ES2959883T3 - Nuevos anticuerpos que se unen específicamente a epítopos del virus del zika y usos de los mismos - Google Patents

Nuevos anticuerpos que se unen específicamente a epítopos del virus del zika y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

La invención se refiere a anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que neutralizan potentemente la infección por ZIKV. La invención también se refiere a sitios antigénicos a los que se unen los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno, así como a ácidos nucleicos que codifican y a células B inmortalizadas que producen dichos anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. Además, la invención se refiere al uso de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la invención en métodos de detección así como en el diagnóstico, profilaxis y tratamiento de la infección por ZIKV. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevos anticuerpos que se unen específicamente a epítopos del virus del zika y usos de los mismos
La presente invención se refiere a anticuerpos y a fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a epítopos del virus del Zika (ZIKV). Dichos anticuerpos potencialmente neutralizan la infección por virus del Zika (ZIKV) y se pueden usar para el diagnóstico. La invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos y a células B inmortalizadas que producen dichos anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. Además, la invención se refiere al uso de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la invención en el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de la infección por ZIKv.
El virus del Zika (ZIKV), un flavivirus transmitido por mosquitos, es una emergencia de salud pública. El ZIKV se aisló por primera vez macacos en 1947, en el bosque de Zika en Uganda (G. W. A. Dick, S. F. Kitchen, A. J. Haddow, Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 46, 509-520 (1952)) y la primera infección humana se reportó en Nigeria en 1954 (F.N. Macnamara, Zika virus: a report on three cases of human infection during an epidemic of jaundice in Nigeria. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 48, 139-145 (1954)). Desde entonces, se han producido infecciones por ZIKV esporádicamente en África y el sureste de Asia (D. Musso, Van Mai Cao-Lormeau, D. J. Gubler, Zika virus: following the path of dengue and chikungunya? The Lancet. 386, 243-244 (2015)), pero se ha informado de epidemias en la Micronesia en 2007 (M. R. Duffy et al., Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. N Engl J Med. 360, 2536-2543 (2009)) y en la Polinesia Francesa en 2013-14, propagándose el virus posteriormente a otros países en el continente Oceanía (V.-M. Cao-Lormeau, D. Musso, Emerging arboviruses in the Pacific. Lancet. 384, 1571-1572 (2014); D. Musso, E. J. Nilles, V.-M. Cao-Lormeau, Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin. Microbiol. Infect. 20, 0595-6 (2014)). Después de su introducción en Brasil en 2015, el ZIKV se ha propagado rápidamente y, en febrero de 2016, la Organización Mundial de la Salud (OMS) lo declaró una emergencia de salud pública de interés internacional (L. R. Baden, L. R. Petersen, D. J. Jamieson, A. M. Powers, M. A. Honein, Zika Virus. N. Engl. J. Med.
374, 1552-1563 (2016); A. S. Fauci, D. M. Morens, Zika Virus in the Americas - Yet Another Arbovirus Threat. N Engl J Med, 160113142101009 (2016); D. L. Heymann et al., Zika virus and microcephaly: why is this situation a PHEIC? Lancet. 387, 719-721 (2016)). La vía principal de la infección por ZIKV es a través de las picaduras de los mosquitos Aedes, pero el virus también puede transmitirse por vía sexual (D. Musso et al., Potential sexual transmission of Zika virus. Emerg Infect Dis. 21, 359-361 (2015)) y vertical (J. Mlakar et al., Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374, 951-958 (2016)). Si bien la mayoría de las infecciones por ZIKV son asintomáticas o causan sólo síntomas leves, existe evidencia de que la infección por ZIKV puede conducir a complicaciones neurológicas, como el síndrome de Guillain-Barré en adultos (V.-M. Cao-Lormeau et al., Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. Lancet. 0 (2016), doi:10.1016/S0140-6736(16)00562-6) y a defectos congénitos de nacimiento, incluyendo microcefalia del feto en desarrollo (G. Calvet, R. S. Aguiar, A. Melo, S. A. Sampaio, Detection and sequencing of Zika virus from amniotic fluid of fetuses with microcephaly in Brazil: a case study. Lancet Infect Dis (2016), doi:10.1016/s1473-3099(16)00095-5; J. Mlakar et al., Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374, 951-958 (2016); E. J. Rubin, M. F. Greene, L. R. Baden, Zika Virus and Microcephaly. N Engl J Med (2016), doi:10.1056/NEJMe1601862)), probablemente por su capacidad de infectar las células progenitoras neurales humanas (H. Tang et al., Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Stem Cell, 1-5 (2016)).
El ZIKV pertenece al género flavivirus, que también incluye el virus del Nilo Occidental, el virus del dengue, el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, el virus de la fiebre amarilla y varios otros virus que pueden causar encefalitis. Los flavivirus son virus con envoltura, de geometrías icosaédricas y esféricas. El diámetro es de aproximadamente 50 nm. Los genomas son ARN lineales de sentido positivo y no segmentados, de aproximadamente 10-11 kb de longitud. El genoma de los flavivirus codifica 3 proteínas estructurales (cápside, prM<y envoltura) y 8 proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A,>N<s>4B,<NS5 y NS5B).>
Mientras que las proteínas de envoltura (E) del flavivirus median la fusión y son la diana principal de los anticuerpos neutralizantes, la proteína no estructural 1 (NS1) es secretada por las células infectadas y está implicada en la evasión inmune y la patogénesis (D. A. Muller, P. R. Young, The flavivirus NS1 protein: molecular and structural biology, immunology, role in pathogenesis and application as a diagnostic biomarker. Antiviral Res. 98, 192-208 (2013)). Dos estudios estructurales recientes demostraron un alto nivel de similitud estructural entre la proteína E del ZIKV y la de otros flavivirus, tal como el virus del dengue (DENV), el virus de la fiebre amarilla (YFV) y el virus del Nilo Occidental (WNV), pero también revelaron características únicas que pueden estar relacionadas con el neurotropismo del ZIKV (L. Dai et al., Structures of the Zika Virus Envelope Protein and Its Complex with a Flavivirus Broadly Protective Antibody. Cell Host Microbe (2016), doi:10.1016/j.chom.2016.04.013; D. Sirohi et al., The 3.8 A resolution cryo-EM structure of Zika virus. Science, aaf5316 (2016)). De manera similar, el análisis estructural de la proteína NS1 de ZIKV (ZIKV-NS1) reveló características conservadas con las NS1 de otros flavivirus, aunque con diferentes características electrostáticas (J. Kim et al., Zika virus NS1 structure reveals diversity of electrostatic surfaces among flaviviruses, 1-6 (2016)).
Un fenómeno que es característico de ciertos flavivirus es la actividad de potenciación de la enfermedad de los anticuerpos de reacción cruzada que se provoca por una infección previa por virus heterólogos. En el caso del virus del dengue (DENV), para el cual se conocen 4 serotipos, existe evidencia epidemiológica de que una infección primaria protege de la reinfección con el mismo serotipo, pero representa un factor de riesgo para el desarrollo de una enfermedad grave en la reinfección con un serotipo diferente (S. B. Halstead, Dengue Antibody-Dependent Enhancement: Knowns and Unknowns. Microbiol Spectr. 2, 249-271 (2014)). La enfermedad exacerbada es desencadenada por anticuerpos específicos de E y prM que no logran neutralizar el virus entrante, sino que potencian su captura por las células que expresan el receptor Fc (FcR+), lo que lleva a una potenciación de la replicación viral y a la activación de las células T de memoria con reacción cruzada. Se cree que la tormenta de citocinas resultante es la base de la forma más grave de la enfermedad conocida como fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de choque por dengue (S. B. Halstead, Neutralization and antibody-dependent enhancement of dengue viruses. Adv Virus Res. 60, 421-467 (2003); G. Screaton, J. Mongkolsapaya, S. Yacoub, C. Roberts, New insights into the immunopathology and control of dengue virus infection. Nat Rev Immunol. 15, 745-759 (2015). El papel de los anticuerpos en el dengue grave está respaldado por estudios que demuestran que los niveles decrecientes de anticuerpos maternos en los bebés representan un mayor riesgo de desarrollo de la enfermedad grave del dengue (S. B. Halstead, Neutralization and antibody-dependent enhancement of dengue viruses. Adv Virus Res. 60, 421-467 (2003); S. B. Halstead et al., Dengue hemorrhagic fever in infants: research opportunities ignored. Emerging Infect Dis. 8, 1474-1479 (2002); T. H. Nguyen et al., Dengue hemorrhagic fever in infants: a study of clinical and cytokine profiles. J Infect Dis. 189, 221-232 (2004); A. L. Rothman, Dengue: defining protective versus pathologic immunity. J Clin Invest. 113, 946-951 (2004)).
Recientemente se ha demostrado que la mayoría de los anticuerpos que reaccionaban a la proteína de envoltura del DENV también se unían a ZIKV, pero aquellos que reconocen el epítopo principal lineal fusión-bucle (FLE) no neutralizaban el ZIKV y, en su lugar, promovían el aumento dependiente de anticuerpos (ADE) de la infección por ZIKV (Dejnirattisai W, Supasa P, Wongwiwat W, Rouvinski A, Barba-Spaeth G, Duangchinda T, Sakuntabhai A, Cao-Lormeau VM, Malasit P, Rey FA, Mongkolsapaya J, Screaton GR: Dengue virus sero-cross-reactivity drives antibody-dependent enhancement of infection with zika virus. Nat Immunol. 2016 Jun 23. doi: 10.1038/ni.3515..
[Publicación electrónica previa a impresión]). Por ejemplo, Dai et al., 2016, describen que el anticuerpo murino fuertemente neutralizante de flavivirus 2A10G6, que neutraliza DENV, el virus de la fiebre amarilla (YFV) y el virus del Nilo occidental (WNV), se une al bucle de fusión de la proteína E del ZIKV (FLE) (L. Dai et al., Structures of the Zika Virus Envelope Protein and Its Complex with a Flavivirus Broadly Protective Antibody. Cell Host Microbe (2016), doi:10.1016/j.chom.2016.04.013). Barba-Spaeth et al., 2016, describen los anticuerpos neutralizantes de ZIKV C8 y A11, mostrando C8 mayor potencia de neutralización y enlace a EDE1 del ZIKV (Barba-Spaeth G, Dejnirattisai W, Rouvinski A, Vaney MC, Medits I, Sharma A, Simon-Loriére E, Sakuntabhai A, Cao-Lormeau VM, Haouz A, England P, Stiasny K, Mongkolsapaya J, Heinz FX, Screaton GR, Rey FA. Structural basis of potent Zikadengue virus antibody cross-neutralization. Nature. 2016 Aug 4;536(7614):48-53). Estos anticuerpos también presentan reactividad cruzada a DENV (Barba-Spaeth et al., 2016).
Además, de acuerdo con la OMS, el reciente aumento de casos de microcefalia y otros trastornos neurológicos potencialmente asociados con la infección por el virus del Zika ha provocado un aumento en la demanda de pruebas de laboratorio para detectar la infección por el virus del Zika. En este contexto, se requiere una alta especificidad de los anticuerpos para distinguir la infección por ZIKV de la infección por otros flavivirus. Sin embargo, los anticuerpos anti-Zika conocidos suelen ser reactivos cruzados para otros flavivirus y, por tanto, no son útiles para distinguir la infección por ZIKV de la infección de otros flavivirus.
En vista de lo anterior, es un objeto de la presente invención proporcionar nuevos anticuerpos que se unen específicamente a epítopos de ZIKV. También es un objeto de la presente invención proporcionar anticuerpos anti-ZIKV potencialmente neutralizantes. Dichos anticuerpos preferiblemente no contribuyen a la potenciación dependiente de anticuerpos (ADE) de la infección por el virus del Zika. También es un objeto de la presente invención proporcionar anticuerpos anti-ZIKV altamente específicos útiles en el diagnóstico y el ensayo de la infección por ZIKV y métodos de diagnósticoin-vitroque utilizan dichos anticuerpos.
El objeto subyacente de la presente invención se resuelve mediante el objeto reivindicado.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos aquí empleados tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica.
A lo largo de esta descripción y las reivindicaciones que le siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que el término “comprender” y variaciones tales como “comprende” y “que comprende” implican la inclusión de un miembro, número entero o paso indicado, pero no la exclusión de cualquier otro miembro, número entero o paso no indicado. El término “consiste en” es una realización particular del término “comprende” en el que se excluye cualquier otro miembro, número entero o paso no indicado. En el contexto de la presente invención, el término “comprende” abarca el término “consiste en”. De tal modo, el término “que comprende” abarca “que incluye” o “incluyendo”, así como “que consiste”, por ejemplo una composición que “comprende” X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y.
Los términos “un” y “una”, así como “el” y “la”, y referencias similares utilizados en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse como que abarcan tanto el singular como el plural, a menos que se indique aquí lo contrario o el contexto lo contradiga claramente. La mención de los rangos de valores aquí tiene por único fin servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor individual que se encuentre dentro del rango. A menos que se indique aquí lo contrario, cada valor individual se incorpora en la descripción como si se mencionara individualmente. Ningún lenguaje de la descripción debe interpretarse como que indica cualquier elemento no reivindicado esencial para la práctica de la invención.
La palabra “esencialmente” no excluye “completamente”, por ejemplo una composición que está “esencialmente libre” de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra “esencialmente” puede omitirse de la definición de la invención.
El término “aproximadamente” en relación con un valor numérico x significa x±10 %.
El término “enfermedad” tal como se usa aquí pretende ser un sinónimo general y se aplica de manera intercambiable con los términos “trastorno” y “condición” (tal como en condición médica), en el sentido de que todos reflejan una condición anormal del cuerpo humano o animal o de una de sus partes que dificulta el funcionamiento normal que se manifiesta típicamente distinguiendo signos y síntomas y causa que el ser humano o el animal tengan una vida o calidad de vida reducida.
Tal como se usa aquí, la referencia a “tratamiento” de un sujeto o paciente pretende incluir la prevención, la profilaxis, la atenuación, la mejora y la terapia. Los términos “sujeto” o “paciente” se usan aquí de manera intercambiable para referirse a todos los mamíferos, incluyendo seres humanos. Ejemplos de sujetos incluyen seres humanos, vacas, perros, gatos, caballos, cabras, ovejas, cerdos y conejos. En una realización, el paciente es un ser humano.
Tal como se usan aquí, los términos “fragmento de unión a antígeno”, “fragmento” y “fragmento de anticuerpo” se aplican indistintamente para referirse a cualquier fragmento de un anticuerpo de la invención que mantiene la actividad de unión a antígeno del anticuerpo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo monocatenario, Fab, Fab', F(ab')<2>, Fv o scFv. Además, tal como se usa aquí, el término “anticuerpo” incluye tanto anticuerpos como fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
Tal como se usa aquí, el término “anticuerpo” abarca varias formas de anticuerpos, incluyendo, sin limitación, anticuerpos completos, fragmentos de anticuerpos, en particular fragmentos de unión a antígeno, anticuerpos humanos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos recombinantes y anticuerpos modificados genéticamente (variante o anticuerpos mutantes) siempre que se conserven las propiedades características de acuerdo con la invención. Se prefieren los anticuerpos humanos y los anticuerpos monoclonales, y especialmente los anticuerpos monoclonales humanos, en particular como anticuerpos monoclonales humanos recombinantes.
Los anticuerpos humanos son bien conocidos en el estado de la técnica (van Dijk, M. A., & van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). Los anticuerpos humanos también pueden producirse en animales transgénicos (por ejemplo, ratones), que son capaces, después de inmunización, de producir un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos sin que se produzca inmunoglobulina endógena. La transferencia de la matriz génica de la línea germinal de inmunoglobulina humana en estos ratones mutantes de línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno (véase, por ejemplo, Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 3340). Los anticuerpos humanos también pueden producirse en bibliotecas de presentación de fagos (Hoogenboom, H. R., & Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381 388; Marks, J. D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). También se dispone de las técnicas de Cole et al. y Boerner et al. para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); y Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Preferiblemente, los anticuerpos monoclonales humanos se preparan utilizando una inmortalización mejorada de células B con el virus EBV, tal como se describe en Traggiai E, Becker S, Subbarao K, Kolesnikova L, Uematsu Y, Gismondo MR, Murphy BR, Rappuoli R, Lanzavecchia A. (2004): An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat. Med. 10(8):871-5. Tal como se usa aquí, el término “anticuerpo humano” también comprende tales anticuerpos modificados, por ejemplo, en la región variable, para generar las propiedades según la invención aquí descritas. Tal como se usa aquí, el término “región variable” (región variable de cadena ligera (VL), región variable de cadena pesada (VH) denota cada uno de los pares de cadenas ligeras y pesadas que participan directamente en la unión del anticuerpo al antígeno.
Los anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier isotipo (por ejemplo IgA, IgG, IgM, es decir, una cadena pesada a, y o p), pero preferiblemente serán IgG. Dentro del isotipo de IgG, los anticuerpos pueden ser las subclases IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, siendo preferente IgG1. Los anticuerpos de la invención pueden tener una cadena ligera<k>o A.
Preferiblemente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, es un anticuerpo purificado, un anticuerpo monocatenario, un fragmento Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv.
Así, los anticuerpos de la invención pueden ser preferiblemente anticuerpos humanos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos monoclonales humanos, anticuerpos recombinantes o anticuerpos purificados. La invención también proporciona fragmentos de los anticuerpos de la invención, en particular fragmentos que retienen la actividad de unión a antígeno de los anticuerpos. Tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monocatenarios, Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv. Aunque la descripción, incluyendo las reivindicaciones, puede en algunas partes referirse explícitamente a fragmentos de unión a antígeno, fragmentos de anticuerpos, variantes y derivados de los anticuerpos, se entiende que el término “anticuerpo” o “anticuerpo de la invención” incluye todas las categorías de anticuerpos, específicamente, fragmento(s) de unión a antígeno, fragmento(s) de anticuerpos, variante(s) y derivado(s) de anticuerpos.
Los fragmentos de los anticuerpos de la invención se pueden obtener a partir de los anticuerpos mediante métodos que incluyen la digestión con enzimas, como pepsina o papaína, y/o mediante escisión de enlaces disulfuro por reducción química. Alternativamente, los fragmentos de los anticuerpos pueden obtenerse por clonación y expresión de parte de las secuencias de las cadenas pesadas o ligeras. Los "fragmentos" de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv. La invención también abarca fragmentos Fv monocatenarios (scFv) derivados de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo de la invención. Por ejemplo, la invención incluye un scFv que comprende las CDR de un anticuerpo de la invención. También se incluyen monómeros y dímeros de cadena pesada o ligera, anticuerpos de cadena pesada de dominio único, anticuerpos de cadena ligera de dominio único, así como anticuerpos monocatenarios, por ejemplo Fv monocatenario, en el que los dominios variables de cadena ligera y pesada están unidos por un enlazador peptídico.
Los fragmentos de anticuerpos de la invención pueden impartir interacciones monovalentes o multivalentes y estar contenidos en diversas estructuras, tal como se describió anteriormente. Por ejemplo, se pueden sintetizar moléculas scFv para crear un “triacuerpo” trivalente o un “tetracuerpo” tetravalente. Las moléculas scFv pueden incluir un dominio de la región Fc, resultando en minicuerpos bivalentes. Además, las secuencias de la invención pueden ser un componente de moléculas multiespecíficas donde las secuencias de la invención se dirigen a los epítopos de la invención y otras regiones de la molécula se unen a otras dianas. Moléculas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, Fab2 biespecífico, Fab3 triespecífico, scFv biespecífico y diacuerpos (Holliger & Hudson, 2005, Nature Biotechnology 9: 1126-1136).
Los anticuerpos según la presente invención se pueden proporcionar en una forma purificada. Típicamente, el anticuerpo estará presente en una composición esencialmente libre de otros polipéptidos, por ejemplo donde menos del 90% (en peso), generalmente menos del 60% y más generalmente menos del 50% de la composición se compone de otros polipéptidos.
Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden ser inmunogénicos en huéspedes humanos y/o no humanos (o heterólogos), por ejemplo en ratones. Por ejemplo, los anticuerpos pueden tener un idiotopo que es inmunogénico en huéspedes no humanos, pero no en un huésped humano. Los anticuerpos de la invención para uso humano incluyen aquellos que no pueden aislarse fácilmente de huéspedes tales como ratones, cabras, conejos, ratas, mamíferos no primates, etc., y que no pueden obtenerse generalmente por humanización o a partir de xeno-ratones.
Tal como se usa aquí, un “anticuerpo neutralizante” es aquel que puede neutralizar, es decir, prevenir, inhibir, reducir, impedir o interferir con la capacidad de un patógeno para iniciar y/o perpetuar una infección en un huésped. Los términos “anticuerpo neutralizante” y “un anticuerpo que neutraliza” o “anticuerpos que neutralizan” se usan aquí indistintamente. Estos anticuerpos pueden emplearse solos o en combinación como agentes profilácticos o terapéuticos en la formulación adecuada, en asociación con una vacunación activa, como una herramienta de diagnóstico o como una herramienta de producción tal como se describe aquí.
Las dosis se expresan a menudo en relación con el peso corporal. Por tanto, una dosis que se expresa como [g, mg u otra unidad]/kg (o g, mg, etc.) generalmente se refiere a [g, mg u otra unidad] “por kg (o g, mg, etc.) de peso corporal”, incluso aunque el término “peso corporal” no se mencione explícitamente.
El término “unido específicamente” y referencias similares no abarca la unión no específica.
El término “vacuna” tal como se emplea aquí se entiende típicamente como un material profiláctico o terapéutico que proporciona al menos un antígeno, preferiblemente un inmunógeno. El antígeno o inmunógeno puede derivarse de cualquier material adecuado para la vacunación. Por ejemplo, el antígeno o inmunógeno puede derivarse de un patógeno, tal como de bacterias o partículas virales, etc., o de un tumor o tejido canceroso. El antígeno o inmunógeno estimula el sistema inmune adaptativo del cuerpo para proporcionar una respuesta inmune adaptativa. En particular, un “antígeno” o un “ inmunógeno” se refiere típicamente a una sustancia que puede ser reconocida por el sistema inmune, preferiblemente por el sistema inmune adaptativo, y que es capaz de desencadenar una respuesta inmune específica de antígeno, por ejemplo mediante la formación de anticuerpos y/o células T específicas de antígeno, como parte de una respuesta inmune adaptativa. Típicamente, un antígeno puede ser o puede comprender un péptido o proteína que puede ser presentado por el MHC a las células T.
Tal como se usa aquí, el término “variante de secuencia” (o también “variante”) se refiere a cualquier alteración en una secuencia de referencia, siendo una secuencia de referencia cualquiera de las secuencias citadas en “Tablas de secuencias y números de identificación de secuencias” (listado de secuencias), es decir, las SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 407. Por tanto, el término “variante de secuencia” incluye variantes de secuencia de nucleótidos y variantes de secuencia de aminoácidos. Cabe destacar que las variantes de secuencia a las que se hace referencia aquí son en particular variantes de secuencia funcionales, es decir, variantes de secuencia que mantienen la función biológica de, por ejemplo, el anticuerpo. En el contexto de la presente invención, dicha esta función biológica retenida es preferiblemente la neutralización de la infección por ZIKV, la unión del anticuerpo a la proteína E de ZIKV y/o la unión del anticuerpo a la proteína NS1 de ZIKV. Así, variantes de secuencia preferentes son variantes de secuencia funcionales que tienen al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia con una secuencia de referencia. Como se usa aquí, la frase “variante de secuencia funcional de la(s) misma(s) que tenga al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia” significa que (i) la variante de secuencia es funcional tal como se describe aquí y (ii) cuanto mayor sea el % de identidad de secuencia, más preferible es la variante de secuencia. En otras palabras, la frase “variante de secuencia funcional de la(s) misma(s) que tenga al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia” significa en particular que la variante de secuencia funcional tiene al menos un 70% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos un 75% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos un 80% de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos un 88% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos un 90% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos un 92% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos un 95% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos un 96% de identidad de secuencia, de manera particularmente preferible al menos un 97% de identidad de secuencia, de manera particularmente preferible al menos un 98% de identidad de secuencia y con total preferencia al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia respectiva.
El término “variante de secuencia” incluye en particular variantes que comprenden mutaciones y/o sustituciones en comparación con la secuencia de referencia. Variantes ilustrativas de una parte de una secuencia Fc incluyen, pero no se limitan a, aquellas con una sustitución de L a A en la posición CH24, CH25, o ambas.
La identidad de secuencia generalmente se calcula con respecto a la longitud completa de la secuencia de referencia (es decir, la secuencia indicada en la solicitud). El porcentaje de identidad, tal como se menciona aquí, se puede determinar, por ejemplo, mediante BLAST usando los parámetros predeterminados especificados por el NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [matriz BLOSUM 62; penalización de apertura de hueco = 11 y penalización de extensión de hueco = 1].
Tal como se usa aquí, una “variante de secuencia de nucleótidos” tiene una secuencia alterada en la que uno o más de los nucleótidos de la secuencia de referencia se han eliminado o sustituido o donde se han insertado uno o más nucleótidos en la secuencia de la secuencia de nucleótidos de referencia. Los nucleótidos se mencionan aquí mediante la designación estándar de una letra (A, C, G o T). Debido a la degeneración del código genético, una “variante de secuencia de nucleótidos” puede resultar en un cambio en la respectiva secuencia de aminoácidos de referencia, es decir, en una “variante de secuencia de aminoácidos” o no. Las variantes de secuencia preferidas son aquellas variantes de secuencia de nucleótidos que no dan como resultado variantes de secuencia de aminoácidos (mutaciones silenciosas), pero otras mutaciones no silenciosas también están dentro del alcance, en particular secuencias de nucleótidos mutantes que resultan en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, más preferiblemente al menos un 95% idéntica en secuencia a la secuencia de referencia.
Una “variante de secuencia de aminoácidos” tiene una secuencia alterada en la que uno o más de los aminoácidos de la secuencia de referencia se eliminan o sustituyen, o se insertan uno o más aminoácidos en la secuencia de la secuencia de aminoácidos de referencia. Como resultado de las alteraciones, la variante de secuencia de aminoácidos tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% idéntica a la secuencia de referencia, preferiblemente al menos un 90% idéntica, más preferiblemente al menos un 95% idéntica, con total preferencia un 99% idéntica a la secuencia de referencia. Las secuencias variantes que son al menos idénticas en un 90% no tienen más de 10 alteraciones, esto es cualquier combinación de deleciones, inserciones o sustituciones, por cada 100 aminoácidos de la secuencia de referencia.
Si bien es posible tener sustituciones de aminoácidos no conservativas, se prefiere que las sustituciones sean sustituciones de aminoácidos conservativas, donde el aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares a las del aminoácido correspondiente en la secuencia de referencia. A modo de ejemplo, las sustituciones de aminoácidos conservativas implican la sustitución de un aminoácido alifático o hidrófobo, por ejemplo alanina, valina, leucina e isoleucina, por otro; la sustitución de un aminoácido que contiene hidroxilo, por ejemplo serina y treonina, por otro; la sustitución de un residuo ácido, por ejemplo ácido glutámico o ácido aspártico, por otro; el reemplazo de un residuo que contiene amida, por ejemplo asparagina y glutamina, por otro; el reemplazo de un residuo aromático, por ejemplo fenilalanina y tirosina, por otro; el reemplazo de un residuo básico, por ejemplo lisina, arginina e histidina, por otro; y la sustitución de un aminoácido pequeño, por ejemplo alanina, serina, treonina, metionina y glicina, por otro.
Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales que varían en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos únicos o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen la fusión al extremo N-terminal o C-terminal de una secuencia de aminoácidos a una molécula reporter o una enzima.
Es importante destacar que las alteraciones en las variantes de secuencia no anulan la funcionalidad de la secuencia de referencia respectiva, en el presente caso, por ejemplo, la funcionalidad de una secuencia de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para unirse al mismo epítopo y/o para neutralizar de forma suficiente la infección porZIKV. Se pueden encontrar orientaciones para determinar qué nucleótidos y residuos de aminoácidos, respectivamente, pueden ser sustituidos, insertados o eliminados sin perder dicha funcionalidad mediante el uso de programas informáticos bien conocidos en la técnica.
Tal como se usa aquí, una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos “derivada de” un ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína designado se refiere al origen del ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico o la secuencia de aminoácidos que se deriva de una secuencia particular tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a esa secuencia o a parte de la misma, de la cual se deriva, por lo que “esencialmente idénticas” incluye variantes de secuencia tal como se definen anteriormente. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico o la secuencia de aminoácidos que se deriva de un péptido o proteína particular se deriva del dominio correspondiente del péptido o proteína particular. Por tanto, “correspondiente” se refiere en particular a la misma funcionalidad. Por ejemplo, un “dominio extracelular” corresponde a otro “dominio extracelular” (de otra proteína) o un “dominio transmembrana” corresponde a otro “dominio transmembrana” (de otra proteína). Las partes “correspondientes” de péptidos, proteínas y ácidos nucleicos son, por tanto, fácilmente identificables para un experto en la técnica. Del mismo modo, las secuencias “derivadas de” otra secuencia suelen ser fácilmente identificables para un experto en la técnica por tener su origen en la secuencia.
Preferiblemente, una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos derivada de otro ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína puede ser idéntica al ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína de partida (del cual se deriva). Sin embargo, una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos derivada de otro ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína también puede tener una o más mutaciones con respecto al ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína de partida (del cual se deriva), en particular una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos derivada de otro ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína puede ser una variante de secuencia funcional, tal como se describió anteriormente, del ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína de partida (del cual se deriva). Por ejemplo, en un péptido/proteína, uno o más residuos aminoácidos pueden sustituirse por otros residuos aminoácidos o pueden ocurrir una o más inserciones o deleciones de residuos de aminoácidos.
Tal como se usa aquí, el término “mutación” se refiere a un cambio en la secuencia de ácido nucleico y/o en la secuencia de aminoácidos en comparación con una secuencia de referencia, por ejemplo, una secuencia genómica correspondiente. Una mutación, por ejemplo, en comparación con una secuencia genómica, puede ser, por ejemplo, una mutación somática (de origen natural), una mutación espontánea, una mutación inducida, por ejemplo inducida por enzimas, sustancias químicas o radiación, o una mutación obtenida por mutagénesis dirigida (métodos de biología molecular para realizar cambios específicos e intencionales en la secuencia de ácido nucleico y/o en la secuencia de aminoácidos). Por tanto, debe entenderse que los términos “mutación” o “mutar” también incluyen hacer una mutación física, por ejemplo en una secuencia de ácido nucleico o en una secuencia de aminoácidos. Una mutación incluye la sustitución, deleción e inserción de uno o más nucleótidos o aminoácidos, así como la inversión de varios nucleótidos o aminoácidos sucesivos. Para lograr una mutación en una secuencia de aminoácidos, preferiblemente se puede introducir una mutación en la secuencia de nucleótidos que codifica dicha secuencia de aminoácidos para expresar un polipéptido mutado (recombinante). Se puede lograr una mutación, por ejemplo, alterando, por ejemplo mediante mutagénesis dirigida al sitio, un codón de una molécula de ácido nucleico que codifica un aminoácido, dando como resultado un codón que codifica un aminoácido diferente, o sintetizando una variante de secuencia, por ejemplo conociendo la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido y diseñando la síntesis de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una variante del polipéptido sin necesidad de mutar uno o más nucleótidos de una molécula de ácido nucleico.
Anticuerpos que neutralizan potentemente la infección por el virus Zika
La presente invención se basa, entre otros hallazgos, en el descubrimiento y aislamiento de anticuerpos que se unen específicamente a epítopos del virus Zika. Dichos anticuerpos son altamente potentes para neutralizar el virus del Zika y se dirigen a un sitio antigénico de la proteína de envoltura (E) del virus Zika o a un epítopo cuaternario del ZIKV. Dichos anticuerpos son deseables, ya que sólo se requieren pequeñas cantidades de anticuerpos para neutralizar el virus del Zika. En particular, actualmente no hay ninguna prevención/tratamiento disponible para la infección por el virus Zika. Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención son altamente efectivos tanto en la prevención como en el tratamiento o atenuación de la infección por el virus Zika. Además, debido a la especificidad de los anticuerpos para el virus Zika, no provocan ADE, sino que bloquean la ADE. En el diagnóstico, los anticuerpos específicos del Zika proporcionan una herramienta importante para distinguir la infección por el virus Zika de la infección por otros flavivirus, tal como el virus del dengue.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un epítopo del virus Zika y neutraliza la infección por Zika, donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las secuencias de aminoácidos CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y las secuencias de aminoácidos CDRL1, C<d>R<l>2 y CDRL3 (i) según las SEQ ID NO: 1 - 5 y 7; (ii) según las SEQ ID NO: 1 - 4 y 6 - 7; (iii) según las SEQ ID NO: 19 - 23 y 25; (iv) según las SEQ ID NO: 19 - 22 y 24 - 25; (v) según las SEQ ID NO: 37 - 41 y 43; (vi) según las SEQ ID<n>O: 37 - 40 y 42 - 43; (vii) según las SEQ ID NO: 73 -77y 79; o (viii) según las SEQ ID NO: 73 - 76 y 78 - 79. En otras palabras, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención reduce la infectividad viral del virus del Zika.
Para estudiar y cuantificar la infectividad del virus (o “neutralización”) en el laboratorio, el experto en la técnica es conocedor de diversos “ensayos de neutralización” estándar. Para un ensayo de neutralización, típicamente los virus animales se propagan en células y/o líneas celulares. En el contexto de la presente invención, se prefiere un ensayo de neutralización en el que se incuban células cultivadas con una cantidad fija de virus del Zika (ZIKV) en presencia (o ausencia) del anticuerpo a analizar. Como lectura se puede usar, por ejemplo, citometría de flujo. Alternativamente, también son concebibles otras lecturas, tal como la determinación de la cantidad de proteínas no estructurales de ZIKV (tal como NS1 de ZIKV) secretadas en el sobrenadante del cultivo. Por ejemplo, se puede emplear un ensayo basado en inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) de dosis infecciosa 50 en cultivo celular (DICT50) (ELISA-DICT50) de captura del antígeno de la proteína no estructural 1 (NS1) de ZIKV como alternativa al ensayo de placa estándar para titulación del virus del Zika, de manera similar a la descrita para el virus del dengue ( D E<n>V ) por Li J, Hu D-M, Ding X-X, Chen Y, Pan Y-X, Qiu L-W, Che X-Y: Enzyme-linked immunosorbent assay-format tissue culture infectious dose-50 test for titrating dengue virus. PLoS<o>N<e>2011, 6:e22553. En un ensayo de este tipo, por ejemplo, pueden usarse ventajosamente los anticuerpos de unión a NS1 de ZIKV, tal como se describe en la presente solicitud.
En una realización preferente de un ensayo de neutralización de ZIKV, se incuban células cultivadas, por ejemplo células Vero, con una cantidad fija de ZIKV en presencia o ausencia del anticuerpo a analizar, por ejemplo durante aproximadamente cuatro días. Después de la incubación, las células se pueden lavar y cultivar adicionalmente. Para medir la infectividad del virus se puede usar citometría de flujo. Para ello, las células se pueden fijar, por ejemplo, con 2 % de formaldehído, permeabilizar, por ejemplo en PBS (tampón salino fosfato) 1% FCS (suero de ternera fetal) saponina 0,5%, y teñir, por ejemplo con anticuerpo de ratón 4G2. A continuación, las células pueden incubarse con una IgG anti-ratón de cabra conjugada con un colorante, tal como Alexa Fluor488, y analizarse mediante citometría de flujo. Alternativamente, las células viables pueden detectarse por citometría de flujo utilizando, por ejemplo, el reactivo WST-1 (Roche). Una cepa de ZIKV preferida para su uso en dicho ensayo de neutralización es ZIKV H/PF/2013.
El anticuerpo y el fragmento de unión a antígeno de la invención tienen una alta potencia neutralizante. La concentración del anticuerpo requerida para una neutralización del 50% del virus Zika (IC50) en comparación con los controles sin anticuerpos, es, por ejemplo, de hasta aproximadamente 3 pg/ml o hasta aproximadamente 1 pg/ml. Preferiblemente, la concentración del anticuerpo de la invención requerida para una neutralización del 50% de ZIKV (IC50) es de hasta aproximadamente 500 ng/ml, más preferiblemente la concentración del anticuerpo de la invención requerida para una neutralización del 50% de Z IK<v>(IC50) es de hasta aproximadamente 250 ng/ml, incluso más preferiblemente la concentración del anticuerpo de la invención requerido para una neutralización del 50% de ZIKV (IC50) es de hasta aproximadamente 150 ng/ml. Con mayor preferencia, la concentración del anticuerpo de la invención requerida para una neutralización del 50% de ZIKV (IC50) es de aproximadamente 100 ng/ml o inferior, por ejemplo aproximadamente 90 ng/ml o menos, aproximadamente 80 ng/ml o menos, aproximadamente 70 ng/ml o menos, aproximadamente 60 ng/ml o menos, aproximadamente 50 ng/ml o menos, aproximadamente 45 ng/ml o menos, aproximadamente 40 ng/ml o menos, aproximadamente 35 ng/ml o menos, aproximadamente 30 ng/ml o menos, aproximadamente 25 ng/ml o menos, aproximadamente 20 ng/ml o menos o, de manera particularmente preferente, aproximadamente 15 ng/ml o menos. En particular, la concentración del anticuerpo de la invención requerida para una neutralización del 50% de ZIKV (IC50) es preferiblemente de aproximadamente 50 ng/ml o menos. Esto significa que sólo se requieren bajas concentraciones del anticuerpo para una neutralización del 50% de ZIKV. La concentración del anticuerpo de la invención requerida para una neutralización del 50% de ZIKV (IC50) puede medirse usando ensayos de neutralización estándar, como es conocidos por el experto en la técnica o, en particular, como se describe anteriormente.
En general, la unión de un anticuerpo se puede evaluar mediante el uso de un ensayo ELISA estándar (ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas), que es bien conocido por los expertos. Un ensayo ELISA estándar ilustrativo se puede llevar a cabo de la siguiente manera: se pueden recubrir placas ELISA (por ejemplo durante la noche a 4°C) con una cantidad suficiente (por ejemplo 1 |jg/ml) de la proteína/complejo/partícula de la que se analizará la unión del anticuerpo (por ejemplo, para la unión a DENV como se describe a continuación, se utilizan proteínas E de DENV y/o VLP de DENV), por ejemplo en PBS. Las placas se pueden bloquear, por ejemplo con una solución al 1% p/v de seroalbúmina bovina (BSA) en PBS, y se incuban con el anticuerpo a analizar (por ejemplo durante aproximadamente 1,5 horas a temperatura ambiente). Después del lavado, puede revelarse la unión del anticuerpo, por ejemplo utilizando IgG anti-humana de cabra acoplada a fosfatasa alcalina. A continuación, las placas se pueden lavar, se puede añadir el sustrato requerido (por ejemplo p-NPP) y las placas se pueden leer, por ejemplo a 405 nm. Las afinidades relativas de la unión del anticuerpo pueden determinarse midiendo la concentración de mAb (EC50) requerida para lograr una unión máxima del 50% en saturación. Los valores de EC50 pueden calcularse mediante la interpolación de curvas de unión ajustadas por regresión no lineal de cuatro parámetros con un bucle variable.
Preferiblemente, el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención no se une esencialmente a partículas similares al virus del dengue y/o a la proteína de envoltura del dengue. Más preferiblemente, el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, no se une esencialmente a partículas similares al virus del dengue y/o a la proteína de envoltura del dengue de cualquiera de los cuatro serotipos de DENV DENV1, DENV2, De Nv 3 y d En V4. Aquí, “esencialmente no unida” significa que, para el anticuerpo o para un fragmento de unión a antígeno del mismo, no puede determinarse un valor de EC50 de hasta 102 ng/ml, preferiblemente hasta 103 ng/ml, más preferiblemente hasta 5103 ng/ml, incluso más preferiblemente hasta 8103 ng/ml y con total preferencia hasta 104 ng/ml en un ensayo ELISA estándar para partículas similares al virus del dengue (VLP de DENV) y/o a la proteína de envoltura del dengue (proteína E de DENV). En otras palabras, la concentración del anticuerpo, o de un fragmento de unión a antígeno del mismo, requerida para lograr una unión máxima del 50% en saturación (EC50) a partículas similares al virus del dengue (VLP de DENV) y/o a la proteína de envoltura del dengue (proteína E de DENV) en un ensayo ELISA estándar es típicamente superior a l02 ng/ml, preferiblemente más de 103 ng/ml, más preferiblemente más de 5103 ng/ml, incluso más preferiblemente más de 8-103 ng/ml y con total preferencia más 104 ng/ml.
Preferentemente, el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención no contribuye a la potenciación dependiente de anticuerpo (ADE) de la infección por el virus Zika. Más preferiblemente, el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención bloquea la potenciación dependiente de anticuerpo (ADE) de la infección por el virus Zika.
La ADE puede evaluarse mediante un ensayo basado en citometría de flujo utilizando, por ejemplo, células cultivadas o líneas celulares, tales como células K562. Por ejemplo, los anticuerpos a analizar y el ZIKV pueden mezclarse durante 1 hora a 37 °C y añadirse 5.000 células K562/pocillo. Después de cuatro días, las células pueden fijarse, permeabilizarse y teñirse con m4G2, por ejemplo tal como se describe anteriormente para los ensayos de neutralización. El número de células infectadas se determina mediante citometría de flujo, tal como se describe anteriormente para los ensayos de neutralización.
Preferiblemente, el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención es un anticuerpo humano. También es preferente que el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención sea un anticuerpo monoclonal, preferiblemente un anticuerpo monoclonal humano. Además, también se prefiere que el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención sea un anticuerpo recombinante.
Preferiblemente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende un resto Fc. Más preferiblemente, el resto Fc se deriva de origen humano, por ejemplo de IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4 humana, siendo particularmente preferente IgG1 humana.
Tal como se usa aquí, el término “resto Fc” se refiere a una secuencia derivada de parte de una cadena pesada de inmunoglobulina que comienza en la región bisagra justo antes del sitio de escisión de papaína (por ejemplo el residuo 216 en IgG nativa, suponiendo que el primer residuo de la región constante de la cadena pesada sea 114) y finaliza en el extremo C-terminal de la cadena pesada de inmunoglobulina. Por consiguiente, un resto Fc puede ser un resto Fc completo o una parte (por ejemplo un dominio) del mismo. Un resto Fc completo comprende al menos un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 (por ejemplo las posiciones de aminoácidos de la UE 216-446). A veces está presente un residuo de lisina (K) adicional en el extremo C-terminal del resto Fc, pero a menudo se escinde de un anticuerpo maduro. Cada una de las posiciones de aminoácidos dentro de un resto Fc se numeran de acuerdo con el sistema de numeración de la UE de Kabat reconocido en la técnica, véase, por ejemplo, Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, 1983 y 1987.
Preferiblemente, en el contexto de la presente invención, un resto Fc comprende al menos uno de: un dominio bisagra (por ejemplo región bisagra superior, media y/o inferior), un dominio CH2, un dominio CH3 o una variante, parte o fragmento de los mismos. En realizaciones preferentes, un resto Fc comprende al menos un dominio bisagra, un dominio CH2 o un dominio CH3. Más preferiblemente, el resto Fc es un resto Fc completo. El resto Fc también puede comprender una o más inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos con respecto a un resto Fc de origen natural. Por ejemplo, al menos uno de un dominio bisagra, dominio CH2 o dominio CH3 (o partes de los mismos) puede eliminarse. Por ejemplo, un resto Fc puede comprender o consistir en: (i) dominio bisagra (o parte del mismo) fusionado a un dominio CH2 (o parte del mismo), (ii) un dominio bisagra (o parte del mismo) fusionado a un dominio CH3 (o parte del mismo), (iii) un dominio CH2 (o parte del mismo) fusionado a un dominio CH3 (o parte del mismo), (iv) un dominio bisagra (o parte del mismo), (v) un dominio CH2 (o parte del mismo) o (vi) un dominio CH3 o parte del mismo.
Un experto en la técnica entenderá que el resto Fc puede modificarse de modo que varíe en la secuencia de aminoácidos del resto Fc completo de una molécula de inmunoglobulina de origen natural, al tiempo que conserva al menos una función deseable conferida por el resto Fc de origen natural. Tales funciones incluyen la unión al receptor Fc (FcR), la modulación de la vida media del anticuerpo, la función ADCC, la unión a la proteína A, la unión a la proteína G y la unión al complemento. Los expertos en la técnica conocen bien las partes de restos Fc de origen natural que son responsables y/o esenciales para tales funciones.
Por ejemplo, para activar la cascada de complemento, C1q se une a al menos dos moléculas de IgG1 o a una molécula de IgM, unida a la diana antigénica (Ward, E. S., & Ghetie, V., Ther. Immunol. 2 (1995) 77-94). Burton, D. R., describió (Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206) que la región de la cadena pesada que comprende los residuos de aminoácidos 318 a 337 está implicada en la fijación del complemento. Duncan, A. R., & Winter, G. (Nature 332 (1988) 738-740), utilizando mutagénesis dirigida, informaron que Glu318, Lys320 y Lys322 forman el sitio de unión a C1q. El papel de los residuos Glu318, Lys320 y Lys 322 en la unión de C1q se confirmó mediante la capacidad de un péptido sintético corto que contiene estos residuos de inhibir la lisis mediada por el complemento.
Por ejemplo, la unión de FcR puede estar mediada por la interacción del resto Fc (de un anticuerpo) con los receptores Fc (FcR), que son receptores especializados de la superficie celular de células hematopoyéticas. Los receptores Fc pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas y se ha demostrado que median tanto la eliminación de patógenos recubiertos de anticuerpos mediante fagocitosis de complejos inmunes, como la lisis de eritrocitos y otras dianas celulares (por ejemplo células tumorales) recubiertas con el anticuerpo correspondiente, mediante citotoxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo (ADCC; Van de Winkel, JG, y Anderson, CL, J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524). Los FcR se definen por su especificidad para las clases de inmunoglobulina; los receptores Fc para anticuerpos de IgG se denominan F<cy>R, para IgE como F<ce>R, para IgA como FcaR y así sucesivamente y los receptores Fc neonatales se denominan FcRn. La unión al receptor de Fc se describe, por ejemplo, en Ravetch, J. V., & Kinet, J. P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P. J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M., et al., J Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341; y Gessner, J. E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248.
La reticulación de receptores mediante el dominio Fc de los anticuerpos IgG nativos (F<cy>R) desencadena una amplia variedad de funciones efectoras, tales como fagocitosis, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y liberación de mediadores inflamatorios, así como la depuración de complejos inmunes y la regulación de la producción de anticuerpos. Por tanto, son preferentes los restos Fc que proporcionan reticulación de receptores (FcyR). En humanos, se han caracterizado tres clases de FcyR, que son: (i) FcyRI (CD64), que se une a IgG monomérica con alta afinidad y se expresa en macrófagos, monocitos, neutrófilos y eosinófilos; (ii) F<cy>RII (CD32), que se une a la IgG complejada con afinidad media a baja, se expresa ampliamente, en particular en leucocitos, se sabe que es un elemento central en la inmunidad mediada por anticuerpos y que se puede dividir en F<cy>RIIA, FcyRIIB y FcyRIIC, que realizan diferentes funciones en el sistema inmune, pero se unen con una afinidad baja similar a la IgG-Fc, y los ectodominios de estos receptores son altamente homólogos; y (iii) FcyRIII (CD16), que se une a IgG con afinidad media a baja y existe como dos tipos: FcyRIIIA, que se encuentra en células Nk , macrófagos, eosinófilos y algunos monocitos y células T y media ADCC, y FcyRIIIB, que se expresa altamente en neutrófilos. FcyRIIA se encuentra en muchas células involucradas en la eliminación (por ejemplo macrófagos, monocitos, neutrófilos) y parece ser capaz de activar el proceso de muerte. FcyRIIB parece desempeñar un papel en procesos inhibitorios y se encuentra en células B, macrófagos, mastocitos y eosinófilos. Es importante destacar que el 75% de todos los F<cy>RIIB se encuentran en el hígado (Ganesan, L. P. et al., 2012: FcYRIIb on liver sinusoidal endothelium clears small immune complexes. Journal of Immunology 189: 4981-4988). El F<cy>RIIB se expresa abundantemente en el endotelio sinusoidal del hígado, denominado LSEC, y en las células de Kupffer del hígado, y el LSEC es el sitio principal de la depuración de los complejos inmunes pequeños (Ganesan, L. P. et al., 2012: FcYRIIb on liver sinusoidal endothelium clears small immune complexes. Journal of Immunology 189: 4981-4988).
Por consiguiente, en la presente invención se prefieren los anticuerpos, y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que pueden unirse a FcYRIIb, por ejemplo anticuerpos que comprenden un resto Fc para unirse a FcYRIIb, en particular una región Fc, tal como, por ejemplo, anticuerpos de tipo IgG. Además, es posible diseñar el resto Fc para mejorar la unión de F<cy>RIIB mediante la introducción de las mutaciones S267E y L328F, tal como se describe en Chu, S. Y. et al., 2008: Inhibition of B cell receptor-mediated activation of primary human B cells by coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with Fc-engineered antibodies. Molecular Immunology 45, 3926-3933. Por tanto, la eliminación de los complejos inmunes se puede potenciar (Chu, S., et al., 2014: Accelerated Clearance of IgE In Chimpanzees Is Mediated By Xmab7195, An FcEngineered Antibody With Enhanced Affinity For Inhibitory Receptor FcYRIIb. Am J Respir Crit, American Thoracic Society International Conference Abstracts). Por consiguiente, en el contexto de la presente invención, son preferentes los anticuerpos o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos que comprenden un resto Fc modificado con las mutaciones S267E y L328F, en particular según se describe en Chu, S.Y. et al., 2008: Inhibition of B cell receptor-mediated activation of primary human B cells by coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with Fc-engineered antibodies. Molecular Immunology 45, 3926-3933.
En las células B parece funcionar suprimiendo la producción de inmunoglobulina adicional y el cambio de isotipo a, por ejemplo, la clase IgE. En los macrófagos, F<cy>RIIB actúa inhibiendo la fagocitosis mediada por F<cy>RIIA. En eosinófilos y mastocitos, la forma b puede ayudar a suprimir la activación de estas células mediante la unión de IgE a su receptor separado.
Con respecto a la unión de FcyRI, la modificación en la IgG nativa de al menos uno de E233-G236, P238, D265, N297, A327 y P329 reduce la unión a FcyRI. Los residuos de IgG2 en las posiciones 233-236, sustituidos en IgG1 e IgG4, reducen la unión a F<cy>RI 103 veces y eliminan la respuesta de monocitos humanos a los glóbulos rojos sensibilizados con anticuerpos (Armor, K. L., et al. Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624). Con respecto a la unión de FcyRII, se encuentra una unión reducida para FcyRIIA, por ejemplo para al menos una mutación de IgG E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 y K414. Con respecto a la unión de FcyRIII, se encuentra una unión reducida a FcyRIIIA, por ejemplo para al menos una mutación de E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 y D376. El mapeo de los sitios de unión en la IgG1 humana para los receptores de Fc, los sitios de mutación mencionados anteriormente y los métodos para medir la unión a F<cy>RI y F<cy>RIIA se describen en Shields, R. L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604.
Con respecto a la unión crucial a F<cy>RII, dos regiones de Fc de la IgG nativa parecen ser críticas para las interacciones de F<cy>RII e IgG,específicamente, (i) el sitio bisagra inferior del Fc de IgG, en particular los residuos aminoácidos L, L, G, G (234-237, numeración de la UE) y (ii) la región adyacente del dominio CH2 de Fc de IgG, en particular un bucle y cadenas en el dominio CH2 superior adyacente a la región bisagra inferior, por ejemplo en una región de P331 (Wines, B.D., et al., J. Immunol. 2000; 164: 5313-5318). Además, FcyRI parece unirse al mismo sitio en el Fc de IgG, mientras que FcRn y la proteína A se unen a un sitio diferente en el Fc de IgG, que parece estar en la interfaz CH2-CH3 (Wines, BD, et al., J. Immunol. 2000; 164: 5313-5318).
Por ejemplo, el resto Fc puede comprender o consistir en al menos la porción de un resto Fc que en la técnica es conocido por ser necesario para la unión a FcRn o una vida media prolongada. Alternativa o adicionalmente, el resto Fc del anticuerpo de la invención comprende al menos la porción conocida en la técnica que se requiere para la unión a la proteína A y/o el resto Fc del anticuerpo de la invención comprende al menos la porción de una molécula Fc conocida en la técnica que se requiere para la unión a la proteína G. Preferiblemente, la función retenida es la neutralización de la infección por el virus Zika, que se supone mediada por la unión de FcyR. Por consiguiente, un resto Fc preferente comprende al menos la porción conocida en la técnica que se requiere para la unión de F<cy>R. Por tanto, como se describió anteriormente, un resto Fc preferente puede comprender (i) el sitio bisagra inferior del Fc nativo de IgG, en particular los residuos de aminoácidos L, L, G, G (234-237, numeración de la UE) y (ii) la región adyacente del dominio CH2 del Fc de la IgG nativa, en particular un bucle y cadenas en el dominio CH2 superior adyacente a la región bisagra inferior, por ejemplo en una región de P331, por ejemplo una región de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos consecutivos en el dominio CH2 superior del Fc de la IgG nativa alrededor de P331, por ejemplo entre los aminoácidos 320 y 340 (numeración de la UE) del Fc de la IgG nativa.
Preferiblemente, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprende una región Fc. Tal como se usa aquí, el término “región Fc” se refiere a la porción de una inmunoglobulina formada por dos o más restos Fc de cadenas pesadas de anticuerpos. Por ejemplo, la región Fc puede ser una región Fc monomérica o “monocatenaria” (es decir, una región scFc). Las regiones Fc monocatenarias están compuestas por restos Fc unidos dentro de una única cadena polipeptídica (por ejemplo codificada en una única secuencia de ácido nucleico contigua). Regiones scFc iliustrativas se describen en la W o 2008/143954 A2. Preferentemente, la región Fc es una región Fc dimérica. Una “región Fc dimérica” o “dcFc” se refiere al dímero formado por los restos Fc de dos cadenas pesadas de inmunoglobulina separadas. La región Fc dimérica puede ser un homodímero de dos restos Fc idénticos (por ejemplo una región Fc de una inmunoglobulina de origen natural) o un heterodímero de dos restos Fc no idénticos.
Los restos Fc de la región Fc pueden ser de la misma o de diferente clase y/o subclase. Por ejemplo, los restos Fc pueden derivarse de una inmunoglobulina (por ejemplo una inmunoglobulina humana) de una subclase de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Preferiblemente, los restos Fc de la región Fc son de la misma clase y subclase. Sin embargo, la región Fc (o uno o más restos Fc de una región Fc) también puede ser quimérica, por lo que una región Fc quimérica puede comprender restos Fc derivados de diferentes clases y/o subclases de inmunoglobulina. Por ejemplo, al menos dos de los restos Fc de una región Fc dimérica o monocatenaria pueden ser de diferentes clases y/o subclases de inmunoglobulina. Adicional o alternativamente, las regiones Fc quiméricas pueden comprender uno o más restos Fc quiméricos. Por ejemplo, la región o resto Fc quimérico puede comprender una o más porciones derivadas de una inmunoglobulina de una primera subclase (por ejemplo una subclase IgG1, IgG2 o IgG3), mientras que el resto de la región o resto Fc es de una subclase diferente. Por ejemplo, una región Fc o un resto de un polipéptido Fc puede comprender un dominio CH2 y/o CH3 derivado de una inmunoglobulina de una primera subclase (por ejemplo una subclase de IgG1, IgG2 o IgG4) y una región bisagra de una inmunoglobulina de una segunda subclase (por ejemplo una subclase IgG3). Por ejemplo, la región o resto Fc puede comprender un dominio bisagra y/o CH2 derivado de una inmunoglobulina de una primera subclase (por ejemplo una subclase IgG4) y un dominio CH3 de una inmunoglobulina de una segunda subclase (por ejemplo una subclase IgG1, IgG2 o IgG3). Por ejemplo, la región Fc quimérica puede comprender un resto Fc (por ejemplo un resto Fc completo) de una inmunoglobulina para una primera subclase (por ejemplo una subclase IgG4) y un resto Fc de una inmunoglobulina de una segunda subclase (por ejemplo una subclase IgG1, IgG2 o IgG3). Por ejemplo, la región o resto Fc puede comprender un dominio CH2 de una inmunoglobulina IgG4 y un dominio CH3 de una inmunoglobulina IgG1. Por ejemplo, la región o resto Fc puede comprender un dominio CH1 y un dominio CH2 de una molécula de IgG4 y un dominio CH3 de una molécula de IgG1. Por ejemplo, la región o resto Fc puede comprender una parte de un dominio CH2 de una subclase particular de anticuerpo, por ejemplo las posiciones UE 292-340 de un dominio CH2. Por ejemplo, una región o resto Fc puede comprender aminoácidos en las posiciones 292-340 de CH2 derivadas de un resto IgG4 y el resto CH2 derivado de un resto IgG1 (alternativamente, 292-340 de CH2 pueden derivarse de un resto IgG1 y el resto CH2 puede derivarse de un resto IgG4).
Además, una región o resto Fc puede (adicional o alternativamente) comprender, por ejemplo, una región bisagra quimérica. Por ejemplo, la bisagra quimérica se puede derivar, por ejemplo, en parte de una molécula IgG1, IgG2 o IgG4 (por ejemplo una secuencia bisagra media superior e inferior) y en parte de una molécula de IgG3 (por ejemplo una secuencia bisagra media). En otro ejemplo, una región o resto Fc puede comprender una bisagra quimérica derivada, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG4. En otro ejemplo, la bisagra quimérica puede comprender dominios bisagra superior e inferior de una molécula de IgG4 y un dominio bisagra central de una molécula de IgG1. Una bisagra quimérica de este tipo se puede producir, por ejemplo, introduciendo una sustitución de prolina (Ser228Pro) en la posición 228 UE en el dominio bisagra medio de una región bisagra de IgG4. En otra realización, la bisagra quimérica puede comprender aminoácidos en las posiciones UE 233-236 de un anticuerpo IgG2 y/o la mutación Ser228Pro, siendo los aminoácidos restantes de la bisagra de un anticuerpo IgG4 (por ejemplo una bisagra quimérica de secuencia ESKYGPPCPPCPAPPVAGP). Otras bisagras quiméricas que pueden usarse en el resto Fc del anticuerpo de acuerdo con la presente invención se describen en la US 2005/0163783 A1.
En la presente invención, es preferente que el resto Fc o la región Fc comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de inmunoglobulina humana (por ejemplo de una región Fc o resto Fc de una molécula de IgG humana). Sin embargo, los polipéptidos pueden comprender uno o más aminoácidos de otra especie de mamífero. Por ejemplo, se puede incluir un resto Fc de primate o un sitio de unión de primate en los polipéptidos en cuestión. Alternativamente, uno o más aminoácidos murinos pueden estar presentes en el resto Fc o en la región Fc.
Preferiblemente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención comprende, en particular además de un resto Fc como se describe anteriormente, otras partes derivadas de una región constante, en particular de una región constante de IgG, preferiblemente de una región constante de IgG1, más preferiblemente de una región constante de IgG1 humana. Con mayor preferencia, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención comprende, en particular además de un resto Fc como se describe anteriormente, todas las otras partes de las regiones constantes, en particular todas las otras partes de las regiones constantes de IgG, preferiblemente todas las otras partes de las regiones constantes de IgG1, más preferiblemente todas las otras partes de las regiones constantes de IgG1 humana.
Secuencias particularmente preferentes de las regiones constantes son las secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 145-148 (secuencias de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ ID NO: 149-152). Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de IgG1 CH1-CH2-CH3 es de acuerdo con la SEQ ID NO: 145 o una variante de secuencia funcional de la misma tal como se describe aquí. Incluso más preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de IgG1 CH1-CH2-CH3 es de acuerdo con la SEQ ID NO: 146 o una variante de secuencia funcional de la misma, tal como se describe aquí, donde se mantiene la mutación “LALA”.
Como se ha descrito anteriormente, un anticuerpo particularmente preferente de acuerdo con la presente invención comprende una región Fc (completa) derivada de IgG1 humana. Más preferiblemente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención comprende, en particular además de una región Fc (completa) derivada de IgG1 humana, también todas las otras partes de las regiones constantes de IgG, preferiblemente todas las otras partes de las regiones constantes de IgG1, más preferiblemente todas las otras partes de las regiones constantes de IgG1 humana.
Sin limitarse a ninguna teoría, se cree que la potenciación dependiente de anticuerpos (ADE) de la infección por el virus Zika se produce por la unión del resto Fc del anticuerpo, en particular el resto Fc de la cadena pesada de una molécula de IgG, a un receptor Fc, por ejemplo un receptor F<cy>en una célula huésped. Por tanto, es preferente que el anticuerpo de acuerdo con la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprenda una o más mutaciones en el resto Fc. La o las mutaciones pueden ser cualquiera que reduzca la unión del anticuerpo a un receptor Fc (FcR), en particular que reduzca la unión del anticuerpo a un receptor Fcy (FcyR). Por otra parte, es preferente que el anticuerpo de acuerdo con la presente invención comprenda un resto Fc/región Fc (completo), donde la interacción/unión con FcRn no está comprometida. Por consiguiente, es particularmente preferente que el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprenda una o más mutaciones en el resto Fc, que (i) reduzca(n) la unión del anticuerpo a un receptor F<cy>, pero no comprometa(n) la interacción con FcRn. Un ejemplo de tal mutación es la mutación “LALA” que se describe a continuación.
En general, la unión del anticuerpo a un receptor Fc puede evaluarse mediante varios métodos conocidos por los expertos, tales como ELISA (Hessell AJ, Hangartner L, Hunter M, Havenith CEG, Beurskens FJ, Bakker JM, Lanigan CMS, Landucci G, Forthal DN, Parren PWHI, et al.: Fc receptor but not complement binding is important in antibody protection against HIV. Nature 2007, 449:101-104; Grevys A, Bern M, Foss S, Bratlie DB, Moen A, Gunnarsen KS, Aase A, Michaelsen TE, Sandlie I, Andersen JT: Fc Engineering of Human IgG1 for Altered Binding to the Neonatal Fc Receptor Affects Fc Effector Functions. 2015, 194:5497-5508) o citometría de flujo (Perez LG, Costa MR, Todd CA, Haynes BF, Montefiori DC: Utilization of immunoglobulin G Fc receptors by human immunodeficiency virus type 1: a specific role for antibodies against the membrane-proximal external region of gp41. J Virol 2009, 83: 7397-7410; Piccoli L, Campo I, Fregni CS, Rodríguez BMF, Minola A, Sallusto F, Luisetti M, Corti D, Lanzavecchia A: Neutralization and clearance of GM-CSF by autoantibodies in pulmonary alveolar proteinosis. Nat Commun 2015, 6:1-9).
En general, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede estar glicosilado. Los glicanos ligados a N unidos al dominio CH2 de una cadena pesada, por ejemplo, pueden influir en la unión de C1q y FcR, teniendo los anticuerpos no glicosilados menor afinidad por estos receptores. Por consiguiente, el dominio CH2 del resto Fc del anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede comprender una o más mutaciones en las que un residuo glicosilado se sustituye con un residuo no glicosilado. La estructura del glicano también puede afectar a la actividad, por ejemplo, pueden obervarse diferencias en la muerte celular mediada por el complemento en función del número de azúcares galactosa (0, 1 o 2) en el extremo de la cadena biantenaria de un glicano. Preferiblemente, los glicanos del anticuerpo no conducen a una respuesta inmunogénica humana después de la administración.
Además, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede modificarse introduciendo mutaciones aleatorias de aminoácidos en una región particular del dominio CH2 o CH3 de la cadena pesada para alterar su afinidad de unión por FcR y/o su vida media en suero en comparación con anticuerpos no modificados. Ejemplos de dichas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, sustituciones de al menos un aminoácido de la región constante de la cadena pesada seleccionado del grupo consistente en los residuos aminoácidos 250, 314 y 428.
De manera particularmente preferente, el resto Fc de un anticuerpo de la invención comprende una sustitución en las posiciones CH2 4, CH2 5 o ambas. En general, el aminoácido en las posiciones 4 y 5 de CH2 de las IgG1 e IgG3 de tipo silvestre es una leucina (“L”). Preferentemente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención comprende un aminoácido en la posición CH24, CH25 o ambas que no es L. Más preferiblemente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención comprende una alanina (“A”) en la posición CH2 4, o CH2 5 o en ambas. Más preferiblemente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención comprende tanto una sustitución CH2 L4A como una sustitución CH2 L5A. Dichos anticuerpos se denominan aquí como variante “LALA”. Curiosamente, tal mutación “LALA” en el resto Fc no sólo produce una falta de contribución del anticuerpo respectivo en la potenciación dependiente de anticuerpos (ADE) de la infección por el virus Zika, sino que también bloquea la potenciación dependiente de anticuerpos (ADE) de la infección por el virus Zika. Una secuencia de aminoácidos ilustrativa de IgG1 CH1-CH2-CH3 que comprende la mutación “LALA” es aquella de acuerdo con la SEQ ID NO: 146. Así, la secuencia de aminoácidos de IgG1 CH1-CH2-CH3 preferiblemente es de acuerdo con la SEQ ID NO: 146 o una variante de secuencia funcional de la misma, tal como se describe aquí, donde se mantiene la mutación “LALA”.
Preferiblemente, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, se une al dominio III de la proteína de envoltura del virus del Zika (“EDIII”, también denominado “DiII”). En otras palabras, se prefiere que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención se una a un epítopo de la proteína de envoltura del virus Zika, que incluye uno o más residuos de aminoácidos del dominio III de la proteína de envoltura (EDIII) del virus Zika. El ZIKV incluye un núcleo de nucleocápside que comprende un ARN monocatenario envuelto por proteínas del núcleo. El núcleo de la nucleocápside está encapsulado con una membrana de bicapa lipídica con “proteínas de membrana” y “proteínas de envoltura”. La proteína de envoltura (proteína E) de ZIKV es el antígeno dominante. El ectodominio de la proteína de envoltura comprende tres dominios distintos: el dominio I de la proteína E (EDI), el dominio II de la proteína E (EDII) y el dominio III de la proteína E (EDIII). El EDIII está altamente conservado entre las diferentes cepas de ZIKV (véase la Figura 12 para una alineación de secuencias de aminoácidos de EDIII de diferentes cepas de ZIKV).
Por consiguiente, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, se une más preferiblemente al dominio III de la proteína de envoltura (EDIII) del virus del Zika, donde EDIII tiene la siguiente secuencia de<aminoácidos>(S<e>Q<ID NO: 401):>
TAAFTFTKXPAEXXHGTVTVEXQYXGXDGPCKXPXQMAVDXQTLTPVGRLITANPVITEXTENSKMMLELDPPFG DSYIVIGXGXKKITHHWHRS
siendo X cualquier aminoácido (de origen natural). En otras palabras, es preferente que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención se una a un epítopo de la proteína de envoltura del virus del Zika, incluyendo uno o más residuos de aminoácidos de SEQ ID NO: 401.
También es preferente que el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, se una al dominio III de la proteína de envoltura (EDIII) del virus del Zika, donde EDIII tiene la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 407):
X 1GX2X3YSLCTAAFTFTKX4PAEX5X6HGTVTVEX7QYX8GX9DGPCKX10PX11QMAVDX12QTLTPVGRLITANPVITE X 13TX14NSKMMLELDPPFGDSYIVIGX15GX16X17KITHHWHRSG
donde
XI puede ser cualquier aminoácido (de origen natural), preferiblemente K, A o E;
X2 puede ser cualquier aminoácido (de origen natural), preferiblemente V, F o L;
X3 puede ser cualquier aminoácido (de origen natural), preferiblemente S o F;
X4 puede ser cualquier aminoácido (de origen natural), preferiblemente I o V;
X5 puede ser cualquier aminoácido (de origen natural), preferiblemente T o V;
X6 puede ser cualquier aminoácido (de origen natural), preferiblemente L o D;
X7 puede ser cualquier aminoácido (de origen natural), preferiblemente V o G;
X8 puede ser cualquier aminoácido (de origen natural), preferiblemente A o G;
X9 puede ser cualquier aminoácido (de origen natural) excepto R, preferiblemente T o A;
X10 puede ser cualquier aminoácido (de origen natural), preferiblemente V o I;
X I I puede ser cualquier aminoácido (de origen natural), preferiblemente A o V;
X12 puede ser cualquier aminoácido (de origen natural), preferiblemente M o T;
X13 puede ser cualquier aminoácido (de origen natural), preferiblemente S o G;
X14 puede ser cualquier aminoácido (de origen natural), preferiblemente E o K;
X15 puede ser cualquier aminoácido (de origen natural), preferiblemente V o I;
X16 puede ser cualquier aminoácido (de origen natural), preferiblemente E, A, K o D; y
X17 puede ser cualquier aminoácido (de origen natural), preferiblemente E, A o K, más preferiblemente K o A.
En otras palabras, se prefiere que el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención se una a un epítopo de la proteína de envoltura del virus Zika e incluya uno o más residuos de aminoácidos de SEQ ID NO: 407.
Por ejemplo, el EDIII se extiende desde el aminoácido 309 hasta el aminoácido 403 de la proteína E de ZIKV de la cepa ZIKV H/PF/2013 (número de acceso de Genbank KJ776791). Así, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, se une con total preferencia al dominio III de la proteína de envoltura (EDIII) del virus del Zika, teniendo el EDIII la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 402):
TAAFTFTKIPAETLHGTVTVEVQYAGTDGPCKVPAQMAVDMQTLTPVGRLITANPVITESTENSKMMLELDPPFGD SYIVIGVGEKKITHHWHRS.
En otras palabras, es preferente que el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención se una a un epítopo de la proteína de envoltura del virus del Zika, lo que incluye uno o más residuos de aminoácidos de SEQ ID NO: 402.
Sorprendentemente, los presentes inventores han encontrado que los anticuerpos que se unen al dominio III de la proteína de envoltura (EDIII) del virus del Zika muestran (i) una mayor neutralización de ZIKV y (ii) una menor reactividad cruzada con DENV (en particular, esencialmente no hay ninguna reactividad cruzada con DENV) en comparación con los anticuerpos que se unen al dominio I/II de la proteína de envoltura (EDI/II) del virus del Zika.
Más preferiblemente, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención se une a un epítopo de la proteína de envoltura del virus del Zika incluyendo uno o más residuos de aminoácidos del borde lateral (LR) de EDIII y/o uno o más residuos de aminoácidos de la región bisagra de EDI-EDIII. El borde lateral de EDIII y la región bisagra EDI-EDIII son conocidas por los expertos y se describen, por ejemplo, en Zhao, H., Fernandez, E., Dowd, K.A., Speer, S.D., Platt, D.J., Gorman, M.J., Govero, J., Nelson, C.A., Pierson, T.C., Diamond, M.S., et al. (2016). Structural Basis of Zika Virus-Specific Antibody Protection. Cell 166(4):1016-27 y en Kostyuchenko VA, Lim EX, Zhang S, Fibriansah G, Ng TS, Ooi JS, Shi J, Lok SM. Structure of the thermally stable Zika virus. Nature. 19 de mayo de 2016; 533(7603):425-8. Sin limitarse a ninguna teoría, se supone que (i) la unión al LR puede inhibir la fusión al atrapar un estado de transición de fusión del virus y (ii) la unión a la bisagra de EDI-EDIII y EDIII puede impedir el movimiento de EDIII para formar la estructura de post fusión trimérica, lo que detiene la fusión de la membrana.
Así, es preferente que el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención inhiba o sea capaz de inhibir un paso posterior a la unión de ZIKV. Típicamente, “posterior a la unión” se refiere a cualquier paso de la infección por ZIKV después de la unión de ZIKV a la membrana celular (de la célula diana del ZIKV). Por ejemplo, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención preferiblemente (puede) prevenir la fusión de la membrana. Además, también se prefiere que el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención cause o sea capaz de causar la agregación de (partículas de) ZIKV. Con total preferencia, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención (es capaz de) (i) inhibir o inhibe un paso posterior a la unión de ZIKV y (ii) causar o causa la agregación de (partículas de) ZIKV.
También se prefiere que el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, se una a un epítopo cuaternario mostrado en un virión infeccioso de ZIKV. A pesar de una considerable actividad neutralizadora, tales anticuerpos generalmente no muestran una unión detectable a la proteína E de ZIKV recombinante o a EDIII de ZIKV en un ensayo ELISA estándar (como se describe anteriormente), es decir, cuando se analizanin vitro,en particular en forma purificada (es decir, proteína E de ZIKV “fuera de/sin” virión, partícula tipo virus o similar). Por tanto, “ninguna unión detectable” generalmente significa que no se detecta una EC50 hasta 10.000 ng/ml en un ensayo ELISA estándar. En otras palabras, si la EC50 detectable en un ensayo ELISA estándar está por encima de 10.000 ng/ml se denomina “unión no detectable”.
Así, dichos anticuerpos también se denominan aquí anticuerpos “neutralizantes sin unión a E” (NNB). El epítopo cuaternario mostrado en un virión infeccioso de ZIKV es típicamente un epítopo conformacional. Por ejemplo, el epítopo cuaternario mostrado en un virión infeccioso de ZIKV puede formarse en la interfaz de dos monómeros de la proteína de envoltura que forman un dímero (“epítopo de dímero de envoltura”; EDE) o puede formarse a través de dímeros vecinos (“epítopo en forma de V”).
En general, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende (al menos) tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en una cadena pesada y (al menos) tres CDR en una cadena ligera, tal como se define en las reivindicaciones. En general, las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) son las regiones hipervariables presentes en los dominios variables de la cadena pesada y los dominios variables de la cadena ligera. Típicamente, las CDR de una cadena pesada y la cadena ligera unida de un anticuerpo forman en conjunto el receptor de antígeno. Normalmente, las tres CDR (CDR1, CDR2 y CDR3) están dispuestas de forma no consecutiva en el dominio variable. Dado que los receptores de antígenos están compuestos típicamente de dos dominios variables (en dos cadenas polipeptídicas diferentes, es decir, las cadenas pesada y ligera), hay seis CDR para cada receptor de antígeno (cadena pesada: CDRH1, CDRH2 y CDRH3; cadena ligera: CDRL1, CDRL2 y CDRL3). Una única molécula de anticuerpo generalmente tiene dos receptores de antígeno y, por tanto, contiene doce CDR. Las CDR en la cadena pesada y/o ligera pueden estar separadas por regiones marco, por lo que una región marco (FR) es una región en el dominio variable que es menos “variable” que la CDR. Por ejemplo, una cadena (o cada cadena, respectivamente) puede estar compuesta por cuatro regiones marco separadas por tres CDR.
Se determinaron las secuencias de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos ilustrativos de la invención que comprenden tres CDR diferentes en la cadena pesada y tres CDR diferentes en la cadena ligera. La posición de los aminoácidos CDR se define de acuerdo con el sistema de numeración IMGT (IMGT: http://www.imgt.org/; cf. Lefranc, M.-P. et al. (2009) Nucleic Acids Res. 37, D1006-D1012).
Tabla 1: SEQ ID NO de las secuencias de aminoácidos de las CDR de cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3) y de la región variable de la cadena pesada (denominada “VH”) de anticuerpos ilustrativos de acuerdo con la resente invención
La Tabla 2 a continuación: muestra las SEQ ID NO de las secuencias de aminoácidos de las CDR de cadena ligera (CDRL1, CDRL2 y CDRL3) y de la región variable de la cadena ligera (denominada “VL”) de anticuerpos ilustativos de acuerdo con la presente invención:
Así, es preferente que el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprenda secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad con al menos una de las secuencias de CDR, la secuencia VH y/o la secuencia VL que se muestran en la Tabla 1 y/o en la Tabla 2.
El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprende las secuencias de aminoácidos CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y las secuencias de aminoácidos CDRL1, CDRl2 y CDRL3 (i) de acuerdo con las SEQ ID NO: 1-5 y 7; (ii) de acuerdo con las SEQ ID NO: 1-4 y 6-7; (iii) de acuerdo con las SEQ ID NO: 19-23 y 25; (iv) de acuerdo con las SEQ ID NO: 19-22 y 24-25; (v) de acuerdo con las SEQ ID NO: 37-41 y 43; (vi) de acuerdo con las SEQ ID NO: 37-40 y 42-43; (vii) de acuerdo con las SEQ ID NO: 73-77 y 79; o (viii) de acuerdo con las SEQ ID NO: 73-76 y 78-79.
Incluso más preferiblemente, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprende las secuencias de aminoácidos de CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y las secuencias de aminoácidos de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 (i) de acuerdo con las SEQ ID NO: 1-5 y 7; (ii) de acuerdo con las SEQ ID NO: 1-4 y 6-7; (iii) de acuerdo con las SEQ ID NO: 73-77 y 79; o (iv) de acuerdo con las SEQ ID NO: 73-76 y 78-79.
También es preferible que, preferentemente, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprenda las secuencias de aminoácidos de CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y las secuencias de aminoácidos de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 (i) de acuerdo con las SEQ ID NO: 19-23 y 25; (ii) de acuerdo con las SEQ ID NO: 19-22 y 24-25; (iii) de acuerdo con las SEQ ID NO: 37-41 y 43; o (vi) de acuerdo con las SEQ ID NO: 37-40 y 42-43.
Con total preferencia, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprende las secuencias de aminoácidos de CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y las secuencias de aminoácidos de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 (i) de acuerdo con las SEQ ID NO: 1-5 y 7; o (ii) de acuerdo con las SEQ ID NO: 1-4 y 6-7.
Además, también es preferible que el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprenda una región variable de la cadena pesada (VH) y, opcionalmente, una región variable de la cadena ligera (VL), donde la región variable de la cadena pesada (VH) comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 8, 26, 44 y 80, o una variante de secuencia funcional de las mismas que tenga al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia.
Con mayor preferencia, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprende (i) una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (VH) de acuerdo con la SEQ ID NO: 8, o una variante de secuencia funcional de la misma con al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia y/o una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (VL) de acuerdo con la SEQ ID NO: 9 o una variante de la secuencia funcional de la misma que tenga al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia; (ii) una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (VH) de acuerdo con la SEQ ID NO: 26 o una variante de secuencia funcional de la misma que tenga al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia y/o una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (VL) de acuerdo con la SEQ ID NO: 27, o una variante de secuencia funcional de la misma con al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia; (iii) una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (VH) de acuerdo con la SEQ ID NO: 44 o una variante de secuencia funcional de la misma que tenga al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia y/o una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (VL) de acuerdo con la SEQ ID NO: 45 o una variante de la secuencia funcional de la misma que tenga al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia; o (iv) una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (VH) de acuerdo con la SEQ ID NO: 80 o una variante de secuencia funcional de la misma que tenga al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia y/o una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (VL) de acuerdo con la SEQ ID NO: 81 o una variante de secuencia funcional de la misma que tenga al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia
Incluso con mayor preferencia, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprende (i) una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) de acuerdo con la SEQ ID NO: 8, o una variante de secuencia funcional de la misma con al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia y/o una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (VL) de acuerdo con la SEQ ID NO: 9 o una variante de secuencia funcional de la misma con al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia o (ii) una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (VH) de acuerdo con la SEQ ID NO: 80 o una variante de secuencia funcional de la misma que tenga al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia y/o una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (VL) de acuerdo con la SEQ ID NO: 81 o una variante de secuencia funcional de las mismas que tenga al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia.
Incluso más preferiblemente, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprende (i) una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) de acuerdo con la SEQ ID NO: 8 o una variante de secuencia funcional de la misma con al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia y/o una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (VL) de acuerdo con la SEQ ID NO: 9 o una variante de secuencia funcional de la misma que tenga al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia o (ii) una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (VH) de acuerdo con la SEQ ID NO: 80 o una variante de secuencia funcional de la misma que tenga al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia y/o una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (VL) de acuerdo con la SEQ ID NO: 81 o una variante de secuencia funcional de la misma con al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia.
También es preferible que el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprenda (i) una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (VH) de acuerdo con la SEQ ID NO: 26 o una variante de secuencia funcional de la misma que tenga al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia y/o una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (VL) de acuerdo con la SEQ ID NO: 27 o una variante de secuencia funcional de la misma que tenga al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia; o (ii) una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (VH) de acuerdo con la SEQ ID NO: 44 o una variante de secuencia funcional de la misma que tenga al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia y/o una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (VL) de acuerdo con la SEQ ID NO: 45 o una variante de secuencia funcional de las mismas que tenga al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia.
Con total preferencia, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) de acuerdo con la SEQ ID NO: 8 o una variante de secuencia funcional de la misma con al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia y/o una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (VL) de acuerdo con la SEQ ID NO: 9 o una variante de secuencia funcional de la misma con al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia.
Preferentemente, el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención es para uso como un medicamento. Más preferiblemente, el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención es para uso en la prevención y/o tratamiento de la infección por el virus Zika. Este aspecto se describe con más detalle a continuación.
Molécula de ácido nucleico
En otro aspecto, la invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención, tal como se describe anteriormente. Ejemplos de moléculas de ácido nucleico y/o polinucleótidos incluyen, por ejemplo, un polinucleótido recombinante, un vector, un oligonucleótido, una molécula de ARN tal como un ARNr, un ARNm, un miARN, un siARN o un ARNt, o una molécula de ADN, tal como un ADNc. Son preferentes las secuencias de ácido nucleico que codifican parte o la totalidad de las cadenas ligeras y pesadas, así como las CDR de los anticuerpos de la presente invención. Preferiblemente, por tanto, aquí se proporcionan secuencias de ácido nucleico que codifican parte o la totalidad de las cadenas ligeras y pesadas, en particular las secuencias VH y VL y CDR de los anticuerpos ilustrativos de la invención. Las Tablas 1 y 2 proporcionan los números de identificación de secuencias para las secuencias de aminoácidos de las CDR, VH y VL de anticuerpos ilustrativos de acuerdo con la presente invención.
La Tabla 3 a continuación proporciona los números de identificación de secuencias para secuencias de ácido nucleico ilustrativas que codifican las CDR, VH y VL de anticuerpos de ejemplo de acuerdo con la presente invención. Debido a la redundancia del código genético, la presente invención también comprende variantes de secuencia de estas secuencias de ácido nucleico y, en particular, aquellas variantes de secuencia que codifican las mismas secuencias de aminoácidos.
Una molécula de ácido nucleico es una molécula que comprende, preferiblemente que consiste en, componentes de ácido nucleico. El término molécula de ácido nucleico se refiere preferiblemente a moléculas de ADN o ARN. En particular, se utiliza como sinónimo del término “polinucleótido”. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico es un polímero que comprende o consiste en monómeros de nucleótidos que están unidos covalentemente entre sí por enlaces fosfodiéster de una cadena principal de azúcar/fosfato. El término “molécula de ácido nucleico” también abarca moléculas de ácido nucleico modificadas, tales como moléculas de ADN o ARN modificadas con bases, modificadas con azúcar o modificadas con la cadena principal, etc.
La Tabla 3 muestra ejemplos de secuencias de ácido nucleico de las CDR, así como la región variable de la cadena pesada (VH) y la región variable de la cadena ligera (VL) de cinco anticuerpos de ejemplo de acuerdo con la presente invención (“ZKA190”, “ZKA64”, “ZKA230”, “ZKA185”):
Preferiblemente, la secuencia de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 10-18, 28-36, 46-54, 64-72 y 82-90; o una variante de secuencia funcional de las mismas.
También es preferente que las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención incluyan secuencias de ácido nucleico que tengan al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad con el ácido nucleico que codifica una CDR, una secuencia VH y/o una secuencia VL utilizada en un anticuerpo (de ejemplo) de acuerdo con la presente invención, por ejemplo con las secuencias mostradas en la Tabla 3.
En general, la molécula de ácido nucleico puede manipularse para insertar, eliminar o alterar ciertas secuencias de ácido nucleico. Los cambios de dicha manipulación incluyen, pero no se limitan a, cambios para introducir sitios de restricción, para modificar el uso del codón, para añadir u optimizar secuencias reguladoras de la transcripción y/o la traducción, etc. También es posible cambiar el ácido nucleico para alterar los aminoácidos codificados. Por ejemplo, puede ser útil introducir una o más (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo. Dichas mutaciones puntuales pueden modificar las funciones efectoras, la afinidad de unión a antígeno, modificaciones postraduccionales, la inmunogenicidad, etc., pueden introducir aminoácidos para la unión de grupos covalentes (por ejemplo etiquetas) o pueden introducir etiquetas (por ejemplo con propósitos de purificación). Las mutaciones se pueden introducir en sitios específicos o se pueden introducir aleatoriamente, seguido de selección (por ejemplo evolución molecular). Por ejemplo, uno o más ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las regiones CDR, una secuencia VH y/o una secuencia VL de un anticuerpo (de ejemplo) de la invención pueden mutarse de manera aleatoria o direccional para introducir diferentes propiedades en los aminoácidos codificados. Dichos cambios pueden ser resultado de un proceso iterativo en el que se mantienen los cambios iniciales y se introducen nuevos cambios en otras posiciones de nucleótidos. Además, los cambios logrados en pasos independientes se pueden combinar. Las diferentes propiedades introducidas en los aminoácidos codificados pueden incluir, pero no se limitan a, una afinidad mejorada.
Vector
Dentro del alcance de la invención se incluyen además vectores, por ejemplo vectores de expresión, que comprenden una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Preferiblemente, un vector comprende una molécula de ácido nucleico tal como se describe anteriormente.
El término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico, preferiblemente a una molécula de ácido nucleico recombinante, es decir, una molécula de ácido nucleico que no es de origen natural. Un vector en el contexto de la presente invención es adecuado para incorporar o albergar una secuencia de ácido nucleico deseada. Dichos vectores pueden ser vectores de almacenamiento, vectores de expresión, vectores de clonación, vectores de transferencia, etc. Un vector de almacenamiento es un vector que permite el almacenamiento conveniente de una molécula de ácido nucleico. Así, por ejemplo, el vector puede comprender una secuencia correspondiente a un anticuerpo deseado o a un fragmento de anticuerpo del mismo de acuerdo con la presente invención. Se puede usar un vector de expresión para la producción de productos de expresión, tales como ARN, por ejemplo ARNm, o péptidos, polipéptidos o proteínas. Por ejemplo, un vector de expresión puede comprender las secuencias necesarias para la transcripción de un tramo de secuencia del vector, tal como una secuencia promotora. Un vector de clonación es típicamente un vector que contiene un sitio de clonación, que se puede usar para incorporar secuencias de ácido nucleico en el vector. Un vector de clonación puede ser, por ejemplo, un vector plásmido o un vector bacteriófago. Un vector de transferencia puede ser un vector que sea adecuado para transferir moléculas de ácido nucleico a células u organismos, por ejemplo vectores virales. Un vector en el contexto de la presente invención puede ser, por ejemplo, un vector de a Rn o un vector de ADN. Preferiblemente, un vector es una molécula de ADN. Por ejemplo, un vector en el sentido de la presente solicitud comprende un sitio de clonación, un marcador de selección, tal como un factor de resistencia a antibióticos, y una secuencia adecuada para la multiplicación del vector, tal como un origen de replicación. Preferiblemente, un vector en el contexto de la presente solicitud es un vector plásmido.
Células
En un aspecto adicional, la presente invención también proporciona células que expresan el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención y/o que comprenden el vector de acuerdo con la presente invención.
Ejemplos de tales células incluyen, pero no se limitan a, células eucariotas, por ejemplo células de levadura, células animales o células vegetales. Preferiblemente, las células son células de mamífero, más preferiblemente una línea celular de mamífero. Ejemplos preferidos incluyen células humanas, células CHO, células HEK293T, células PER.C6, células NS0, células hepáticas humanas, células de mieloma o células de hibridoma.
En particular, la célula puede transfectarse con un vector de acuerdo con la presente invención, preferiblemente con un vector de expresión. El término “transfección” se refiere a la introducción de moléculas de ácido nucleico, tales como las moléculas de ADN o ARN (por ejemplo ARNm), en las células, preferiblemente en células eucariotas. En el contexto de la presente invención, el término “transfección” abarca cualquier método conocido por el experto en la técnica para introducir moléculas de ácido nucleico en células, preferiblemente en células eucariotas, tal como en células de mamíferos. Tales métodos abarcan, por ejemplo, electroporación, lipofección, por ejemplo basada en lípidos y/o liposomas catiónicos, precipitación con fosfato de calcio, transfección basada en nanopartículas, transfección basada en virus o transfección basada en polímeros catiónicos, tales como DEAE-dextrano o polietilenimina, etc. Preferiblemente, la introducción no es viral.
Además, las células de la presente invención pueden transfectarse de manera estable o transitoria con el vector de acuerdo con la presente invención, por ejemplo para expresar el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención. Preferiblemente, las células se transfectan de manera estable con el vector de acuerdo con la presente invención que codifica el anticuerpo o con el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención. Alternativamente, también es preferente que las células se transfecten de manera transitoria con el vector de acuerdo con la presente invención que codifica el anticuerpo o con el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención.
Otras características opcionales de los anticuerpos
Los anticuerpos de la invención se pueden acoplar, por ejemplo, a un fármaco para administrar a un sitio de tratamiento o acoplarse a una etiqueta detectable para facilitar la obtención de imágenes de un sitio que comprende células de interés. Los métodos para acoplar anticuerpos a fármacos y etiquetas detectables son bien conocidos en la técnica, ya que son métodos para obtener imágenes usando etiquetas detectables. Los anticuerpos etiquetados pueden emplearse en una amplia variedad de ensayos, empleando una amplia variedad de etiquetas. La detección de la formación de un complejo antígeno-anticuerpo entre un anticuerpo de la invención y un epítopo de interés puede facilitarse uniendo una sustancia detectable al anticuerpo. Los medios de detección adecuados incluyen el uso de etiquetas, tales como radionúclidos, enzimas, coenzimas, fluorescentes, quimioluminiscentes, cromógenos, sustratos enzimáticos o cofactores, inhibidores enzimáticos, complejos de grupos protésicos, radicales libres, partículas, colorantes y similares. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos protésicos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente es el luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 35S o 3H. Dichos reactivos etiquetados pueden usarse en diversos ensayos bien conocidos, tales como radioinmunoensayos, inmunoensayos enzimáticos, por ejemplo ELISA, inmunoensayos fluorescentes, y similares. Los anticuerpos etiquetados de acuerdo con la presente invención se pueden usar así en tales ensayos por ejemplo como se describe en US 3.766.162, US 3.791.932, US 3.817.837 y U<s>4.233.402.
Un anticuerpo de acuerdo con la invención puede conjugarse con un resto terapéutico tal como una citotoxina, un agente terapéutico o un ion metálico radioactivo o radioisótopo. Ejemplos de radioisótopos incluyen, pero no se limitan a, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, Bi-213, Pd-109, Tc-99, In-111 y similares. Tales conjugados de anticuerpos se pueden usar para modificar una respuesta biológica dada; el resto de fármaco no debe interpretarse como limitado a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto de fármaco puede ser una proteína o un polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina de la difteria.
Las técnicas para conjugar dicho resto terapéutico con anticuerpos son bien conocidas. Véase, por ejemplo, Arnon et al. (1985) “Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy,” en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-256; ed. Hellstrom et al. (1987) “Antibodies for Drug Delivery,” en Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2a ed; Marcel Dekker, Inc.), pp. 623-653; Thorpe (1985) “Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review”, en Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al. pp. 475-506 (Editrice Kurtis, Milano, Italy, 1985); “Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy,” en Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al. (Academic Press, New York, 1985), pp. 303-316; y Thorpe et al. (1982) Immunol. Rev. 62:119-158.
Alternativamente, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo del mismo puede conjugarse con un segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo para formar un heteroconjugado de anticuerpo tal como se describe en la US 4.676.980. Además, se pueden usar enlazadores entre las etiquetas y los anticuerpos de la invención, por ejemplo como se describe en la US 4.831.175. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden etiquetarse directamente con yodo radiactivo, indio, itrio u otra partícula radiactiva conocida en la técnica, por ejemplo como se describe en la US 5.595.721. El tratamiento puede consistir en una combinación de tratamiento con anticuerpos conjugados y no conjugados administrados simultánea o posteriormente, por ejemplo como se describe en las WO 00/52031, WO 00/52473.
Los anticuerpos de la invención también pueden unirse a un soporte sólido. Además, los anticuerpos de la invención o los fragmentos de anticuerpos funcionales de los mismos pueden modificarse químicamente mediante una conjugación covalente a un polímero para, por ejemplo, aumentar su vida media circulante. Ejemplos de polímeros y métodos para unirlos a péptidos se citan en las US 4.766.106, US 4.179.337, US 4.495.285 y US 4.609.546. En algunas realizaciones, los polímeros pueden seleccionarse entre polioles polioxietilados y polietilenglicol (PEG). El PEG es soluble en agua a temperatura ambiente y tiene la fórmula general: R(O-CH2-CH2)nO-R, donde R puede ser hidrógeno o un grupo protector, tal como un grupo alquilo o alcanol. Preferiblemente, el grupo protector puede tener entre 1 y 8 carbonos. Por ejemplo, el grupo protector es metilo. El símbolo n es un número entero positivo. En una realización, n está entre 1 y 1.000. En otra realización, n está entre 2 y 500. Preferiblemente, el PEG tiene un peso molecular promedio entre 1.000 y 40.000, más preferiblemente el PEG tiene un peso molecular entre 2.000 y 20.000, incluso más preferiblemente el PEG tiene un peso molecular entre 3.000 y 12.000. Además, el PEG puede tener al menos un grupo hidroxilo, por ejemplo el PEG puede tener un grupo hidroxilo terminal. Por ejemplo, es el grupo hidroxilo terminal el que se activa para reaccionar con un grupo amino libre en el inhibidor. Sin embargo, se entenderá que el tipo y la cantidad de los grupos reactivos puede variar para lograr un PEG/anticuerpo conjugado covalentemente de la presente invención.
Los polioles polioxietilados solubles en agua también son útiles en la presente invención. Incluyen sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada, glicerol polioxietilado (POG) y similares. En una realización, se usa POG. Sin limitarse a ninguna teoría, debido a que la cadena principal glicerol del glicerol polioxietilado es el mismo esqueleto que ocurre naturalmente en, por ejemplo, animales y humanos en cuanto a monoglicéridos, diglicéridos y triglicéridos, esta ramificación no se verá necesariamente como un agente extraño en el cuerpo. El POG puede tener un peso molecular en el mismo rango que PEG. Otro sistema de administración de fármacos que puede usarse para aumentar la vida media en circulación es el liposoma. Un experto en la técnica conoce los métodos de preparación de sistemas de administración de liposomas. Otros sistemas de administración de fármacos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Poznansky et al. (1980) y Poznansky (1984).
Los anticuerpos de la invención se pueden proporcionar en forma purificada. Típicamente, el anticuerpo estará presente en una composición que está esencialmente libre de otros polipéptidos, por ejemplo donde menos del 90% (en peso), generalmente menos del 60% y más generalmente menos del 50% de la composición se compone de otros polipéptidos.
Los anticuerpos de la invención pueden ser inmunogénicos en huéspedes no humanos (o heterólogos), por ejemplo en ratones. En particular, los anticuerpos pueden tener un idiotopo que es inmunogénico en huéspedes no humanos, pero no en un huésped humano. En particular, los anticuerpos de la invención para uso humano incluyen aquellos que no pueden aislarse fácilmente de huéspedes, tales como ratones, cabras, conejos, ratas, mamíferos no primates, etc., y no pueden obtenerse generalmente mediante humanización o a partir de xeno-ratones.
Producción de anticuerpos
Los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden prepararse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la metodología general para producir anticuerpos monoclonales utilizando tecnología de hibridoma es bien conocida (Kohler, G. & Milstein, C., 1975; Kozbar et al., 1983). En una realización, se usa el método alternativo de inmortalización con EBV descrito en la WO2004/076677.
Un método preferente se describe en la WO 2004/076677. En este método, las células B que producen el anticuerpo de la invención se transforman con EBV y un activador policlonal de células B. Se pueden añadir opcionalmente estimulantes adicionales del crecimiento y la diferenciación celular durante el paso de transformación para mejorar aún más la eficiencia. Estos estimulantes pueden ser citocinas, tal como IL 2 e IL-15. En un aspecto, se agrega IL-2 durante el paso de inmortalización para mejorar aún más la eficiencia de la inmortalización, pero su uso no es esencial. Las células B inmortalizadas producidas usando estos métodos pueden cultivarse posteriormente utilizando métodos conocidos en la técnica y aislarse los anticuerpos de ellas.
Otro método preferente se describe en la WO 2010/046775. En este método, se cultivan células plasmáticas en número limitado o como células plasmáticas individuales en placas de cultivo de micropocillos. Los anticuerpos pueden aislarse de los cultivos de células plasmáticas. Además, a partir de los cultivos de células plasmáticas, se puede extraer el ARN y se puede llevar a cabo una PCR utilizando métodos conocidos en la técnica. Las regiones VH y VL de los anticuerpos pueden amplificarse mediante RT-PCR” (PCR con trascriptasa inversa), secuenciarse y clonarse en un vector de expresión que luego se transfecta en células HEK293T u otras células huésped. La clonación del ácido nucleico en vectores de expresión, la transfección de células huésped, el cultivo de las células huésped transfectadas y el aislamiento del anticuerpo producido pueden realizarse utilizando cualquier método conocido por los expertos en la técnica.
Los anticuerpos pueden purificarse adicionalmente, si se desea, utilizando filtración, centrifugación y diversos métodos cromatográficos, tales como HPLC o cromatografía de afinidad. Las técnicas para la purificación de anticuerpos, por ejemplo anticuerpos monoclonales, incluyendo las técnicas para producir anticuerpos de calidad farmacéutica, son bien conocidas en la técnica.
Los fragmentos de los anticuerpos de la invención se pueden obtener a partir de los anticuerpos mediante métodos que incluyen la digestión con enzimas, tales como pepsina o papaína, y/o mediante la escisión de enlaces disulfuro por reducción química. Alternativamente, los fragmentos de los anticuerpos pueden obtenerse por clonación y expresión de parte de las secuencias de las cadenas pesadas o ligeras. Los "fragmentos" de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv. La invención también abarca fragmentos Fv monocatenarios (scFv) derivados de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo de la invención. Por ejemplo, la invención incluye un scFv que comprende las CDR de un anticuerpo de la invención. También se incluyen los monómeros y dímeros de cadena pesada o ligera, los anticuerpos de cadena pesada de dominio único, los anticuerpos de cadena ligera de dominio único, así como los anticuerpos monocatenarios, por ejemplo Fv monocatenario en el que los dominios variables de cadena ligera y pesada están unidos por un enlazador peptídico.
Los fragmentos de anticuerpos de la invención pueden impartir interacciones monovalentes o multivalentes y estar contenidos en diversas estructuras, tal como se describió anteriormente. Por ejemplo, las moléculas scFv se pueden sintetizar para crear un “triacuerpo” trivalente o un “tetracuerpo” tetravalente. Las moléculas scFv pueden incluir un dominio de la región Fc que resulta en minicuerpos bivalentes. Además, los anticuerpos o los fragmentos de unión a antígeno de la invención pueden ser un componente de moléculas multiespecíficas en las que los anticuerpos o los fragmentos de unión a antígeno se dirigen a los epítopos aquí descritos y otras regiones de la molécula se unen a otras dianas. Moléculas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, Fab2 biespecífico, Fab3 triespecífico, scFv biespecífico y diacuerpos (Holliger & Hudson, 2005, Nature Biotechnology 9: 1126-1136).
Se pueden usar técnicas estándar de biología molecular para preparar secuencias de ADN que codifican los anticuerpos o los fragmentos de anticuerpo de la presente invención o sus fragmentos. Las secuencias de ADN deseadas pueden sintetizarse completamente o en parte usando técnicas de síntesis de oligonucleótidos. Las técnicas de mutagénesis dirigida y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se pueden usar de forma correspondiente.
Se puede usar cualquier célula huésped/sistema de vectores adecuado para la expresión de las secuencias de ADN que codifican las moléculas de anticuerpo de la presente invención o sus fragmentos. Se pueden usar sistemas bacterianos, por ejemplo E. coli, y otros sistemas microbianos, en parte, para la expresión de fragmentos de anticuerpos, tales como los fragmentos Fab y F(ab')2 y especialmente para los fragmentos Fv y los fragmentos de anticuerpos monocatenarios, por ejemplo FV monocatenarios. Se pueden usar sistemas de expresión de células huéspedes eucariotas, por ejemplo de mamíferos, para la producción de moléculas de anticuerpos más grandes, incluyendo moléculas de anticuerpos completas. Células huésped de mamífero adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células CHO, HEK293T, PER.C6, NS0, de mieloma o de hibridoma.
La descripción también proporciona un proceso para la producción de una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente invención, el cual comprende cultivar una célula huésped que comprende un vector que codifica un ácido nucleico de la presente invención en condiciones adecuadas para la expresión de proteínas a partir de un ADN que codifica la molécula de anticuerpo de la presente invención y aislar la molécula de anticuerpo.
La molécula de anticuerpo puede comprender sólo un polipéptido de cadena pesada o ligera, en cuyo caso sólo se necesita usar una secuencia de codificación del polipéptido de cadena pesada o ligera para transfectar las células huésped. Para la producción de productos que comprenden tanto cadenas pesadas como ligeras, la línea celular puede transfectarse con dos vectores, un primer vector que codifica un polipéptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipéptido de cadena pesada. Alternativamente, se puede usar un único vector, incluyendo el vector las secuencias que codifican los polipéptidos de cadena ligera y cadena pesada.
Alternativamente, los anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden producir mediante (i) la expresión de una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención en una célula huésped, por ejemplo empleando un vector de acuerdo con la presente invención, y (ii) aislando el producto de anticuerpo expresado. Además, el método puede incluir (iii) purificar el anticuerpo aislado. Las células B transformadas y las células plasmáticas cultivadas pueden examinarse para detectar aquellas que producen anticuerpos de la especificidad o función deseada.
El paso de cribado puede llevarse a cabo mediante cualquier inmunoensayo, por ejemplo ELISA, mediante tinción de tejidos o células (incluyendo células transfectadas), mediante un ensayo de neutralización o mediante uno de varios otros métodos conocidos en la técnica para identificar la especificidad o función deseadas. El ensayo se puede seleccionar basándose en el simple reconocimiento de uno o más antígenos o basándose además en una función deseada, por ejemplo para seleccionar anticuerpos neutralizantes en lugar de sólo anticuerpos de unión a antígeno, para seleccionar anticuerpos que puedan cambiar las características de las células, tal como sus cascadas de señalización, su forma, su tasa de crecimiento, su capacidad de influir en otras células, su respuesta a la influencia de otras células o de otros reactivos o por un cambio en las condiciones, su estado de diferenciación, etc.
Los clones de células B transformadas individuales pueden producirse posteriormente a partir del cultivo de células B transformadas y positivas. La etapa de clonación para separar clones individuales de la mezcla de células positivas puede llevarse a cabo utilizando dilución limitante, micromanipulación, deposición de células individuales por clasificación celular u otro método conocido en la técnica.
El ácido nucleico de las células plasmáticas cultivadas se puede aislar, clonar y expresar en células HEK293T u otras células huésped conocidas usando métodos conocidos en la técnica.
Los clones de células B inmortalizadas o las células huésped transfectadas de la invención se pueden usar de varias maneras, por ejemplo como fuente de anticuerpos monoclonales, como fuente de ácido nucleico (ADN o ARNm) que codifica un anticuerpo monoclonal de interés, para investigación, etc.
También se describe aquí una composición que comprende células de memoria B inmortalizadas o células huésped transfectadas que producen anticuerpos de acuerdo con la presente invención.
El clon de células B inmortalizadas o las células plasmáticas cultivadas también se pueden usar como fuente de ácido nucleico para la clonación de genes de anticuerpos para la expresión recombinante posterior. La expresión de fuentes recombinantes es más común con fines farmacéuticos que la expresión de células B o hibridomas, por ejemplo por razones de estabilidad, reproducibilidad, facilidad de cultivo, etc.
También se describe aquí un método para preparar una célula recombinante que comprende los siguientes pasos: (i) obtener uno o más ácidos nucleicos (por ejemplo ARNm de cadena pesada y/o ligera) del clon de células B o de las células plasmáticas cultivadas que codifican el anticuerpo de interés; (ii) insertar el ácido nucleico en un vector de expresión y (iii) transfectar el vector en una célula huésped para permitir la expresión del anticuerpo de interés en esa célula huésped.
También se describe aquí un método para preparar una célula recombinante que comprende los siguientes pasos: (i) secuenciar el (los) ácido(s) nucleico(s) del clon de células B o de las células plasmáticas cultivadas que codifican el anticuerpo de interés; y (ii) usar la información de secuencia del paso (i) para preparar ácido(s) nucleico(s) para su inserción en una célula huésped con el fin de permitir la expresión del anticuerpo de interés en esa célula huésped. El ácido nucleico puede, pero no necesita, ser manipulado entre los pasos (i) y (ii) para introducir sitios de restricción, para cambiar el uso de codones y/o para optimizar la transcripción y/o las secuencias reguladoras de la traducción.
También se describe aquí un método para preparar una célula huésped transfectada, que comprende el paso de transfectar una célula huésped con uno o más ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo de interés, siendo los ácidos nucleicos aquellos que se derivaron de un clon de una célula B inmortalizada o una célula plasmática cultivada de la invención. Por tanto, los procedimientos para preparar primero el (los) ácido(s) nucleico(s) y posteriormente usarlo(s) para transfectar una célula huésped pueden ser llevados a cabo en diferentes momentos, por diferentes personas y en diferentes lugares (por ejemplo en diferentes países).
Estas células recombinantes de la invención se pueden usar con fines de expresión y cultivo. Son particularmente útiles para la expresión de anticuerpos para la producción farmacéutica a gran escala. También pueden usarse como ingrediente activo de una composición farmacéutica. Se puede utilizar cualquier técnica de cultivo adecuada, incluyendo, entre otros, cultivo estático, cultivo en botella rotatoria, fluido ascítico, cartucho de biorreactor de tipo fibra hueca, minifermentador modular, tanque con agitación, cultivo de microportadores, perfusión de núcleo cerámico, etc.
Los métodos para obtener y secuenciar genes de inmunoglobulina a partir de células B o células plasmáticas son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, el Capítulo 4 de Kuby Immunology, 4a edición, 2000).
La célula huésped transfectada puede ser una célula eucariota, incluyendo células de levadura y animales, en particular células de mamíferos (por ejemplo células CHO, células NS0, células humanas tales como células PER.C6 o HKB 11, células de mieloma o células hepáticas humanas), así como células vegetales, siendo preferentes las células de mamífero. Los huéspedes de expresión preferidos pueden glicosilar el anticuerpo de la invención, particularmente con estructuras carbohidrato que no son inmunogénicas en seres humanos. En una realización, la célula huésped transfectada puede crecer en un medio libre de suero. En una realización adicional, la célula huésped transfectada puede crecer en cultivo sin la presencia de productos derivados de animales. La célula huésped transfectada también puede cultivarse para producir una línea celular.
También se describe aquí un método para preparar una o más moléculas de ácido nucleico (por ejemplo genes de cadena pesada y ligera) que codifican un anticuerpo de interés, que comprende los pasos de: (i) preparar un clon de células B inmortalizadas o cultivar células plasmáticas de acuerdo con la invención; (ii) obtener del clon de células B o de las células plasmáticas cultivadas un ácido nucleico que codifica el anticuerpo de interés. Además, también se describe aquí un método para obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo de interés, que comprende los pasos de: (i) preparar un clon de células B inmortalizadas o cultivar células plasmáticas de acuerdo con la invención; (ii) secuenciar el ácido nucleico del clon de células B o las células plasmáticas cultivadas que codifican el anticuerpo de interés.
También se describe aquí un método para preparar una o más moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo de interés, el cual comprende el paso de obtener el ácido nucleico que se obtuvo a partir de un clon de células B transformadas o células plasmáticas cultivadas de la invención. Así, los procedimientos para obtener primero el clon de células B o las células plasmáticas cultivadas y posteriormente obtener los ácidos nucleicos del clon de células B o las células plasmáticas cultivadas pueden ser llevados a cabo en diferentes momentos, por diferentes personas y en diferentes lugares (por ejemplo en diferentes países).
También se describe aquí un método para preparar un anticuerpo (por ejemplo para uso farmacéutico) de acuerdo con la presente invención, que comprende los pasos de: (i) obtener y/o secuenciar uno o más ácidos nucleicos (por ejemplo genes de cadena pesada y ligera) del clon de células B seleccionado o de las células plasmáticas cultivadas que expresan el anticuerpo de interés; (ii) insertar el (los) ácido(s) nucleico(s) en o usar la(s) secuencia(s) de ácido(s) nucleico(s) para preparar un vector de expresión; (iii) transfectar una célula huésped que puede expresar el anticuerpo de interés; (iv) cultivar o subcultivar las células huésped transfectadas en condiciones en las que se expresa el anticuerpo de interés; y, opcionalmente, (v) purificar el anticuerpo de interés.
También se describe aquí un método para preparar un anticuerpo que comprende los pasos de: cultivar o subcultivar una población de células huésped transfectadas, por ejemplo una población de células huésped transfectadas de manera estable, bajo condiciones en las que se expresa el anticuerpo de interés y, opcionalmente, purificar el anticuerpo de interés, donde dicha población de células huésped transfectadas se ha preparado (i) proporcionando ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) un anticuerpo de interés seleccionado producido por un clon de células B o células plasmáticas cultivadas preparadas como se describe anteriormente, (ii) insertando el (los) ácido(s) nucleico(s) en un vector de expresión, (iii) transfectando el vector en una célula huésped que puede expresar el anticuerpo de interés y (iv) cultivando o subcultivando la célula huésped transfectada que comprende los ácidos nucleicos insertados para producir el anticuerpo de interés. Por tanto, los procedimientos para preparar primero la célula huésped recombinante y posteriormente cultivarla para expresar el anticuerpo pueden ser llevados a cabo en momentos muy diferentes, por personas diferentes y en diferentes lugares (por ejemplo en diferentes países).
Composición farmacéutica
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más de:
(i) el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de acuerdo con la presente invención;
(ii) el ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la presente invención; (iii) el vector que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención; y/o
(iv) la célula que expresa el anticuerpo de acuerdo con la presente invención o que comprende el vector de acuerdo con la presente invención.
En otras palabras, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención y/o la célula de acuerdo con la presente invención.
La composición farmacéutica también puede contener preferiblemente un vehículo, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable. Aunque el vehículo o excipiente puede facilitar la administración, no debe inducir la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición. Ni debe ser tóxico. Vehículos adecuados pueden ser macromoléculas grandes y de metabolismo lento tales como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas víricas inactivas. En general, los vehículos farmacéuticamente aceptables de una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención pueden ser componentes activos o componentes inactivos. Preferiblemente, el vehículo farmacéuticamente aceptable en una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención no es un componente activo con respecto a la infección por el virus del Zika.
Se pueden usar sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo sales de ácidos inorgánicos como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables de una composición farmacéutica pueden contener además líquidos como agua, solución salina, glicerol y etanol. Además, en tales composiciones pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias de ajuste del pH. Dichos vehículos permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen en forma de comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, compuestos acuosos y suspensiones, para su ingestión por parte del sujeto.
Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden preparar en diversas formas. Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o suspensiones. También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para la solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección (por ejemplo una composición liofilizada tipo Synagis™ y Herceptin™, para la reconstitución con agua estéril que contiene un conservante). La composición se puede preparar para la administración tópica, por ejemplo como una pomada, crema o polvo. La composición puede prepararse para la administración oral, por ejemplo como comprimido o cápsula, como aerosol o como jarabe (opcionalmente saborizado). La composición se puede preparar para la administración pulmonar, por ejemplo como inhalador, usando un polvo fino o un aerosol. La composición puede prepararse como un supositorio o pesario. La composición se puede preparar para la administración nasal, auditiva u ocular, por ejemplo en forma de gotas. La composición puede estar en forma de kit, diseñada de manera que se reconstituya una composición combinada justo antes de la administración a un sujeto. Por ejemplo, un anticuerpo liofilizado se puede proporcionar en forma de kit con agua estéril o una solución tampón estéril.
Se prefiere que el ingrediente activo en la composición sea una molécula de anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o variantes y derivados de los mismos, en particular el ingrediente activo en la composición es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o variantes y derivados de los mismos de acuerdo con la presente invención. Como tal, puede ser susceptible de degradación en el tracto gastrointestinal. Por tanto, si la composición se va a administrar por una vía que utiliza el tracto gastrointestinal, la composición puede contener agentes que protejan al anticuerpo contra la degradación, pero que liberen el anticuerpo una vez que se haya absorbido del tracto gastrointestinal.
Una discusión completa de vehículos farmacéuticamente aceptables está disponible en Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, ISBN: 0683306472.
Las composiciones farmacéuticas de la invención en general tienen un pH entre 5,5 y 8,5, en algunas realizaciones puede estar entre 6 y 8, y en otras es de aproximadamente 7. El pH se puede mantener empleando una solución tampón. La composición puede ser estéril y/o libre de pirógenos. La composición puede ser isotónica con respecto a los humanos. En una realización, las composiciones farmacéuticas de la invención se suministran en recipientes herméticamente cerrados.
Dentro del alcance de la invención están las composiciones en varias formas de administración; las formas incluyen, pero no se limitan a, formas adecuadas para la administración parenteral, por ejemplo mediante inyección o infusión, por ejemplo mediante inyección en bolo o infusión continua. Cuando el producto es para inyección o infusión, puede tener forma de una suspensión, solución o emulsión en un vehículo oleoso o acuoso, y puede contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, la molécula de anticuerpo puede estar en forma seca para ser reconstituida antes de usarla con un líquido estéril adecuado. Se entiende típicamente que un vehículo es un material adecuado para almacenar, transportar y/o administrar un compuesto, tal como un compuesto farmacéuticamente activo, en particular los anticuerpos de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, el vehículo puede ser un líquido fisiológicamente aceptable adecuado para almacenar, transportar y/o administrar un compuesto farmacéuticamente activo, en particular los anticuerpos de acuerdo con la presente invención. Una vez formuladas, las composiciones de la invención se pueden administrar directamente al sujeto. En una realización, las composiciones se adaptan para la administración a mamíferos, por ejemplo sujetos humanos.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse mediante una gran variedad de vías que incluyen, pero no se limitan a, la vía oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea, tópica, subcutánea, intranasal, intranasal, enteral, sublingual, intravaginal o rectal. También se pueden usar hiposprays para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Preferiblemente, la composición farmacéutica se puede preparar para la administración oral, por ejemplo como comprimidos, cápsulas y similares, para la administración tópica o como inyectables, por ejemplo como soluciones o suspensiones líquidas, siendo particularmente preferente que la composición farmacéutica sea un inyectable. También se prefieren las formas sólidas adecuadas para la solución en o la suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección, por ejemplo que la composición farmacéutica esté en forma liofilizada.
Para inyección, por ejemplo la inyección intravenosa, cutánea o subcutánea o en un lugar de interés, el ingrediente activo preferiblemente estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable libre de pirógenos y con un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la técnica pueden preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos, tales como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de Ringer lactato. Se pueden incluir conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, según se requiera. Con respecto a otro compuesto farmacéuticamente útil de acuerdo con la presente invención que se va a administrar a un individuo, ya sea un polipéptido, un péptido o una molécula de ácido nucleico, la administración es preferiblemente en una “cantidad profilácticamente efectiva” o una “cantidad terapéuticamente efectiva” (según sea el caso), siendo ésta suficiente para mostrar un beneficio para el individuo. La cantidad real administrada, así como la velocidad y el tiempo de administración dependerán de la naturaleza y la gravedad de la condición a tratar. En el caso de la inyección, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se puede proporcionar, por ejemplo, en una jeringa precargada.
La composición farmacéutica de la invención como se define anteriormente también puede administrarse vía oral en cualquier forma de dosificación aceptable por vía oral, incluyendo, pero no sin limitarse a, cápsulas, comprimidos, soluciones o suspensiones acuosas. En el caso de comprimidos para uso oral, los vehículos comúnmente utilizados incluyen lactosa y almidón de maíz. Típicamente, también se añaden agentes lubricantes, como estearato de magnesio. Para la administración oral en forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando se requieren suspensiones acuosas para uso oral, el ingrediente activo, es decir, la molécula de conjugado de carga transportadora de la invención, tal como se define anteriormente, se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, también se pueden añadir ciertos agentes edulcorantes, saborizantes o colorantes.
La composición farmacéutica de la invención también puede administrarse vía tópica, especialmente cuando el objetivo del tratamiento incluye áreas u órganos fácilmente accesibles mediante aplicación tópica, por ejemplo incluyendo enfermedades de la piel o de cualquier otro tejido epitelial accesible. Las formulaciones tópicas adecuadas se preparan fácilmente para cada una de estas áreas u órganos. Para aplicaciones tópicas, la composición farmacéutica de la invención se puede formular en una pomada adecuada que contiene la composición farmacéutica de la invención, en particular sus componentes como se define anteriormente, suspendida o disuelta en uno o más vehículos. Los vehículos para la administración tópica incluyen, pero no se limitan a, aceites minerales, vaselina líquida, vaselina blanca, propilenglicol, polioxietileno, compuesto de polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Alternativamente, la composición farmacéutica de la invención se puede formular en una loción o crema adecuada. En el contexto de la presente invención, los vehículos adecuados incluyen, pero no se limitan a, aceites minerales, monoestearato de sorbitano, polisorbato 60, cera de ésteres cetílicos, alcohol cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua.
El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple. En particular, la composición farmacéutica se puede proporcionar como un producto de dosis única. Preferiblemente, la cantidad del anticuerpo en la composición farmacéutica, en particular si se proporciona como un producto de dosis única, no es superior a 200 mg, más preferiblemente no es superior a 100 mg, e incluso más preferiblemente no es superior a 50 mg.
Por ejemplo, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se puede administrar diariamente, por ejemplo, una o varias veces al día, por ejemplo, una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces al día, preferiblemente una o dos veces al día, más preferible una vez al día, durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 o más días, por ejemplo, diariamente durante 1, 2, 3, 4, 5, 6 meses. Preferiblemente, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se puede administrar semanalmente, por ejemplo una o dos veces por semana, durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 o más semanas, por ejemplo semanalmente durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses o semanalmente durante 2, 3, 4 o 5 años. Además, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se puede administrar preferiblemente mensualmente, por ejemplo una vez al mes o, más preferiblemente, cada dos meses, durante 1, 2, 3, 4 o 5 años o más. También se prefiere que la administración continúe durante toda la vida. Además, también se contempla una sola administración, en particular con respecto a ciertas indicaciones, por ejemplo para la prevención de la infección por el virus del Zika en caso de exposición accidental, por ejemplo en sujetos no inmunizados. Sin embargo, el programa de tratamiento especialmente preferente es la profilaxis posterior a la exposición (PEP), administrándose una o más dosis únicas tan pronto como sea posible después de la infección por Zika. También se prefiere un entorno profiláctico, administrándose una o más dosis únicas para prevenir la infección por Zika (es decir, antes de la infección por Zika, en particular en sujetos no inmunizados contra el Zika).
En particular, es preferible que, para una dosis única, por ejemplo una dosis diaria, semanal o mensual, especialmente para una dosis semanal, la cantidad de anticuerpo o de fragmento de unión a antígeno del mismo en la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención no sea superior a 1 g, preferiblemente no superior a 500 mg, más preferiblemente no superior a 200 mg, aún más preferiblemente no superior a 100 mg y de manera particularmente preferible no superior a 50 mg.
Las composiciones farmacéuticas incluyen típicamente una cantidad “efectiva” de uno o más anticuerpos de la invención, es decir, una cantidad suficiente para tratar, mejorar, atenuar o prevenir una enfermedad o afección deseada o para mostrar un efecto terapéutico detectable. Los efectos terapéuticos también incluyen la reducción o atenuación de la potencia patógena o de síntomas físicos. La cantidad efectiva precisa para cualquier sujeto en particular dependerá de su tamaño, peso y salud, la naturaleza y el alcance de la condición y los productos terapéuticos o combinación de productos terapéuticos seleccionados para la administración. La cantidad efectiva para una situación dada se determina mediante la experimentación de rutina y es criterio del médico. Para los fines de la presente invención, una dosis efectiva será generalmente de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 100 mg/kg, preferiblemente de aproximadamente 0,0075 a aproximadamente 50 mg/kg, más preferiblemente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg e incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 5 mg/kg del anticuerpo de la presente invención (por ejemplo la cantidad del anticuerpo en la composición farmacéutica) en relación al peso corporal (por ejemplo en kg) del individuo al que se administra.
Además, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención también puede comprender un componente activo adicional, que puede ser un anticuerpo adicional o un componente que no es un anticuerpo. El componente activo adicional preferiblemente es un inhibidor del punto de control. También es preferente que se combine un anticuerpo neutralizante de ZIKV, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, como se describe aquí con un anticuerpo de unión a NS1 de ZIKV o con un fragmento de unión a antígeno del mismo, como se describe aquí, como componente activo adicional (co-agente). Por tanto, además de la neutralización de ZIKV, puede bloquearse la función patógena de NS1.
La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede comprender uno o más de los componentes activos adicionales, por ejemplo tal como se describen a continuación, como co-agentes en el contexto de una terapia de combinación.
El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno, de acuerdo con la presente invención puede estar presente en la misma composición farmacéutica que el componente activo adicional o, preferiblemente, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la presente invención está comprendido en una primera composición farmacéutica y el componente activo adicional está comprendido en una segunda composición farmacéutica diferente de la primera composición farmacéutica. Por consiguiente, si se contempla más de un componente activo adicional, cada componente activo adicional y el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno, de acuerdo con la presente invención, está preferiblemente comprendido en una composición farmacéutica diferente. Dichas composiciones farmacéuticas diferentes pueden administrarse combinadas/simultáneamente o en momentos separados o en ubicaciones separadas (por ejemplo, partes individuales del cuerpo).
Preferiblemente, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno, de acuerdo con la presente invención y el componente activo adicional proporcionan un efecto terapéutico aditivo o, preferiblemente, un efecto terapéutico sinérgico. El término “sinergia” se utiliza para describir un efecto combinado de dos o más agentes activos que es mayor que la suma de los efectos individuales de cada agente activo respectivo. Por tanto, cuando el efecto combinado de dos o más agentes resulta en una “ inhibición sinérgica” de una actividad o proceso, se pretende que la inhibición de la actividad o proceso sea mayor que la suma de los efectos inhibidores de cada agente activo respectivo. El término “efecto terapéutico sinérgico” se refiere a un efecto terapéutico observado con una combinación de dos o más terapias, siendo el efecto terapéutico (medido por cualquiera de diversos parámetros) mayor que la suma de los efectos terapéuticos individuales observados con las terapias individuales respectivas.
En una realización, una composición de la invención puede incluir anticuerpos de la invención, donde los anticuerpos pueden constituir al menos el 50% en peso (por ejemplo el 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más) de la proteína total en la composición. Preferentemente, en dicha composición, los anticuerpos están en forma purificada.
También se describe aquí un método para preparar una composición farmacéutica que comprende los pasos de: (i) preparar un anticuerpo de la invención; y (ii) mezclar el anticuerpo purificado con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.
En otro aspecto de la descripción, un método para preparar una composición farmacéutica comprende el paso de: mezclar un anticuerpo con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, siendo el anticuerpo un anticuerpo monoclonal que se obtuvo a partir de una célula B transformada o de una célula plasmática cultivada de la invención.
Como alternativa al suministro de anticuerpos o células B con fines terapéuticos, es posible administrar un ácido nucleico (típicamente ADN) que codifica el anticuerpo monoclonal (o el fragmento activo del mismo) de interés derivado de células B o de células plasmáticas cultivadas a un sujeto, de modo que el ácido nucleico pueda expresarsein situen el sujeto para proporcionar un efecto terapéutico deseado. La terapia génica adecuada y los vectores de suministro de ácidos nucleicos son conocidos en la técnica.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir un antimicrobiano, en particular si están envasadas en un formato multidosis. Pueden comprender un tensioactivo, por ejemplo Tween (polisorbato), tal como Tween 80. Los tensioactivos generalmente están presentes en niveles bajos, por ejemplo menos del 0,01%. Las composiciones también pueden incluir sales de sodio (por ejemplo cloruro de sodio) para dar tonicidad. Por ejemplo, una concentración de 10 ± 2 mg/ml de NaCl es típica.
Además, las composiciones farmacéuticas pueden comprender un alcohol de azúcar (por ejemplo manitol) o un disacárido (por ejemplo sacarosa o trehalosa), por ejemplo aproximadamente 15-30 mg/ml (por ejemplo 25 mg/ml), en particular si están liofilizadas o si incluyen un material que ha sido reconstituido a partir de material liofilizado. El pH de una composición para la liofilización se puede ajustar entre 5 y 8 o entre 5,5 y 7 o a aproximadamente 6,1 antes de la liofilización.
Las composiciones de la invención también pueden comprender uno o más agentes inmunorreguladores. En una realización, uno o más de los agentes inmunorreguladores incluyen un adyuvante.
Tratamientos médicos, kits y usos
Tratamientos médicos
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención para su uso en la prevención y/o el tratamiento de la infección por el virus del Zika.
La prevención de la infección por el virus del Zika se refiere en particular a entornos profilácticos donde el sujeto no fue diagnosticado con la infección por el virus del Zika (o bien no se realizó el diagnóstico o los resultados del diagnóstico fueron negativos) y/o el sujeto no muestra síntomas de la infección por el virus Zika. En consecuencia, la prevención de la infección por el virus Zika incluye la “profilaxis posterior a la exposición” (PEP), es decir, el tratamiento preventivo después de una posible infección por el virus Zika, por ejemplo después de una picadura de mosquito en una zona afectada por el virus del Zika. La prevención de la infección por el virus del Zika es particularmente útil en sujetos de alto riesgo, tales como pacientes embarazadas, y/o en sujetos que permanecen en áreas afectadas por el virus del Zika (tal como aquellos que viven en áreas afectadas por el virus del Zika o que viajan a áreas afectadas por el virus del Zika).
Por el contrario, en entornos terapéuticos, el sujeto suele estar infectado por el virus del Zika, diagnosticado con una infección por el virus del Zika y/o muestra síntomas de infección por el virus del Zika. Es de destacar que los términos “tratamiento” y “terapia”/”terapéutico” de la infección por ZIKV incluyen la curación (completa) y la atenuación de la infección por ZIKV.
Por consiguiente, el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se usan preferiblemente para el tratamiento de la infección por el virus del Zika en sujetos diagnosticados con la infección por el virus del Zika o en sujetos que muestran síntomas de infección por Zika.
También se prefiere que el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se usen en la prevención y/o el tratamiento de la infección por el virus del Zika en sujetos asintomáticos. Esos sujetos pueden ser diagnosticados o no diagnosticados de infección por el virus del Zika.
Preferiblemente, el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se usan para la prevención y/o el tratamiento de la infección por el virus del Zika en pacientes embarazadas, en particular para prevenir la infección congénita. Por ejemplo, esto se puede realizar de manera similar a la prevención de la infección congénita por HCMV, tal como se describe en Nigro G, Adler SP, La Torre R, Best AM, Congenital Cytomegalovirus Collaborating Group: Passive immunization during pregnancy for congenital cytomegalovirus infection; N Engl J Med 2005, 353:1350-1362.
Sin limitarse a ninguna teoría, se supone que el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención puede atravesar la placenta mediante la interacción con FcRn si se administra a una paciente embarazada, por ejemplo mediante inyección (i.v.) o cualquier otra vía de administración tal como se describe aquí. Es importante destacar que la interacción de las variantes de anticuerpos “LALA” aquí descritas con FcRn no está comprometida. Se cree que la FcRn ya se expresa en el primer trimestre en la placenta.
Alternativamente, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención también se puede administrar en el espacio extraamniótico.
Preferiblemente, el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se utilizan para la prevención y/o el tratamiento de la infección por el virus del Zika, donde el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, el ácido nucleico, el vector, la célula o la composición farmacéutica se administran hasta siete días después de (una posible) infección por el virus Zika, preferiblemente hasta cinco días después de (una posible) infección por el virus Zika, más preferiblemente hasta cuatro días después de (una posible) infección por el virus Zika, incluso más preferiblemente hasta tres días después de (una posible) infección por el virus Zika y con total preferencia hasta un día después de (una posible) infección por el virus Zika. Dicho programa de tratamiento puede ser útil en entornos terapéuticos, así como en entornos profilácticos, en particular en la profilaxis posterior a la exposición (PEP).
En la PEP, típicamente la primera administración del anticuerpo, o de un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, del vector de acuerdo con la presente invención, de la célula de acuerdo con la presente invención o de la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención es lo más pronto posible después de una posible infección por ZIKV, por ejemplo después de una picadura de mosquito en un área afectada por ZIKV. Por consiguiente, en<p>E<p>, la primera administración del anticuerpo neutralizante, o del fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, del vector de acuerdo con la presente invención, de la célula de acuerdo con la presente invención o de la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención es típicamente hasta uno o más días después de (una posible) infección por ZIKV, tal como se describe anteriormente.
También es preferible que el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se utilizan para la prevención y/o el tratamiento de la infección por el virus del Zika, donde el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, el ácido nucleico, el vector, la célula o la composición farmacéutica se administran hasta tres meses antes de (una posible) infección por el virus del Zika, preferiblemente hasta un mes antes de (una posible) infección por el virus del Zika, más preferiblemente hasta dos semanas antes de (una posible) infección por el virus del Zika, incluso más preferiblemente hasta una semana antes de (una posible) infección por el virus del Zika y con total preferencia hasta un día antes de (una posible) infección por el virus del Zika. Dicho programa de tratamiento se refiere en particular a un entorno profiláctico.
En general, y en particular en PEP, después de la primera administración del anticuerpo, o de un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, del vector de acuerdo con la presente invención, de la célula de acuerdo con la presente invención o de la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, pueden seguir una o más administraciones posteriores, preferiblemente una dosis única al día o cada dos días, durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 días. También es preferente que después de la primera administración del anticuerpo, o de un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, del vector de acuerdo con la presente invención, de la célula de acuerdo con la presente invención o de la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, puedan seguirse una o más administraciones posteriores, preferiblemente una dosis única una o dos veces por semana durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 semanas. También se prefiere que después de la primera administración del anticuerpo, o de un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, del vector de acuerdo con la presente invención, de la célula de acuerdo con la presente invención o de la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puedan seguirse una o más administraciones posteriores, preferiblemente una dosis única cada 2 o 4 semanas durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 semanas. También se prefiere que después de la primera administración del anticuerpo, o de un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, del vector de acuerdo con la presente invención, de la célula de acuerdo con la presente invención o de la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puedan seguirse una o más administraciones posteriores, preferiblemente una dosis única cada dos o cuatro meses durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 meses. También se prefiere que después de la primera administración del anticuerpo, o de un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, del vector de acuerdo con la presente invención, de la célula de acuerdo con la presente invención o de la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puedan seguir una o más administraciones posteriores, preferiblemente una dosis única una o dos veces al año durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 años.
Preferiblemente, el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se administran en una dosis (única) de 0,005 a 100 mg/kg de peso corporal, preferiblemente en una dosis (única) de 0,0075 a 50 mg/kg de peso corporal, más preferiblemente en una dosis (única) de 0,01 a 10 mg/kg de peso corporal, incluso más preferiblemente en una dosis (única) de 0,05 a 5 mg/kg de peso corporal, y de manera particularmente preferente en una dosis (única) de 0,1 a 1 mg/kg de peso corporal.
El anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención pueden administrarse por diversas vías, tal como la vía oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea, tópica, subcutánea, intranasal, enteral, sublingual, intravaginal o rectal. La administración intravenosa, la administración subcutánea o la administración intramuscular son preferibles, siendo especialmente preferentes la administración intravenosa o la administración subcutánea.
En pacientes embarazadas, el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención también puede administrarse de manera intra o extra-amniótica, por ejemplo mediante inyección.
Terapia de combinación
La administración del anticuerpo, o de un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, del vector de acuerdo con la presente invención, de la célula de acuerdo con la presente invención o de la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención en los métodos y usos según la invención puede llevarse a cabo sola o en combinación con un co-agente (también denominado aquí “componente activo adicional”) que sea particularmente útil para prevenir y/o tratar la infección por ZIKV.
La invención abarca la administración del anticuerpo, o de un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, del vector de acuerdo con la presente invención, de la célula de acuerdo con la presente invención o de la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, administrándose a un sujeto antes, simultánea o secuencialmente con otros regímenes terapéuticos o co-agentes útiles para tratar y/o prevenir la infección por ZIKV. Dicho anticuerpo, ácido nucleico, vector, célula o composición farmacéutica que se administra simultáneamente con dichos co-agentes puede administrarse en la misma composición o en una diferente y por la misma vía de administración o una diferente.
Dichos otros regímenes terapéuticos o co-agentes pueden ser, por ejemplo, un inhibidor del punto de control.
Así, en otro aspecto de la presente invención, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se administran en combinación con un inhibidor de punto de control para los usos (médicos), tal como se describe aquí.
Los inhibidores del punto de control preferentes se dirigen a un bloqueo de la proteína PD-1/PDL-1 y/o del CTLA4 y, por tanto, incluyen anticuerpos anti-PD-1, anticuerpos anti-PD-L1 y anticuerpos anti-CTLA4. Así, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede comprender uno o más de los componentes activos adicionales.
También es preferente que un anticuerpo neutralizante de ZIKV, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se describe aquí, se combine con un anticuerpo de unión a NS1 de ZIKV, o a un fragmento de unión a antígeno del mismo, como se describe aquí, como un componente activo adicional (co-agente). Por tanto, el papel patogénico de NS1 puede bloquearse, además de neutralizar el ZIKV. Por consiguiente, un anticuerpo de unión a NS1 de ZIKV, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se describe aquí, es un componente activo adicional preferente (co-agente). Anticuerpos de unión a NS1 de ZIKV, o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, para la combinación comprenden los seis CDR (CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3), o las secuencias VH/VL (o variantes de secuencias de éstos, manteniéndose los seis CDR), de cualquiera de los antricpuerpos anti-NS1 aquí descritos; con mayor preferencia las seis CDR (CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3), o las secuencias VH/VL (o variantes de secuencia de éstas, donde se mantienen las seis CDR), de cualquier de los anticuerpos ZKA15, ZKA25 y ZKA35 como se describen aquí.
El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno, de acuerdo con la presente invención puede estar presente en la misma composición farmacéutica que el componente activo (co-agente) adicional o, preferiblemente, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno, de acuerdo con la presente invención está comprendido en una primera composición farmacéutica y el componente activo (co-agente) adicional está comprendido en una segunda composición farmacéutica diferente de la primera composición farmacéutica. Por consiguiente, si se contempla más de un componente activo (co-agente) adicional, cada componente activo (co-agente) adicional y el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno, de acuerdo con la presente invención, preferiblemente está comprendido en una composición farmacéutica diferente. Dichas composiciones farmacéuticas diferentes pueden administrarse combinadas/simultáneamente o en momentos separados o en ubicaciones separadas (por ejemplo en zonas individuales del cuerpo).
Preferentemente, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno, de acuerdo con la presente invención y el componente activo (co-agente) adicional proporcionan un efecto terapéutico aditivo o preferiblemente un efecto terapéutico sinérgico. El término “sinergia” se utiliza para describir un efecto combinado de dos o más agentes activos que es mayor que la suma de los efectos individuales de cada agente activo respectivo. Por tanto, cuando el efecto combinado de dos o más agentes resulta en una “inhibición sinérgica” de una actividad o proceso, se pretende que la inhibición de la actividad o proceso sea mayor que la suma de los efectos inhibidores de cada agente activo respectivo. El término “efecto terapéutico sinérgico” se refiere a un efecto terapéutico observado con una combinación de dos o más terapias, siendo el efecto terapéutico (medido por cualquiera de diversos parámetros) mayor que la suma de los efectos terapéuticos individuales observados con las terapias individuales respectivas.
Otros usos y kits
En otros adicional, la presente invención también proporciona el uso del anticuerpo, o de un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, del vector de acuerdo con la presente invención, de la célula de acuerdo con la presente invención o de la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención para controlarin vitrola calidad de una vacuna anti-Zika, verificando que el antígeno de dicha vacuna contiene el epítopo específico en la conformación correcta. Los antígenos preferentes comprendidos por tales vacunas anti-Zika a verificar incluyen la proteína de envoltura de ZIKV o cualquier otra molécula/complejo que comprende o consiste en (i) el dominio III de la proteína E de ZIKV (EDIII) tal como se describe anteriormente, o (ii) un epítopo de ZIKV cuaternario tal como se describe anteriormente.
Además, la presente invención también proporciona el uso del anticuerpo, o de un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, en el diagnósticoin vitrode una infección por el virus Zika.
Además, también se proporciona el uso del anticuerpo, o de un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, para determinarin vitrosi una muestra de sangre aislada (por ejemplo sangre completa, suero y/o plasma) está infectada con el virus del Zika.
Los métodos de diagnósticoin vitropueden incluir poner en contacto un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo con una muestra. Dichas muestras pueden aislarse de un sujeto, por ejemplo una muestra de tejido aislada tomada de, por ejemplo, fosas nasales, cavidades sinusales, glándulas salivales, pulmón, hígado, páncreas, riñón, oído, placenta, tracto digestivo, corazón, ovarios, pituitaria, adrenales, tiroides, cerebro, piel o sangre, preferiblemente suero o plasma. Los métodos de diagnóstico también pueden incluir la detección de un complejo antígeno/anticuerpo, en particular después de la puesta en contacto de un anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo con una muestra. Típicamente, tal paso de detección se lleva a cabo en laboratorio, es decir, sin contacto con el cuerpo humano o animal. Los expertos en la técnica conocen bien ejemplos de métodos de detección e incluyen, por ejemplo, ELISA (ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas).
En otro aspecto, la presente invención también proporciona un kit de partes que comprende al menos un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, al menos un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, al menos un vector de acuerdo con la presente invención, al menos una célula de acuerdo con la presente invención y/o al menos una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención. Además, el kit comprende medios para la administración del anticuerpo, o del fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, del vector de acuerdo con la presente invención, de la célula de acuerdo con la presente invención o de la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, tal como una jeringa o un vial, un prospecto y/o un co-agente que se administrará tal como se describe anteriormente.
DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1: muestra la reactividad (ELISA) y la actividad neutralizadora de ZIKV y DENV1 de anticuerpos derivados de cuatro donantes inmunes a ZIKV (ZKA, ZKB, ZKC y ZKD) para la proteína E de ZIKV y DENV1-4 y el dominio EDIII de la proteína E de ZIKV; NNB, anticuerpos neutralizantes sin unión a la proteína E.
Figura 2: muestra la reactividad (ELISA) de anticuerpos derivados de cuatro donantes inmunes a ZIKV (ZKA, ZKB, ZKC y ZKD) a la proteína NS1 de ZI<k>V, DENV1-4 y otros flavivirus. YFV - virus de la fiebre amarilla; WVN-virus del Nilo Occidental; JEV -virus de la encefalitis japonesa y TBEV - virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (nd, no determinado).
Figura 3: muestra la unión de los anticuerpos ZKA190, ZKA78 y ZKA64 a la proteína E de ZIKV y DENV1 y a las proteínas de EDIII de ZIKV tal como se mide mediante ELISA.
Figura 4: muestra la unión de los anticuerpos ZKA185 y ZKA190 a la proteína E de ZIKV, las proteínas VLP de DENV1 y las proteínas de EDIII de ZIKV tal como se mide mediante ELISA.
Figura 5: muestra la unión de los anticuerpos ZKA15, ZKA25 y ZKA35 a las proteínas NS1 de ZIKV y DENV1-4 de acuerdo tal como se mide mediante ELISA.
Figura 6: muestra, para el Ejemplo 3, el mapeo de sitios antigénicos de la proteína NS1 de ZIKV utilizando estudios de unión a octetos de competencia cruzada. (A-B) Matriz de competencia cruzada realizada con Octet en 24 mAbs específicos para NS1 de ZIKV (A) o con reactividad cruzada para NS1 de DENV (B). , falta de unión del anticuerpo secundario; /-, pérdida parcial de unión del mAb secundario; -, unión del mAb secundario. Celdas tachadas, no analizadas. (C) Mapa de los sitios antigénicos seleccionados por los mAb específicos de NS1 de ZIKV, según se define usando BLI (Octet).
Figura 7: muestra, para el Ejemplo 4, el ensayo de bloqueo de unión utilizando mAb ZKA35 como sonda para detectar NS1 de ZIK<v>en plasma de donantes inmunes a ZIKV (n = 4), inmunes a DENV (n = 5) y de control (n = 48) (dilución 1/10). Las muestras de plasma se analizaron para determinar su capacidad para unirse a NS1 (puntos sin relleno) e inhibir la unión del mAb ZKA35 biotinilado a NS1 (puntos con relleno).
Figura 8: muestra, para el Ejemplo 5, la actividad neutralizante de los anticuerpos ZKA190, ZKA64, ZKA64-LALA, ZKA230 y ZKA78 contra ZIKV (cepa H/PF/2013) y DENV1 en células Vero tal como se mide mediante una citometría de flujo (% de células infectadas).
Figura 9: muestra, para el Ejemplo 5, la actividad neutralizante de los anticuerpos ZKA190, ZKA64, ZKA185, ZKA230 y ZKA78 contra ZIKV (cepa H/PF/2013) en células Vero, tal como se mide mediante lectura de viabilidad celular (wst-1, Roche).
Figura 10: muestra, para el Ejemplo 6, la actividad de potenciación de la infección (ADE, potenciación dependiente de anticuerpos) de los anticuerpos ZKA190, ZKA64, ZKA64-LALA, ZKA185, ZKA230 y ZKA78 para ZIKV (cepa H/PF/2013) en células K562 no permisivas tal como se mide mediante citometría de flujo (% de células infectadas).
Figura 11: muestra, para el Ejemplo 6, que cuatro plasmas inmunes a ZIKV y un plasma inmune a DENV mostraron una capacidad similar para potenciar la infección por ZIKV de células K562 (panel superior). Este efecto de ADE se bloqueó completamente en los cinco plasmas inmunes mediante el anticuerpo ZKA64-LALA específico de EDIII (panel inferior).
Figura 12: muestra la alineación de aminoácidos de la región EDIII de 39 cepas ZIKV del linaje asiático desde 2013 (incluyendo la cepa prototípica MR766 del linaje africano aislada en 1947).
Figura 13: muestra, para el Ejemplo 5, la actividad neutralizante del anticuerpo ZKA190 y ZKA190-LALA contra tres cepas de ZIKV (H/PF/2013, M<r>766 y MRS_OPY_Martinique_PaRi_2015) en células Vero, tal como se mide por citometría de flujo (% de células infectadas).
Figura 14: muestra, para el Ejemplo 7, el análisis de bloqueo de unión de NS1 de residentes europeos. Se muestran los valores del ensayo de bloqueo de unión para las muestras recolectadas en Italia y Suiza. Se muestran los valores del ensayo de bloqueo de unión en muestras de individuos infectados con ZIKV, primarios y secundarios infectados con DENV, WNV y CHIKV, y un panel de muestras de donantes de sangre sanos de Suiza.
Figura 15: muestra, para el Ejemplo 8, la neutralización de mAb ZKA190 y C8 probados contra un panel de cuatro cepas de ZIKV, tal como se determina por el porcentaje de células Vero infectadas en presencia de cantidades crecientes de mAb (A). También se muestran los valores de IC<50>(B) y las estadísticas (C). Los datos son representativos de al menos dos experimentos independientes.
Figura 16: muestra, para el Ejemplo 9, la neutralización y mejora de la infección por ZIKV por el anticuerpo ZKA190. (A) Neutralización de la infección por la cepa ZIKV PRVABC59 de hNPC por ZKA190, ZKA190-LALA y un mAb de control tal como se determinada por el ensayo de placa en células Vero (panel izquierdo) e inmunofluorescencia indirecta de hNPC infectadas usando un anticuerpo anti-E etiquetado con fluoróforo (panel derecho). (B) ADE de infección por ZIKV de células K562 no permisivas por ZKA190 y ZKA190-LALA. (C)<a>D<e>inducida en células K562 cuando ZIKV se preincuba con diluciones seriadas de suero plasmático de diferentes pacientes positivos a ZIKV (panel izquierdo). Cuando se añade ZKA190 LALA a los complejos de suero ZIKV, se inhibe la ADE (panel derecho). (D) ADE inducida en células K562 cuando ZIKV se preincuba con diluciones seriadas de un mAb con reacción cruzada con prM (DV62) derivado de un donante inmune a DENV. ZKA190-LALA inhibe el ADE de ZIKV cuando está complejado con el anticuerpo DV62 reactivo a prM. (E) Efecto sobre ADE inducida por la dilución de potenciación de pico de un plasma DENV2 (panel izquierdo) o mAb DV62 anti-prM (panel derecho) por diluciones en serie de los mAb indicados.
Figura 17: muestra, para el Ejemplo 10, la identificación del epítopo ZKA190 y el análisis de su conservación en cepas de ZIKV. (A) Superposición de espectros [15N, 1H]-HSQC de EDIII de ZIKV etiquetado con 15N en ausencia (negro) o presencia (rojo) de Fab de ZKA190 sin etiquetar. Las diferencias identifican los residuos de EDIII afectados por la unión del anticuerpo. (B) Mapeo del epítopo de RMN de Fab de ZKA190 en complejo con EDIII de ZKV. La perturbación de desplazamientos químicos (CSP, eje Y) se representa en función del número de residuos de EDIII. Los residuos afectados por la unión del anticuerpo están en rojo. (C) Los residuos en el bucle FG identificados por el mapeo del epítopo de RMN están parcialmente ocultos en la proteína E del mol A, pero en gran parte se exponen en los moles B y C. El EDIII de la proteína E se muestra de color azul. Los residuos identificados por el mapeo del epítopo de RMN se muestran de color magenta, excepto los del bucle FG, que se muestran en verde. Las proteínas E adyacentes se muestran como una superficie gris. (D) Nivel de conservación de residuos de aminoácidos en el epítopo ZKA190 calculado mediante análisis de secuencia de 217 cepas de ZIKV encontradas en las bases de datos de Recursos del ZIKV (NCBI) al 24 de noviembre de 2016. (E) Representación de libro abierto que muestra la complementariedad de carga entre el epítopo y el paratopo del resultado de acoplamiento. Los límites del epítopo y paratopo están rodeados con un círculo de color verde. Los bordes entre las cadenas pesada y ligera de Fab y su huella correspondiente en EDIII se muestran como líneas punteadas de color amarillo.
Figura 18: muestra, para el Ejemplo 10, el epítopo ZKA190 identificado por RMN y acoplamiento. (A) Representación en viñeta de las 12 estructuras de RMN de energía más baja de EDIII de ZIKV, con residuos afectados por la unión de ZKA190 en color rojo. La flexibilidad en el extremo N-terminal del constructo es aparente. (B) Modelo del complejo ZKA190:EDIII derivado por acoplamiento computacional y simulación molecular validado por los resultados de RMN. El epítopo identificado por RMN en EDIII (gris) está en rojo. La cadena pesada y ligera de ZKA190 se muestran de color verde oscuro y claro, respectivamente. Los residuos de EDIII que afectan o no a la unión del anticuerpo cuando se mutan se muestran como barras de color naranja y azul, respectivamente. (C) El epítopo ZKA190 identificado por RMN (rojo) está accesible en la superficie del virus (blanco).
Figura 19: muestra, para el Ejemplo 10, la unión de EDIII de tipo silvestre o mutada a IgG de ZKA190. Se muestran los datos SPR y cinéticas de unión. Los mutantes de EDIII que afectan (resaltados en rojo) o que no afectan la unión se muestran como se indica en la figura.
Figura 20: muestra, para el Ejemplo 11, los resultados de los experimentos de microscopía confocal. ZIKV incubado con una concentración superior a 10'000 veces el valor de IC<50>de Fab de ZKA190 o IgG completa se añadió a células Vero. El complejo ZIKV:anticuerpo se detecta dentro de las células (verde) y se localiza junto con endosomas (superposición de rojo, amarillo). Los endosomas y los orgánulos ácidos están marcados con Lysotracker rojo; el colorante Alexa-488 conjugado con ZKA190 se muestra en color verde. Los núcleos se tiñen con DAPI (azul).
Figura 21: muestra, para el Ejemplo 12, la eficacia profiláctica y terapéutica de ZKA190. (A) ZKA190 protege fuertemente contra la infección por ZIKV cuando se administra de forma profiláctica a ratones (A129 en (A) y AG129 en (B) expuestos a una dosis letal de la cepa MP17451 de ZIKV. Los experimentos usaron N=4-8 ratones por grupo. Se muestran las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier (A). La significación se determinó utilizando la prueba de rangos logarítmicos de Mantel-Cox. Panel A superior izquierdo: ZKA190 a 5, 1 y 0,2 mg/kg frente a mAb de control, P = 0,0031; ZKA190 a 0,04 mg/kg frente a mAb de control, P = 0,0116; ZKA190-LALA a 5, 1, 0,2 y 0,04 mg/kg frente a mAb de control, P = 0,0031. Panel A superior derecho: Puntuación de morbilidad de los ratones monitoreados durante un período de 14 a 15 días (se utilizaron dos métodos de calificación diferentes; ver Dowall, SD, Graham, VA, Rayner, E., Atkinson, B., Hall, G., Watson, RJ, Bosworth, A., Bonney, LC, Kitchen, S., & Hewson, R. (2016). A Susceptible Mouse Model for Zika Virus Infection. PLoS Negl Trop Dis 10, e0004658-13). Panel A, paneles inferiores: peso corporal de los ratones. Paneles B: Se administró ZKA190 o ZKA190-LALA a 15 mg/kg en diferentes intervalos de tiempo después de la infección por ZIKV. Panel B superior izquierdo: Se muestra una curva de supervivencia de Kaplan-Meier. Los experimentos usaron N=5 ratones por grupo. La significación se determinó utilizando la prueba de rangos logarítmicos de Mantel-Cox. Se administraron ZKA190 y ZKA190-LALA en los días 1, 2, 3 o 4 frente al control, P = 0,0016. Panel B superior derecho: Calificación de morbilidad de los ratones monitoreados durante 14 días de acuerdo con (Dowall et al., 2016). Los ratones fueron monitoreados durante un período de 14 días para detectar la pérdida de peso corporal (Panel B, paneles inferiores). El anticuerpo de control es MPE8 específico para la proteína F del RSV (Corti, D., et al. Cross-neutralization of four paramyxoviruses by a human monoclonal antibody. Nature 501,439-443 (2013)).
Figura 22: muestra, para el Ejemplo 12, la eficacia profiláctica del mAb de ZKA190 específico para EDIII anti-ZIKV contra las cepas MP1741 de ZIK<v>. (A) Se muestra la viremia medida como UFP/ml en el día 5 en la sangre de todos los animales. (B) La carga viral se midió como copias genómicas/ml mediante PCRq en el día 5 en sangre de todos los animales y en tejidos indicados cuando se sacrificaron los animales al final del estudio o cuando se cumplieron los criterios de valoración humanitarios. (C) Los ratones fueron monitoreados durante un período de 14 días para determinar la pérdida de peso corporal (D) Concentración de IgG en suero humano en las muestras de sangre del día 5. La significación se determinó en comparación con el tratamiento con anticuerpos de control mediante la prueba de U de Mann-Whitney no paramétrica para datos no apareados. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p<0,001.
Figura 23: muestra, para el Ejemplo 12, la eficacia terapéutica del mAb de ZKA190 específico para EDIII anti-ZIKV. (A) Las cargas virales se midieron como UFP en el día 5 en la sangre de todos los animales. (B) Las cargas virales se midieron como copias genómicas por qPCR en el día 5 en la sangre de todos los animales, así como en la sangre y los tejidos indicados cuando los animales se sacrificaron al final del estudio o cuando se cumplieron los criterios de valoración humanitarios. La significación se determinó en comparación con el tratamiento con anticuerpos de control mediante la prueba de U de Mann-Whitney no paramétrica para datos no apareados. *p < 0,05; **p < 0,01. (C) Concentración de IgG en suero humano en muestras de sangre del día 5.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Aislamiento de anticuerpos específicos contra ZIKV y producción de anticuerpos monoclonales
Se aislaron células B de memoria IgG+ a partir de células mononucleares de sangre periférica PBMC crioconservadas de cuatro donantes infectados con ZIKV (ZKA, ZKB, ZKC y ZKD) utilizando microesferas CD22 (Miltenyi Biotec), seguido de un agotamiento de células que portaban IgM, IgD e IgA mediante clasificación celular Las células B de memoria de los donantes infectados con ZIKV se inmortalizaron posteriormente con EBV (virus de Epstein-Barr) y oligodesoxinucleótido CpG 2006 (CpG) en múltiples pocillos replicados como se describe anteriormente (Traggiai, E. et al., Nat. Med. 10, 871-875, 2004) y los sobrenadantes del cultivo se analizaron posteriormente en un cribado primario utilizando en paralelo un ensayo de micro-neutralización con 384 pocillos y un ensayo de unión (ELISA) para probar su unión a la proteína<n>S1 de ZIKV o a la proteína E de ZIKV. Los resultados del ensayo de unión se muestran en la Figura 1 (unión a la proteína E de ZIKV) y en la Figura 2 (unión a la proteína NS1 de ZIKV).
Los ensayos de neutralización se realizaron en células Vero. En una placa de 384 pocillos, se incubó ZIKV H/PF/2013 que produjo una tasa de infección (multiplicidad de infección, MOI) de 0,35 con sobrenadantes durante 1 hora al 37% (5% de CO<2>) antes de la adición a las 5.000 células vero previamente sembradas. Éstas se incubaron durante 5 días más, tras lo cual se eliminó el sobrenadante y se añadió el reactivo WST-1 (Roche). Los cultivos positivos se recolectaron y expandieron. De los cultivos positivos se recuperaron las secuencias VH y VL mediante RT-PCR. Los anticuerpos se clonaron en vectores de expresión de IgG1 e Ig kappa o Ig lambda humana (proporcionados amablemente por Michel Nussenzweig, Rockefeller University, Nueva York, EE.UU.) Esencialmente como se describe en Tiller T, Meffre E, Yurasov S, Tsuiji M, Nussenzweig MC, Wardemann H (2008) Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods 329: 112-124. Se produjeron anticuerpos monoclonales a partir de células B inmortalizadas con EBV o mediante transfección transitoria de células FreeStyle™ 293 (Invitrogen). Se recolectaron los sobrenadantes de células B o células transfectadas, y las IgG se purificaron por afinidad mediante cromatografía de proteína A o proteína G (GE Healthcare) y se desalaron frente a PBS.
La Figura 1 proporciona una visión general de los anticuerpos neutralizantes de ZIKV seleccionados (véanse las Tablas 1 y 2 para las secuencias de aminoácidos de sus CDR y las regiones variables de la cadena pesada/ligera). Las dos últimas columnas de la Figura 1 proporcionan las actividades de neutralización (IC<50>) de ZIKV y DENV1 (si se analizaron). Las otras columnas proporcionan actividades de unión (EC<50>) de los anticuerpos contra la proteína E de ZIKV (ZIKV E), la proteína E de DENV1 (DENV1 E), la proteína E de DENV2 (DENV2 E), la proteína E de DENV3 (DENV3 E), la proteína E de DENV4 (DENV4 E), la partícula tipo virus de DENV1 (DENV1 VLP), la partícula tipo virus de<d>E<n v>2 (DENV2 VLP), la partícula tipo virus de DENV3 (DENV3 VLP), la partícula tipo virus de DENV4 (DENV4 VLP) y al dominio EDIII de la proteína E de ZIKV (DIII ZKA).
Se aislaron anticuerpos adicionales por su capacidad para unirse a la proteína NS1 de ZIKV (véase la Figura 2). Los cultivos positivos se recolectaron y expandieron. De los cultivos positivos se recuperaron las secuencias VH y VL mediante RT-PCR. Los anticuerpos se clonaron en vectores de expresión de IgG1 e Ig kappa o Ig lambda humana (proporcionados amablemente por Michel Nussenzweig, Rockefeller University, Nueva York, EE.UU.) Esencialmente como se describe en Tiller T, Meffre E, Yurasov S, Tsuiji M, Nussenzweig MC, Wardemann H (2008) Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods 329: 112-124. Se produjeron anticuerpos monoclonales a partir de células B inmortalizadas con EBV o mediante transfección transitoria de células FreeStyle™ 293 (Invitrogen). Se recolectaron los sobrenadantes de células B o células transfectadas, y las IgG se purificaron por afinidad mediante cromatografía de proteína A o proteína G (GE Healthcare) y se desalaron frente a PBS.
La Figura 2 proporciona una visión general de los anticuerpos de unión a la proteína NS1 de ZIKV seleccionados (véanse Tablas de Secuecnias u número de secuencia más abajo para las secuencias de aminoácidos de sus CDR y las regiones variables de la cadena pesada/ligera). Específicamente, la Figura 2 proporciona actividades de unión (EC<50>) de los anticuerpos contra la proteína NS1 de Z iKv (ZIKV NS1), la proteína Ns 1 de DENV1 (DENV1 NS1), la proteína NS1 de DENV2 (DENV2 NS1), la proteína NS1 de DENV3 (DENV3 NS1), la proteína NS1 de DENV4 (DENV4 NS1), la proteína N<s>1 del virus de la fiebre amarilla (YFV NS1), la proteína NS1 del virus del Nilo Occidental (WNV NS1), la proteína NS1 del virus de la encefalitis japonesa (JEV n S1) y la proteína NS1 del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV NS1).
Ejemplo 2: Caracterización de los anticuerpos ZKA190, ZKA185, ZKA230, ZKA230, ZKA64 (según la presente invención) y de ZKA78 (no de acuerdo con la invención)
En el Ejemplo 1, se identificó un gran número de anticuerpos neutralizantes de ZIKV y se caracterizaron por su especificidad a ZIKV, en particular a la proteína E de ZIKV y EDIII de ZIKV, así como por su reactividad cruzada hacia DENV. Los anticuerpos ZKA190 (SEQ ID NO: 1-18), ZKA185 (SEQ ID NO: 19-36), ZKA230 (SEQ ID NO: 37 54), ZKA64 (SEQ ID NO: 73-90) y ZKA 78 (SEQ ID NO: 55-72) descritos en el Ejemplo 1 posteriormente se seleccionaron y analizaron contra la proteína E de ZIKV (“ZIKV”), EDIII de ZIKV (“DIIIZI”) y también se analizaron contra la proteína E del virus del dengue (DENV, serotipo número 1) mediante ELISA. Para ello, se utilizó un ensayo ELISA estándar. Brevemente, las placas ELISA se recubrieron con proteína E de ZIKV a 1 o 3 pg/ml, se bloquearon con FCS al 10% en PBS, se incubaron con sueros o anticuerpos humanos y se lavaron. Los anticuerpos unidos se detectaron mediante incubación con IgG anti-humana de cabra conjugada con fosfatasa alcalina (Southern Biotech). A continuación, se lavaron las placas, se añadió sustrato (p-NPP, Sigma) y se leyeron las placas a 405 nm. Las afinidades relativas de la unión del anticuerpo monoclonal se determinaron midiendo la concentración de anticuerpo (EC<50>) requerida para lograr una unión máxima del 50% en saturación.
Los resultados se muestran en la Figura 3 y 4. Cabe destacar que ZKA64 y ZKA190 se unieron a la proteína E de ZIKV y el EDIII de ZIKV (“DIII ZI”) con bajos valores de EC<50>, lo que indica que ZKA64 y ZKA190 se unen al dominio III de la proteína E de ZIKV (EDIII). ZKA78 se unió a la proteína E de ZIKV, pero no al EDIII de ZIKV, lo que indica que ZKA78 se une a la proteína E de ZIKV, pero no se dirige a la región del EDIII. A pesar de su considerable actividad neutralizante de ZIKV (véase Fig. 1), los anticuerpos ZKA185 y ZKA230 no mostraron ninguna unión detectable a la proteína E de ZIKV ni al EDIII de ZIKV (Fig. 4). En consecuencia, ZKA185 y ZKA230 se denominaron anticuerpos “neutralizantes sin unión E” (NNB). Se supone que esos anticuerpos NNB reconocen los epítopos cuaternarios que se muestran en los viriones infecciosos de ZIKV, pero no en las proteínas solubles.
Además, ninguno de ZKA190, ZKA185, ZKA230 y ZKA64 mostró ninguna unión detectable a las proteínas E de DENV (Figura 1, serotipos DENV1-4, y Figuras 3 y 4), lo que indica que ZKA190, ZKA185, ZKA230 y ZKA64 son específicos para ZIKV y no tienen una reacción cruzada al virus del dengue. Por el contrario, ZKA78, que se supone que se une al EDI/II de ZIKV, pero no al EDIII de ZIKV (véase Fig. 3), se unió a proteínas E de DENV (Figuras 1 y 3), lo que indica que ZKA78 es un anticuerpo con reacción cruzada vinculante tanto a ZIKV como a DENV.
Para confirmar aún más esos resultados, los anticuerpos de unión a la proteína E de ZIKV ZKA190, ZKA64 y ZKA78 se analizaron adicionalmente contra la proteína E del virus del dengue (DENV, serotipos número 1-4). ZKA64 y ZKA190 no se unieron a la proteína E de DENV1-4, lo que confirma que ZKA64 y ZKA190 son específicos para ZIKV. Por el contrario, ZKA78, se unió a DENV1-4 E, lo que confirma que ZKA78 es un anticuerpo con reactividad cruzada que se une a la proteína E de ZIKV y DENV (véase Fig. 1).
Ejemplo 3: Caracterización de los anticuerpos específicos contra la proteína NS1 de ZIKV (no abarcado por el objeto de las reivindicaciones) para el diagnóstico serológico
En el Ejemplo 1, se identificó un gran número de anticuerpos reactivos contra NS1 y posteriormente se caracterizaron por su especificidad a NS1 de ZIKV y reactividad cruzada hacia otras proteínas NS1 de flavivirus (Fig. 2). Los anticuerpos ZKA15 (SEQ ID NO: 91-108), ZKA25 (SEQ ID NO: 109-126) y ZKA35 (SEQ ID NO: 127 144) se caracterizaron adicionalmente por la unión a las proteínas NS1 de ZIKV y NS1 de DENV1, NS1 de DENV2, NS1 de DENV3 y NS1 de DENV4. Para ello, se utilizó un ensayo ELISA estándar. Brevemente, las placas de ELISA se recubrieron con proteína NS1 de ZIKV a 1 pg/ml, se bloquearon con FCS al 10% en PBS, se incubaron con sueros o anticuerpos humanos y se lavaron. Los anticuerpos unidos se detectaron mediante incubación con IgG anti-humana de cabra conjugada con fosfatasa alcalina (Southern Biotech). A continuación, se lavaron las placas, se añadió sustrato (p-NPP, Sigma) y se leyeron las placas a 405 nm. Las afinidades relativas de la unión del anticuerpo monoclonal se determinaron midiendo la concentración de anticuerpo (EC<50>) requerida para lograr una unión máxima del 50% en la saturación.
Los resultados se muestran en la Figura 5. Los tres anticuerpos (ZKA15, ZKA25 y ZKA35) se unieron con alta afinidad a la proteína NS1 de ZIKV, pero no a los antígenos de NS1 de DENV1-4 (Fig. 5).
Para investigar más a fondo la unión de los anticuerpos a la proteína NS1 de ZIKV, se utilizaron ensayos de competencia de interferometría de biomasa. Se generó una matriz de competencia cruzada utilizando la interferometría de biocapa (BLI; Octet) en 13 anticuerpos específicos para NS1 de ZIKV (es decir, sin reactividad cruzada con NS1 de DEn V), específicamente los anticuerpos ZKA24, ZKA15, ZKA32, ZKA19, ZKA50, ZKA37, ZKA46, ZKA10, ZKA48, ZKA35, ZKA25, ZKA44 y ZKA30 (véase la Fig. 6A). Como se puede inferir a partir de la Fig. 2, ninguno de esos 13 anticuerpos mostró una unión detectable a la proteína NS1 de DENV.
Los ensayos de competencia y la determinación de los sitios antigénicos se determinaron a 37 °C con un sistema Octet RED96, FortéBio. La proteína ZIKV-NS1 diluida a 2,5 pg/ml en PBS se inmovilizó durante 7-9 minutos sobre la superficie de un chip sensor recubierto con APS. Los biosensores recubiertos se colocaron en pocillos que contenían una solución tampón de bloqueo (0,1% BSA en PBS) durante 6 minutos para bloquear los sitios de unión del biosensor libres. A continuación, los biosensores recubiertos se incubaron durante 8 minutos con un conjunto de mAb purificados únicos específicos para ZIKV-NS1 diluidos en solución tampón de bloqueo a 10 pg/ml. Después de la unión del primer conjunto de mAb (paso 1), los biosensores se movieron a pocillos que contenían diferentes mAb durante 8 minutos (paso 2). La asociación del segundo mAb dio como resultado el reconocimiento de un sitio antigénico diferente en comparación con el primer mAb (por ejemplo, no competencia). La competencia o la competencia parcial se determinaron en el paso 2 cuando no se detectó asociación o se detectó una asociación baja, respectivamente. Se creó una matriz de competencia cruzada mediante varias ejecuciones de competiciones para predecir el mapeo de sitios antigénicos en la proteína NS1 de ZIKV.
Los resultados se muestran en las Figuras 6A y 6C. En primer lugar, todos los anticuerpos específicos contra la proteína NS1 de ZIKV analizados se unieron a los sitios antigénicos S1 y/o S2 (Fig. 6A). Sin embargo, algunos de los anticuerpos no compitieron con otros. Por ejemplo, ZKA15 no compitió por la unión con ZKA25 y ZKA35 y viceversa (Fig. 6A). En consecuencia, el anticuerpo ZKA15 se asignó al sitio antigénico S1, mientras que los anticuerpos ZKA25 y ZKA35 se asignaron al sitio antigénico S2 (Fig. 6C). En resumen, en función de los anticuerpos utilizados, se identificaron los sitios antigénicos (S1 y S2) en la proteína NS1 de ZIKV (Fig. 6C).
Además, se investigó la unión de 10 anticuerpos de reacción cruzada a la proteína NS1 de ZIKV y a la proteína NS1 de DENV (específicamente, ZKA18, ZKA29, ZKA39, ZKA53, ZKA54, ZKB19, ZKB23, ZKC29, ZKC33 y ZKC34; Fig. 6B) a los sitios antigénicos S1 y/o S2 en la proteína NS1 de ZIKV. Como se puede inferir a partir de la Fig. 2, los 10 anticuerpos mostraron unión a la proteína NS1 de DENV. Dichos 10 anticuerpos con reactividad cruzada se analizaron en un ensayo de competencia cruzada tal como se describió anteriormente (para los anticuerpos específicos de NS1 de ZIKV) contra el anticuerpo específico del S1 de NS1 de ZIKV, ZKA15, y contra el anticuerpo específico del S2 de NS1 de ZIKV, ZKA35.
Los resultados se muestran en la Fig. 6B. Curiosamente, ninguno de los diez anticuerpos reactivos cruzados analizados compitió con ZKA15 y/o ZKA35 por la unión a los sitios antigénicos S1 y/o S2 en NS1 de ZIKV (Figura 6B). Estos resultados muestran que el sitio antigénico de ZKA15 y ZKA35 no está dirigido por anticuerpos con reacción cruzada con NS1. Por tanto, los sitios antigénicos S1 y S2 de NS1 fueron el blanco de ZIKV específicos, pero no de anticuerpos de reacción cruzada.
Ejemplo 4: Uso de anticuerpos específicos contra la proteína NS1 de ZIKV (no abarcados por el objeto de las reivindicaciones) en el diagnóstico de la infección por ZIKV
En el presente Ejemplo, se investigó la utilidad de los anticuerpos específicos contra la proteína NS1 de ZIKV (no cubiertos por el objeto de las reivindicaciones) en el diagnóstico de la infección por ZIKV. Más específicamente, se determinó el uso de anticuerpos específicos contra la proteína NS1 de ZIKV invención para detectar específicamente la presencia o ausencia de anticuerpos contra la proteína NS1 de ZIKV en muestras de plasma de donantes infectados con ZIKV o DENV.
Para este fin, se utilizó un ensayo de “bloqueo de unión”. En particular, se midió la capacidad de los anticuerpos contra el plasma reactivos con la proteína NS1 de ZIKV para inhibir la unión del anticuerpo biotinilado ZKA35 a la proteína NS1 de ZIKV. Para ello, el anticuerpo ZKAK específico para ZIKV ZKA35 se biotiniló utilizando el kit de biotinilación en fase sólida EZ-Link NHS-PEO (Pierce). El anticuerpo ZKA35 etiquetado se analizó para determinar la unión a la proteína NS1 de ZIKV a fin de determinar la concentración óptima de ZKA35 para lograr una unión máxima del 70%. Las muestras de plasma de los donantes inmunes a ZIKV (n=4), DENV (n=5) y el plasma de control (n=48) (dilución 1/10) se añadieron a placas de ELISA recubiertas con NS1 de ZIKV. Después de 1 h, se añadió el anticuerpo anti-NS1 de ZIKV biotinilado, ZKA35, a la concentración, con lo que se consiguió una unión máxima de 70% y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se lavaron las placas, se añadió sustrato (p-NPP, Sigma) y se leyeron las placas a 405 nm. El porcentaje de inhibición se calculó de la siguiente manera: ((1-[(DO muestra-DO ctrl neg)/(DO ctrl pos-DO ctrl neg)]) * 100
Los resultados se muestran en la Figura 7. Cabe destacar que la unión del anticuerpo ZKA35 al sitio antigénico S2 en NS1 fue inhibida sólo por muestras de plasma de donantes inmunes a ZIKV, pero no por donantes inmunes a DENV, y su unión tampoco fue inhibida por 48 muestras de control de plasma (Figura 7). En consecuencia, este ensayo puede usarse para detectar específicamente infecciones por ZIKV clínicas y subclínicas a nivel de la población.
Ejemplo 5: Los anticuerpos ZKA190, ZKA185, ZKA230 y ZKA64 de acuerdo con la presente invención neutralizan potentemente la infección por ZIKV
Los anticuerpos aislados ZKA190, ZKA185, ZKA230, ZKA64 (de acuerdo con la presente invención) y ZKA78 (no cubierto por el objeto de las reivindicaciones) se analizaron para determinar su capacidad para neutralizar la infección por ZIKV y DENV1in vitro.
La neutralización de la infección por DENV y ZIKV mediante anticuerpos se midió utilizando un ensayo basado en la citometría de flujo de micro-neutralización. Se mezclaron diferentes diluciones de anticuerpos con ZIKV (MOI de 0,35) o DENV1 atenuado (todos a MOI de 0,04) durante 1 hora a 37 °C y se añadieron a 5.000 células Vero/pocillo en placas de fondo plano de 96 pocillos. Después de cuatro días para ZIKV y cinco días para DENV, las células se fijaron con formaldehído al 2%, se permeabilizaron en PBS al 1% de FCS al 0,5% de saponina y se tiñeron con el mAb 4G2 de ratón. Las células se incubaron con una IgG anti-ratón de cabra conjugada con Alexa Fluor488 (Jackson Immuno-Research, 115485164) y se analizaron mediante citometría de flujo. En otros casos, los datos de neutralización de ZIKV también se determinan midiendo la viabilidad celular utilizando el reactivo WST-1 (Roche). El título de neutralización (concentración inhibidora del 50% [IC<50>]) se expresó como concentración de anticuerpos que reducían la infección en un 50% en comparación con los pocillos de control de sólo células.
Los resultados se muestran en las Figuras 8, 9 y 13. Los mAb ZKA64 y ZKA190 específicos de EDIII y el mAb ZKA230 de NNB eran altamente potentes en la neutralización de ZIKV (cepa H/PF/2013), con valores de IC<50>de 93, 9 y 10 ng/ml, respectivamente (Figura 8, panel superior). Por el contrario, el anticuerpo ZKA78 con reactividad cruzada sólo neutralizó parcialmente la infectividad por ZIKV y la infectividad por DENV1 neutralizada de forma cruzada (Figura 8, paneles inferiores). Se obtuvieron datos similares al medir el efecto citopático inducido por ZIKV de acuerdo con lo medido con el reactivo WST-1 (Figura 9). En este segundo ensayo, el anticuerpo NNB ZKA185 también se incluyó en el panel de anticuerpos analizados y mostró una IC<50>similar a la de los anticuerpos ZKA190 más potentes (específicos para EDIII) y ZKA230 (NNB).
Es importante señalar que los anticuerpos ultra potentes ZKA64 y ZKA190, además de su capacidad para neutralizar la cepa ZIKV H/PH/2013 (presente ejemplo), también se unen a la proteína E y al EDIII derivados de las cepas MR766 y SPH2015 de ZIKV, respectivamente (Figura 1 y Figura 3). También se confirmó que ZKA190 y ZKA190-LALA neutralizan efectivamente dos cepas de ZIKV adicionales (MR766 y MRS_OPY_Martinique_PaRi_2015) (Figura 13). En conjunto, los resultados indican que los anticuerpos ultra potentes ZKA64 y ZKA190 reaccionan de forma cruzada con múltiples cepas de ZIKV que pertenecen a diferentes genotipos y orígenes (África oriental y asiática desde Uganda, Polinesia francesa, Martinica y Brasil).
Ejemplo 6: La mutación “LALA” inhibe la potenciación dependiente de anticuerpos de la infección por ZIKV mediante anticuerpos séricos
Los anticuerpos neutralizantes también se analizaron para determinar su capacidad para mejorar la infección por ZIKV en las células K562 no permisivas (ensayo de potenciación dependiente de anticuerpos, ensayo ADE). La ADE se midió mediante un ensayo basado en flujo utilizando células K562. Los anticuerpos y ZIKV H/PF/2013 (MOI de 0,175) se mezclaron durante 1 hora a 37 °C y se añadieron a 5.000 células K562/pocillo. Después de cuatro días, las células se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron con m4G2. El número de células infectadas se determinó mediante citometría de flujo.
Los resultados se muestran en la Figura 10. Todos los anticuerpos potenciaron la infección de ZIKV en las células K562 no permisivas en un amplio rango de concentraciones, incluyendo aquellos que neutralizaron completamente la infección por ZIKV en las células Vero (Figura 10). Es de destacar que, mientras que los anticuerpos ZKA64 y ZKA190 específicos de EDIII neutralizaron completamente las infecciones por ZIKV de células K562 por encima de 1 |jg/ml, el anticuerpo NNB ZKA230 no pudo hacerlo, un resultado que podría deberse a los diferentes mecanismos de neutralización de virus libres frente a virus internalizados en el receptor Fc gamma. Por el contrario, el ZKA78 con reactividad cruzada, que sólo neutralizó parcialmente la infectividad por ZIKV, potenció efectivamente la infección por ZIKV de las células K562. Estos resultados muestran que los anticuerpos reactivos cruzados provocados por la infección por ZIKV o DENV pueden mediar la ADE heteróloga.
En vista de ello, se investigó si la ADE también podía ser inducida por sueros inmunes y si esto podía ser bloqueado mediante anticuerpos neutralizantes administrados como una “variante de LALA”. Para obtener la variante de LALA, cada una de las cadenas pesadas se mutó en los aminoácidos 4 y 5 del dominio CH2 sustituyendo una alanina en lugar de la leucina natural utilizando mutagénesis dirigida. Como se describió anteriormente, las variantes de LALA (de los anticuerpos IgG1 humanos) no se unen a los receptores Fc-gamma ni al complemento.
Para investigar el efecto del anticuerpo ZKA64-LALA en la ADE de ZIKV, se utilizó un ensayo de inhibición de ADE. Dado que se observó ADE de ZIKV utilizando plasma inmune a ZIKV o DENV, se mezcló ZIKV (MOI de 0,175) con plasma de donantes primarios infectados con ZIKV o DENV durante 30 minutos a 37 °C. El anticuerpo ZKA64-LALA se añadió a 50 jg/ml, se mezcló con 5.000 células K562/pocillo y se incubó durante tres días. A continuación, las células se tiñeron con 4G2 y se analizaron mediante citometría de flujo.
Los resultados se muestran en la Figura 11. En un entorno homólogo, cuatro plasmas inmunes a ZIKV recolectados de pacientes convalecientes y un plasma inmune a DENV mostraron una capacidad similar para potenciar la infección por ZIKV de células K562 (Figura 11, panel superior), y este efecto a De fue completamente bloqueado por el anticuerpo ZKA64-LALA específico para EDIII (Figura 11, panel inferior).
Cabe destacar que el efecto ADE del plasma inmune a ZIKV y DENV fue completamente bloqueado por el anticuerpo ZKA64-LALA específico para EDIII. La capacidad de bloqueo de ADE de un único anticuerpo LALA específico para EDIII podría estar relacionada no sólo con su capacidad para superar a los anticuerpos potenciadores del suero, sino también para neutralizar el virus una vez internalizado en los endosomas.
Estos resultados indican que un anticuerpo potencialmente neutralizante, tal como ZKA190, ZKA230, ZKA185 o ZKA64 desarrollado en la forma “LALA” tiene un gran potencial para ser utilizado en entornos profilácticos o terapéuticos para prevenir la infección congénita por ZIKV, por ejemplo en mujeres embarazadas y/o en personas que viven en zonas de alto riesgo. El uso de la forma LALA evita el riesgo de ADE de ZIKV y, como se muestra anteriormente, también podría bloquear la ADE de los anticuerpos de reacción cruzada preexistentes, como en el caso de pacientes que ya son inmunes a DENV.
Ejemplo 7: Análisis de muestras de residentes europeos utilizando anticuerpos específicos contra la proteína NS1 de ZIKV (no abarcados por el objeto de las reivindicaciones) para el diagnóstico de la infección por ZIKV
El presente ejemplo se basa en el ensayo de bloqueo de unión descrito en el Ejemplo 4. Para evaluar más a fondo la especificidad del ensayo BOB de la proteína NS1 de ZIKV, se analizó un gran conjunto de muestras obtenidas de pacientes infectados con virus DENV, WNV o del Chikungunya (CHIKV).
Para este fin, se utilizó un ensayo de “bloqueo de unión”. Se recubrieron placas de poliestireno durante la noche con 1 |jg/ml de NS1 de ZIKV y se bloquearon durante 1 hora con PBS que contenía BSA al 1%. Se añadió plasma o suero (dilución 1:10) a placas de ELISA recubiertas con NS1. Posteriormente, por ejemplo, después de 1 hora, se añadió un volumen igual de anti-NS1 ZKA35 biotinilado y la mezcla se incubó, por ejemplo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las placas se lavaron y se añadió estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina, por ejemplo durante 30 minutos. Las placas se lavaron de nuevo y se añadió el sustrato. El porcentaje de inhibición se calculó de la siguiente manera: ((1-[(DO muestra-DO ctrl neg)/(DO ctrl pos-DO ctrl neg)]) * 100
Los resultados se muestran en la Figura 14. Treinta y una de las 32 muestras (96,9%) de pacientes con WNV se recolectaron más de 10 días después de que el inicio de los síntomas fuera negativo. Cabe destacar que el único positivo se obtuvo a partir de una muestra recolectada en 2016. Dos de las 27 muestras de pacientes con DENV recolectadas más de 10 días después de la aparición de los síntomas tuvieron una calificación positiva y las dos muestras positivas se derivaron de infecciones secundarias por DENV. Además, ninguna de las muestras derivadas de pacientes con chikungunya o de pacientes vacunados contra YFV obtuvo una calificación positiva. También se probó un gran número de muestras de plasma de donantes de sangre suizos (n=116) recolectadas entre 2010 y 2016. Ninguna de esas muestras obtuvo un resultado positivo. Los resultados obtenidos confirmaron y reforzaron la alta sensibilidad y especificidad del ensayo ELISA de bloqueo de unión de NS1.
Ejemplo 8: Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención neutraliza ZIKV más potentemente que el anticuerpo mAb C8 de EDE1 de la técnica anterior.
Para comparar los anticuerpos neutralizantes de acuerdo con la presente invención con anticuerpos anti-ZIKV altamente neutralizantes de la técnica anterior, se comparó el rendimiento de neutralización de ZKA190 con el mAb C8 del epítopo de dímero de envoltura 1 (EDE1) altamente neutralizante de la técnica anterior (Barba-Spaeth G, Dejnirattisai W, Rouvinski A, Vaney MC, Medits I, Sharma A, Simon-Loriére E, Sakuntabhai A, Cao-Lormeau VM, Haouz A, England P, Stiasny K, Mongkolsapaya J, Heinz FX, Screaton GR, Rey FA. Structural basis of potent Zikadengue virus antibody cross-neutralization. Nature. 4 de agosto de 2016; 536(7614):48-53). La neutralización de ambos anticuerpos se analizó contra un panel de cuatro cepas distintas de ZIKV (H/PF/2013; MR766, MRS-OPY y PV10552).
Brevemente, la neutralización de la infección por ZIKV mediante mAb se midió utilizando un ensayo basado en citometría de flujo de micro-neutralización. Diferentes diluciones de mAb se mezclaron con ZIKV (MOI de 0,35) durante 1 hora a 37 °C y se añadieron a 5.000 células Vero/pocillo en placas de fondo plano de 96 pocillos. Después de cuatro días para ZIK<v>, las células se fijaron con formaldehído al 2%, se permeabilizaron en PBS que contenía suero de ternera fetal al 1% (Hyclone) y saponina al 0,5%, y se tiñeron con el mAb 4G2 de ratón. Las células se incubaron con una IgG anti-ratón de cabra conjugada con Alexa Fluor488 (Jackson Immuno-Research, 115485164) y se analizaron mediante citometría de flujo. El título de neutralización (concentración inhibidora del 50% [IC<50>]) se expresa como la concentración de anticuerpos que redujo la infección en un 50% en comparación con los pocillos de control de sólo virus.
Los resultados se muestran en la Figura 15. El mAb ZKA190 neutralizó potentemente las cepas africanas, asiáticas y americanas con una IC50 que oscilaba entre 0,6 y 8 ng/ml. En comparación, el anticuerpo C8 de la técnica anterior era aproximadamente 24 veces menos potente.
Ejemplo 9: Caracterización adicional del anticuerpo ZKA190
La potencia del anticuerpo ZKA190 se investigó adicionalmentein vitroein vivo.Para este fin, el mAb se sintetizó en formato de tipo silvestre (wt) de IgG1 y en un formato de Fc-LALA de IgG1. Brevemente, las secuencias VH y VL se clonaron en vectores de expresión humanos de IgY1, IgK e IgA (amablemente proporcionados por Michel Nussenzweig, Rockefeller University, Nueva York, NY, EE.UU.), esencialmente tal como se describe en Tiller T, Meffre E, Yurasov S, Tsuiji M, Nussenzweig MC, Wardemann H: Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods 2008, 329:112-124. Los mAb recombinantes se produjeron mediante transfección transitoria de células EXPI293 (Invitrogen), se purificaron mediante cromatografía de proteína A (GE Healthcare) y se desalaron frente a PBS. Para obtener la variante LALA, cada una de las cadenas pesadas se mutó en los aminoácidos 4 y 5 del dominio CH2 sustituyendo una alanina en lugar de la leucina natural utilizando mutagénesis dirigida. Como se describió anteriormente, las variantes de LALA (de los anticuerpos IgG1 humanos) no se unen a los receptores Fc-gamma ni al complemento.
Como se muestra en la Figura 15A y se describe en el Ejemplo 8, ZKA190 se analizó contra un panel de cuatro cepas de ZIKV. El mAb ZKA190 neutralizó potentemente las cepas africanas, asiáticas y americanas con una IC<50>que oscilaba entre 0,004 y 0,05 nM (Figura 15A; 0,6 a 8 ng/ml).
Dado que se ha demostrado que ZIKV infecta células progenitoras neuronales humanas (hNPC), lo que conduce a un aumento de la toxicidad celular, la desregulación del ciclo celular y la disminución del crecimiento celular, ZKA190 y ZKA190-LALA se analizaron en hNPC. Con este fin, se reprogramaron fibroblastos masculinos adultos obtenidos del e Movement Disorders Bio-Bank (Neurogenetics Unit of the Neurological Institute 'Carlo Besta', Milán) utilizando el kit CytoTune-iPS 2.0 Sendai (Life Technologies). Las hPSC se mantuvieron en condiciones libres de alimentador en mTeSR1 (STEMCELL Technologies). Para generar cuerpos embrioides (EB, las hiPSC disociadas se colocaron en placas de baja adhesión en mTeSR1 suplementado con N2 (0,5x) (ThermoFisher Scientific), Nogina humana (0,5 mg/ml, R&D System), SB431542 (5 pM, Sigma), Y27632 (10 pM, Miltenyi Biotec) y penicilina/estreptomicina (1%, Sigma) (tal como se describe en Marchetto MCN, Carromeu C, Acab A, Yu D, Yeo GW, Mu Y, Chen G, Gage FH, Muotri AR: A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell 2010, 143:527-539). Para obtener rosetas, los EB se sembraron después de 10 días en placas recubiertas con matrigel (1:100, factor de crecimiento de matrigel reducido, Corning) en DMEM/F12 (Sigma) con N2 (1:100), aminoácidos no esenciales (1%, ThermoFisher Scientific) y penicilina/estreptomicina. Después de 10 días, las células se pasaron con Accutase (Sigma) y se sembraron en matraces recubiertos con matrigel en medios NPC que contenían DMEM/F12, N2 (0,25%), B27 (0,5%, ThermoFisher Scientific), penicilina/estreptomicina y FGF2 (20 ng/ml, ThermoFisher Scientific). Las hNPC (3x104) se colocaron en cubreobjetos en placas de 24 pocillos 3 días antes de la infección con la cepa PRVABC59. El stock de virus se incubó con los mAb 1 h antes de la adición a las hNPC para obtener una MOI de 0,5. Después de 4 h de adsorción del virus, se eliminó el sobrenadante del cultivo y se volvió a añadir medio fresco que contenía los mAb. El sobrenadante se recolectó 96 h después de la infección para medir los títulos de virus mediante el ensayo de placa en células Vero. Las células se fijaron en solución de paraformaldehído al 4% (PFA, Sigma) en solución salina tampón fosfato (PBS, Euroclone) durante 30 minutos para la inmunofluorescencia indirecta. Las células fijas se permeabilizaron durante 30 minutos (min) en una solución de bloqueo que contenía Triton X-100 (Sigma) al 0,2% y suero de burro (Sigma) al 10%, y se incubaron durante la noche a 4 °C con los anticuerpos primarios en la solución de bloqueo. Se usó el siguiente anticuerpo para la detección: anti-envoltura (1:200, Millipore, MAB10216). A continuación, las células se lavaron con PBS y se incubaron durante 1 hora con Hoechst y anticuerpos secundarios anti-ratón Alexa Fluor-488 (1:1.000 en solución de bloqueo, ThermoFisher Scientific). Después de lavados con PBS, las células se lavaron de nuevo y se montaron. Los resultados se muestran en la Figura 16A. Tanto ZKA190 como ZKA190-LALA eliminaron completamente la infección y la replicación de ZIKV en las hNPC.
A continuación, se analizó la capacidad de ZKA190 y ZKA190-LALA para causar ADE en la línea celular K562, tal como se describe en el Ejemplo 6. Brevemente, la ADE se midió mediante un ensayo basado en flujo utilizando células K562. Brevemente, para ZKA190, ZKA190 y ZIKV H/PF/2013 (MOI de 0,175) se mezclaron durante 1 hora a 37 °C y se añadieron a 5.000 células K562/pocillo. Después de cuatro días, las células se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron con mAb m4G2. El número de células infectadas se determinó mediante citometría de flujo. Para ZKA190-LALA, se mezcló ZIKV (MOI de 0,175) con plasma de donantes primarios infectados con ZIKV durante 30 minutos a 37 °C. ZKA190-LALA se añadió a 50 pg/ml, se mezcló con 5.000 células K562/pocillo y se incubó durante tres días. A continuación, las células se tiñeron con 4G2 y se analizaron mediante citometría de flujo. Los resultados se muestran en la Figura 16B. ZKA190 permite la ADE de 0,0001 a 1 nM; como se esperaba, ZKA190-LALA no mostró ninguna actividad de ADE. También se probó la capacidad de ZKA190-LALA para inhibir la ADE inducida por el plasma de cuatro donantes inmunes a ZIKV en células K562. Los resultados se muestran en la Figura 16C. Se encontró que ZKA190-LALA inhibía completamente la ADE inducida por los anticuerpos plasmáticos (Figura 16C).
Los anticuerpos anti-prM forman parte de los anticuerpos predominantes provocados durante la respuesta inmune humana contra los flavivirus y se ha demostrado que potencian la infección del virusin vitro(Dejnirattisai, W., Jumnainsong, A., Onsirisakul, N., Fitton, P., Vasanawathana, S., Limpitikul, W., Puttikhunt, C., Edwards, C., Duangchinda, T., Supasa, S., et al. (2010). Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans. Science 328, 745-748). Se preincubaron células K562 con diluciones seriadas del anticuerpo DV62 con reactividad cruzada con prM (Beltramello, M., Williams, KL, Simmons, CP, Macagno, A., Simonelli, L., Quyen, NTH, Sukupolvi-Petty, S., Navarro-Sanchez, E., Young, PR, de Silva, AM, et al. (2010). The human immune response to Dengue virus is dominated by highly cross-reactive antibodies endowed with neutralizing and enhancing activity. Cell Host Microbe 8, 271-283) derivado de un donante inmune a DENV. Los resultados se muestran en la Figura 16D. DV62 reaccionó de forma cruzada con la proteína prM de ZIKV y causó ADE en un amplio rango de concentraciones (Figura 16D). ZKA190-LALA puede bloquear completamente la ADE inducida por el mAb DV62 anti-prM de partículas de ZIKV inmaduras o parcialmente inmaduras (Figura 16D).
Finalmente, se analizó la capacidad de diferentes concentraciones de ZKA190, ZKA190-LALA y Fab de ZKA190 para causar o bloquear la ADE de ZIKV en presencia de concentraciones elevadas de plasma anti-DENV2 humano o DV62. Los resultados se muestran en la Figura 16E. A bajas concentraciones, ZKA190 incrementó la ADE mediada por DV62 de prM de la infección por ZIKV, en concordancia con su capacidad para promover la entrada de viriones maduros e inmaduros, mientras que, a concentraciones por encima de 1,3 nM (es decir, 200 ng/ml), ZKA190 bloqueó la ADE inducida tanto por plasma de DENV como mAb DV62. ZKA190-LALA, así como su fragmento Fab, redujeron la ADE a concentraciones por encima de 0,06 nM, lo que indica que ambos inhibían la infección del virus en un paso posterior a la unión, tal como la fusión.
Ejemplo 10: ZKA190 se une a una región conservada y altamente accesible de EDIII
Para determinar el epítopo de ZKA190 a nivel de residuo, se usó espectroscopía RMN en solución tal como se describe en Bardelli, M., Livoti, E., Simonelli, L., Pedotti, M., Moraes, A., Valente, A.P., and Varani, L. (2015). Epitope mapping by solution NMR spectroscopy. J. Mol. Recognit. 28, 393-400; Simonelli, L., Beltramello, M., Yudina, Z., Macagno, A., Calzolai, L., y Varani, L. (2010). Rapid structural characterization of human antibodyantigen complexes through experimentally validated computational docking. J Mol Biol 396, 1491-1507; y Simonelli, L., Pedotti, M., Beltramello, M., Livoti, E., Calzolai, L., Sallusto, F., Lanzavecchia, A., and Varani, L. (2013). Rational Engineering of a Human Anti-Dengue Antibody through Experimentally Validated Computational Docking. PLoS ONE 8, e55561.
Brevemente, los espectros se registraron en un espectrómetro RMN de 700 MHz Bruker Avance a 300 K. Para las asignaciones de resonancias de la cadena principal se utilizaron experimentos de resonancia triple estándar (HNCO, HN(CA)CO, HN(CO)CACB, HNCACB), mientras que las cadenas laterales se anotaron usando experimentos de HCCH-TOCSY y HBHA(CO)NH. Todos los experimentos de RMN se procesaron con el software Topspin 2.1 (Bruker Biospin) y se analizaron con la aplicación de software CARA. Los picos cruzados de NOESY se asignaron automáticamente utilizando la macro de CYANA “noeassign” basada en los desplazamientos químicos asignados manualmente. Las restricciones de distancia superior utilizadas para los cálculos de estructura en CYANA utilizando el protocolo de apareamiento simulado estándar se derivaron de los espectros NOESY de 70 ms resueltos con 15N y 13C. La dinámica de la cadena principal del EDIII de ZIKV se derivó de mediciones de relajación de 15N registradas en espectrómetros de 600 y 700 MHz. Se utilizaron versiones detectadas por protones de la tasa de relajación (R2) de Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG), inversión-recuperación (R1) y 15N{1h }n OE de estado estable. Los ajustes de retardo para la serie T2 estaban en el rango de 0 a 0,25 segundos y para la serie T1 entre 0,02 y 2 segundos. El experimento 15N{1H}NOE utilizó un retraso de relajación de 5 s. Las tasas de relajación de R1 y R2 se derivaron de ajustes de mínimos cuadrados de las funciones exponenciales correspondientes a los datos medidos utilizando scripts de escritura propia. Los datos de relajación se analizaron en un enfoque sin modelo utilizando el paquete de software DYNAMICS. El programa ROTDIF se utilizó para calcular el tiempo de correlación global a partir de los datos de relajación (8,5 ns). El mapeo del epítopo de RMN se realizó tal como se describe anteriormente (Bardelli et al., 2015; Simonelli et al., 2010; 2013). Brevemente, la superposición de los espectros 15NHSQC de EDIII etiquetado libres o unidos al Fab de ZKA190 permitió la identificación de residuos de EDIII cuya señal de RMN cambió durante la formación del complejo, lo que indica que se vieron afectados por la unión de ZKA190. Los cambios se identificaron mediante una inspección manual y mediante la perturbación de desplazamientos químicos (CSP) CSP=((A5<h>)2+(A5n/1 O)2)1'2 |_as muestras de RMN fueron típicamente 800 pM de EDIII etiquetado con [15N, 13C] en fosfato sódico 20 mM, NaCI 50 mM, pH 6,0. Se usaron muestras de EDIII 2H,15N perdeuteradas (nominalmente 70%) para el mapeo del epítopo de RMN con una relación EDIII:Fab de ZKA190 de 1:1,1; la concentración de EDIII fue típicamente de 0,4 mM.
Dado que la señal de RMN depende en gran medida del entorno químico local, los cambios en la formación del complejo identifican los residuos de antígenos que se ven afectados por la unión del anticuerpo, ya sea directamente o mediante efectos alostéricos. Al comparar los espectros de RMN de EDIII libre y unido (Figura 17A), los residuos afectados por ZKA190 se asignaron al LR de EDIII, en particular a los bucles BC, DE y FG, así como a parte de la bisagra de EDI-EDIII (Figura 18A). Estos residuos son casi idénticos entre las 217 cepas conocidas de ZIKV, con la excepción de las sustituciones en V341I y E393D en el aislado de Uganda de 1947 (Figura 17D).
Estas mutaciones también están presentes en la cepa MR766 que fue neutralizada eficientemente por ZKA190 (Figura 15A). El análisis del epítopo ZKA190 en la estructura de ZIKV no compleja mostró que el epítopo es altamente accesible, excepto por el bucle FG en el vértice de 5 veces (Figura 18B y Figura 17C, molécula A).
El acoplamiento computacional seguido de la simulación de dinámica molecular, guiado y validado por la información del epítopo derivado de la RMN, así como la mutagénesis por EDIII, mostró que ZKA190 se une a través de una interfaz caracterizada por la complementariedad de carga y forma (Figura 18B y 17E). El acoplamiento indica que no hay contactos directos entre ZKA190 y el bucle f G en EDIII, lo que sugiere que los cambios en sus señales de<r>M<n>al unirse al anticuerpo se derivan de los efectos alostéricos. Esta noción está respaldada por el hecho de que las mutaciones de los residuos del bucle FG en EDIII recombinante, pero no en otras regiones del epítopo, no afectaron la afinidad de unión de ZKA190 para EDIII (Figura 18B y 19).
Ejemplo 11: Mecanismos de neutralización de ZKA190
La capacidad de ZKA190 para neutralizar eficazmente el virus puede implicar la inhibición de la unión celular o la fusión de la membrana. Otro mecanismo podría implicar la inactivación del virus a través de la reticulación de partículas virales.
El Fab de ZKA190 puede neutralizar el ZIKV, aunque de manera menos eficiente que la IgG correspondiente. Al unirse al enlazador de EDI-EDIII, ZKA190 (tanto Fab como IgG) podría inhibir la rotación de ~70 grados de DIII requerida para la fusión viral a la membrana de la célula huésped (Bressanelli, S., Stiasny, K., Allison, S.L., Stura, E.A., Duquerroy, S., Lescar, J., Heinz, F.X., and Rey, F.A. (2004). Structure of a flavivirus envelope glycoprotein in its low-pH-induced membrane fusion conformation. Embo J 23, 728-738; Modis, Y., Ogata, S., Clements, D., and Harrison, S.C. (2004). Structure of the dengue virus envelope protein after membrane fusion. Nature 427, 313 319). Alternativamente, ZKA190 podría evitar la unión de ZIKv a células diana.
La capacidad de ZKA190 de inhibir la fusión de la membrana está respaldada por el análisis de microscopía confocal. Para este fin, se dispusieron células Vero en placas a 7.500 células/pocillo, en cubreobjetos de 12 mm de diámetro en placas de 24 pocillos, y se incubaron durante la noche. Las células se infectaron con ZIKV H/PF/2013 (MOI de 100) en presencia o ausencia de concentraciones neutralizantes de mAb conjugados con Alexa-488 (0,7<j>M) a 37 °C durante 3 h, se lavaron con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 2% en PBS durante 30 min a temperatura ambiente. El endosoma acidificado se identificó con Lysotracker rojo (Invitrogen) mediante la adición del tinte (50 nM) a las células durante los últimos 30 minutos de la incubación antes de la fijación. La fijación fue seguida por lavados extensos en PBS y glicina 50 mM y finalmente se prepararon los cubreobjetos para el análisis microscópico utilizando un medio de montaje Vectashield para fluorescencia con DAPI (Vector Laboratories). Las muestras se analizaron mediante microscopía confocal utilizando un microscopio Leica TCS SP5 con un objetivo de 63 */1,4 N.A. El análisis y procesamiento de imágenes se realizó con el software FIJI.
Los resultados se muestran en la Figura 20. El análisis de microscopía confocal muestra que ZKA190 (Fab o IgG) puede ingresar a las células Vero sólo cuando se complejan con ZIKV, a concentraciones neutralizantes que exceden la IC<50>10.000 veces (Figura 20).
Ejemplo 12: Caracterizaciónin vivodel mAb ZKA190 específico de EDIII
Para evaluar sus propiedades profilácticas y terapéuticas, ZKA190 y ZKA190-LALA se analizaron en ratones A129 expuestos a una dosis letal de ZIKV, cepa MP1751 (linaje africano). Para analizar sus potencias profilácticas, ZKA190 y ZKA190-LALA se administraron un día antes de la exposición al virus.
Se administró a ratones A129 hembra (receptor IFN-alfa/beta -/-) y a ratones 129Sv/Ev de tipo silvestre, de 5-8 semanas, mAb (ZKA190, ZKA190-LALA y el anticuerpo de control MPE8 (Corti, D., et al. Cross-neutralization of four paramyxoviruses by a human monoclonal antibody. Nature 501,439-443 (2013)) se diluyó en PBS a diferentes dosis, vía intraperitoneal (i.p.), en un volumen de 500 jl. Los mAb se administraron 1 día antes o 1,2, 3 o 4 días después de la exposición al virus. Los animales se estimularon subcutáneamente con 102 UFP de ZIKV (cepa MP1751) y se les dio seguimiento durante 14 días. Los pesos y las temperaturas se monitorearon diariamente y las observaciones clínicas se registraron al menos dos veces por día. En el día 5 posterior a la exposición, se recolectaron 50 j l de sangre de cada animal en un tubo RNAprotect (Qiagen, Reino Unido) y se congelaron a -80 °C. Al final del estudio (14 días después de la exposición) o cuando los animales cumplieron con los criterios de valoración humanitarios, se realizaron necropsias y se extrajeron muestras de sangre, cerebro, bazo, hígado, riñón y ovario para el análisis virológico.
Se pesaron muestras de tejido de ratones A129 y se homogeneizaron en PBS utilizando bolas de cerámica y un homogeneizador automático (Precellys, Reino Unido) utilizando seis ciclos de 5 segundos de 6.500 rpm con un espacio de 30 segundos. Se transfirieron 200 j l de homogeneizado de tejido o solución de sangre a 600 j l de solución tampón RLT (Qiagen, Reino Unido) para la extracción de ARN utilizando el kit de extracción RNeasy Mini (Qiagen, Reino Unido); las muestras se pasaron a través de un homogeneizador QIAshredder (Qiagen, Reino Unido) como paso inicial. Se utilizó un ensayo de RT-PCR en tiempo real específico de ZIKV para la detección del ARN viral de los animales en cuestión. Las secuencias de cebador y sonda se adoptaron de Quick et al., 2017 (Quick, J, Grubaugh ND, Pullan ST, Claro IM, Smith AD, Gangavarapu K, Oliveira G, Robles-Sikisaka R, Rogers TF, Beutler NA, et al.: Multiplex PCR method for MinION and Illumina sequencing of Zika and other virus genomes directly from clinical samples. Nat Protoc 2017, 12: 1261-1276) con optimización y validación internas realizadas para proporcionar una mezcla óptima y condiciones de ciclado. La RT-PCR en tiempo real se realizó con el kit qRT-PcR SuperScript III Platinum One-step (Life Technologies, Reino Unido). La mezcla maestra final (15 j l) estaba compuesta por 10 j l de 2x mezcla de reacción, 1,2 j l de agua de grado de PCR, 0,2 j l de MgSO<4>50 mM, 1 j l de cada cebador (ZIKV 1086 y ZIKV 1162c, ambos a una concentración de trabajo de 18 jM ), 0,8 j l de sonda (ZIKV 1107-FAM a una concentración de trabajo de 25 jM ) y 0,8 j l de mezcla de enzimas SSIII. Se añadieron cinco j l del patrón de ARN a la mezcla maestra, produciendo un volumen de reacción final de 20 jl. Las condiciones de ciclado utilizadas fueron 50 °C durante 10 minutos, 95 °C durante 2 minutos, seguidas de 45 ciclos de 95 °C durante 10 segundos y 60 °C durante 40 segundos, más un paso de enfriamiento final a 40 °C durante 30 segundos. El análisis de cuantificación con fluorescencia se realizó al final de cada paso a 60 °C. Las reacciones se ejecutaron y analizaron en la plataforma 7500 FAST (Life Technologies, Reino Unido) utilizando la versión de software 75002.0.6. La cuantificación de la carga viral en muestras se realizó utilizando una serie de diluciones de oligonucleótido de ARN cuantificado (Integrated DNA Technologies). El oligonucleótido comprendía las 77 bases del ARN de ZIKV que era el blanco del ensayo, con base en el número de acceso de GenBank AY632535.2 y se sintetizó a una escala de 250 nmol con purificación por HPLC.
Los resultados se muestran en las Figuras 21, 22 y 23. ZKA190 y ZKA190-LALA protegieron a los ratones de la mortalidad y la morbilidad a concentraciones de 5,1 o 0,2 mg/kg (Figura 21A-Figura 21B). ZKA190-LALA, y en menor medida ZKA190, retrasó la morbilidad y la mortalidad en comparación con el grupo de control a 0,04 mg/kg. Los títulos víricos en sangre y órganos se redujeron significativamente en comparación con los animales de control tratados con anticuerpos, incluso en presencia de niveles de anticuerpos séricos por debajo de 1 jg/m l (Figura 22A-D).
Para evaluar el potencial terapéutico de ZKA190, se administraron ZKA190 y ZKA190-LALA en diferentes intervalos de tiempo después de la infección por ZIKV. Con una dosis de 15 mg/kg, se consiguieron tasas de supervivencia del 80% al 100% y la morbilidad se redujo considerablemente incluso cuando el tratamiento se administró cuatro días después de la infección (Figura 21E-G). El tratamiento con ZKA190 y ZKA190-LALA en todos los intervalos de tiempo posteriores a la infección dio lugar a títulos virales significativamente reducidos, en comparación con los animales tratados con el anticuerpo de control, con una clara tendencia a una mayor reducción con el tratamiento más temprano (Figura 23A-23C). Cabe destacar que ZKA190-LALA mostró una actividad antiviral significativamente reducida en la muestra de sangre del día 5 en comparación con ZKA190 cuando se administraron los mAb cuatro días después de la infección, un resultado que podría estar relacionado con la capacidad alterada de la variante de LAL<a>para facilitar la eliminación rápida de viriones recubiertos.
Tablas de secuencias números de identificación de secuencias
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un epítopo del virus del Zika y neutraliza la infección del virus del Zika, donde el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende las secuencias de aminoácidos CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y las secuencias de aminoácidos CDRL1, CDRL2 y CDRL3 (i) según las SEQ ID NO: 1 - 5 y 7; (ii) según las SEQ<i>D NO: 1 - 4 y 6 - 7; (iii) según las SEQ ID NO: 19 - 23 y 25; (iv) según las SEQ ID NO: 19-22 y 24 - 25; (v) según las SEQ ID NO: 37 - 41 y 43; (vi) según las SEQ ID<n>O: 37 - 40 y 42 - 43; (vii) según las SEQ ID NO: 73 - 77 y 79; o (viii) según las SEQ iD NO: 73 -76 y 78 - 79.
2. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende un resto Fc; preferentemente el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una mutación en el resto Fc, reduciendo dicha mutación la unión del anticuerpo a un receptor Fc; con mayor preferencia el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una mutación CH2 L4A, una mutación CH2 L5A o ambas.
3. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende (i) una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (VH) de acuerdo con la SEQ ID NO: 8, o una variante de secuencia funcional de la misma con al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia y/o una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (VL) de acuerdo con la SEQ ID NO: 9, o una variante de la secuencia funcional de la misma con al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia; (ii) una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (VH) de acuerdo con la SEQ ID NO: 26, o una variante de secuencia funcional de la misma con al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia y/o una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (VL) de acuerdo con la SEQ ID NO: 27, o una variante de secuencia funcional de la misma con al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia; (iii) una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (VH) de acuerdo con la SEQ ID NO: 44, o una variante de secuencia funcional de la misma con al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia y/o una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (VL) de acuerdo con la SEQ ID NO: 45 o una variante de la secuencia funcional de la misma con al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia; o (iv) una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (VH) de acuerdo con la SEQ ID NO: 80, o una variante de secuencia funcional de la misma que tenga al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia y/o una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (VL) de acuerdo con la SEQ ID NO: 81, o una variante de secuencia funcional de las mismas con al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia.
4. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso como un medicamento.
5. Una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
6. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5.
7. Una célula que expresa el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1a 3 o que comprende el vector según la reivindicación 6.
8. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el ácido nucleico según la reivindicación 5, el vector según la reivindicación 6 y/o la célula según la reivindicación 7, y, opcionalmente, un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
9. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1a 3, el ácido nucleico según la reivindicación 5, el vector según la reivindicación 6, la célula según la reivindicación 7 o la composición farmacéutica según la reivindicación 8 para su uso en la prevención o el tratamiento de la infección por el virus del Zika.
10. El anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, el ácido nucleico, el vector, la célula o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 9, donde el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, el ácido nucleico, el vector, la célula o la composición farmacéutica se administran en combinación con un inhibidor del punto de control.
11. Uso del anticuerpo, o del fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el diagnósticoin vitrode la infección por el virus del Zika.
12. Uso del anticuerpo, o del fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1a 3 para la monitorizaciónin vitrode la calidad de una vacuna anti-Zika comprobando que el antígeno de dicha vacuna contiene el epítopo específico en la conformación correcta.
13. Un kit de partes que comprende al menos un anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1a 3, al menos un ácido nucleico según la reivindicación 5, al menos un vector según la reivindicación 6, al menos una célula según la reivindicación 7 o al menos una composición farmacéutica según la reivindicación 8 y medios para la administración del anticuerpo, o del fragmento de unión a antígeno del mismo, del ácido nucleico, del vector, de la célula o de la composición farmacéutica.
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