento.
Inmortalizacion mediada por EBV es un proceso complejo que implica la inmortalizacion de celulas B debido a las protemas que se expresan por EBV, y esta regulada por la interaccion entre las protemas EBV y celulas huesped (Sugimoto M et al, 2004; Bishop G E, y Busch L K, 2002). Si se desea, el proceso de inmortalizacion puede ser seguido por la medicion de la expresion de protemas de EBV espedficos y las transcripciones tales como EBNA2, EBNA1, LMP2, LMP1, o EBERs (Thorley-Lawson DA, 2001). Estas protemas pueden ser detectadas por PCR, inmunofluorescencia, transferencia Western, u otros metodos que permiten la deteccion de ADN de EBV y las protemas en las celulas infectadas (Schlee M et al, 2004; Parque CH et al, 2004; Humme S et al,. 2003; Konishi K et al, 2001; Haan K et al, 2001).
EXAMEN Y AISLAMIENTO DE CELULAS B TRANSFORMADAS
En algunas realizaciones, celulas B transformadas y/o activadas se pueden examinar para las que tienen la especificidad de antfgeno deseada, y clones de celulas B individuales pueden producirse a partir de las celulas positivas. La etapa de deteccion puede llevarse a cabo mediante ELISA, por tincion de tejidos o celulas (incluyendo celulas transfectadas), un ensayo de neutralizacion, y/o uno de un numero de otros metodos conocidos en la tecnica para identificar la especificidad de antfgeno deseada. El ensayo se puede seleccionar sobre la base de simple reconocimiento del antfgeno, o puede seleccionarse sobre la base adicional de una funcion deseada, por ejemplo, anticuerpos neutralizantes en lugar de anticuerpos de union al antfgeno.
En algunas realizaciones, una etapa de clonacion para la separacion de clones individuales a partir de la mezcla de celulas positivas se puede llevar a cabo usando dilucion limitante, micromanipulacion, la deposicion de una sola celula por clasificacion de celulas, y/o por cualquier otro metodo conocido en la tecnica. En algunas realizaciones, la clonacion se lleva a cabo usando dilucion limitante. En algunas realizaciones, las celulas B clonadas se derivan de las celulas B que han sido inmortalizadas usando transformacion de EBV junto con la inhibicion de la respuesta del huesped innata a las senales proliferativas mediadas por activador.
En algunas realizaciones, la presente divulgacion proporciona la produccion de celulas B inmortalizadas que producen anticuerpos que tienen una especificidad de antfgeno deseada. Tales celulas B se pueden utilizar de diversas maneras, por ejemplo como una fuente de anticuerpos monoclonales, como fuente de acido nucleico (ADN o ARNm) que codifica un anticuerpo monoclonal de interes, para la administracion a los sujetos para la terapia celular, como un agente terapeutico o farmaceutico.
En algunas realizaciones, el sobrenadante de las celulas B activadas en cultivo se pueden examinar para anticuerpos de interes usando metodos conocidos en la tecnica. El examen se realiza para identificar uno o mas anticuerpos monoclonales capaces de unirse a un antfgeno de interes. Dicho examen se puede realizar en sobrenadante de cultivo y/o anticuerpos purificados. Alternativamente, la deteccion puede llevarse a cabo utilizando el sobrenadante de cultivo y/o anticuerpos purificados a partir de celulas B activadas y/o inmortalizadas. Ademas, cuando los anticuerpos de reaccion cruzada son de interes, la capacidad de los anticuerpos monoclonales frente a una reaccion cruzada con dos o mas antfgenos diferentes se pueden determinar. Por otra parte, en algunas realizaciones, puede ser deseable para la deteccion de anticuerpos con ciertas caractensticas funcionales (por ejemplo, actividad de neutralizacion).
La especificidad de union de anticuerpos monoclonales producidos por la presente divulgacion pueden, por ejemplo, ser determinada en un inmunoensayo, por ejemplo, mediante inmunoprecipitacion u otro ensayo de union in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA).
Clases generales representativas de metodos de examen que se pueden emplear incluyen, pero no se
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limitan a, (a) ensayos de captura de anticuerpo; (b) ensayos de captura de antigeno; y (c) examenes funcionales.
En ensayos de captura de anticuerpos, el antigeno se puede unir a una fase solida, se permite que los anticuerpos monoclonales a ensayarse se unan al antigeno, los anticuerpos no unidos se eliminan mediante lavado, y entonces se detectan los anticuerpos unidos, por ejemplo mediante un reactivo secundario tal como un anticuerpo marcado que reconoce espedficamente el anticuerpo.
Para un ensayo de captura de antfgeno, el antfgeno se puede marcar directamente. En una realizacion, los anticuerpos monoclonales a ensayar se pueden unir a una fase solida y despues se hicieron reaccionar con el antfgeno opcionalmente marcado. Alternativamente, el complejo anticuerpo-antigeno se puede permitir que se forme mediante inmunoprecipitacion antes de la union del anticuerpo monoclonal a ensayar a una fase solida. Una vez que los complejos anticuerpo-antigeno se unen a la fase solida, el antigeno no unido se puede eliminar por lavado y positivos pueden ser identificados mediante la deteccion del antigeno.
Diversos examenes funcionales existen para identificar anticuerpos monoclonales con actividades deseadas. En la presente descripcion, uno de tales examenes, como se describe en los Ejemplos, es un ensayo de neutralizacion.
EXPRESION RECOMBINANTE
Los metodos de la presente divulgacion tambien permiten la obtencion y/o secuenciacion de un acido nucleico para el anticuerpo a partir del clon de celulas B seleccionado; y utilizar el acido nucleico para generar una celula huesped que puede expresar el anticuerpo de interes.
En algunas realizaciones, la secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo deseado se puede secuenciar y despues emplear un sistema de expresion heterologo, por ejemplo, 293 celulas o celulas CHO. En algunas realizaciones, un anticuerpo se puede expresar de forma recombinante mediante la obtencion de uno o mas acidos nucleicos (por ejemplo, genes de cadena pesada y/o ligera) a partir del clon de una celula B que codifica el anticuerpo de interes e insertar el acido nucleico en una celula huesped con el fin de permitir la expresion del anticuerpo de interes en esa huesped.
Se describe la produccion de anticuerpos utilizando metodos de ADN recombinante, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos N° 4.816.567. Para la produccion recombinante del anticuerpo, el acido nucleico que lo codifica se afsla y se inserta en un vector replicable para clonacion adicional (amplificacion del ADN) o para la expresion. ADN que codifica un anticuerpo monoclonal se afsla facilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleotidos que son capaces de unirse espedficamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Los vectores que pueden unirse incluyen generalmente, pero no se limitan a, uno o mas de los siguientes: una secuencia senal, un origen de replicacion, uno o mas genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminacion de la transcripcion. Ejemplos de tales componentes del sistema de expresion se describen en, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos N° 5.739.277. Las celulas huesped adecuadas para la clonacion o expresion del ADN en los vectores del presente documento son las celulas procariotas, de levadura, o eucariotas superiores (vease, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N° 5.739.277).
COMPOSICIONES FARMACEUTICAS
El presente objeto divulgado proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden los anticuerpos producidos de acuerdo con la presente descripcion. En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones farmaceuticas que comprenden celulas B transformadas y/o activadas. En algunas realizaciones, una composicion farmaceutica puede comprender uno o mas anticuerpos monoclonales producidos en el uso de los metodos descritos en este documento. En algunas realizaciones, ambos anticuerpos monoclonales, asf como las celulas B transformadas y/o activadas del presente objeto divulgado se pueden incluir en una composicion farmaceutica. En algunas realizaciones, un panel de anticuerpos monoclonales producidos de acuerdo con la presente descripcion puede incluirse en una composicion farmaceutica. En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales y/o celulas B producida de acuerdo con la presente descripcion pueden ser incluidas con uno o mas agentes adicionales, por ejemplo, farmacos antivirales o analgesicos.
En algunas realizaciones, una composicion farmaceutica puede tambien contener un vedculo o adyuvante farmaceuticamente aceptable para la administracion del anticuerpo. En algunas realizaciones, el portador es farmaceuticamente aceptable para uso en humanos. El vedculo o adyuvante no debe inducir por sf mismo la produccion de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composicion y no debe ser toxico. Los vedculos adecuados pueden ser macromoleculas grandes, metabolizadas lentamente tales como protemas, polipeptidos, liposomas, polisacaridos, acidos polilacticos, acidos poliglicolicos, aminoacidos polimericos, copolfmeros de aminoacidos y padculas de virus inactivas.
Las sales farmaceuticamente aceptables se pueden utilizar, por ejemplo sales de acido mineral, tales como
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hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos y sulfatos, o sales de acidos organicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.
Los vetnculos farmaceuticamente aceptables en composiciones terapeuticas pueden contener adicionalmente Kquidos tales como agua, solucion salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias tamponantes del pH, pueden estar presentes en tales composiciones. Tales vetnculos permiten que las composiciones farmaceuticas se formulen como comprimidos, pfldoras, grageas, capsulas, Kquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas y suspensiones, para ingestion por el paciente.
Las composiciones del presente objeto divulgado pueden comprender ademas un vehfculo para facilitar la preparacion de la composicion y la administracion. Cualquier vetnculo de suministro o vetnculo adecuado se pueden utilizar, incluyendo pero no limitado a una microcapsula, por ejemplo una microesfera o una nanoesfera (Manome et al (1994) Cancer Res. 54: 5.408-5.413; Saltzman & Fung (1997) Adv Drug Deliv Rev 26: 209 a 230), un glicosaminoglicano (patente de Estados Unidos N° 6,106,866), un acido graso (patente de Estados Unidos No. 5.994.392), una emulsion grasa (patente de Estados Unidos N° 5.651.991), un lfpido o derivado de lfpido (Pat. No. 5,786,387), colageno (Pat. No. 5,922,356), un polisacarido o derivado del mismo (patente de Estados Unidos N° 5.688.931), una nanosuspension (patente de Estados Unidos N° 5.858.410), una micela polimerica o conjugado (Goldman et al (1997) Cancer Res. 57: 1447-1451 y en la patente de Estados Unidos numeros 4.551.482, 5.714.166, 5.510.103, 5.490.840, y 5.855.900), y un polisoma (patente de Estados Unidos No. 5.922.545).
Secuencias de anticuerpos se pueden acoplar a agentes activos o portadores usando metodos conocidos en la tecnica, incluyendo pero no limitado a conjugacion de carbodiimida, esterificacion, oxidacion con peryodato sodico, seguido por alquilacion reductora, y la reticulacion de glutaraldehndo (Goldman et al. (1997) Cancer Res. 57: 1447-1451; Cheng (1996) Hum. Gene Ther. 7: 275-282; Neri et al (1997) Nat Biotechnol 15: 1271-1275; Nabel (1997) Vectors for Gene Therapy. In Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, Nueva York, Park et al (1997) Adv Pharmacol 40: 399-435; Pasqualini et al (1997) Nat Biotechnol 15: 542-546; y Bauminger Wilchek (1980) Meth Enzymol 70: 151-159; Patente de Estados Unidos N° 6.071.890; y la Patente Europea N° 0 439 095).
Una composicion terapeutica de la presente invencion comprende, en algunas realizaciones, una composicion farmaceutica que incluye un portador farmaceuticamente aceptable. Las formulaciones adecuadas incluyen soluciones acuosas y no acuosas esteriles de inyeccion que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostaticos, bactericidas antibioticas y solutos que hacen la formulacion isotonica con los fluidos corporales del receptor previsto; y suspensiones acuosas y no acuosas esteriles que pueden incluir agentes de suspension y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unica o recipientes de dosis multiples, por ejemplo ampollas selladas y viales, y pueden almacenarse en un estado congelado o liofilizado que requiere solo la adicion del vetnculo lfquido esteril, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Algunos ingredientes ejemplares son SDS en el intervalo de algunas realizaciones de 0,1 a 10 mg/ml, en algunas realizaciones aproximadamente 2,0 mg/ml; y/o manitol u otro azucar en el intervalo en algunas realizaciones de 10 a 100 mg/ml, en algunas realizaciones aproximadamente 30 mg/ml; y/o solucion salina tamponada con fosfato (PBS). Cualesquiera otros agentes convencionales en la tecnica teniendo en cuenta el tipo de formulacion en cuestion pueden ser utilizados. En algunas realizaciones, el portador es farmaceuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el portador es farmaceuticamente aceptable para uso en humanos.
Las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion pueden tener un pH entre 5,5 y 8,5, preferiblemente entre 6 y 8, y mas preferiblemente aproximadamente 7. El pH se puede mantener mediante el uso de un tampon. La composicion puede ser esteril y/o libre de pirogenos. La composicion puede ser isotonica con respecto a los seres humanos. Las composiciones farmaceuticas del presente objeto divulgado se pueden suministrar en recipientes hermeticamente cerrados.
Las composiciones farmaceuticas pueden incluir una cantidad eficaz de uno o mas anticuerpos como se describe aqrn. En algunas realizaciones, una composicion farmaceutica puede comprender una cantidad que es suficiente para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o condicion deseada, o para mostrar un efecto terapeutico detectable. Los efectos terapeuticos tambien incluyen reduccion en los smtomas ffsicos. La cantidad eficaz precisa para cualquier sujeto particular dependera de su tamano y de la salud, la naturaleza y extension de la condicion, y la terapeutica o combinacion de agentes terapeuticos seleccionados para la administracion. La cantidad eficaz para una situacion dada se determina por experimentacion de rutina tal como se practica por uno de habilidad normal en la tecnica.
regJmenes DE TRATAMIENTO: farmacocinetica
Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden administrarse en una variedad de formas de dosificacion unitaria dependiendo del metodo de administracion. Las dosis para composiciones farmaceuticas tfpicas de anticuerpos son bien conocidas para los expertos en la tecnica. Tales dosificaciones son tfpicamente de tipo orientativo y se ajustan dependiendo del contexto terapeutico particular o la tolerancia del paciente. La cantidad de anticuerpo adecuada para lograr esto se define como una "dosis terapeuticamente eficaz". El programa de
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dosificacion y las cantidades eficaces para este uso, es dedr, el "regimen de dosificacion" dependera de una variedad de factores, incluyendo la etapa de la enfermedad o afeccion, la gravedad de la enfermedad o afeccion, el estado general de salud del paciente, el estado ffsico del paciente, la edad, la formulacion farmaceutica y la concentracion de agente activo, y similares. En el calculo del regimen de dosificacion para un paciente, el modo de administracion tambien se tiene en consideracion. El regimen de dosificacion tambien debe tomar en consideracion la farmacocinetica, es dedr, tasa de absorcion, biodisponibilidad, metabolismo, el aclaramiento, y similares de la composicion farmaceutica. Vease, por ejemplo, el ultimo Remington; Egleton, Peptides 18: 1431-1439, 1997; Langer, Science 249: 1527-1533, 199o.
Para los propositos de la presente invencion, una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion que comprende un anticuerpo, contiene aproximadamente 0,05 a 1 500 |jg de protema, preferiblemente de aproximadamente 10 a 1000 jg de protema, mas preferiblemente de aproximadamente 30 a 500 jg y mas preferiblemente de aproximadamente 40 a 300 pg, o cualquier numero entero entre estos valores. Por ejemplo, los anticuerpos de la invencion se pueden administrar a un sujeto a una dosis de aproximadamente 0,1 jg a aproximadamente 200 mg, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 jg a aproximadamente 5 jg, de aproximadamente 5 jg a aproximadamente 10 jg, de aproximadamente 10 jg a aproximadamente 25 jg, de aproximadamente 25 jg a aproximadamente 50 jg, de aproximadamente 50 jg a aproximadamente 100 jg, de aproximadamente 100 jg a aproximadamente 500 jg, de aproximadamente 500 jg de aproximadamente 1 mg, desde aproximadamente 1 mg a aproximadamente 2 mg, con dosis de refuerzo opcionales indicados en, por ejemplo, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, dos meses, tres meses, 6 meses y/o un ano despues. Se entiende que el nivel de dosis espedfico para cualquier paciente particular depende de una variedad de factores incluyendo la actividad del anticuerpo espedfico empleado, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administracion, via de administracion, y velocidad de excrecion, combinacion de farmacos y la gravedad de la enfermedad sometida a terapia particular.
Las vfas de administracion incluyen, pero no se limitan a administracion oral, topica, subcutanea, intramuscular, intravenosa, subcutanea, intradermica, transdermica y subdermica. Dependiendo de la via de administracion, el volumen por dosis es preferiblemente de aproximadamente 0,001 a 10 ml, mas preferiblemente de aproximadamente 0,01 a 5 ml, y mas preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 3 ml. Las composiciones se pueden administrar en un tratamiento de dosis unica o en multiples tratamientos de dosis en un horario y durante un periodo de tiempo apropiado para la edad, peso y estado del sujeto, la formulacion de anticuerpo particular usada, y la via de administracion.
KITS
Se pueden prever kits siempre que comprendan anticuerpos producidos de acuerdo con la presente descripcion que se pueden utilizar, por ejemplo, para aplicaciones terapeuticas descritas anteriormente. El artmulo de fabricacion comprende un recipiente con una etiqueta. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo tubos, botellas, viales, y de prueba. Los recipientes pueden estar formados de una variedad de materiales tales como vidrio o plastico. El recipiente contiene una composicion que incluye un agente activo que es eficaz para aplicaciones terapeuticas, como se describe anteriormente. El agente activo en la composicion puede comprender el anticuerpo. La etiqueta en el recipiente indica que la composicion se usa para una terapia particular o aplicacion no terapeutica, y tambien puede indicar instrucciones para uso in vivo o in vitro, tales como los descritos anteriormente.
Los siguientes ejemplos de aspectos espedficos para llevar a cabo la presente invencion se ofrecen con propositos ilustrativos solamente, y no pretenden limitar el alcance de la presente invencion tal como se establece en las reivindicaciones de ninguna manera.
EJEMPLOS
Metodos y materiales
Declaracion de Etica
Se obtuvo el consentimiento informado y todos los procedimientos llevados a cabo bajo un protocolo aprobado por la Junta de Revision Institucional de la Universidad Nacional (numero NUS-IRB es 06-196).
Celulas y virus
Celulas C6/36 y celulas BHK-21 se cultivaron como se ha descrito previamente (28). Todas las cepas de Dengue excepto cepas EHI y PVP 159 se obtuvieron del Instituto de Novartis de Enfermedades Tropicales, Singapur (NITD). La cepa EHI se obtuvo del Instituto de Salud Ambiental, Singapur (EHI) y PVP 159 (DENV1/SG/07K3640DK1/2008) de la cohorte de pacientes EDEN (29).
Clonacion de las celulas B
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El aislamiento y la inmortalizacion de celulas B se llevo a cabo como se describio previamente (10). Despues de 15 dfas de cultivo, los sobrenadantes se rastrearon para los anticuerpos espedficos a DENV por ELISA y PRNT.
Ensayos de union ELISA
Placas de fondo plano de 96 pocillos (placas Maxisorp, Nunc) se recubrieron con anticuerpo de raton 4G2 durante la noche a 5 pg/ml durante la noche. Las placas se lavaron tres veces con PBS/Tween-20 0,01%. Se anadieron diferentes manchas DENV en 1x105 pfu en 50 pl por pocillo y se incubaron adicionalmente durante 2 h. Las placas se lavaron tres veces con PBS/Tween-20 0,01%. HM14C10 se anadio a las placas y se incubaron durante 1 h. Las placas se lavaron tres veces con PBS/Tween-20 0,01%. Se anadio anti-IgG humana conjugada con HRP (Pierce, Singapur) y se incubo durante 1 h. Se anadio sustrato TMB (GE Healthcare, Singapur) y 0,1 M de acido sulfurico utilizado para detener la reaccion.
Produccion de HM14c10 recombinante
ARN a partir de celulas B se extrajo usando un kit de extraccion de ARN (Qiagen). La clonacion y expresion de anticuerpos recombinantes se llevo a cabo como se describio previamente (30).
Ensayo de mejora dependiente de anticuerpos
El virus de Dengue (5 x 102 pfu/ml) se pre-incubo con los medios, los anticuerpos individuales monoclonales (HM4G2, HM14c10 o HM14c10 N297Q) o subclases de anticuerpos monoclonales de HM14c10 (IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) y despues se anadio a 105 de las celulas K562. Despues de una hora, las celulas se lavaron extensamente con PBS para eliminar el virus no unido y el anticuerpo monoclonal. Despues de un penodo adicional de 48 h, los sobrenadantes se recogieron y se determinaron los tttulos virales mediante ensayo de placas en celulas BHK-21.
Experimentos con ratones in vivo
Ratones GA129 son deficientes en receptores de IFN-a/p y y (31). Los ratones fueron tratados de acuerdo con las recomendaciones del Comite de Cuidado y Uso de Animales Institucional (protocolo de IACUC N°: 018/11). Un diagrama esquematico que detalla las aplicaciones profilacticas y terapeuticas de HM14c10 frente a controles tratados con PBS se proporciona en la Figura 21. Los ratones se sacrificaron y la viremia se cuantifico por un ensayo de placa establecida (32).
Imagenes de celulas vivas confocal de lapso de tiempo
Toda la microscopia de celulas vivas de lapso de tiempo se realizo en un microscopio confocal de A1Rsi invertido (Nikon, Japon) usando lente de apertura numerica de Plan-Apochromat 100X 1.4 (NA). Imagenes de celulas vivas se realizaron con las celulas BHK vivas no fijadas cultivadas en cubreobjetos de vidrio de 25 mm (Marienfeld GmbH, Alemania) montados sobre soporte de la camara (Nikon, Japon). Las celulas se sembraron a una densidad de 4 X 104/pocillo 1 dfa antes del experimento y se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS. Para la deteccion simultanea de anticuerpos marcados de Alexa Fluor-488 y virus DEN1 marcados con Alexa Fluor-647, la lmea de 488 nm de un laser de iones de argon, y la luz de un laser de helio neon 633-nm se dirigieron a traves de un divisor de haz de HFT UV/488/633, y la fluorescencia se detecto usando un divisor de haz NFT 545 en combinacion con un filtro de paso de banda de 505-530 para Alexa Fluor-488 de deteccion y un filtro de paso largo 650 para deteccion de Alexa Fluor-647. Las imagenes fueron capturadas a intervalos de 30 segundos a 1 cuadro por seg (fps) durante 30 a 60 min. Todos los experimentos de formacion de imagenes de celulas vivas se realizaron con celulas incubadas a 37°C en 5% de sistema incubador de jaula de microscopio de CO2 (OkoLab, Italia). Las imagenes fueron analizadas y procesadas por elementos de Nikon Imaging Software (NIS) de software C (64 bits, version 3, SP7/constructor 547) [Nikon, Japon].
Cuantificacion de fluorescencia intracelular
El efecto del anticuerpo en la endocitosis de DENV1 se evaluo midiendo el nivel relativo de fluorescencia dentro de las celulas vivas. Despues del tratamiento con el anticuerpo respectivo, imagenes de al menos 100 celulas fueron adquiridas al azar usando microscopio confocal de A1Rsi de tres experimentos independientes. La region intracelular de las celulas fueron entonces demarcadas individualmente de forma manual utilizando la funcion de "region de interes" [ROI] de software de Elementos NIS (Nikon, Japon) y el nivel de fluorescencia relativa de Alexa Fluor-488 dentro de cada celula se midio utilizando la funcion de estadfsticas de ROI del software. La desviacion media estandar, y prueba t de student se calcularon para cada poblacion de celulas usando Microsoft Excel. La fluorescencia de poblaciones de celulas no tratadas infectadas con DEN1 se normalizaron a 100% y se utilizaron como una comparacion con celulas infectadas tratadas con anticuerpo.
CryoEM
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El virus de Dengue (cepa PVP 159) se preparo como se ha descrito previamente (3). El virus se mezclo con Fab HM14c10 en una relacion molar de 1: 1, se incubo a 37°C durante 30 min, y luego 4°C durante 2 h. El complejo entonces se congelo rapidamente en etano lfquido en rejillas de carbono de encaje, que se recubrieron con una capa delgada de carbono continuo. Las partmulas de virus se obtuvieron imagenes con un 300 kV FEI Titan Krios en las condiciones siguientes: dosis de electrones de 16 e-/A2, magnificacion de 47.000, rango de desenfoque de 1 pm a 3 pm. Las imagenes se registraron en un 4K por la camara 4K Gatan CCD que resulta en un tamano de pixel de 1,9 A por pixel. El total de 5.566 partmulas se encajonaron y los parametros de la funcion de transferencia de contraste se determinaron utilizando el encajador de programas y ctfit, respectivamente, en la suite de programas EMAN (33). La orientacion de las partmulas se determino mediante el uso de protocolo de recocido simulado (MPSA) multi-trayectorio (34). El virus del Nilo Occidental fue utilizado como un modelo inicial (26). El mapa tridimensional se genera mediante el programa hecho en EMAN. Se encontro que el mapa final de resolucion 7 A tal como se determino por el corte de coeficiente de cascara de Fourier de 0.5. La estructura cristalina de protema E post-fusion de DENV1 (18) no encaja bien en el mapa de densidad de cryoEM como un cuerpo ngido, los dominios en la protema E se rompieron y luego se montaron conjuntamente. El ajuste de las moleculas en el mapa cryoEM (establecido a nivel de contorno 4a) luego se optimiza mediante el uso de la funcion de "mapa de ajuste" de la quimera (35). Para crear un modelo de homologfa de la region de varable HM14c10, fue elegida una estructura con el mejor ajuste de secuenciadores (PDB codigo 2GHW) y el modelo de homologfa se creo utilizando el modelador (19). La cadena pesada y ligera del modelo de homologfa se colocaron por separado en el mapa de cryoEM (fijado en el nivel de contorno 3a) en las dos orientaciones posibles del Fab (Fig. 19).
Ejemplo 1: Aislamiento de un anticuerpo especifico DENV1 14c10 fuertemente neutralizante de un paciente infectado con DENV1 convaleciente.
Se identifico, se sub-clono y se expandio un grupo de lmeas celulares de linfocitos B que secretan anticuerpos con actividad de union y neutralizacion espedfica de serotipo para DENV1. Una de estas lmeas celulares, BCL-14c10, produjo IgG con union y actividad de neutralizacion significativamente mas fuerte que otros (FIG. 14A). Esta lmea celular se utilizo como una fuente de plantillas de genes de inmunoglobulina para la amplificacion por PCR y la expresion de IgG1 humanas recombinantes (FIG. 14B (a)). Un anticuerpo humano recombinante (HM) 14c10 tema actividad de union comparable para DENV1 con el BCL-14c10 parental (FIG. 14B (b)). HM14c10 neutralizado y unido a DENV1 pero no DENV2, 3 o 4 (FIG. 14C), y exhibio una fuerte actividad neutralizante con una PRNT50 de 0,328 pg/ml in vitro (FIG. 11A).
La actividad de ADE relacionada con el desarrollo de DHF y DSS se ha propuesto que se produzca cuando las concentraciones de anticuerpos y complejos de forma DENV que se unen a celulas que llevan el receptor Fc sub-neutralizante. Esto conduce a un aumento en la absorcion de virus y la secrecion de citoquinas pro-inflamatorias y quimiocinas (11). Se comparo la actividad de ADE de HM14c10 con un anticuerpo monoclonal HM4G2 de anti- Flavivirus humanizado utilizando un sistema establecido in vitro de ensayo empleando la lmea celular K562 mielomonodtica que expresa FcyR (12). HM4G2 tiene actividad de union cruzada de serotipo y se dirige a un bucle de fusion conservado de E-DII en la DENV1-4 (13). Hemos observado que HM14c10 exhibe alguna mejora homotfpica de la infeccion DENV1 en concentraciones sub-neutralizantes pero no actividad potenciadora para DENV2, 3 o 4, a la que no se une. En contraste, HM4G2 media la mejora de los cuatro serotipos a concentraciones sub-neutralizantes (FIG. 11B). Para investigar la contribucion de FcyRs de K562 a la actividad de ADE homotfpica observada de HM14c10, expresamos el anticuerpo como un fragmento Fab o union de FcyR reducida mediante la eliminacion del sitio de glicosilacion en IgG1 humana mediante sustitucion con el residuo de asparagina (N) en la posicion 297 por glutamina (Q) (14). Tanto el mutante HM14c10Fab como N297Q exhibio una reduccion en su actividad de ADE homotfpica frente a los controles de IgG1 enteras (FIG. 11C (a)). A continuacion se comparo la influencia de sub-clase IgG sobre la actividad de ADE y observamos una correlacion parcial con las actividades de union reportadas para FcyRIIA en K562 (15). La actividad de ADE puede ser clasificada del siguiente modo: IgG3> IgG1> IgG2> IgG4 siendo IgG3 la mas alta y Ig G4 la mas baja (Fig 11C (b).). Asf, la actividad de ADE de este anticuerpo anti-DENV neutralizante aparece dependiente de union FcyR aunque cabe senalar que la influencia de FcyR1 de alta afinidad y componentes del complemento en la neutralizacion del virus no se abarco en estos experimentos (16).
Una complejidad adicional en DENV es la presencia de multiples genotipos dentro de un unico serotipo. Genotipos de DENv 1 pueden variar hasta un 3% en su composicion de aminoacidos y los informes anteriores de los anticuerpos anti-DENV de raton han sugerido que la actividad protectora puede variar entre genotipos (17). Se comparo la actividad de union de HM14c10 para un numero de aislados clmicos de DENV1 que representan dos genotipos de DENV1 dispares (I y IV) con hM4G2. Tanto HM14c10 como HM4G2 exhiben actividad de union para los genotipos ensayados, con HM4G2 presentan mejores caractensticas de union en todos los casos (FIG. 15). En contraste, HM14c10 exhibio actividad de neutralizacion superior en comparacion con HM4G2 para todos los aislamientos/genotipos ensayados (FIG. 11D).
Ejemplo 2: HM14c10 se une a un epftopo dependiente de la estructura cuaternaria.
La naturaleza exacta de la interaccion entre un anticuerpo dado y el DENV debe tener la clave para explicar la neutralizacion. Para determinar esto, una estructura de microscopfa crio-electronica (cryoEM) de complejo Fab
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HM14c10:DENV1 se resolvio a resolucion de 7 A (Fig 12A). En plena ocupacion, 120 copias de Fab HM14c10 se unen a todas los 180 copias disponibles de las protemas E en la superficie del virus. Para identificar la huella de HM14c10 en la protema E, la estructura cristalina de la protema E DENV1 (18) se monta en el mapa de densidad de cryoEM (FIG. 16 y en la Tabla 1). El mapa de cryoEM de resolucion 7 A mostro conexiones de densidad claras entre los Fab HM14c10 y las protemas E, lo que permite la identificacion de la residuos de protema E en la interfaz de interaccion (FIG. 12b y FIG. 17). El epftopo reconocido por HM14c10 es dependiente de la estructura cuaternaria del virus. Dos Fab de HM14c10 se unen a tres protemas E en la unidad asimetrica de virus (FIG. 12C y D). Cada anticuerpo se une a traves de dos protemas E adyacentes con la mitad del epftopo en E-DIII y la otra mitad en la bisagra de E-DI y E-DI-E-DII de una protema E vecina.
Para comprender la interaccion Fab con la protema E, se ha creado un modelo de homologfa de la region variable de HM14c10 (FIG. 18), basado en una estructura de anticuerpo humano de referencia (PDB codigo 2GHW) utilizando el modelador (19). La region variable de la cadena ligera y pesada del modelo de homologfa fue entonces bloqueada en las densidades de cryoEM. Aunque las estructuras de ambas cadenas son similares, hay un ajuste distintivo que da una mejor correlacion con la densidad (FIG. 19A y B). El analisis de la interfaz de protema Fab-E sugiere que todas las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las cadenas pesadas y ligeras estan involucradas en la interaccion (FIG. S6C).
Tabla 1: Montaje de dominios de protema DENV 1 E en densidad de cryoEM HM14c10:DENV1.
Protema E en unidad asimetrica3
Dominio de protema E Numero de atomos colocados Valor de mapa medio en posiciones de atomo antesb/tras aiustec N° de atomos fuera de contorno antesb/tras ajuste0 Cambio de posicion previa (A) Rotacion de posicion previa (°)
A
I 889 3,790/4,291 447/362 2,63 16,1
II
1.260 4,635/5,212 533/424 2,16 3,02
III
1.522 3,592/4,141 816/695 2,98 6,07
B
I 889 4,126/4,368 403/368 1,37 12,7
II
1.260 4,715/5,359 539/409 2,30 4,51
III
1.522 4,185/4,380 685/648 1,48 4,75
C
I 889 4,033/4,261 407/379 1,93 10,2
II
1.260 4,744/5,098 499/428 1,06 7,37
III
1.522 4,100/4,345 739/668 1,64 6,03
a Para la designacion de la posicion de protema E vease la FIG. 12.
b Dominios de protema E Dengue 1 se superpusieron en primer lugar sobre las posiciones de protema E de la estructura de cryoEM de virus de Dengue 2 maduro (27).
c Ajuste de dominios de protema E Dengue 1 en mapa cryoEM HM14c10:DENV1 (establecido a un nivel de contorno de 4a) se optimiza mediante el uso de la funcion de ajuste-in-mapa en Chimera (35).________________________________________________
Las huellas de union de los dos Fab HM14c10 en una unidad asimetrica no son identicas (FIG. 12D), con doce aminoacidos comunes a ambas interfaces, pero cuatro que son unicos (Tabla 2). La comparacion de secuencias de los residuos de epftopo entre diferentes aislados de DENV1 indica que la mayona de los residuos se conservan (FIG. 20A), conforme a la actividad neutralizante observada de HM14c10. En contraste, estos residuos no se conservan en otros serotipos DENV o virus del Nilo Occidental (WNV) (FIG. 20B).
Tabla 2. Epftopo Fab HM14c10 en protemas E de DENV 1.
Fab
Molecula de protema E en la unidad asimetrica Dominio de protema E Residuos de protema E*
HM14c10 (I)
A I T51, L135, K136, G159, T160, T165, P166, Q167, E172, I173, T275
A
II N52, G274
B
III K310, E384, K385
HM14c10 (II)
B I T51, Q131, Y132, G159, T160, T165, P166, Q167, E172, I173, L175, T275
B
II N52, G274
C
III L308, K310
*Residuos comunes en ambos epftopos ligados por Fab HM14c10 (I) y HM14c10 (II) se indican en negrita.________________________________________________________
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Ejemplo 3: Microscopia confocal a intervalos de tiempo que revela el mecanismo de neutralizacion de HM14c10.
Los anticuerpos pueden neutralizar infecciones virales por diversos mecanismos que incluyen la inhibicion de la fijacion del virus o la fusion a membranas endosomales, o mediante el bloqueo de los cambios conformacionales inducidos por virus de las glicoprotemas de la superficie (20, 21). Para entender el mecanismo de neutralizacion HM14c10 de DENV1, se empleo microscop^a confocal a intervalos de tiempo para realizar un seguimiento de la infeccion de las celulas por vivo, marcado con fluorescencia DENV (22) (FIG. 13 y 21A). Cuando se incubaron celulas BHK con DENV1 y control de isotipo Mabs (union no DENV), el virus se unio en multiples compartimentos, predominantemente perinucleares, intra-celulares (FIG. 14A (a)). Concentraciones neutralizantes de HM4G2 indujeron la formacion de agregados virales en el espacio extracelular pero tambien se internalizaron con exito, lo que confirma que HM4G2 no inhibe virus de fijacion/internalizacion (FIG. 13A (b)). En contraste, HM14c10 indujo la formacion de agregados mas pequenos, pero adjunto bloqueado eficazmente, manteniendose la mayona de las pequenas partmulas virales en el espacio extracelular despues de una hora (FIG. 13A (c)). HM4G2 retrasa la acumulacion de virus intracelulares en comparacion con el control de isotipo (FIG. 13B, paneles superior e intermedio). Complejos HM14c10:DENV1 no entraron en las celulas pero se podfan ver desviar de su superficie (Fig. 13B, panel inferior). El grado de DENV1 fluorescente internalizado en todas las tres condiciones se cuantifico (FIG. 13C). Estos datos sugieren que el modo primario de la inhibicion de DENV1 por HM14c10 se realiza a traves de un bloqueo de la fijacion del virus a las celulas huesped.
Ejemplo 4: HM14c10 exhibe gran actividad profilactica y terapeutica in vivo.
DENV no es un patogeno natural en roedores inmunocompetentes, es posible inducir una viremia dependiente de la dosis en ratones GA129 deficientes en receptores de IFN de tipo I/II. Hemos inyectado estos ratones con DENV1 no modificada subcutaneamente (modelo I, FIG. 21B (a)) o intraperitonaalmente (modelo II, FIG. 21B (b)), luego cuantifico viremia 3-4 dfas mas tarde, respectivamente (20). Dos aislados clmicos DENV1, que representan genotipos dispares (genotipo EHI-D1 I contra Westpac genotipo IV), se utilizaron para determinar la eficacia in vivo de HM14c10. En ambos modelos, HM14c10 previno la enfermedad cuando se administra a los ratones 24 horas antes de la infeccion DENY1, o cuando se administra 48 h despues de la infeccion (FIG. 13D). La menor concentracion de HM14c10 donde se observo una reduccion significativa en la viremia es de 0,6 |jg por raton (o 160 pM), lo que representa una potencia in vivo que no ha sido igualada por cualquier otra formulacion terapeutica anti-DENV informada.
Discusion
Los informes recientes sobre las respuestas humorales engendradas por la infeccion DENV (23, 24) sugieren que hay un predominio de anticuerpos que son en su mayona serotipo DENV de reaccion cruzada con las actividades de neutralizacion debiles. Aunque escaso en el repertorio de suero humano, se sugieren los anticuerpos E-DIII para proteger contra la infeccion por DENV (23, 24) y esto es consistente con los estudios sobre la respuesta de anticuerpos murinos para DENV (7). Los anticuerpos humanos caracterizados han sido principalmente espedficos para DI y DII de la protema del virus E. Se observo un pequeno numero de anticuerpos caracterizados que se unen a todo el virus, pero no a la protema E recombinante que sugiere especificidad para epftopos dependientes de estructura cuaternaria (23). En este estudio, hemos aislado y caracterizado a fondo un anticuerpo neutralizante potente contra el serotipo DENV 1. Este anticuerpo es altamente neutralizante en sistemas tanto in vitro como in vivo. Ya que se une solo a DENV1, no causa una infeccion mejorada de las celulas mielomonocfticas por otros serotipos DENV.
La estructura cryoEM de resolucion 7 A de Fab HM14c10 complejado con DENV1, mostraron detalles de la union entre Fab y la protema E. Este nivel de detalle no se ha observado en las estructuras cryoEM anteriores de complejos de Flavivirus en anticuerpos. La huella del HM14c10 se extiende a traves de E-DIII y E-DI:E-DII de una protema E vecina (Figura 12D.). Un informe sobre un anticuerpo humano CR4354 espedfico para WNV tambien ha implicado a esta region como un objetivo para la inmunidad (25). Aunque la estructura cryoEM de WNV complejado con Fab CR4354 se resuelve a una resolucion mas baja (resolucion 14A) (FIG. 22A), el accesorio de la estructura cristalina Fab CR4354 genera una estructura de resolucion pseudo-atomica. Esto permitio la identificacion de residuos que interactuan. Comparacion de epftopo CR4354 en WNV y epftopo HM14c10 en DENV1 (FIG. 22B) mostraron que CR4354 tiene una proporcion mas grande de la huella en E-DIII mientras que HM14c10 tiene la mayona de los residuos que interactuan en E-DI. La comparacion de secuencias de los epftopos mostro que solo aproximadamente 20% de la CR4354 se solapa con epftopos HM14c10, y los residuos se solapan son en su mayona no conservada (FIG. 22C).
Aunque epftopos CR4354 y HM14c10 no son identicos, la union de estos anticuerpos deben mantener las protemas E vecinas juntas bloqueando de este modo la estructura del virus y previniendo los cambios de conformacion esenciales para una infeccion productiva es decir, la fijacion del virus a la sede de receptores y de fusion dentro de la via endocftica de las celulas huesped. Microscopia confocal de imagenes viva de intervalo de tiempo muestra que HM14c10 inhibe la union de DENV a las celulas huesped. En contraste CR4354 ha demostrado inhibir preferencialmente fusion WNV lo que sugiere la orientacion de esta region por los resultados de anticuerpos
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en mas de un mecanismo de inhibicion.
Se ha sugerido que las protemas de superficie de DENV se someten a cambios constantes en la condicion fisiologica - denominada "respiracion" (21). Es posible que la respiracion pueda desempenar un papel en la facilitacion de la union del virus a las celulas. Ya que HM14c10 interconecta las protemas E superficiales, puede entonces inhibir la union mediante la prevencion de las protemas de superficie de someterse a la respiracion. Alternativamente, E-DIII ha demostrado ser importante para la union de la celula huesped, la union de HM14c10 a E- DIII puede as^ estericamente obstaculizar este proceso. HMAb CR4354, aunque se une a la region similar como HM14c10, no inhibe la fijacion de WNV. Esto implica que la WNV que causa encefalitis y DENV que causa enfermedad febril no comparten determinantes de union a receptores identicos.
Se demostro que HMAb CR4354 prevema la fusion del virus a la membrana endosomal a pH bajo (25). Ya que HM14c10 tambien se une a traves de las protemas E vecinas, no se puede descartar la posibilidad de que HM14c10 pueda inhibir la reordenacion de estructuras dimericas E a trimericas durante la fusion. El potencial para inhibir tanto la union al receptor como la fusion puede explicar la eficacia excepcional in la de HM14c10.
La mayona de los flavivirus de protemas E tienen estructura cuaternaria similar basada en un alto grado de similitud entre las estructuras cryoEM de WNV (26) y DENV (27). Por lo tanto, todas las protemas E superficiales de flavivirus pueden sufrir reordenamientos estructurales similares durante su ciclo de infeccion. Los anticuerpos que se dirigen a una region similar como HM14c10 o CR4354 en otros flavivirus pueden por lo tanto ser protectores. Dado que los anticuerpos HM14c10 y CR4354 son los unicos dos anticuerpos caracterizados con esta actividad de union y ambos se derivan de fuentes humanas, indica que este tipo de epftopo es probablemente un determinante para la inmunidad de Flavivirus generalizada. Esto tiene importantes implicaciones para el diseno y evaluacion de futuras vacunas.
Por ultimo, dado que HM14c10 tiene perfiles de neutralizacion fuertes contra la mayona de los aislados clmicos de DENV1 y excelente eficacia in vivo, este anticuerpo representa un buen candidato terapeutico para el tratamiento de pacientes infectados con DENV1.
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Aunque se han descrito e ilustrado aspectos espedficos de la invencion, dichos aspectos deben ser considerados ilustrativos de la invencion solamente y no como limitantes de la invencion tal como se interpretara de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas.
Aunque la invencion anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustracion y ejemplo para propositos de claridad de comprension, sera facilmente evidente para un experto ordinario en la tecnica a la luz de las ensenanzas de esta invencion que ciertos cambios y modificaciones se pueden hacer a la misma sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (24)

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    Reivindicaciones
    1. Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une espedficamente a una protema (E) de envoltura de serotipo de virus de Dengue 1 o fragmento de la misma, en la que el anticuerpo es un anticuerpo humano con la actividad neutralizante que se une a traves de dos protemas E en un virus, en el que la union a traves de dos protemas E comprende la union a DI y la bisagra entre DI y II en la protema E y DIII de una protema E vecina.
  2. 2. El anticuerpo o fragmento del mismo segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo se seleccionan del grupo que consiste en: (a) una molecula de inmunoglobulina entera; (b) un scFv; (c) un fragmento Fab; (d) un F(ab')2; y (e) un Fv vinculado a disulfuro.
  3. 3. El anticuerpo o fragmento del mismo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el anticuerpo o fragmento comprende los mismos:
    un dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en: (a) un dominio constante de IgM humana; (b) un dominio constante de IgG1 humana; (c) un dominio constante de IgG2 humana; (d) un dominio constante de IgG3 humana; (e) un dominio constante de IgG4 humana; y (f) un dominio constante de IgA1/2 humana;
  4. 4. El anticuerpo o fragmento del mismo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende:
    una cadena pesada que comprende al menos una CDR seleccionada de entre el grupo de CDRs con las secuencias de aminoacidos SYGMH, VIWYDGSKTYYGDSVKG o GIAGGWAFW.
  5. 5. El anticuerpo o fragmento del mismo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el anticuerpo o fragmento comprende los mismos:
    una cadena pesada que comprende las tres CDR con las secuencias de aminoacidos SYGMH, VIWYDGSKTYYGDSVKG y GIAGGWAFW.
  6. 6. El anticuerpo o fragmento del mismo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende:
    una cadena pesada con la secuencia de aminoacidos
    EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVRQAPGKG
    LEWVAVIWYDGSKTYYGDSVKGRFTISKDNSKKMVNLQMDSLGV
    EDTAFYYCARGIAGGWAFWGIDLWGQGTLVTVSS.
  7. 7. El anticuerpo o fragmento del mismo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el anticuerpo o fragmento comprende:
    un marco de cadena pesada de IGHV1-2*02 y al menos una de las CDR con la secuencia de aminoacidos SYGMH, VIWYDGSKTYYGDSVKG o GIAGGWAFW.
  8. 8. El anticuerpo o fragmento del mismo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el anticuerpo o fragmento comprende:
    un dominio constante de inmunoglobulina de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: (a) un dominio constante de Ig kappa humana; y (b) un dominio constante de Ig lambda humana.
  9. 9. El anticuerpo o fragmento del mismo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende:
    una cadena ligera que comprende al menos una CDR seleccionada de entre el grupo de CDRs con las secuencias de aminoacidos RASQNVYSYLG, GVTSRAT o QQYAG.
  10. 10. El anticuerpo o fragmento del mismo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el anticuerpo o fragmento comprende:
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    una cadena ligera que comprende las tres CDR con las secuencias de aminoacidos RASQNVYSYLG, GVTSRAT y QQYAG.
  11. 11. El anticuerpo o fragmento del mismo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende:
    una cadena ligera con la secuencia de aminoacidos
    DVVMTQSPGTLS LSPG ER ATLSCR A SQNVYSYLGWY QHKPGR S PR LLIFGVTSRATGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYA GSAYTFGQGTKVEIKR
    o
    D1VMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQNVYSYLGWYQHKPGRSPR
    LL1FGVTSRATGVPDRFSGSGSGTDFTLT1SRLEPEDFAVYYCQQYA
    GSAYTFGQGTKVEIKR.
  12. 12. El anticuerpo o fragmento del mismo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el anticuerpo o fragmento comprende:
    un marco de cadena ligera de IGKV3-20*01 y al menos una de las CDRs con las secuencias de aminoacidos RASQNVYSYLG, GVTSRAT o QQYAG.
  13. 13. El anticuerpo o fragmento del mismo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el anticuerpo:
    se une a un virus de Dengue que tiene la especificidad de union de un anticuerpo con la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVRQAPGKG LEWVAVIWYDGSKTYYGDSVK- GRFTISKDNSKKMVNLQMDSLGV
    EDTAFYYCARGIAGGWAFWGIDLWGQGTLVTVSS y la secuencia de aminoacidos de cadena ligera
    DVVMTQSPGTLS LSPGERATLSCRASQNVYSYLGWYQHKPGRSPR
    LLIFGVTSRATGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYA
    GSAYTFGQGTKVEIKR
    o
    DIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQNVYSYLGWYQHKPGRSPR
    LLIFGVTSRATGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYA
    GSAYTFGQGTKVEIKR.
  14. 14. El anticuerpo o fragmento del mismo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el anticuerpo:
    es un anticuerpo con la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada
    EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVRQAPGKG
    LEWVAVIWYDGSKTYYGDSVKGRFTISKDNSKKMVNLQMDSLGV
    EDTAFYYCARGIAGGWAFWGIDLWGQGTLVTVSS y la secuencia de aminoacidos de cadena ligera
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    65
    DVVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQNVYSYLGWYQHKPGRSPR
    LLIFGVTSRATGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYA
    GSAYTFGQGTKVEIKR
    o
    DIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQNVYSYLGWYQHKPGRSPR
    LLIFGVTSRATGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYA
    GSAYTFGQGTKVEIKR.
  15. 15. El anticuerpo o fragmento del mismo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo se une a un antigeno con una constante de afinidad (Kd) de menos de 1 x 10-8 M y, opcionalmente, se une a un antigeno con una constante de afinidad (Kd) de menos de 1 x 10-9 M.
  16. 16. El anticuerpo o fragmento del mismo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en el que el anticuerpo se deriva de una celula B de un paciente que se ha recuperado de la infeccion por el virus de Dengue.
  17. 17. Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 y un vehuculo farmaceuticamente aceptable eficaz para reducir o prevenir la infeccion por virus de Dengue en un sujeto.
  18. 18. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 17, que comprende ademas un segundo agente.
  19. 19. Un anticuerpo o fragmento del mismo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 para su uso en un metodo de inmunizacion pasiva contra la infeccion por virus de Dengue que comprenden la administracion a un sujeto de una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-16.
  20. 20. Un anticuerpo o fragmento del mismo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 para su uso en un metodo de tratamiento de la infeccion por virus de Dengue que comprende la administracion a un sujeto en necesidad del mismo de una cantidad de anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 que es eficaz para reducir o prevenir la enfermedad.
  21. 21. El anticuerpo para el uso segun la reivindicacion 20, en donde:
    el anticuerpo se administra por via intravenosa (IV), subcutanea (SC), intramuscular (IM), transdermica, o por via oral; o
    el anticuerpo se administra en una cantidad en el intervalo de 1 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal del sujeto; o
    dicho uso comprende ademas la administracion de un segundo agente, opcionalmente en el que el segundo agente es farmaco antiviral o farmaco analgesico.
  22. 22. Un acido nucleico aislado que codifica el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-16.
  23. 23. Un vector de expresion que comprende el acido nucleico de la reivindicacion 22.
  24. 24. Una celula huesped que comprende el vector de expresion de la reivindicacion 23, opcionalmente en la que la celula huesped es una celula bacteriana, una celula eucariotica, o una celula de mairnfero
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