EA043940B1 - Мультиспецифические антитела, специфичные в отношении эпитопов вируса зика, и их применение - Google Patents

Description

Изобретение относится к мультиспецифическим антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые специфически связываются с различными эпитопами вируса Зика (ZIKV). Такие антитела эффективно нейтрализуют инфекцию вируса Зика (ZIKV) и минимизируют или прекращают образование вакцин-ускользающих мутантов вируса Зика. Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, которые кодируют такие антитела и фрагменты антител. Изобретение также относится к применению антител и фрагментов антител по настоящему изобретению для профилактики и лечения инфекции ZIKV.

Вирус Зика (ZIKV) относится к флавивирусам, переносится комарами и представляет угрозу для общественного здравоохранения. Впервые ZIKV был выделен из макак в 1947 году в лесу Зика в Уганде (Dick G.W.A. с соавт., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 46, 1952, 509-520) и первая инфекция у человека была описана в Нигерии в 1954 году (Macnamara F.N., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 48, 1954, 139-145). С тех пор инфекции ZIKV периодически регистрировали в Африке и Юго-Восточной Азии (Musso D., CaoLormeau V.-M., Gubler D. J., The Lancet. 386, 2015, 243-244), а эпидемии были отмечены в Макронезии в 2007 году (Duffy M.R. с соавт., N Engl J Med. 360, 2009, 2536-2543) и Французской Полинезии в 20132014 годах, с последующим распространением вируса в другие страны Океании (Cao-Lormeau V.-M., Musso D. Lancet. 384, 2014, 1571-1572); Musso D., Nilles E. J., Cao-Lormeau V.-M. Clin. Microbiol. Infect. 20, 2014, 0595-6). После своего появления в Бразилии в 2015 году ZIKV быстро распространился, и в феврале 2016 года Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) в связи с его распространением объявила о чрезвычайной ситуации в области здравоохраения, имеющей международное значение (Baden L.R. с соавт. N. Engl. J. Med. 374, 2016, 1552-1563; Fauci A.S., Morens D.M. N Engl J Med, 160113142101009, 2016; Heymann D.L. с соавт. Lancet. 387, 2016, 719-721). Основное распространение инфекции ZIKV происходит через укусы комаров Aedes, но этот вирус также может распространяться половым путем (Musso D. с соавт. Emerg Infect Dis. 21, 2015, 359-361) и передаваться вертикально (от родителей детям) (Mlakar J. с соавт. N Engl J Med. 374, 2016, 951-958). Хотя большинство инфекций ZIKV бессимптомны или симптомы проявляются в легкой форме, есть свидетельства того, что инфекция ZIKV может вызвать неврологические осложнения, например синдром Гийена-Барре у взрослых (CaoLormeau V.-M. с соавт. Lancet. 0, 2016, doi:10.1016/S0140-6736(16)00562-6) и врожденные дефекты, включая микроцефалию у развивающегося плода (Calvet G. с соавт. Lancet Infect Dis 2016, doi: 10.1016/s1473-3099(16)00095-5; Mlakar J. с соавт. N Engl J Med. 374, 2016, 951-958; Rubin E. J. с соавт. N Engl J Med 2016, doi:10.1056/NEJMe1601862), вероятно, благодаря своей способности инфицировать нейрональные клетки-предшественники человека (Tang H. с соавт. Stem Cell, 2016, 1-5).

ZIKV принадлежит к роду Flavivirus, к которому также относят вирус Западного Нила, вирус денге, вирус клещевого энцефалита, вирус желтой лихорадки и несколько других вирусов, которые могут вызывать энцефалит. Флавивирусы имеют оболочку икосаэдрической или сферической формы. Диаметр около 50 нм. Геномы являются позитивно-полярными линейными нитями РНК и несегментированы, около 10-11 т.о. в длину. Геном флавивирусов кодирует 3 структурных белка (капсид, prM и оболочку) и 8 неструктурных белков (NS1, nS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, nS5 и NS5B).

Хотя белки оболочки флавивирусов (E - envelope) опосредуют слияние и являются основной мишенью нейтрализующих антител, неструктурный белок 1 (NS1) секретируется инфицированными клетками и участвует в уклонении от иммунитета и в патогенезе (Muller D.A., Young P.R. Antiviral Res. 98, 2013, 192-208). Два недавних структурных исследования показали высокий уровень структурного сходства между белком E вируса ZIKV и этим же белком других флавивирусов, например, вируса денге (DENV), вируса желтой лихорадки (YFV) и вируса Западного Нила (WNV), но с другой стороны выявили уникальные свойства, которые могут быть связаны с нейротропизмом ZIKV (Dai L. с соавт., Cell Host Microbe (2016), doi:10.1016/j.chom.2016.04.013; Sirohi D. с соавт., Science, aaf5316 (2016). Аналогичным образом, структурный анализ NS1 вируса ZIKV выявил консервативные признаки NS1 других флавивирусов, хотя и с различными электростатическими свойствами (Kim J., 1-6 (2016)).

Феноменом, который характерен для некоторых флавивирусов, является усиливающая болезнь активность перекрестно-реактивных антител, вызванных предыдущей инфекцией гетерологичными вирусами. В случае вируса денге (DENV), у которого известны 4 серотипа, имеются эпидемиологические данные, свидетельствующие о том, что первичная инфекция защищает от повторного заражения тем же серотипом, но представляет собой фактор риска развития тяжелого заболевания при повторном заражении другим серотипом (Halstead S.B., Microbiol Spectr. 2, 2014, 249-271). Обостренное заболевание вызывается E и prM-специфическими антителами, которые не способны нейтрализовать поступающий вирус, но вместо этого усиливают его захват клетками, экспрессирующими рецептор Fc (FcR +), что приводит к усиленной репликации вируса и активации перекрестно-реактивных T-клеток памяти. Возникающий цитокиновый шторм предположительно является основой самой тяжелой формы болезни, известной как геморрагическая лихорадка денге/синдром шока денге (Halstead S.B., Adv Virus Res. 60, 2003, 421-467; Screaton G., Mongkolsapaya J., Yacoub S., Roberts C. Nat Rev Immunol. 15, 2015, 745-759). Роль антител при тяжелой форме денге подтверждается исследованиями, показывающими, что снижение уровня материнских антител у детей представляет повышенный риск развития тяжелой формы денге (Halstead S.B., Adv Virus Res. 60, 2003, 421-467; Halstead S.B. с соавт., Emerging Infect Dis. 8, 2002, 1474-1479); Nguyen

- 1 043940

T.H. с соавт., J Infect Dis. 189, 2004, 221-232; Rothman A.L., J Clin Invest. 113, 2004, 946-951).

Ранее было показано, что большинство антител, которые реагировали на белок оболочки DENV, также связывались с ZIKV, но те, которые распознают большой линейный эпитоп петли слияния (linear fusion-loop epitope - FLE), не нейтрализовали ZIKV и вместо этого способствовали антителозависимому усилению (ADE) инфекции ZIKV (Dejnirattisai W., Nat Immunol. 2016 г., 23 июня, doi: 10.1038/ni.3515. [публикация в интернете до выхода в печати]).

Кроме того, организмы с высоким уровнем мутирования, например, различные вирусы, например, вирус Зика, часто используют так называемое избавление за счет мутаций в качестве механизма, позволяющего избежать разрушения клетками-хозяевами. А именно, вирус может защищаться от иммунных реакций хозяина, за счет мутаций в своем генотипе и фенотипе (избавление за счет мутаций). Соответственно, выработка мутаций избавления (то есть появление вирусов, несущих мутации избавления) может снизить эффективность лекарственных препаратов антител.

Ввиду вышеизложенного, задача, решаемая в настоящем изобретении, заключается в разработке мультиспецифических антител, которые могут нейтрализовать вирус Зика (ZIKV). Такие антитела не способствуют предпочтительному антителозависимому усилению (ADE) инфекции вирусом Зика. Также целью настоящего изобретения является предоставление высокоспецифичных анти-ZIKV-антител, устраняющих или минимизирующих возникновение мутантов ZIKV, защищающихся за счет мутаций.

Решение задачи, лежащее в основе настоящего изобретения, приводится в формуле изобретения.

Хотя настоящее изобретение подробно описано ниже, следует учитывать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными методологиями, протоколами и реагентами, описанными в данном описании, поскольку их можно варьировать. Также следует учитывать, что используемая в настоящем изобретении терминология не предназначена для ограничения рамок охвата настоящего изобретения, ограничиваемого только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном изобретении, имеют те же значения, которые применяют специалисты в данной области.

Ниже приводят описание элементов настоящего изобретения. Эти элементы перечислены при описании некоторых конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, однако следует учитывать, что их можно комбинировать каким-либо образом и в каким-либо количестве для создания дополнительных вариантов осуществления настоящего изобретения. Различные описанные примеры и предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения не должны истолковываться как ограничивающие настоящее изобретение только приведенными вариантами его осуществления. Это описание следует рассматривать как поддерживающее и охватывающее варианты осуществления настоящего изобретения, которые объединяют конкретные варианты осуществления с каким-либо количеством описанных и/или предпочтительных элементов. Кроме того, какие-либо перестановки и комбинации всех описанных элементов в изобретении должны рассматриваться как раскрытые в описании настоящего изобретения, если из контекста не следует иное.

В настоящем описании и в приводимой ниже формуле изобретения, если из контекста не следует иное, понятие содержит, а также понятия включает и содержащее, означает включение определенного объекта, целого числа или стадии, но не исключает какие-либо другие объекты, целые числа или стадии. Понятие состоит из означает конкретно понятие содержит и исключает какой-либо неуказанный элемент, целое число или стадию. В контексте настоящего изобретения понятие включает охватывает понятие состоит из. Таким образом, понятие содержащий охватывает понятие включающий, а также состоящий, например, композиция, содержащая X, может состоять исключительно из X или может включать в себя что-то дополнительное, например, X + Y.

В контексте настоящего изобретения (особенно в контексте формулы изобретения) может подразумеваться как единственное, так и множественное число объектов, если не указано иное или нет явного противоречия контексту. Перечисление диапазонов величин в настоящем изобретении предназначено для того, чтобы служить кратким способом индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, находящееся в диапазоне. Если в настоящем изобретении не указано иначе, каждое отдельное значение включают в описание так, как если бы оно было отдельно в нем указано. Язык изложения в настоящем описании не должен истолковываться как указывающий на какой-либо незаявленный элемент, существенный для практического применения изобретения.

Понятие по существу не исключает понятия полностью, например, композиция, которая по существу не содержит Y, может быть полностью свободна от Y. При необходимости слово по существу может быть опущено из описания настоящего изобретения.

Понятие примерно применительно к численному выражению χ означает ±10%.

Понятие заболевание в контексте настоящего изобретения является синонимом и используется взаимозаменяемо с понятиями расстройство и состояние (состояние здоровья), поскольку все они отражают ненормальное состояние организма человека или животного или какой-либо из его частей, приводящее к нарушению функционирования, которое обычно проявляется в изменении признаков и симптомов и приводит к тому, что у человека или животного снижается продолжительность или качество жизни.

- 2 043940

В настоящем изобретении упоминание понятия лечение субъекта или пациента включает профилактику, ослабление проявления заболевания, улучшение и терапию. Понятия субъект или пациент применяются в настоящем изобретении взаимозаменяемо для обозначения всех млекопитающих, включая людей. К субъектам, например, относят людей, коров, собак, кошек, лошадей, коз, овец, свиней и кроликов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пациентом является человеком.

В настоящем изобретении понятия антигенсвязывающий фрагмент, фрагмент и фрагмент антитела используют взаимозаменяемо для обозначения какого-либо фрагмента антитела по настоящему изобретению, который сохраняет антигенсвязывающую активность антитела. Примеры фрагментов антител включают, но ими не ограничиваются, одноцепочечные антитела, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv или scFv. Кроме того, понятие антитело в контексте настоящего описания включает как антитела, так и их антигенсвязывающие фрагменты.

В настоящем изобретении понятие антитело охватывает различные формы антител, включая, но ими не ограничиваясь, целые антитела, фрагменты антител, в частности антигенсвязывающие фрагменты, антитела человека, химерные антитела, гуманизированные антитела, рекомбинантные антитела и генно-инженерные антитела (варианты или мутантные антитела) до тех пор, пока сохраняются характерные свойства согласно настоящему изобретению. Моноклональные антитела являются предпочтительными и особенно предпочтительными являются моноклональные антитела с CDR человека или вариабельными областями человека. В частности, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно являются производными антител человека (то есть они содержат CDR и/или вариабельные области антител человека). Более предпочтительно, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, по настоящему изобретению также содержат константные области антител человека. Наиболее предпочтительно все константные и вариабельные области антител или их антигенсвязывающих фрагментов в соответствии с настоящим изобретением имеют происхождение от человека, то есть константные и вариабельные области человека, такие как константные и вариабельные области антитела человека.

Антитела человека хорошо известны специалистам в данной области (van Dijk M.A., van de Winkel J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 2001, 368-374). Антитела человека могут также вырабатываться у трансгенных животных (например, мышей), которые способны после иммунизации вырабатывать полный спектр или отбирать антитела человека при отсутствии выработки эндогенного иммуноглобулина. Перенос массива генов иммуноглобулина зародышевой линии человека в зародышевую линию таких мутантных мышей приводит к выработке антител человека при заражении антигеном (см., например, Jakobovits A. с соавт., Proc. Nail. Acad. Sci. USA 90, 1993, 2551-2555; Jakobovits A. с соавт., Nature 362, 1993, 255258; Bruggemann M. с соавт., Year Immunol. 7, 1993, 3340). Антитела человека также могут вырабатываться в библиотеках фагового дисплея (Hoogenboom H.R., Winter G., J. Mol. Biol. 227, 1992, 381-388; Marks J. D. с соавт., J. Mol. Biol. 222, 1991, 581-597). Методы Cole с соавт. и Boerner с соавт. также могут использоваться для получения моноклональных антител человека (Cole с соавт., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, с. 77, 1985; Boerner P. с соавт., J. Immunol. 147, 1991, 86-95). Предпочтительно моноклональные антитела человека получают с использованием улучшенной иммортализации клеток EBV-B, как описано в публикации Traggiai E. с соавт., Nat Med. 10(8), 2004, 871-875. В контексте настоящего изобретения понятие антитело человека также охватывает модифицированные антитела, например, в вариабельной области или константной области, которые проявляют свойства по настоящему изобретению.

Антитела по настоящему изобретению могут относиться к какому-либо изотипу (например, IgA, IgG, IgM, т.е. тяжелая цепь α, γ или μ), но предпочтительно к IgG. В рамках изотипа IgG антитела могут быть из подклассов IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, причем подкласс IgG1 является предпочтительным. Антитела по настоящему изобретению могут иметь к или λ легкую цепь.

Антитело по настоящему изобретению, или его антигенсвязывающий фрагмент, может быть очищенным антителом или одноцепочечным антителом, например, биспецифичным одноцепочечным фрагментом Fv(scFv).

Изобретение также предусматривает фрагменты антител по настоящему изобретению, в частности фрагменты, которые сохраняют антигенсвязывающую активность антител. Хотя описание настоящего изобретения, включающее формулу изобретения, может в некоторых местах явно относиться к антигенсвязывающему фрагменту (фрагментам), фрагменту (фрагментам) антитела, варианту (вариантам) и/или производному (производным) антител, подразумевается, что понятие антитело или антитело по настоящему изобретению включает все категории антител, а именно антигенсвязывающий фрагмент (фрагменты), фрагмент (фрагменты) антител, вариант (варианты) и производное (производные) антител. Фрагменты антител по настоящему изобретению могут быть получены из антител способами, которые включают расщепление ферментами, такими как пепсин или папаин, и/или расщеплением дисульфидных связей путем химического восстановления. Альтернативно, фрагменты антител могут быть получены путем клонирования и экспрессии части последовательностей тяжелых или легких цепей. Например, изобретение включает биспецифичный scFv, содержащий CDR из антитела по настоящему изобретению.

- 3 043940

Фрагменты антител по настоящему изобретению могут придавать одновалентные или многовалентные взаимодействия и могут содержаться в различных структурах. Например, молекулы scFv могут быть синтезированы для создания трехвалентного триаантитела или четырехвалентного тетраантитела.

Молекулы scFv могут включать домен области Fc, что приводит к образованию двухвалентных миниантител.

Антитела по настоящему изобретению могут быть предусмотрены в очищенной форме. Обычно антитело бывает в составе композиции, которая, по существу, не содержит других полипептидов, например, других полипептидов в композиции менее 90% (по массе), обычно менее 60 и наиболее часто менее 50%.

Антитела по настоящему изобретению могут быть иммуногенными в организмах-хозяевах у людей и/или других видов (гетерологичных), например у мышей. Например, антитела могут иметь идиотоп, который является иммуногенным для хозяев, не для людей, но не для организма человека-хозяина. Антитела по настоящему изобретению для использования человеком включают антитела, которые не могут быть легко выделены из хозяев, таких как мыши, козы, кролики, крысы, млекопитающие, не являющиеся приматами, и т.д., и обычно не могут быть получены гуманизацией или от ксено-мышей.

В контексте настоящего изобретения понятие нейтрализующее антитело означает антитело, которое может нейтрализовать, то есть предотвращать, ингибировать, уменьшать или препятствовать способности патогена инициировать и/или сохранять инфекцию у хозяина. Термины нейтрализующее антитело и антитело, которое нейтрализует или антитела, которые нейтрализуют используются в настоящем изобретении взаимозаменяемо. Эти антитела могут быть использованы по отдельности или в комбинации, в качестве профилактических или терапевтических агентов при подходящем составе, в сочетании с активной вакцинацией, в качестве диагностического инструмента или в качестве производственного инструмента, как описано в настоящем изобретении.

Дозы часто разрабатывают с учетом массы тела. Например, доза, выраженная в [г, мг или другой единице]/кг (или г, мг и т.д.) обычно относится к [г, мг или другой единице] на кг (или г, мг и т.д.) массы тела, даже если понятие масса тела точно не указывается.

Понятие специфически связывающий и аналогичная ссылка не включают неспецифическое прилипание.

В контексте настоящего изобретения понятие вакцина обычно означает профилактический или терапевтический материал, обеспечивающий, по меньшей мере, один антиген, предпочтительно иммуноген. Антиген или иммуноген могут быть получены из какого-либо материала, который подходит для вакцинации. Например, антиген или иммуноген могут быть получены из патогена, такого как бактерии или частицы вируса и т.д., или из опухоли или раковой ткани. Антиген или иммуноген стимулирует адаптивную иммунную систему организма для обеспечения адаптивного иммунного ответа. В частности, антиген или иммуноген обычно обозначают к веществу, которое может распознаваться иммунной системой, предпочтительно адаптивной иммунной системой, и которое способно вызывать антигенспецифический иммунный ответ, например, путем образования антител и/или антиген-специфических Tклеток как части адаптивного иммунного ответа. Обычно, антиген может быть, или может включать, пептид или белок, который может быть презентирован главным комплексом гистосовместимости (ГКГС) T-клеткам.

В контексте настоящего изобретения понятие вариант последовательности (также просто вариант) относится к какому-либо изменению в эталонной последовательности, в результате чего исходная последовательность представляет какую-либо из последовательностей, перечисленных в разделе Таблицы последовательностей и номера SEQ ID NO (перечень последовательностей), т.е. из последовательностей от SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO: 273. Таким образом, понятие вариант последовательности включает варианты нуклеотидной последовательности и варианты аминокислотной последовательности. Следует отметить, что варианты последовательности, упоминаемые в настоящем изобретении, являются, в частности, функциональными вариантами последовательности, то есть вариантами последовательности, поддерживающими биологическую функцию, например, антитела. В контексте настоящего изобретения такой поддерживаемой биологической функцией предпочтительно является нейтрализация инфекции ZIKV и/или связывание антитела с ZIKV E белком. Таким образом, предпочтительные варианты последовательности представляют собой такие функциональные варианты последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или по меньшей мере, на 99% идентичны исходной последовательности.

Таким образом, предпочтительные варианты последовательности представляют собой функциональные варианты последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или по меньшей мере, на 99% идентичны исходной последовательности.

В настоящем изобретении выражение функциональный вариант последовательности, который

- 4 043940 идентичен исходной последовательности, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или по меньшей мере, на 99% означает, что (i) вариант последовательности является функциональным, согласно описанному в настоящем изобретении, и (ii) чем выше процент идентичности последовательности, тем более предпочтителен такой вариант последовательности. Иначе говоря, выражение функциональный вариант последовательности, который идентичен исходной последовательности, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или по меньшей мере, на 99% означает, в частности, что функциональный вариант последовательности по отношению к исходной последовательности идентичен, по меньшей мере, на 70, предпочтительно идентичен, по меньшей мере, на 75, предпочтительно идентичен, по меньшей мере, на 80, более предпочтительно идентичен, по меньшей мере, на 85, более предпочтительно идентичен, по меньшей мере, на 88, еще более предпочтительно идентичен, по меньшей мере, на 90, еще более предпочтительно идентичен, по меньшей мере, на 92, и еще более предпочтительно идентичен, по меньшей мере, на 95, и еще более предпочтительно идентичен, по меньшей мере, на 96, особенно предпочтительно идентичен, по меньшей мере, на 97, особенно предпочтительно идентичен, по меньшей мере, на 98, и наиболее предпочтительно идентичен, по меньшей мере, на 99%.

Понятие вариант последовательности включает, в частности, такие варианты, которые содержат мутации и/или замещения по отношению к исходной последовательности. Примеры вариантов последовательности фрагмента Fc включают, но ими не ограничиваются, те варианты, которые имеют замещение L на A в положении CH2 4, CH2 5 или в обоих этих положениях.

Идентичность последовательности обычно рассчитывают относительно полной длины исходной последовательности (то есть последовательности, которая приведена в изобретении). Процент идентичности, согласно описанному в настоящем изобретении, может быть определен, например, с использованием BLAST, применяя параметры по умолчанию, определенные NCBI (the National Center for Biotechnology Information - Национальный центр биотехнологической информации; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [Blosum 62 matrix; штраф открытие гэпа = 11 и штраф за продление гэпа = 1].

В контексте настоящего изобретения понятие вариант нуклеотидной последовательности имеет измененную последовательность, в которой один или несколько нуклеотидов в контрольной последовательности делетированы или замещены, или один или несколько нуклеотидов инсертированы в последовательность исходной нуклеотидной последовательности. В настоящем изобретении нуклеотиды обозначают стандартным однобуквенным кодом (A, C, G или T). Из-за вырожденности генетического кода вариант нуклеотидной последовательности может либо привести к изменению соответствующей эисходной аминокислотной последовательности, то есть к варианту аминокислотной последовательности, либо нет. Предпочтительными вариантами последовательностей являются такие варианты нуклеотидных последовательностей, которые не приводят к вариантам аминокислотных последовательностей (молчащие мутации), но другие не молчащие мутации также входят в объем настоящего изобретения, в частности мутантные нуклеотидные последовательности, которые приводят к аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере, 80, последовательно по меньшей мере, 90, более последовательно по меньшей мере, 95% последовательности идентична контрольной последовательности.

Вариант аминокислотной последовательности имеет измененную последовательность, в которой одна или несколько аминокислот по сравнению с контрольной последовательностью делетированы или замещены, или одна или несколько аминокислот инсертированы по сравнению с контрольной последовательностью. В результате изменений, вариант аминокислотной последовательности имеет аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 80 идентична контрольной последовательности, предпочтительно, по меньшей мере, на 90 идентична, более предпочтительно, по меньшей мере, на 95 идентична, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 99% идентична контрольной последовательности. Варианты последовательности, которые, по меньшей мере, на 90% идентичны, имеют не более 10 изменений, то есть какую-либо комбинацию делеций, инсерций или замещений на 100 аминокислот контрольной последовательности.

Хотя возможно иметь неконсервативные аминокислотные замещения, предпочтительно, чтобы замещения были замещениями консервативных аминокислот, в которых замещенная аминокислота имеет сходные структурные или химические свойства с соответствующей аминокислотой в исходной последовательности. В качестве примера, консервативные аминокислотные замещения включают замещение одной алифатической или гидрофобной аминокислоты, например, аланина, валина, лейцина и изолейцина, на другую; замещение одной гидроксилсодержащей аминокислоты, например, серина и треонина, на другую; замещение одного кислотного остатка, например глутаминовой кислоты или аспарагиновой кислоты, на другую; замещение одного амид-содержащего остатка, например, аспарагина и глютамина, на другой; замещение одного ароматического остатка, например, фенилаланина и тирозина, на другой; замещение одного основного остатка, например лизина, аргинина и гистидина, на другой; и замещение одной малой аминокислоты, например аланина, серина, треонина, метионина и глицина, на другую.

- 5 043940

Инсерции аминокислотной последовательности включают слияния амино-и/или карбокси-конца длиной от одного остатка до полипептидав, содержащего сто или более остатков, а также инсерции в последовательность одного или нескольких аминокислотных остатков. Примеры концевых инсерций включают слияние N- или C-конца аминокислотной последовательности с репортерной молекулой или ферментом.

Важно отметить, что изменения в вариантах последовательности не отменяют соответствующей функциональности исходной последовательности, в данном случае, например, функциональности последовательности антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, связываться с тем же эпитопом и/или существенно нейтрализовать инфекцию ZIKV. Методики определения того, какие нуклеотиды и аминокислотные остатки, соответственно, могут быть замещены, инсертированы или делетированы без нарушения такой функциональности, находятся с помощью компьютерных программ, известных в данной области.

В контексте настоящего изобретения понятие последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, производной от определенной нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида или белка, касается происхождения нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида или белка. Предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, которая получена как производная определенной последовательности, имеет аминокислотную последовательность, которая в значительной степени идентична той последовательности или ее части, из которой она получена, посредством чего будучи по существу идентичной включает варианты последовательности, что описано выше. Предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, которая получена как производная определенного пептида или белка, происходит из соответствующего домена в определенном пептиде или белке. Таким образом, понятие соответствующая относится, в частности, к одной и той же функциональности. Например, внеклеточный домен соответствует другому внеклеточному домену (другого белка), или трансмембранный домен соответствует другому трансмембранному домену (другого белка). Соответствующие части пептидов, белков и нуклеиновых кислот, таким образом, легко идентифицируются специалистами в данной области. Более того, последовательности, производные от другой последовательности, обычно легко идентифицируются специалистами в данной области, поскольку происходят от этой последовательности.

Предпочтительно, последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность, производная от другой нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида или белка, может быть идентичной исходной нуклеиновой кислоте, пептиду, полипептиду или белку (от которого она производна). Однако последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность, полученная из другой нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида или белка, может также иметь одну или несколько мутаций относительно исходной нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида или белка (от которого она производна), в частности, последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность, полученная из другой нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида или белка, может представлять собой вариант функциональной последовательности, как описано выше, исходной нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида или белка (от которого она производна). Например, в пептиде/белке один или несколько аминокислотных остатков могут быть замещены другими аминокислотными остатками, или могут происходить вставки или делеции одного или нескольких аминокислотных остатков.

В контексте настоящего изобретения понятие мутация относится к изменению в последовательности нуклеиновой кислоты и/или аминокислотной последовательности относительно контрольной последовательности, например, соответствующей геномной последовательности. Мутация, например, по сравнению с геномной последовательностью, может быть, например, (природной) соматической мутацией, спонтанной мутацией, индуцированной мутацией, например, вызванной ферментами, химическими веществами или радиацией, или мутацией, полученной сайт-направленным мутагенезом (методами молекулярной биологии для внесения специфических и продуманных изменений в последовательность нуклеиновой кислоты и/или в аминокислотную последовательность). Таким образом, понятия мутация и мутирование следует понимать также как физическое действие по созданию мутации, например, в последовательности нуклеиновой кислоты или в аминокислотной последовательности. К мутациям относят замещения, делеции и инсерции одного или нескольких нуклеотидов или аминокислот, а также инверсии нескольких последовательно расположенных нуклеотидов или аминокислот. Для получения мутации в аминокислотной последовательности предпочтительно, чтобы мутация могла быть введена в нуклеотидную последовательность, кодирующую указанную аминокислотную последовательность, для экспрессии (рекомбинантного) мутировавшего полипептида. Мутация может быть достигнута, например, путем изменения, например, путем сайт-направленного мутагенеза, кодона молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующего одну аминокислоту, чтобы получить кодон, кодирующий другую аминокислоту, или путем синтеза варианта последовательности, например, зная нуклеотидную последовательность молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, и синтезируя разработанную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует вариант полипептида, без необходимости мутировать один или несколько нуклеотидов молекулы нуклеиновой кислоты.

- 6 043940

Несколько документов цитируются по всему тексту данного описания. Каждый из цитируемых документов (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации производителя, инструкции и т.д.), выше или ниже в тексте включен в настоящее изобретение в качестве ссылки. Ничто в настоящем изобретении не должно быть истолковано как признание того, что настоящее изобретение не имеет права предшествовать такому раскрытию в силу предшествующего изобретения.

Следует учитывать, что настоящее изобретение не ограничено определенной методологией, протоколами и реагентами, описанными в настоящем изобретении, поскольку они могут варьироваться. Также следует понимать, что используемая в настоящем изобретении терминология предназначена только для описания определенных вариантов осуществления настоящего изобретения и не предназначена для ограничения области охвата настоящего изобретения, которое ограничивается только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в в настоящем изобретении, имеют те же значения, которые обычно приняты специалистами в данной области.

Мультиспецифические антитела, связывающиеся с определенными эпитопами вируса Зика.

Настоящее изобретение основано, наряду с другими результатами, на открытии того обстоятельства, что мультиспецифические антитела и их антигенсвязывающие фрагменты специфически связываются с разными эпитопами вируса Зика.

Такие антитела минимизируют или элиминируют образование мутантов вируса Зика, ускользающих от антител (антитела-ускользающие мутанты). В частности, в настоящее время нет мер профилактики/лечения инфекции, вызванной вирусом Зика. Антитела по настоящему критерию высоко эффективны для предотвращения, а также лечения или ослабления инфекции вирусом Зика. Более того, благодаря специфичности антител к вирусу Зика, они не вызывают ADE, а скорее блокируют ADE.

Первый объект настоящего изобретения относится к отдельным мультиспецифическим антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые специфически связываются с разными эпитопами вируса Зика. Иначе говоря, настоящее изобретение предусматривает выделенное мультиспецифическое антитело или его антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат, по меньшей мере, два сайта связывания эпитопа, которые специфически связываются с разными эпитопами вируса Зика.

Важно, что в отличие от обычных (ординарных) антител, проявляющих только одну специфичность, мультиспецифические антитела способны связываться, по меньшей мере, с двумя разными эпитопами. В данном случае мультиспецифические антитела специфически связываются (по меньшей мере, с двумя) разными эпитопами вируса Зика.

Таким образом, в контексте настоящего изобретения понятие мультиспецифический относится к способности связываться, по меньшей мере, с двумя разными эпитопами, например, на разных антигенах, например таких как разные белки вируса Зика (ZIKV), или на одном и том же антигене, например, на том же белке ZIKV. Предпочтительно, мультиспецифические антитела, или их антигенсвязывающие фрагменты, по-настоящему изобретению связываются, по меньшей мере, с двумя разными эпитопами на одном и том же белке ZIKV, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, с двумя разными эпитопами на (E) белке оболочки вируса Зика.

Предпочтительно, мультиспецифические антитела, или их антигенсвязывающие фрагменты, понастоящему изобретению являются биспецифическими, триспецифическими, тетраспецифическими или пентаспецифическими, более предпочтительно антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, является биспецифическим или триспецифическим, и наиболее предпочтительно антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, является биспецифическим.

В контексте настоящего изобретения понятия биспецифическое, триспецифическое, тетраспецифическое связаны с числом разных эпитопов, с которыми антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, могут связываться. Например, обычные моноспецифические антитела типа IgG имеют два идентичных сайта связывания эпитопа (паратопы) и, таким образом, могут связываться только с идентичными эпитопами (не с разными эпитопами). Напротив, мультиспецифическое антитело имеет, по меньшей мере, два разных типа сайтов связывания эпитопов (паратопов) и может, таким образом, связываться по меньшей мере с двумя разными эпитопами. В контексте настоящего изобретения понятие паратоп относится к эпитоп-связывающему сайту антитела. Соответственно, термины паратоп и сайт связывания эпитопа используются здесь взаимозаменяемо.

Кроме того, одна специфичность может относиться к одному, двум, трем или нескольким одинаковым паратопам в одном антителе. Фактическое количество паратопов в одной молекуле антитела называется валентностью. Предпочтительно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению, является двухвалентным, трехвалентным, тетравалентным, шестивалентным или восьмивалентным, более предпочтительно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является двухвалентным или тетравалентным, чаще всего, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент являются тетравалентными.

Наиболее предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению является биспецифическим или тетравалентным.

Также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению включает точно две (идентичные) копии каждого из отличающихся сайтов связывания эпи- 7 043940 топов, специфически связывающихся, по меньшей мере, с двумя разными эпитопами вируса Зика.

Например, одно нативное антитело IgG является моноспецифическим и бивалентным, поскольку оно имеет два идентичных паратопа (две идентичные копии). Однако, мультиспецифическое антитело включает, по меньшей мере, два (разных) паратопа. Таким образом, понятие мультиспецифическое относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам, имеющим более одного паратопа и способным связываться с двумя или более различными эпитопами. Понятие мультиспецифические антитела/антигенсвязывающие фрагменты включает, в частности, биспецифические антитела, согласно описанному выше, но обычно также белок, например антитело, каркасы молекул, которые связывают, в частности, три или более разных эпитопа, то есть антитела, имеющие три или более паратопов.

В частности, мультиспецифическое антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, может включать два или более паратопов, причем некоторые паратопы могут быть идентичными, так что все паратопы антитела принадлежат по меньшей мере к двум разным типам паратопов и, следовательно, антитело имеет, по меньшей мере, две специфичности.

Например, мультиспецифическое антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению могут включать четыре паратопа, причем каждые два паратопа идентичны (имеют равную специфичность) и, таким образом, антитело или его фрагмент являются биспецифическим и тетравалентным (два идентичных паратопа для каждой из двух специфичностей). Таким образом, понятие одна специфичность относится, в частности, к одному или нескольким паратопам, проявляющим равную эффективность (которая обычно означает, что такие один или несколько паратопов идентичны) и, таким образом, две специфичности могут быть осуществлены за счет двух, трех, четырех, пяти, шести или более паратопов, поскольку они принадлежат только к двум специфичностям. Например, мультиспецифическое антитело может включать единственный паратоп для каждой (по меньшей мере, для двух) специфичностей, т.е. мультиспецифическое антитело включает всего, по меньшей мере, два паратопа. Например, биспецифическое антитело содержит единственный паратоп для каждой из двух специфичностей, т.е. антитело включает всего два паратопа. Наиболее предпочтительно, антитело включает точно два (идентичных) паратопа для каждой из двух специфичностей, т.е. антитело включает всего четыре паратопа. В другом варианте, антитело может включать три (идентичных) паратопа для каждой из двух специфичностей, т.е. антитело включает всего шесть паратопов.

В контексте настоящего изобретения понятие антиген означает какое-либо структурное вещество, которое служит мишенью для рецепторов адаптивного иммунного ответа, в частности, в качестве мишени для антител, рецепторов T-клеток и/или рецепторов B-клеток. Эпитопом, также называемым антигенным детерминантом, является часть (или фрагмент) антигена, который распознается иммунной системой, в частности, антителами, рецепторами T-клеток и/или рецепторами B-клеток. Таким образом, один антиген имеет, по меньшей мере, один эпитоп, т.е. один антиген содержит один или несколько эпитопов. Антиген может быть (i) пептидом, полипептидом или белком, (ii) полисахаридом, (iii) липидом, (iv) липопротеином или липопептидом, (v) гликолипидом, (vi) нуклеиновой кислотой или (vii) низкомолекулярным лекарственным средством или токсином. Таким образом, антиген может быть пептидом, белком, полисахаридом, липидом, их комбинацией, включающей липопротеины и гликолипиды, нуклеиновую кислоту (например, ДНК, миРНК, мшРНК, антисмысловые олигонуклеотиды, ДНК-ловушку, плазмиду) или низкомолекулярным лекарственным средством (например, циклоспорином A, паклитакселом, доксорубицином, метотрексатом, 5-аминолевулиновой кислотой) или какой-либо их комбинацией. Предпочтительно, антиген выбран из (i) пептида, полипептида или белка, (ii) полисахарида, (iii) липида, (iv) липопротеина или липопептида и (v) гликолипида; более предпочтительно, антиген является пептидом, полипептидом или белком.

Антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению связывается, по меньшей мере, с двумя разными эпитопами вируса Зика. По меньшей мере, к разным эпитопам вируса Зика могут быть расположены разные антигены вируса Зика, такие как разные белки вируса Зика (ZIKV), или один и тот же антиген вируса Зика, например, на том же белке ZIKV. Предпочтительными примерами антигенов/белков ZIKV являются капсид, prM, белки оболочки и неструктурные белки NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5 и NS5B. Наиболее предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению связывается с (по меньшей мере, двумя) разными эпитопами оболочки вируса Зика (ZIKV E белок). Иначе говоря, наиболее предпочтительно антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит, по меньшей мере, два сайта связывания эпитопа, которые специфически связываются с разными эпитопами белка оболочки вируса Зика (E белок ZIKV). ZIKV включает нуклеокапсидную сердцевину, которая содержит одноцепочечную РНК, окруженную белками сердцевины. Ядро нуклеокапсида инкапсулировано липидной бислойной мембраной с мембранными белками и белками оболочки. Белок оболочки ZIKV (E белок) является доминирующим антигеном. Структура и домены ZIKV E белка описаны, например, в публикации Dai L. с соавт., Cell Host Microbe. 19(5), 2016, 696-704.

Предпочтительно, (по меньшей мере, два) разных эпитопа вируса Зика, с которыми связывается антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению являются неперекрещивающимися эпитопами. В частности, аминокислоты, формирующие первый эпитоп вируса Зика, с кото- 8 043940 рым связывается антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению отличаются от аминокислот, формирующих второй эпитоп вируса Зика, с которым связывается антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению.

Антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению может быть антителом какого-либо формата. В частности, мультиспецифические антитела предпочтительно охватывают целые антитела, например, целые IgG- или IgG-подобные молекулы, в то время как антигенсвязывающие фрагменты в контексте настоящего изобретения предпочтительно относятся к небольшим рекомбинантным форматам, например, к формату, основанному на биспецифических активаторах T-клеток (BiTE®; за исключением того, что в контексте настоящего изобретения обе специфичности нацелены на вирус Зика, соответственно, T-клеточная специфичность BiTE® может быть заменена (второй) специфичностью ZIKV), молекулах тандемных одноцепочечных вариабельных фрагментов (taFv), диантителах (Db), одноцепочечных диантителах (scDb) и различных других их производных (форматы биспецифических антител описаны в публикации Byrne H. с соавт., Trends Biotech, 31(11), 2013, 621-632 на фиг. 2, где представлены различные форматы биспецифических антител; Weidle U.H., с соавт., Cancer Genomics and Proteomics 10, 2013, 1-18, в частности, на фиг. 1 представлены различные форматы биспецифических антител; Chan A.C., Carter P.J. Nat Rev Immu 10, 2010, 301-316, где на фиг. 3 представлены различные форматы биспецифических антител). Примеры форматов биспецифичных антител включают, но ими не ограничиваются, Fabs-in-tandem-Ig, DVD-Ig, квадрогибридому, химически связанный Fab (фрагментное связывание с антигеном) и BiTE® (биспецифический T-клеточный активатор). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предпочтительно антитело является антителом Fabs-in-tandem-Ig (FIT-Ig) или DVD-Ig.

Таким образом, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению может быть выбран из группы, включающей Fabs-in-tandem-Ig (FIT-Ig); DVD-Ig; гибридную гибридому (квадрому); мультиспецифическую антикалиновую платформу (фирма Pieris); диантитела; одноцепочечные антитела; тандемные одноцепочечные Fv фрагменты; тандемные антитела (TandAbs), триспецифические антитела (Trispecific Abs) (фирма Affimed) (105-110 кДа); Dart (dual affinity retargeting переориентирующееся антитело с двойной аффинностью; фирма Macrogenics); биспецифические антитела Xmab (фирма Xencor); биспецифические активаторы T-клеток (Bispecific T cell engagers - Bites; фирма Amgen; 55 кДа); Triplebodies; Tribody = Fab-scFv гибридный белок (фирма CreativeBiolabs) производные многофункциональных рекомбинантных антител (110 кДа); платформу Duobody (фирма Genmab); платформу Dock and lock (замка на причале); платформу выступ-во-впадину (Knob into hole - KIH); гуманизированное биспецифическое антитело IgG (REGN1979) (фирма Regeneron); Mab² биспецифические антитела (F-Star); DVD-Ig = двойной вариабельный домен иммуноглобулина (фирма Abbott); каппа-лямбда антитела; TBTI = тетравалентный биспецифический тандемный Ig; и CrossMab.

Антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению может быть выбран из биспецифических IgG-подобных антител (BsIgG), включая CrossMab; DAF (два-в-одном); DAF (четыре-в-одном); DutaMab; DT-IgG; Knobs-in-holes (выступ-во-впадину), обычно LC; сборку выступ-вовпадину (Knob into hole - KIH); заряженную пару (Charge pair); Fab-arm exchange (обмен Fab фрагментами); гибридные белки SEEDbody; Triomab; LUZ-Y; Fcab; κλ-body; ортогональный Fab. Такие форматы биспецифических антител описаны, например, Spiess C., Zhai Q., Carter P.J. Molecular Immunology 67, 2015, 95-106, в частности, на фиг. 1 и в соответствующем описании, например, на стр. 95-101.

Предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению может быть выбран из фрагментов биспецифических антител, включая нанотела, нанотела-HAS; BiTE; диантитела; DART; TandAb; scDiabody; sc-Diabody-CH3; Diabody-CH3; Triple Body; миниантитела; минибоди; TriBi минибоди; scFv-CH3 KIH; Fab-scFv; scFv-CH-CL-scFv; F(ab')2; F(ab')2-scFv2; scFv-KIH; Fab-scFv-Fc; тетравелентное HCAb; scDiabody-Fc; Diabody-Fc; Tandem scFv-Fc; Intrabody. Такие форматы биспецифических антител описаны, например, Spiess C., Zhai Q., Carter P.J. Molecular Immunology 67, 2015, 95-106, в частности, на фиг. 1 и в соответствующем описании, например, на стр. 95-101.

Более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению может быть выбрано из IgG-связанных антител с дополнительным антигенсвязывающим фрагментом, к которым относятся DVD-IgG; IgG(H)-scFv; scFv-(H)IgG; IgG(L)-scFv; scFV-(L)IgG; IgG(L,H)Fv; IgG(H)-V; V(H)-IgG; IgG(L)-V; V(L)-IgG; KIH IgG-scFab; 2scFv-IgG; IgG-2scFv; scFv4-Ig; scFv4-Ig; Zybody; и DVI-IgG (четыре-в-одном). Такие форматы биспецифических антител описаны, например, Spiess C., Zhai Q., Carter P.J. Molecular Immunology 67, 2015, 95-106, в частности, на фиг. 1 и в соответствующем описании, например, на стр. 95-101. Из таких фрагментов антител еще более предпочтительным является DVD-Ig (иммуноглобулин с двойным вариабельным доменом (фирма Abbott)). Такой формат антител описан подробно, например, в публикации Wu C. в соавт., Nat Biotechnol. 25(11), 2007, 12901297; или в публикации DiGiammarino E., Ghayur T., Liu J. Methods Mol Biol. 899, 2012, 145-156.

Наиболее предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению является IgG-присоединенным антителом формата Fabs-in-tandem-Ig (FIT-Ig). Иначе говоря, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению является наиболее пред- 9 043940 почтительно относящимся к формату Fabs-in-tandem-Ig (FIT-Ig). Формат Fabs-in-tandem-Ig (FIT-Ig) подробно описан, например, в WO 2015/103072 A1, включенным в настоящее изобретение в виде ссылки, или в работе Gong S. с соавт., MAbs 2017. Аналогично DVD-Ig, также FIT-Ig является биспецифическим тетравалентным антителом симметричного формата. FIT-Ig может быть получен, используя три полипептида: полипептид 1 обычно включает легкую цепь внешнего гибридизированного Fab, предпочтительно без линкеров, с N-концевой областью тяжелой цепи внутреннего Fab; полипептид 2 обычно включает вариабельную и CH1 области тяжелой цепи внешнего Fab; и полипептид 3 обычно включает легкую цепь внутреннего Fab. Таким образом, антитело формата FIT-Ig обычно включает внутренний Fab и внешний Fab.

Предпочтительно, антитело по настоящему изобретению, или его антигенсвязывающий, нейтрализует инфекцию вируса Зика. Иначе говоря, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению снижает способность к заражению у вируса Зика.

Для изучения и количественной оценки инфекционности вируса (или нейтрализации) в лабораторных условиях специалистам в данной области известны разные стандартные анализы нейтрализации. Для анализа нейтрализации животные вирусы животных обычно размножают в клетках и/или клеточных линиях. В контексте настоящего изобретения анализ нейтрализации предпочтителен, причем культивируемые клетки инкубируют с фиксированным количеством вируса Зика (ZIKV) в присутствии (или в отсутствии) исследуемого антитела. Для снятия данных может применяться, например, жидкостная цитометрия. В другом варианте осуществления настоящего изобретения возможно также снятие других показателей, например, количества неструктурных белков ZIKV (например, ZIKV NS1), секретируемых в супернатант культуры. Например, неструктурный белок 1 вируса ZIKV (NS1) иммуноферментный анализ (ELISA) на основе захвата антигена, тест на инфекционную дозу-50 (TCID50) на культуре ткани (TCID50-ELISA) может применяться в качестве альтернативы методу стандартного подсчета вирусных бляшек для титрования вируса Зика - сходным образом с методом, описанным для вируса денге (DENV) в работе Li J. с соавт., PLoS ONE 2011, 6:e22553. В таком исследовании, например, ZIKV NS1 связывающие антитела, описанные в настоящем изобретении, могут быть полезны.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения для анализа нейтрализации ZIKV культивируемые клетки, например, клетки Vero, инкубируют с определенным количеством ZIKV в присутствии или в отсутствие исследуемого антитела, например, в течение примерно четырех дней. После инкубирования клетки можно промыть и дополнительно культивировать. Для измерения инфекционности вируса можно использовать жидкостную цитометрию. С этой целью клетки могут быть зафиксированы, например, 2% формальдегидом, агентами повышения проницаемости, например, 1% ФСТ (фетальная сыворотка теленка) в ФСБ (фосфатно-солевом буфере), 0,5% сапонином и окрашены, например, с антителом мыши 4G2. Затем клетки можно инкубировать с козьим антителом против иммуноглобулина мышм (goat anti-mouse IgG), конъюгированным с красителем, например Alexa Fluor488, и исследованы методом жидкостной цитометрии. В другом варианте осуществления настоящего изобретения жизнеспособные клетки могут быть выявлены жидкостной цитометрией, используя, например, реагент WST-1 (фирма Roche). Предпочтительным штаммом ZIKV для применения в таком анализе нейтрализации является ZIKV H/PF/2013.

Антитело и антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению обладают высокой нейтрализующей активностью. Концентрация антитела, требуемая для нейтрализации 50% вируса ZIKV (IC₅₀), по сравнению с контролями без антител, составляет, например, до около 3 мкг/мл или до примерно 1 мкг/мл. Предпочтительно концентрация антитела по настоящему изобретению, требуемая для нейтрализации 50% вируса ZIKV (IC₅₀), составляет примерно 500 нг/мл, более предпочтительно концентрация антитела по настоящему изобретению, требуемая для нейтрализации 50% вируса ZIKV (IC₅₀), составляет примерно 250 нг/мл, еще более предпочтительно концентрация антитела по настоящему изобретению, требуемая для нейтрализации 50% вируса ZIKV (IC₅₀), составляет примерно 150 нг/мл. Наиболее предпочтительно, концентрация антитела по настоящему изобретению, требуемая для нейтрализации 50% вируса ZIKV (IC₅₀), составляет примерно 100 нг/мл или менее, например, примерно 90 или менее, примерно 80 или менее, примерно 70 или менее, примерно 60 или менее, примерно 50 или менее, примерно 45 или менее, примерно 40 или менее, примерно 35 или менее, примерно 30 или менее, примерно 25 или менее, примерно 20 или менее или, особенно предпочтительно, примерно 15 нг/мл или менее. В частности, концентрация антитела по настоящему изобретению, требуемая для нейтрализации 50% вируса ZIKV (IC₅₀), предпочтительно составляет примерно 50 нг/мл или менее. Это означает, что только низкие концентрации антитела требуются для нейтрализации 50% вируса ZIKV. Концентрация антитела по настоящему изобретению, необходимая для 50% нейтрализации ZIKV (IC₅₀), может быть измерена с использованием стандартных методов анализа нейтрализации, известных специалистам в данной области или, в частности, по приведенному выше описанию.

В общем, связывание антитела может быть оценено с использованием стандартного метода ELISA (фермент-связанного твердофазного анализа), который хорошо известен специалистам. Вариант стандартного метода ELISA может быть следующим: в планшеты ELISA может быть нанесено покрытие (например, в течение ночи при 4°C ) в достаточном количестве (например, 1 мкг/мл) бел

- 10 043940 ка/комплекса/частиц, с которыми связывается исследуемое антитело (например, для описанного ниже связывания DENV, применяют белки E DENV и/или DENV VLP), например, в ФСБ. Планшеты затем блокируют, например, 1 мас.% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в ФСБ и инкубируют с исследуемым антителом (например, около 1,5 ч при комнатной температуре). После промывки связывание антитела может быть выявлено, например, с помощью козьего антитела против IgG человека (goat anti-human IgG), соединенного с щелочной фосфатазой. Планшеты затем могут быть промыты, требуемый субстрат (например, p-NPP) может быть внесен и планшеты могут быть прочитаны, например, при 405 нм. Относительная аффинность связывания антитела может быть определена путем измерения концентрации mAb (EC₅₀), требуемой для достижения 50% максимального связывания при насещении. Величины EC₅₀ могут быть подсчитаны путем интерполяции кривых связывания, снабженных четырехпараметрической нелинейной регрессией с переменным наклоном.

Предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению существенным образом не связываются с вирус Денге-подобными частицами и/или с белком оболочки вируса Денге. Более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению существенным образом не связываются с вирус Денге-подобными частицами и/или с белком оболочки вируса Денге какого-либо из четырех DENV серотипов DENV1, DENV2, DENV3 и DENV4. Таким образом, по существу, не связывается означает, что для антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, величина EC₅₀ не достигает 10² нг/мл, предпочтительно 103, более предпочтительно 5х10³, еще более предпочтительно 8х10³ и наиболее предпочтительно до 104 нг/мл, что может быть определено стандартным методом ELISA для вирус Денге-подобных частиц (DENV VLP) и/или белка оболочки вируса Денге (белка E DENV). Иначе говоря, концентрация антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, необходимая для достижения 50% максимального связывания при насыщении (EC₅₀) вирус Денге-подобными частицами (DENV VLP) и/или белком оболочки вируса Денге (белком E DENV) в стандартном методе ELISA обычно составляет более 10², предпочтительно более 103, более предпочтительно более 5х10³, еще более предпочтительно более 8х10³ и наиболее предпочтительно более 10⁴ нг/мл.

Предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению не способствует антитело-зависимому усилению (antibody-dependent enhancement - ADE) инфицирования вирусом Зика. Более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению блокирует антитело-зависимое повышение инфицирования (ADE) вирусом Зика. ADE можно оценить методом жидкостной цитометрии, используя, например, культивируемые клетки или линии клеток, например, клетки K562. Например, исследуемые антитела и ZIKV можно перемешивать в течение 1 ч при 37°C и вносить к 5000 K562 клеток/лунку. Через четверо суток клетки можно фиксировать, насыщать и окрашивать m4G2, например, согласно описанному выше в методах нейтрализации. Количество инфицированных клеток определяют жидкостной цитометрией, согласно описанному выше для метода нейтрализации.

Предпочтительно, антитело по настоящему изобретению, или его антигенсвязывающий фрагмент, элиминирует образование ускользающих от антител мутантов ZIKV. Элиминацию размножения ускользающих мутантов специалисты в данной области могут легко определить. Например, для определения склонности антитела или фрагмента антитела к образованию ускользающих мутантов, ZIKV неоднократно пассируют в присутствии суб-нейтрализующих концентраций исследуемого антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента. В примерах 10 и 11 настоящего изобретения ускользающие мутанты ZIKV (MARM) обычно появляются после третьего или четвертого пассажа ZIKV. Соответственно, можно читать, что антитело элиминирует размножение ускользающих мутантов вируса, если все еще ускользающие мутанты ZIKV не выявляются после пяти пассажей вируса (ZIKV) в присутствии субнейтрализующих концентраций антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению. Более предпочтительно, ускользающие мутанты ZIKV не выявляются после шести пассажей вируса (ZIKV) в присутствии суб-нейтрализующих концентраций антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению. Еще более предпочтительно, ускользающие мутанты ZIKV не выявляются после семи пассажей вируса (ZIKV) в присутствии суб-нейтрализующих концентраций антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению. Наиболее предпочтительно, ускользающие мутанты ZIKV не выявляются после восьми пассажей вируса (ZIKV) в присутствии суб-нейтрализующих концентраций антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению.

Например, чтобы оценить склонность антитела или фрагмента антитела к образованию ускользающих мутантов, ZIKV, например штамм H/PF/2013, инкубируют с различными субнейтрализующими концентрациями интересующего антитела/антигенсвязывающего фрагмента, например, по меньшей мере, в течение 30 мин, например, примерно при 37°C (температура тела). Затем добавляют (живые) клетки, например, клетки Vero, и инкубируют, например, в течение, по меньшей мере, одного дня, предпочтительно 3-4 дня, например, примерно при температуре 37°C (температура тела) чтобы допустить размножение вируса. Затем отбирают супернатанты из трех вариантов: самая низкая концентрация пред- 11 043940 ставляющего интерес антитела/антигенсвязывающего фрагмента, при которой наблюдают полную защиту монослоя клеток; концентрация, при которой наблюдают частичное воздействие CPE на монослой клеток; и концентрация, при которой 100% монослоя клеток было разрушено ZIKV CPE.

Одна часть отобранного супернатанта может быть использована для анализов микро-нейтрализации и последующего секвенирования вируса (для выявления анттело-избегающих мутантов), в то время как другая часть (того же самого) выбранного супернатанта может быть использована для следующего этапа отбора (пассажа). А именно, для следующего пассажа часть отобранного супернатанта можно смешать с различными суб-нейтрализующими концентрациями исследуемого антитела/антигенсвязывающего фрагмента и инкубировать, согласно описанному выше, с последующим добавлением (живых) клеток и инкубировать, согласно описанному выше, чтобы, наконец, снова выбрать супернатанты. Такой отбор и способ размножения повторяют на протяжении, по меньшей мере, пяти пассажей, предпочтительно, по меньшей мере, шести пассажей, более предпочтительно, по меньшей мере, семи пассажей, и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, восьми пассажей.

Предпочтительно, каждая CDR или каждая вариабельная область, по меньшей мере, один сайт связывания эпитопа антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению является CDR человека или вариабельной областью человека, соответственно. Наиболее предпочтительно, все константные области и вариабельные области, включенные в антитело, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению являются константными областями человека и вариабельными областями человека.

Также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению является моноклональным антителом, предпочтительно моноклональным, в котором каждая CDR или ее каждая вариабельная область, включенная в антитело, или ее антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению является CDR человека, или вариабельной областью человека, соответственно.

Предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению относится к типу IgG, например, типу IgG1, типу IgG2, типу IgG3 или типу IgG4, более предпочтительно, к типу IgG1. Более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению включает (i) константную область тяжелой цепи типа IgG1 CH1-CH2-CH3, где CH1 означает константный домен 1 тяжелой цепи, CH2 означает константный домен 2 тяжелой цепи, CH3 означает константный домен 3 тяжелой цепи; и (ii) константную область легкой цепи типа IgG CL, где CL означает константный домен легкой цепи. Еще более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению включает константную область тяжелой цепи типа IgG1 CH1-CH2-CH3, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 91 или 92 или функционального варианта этой последовательности, и константную область легкой цепи типа IgG CL, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 93 или 94, или функционального варианта этой последовательности.

Соответственно, предпочтительно, чтобы антитело по настоящему изобретению, или его антигенсвязывающий фрагмент, включало фрагмент Fc. Более предпочтительно, фрагмент Fc происходит от человека, например, от IgG1, IgG2, IgG3 и/или IgG4 человека, причем IgG1 человека особенно предпочтителен. Различные форматы мультиспецифических антител, включающих фрагмент Fc, известны в данной области. Предпочтительными форматами антител, включающих фрагмент Fc, являются форматы антител с присоединенным IgG, описанные выше. Как правило, антитело, содержащее фрагмент Fc, является более эффективным и обладает более длительным периодом полужизни, чем антитела или фрагменты антител без фрагмента Fc.

В контексте настоящего изобретения, понятие фрагмент Fc относится к последовательности, полученной из части тяжелой цепи иммуноглобулина, начинающейся в шарнирной области непосредственно перед сайтом расщепления папаином (например, остаток 216 в нативном IgG, принимающий первый остаток константной области тяжелой цепи, является 114) и заканчивающийся в C-конце тяжелой цепи иммуноглобулина. Соответственно, фрагмент Fc может быть полным фрагментом Fc или его частью (например, его доменом). Полный фрагмент Fc содержит, по меньшей мере, шарнирный домен, домен CH2 и домен CH3 (например, положения аминокислот 216-446 по классификации EC). Дополнительный остаток лизина (K) иногда присутствует на самом C-конце фрагмента Fc, но часто отщепляется от зрелого антитела. Каждое из аминокислотных положений во фрагменте Fc было пронумеровано в соответствии с общепризнанной в ЕС системой нумерации Kabat (см., например, Kabat с соавт., в кн.: Sequences of Proteins of Immunological Interest, Департамент здравоохранения и сферы услуг США. Службы, 1983 и 1987.

Предпочтительно, в контексте настоящего изобретения фрагмент Fc содержит, по меньшей мере, одну составляющую из следующих: домена шарнирной области (например, upper, middle, и/или lower hinge region), домена CH2, домена CH3 или их варианта, части или фрагмента. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения фрагмент Fc содержит, по меньшей мере, шарнирный домен, домен CH2 или домен CH3. Более предпочтительно, фрагмент Fc является полным фрагментом Fc. Фрагмент Fc также может включать одну или более аминокислотных инсерций, делеций или замеще- 12 043940 ний относительно природного фрагмента Fc. Например, по меньшей мере, одна из следующих составляющих, шарнирного домена, домена CH2 или домена CH3 (или их часть), может быть делетирована. Например, фрагмент Fc может включать или состоит из: (i) шарнирного домена (или его части), гибридизированного с доменом CH2 (или его частью), (ii) шарнирного домена (или его части), гибридизированного с доменом CH3 (или его частью), (iii) домена CH2 (или его части), гибридизированного с доменом CH3 (или его частью), (iv) шарнирного домена (или его части), (v) домена CH2 (или его части), или (vi) домена CH3 (или его части).

Специалистам очевидно, что фрагмент Fc может быть модифицирован таким образом, что его аминокислотная последовательность варьирует относительно полного фрагмента Fc природной молекулы иммуноглобулина, сохраняя, по меньшей мере, одну желательную функцию, обусловленную природным фрагментом Fc. Такие функции включают связывание рецептора Fc (FcR), модулирование периода полураспада антитела, ADCC function, связывание белка A, связывание белка G и связывание комплемента. Части природных фрагментов Fc, которые ответственны и/или важны для таких функций, известны специалистам в данной области.

Например, для активации каскада комплемента C1q связывает, по меньшей мере, две молекулы IgG1 или одну молекулу IgM, прикрепленную к антигенной мишени (Ward E. S., Ghetie V., Ther. Immunol. 2, 1995, 77-94). В публикации (Burton D. R., Mol. Immunol. 22, 1985, 161-206) показано, что область тяжелой цепи, включающая аминокислотные остатки с 318 по 337, участвует в фиксации комплемента. В публикации (Duncan A. R., Winter G. Nature 332, 1988, 738-740) методой сайт-направленного мутагенеза установлено, что Glu318, Lys320 и Lys322 формируют сайт связывания с C1q. Роль остатков Glu318, Lys320 и Lys322 в связывании C1q подтвердили способностью короткого синтетического пептида, содержащего эти остатки, ингибировать лизис, опосредованный комплементом.

Например, связывание FcR может быть опосредовано взаимодействием фрагмента Fc (антитела) с рецепторами Fc (FcR), которые являются специализированными рецепторами на поверхности кроветворных клеток. Было показано, что рецепторы Fc, принадлежащие надсемейству иммуноглобулинов, опосредуют как удаление покрытых антителами патогенов путем фагоцитоза иммунных комплексов, так и лизис эритроцитов и различных других клеточных мишеней (например, опухолевых клеток), покрытых соответствующим антителом, антитело-обусловленную клеточнозависимую цитотоксичность (antibody dependent cell mediated cytotoxicity - ADCC; Van de Winkel J.G., Anderson C.L., J. Leukoc. Biol. 49, 1991, 511-524). FcR определяют по специфичности в отношении классов иммуноглобулинов; рецепторы Fc для антител IgG обозначают как FcyR, для IgE - как FcεR, для IgA - как FcaR и так далее; неонатальные рецепторы Fc обозначают как FcRn. Связывание рецептора Fc описано, например, в публикации Ravetch J.V., Kinet J.P., Annu. Rev. Immunol. 9, 1991, 457-492; Capel P.J. с соавт., Immunomethods 4, 1994, 25-34; de Haas M. C. соавт., J Lab. Clin. Med. 126, 1995, 330-341; Gessner J. E. с соавт., Ann. Hematol. 76, 1998, 231248.

Перекрестное связывание рецепторов доменом Fc нативных антител IgG (FcyR) запускает широкий спектр эффекторных функций, включая фагоцитоз, антителозависимую клеточную цитотоксичность и высвобождение медиаторов воспаления, а также клиренс иммунных комплексов и регуляцию выработки антител. Следовательно, Fc-фрагменты, обеспечивающие сшивание рецепторов (FcyR), являются предпочтительными. У людей были описаны три класса FcyR, a именно: (i) FcyRI (CD64), который связывает мономерный IgG с высокой аффинностью и экспрессируется на макрофагах, моноцитах, нейтрофилах и эозинофилах; (ii) известно, что FcyRII (CD32), который связывает комплексный IgG со средней или низкой аффинностью, широко экспрессируется, в частности на лейкоцитах, является центральным игроком в опосредованном антителами иммунитете и который можно разделить на FcyRIIA, FcyRIIB и FcyRIIC, которые выполняют различные функции в иммунной системе, но связываются с аналогичным низким сродством к IgG-Fc, и эктодомены этих рецепторов являются высоко гомологичными; и (iii) FcyRIII (CD16), который связывает IgG со средним или низким сродством и существует в виде двух типов: FcyRIIIA, обнаруженный на NK-клетках, макрофагах, эозинофилах и некоторых моноцитах и T-клетках, и опосредующий ADCC и FcyRIIIB, который высоко экспрессируется на нейтрофилах. FcyRIIA обнаружен на многих клетках, участвующих в уничтожении (например, макрофаги, моноциты, нейтрофилы) и, предположительно, способен активировать процесс уничтожения клеток. Предполагают, что FcyRIIB участвует в процессах ингибирования, он обнаружен на B-клетках, макрофагах и тучных клетках, а также на эозинофилах. Важно, что 75% всех FcyRIIB обнаруживают в печени (Ganesan L.P. с соавт., J of Immunology 189, 2012, 4981-4988). FcyRIIB избыточно экспрессируется в синусоидальном эндотелии печени, обозначаемом LSEC, и в клетках Купфера в печени и LSEC, основных местах очистки малых иммунных комплексов (Ganesan L.P. с соавт., J of Immunology 189, 2012, 4981-4988).

Таким образом, в настоящем изобретении предпочтительны такие тела, и их антигенсвязывающие фрагменты, которые способны связываться с FcyRIIb, например, антитела, включающие фрагмент Fc для связывания с FcyRIIb, в частности, с областью Fc, например, антител типа IgG. Более того, возможно конструирование фрагмента Fc для повышения связывания FcyRIIB путем внедрения мутаций S267E и L328F, что описано Chu S.Y. с соавт., Molecular Immunology 45, 2008, 3926-3933. Таким образом, клиренс

- 13 043940 иммунных комплексов может быть усилен (Chu S. с соавт, 2014, в кн.: Am J Respir Crit, American Thoracic Society International Conference Abstracts). Соответственно, в контексте настоящего изобретения предпочтительны такие антитела, или их антигенсвязывающие фрагменты, которые включают сконструированный фрагмент Fc с мутациями S267E и L328F, в частности, согласно описанию Chu S.Y. с соавт., Molecular Immunology 45, 2008, 3926-3933. На B-клетках он, по-видимому, действует, подавляя дальнейшую выработку иммуноглобулина и переключение изотипов, например, класса IgE. На макрофагах FcyRIIB действует, подавляя фагоцитоз, опосредуемый через FcyRIIA. На эозинофилах и тучных клетках b-форма может способствовать супрессии активации таких клеток через связывание IgE с их отдельным рецептором.

Касательно связывания FcyRI, модификация в нативном IgG, по меньшей мере, одного остатка из E233-G236, P238, D265, N297, A327 и P329, снижает связывание с FcyRI. Остатки IgG2 в положениях 233-236, замещенных в IgG1 и IgG4, снижает связывание с FcyRI в 103 раз и элиминирует ответ моноцитов человека на сенсибилизированные антителами эритроциты (Armour K.L. с соавт., Eur. J. Immunol. 29, 1999, 2613-2624). Касательно связывания FcyRII установлено, что пониженное связывание FcyRIIA, например, для мутации IgG, по меньшей мере, одного остатка из E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 и K414. Касательно связывания FcyRIII, пониженное связывание с cyRIIIA установлено, например, по меньшей мере, для одного остатка из E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 и D376. Картирование сайтов связывания на IgG1 человека для рецепторов Fc, указанные выше сайты мутирования и методы измерения связывания с FcyRI и FcyRIIA описаны в публикации Shields R.L. с соавт., J. Biol. Chem. 276, 2001, 6591-6604.

Касательно связывания с критическим FcyRII, две области нативного Fc IgG, по-видимому, являются критическими для взаимодействия FcyRIIs и IgG, a именно (i) нижнего шарнирного сайта IgG Fc, в частности, аминокислотные остатки L, L, G, G (234 - 237, нумерация EU), и (ii) смежная область домена CH2 в Fc IgG, в частности, петлю и нити в верхнем домене CH2, примыкающем к нижней шарнирной области, например, области (Wines B.D. с соавт., J. Immunol. 164, 2000, 5313-5318). Более того, FcyRI, повидимому, связывается с одним и тем же сайтом на Fc IgG, тогда как FcRn и белок A связываются с разными сайтами в Fc IgG, который, по-видимому, находится на границе раздела CH2-CH3 (Wines B.D. с соавт., J. Immunol. 164, 2000, 5313-5318).

Например, фрагмент Fc может включать или состоять, по меньшей мере, из части фрагмента Fc, о котором известно, что он необходим для связывания FcRn или продления полу-жизни. В другом варианте или дополнительно фрагмент Fc антитела по настоящему изобретению включает, по меньшей мере, известную в данной области часть, необходимую для связывания белка A и/или фрагмента Fc антитела по настоящему изобретению, содержащее, по меньшей мере, часть молекулы Fc, о которой известно, что она необходима для связывания белка G. Предпочтительно, сохраняемой функцией является нейтрализация вирусной инфекции Зика, которая, как предполагается, опосредуется связыванием FcyR. Соответственно, предпочтительный фрагмент Fc включает, по меньшей мере, часть, о которой в данной области известно, что она необходима для связывания FcyR. Выше отмечено, что предпочтительный фрагмент Fc, таким образом, может, по меньшей мере, содержать (i) сайт нижнего шарнира нативного Fc IgG, в частности, аминокислотные остатки L, L, G, G (234-237, нумерация Евросоюза (EU)), и (ii) примыкающую область домена CH2 нативного Fc IgG, в частности, петли и нити в верхнем домене CH2, примыкающем к нижней шарнирной области, например, в области P331, например, области, по меньшей мере, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 последовательных аминокислот в верхнем домене CH2 нативного Fc IgG вокруг P331, например, между аминокислотами 320 и 340 (нумерация EU) нативного Fc IgG.

Предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит область Fc. В контексте настоящего изобретения понятие область Fc относится к части иммуноглобулина, сформированной двумя или более фрагментами Fc тяжелых цепей антитела. Например, область Fc может быть мономерной или одноцепочечной областью Fc (т.е., областью scFc). Одноцепочечные области Fc состоят из фрагментов Fc, связанных в одну полипептидную цепь (например, кодируемую одной непрерывной последовательностью нуклеиновой кислоты). Примеры областей scFc описаны в WO 2008/143954 A2. Предпочтительно область Fc является димерной. Понятие димерная область Fc или dcFc означает димер, сформированный фрагментами Fc двух разных тяжелых цепей иммуноглобулина. Димерная область Fc может быть гомодимером двух идентичных фрагментов Fc (например, области Fc природного иммуноглобулина) или гетеродимером двух неидентичных фрагментов Fc.

Фрагменты Fc области Fc могут принадлежать к одному или разным классам/подклассам. Например, фрагменты Fc могут быть производными от иммуноглобулина (например, иммуноглобулина человека) из подклассав IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Предпочтительно, фрагменты Fc области Fc из одного класса или подкласса. Однако область Fc (или одна или более фрагментов Fc области Fc) также может быть химерной, посредством чего химерная область Fc может содержать фрагменты Fc, производные от разных классов и/или подклассов иммуноглобулина. Например, по меньшей мере, два фрагмента Fc димерной или одноцепочечной области Fc могут быть от разных классов и/или подклассов иммуноглобулина. Дополнительно или в другом варианте, химерные области Fc могут содержать один химерный

- 14 043940 фрагмент или более Fc. Например, химерная область или фрагмент Fc может включать одну или более частей, производных от иммуноглобулина первого подкласса (например, подкласса IgG1, IgG2 или IgG3), хотя остальная часть области или фрагмента Fc относится к другому подклассу. Например, область Fc или фрагмент полипептида Fc может включать домен CH2 и/или CH3, производный от иммуноглобулина первого подкласса (например, подкласса IgG1, IgG2 или IgG4), и шарнирную область от иммуноглобулина второго подкласса (например, подкласса IgG3). Например, область Fc или фрагмент могут включать шарнир и/или домен CH2, производный от иммуноглобулина первого подкласса (например, подкласса IgG4) и домен CH3 от иммуноглобулина второго подкласса (например, подкласса IgG1, IgG2 или IgG3). Например, химерная область Fc может включать фрагмент Fc (например, полный фрагмент Fc) от иммуноглобулина первого подкласса (например, подкласса IgG4) и фрагмент Fc от иммуноглобулина второго подкласса (например, подкласса IgG1, IgG2 или IgG3). Например, область Fc или фрагмент могут включать домен CH2 из иммуноглобулина IgG4 и домен CH3 из иммуноглобулина IgG1. Например, область Fc или фрагмент могут включать домен CH1 и домен CH2 из молекулы IgG4 и домен CH3 из молекулы IgG1. Например, область или фрагмент Fc могут содержать часть домена CH2 от определенного подкласса антитела, например, в EU положениях 292-340 домена CH2. Например, область Fc или фрагмент могут включать аминокислоты в положениях 292-340 в домене CH2, производном от фрагмента IgG4, и остаток CH2, производного от фрагмента IgG1 (в другом варианте, 292-340 домена CH2 могут быть производными от фрагмента IgG1 и остатка CH2 от фрагмента IgG4).

Более того, область Fc или фрагмент Fc может (дополнительно или в другом варианте), например, включать химерную шарнирную область. Например, химерный шарнир может быть производным, например, частично, от молекулы IgG1, IgG2 или IgG4 (например, верхняя и нижняя последовательность шарнира) и, в частности, от молекулы IgG3 (например, средняя последовательность шарнира). В другом примере область или фрагмент Fc могут включать химерный фрагмент, производный, в частности, от молекулы IgG1, и, в частности, от молекулы IgG4. В другом примере химерный фрагмент может включать верхний и нижний домены шарнира от молекулы IgG4 и средний домен шарнира от молекулы IgG1. Такой химерный фрагмент может быть получен, например, путем интродукции замещения пролина (Ser228Pro) в положении EU 228 в среднем домене шарнира шарнирной области IgG4. В другом варианте осуществления настоящего изобретения химерный шарнир может включать аминокислоты в положении EU 233-236 от антитела IgG2 и/или мутацию Ser228Pro, причем оставшиеся аминокислоты шарнира происходят от антитела IgG4 (например, химерный шарнир последовательности ESKYGPPCPPCPAPPVAGP). Другие химерные шарниры, которые могут быть применены во фрагменте Fc антитела по настоящему изобретению, описаны в US 2005/0163783 A1.

В настоящем изобретении предпочтительно, если фрагмент Fc, или область Fc, включает или состоит из аминокислотной последовательности, производной от последовательности иммуноглобулина человека (например, от области Fc или фрагмента Fc от молекулы IgG человека). Однако полипептиды могут включать одну или более аминокислот от другого вида млекопитающих. Например, фрагмент Fc приматов или сайт связывания приматов могут быть включены в полипептиды субъекта. В другом варианте, одна или несколько аминокислот мыши могут содержаться во фрагменте Fc или в области Fc.

Предпочтительно, антитело по настоящему изобретению содержит, в частности дополнительно к фрагменту Fc, согласно описанному выше, другие части, производные от константной области, в частности из константной области IgG, предпочтительно из константной области IgG1, более предпочтительно, из константной области IgG1 человека. Более предпочтительно, антитело по настоящему изобретению содержит, в частности, дополнительно к фрагменту Fc, согласно описанному выше, все другие части константных областей, в частности, все другие части константных областей IgG, предпочтительно, все другие части константных областей IgG1, более предпочтительно, все другие части константных областей IgG1 человека.

Особенно предпочтительными последовательностями константных областей являются аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 91-94 (кодируемые, например, последовательностями нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 95-98, соответственно). Предпочтительно, аминокислотная последовательность IgG1 CH1-CH2-CH3 соответствует SEQ ID NO: 91, или варианту функциональной последовательности, согласно описанию настоящего изобретения. Еще более предпочтительно, аминокислотная последовательность IgG1 CH1-CH2-CH3 соответствует SEQ ID NO: 92 или функциональному варианту этой последовательности, согласно описанию настоящего изобретения, где мутация LALA сохраняется. Выше было отмечено, что особенно предпочтительное антитело по настоящему изобретению содержит (полную) область Fc, производную от IgG1 человека. Более предпочтительно, антитело по настоящему изобретению содержит, в частности, дополнительно к (полной) области Fc, производной от IgG1 человека, также все части константных областей IgG, предпочтительно все другие части константных областей IgG1, более предпочтительно, все другие части константных областей IgG1 человека.

Не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что антитело-зависимое усиление (antibodydependent enhancement - ADE) инфекции вируса Зика вызывается связыванием фрагмента Fc антитела, в частности, фрагмента Fc тяжелой цепи молекулы IgG. к Fc-рецептору, например, рецептору Fcy на клетке-хозяине. Таким образом, предпочтительно, чтобы антитело по настоящему изобретению, или его ан

- 15 043940 тигенсвязывающий фрагмент, содержало одну или более мутаций во фрагменте Fc. Мутация (мутациии) может быть какой-либо мутацией, которая уменьшает связывание антитела с рецептором Fc (FcR), в частности уменьшает связывание антитела с рецептором Fcy (FcyR). С другой стороны, предпочтительно, чтобы антитело по настоящему количеству содержало (полный/полную) фрагмент Fc/область Fc, причем взаимодействие/связывание с FcRn не нарушено. Соответственно, особенно предпочтительно, чтобы антитело по настоящему изобретению, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержало одну или более мутаций во фрагменте Fc, которые (i) уменьшают связывание антитела с рецептором Fcy, но не нарушают взаимодействие с FcRn. Одним из примеров таких мутаций является мутация LALA, описанная ниже.

В общем, связывание антитела с рецептором Fc может оцениваться разными методами, известными специалистам, например, методом ELISA (Hessell A.J. с соавт., Nature, 449, 2007, 101-104; Grevys A. с соавт. Fc Engineering of Human IgG1 for Altered Binding to the Neonatal Fc Receptor Affects Fc Effector Functions. 2015, 194:5497-5508) методом жидкостной цитометрии (Perez L.G. с соавт., J Virol, 83, 2009, 7397-7410; Piccoli L. с соавт., Nat Commun 2015, 6, 1-9).

В общем, антитело по настоящему изобретению может быть гликозилированным. N-связанные гликаны, присоединенные к домену CH2 тяжелой цепи, например, могут влиять на связывание C1q и FcR, причем агликозилированные антитела имеют более низкое сродство к этим рецепторам. Соответственно, домен CH2 фрагмента Fc антитела по настоящему изобретению может включать одну или более мутаций, в которых гликозилированный остаток замещен негликозилированным остатком. Структура гликана также может влиять на активность, например, различия в опосредованной комплементом гибели клеток могут наблюдаться в зависимости от количества молекул сахара галактозы (0, 1 или 2) на конце биантернарной цепи гликана. Предпочтительно, гликаны антитела не приводят к иммуногенному ответу у человека после введения.

Кроме того, антитело по настоящему изобретению может быть модифицировано путем интродукции случайных аминокислотных мутаций в определенную область домена CH2 или CH3 тяжелой цепи, чтобы изменить их а связывающую аффинность с FcR и/или их период полужизни в сыворотке по сравнению с немодифицированными антителами. Примеры таких модификаций включают, но ими не ограничиваются, замещения, по меньшей мере, одной аминокислоты из константной области тяжелой цепи, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных остатков 250, 314 и 428.

Особенно предпочтительно, фрагмент Fc антитела по настоящему изобретению содержит замещение в положениях CH2 4, CH2 5 или в обоих. В общем, аминокислота в положениях 4 и 5 CH2 IgG1 и IgG3 дикого типа является лейцином (L). Предпочтительно, антитело по настоящему изобретению содержит аминокислоту в положении CH2 4, CH2 5 или в обоих, которая не является L. Более предпочтительно, антитело по настоящему изобретению содержит аланин (A) в положении CH2 4 или CH2 5 или в обоих. Наиболее предпочтительно, антитело по настоящему изобретению содержит как замещение CH2 L4A, так и CH2 L5A. Такие антитела упоминаются в настоящем изобретении обозначают LALA. Интересно, что такая мутация LALA во фрагменте Fc не только приводит к отсутствию вклада соответствующего антитела в антитело-зависимое усиление (ADE) инфекции вируса Зика, но также блокирует антитело-зависимое усиление (ADE) инфекции вируса Зика. Типичная аминокислотная последовательность IgG1 CH1-CH2-CH3, содержащая мутацию LALA, соответствует SEQ ID NO: 92. Соответственно, аминокислотная последовательность IgG1 CH1-CH2-CH3 находится в соответствии с SEQ ID NO: 92 или его вариант функциональной последовательности, как описано в данном изобретении, где мутация LALA сохраняется. Наиболее предпочтительно, антитело имеет формат FIT-Ig, описанный выше, содержащий мутацию LALA во фрагменте Fc, согласно описанному в настоящем изобретении.

Предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению не включает сайта связывания рецептора Fc. Более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, не включает область Fc, еще более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, не включает фрагмент Fc. Различные форматы мультиспецифических антител без фрагмента Fc известны в данной области и описаны выше.

Согласно описанному выше, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению, предпочтительно специфически связывается с (по меньшей мере, двумя) разными эпитопами белка оболочки вируса Зика (E белок ZIKV). Более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывается с доменом III белка оболочки вируса Зика (EDIII, также обозначаемым DIII). Иначе говоря, предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению связывается с эпитопом белка оболочки вируса Зика, который включает один или несколько аминокислотных остатков домена III белка оболочки вируса Зика (EDIII). ZIKV включает нуклеокапсидную сердцевину, которая включает одноцепочечную РНК, окруженную сердцевинными белками. Нуклеокапсидная сердцевина инкапсулирована липидной двуслойной мембраной с мембранными белками и белками оболочки. Белок оболочки ZIKV (E белок) является доминантным антигеном. Эктодомен белка оболочки включает три разных домена: домен E белка I (EDI), домен II белка E (EDII) и домен III белка E (EDIII). EDIII высоко консервативен среди разных штаммов ZIKV (см. фиг. 8 для вы- 16 043940 равнивания аминокислотных последовательностей EDIII различных штаммов ZIKV). Антитела, связывающиеся с доменом III белка оболочки вируса Зика (EDIII), показывают (i) повышенную нейтрализацию ZIKV и (ii) пониженную перекрестную реактивность с DENV (в частности, по существу отсутствие перекрестной реактивности с DENV) по сравнению с антителами, связывающимися с доменом I/II белка оболочки вируса Зика (EDI/II).

Соответственно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, более предпочтительно связывается с доменом III белка оболочки вируса Зика (EDIII) с EDIII, имеющим следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 263):

TAAFTFTKXPAEXXHGTVTVEXQYXGXDGPCKXPXQMAVDXQTLTPVGRLITANPVIT

EXTENSKMMLELDPPFGDSYIVIGXGXKKITHHWHRS где X может быть какой-либо (природной) аминокислотой. Иначе говоря, предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению связывается с эпитопом белка оболочки вируса Зика, который включает один или более аминокислотных остатков из SEQ ID NO: 263.

Также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению, связывается с доменом III белка оболочки вируса Зика, (EDIII) с EDIII, содержащим следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 265):

X1GX2X3YSLCTAAFTFTKX4PAEX₅X6HGTVTVEX7QYX8GX9DGPCKX_1OPX11QM

AVDXuQTLTPVGRLITANPVITEXBTXMNSKMMLELDPPFGDSYIVIGXnGXieXn

KITHHWHRSG в которой X1 может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно K, A или E,

X₂ может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно V, F, или L,

X₃ может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно S или F,

X4 может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно I или V, X₅ может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно T или V, X₆ может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно L или D, X₇ может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно V или G, X₈ может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно A или G, X₉ может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно T или A, X₁₀ может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно V или I, Х_и может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно A или V, X₁₂ может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно M или T, X13 может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно S или G, X14 может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно E или K, X15 может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно V или I, X₁₆ может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно E, A, K, или D, X₁₇ может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно E, A, или K, более предпочтительно K или A.

Иначе говоря, предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению связывается с эпитопом белка оболочки вируса Зика, который включает один или несколько аминокислотных остатков последовательности SEQ ID NO: 265.

Например, отрезки EDIII от аминокислоты 309 до амнокислоты 403 белка E ZIKV штамма ZIKV H/PF/2013 (номер в базе данных Genbank KJ776791). Соответственно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, наиболее предпочтительно связывается с доменом III белка оболочки вируса Зика (EDIII) с EDIII, имеющим следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 264):

TAAFTFTKIPAETLHGTVTVEVQYAGTDGPCKVPAQMAVDMQTLTPVGRLITANPVITE

STENSKMMLELDPPFGDSYIVIGVGEKKITHHWHRS.

Иначе говоря, предпочтительно, чтобы антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению связывался с белком оболочки вируса Зика, который включает один или несколько аминокислотных остатков последовательности SEQ ID NO: 264.

Более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению связывается с эпитопом белка оболочки вируса Зика, который включает один или несколько аминокислотных остатков бокового гребня (LR) в EDIII и/или один или несколько аминокислотных остатков шарнирной области EDI-EDIII. EDIII бокового гребня и EDI-EDIII шарнирной области известны специалистам и описаны, например, Zhao H. с соавт., Cell 166(4), 2016, 1016-1027, и Kostyuchenko V.A. с соавт., Nature. 533(7603016), 2016, 425-428. Не ограничиваясь какой-либо теорией, приходят к заключению, что (i) связываясь с LR, можно ингибировать слияние путем захвата переходного состояния слияния вируса и (ii) связывания с шарниром EDI-EDIII и EDIII можно препятствовать движению EDIII с образованием тримерной структуры после слияния, тем самым останавливая слияние мембран.

Соответственно, предпочтительно, чтобы антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению (были способны) ингибировать стадию после присоединения ZIKV. Понятие

- 17 043940 после присоединения обычно означает какую-либо стадию инфицирования ZIKV после присоединения ZIKV к мембране клетки (клетки, на которую нацелен ZIKV). Например, предпочтительно, чтобы антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению (были способны) препятствовать слиянию мембран. Кроме того, предпочтительно, чтобы антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению (были способны) вызывать агрегирование ZIKV (частиц). Наиболее предпочтительно, чтобы антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению (были способны) (i) ингибировать стадию после присоединения ZIKV и (ii) вызывать агрегирование ZIKV (частиц). Особенно предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению включает, по меньшей мере, одну CDR, предпочтительно все шесть CDR, более предпочтительно вариабельную область, еще более предпочтительно обе вариабельные области (т.е. сайт связывания эпитопа), в частности специфичность, в качестве примера антитела человека ZKA190, которое связывается с ZIKV EDIII (см. пример 1, фиг. 1). Аминокислотные последовательности CDR и вариабельные области ZKA190, которые предпочтительно содержатся в антителе, или его антигенсвязывающем фрагменте, по настоящему изобретению, описаны в табл. 1 и 2 ниже.

Также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, несмотря на значительную нейтрализующую активность, такие антитела обычно не обнаруживают связывания с рекомбинантным E белком ZIKV или с EDIII ZIKV в стандартном методе ELISA (согласно описанному выше), т.е. при тестировании in vitro, в частности, в очищенной форме (то есть с E белком ZIKV вне/без вириона, вирусоподобной частицы или тому подобного). Таким образом, невыявляемое связывание обычно означает, что при использовании стандартного метода ELISA не было обнаружено EC₅₀ до 10000 нг/мл. Иначе говоря, если обнаруживаемый при стандартном методе ELISA показатель EC₅₀ выше 10000 нг/мл, значит в таком случае наблюдают невыявляемое связывание.

Следовательно, такие антитела также упоминаются в настоящем изобретении как нейтрализующие не-Б-связывающие (neutralizing-non-E-binding - NNB) антитела. Четвертичный эпитоп, локализованный на инфекционном вирионе ZIKV, обычно является конформационным эпитопом. Например, четвертичный эпитоп, локализованный на инфекционном вирионе ZIKV, может формироваться на границе раздела двух мономеров белка оболочки, образуя димер (эпитоп димера оболочки; envelope dimer epitope EDE), или он может формироваться через соседние димеры (эпитоп, соединяемый по типу ёлочки).

Особенно предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит, по меньшей мере, одну CDR, предпочтительно, все шесть CDR, более предпочтительно, вариабельную область, еще более предпочтительно обе вариабельные области (т.е. сайт связывания эпитопа), в частности, специфичность, приведенного в качестве примера антитела человека ZKA230, которое связывается с четвертичным эпитопом, локализованным на инфекционном вирионе ZIKV (см. пример 1, фиг. 1). Аминокислотные последовательности CDR и вариабельные области ZKA230, которые предпочтительно включены в антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению, описаны ниже в табл. 1 и 2.

Также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с доменом II белка оболочки вируса Зика (EDII). EDII является удлиненным напоминающим палец доменом, содержащим консервативную петлю слияния, которая взаимодействует с эндосомальной мембраной клетки-хозяина, простирающейся примерно от аминокислоты в положении 52 до аминокислоты в положении 132 и примерно от аминокислоты в положении 193 до аминокислоты в положении 280 белка E ZIKV (Dai L. с соавт., Cell Host Microbe, 19(5), 2016, 696-704).

Особенно предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит, по меньшей мере, одну CDR, предпочтительно все шесть CDR, более предпочтительно, вариабельную область, еще более предпочтительно, обе вариабельные области (т.е. сайт связывания эпитопа), в частности, специфичность, приведенного в качестве примера антитела человека ZKA185, которое связывается с ZIKV EDII. Аминокислотные последовательности CDR и вариабельных областей ZKA185, которые предпочтительно включены в антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению, описаны ниже в табл. 1 и 2.

Предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению (i) связывается с доменом III белка оболочки вируса Зика (EDIII) и (ii) связывается с доменом II белка оболочки вируса Зика (EDII). Иначе говоря, предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению включает (i) сайт связывания эпитопа, который специфически связывается с доменом III белка оболочки вируса Зика (EDIII), и (ii) сайт связывания эпитопа, который специфически связывается с доменом II белка оболочки вируса Зика (EDII). Согласно описанному выше, предпочтительно, если домен III белка оболочки вируса Зика включал или состоял из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 263 или 265, в особенности, SEQ ID NO: 264.

Более того, согласно описанному выше, также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывается с эпитопом белка оболочки вируса Зика, который включает один или более аминокислотных остатков бокового гребня (LR) EDIII и/или один или более аминокислотных остатков шарнирной области EDI-EDIII. Иначе говоря, сайт связывания эпитопа, нацеливающийся на EDIII, связывается с одним или более аминокислотными остатками бокового гребня (LR) EDIII и/или

- 18 043940 одним или более аминокислотными остатками шарнирной области EDI-EDIII.

Также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению (i) связывается с доменом III белка оболочки вируса Зика Zika (EDIII) и (ii) связывается с четвертичным эпитопом, представленным на инфекционном вирионе ZIKV. Иначе говоря, предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению включает (i) сайт связывания эпитопа, который специфически связывается с доменом III белка оболочки вируса Зика (EDIII), и (ii) сайт связывания эпитопа, который специфически связывается с четвертичным эпитопом, представленным на инфекционном вирионе ZIKV. Согласно описанному выше, предпочтительно, если домен III белка оболочки вируса Зика содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 263 или 265, в особенности, SEQ ID NO: 264. Более того, согласно описанному выше, также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывается с эпитопом белка оболочки вируса Зика, который включает один или несколько аминокислотных остатков бокового гребня (LR) EDIII и/или один или несколько аминокислотных остатков шарнирной области EDI-EDIII. Иначе говоря, сайт связывания эпитопа, нацеливающийся на EDIII, предпочтительно связывается с одним или несколькими аминокислотными остатками бокового гребня (LR) EDIII и/или одним или несколькими аминокислотными остатками шарнирной области EDI-EDIII.

В общем, единственный сайт связывания эпитопа (также называемый паратопом или рецептором антигена) антитела по настоящему изобретению, или его антигенсвязывающего фрагмента, предпочтительно содержит три области, определяющие комплементарность (CDR) в тяжелой цепи и (по меньшей мере) три CDR в легкой цепи. В общем, области, определяющие комплементарность (CDR) являются гипервариабельными областями, содержащимися в вариабельных доменах тяжелой цепи, и вариабельными доменами легкой цепи.

Обычно CDR тяжелой цепи и связанной легкой цепи антитела вместе образуют рецептор антигена (сайт связывания эпитопа). Обычно три CDR (CDR1, CDR2 и CDR3) расположены в вариабельном домене не последовательно. Поскольку сайты связывания эпитопа обычно состоят из двух вариабельных доменов (например, на двух разных полипептидных цепях, т.е. тяжелой и легкой цепи), для каждого сайта связывания эпитопа имеется шесть CDR (тяжелая цепь: CDRH1, CDRH2 и CDRH3; легкая цепь: CDRL1, CDRL2 и CDRL3). CDR в тяжелой и/или легкой цепи могут быть разделены каркасными областями, причем каркасная область (framework region - FR) является областью вариабельного домена, которая менее вариабельная, чем CDR. Например, последовательность (или каждая последовательность, соответственно) может состоять из четырех каркасных областей, разделенных тремя CDR.

Были определены последовательности тяжелых цепей и легких цепей различных примеров антител человека против белка E вируса ZIKV, включающие три разные CDR в тяжелой цепи и три разные CDR в легкой цепи (см. приведенные ниже табл. 1 и 2). Положение аминокислот CDR выражено в соответствии системой нумерации IMGT (IMGT: http://www.imgt.org/; cf. Lefranc M.-P. С соавт., Nucleic Acids Res. 37, 2009, D1006-D1012). Предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению comprises по меньшей мере, одну CDR в приводимых ниже примерах антител. Более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению включает все шесть CDR (сайта связывания антитела) в приводимых ниже примерах антител. Еще более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению включает вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL) в приводимых ниже примерах антител.

- 19 043940

Таблица 1

SEQ ID NO аминокислотных последовательностей CDR тяжелой цепи (CDRH1, CDRH2 и CDRH3) и вариабельной области тяжелой цепи (называемой VH) типичных антител

Обозначение антитела	CDRH1	CDRH2	CDRH3	VH
ZKA190	1	2	3	8
ZKA185	19	20	21	26
ZKA230	37	38	39	44
ZKA78	55	56	57	62
ZKA64	73	74	75	80
ZKA3	99	100	101	102
ZKA4	103	104	105	106
ZKA5	107	108	109	110
ZKA6	111	112	ИЗ	114
ZKA7	115	116	117	118
ZKA8	119	120	121	122
ZKA76	123	124	125	126
ZKA117	127	128	129	130
ZKB27	131	132	133	134
ZKB29	135	136	137	138
ZKB34	139	140	141	142
ZKB39	143	144	145	146
ZKB46	147	148	149	150
ZKB53	151	152	153	154
ZKC26	155	156	157	158
ZKD5	159	160	161	162
ZKD7	163	164	165	166
ZKD8	167	168	169	170
ZKD15	171	172	173	174
ZKD16	175	176	177	178
ZKD17	179	180	181	182
ZKD20	183	184	185	186
ZKA134	187	188	189	190
ZKA246	191	192	193	194
ZKA256	195	196	197	198
ZKB42	199	200	201	202
ZKB85	203	204	205	206
ZKB47	207	208	209	210
ZKC6	211	212	213	214
ZKA160	215	216	217	218
ZKA172	219	220	221	222
ZKA174	223	224	225	226
ZKA189	227	228	229	230
ZKA195	231	232	233	234
ZKA215	235	236	237	238
ZKA218	239	240	241	242
ZKB75	243	244	245	246
ZKB83	247	248	249	250
ZKC3	251	252	253	254
ZKC18	255	256	257	258
ZKD1	259	260	261	262

Таблица 2

SEQ ID NO аминокислотных последовательностей CDR легкой цепи (CDRL1, CDRL2 и CDRL3) и вариабельной области легкой цепи (называемой VL) типичных антител

Обозначение антитела	CDRL1	CDRL2	CDRL2 long	CDRL3	VL
ZKA190	4	5	6	7	9
ZKA185	22	23	24	25	27
ZKA230	40	41	42	43	45
ZKA78	58	59	60	61	63
ZKA64	76	77	78	79	81

Таким образом, предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит аминокислотные последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR, последовательности VH и/или последовательности VL, представленных в табл. 1 и/или табл. 2.

- 20 043940

Предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRH1, по меньшей мере, одну CDRH2 и, по меньшей мере, одну CDRH3, и легкую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRL1, по меньшей мере, одну CDRL2 и, по меньшей мере, одну CDRL3, причем, по меньшей мере, одна CDR, предпочтительно, по меньшей мере, одна CDRH3 тяжелой цепи включает или состоит из какой-либо из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 3, 75, 39, 21, 57, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257 и 261, или функционального варианта этих последовательностей, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этой последовательности.

Более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRH1, по меньшей мере, одну CDRH2 и, по меньшей мере, одну CDRH3, и легкую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRL1, по меньшей мере, одну CDRL2 и, по меньшей мере, одну CDRL3, причем, по меньшей мере, одна CDR, предпочтительно, по меньшей мере, одна CDRH3 тяжелой цепи включает или состоит из какой-либо из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 3, 21 и 39, 57 и 75 или функционального варианта этих последовательностей, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этой последовательности.

Более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRH1, по меньшей мере, одну CDRH2 и, по меньшей мере, одну CDRH3, и легкую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRL1, по меньшей мере, одну CDRL2 и, по меньшей мере, одну CDRL3, причем, по меньшей мере, одна CDR, предпочтительно, по меньшей мере, одна CDRH3 тяжелой цепи включает или состоит из какой-либо из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 3, 21 и 39 или функционального варианта этих последовательностей, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этой последовательности.

Также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRH1, по меньшей мере, одну CDRH2 и, по меньшей мере, одну CDRH3, и легкую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRL1, по меньшей мере, одну CDRL2 и, по меньшей мере, одну CDRL3, причем, по меньшей мере, одна CDR, предпочтительно, по меньшей мере, одна CDRH3 тяжелой цепи включает или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 39, или функционального варианта этих последовательностей, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этой последовательности.

Наиболее предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRH1, по меньшей мере, одну CDRH2 и, по меньшей мере, одну CDRH3, и легкую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRL1, по меньшей мере, одну CDRL2 и, по меньшей мере, одну CDRL3, причем, по меньшей мере, одна CDR, предпочтительно, по меньшей мере, одна CDRH3 тяжелой цепи включает или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 или функционального варианта этой последовательности, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этой последовательности.

Более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRH1, по меньшей мере, одну CDRH2 и, по меньшей мере, одну CDRH3, и легкую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRL1, по меньшей мере, одну CDRL2 и, по меньшей мере, одну CDRL3, причем (i) по меньшей мере, одна CDRH1 тяжелой цепи включает какую-либо аминокислотную последовательность из последовательностей SEQ ID NO: 1,19, 37, 55, 73, 99, 103, 107, 111, 115, 119, 123, 127, 131, 135, 139, 143, 147, 151, 155, 159, 163, 167, 171, 175, 179, 183, 187, 191, 195, 199, 203, 207, 211, 215, 219, 223, 227, 231, 235, 239, 243, 247, 251, 255 и 259, или функциональный вариант этих последовательностей, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по

- 21 043940 меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этой последовательности.

Более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRH1, по меньшей мере, одну CDRH2 и, по меньшей мере, одну CDRH3, и легкую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRL1, по меньшей мере, одну CDRL2 и, по меньшей мере, одну CDRL3, причем, по меньшей мере, одна CDR, предпочтительно, по меньшей мере, одна CDRH3 тяжелой цепи включает или состоит из какой-либо из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 3, 21 и 39 или функционального варианта этих последовательностей, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этой последовательности;

(ii) по меньшей мере, одна CDRH2 включает какую-либо аминокислотную последовательность из последовательностей SEQ ID NO: 2, 20, 38, 56, 74, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256 и 260, или функциональный вариант этих последовательностей, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этой последовательности; и/или (iii) по меньшей мере, одна CDRH3 тяжелой цепи содержит какую-либо аминокислотную последовательность из последовательностей SEQ ID NO: 3, 21, 39, 57, 75, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257 и 261, или функциональный вариант этих последовательностей, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этой последовательности.

Еще более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь, содержащую, по меньшей мере, одну CDRH1, по меньшей мере, одну CDRH2 и, по меньшей мере, одну CDRH3, и легкую цепь, содержащую, по меньшей мере, одну CDRL1, по меньшей мере, одну CDRL2 и, по меньшей мере, одну CDRL3, причем (i) по меньшей мере, одна CDRH1 тяжелой цепи включает какую-либо аминокислотную последовательность из последовательностей SEQ ID NO: 1,19, 37, 55 и 73 или функциональный вариант этих последовательностей, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этой последовательности;

(ii) по меньшей мере, одна CDRH2 включает какую-либо аминокислотную последовательность из последовательностей SEQ ID NO: 2, 20, 38, 56 и 74 или функциональный вариант этих последовательностей, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этой последовательности; и/или (iii) по меньшей мере, одна CDRH3 тяжелой цепи содержит какую-либо аминокислотную последовательность из последовательностей SEQ ID NO: 3, 21, 39, 57 и 75 или функциональный вариант этих последовательностей, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этой последовательности.

Еще более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRH1, по меньшей мере, одну CDRH2 и, по меньшей мере, одну CDRH3 и легкую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRL1, по меньшей мере, одну CDRL2 и, по меньшей мере, одну CDRL3, причем (i) по меньшей мере, одна CDRH1 тяжелой цепи включает какую-либо аминокислотную последовательность из последовательностей SEQ ID NO: 1,19 и 37, или функциональный вариант этих последовательностей, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этой последовательности;

(ii) по меньшей мере, одна CDRH2 включает какую-либо аминокислотную последовательность из последовательностей SEQ ID NO: 2, 20 и 38, или функциональный вариант этих последовательностей,

- 22 043940 который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на

85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этой последовательности; и/или (iii) по меньшей мере, одна CDRH3 тяжелой цепи содержит какую-либо аминокислотную последовательность из последовательностей SEQ ID NO: 3, 21 и 39, или функциональный вариант этих последовательностей, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этой последовательности.

Еще более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRH1, по меньшей мере, одну CDRH2 и, по меньшей мере, одну CDRH3 и легкую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRL1, по меньшей мере, одну CDRL2 и, по меньшей мере, одну CDRL3, причем (i) по меньшей мере, одна CDRH1 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 73 или функциональный вариант этих последовательностей, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен такой последовательности;

(ii) по меньшей мере, одна CDRH2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 74 или функциональный вариант этих последовательностей, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этой последовательности; и/или (iii) по меньшей мере, одна CDRH3 тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из последовательностей SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 75 или функциональный вариант этих последовательностей, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этой последовательности.

Также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRH1, по меньшей мере, одну CDRH2 и, по меньшей мере, одну CDRH3, и легкую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRL1, по меньшей мере, одну CDRL2 и, по меньшей мере, одну CDRL3, причем (i) по меньшей мере, одна CDRH1 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 37 или функциональный вариант этих последовательностей, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен такой последовательности;

(ii) по меньшей мере, одна CDRH2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 38 или функциональный вариант этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; и/или (iii) по меньшей мере, одна CDRH3 тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 39 или функциональный вариант этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этой последовательности.

Наиболее предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRH1, по меньшей мере, одну CDRH2 и, по меньшей мере, одну CDRH3, и легкую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRL1, по меньшей мере, одну CDRL2 и, по меньшей мере, одну CDRL3, причем (i) по меньшей мере, одна CDRH1 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или функциональный вариант этой последовательности, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по мень-

- 23 043940 шей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен такой последовательности;

(ii) по меньшей мере, одна CDRH2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; и/или (iii) по меньшей мере, одна CDRH3 тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этой последовательности.

Также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRH1, по меньшей мере, одну CDRH2 и, по меньшей мере, одну CDRH3, и легкую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRL1, по меньшей мере, одну CDRL2 и, по меньшей мере, одну CDRL3, причем (i) по меньшей мере, одна CDRL1 включает какую-либо аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 4, 22, 40, 58 и 76 или функциональный вариант этих последовательностей, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этим последовательностям;

(ii) по меньшей мере, одна CDRL2 включает какую-либо аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:, 6, 23, 24, 41, 42, 59, 60, 77 и 78 или функциональный вариант этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; и/или (iii) по меньшей мере, одна CDRL3 содержит какую-либо аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 7, 25, 43, 61 и 79 или функциональный вариант этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям.

Более предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRH1, по меньшей мере, одну CDRH2 и, по меньшей мере, одну CDRH3, и легкую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRL1, по меньшей мере, одну CDRL2 и, по меньшей мере, одну CDRL3, причем (i) по меньшей мере, одна CDRL1 включает какую-либо аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 4, 22, 40, 58 и 76 или функциональный вариант этих последовательностей, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этим последовательностям;

(ii) по меньшей мере, одна CDRL2 включает какую-либо аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 5, 6, 23, 24, 41 и 42, или функциональный вариант этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; и/или (iii) по меньшей мере, одна CDRL3 содержит какую-либо аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 7, 25 и 43, или функциональный вариант этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям.

Еще более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRH1, по меньшей мере, одну CDRH2 и, по меньшей мере, одну CDRH3, и легкую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRL1, по меньшей мере, одну CDRL2 и, по меньшей мере, одну CDRL3, причем (i) по меньшей мере, одна CDRL1 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4

- 24 043940 или SEQ ID NO: 76; или функциональный вариант этих последовательностей, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этим последовательностям;

(ii) по меньшей мере, одна CDRL2 включает какую-либо аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 5, 6, 77 и 78, или функциональный вариант этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; и/или (iii) по меньшей мере, одна CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 79; или функциональный вариант этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям.

Также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRH1, по меньшей мере, одну CDRH2 и, по меньшей мере, одну CDRH3, и легкую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRL1, по меньшей мере, одну CDRL2 и, по меньшей мере, одну CDRL3, причем (i) по меньшей мере, одна CDRL1 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 40; или функциональный вариант этих последовательностей, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97 по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этим последовательностям;

(ii) по меньшей мере, одна CDRL2 включает какую-либо аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 23, 24, 41 и 42, или функциональный вариант этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; и/или (iii) по меньшей мере, одна CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 43; или функциональный вариант этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям.

Наиболее предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRH1, по меньшей мере, одну CDRH2 и, по меньшей мере, одну CDRH3, и легкую цепь, включающую, по меньшей мере, одну CDRL1, по меньшей мере, одну CDRL2 и, по меньшей мере, одну CDRL3, причем (i) по меньшей мере, одна CDRL1 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или функциональный вариант этой последовательности, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этой последовательности;

(ii) по меньшей мере, одна CDRL2 включает какую-либо аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 5 или 6, или функциональный вариант этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; и/или (iii) по меньшей мере, одна CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или функциональный вариант этой последовательности, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям.

Предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3, (i) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 1-3; или функциональные варианты этих по-

- 25 043940 следовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(ii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 19-21; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(iii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 37-39; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(iv) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 55-57; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(v) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 73-75; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(vi) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 99-101; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(vii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 103-105 или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(viii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 107-109; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(ix) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 111-113; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(x) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 115-117; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xi) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 119-121; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 123-125; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xiii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 127-129; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92,

- 26 043940 по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xiv) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 131-133; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xv) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 135-137 или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xvi) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 139-141; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xvii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 143-145; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xviii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 147-149; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xix) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 151-153; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xx) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 155-157; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xxi) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 159-161; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xxii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 163-165; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xxiii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 167-169; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xxiv) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 171-173; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xxv) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 175-177; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

- 27 043940 (xxvi) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 179-181; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xxvii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 183-185; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xxviii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 187-189; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xxix) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 191-193; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xxx) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 195-197; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xxxi) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 199-201; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xxxii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 203-205; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xxxiii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 207-209; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xxxiv) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 211-213; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xxxv) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 215-217; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xxxvi) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 219-221; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xxxvii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 223-225; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xxxviii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 227-229; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей

- 28 043940 мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xxxix) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 231-233; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xl) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 235-237; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xli) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 239-241; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xlii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 243-245; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xliii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 247-249; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xliv) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 251-253; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(xlv) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 255-257; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; или (xlvi) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 259-261; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям.

Соответственно, также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3, а также аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, (i) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 1-5 и 7; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(ii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 1-4 и 6, 7; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(iii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 19-23 и 25; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(iv) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 19-22 и 24, 25; или функциональные вари-

- 29 043940 анты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(v) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 37-41 и 43; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(vi) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 37-40 и 42, 43; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(vii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 55-59 и 61; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(viii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 55-58 и 60, 61; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(ix) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 73-77 и 79; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; или (x) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 73-76 и 78, 79; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям.

Более предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3, а также аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, (i) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 1-5 и 7; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(ii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 1-4 и 6, 7; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(iii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 19-23 и 25; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(iv) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 19-22 и 24, 25; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(v) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 37-41 и 43; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

- 30 043940 (vi) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 37-40 и 42, 43; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(vii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 73-77 и 79; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; или (viii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 73-76 и 78, 79; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям.

Еще более предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3, а также аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, (i) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 1-5 и 7; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(ii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 1-4 и 6, 7; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(iii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 73-77 и 79; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; или (iv) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 73-76 и 78, 79; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям.

Также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3, а также аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, (i) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 19-23 и 25; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(ii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 19-22 и 24, 25; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(iii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 37-41 и 43; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; или (vi) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 37-40 и 42, 43; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям.

Еще более предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему

- 31 043940 изобретению содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3, а также аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, (i) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 1-5 и 7; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; или (ii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 1-4 и 6, 7; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям.

Также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению, описанный выше, содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3, а также аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, (i) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 19-23 и 25; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; или (ii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 19-22 и 24, 25; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям.

Наиболее предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит (а) первый сайт связывания эпитопа, содержащий аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3, а также аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, (i) соответствующие последовательностям ID NO: 1-5 и 7; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; или (ii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 1-4 и 6, 7; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; и (б) второй сайт связывания эпитопа, содержащий аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3, а также аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, (i) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 19-23 и 25; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; или (ii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 19-22 и 24, 25; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям.

Также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению, описанный выше, содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3, а также аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, (i) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 37-41 и 43; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; или (ii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 37-40 и 42, 43; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере,

- 32 043940 на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям.

Более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит (а) первый сайт связывания эпитопа, содержащий аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3, а также аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, (i) соответствующие последовательностям ID NO: 1-5 и 7; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; или (ii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 1-4 и 6, 7; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; и (б) второй сайт связывания эпитопа, содержащий аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3, а также аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, (i) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 37-41 и 43; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; или (ii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 37-40 и 42, 43; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям.

Кроме того, также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и, необязательно, вариабельную область легкой цепи (VL), причем вариабельная область тяжелой цепи (VH) содержит или состоит из аминокислотной последовательности, соответствующие какой-либо из последовательностей SEQ ID NO: 8, 26, 44, 62, 80, 102, 106, 110, 114, 118, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226, 230, 234, 238, 242, 246, 250, 254, 258 и 262; или функциональный вариант этих последовательностей, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этим последовательностям.

Более того, также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит (i) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 8, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 9, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(ii) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 26, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 27, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98

- 33 043940 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(iii) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 44, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 45, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(iv) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 62, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 63, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; или (v) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 80, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 81, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям.

Более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит (i) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 8, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 9, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(ii) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 26, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 27, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям;

(iii) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 44, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по

- 34 043940 меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 45, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; или (iv) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 80, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 81, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям.

Еще более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит (i) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 8, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 9, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; или (ii) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 80, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 81, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям.

Также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит (i) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 26, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 27, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; или (ii) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 44, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 45, или функциональный вари-

- 35 043940 ант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на

92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям.

Еще более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 8, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 9, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям.

Также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению согласно описанному выше содержит аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 26, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 27, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям.

Наиболее предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению согласно описанному выше содержит (а) первый сайт связывания эпитопа, содержащий аминокислотную последовательность вариабельной области (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 8, или функциональный вариант этой последовательности, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этим последовательностям, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 9, или функциональный вариант этой последовательности, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этим последовательностям; и (б) второй сайт связывания эпитопа, содержащий аминокислотную последовательность вариабельной области (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 26, или функциональный вариант этой последовательности, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этим последовательностям, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 27, или функциональный вариант этой последовательности, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этим последовательностям.

Также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению согласно описанному выше содержит аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 44, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этой последовательности, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 45, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по

- 36 043940 меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этой последовательности.

Более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению согласно описанному выше содержит (а) первый сайт связывания эпитопа, содержащий аминокислотную последовательность вариабельной области (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 8, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 9, или функциональный вариант этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; и (б) второй сайт связывания эпитопа, содержащий аминокислотную последовательность вариабельной области (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 44, или функциональный вариант этой последовательности, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этим последовательностям, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 45, или функциональный вариант этой последовательности, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этим последовательностям.

Особенно предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению находится в формате Fabs-in-tandem-Ig (FIT-Ig) и внешний Fab формата FIT-Ig, включающий сайт связывания эпитопа, содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, (i) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 1-5 и 7; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательност (ii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 1-4 и 6, 7; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям. Более предпочтительно, внешний Fab формата FIT-Ig содержит сайт связывания эпитопа, включающий аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 9, или функциональные варианты этой последовательности, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этой последовательности. Еще более предпочтительно, внутренний Fab формата FIT-Ig содержит сайт связывания эпитопа, включающий аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, (i) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 19-23 и 25; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям; или (ii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 19-22 и 24, 25; или функциональные варианты этих последовательностей, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичны этим последовательностям. Еще более предпочтительно, внутренний Fab формата FIT-Ig содержит сайт связывания эпитопа, включающий аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID

- 37 043940

NO: 26, или функциональный вариант этих последовательностей, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этой последовательности, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 27, или функциональный вариант этих последовательностей, который, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% идентичен этой последовательности.

Предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению предназначен для применения в качестве медикамента. Иначе говоря, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению может применяться для приготовления лекарственного средства. Более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению предназначен для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной вирусом Зика. Иначе говоря, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению может применяться для приготовления медикамента или применяться для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной вирусом Зика. Этот объект подробно описан ниже.

Молекулы нуклеиновых кислот.

Другим объектом, также предусмотренным в настоящем изобретении, является молекула нуклеиновой кислоты, содержащая, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению согласно описанному выше или его фрагмент, причем фрагмент включает, по меньшей мере, одну CDR антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента.

Молекула нуклеиновой кислоты является молекулой, предпочтительно состоящей из компонентов нуклеиновых кислот. Понятие молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно относится к молекулам ДНК или РНК. В частности, он используется как синоним понятия полинуклеотид. Предпочтительно молекула нуклеиновой является полимером, содержащим или состоящим из нуклеотидных мономеров, которые ковалентно связаны друг с другом фосфодиэфирными связями сахара/фосфатного остова. Понятие молекула нуклеиновой кислоты также охватывает модифицированные молекулы нуклеиновой кислоты, например, модифицированные по основанию, модифицированные сахарами или модифицированные в каркасе молекулы, например, ДНК или РНК.

В молекуле нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению кодируемый фрагмент антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит, по меньшей мере, одну CDR антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента. Табл. 1 и 2 представляют номера SEQ ID аминокислотных последовательностей областей CDR, а также VH и VL типичных антител по настоящему изобретению. Соответственно, молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению предпочтительно содержит полинуклеотид, кодирующий одну или несколько аминокислотных последовательностей, показанных в табл. 1 и 2. Предпочтительно, кодируемый фрагмент антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит три CDR, более предпочтительно все три CDR тяжелой цепи сайта связывания эпитопа (CDRH1, CDRH2, CDRH3) и/или все три CDR легкой цепи сайта связывания эпитопа (CDRL1, CDRL2, CDRL3). Соответственно, предпочтительно, чтобы кодируемый фрагмент антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержал (точно) три или шесть CDR. Соответственно, молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает полинуклеотид, кодирующий три или шесть аминокислотных последовательностей CDR, показанных в табл. 1 и 2, в частности соответствующие последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 и/или последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3. Более предпочтительно, кодируемый фрагмент антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит вариабельную область, например, вариабельную область тяжелой цепи (VH) и/или вариабельную область легкой цепи (VL). Соответственно, предпочтительно, чтобы кодируемый фрагмент антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержал (точно) одну или две вариабельные области. Соответственно, молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению предпочтительно включает полинуклеотид, кодирующий одну или две аминокислотные последовательности вариабельной области, показанные в табл. 1 и 2. Наиболее предпочтительно, кодируемый фрагмент антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит (полную) полипептидную цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению. Такая (полная) полипептидная цепь может представлять собой, например, (полную) тяжелую цепь или (полную) легкую цепь. Однако такая (полная) полипептидная цепь может также включать элементы как тяжелой, так и легкой цепи, что известно в данной области техники для многих форматов мультиспецифических антител (например, полипептидных цепей, содержащих константные области тяжелой цепи, но также, например, в дополнение к одной или нескольким вариабельным областям тяжелой цепи, вариабельной области легкой цепи).

Молекула нуклеиновой кислоты может быть моно-, би- или мультицистронной, например, трехцистронной. Молекула бицистронной или мультицистронной нуклеиновой кислоты обычно является моле

- 38 043940 кулой нуклеиновой кислоты, которая обычно может иметь две (бицистронные) или несколько (мультицистронные) открытые рамки считывания (ORF). Открытая рамка считывания в этом контексте является последовательностью кодонов, которая транслируется в пептид или белок. В более общем случае молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержит, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий, по меньшей мере, одно антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению. Если больше молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержит более одного кодирующего полинуклеотида, тогда второй, третий и последующие полинуклеотиды могут кодировать другие пептиды/белки и/или могут кодировать антитела, например, по настоящему изобретению, или также их фрагменты, которые могут быть такими же или отличными от первой области, кодирующей антитело. В предпочтительном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержит, по меньшей мере, два кодирующих полинуклеотида, например (точно) два или три кодирующих полинуклеотида, причем все они кодируют идентичные или разные антитела, или их фрагменты, или их варианты. Например, отдельные фрагменты антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению могут кодироваться разными полинуклеотидами на одной и той же молекуле нуклеиновой кислоты. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может кодировать более одного антитела или фрагмента антитела в одной и той же кодирующей области. Таким образом, молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может быть моно-, би- или мультицистронной.

Например, в одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению может быть одноцепочечным антителом. В этом случае предпочтительно, чтобы полная единственная цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента кодировалась единственным полинуклеотидом.

Соответственно, предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению была моноцистронной, в частности, она может включать один (единственный) полинуклеотид, кодирующий антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению.

Также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит (точно) две разные полипептидные цепи, например, тяжелая цепь и легкая цепь. Это может быть проиллюстрировано классической нативной молекулой IgG, которая содержит две идентичные тяжелые цепи и две идентичные легкие цепи и, таким образом, две различные полипептидные цепи (даже если антитело, в итоге, содержит четыре полипептидные цепи, они могут кодироваться двумя (разными) полинуклеотидами). Предпочтительно, такие две разные полипептидные цепи (например, тяжелая цепь и легкая цепь) антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению могут кодироваться двумя разными полинуклеотидами, которые могут быть расположены в одной и той же молекуле нуклеиновой кислоты, например, в бицистронной молекуле нуклеиновой кислоты или в (точно двух) отдельных молекулах нуклеиновой кислоты (например, каждая молекула нуклеиновой кислоты может быть моноцистронной). Таким образом, предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению была бицистронной, в частности она может содержать (точно) два полинуклеотида, кодирующих (вместе) антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению. Также предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержала (по меньшей мере или точно) один полинуклеотид, кодирующий фрагмент антитела, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению, как описано выше (например, (полную) полипептидную цепь). Таким образом, предпочтительно, если молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению была моноцистронной. Кроме того, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению может кодироваться множеством (например, моноцистронных) молекул нуклеиновых кислот. Например, антитело, содержащее две разных полипептидные цепи, может кодироваться двумя полинуклеотидами, расположенными в двух разных молекулах нуклеиновой кислоты.

Также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению содержит (ровно) три разных полипептидных цепи. Таким образом, предпочтительно, если молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению была трехцистронной (например, кодирующей все три полипептидные цепи в таком антителе, или его антигенсвязывающем фрагменте, по настоящему изобретению). Однако, предпочтительно, если молекула нуклеиновой кислоты является моноцистронной или бицистронной, например, кодирующей одну или две полипептидные цепи, содержащиеся в таком антителе, или его антигенсвязывающем фрагменте, по настоящему изобретению. Например, множество молекул нуклеиновых кислот, например, двух или трех молекул нуклеиновых кислот, могут кодировать (вместе) антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению.

Например, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению особенно предпочтительно в формате Fabs-in-tandem-Ig (FIT-Ig), который обычно включает следующие три полипептидные цепи:

полипептид 1, содержащий или состоящий из легкой цепи внешнего Fab и тяжелой цепи внутреннего Fab, включая константные домены CH1-CH2-CH3, предпочтительно с мутацией LALA, как описано выше, причем предпочтительно легкая цепь внешнего Fab гибридизирована, предпочтительно через лин- 39 043940 керы, с N-концом тяжелой цепи внутреннего Fab;

полипептид 2, содержащий или состоящий из тяжелой цепи внешнего Fab (VH и CH1 внешнего

Fab); и полипептид 3, содержащий или состоящий из легкой цепи внутреннего Fab.

Соответственно, такой FIT-Ig предпочтительно может кодироваться одной (например, трицистронной) молекулой нуклеиновой кислоты, тремя (например, моноцистронной) молекулой нуклеиновой кислоты или двумя (например, одной моноцистронной, одной бицистронной) молекулами нуклеиновой кислоты.

Соответственно, предпочтительно, чтобы такая молекула нуклеиновых кислот по настоящему числу содержала полинуклеотид, кодирующий полипептид 1 антитела FIT-Ig по настоящему уровню. Более предпочтительно, молекула нуклеиновой кислоты не содержит полинуклеотидов, кодирующих полипептид 2 или полипептид 3 антитела FIT-Ig по настоящему определению. Такая молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно является моноцистронной.

Также предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты по настоящему количеству содержала полинуклеотид, кодирующий полипептид 2 антитела FIT-Ig по настоящему изобретению. Более предпочтительно, молекула нуклеиновой кислоты не содержит полинуклеотидов, кодирующих полипептид 1 или полипептид 3 антитела FIT-Ig по настоящему определению. Такая молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно является моноцистронной.

Также предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты по настоящему количеству содержала полинуклеотид, кодирующий полипептид 3 антитела FIT-Ig по настоящему изобретению. Более предпочтительно, молекула нуклеиновой кислоты не содержит полинуклеотидов, кодирующих полипептид 1 или полипептид 2 антитела FIT-Ig по настоящему определению. Такая молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно является моноцистронной.

Также предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержала полинуклеотид, кодирующий полипептид 1, и полинуклеотид, кодирующий полипептид 2 антитела FIT-Ig по настоящему изобретению. Более предпочтительно, молекула нуклеиновой кислоты не содержит полинуклеотида, кодирующего полипептид 3 антитела FIT-Ig по настоящему изобретению. Такая молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно является бицистронной.

Также предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты по настоящему количеству содержала полинуклеотид, кодирующий полипептид 1, и полинуклеотид, кодирующий полипептид 3, антитела FIT-Ig по настоящему изобретению. Более предпочтительно, молекула нуклеиновой кислоты не содержит полинуклеотида, кодирующего полипептид 2 антитела FIT-Ig по настоящему изобретению. Такая молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно является бицистронной.

Также предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержала полинуклеотид, кодирующий полипептид 2, и полинуклеотид, кодирующий полипептид 3, антитела FIT-Ig по настоящему изобретению. Более предпочтительно, молекула нуклеиновой кислоты не содержит полинуклеотида, кодирующего полипептид 1 антитела FIT-Ig по настоящему изобретению. Такая молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно является бицистронной.

Особенно предпочтительно, если молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает полинуклеотид, кодирующий полипептид 1, полинуклеотид, кодирующий полипептид 2, и полинуклеотид, кодирующий полипептид 3, антитела FIT-Ig по настоящему изобретению. Такая молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно является трицистронной.

В общем, молекула нуклеиновой кислоты может быть молекулой ДНК или молекулой РНК. Примеры молекул нуклеиновой кислоты и/или полинуклеотидов включают, например, рекомбинантный полинуклеотид, вектор, олигонуклеотид, молекулу РНК, например, рРНК, мРНК, микроРНК, миРНК или тРНК, или молекулу ДНК, например, кДНК. Предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты является плазмидной ДНК или молекулой мРНК. Плазмидная ДНК является кольцевой, предпочтительно двухцепочечной молекулой ДНК.

В приведенной ниже табл. 3 указаны номера SEQ ID для приведенных в качестве примеров последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих CDR, а также VH и VL, приведенных в качестве примеров последовательностей антител по настоящему изобретению. Из-за избыточности генетического кода настоящее изобретение также включает варианты последовательностей соответствующих нуклеиновых кислот и, в частности, такие варианты последовательностей, которые кодируют одинаковые аминокислотные последовательности.

- 40 043940

Таблица 3

Последовательности нуклеиновых кислот CDR, вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) пяти типичных антител (ZKA190, ZKA64, ZKA230, ZKA185, ZKA78), приведенные в качестве примеров

ZKA190	SEQ ID NO.	Последовательности аминокислоты
CDRH1	10	ggattcaccttcagtaaatatggc
CDRH2	11	atatcatatgagggaagtaataaa
CDRH3	12	gcgaaatcggggacccaatactatgatactactggttatgagtat aggggtttggaatactttggctac
CDRL1	13	cagagtgttagtagcagttac
CDRL2	14	gatgcatcc
CDRL2 long	15	ctcatctatgatgcatccagcagggcc
CDRL3	16	cagcagtatggtaggtcaaggtggaca
VH	17	caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctggg aggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagt aaatatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctg gagtgggtggcagttatatcatatgagggaagtaataaatattat gcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattcc aagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagctgaggac acggcagtgtattactgtgcgaaatcggggacccaatactatgat actactggttatgagtataggggtttggaatactttggctactgg ggccagggaaccctggtcaccgtctcctcag
VL	18	gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctcca ggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagt agcagttacttagcctggtaccagcagaaacgtggccaggctccc aggctcctcatctatgatgcatccagcagggccactggcatccca gacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcacc atcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcag cagtatggtaggtcaaggtggacattcggccaagggaccaaggtg gaaatcaaac
ZKA185	SEQ ID NO.	Последовательности аминокислоты
CDRHl	28	ggatatagttttaccagttactgg
CDRH2	29	tttgatcctagtgactctcaaacc
CDRH3	30	gcgagaagatattgtagtagtagtagttgttatgtggacaat
CDRLl	31	gcattgccaaataaattt
CDRL2	32	gaggacaac
CDRL2 long	33	gtcatctatgaggacaacaaacgaccc
CDRL3	34	tactcaacagacagcagttctaatcccctgggagta
VH	35	gaagtgcagctggtgcagtccggagcagaggtgaaaaagcccggg gagtctctgaggatctcctgtaagggttctggatatagttttacc agttactggatcacctgggtgcgccagatgcccgggaaaggcctg gagtggatggcgaagtttgatcctagtgactctcaaaccaactac agcccgtccttccaaggccacgtcaccatctcagttgacaagtcc atcagcactgcctacttgcagtggagcagcctgaaggcctcggac accgccatgtattactgtgcgagaagatattgtagtagtagtagt tgttatgtggacaattggggccagggaaccctggtcaccatcttc tcag

- 41 043940

VL	36	tcctatgagctgacacagccaccctcggtgtcagtgtccccagga caaacggccaggatcacctgctctggagatgcattgccaaataaa tttgcttattggtaccggcagaagtcaggccaggcccctgttctg gtcatctatgaggacaacaaacgaccctccgggatccctgagaga ttctctggctccagctcagggacaatggccaccttgactatcagt ggggcccaggtggaggatgaagctgactaccactgttactcaaca gacagcagttctaatcccctgggagtattcggcggagggaccaag ctgaccgtcctag
ZKA230	SEQ ID NO.	Последовательности аминокислоты
CDRH1	46	ggtggctccatcagtagtgactac
CDRH2	47	atctattacagtgggagcacc
CDRH3	48	gcgaggaggaggaagtatgattccctttgggggagttttgctttt gatatc
CDRL1	49	agctccaacatcggaggtaattat
CDRL2	50	attaatgat
CDRL2 long	51	ctcatctgtattaatgatcaccggccc
CDRL3	52	gcaacatgggatgacagcctgggtggccttgta
VH	53	caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggcctggtgaagccttcg gagaccctgtccctcacctgcgcagtctctggtggctccatcagt agtgactactggagctggatccggcagcccccagggaagggactg gagtggattgggtatatctattacagtgggagcaccaactacaac ccctccctcaagagtcgagtcaccatatcagtagacacgtccaag aaccacttctccctgaagctgaactctgtgaccgctgcggacacg gccgtgtattactgtgcgaggaggaggaagtatgattccctttgg gggagttttgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcacc gtctcttcag
VL	54	cagtctgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccggg cagagggtcaccatctcttgttctggaagcagctccaacatcgga ggtaattatgtatactggtaccagcagctcccaggaacggccccc aaactcctcatctgtattaatgatcaccggccctcaggggtccct gaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggcc atcagtgggctccagtccgaggatgaggctgattattactgtgca acatgggatgacagcctgggtggccttgtattcggcggagggacc aagctgaccgtcctag
ZKA78	SEQ ID NO.	Последовательности аминокислоты
CDRH1	64	ggcttcacttttagtaactatgca
CDRH2	65	atcgggcgcaacggggactctatc
CDRH3	66	gtgaaagatctggccatccccgagtcctacagaattgaagctgat tat
CDRL1	67	cagtccgtgctgtaccgctctaacaacaagaattac
CDRL2	68	tgggcttca
CDRL2 long	69	ctgatctattgggcttcaacccgggaa
CDRL3	70	cagcagtactattctagtcctcgaact
VH	71	gaggtgcagctggcagaatcaggcgggggactggtccagcctggc ggcagcctgacactgtcttgcagtggatcaggcttcacttttagt aactatgcaatggtgtgggcaaggcaggctcctgggaagggactg gagtatgtctctggcatcgggcgcaacggggactctatctactat actgatagtgtgaagggccggttcaccatcagcagagacaatagc aaatccatggtgtacctgcagatgagctccctgcgaaccgaagac acagcagtgtactattgcgtgaaagatctggccatccccgagtcc tacagaattgaagctgattattggggacagggcaccctggtcatc gtgagcgccg
VL ZKA64 CDRH1 CDRH2 CDRH3 CDRL1 CDRL2 CDRL2 long CDRL3 VH	72 SEQ ID NO. 82 83 84 85 86 87 88 89	gacatcgtgatgacacagtctccagatagtctggcagtcagtctg ggggagagggccactattaactgcaagagctcccagtccgtgctg taccgctctaacaacaagaattacctgtcttggtatcagcagaag cccggacagccccctaaactgctgatctattgggcttcaacccgg gaaagcggcgtcccagacagattctcaggcagcgggtccggaaca gacttcaccctgacaattagccccctgcaggcagaggacgtggct gtctactattgtcagcagtactattctagtcctcgaactttcggc caggggaccaaggtggaaatcaaac Последовательности аминокислоты ggctacaccttcacagggtatcac attaaccctaattctggcgggacc gctcggatgagctcctctatttggggcttcgatcat cagtctgtgctgattaac ggagcatcc ctgatctatggagcatcctccagggct cagcagtacaatgattggccccctatcaca caggtgcagctggtccagagcggagcagaggtgaagaaacccggc gcctcagtgaaggtcagctgcaaagcttccggctacaccttcaca gggtatcacatcgactgggtgaggcaggcaagaggacagggactg gaatggatgggacggattaaccctaattctggcgggaccaactac gcccagaagtttcagggccgagtgactatgaccagagacaccagc atctccacagcttatatgcagctgtcccggctgagatctgacgat agtgccgtctactattgtgctcggatgagctcctctatttggggc ttcgatcattgggggcagggaacactggtgactgtcagttcag
VL	90	gagatcgtgatgactcagtctccagccaccctgtcagtcagccca ggagaacgggcaaccctgtcttgcagagcctcccagtctgtgctg attaacctggcttggtaccagcagaagccaggccaggcaccccga ctgctgatctatggagcatcctccagggctaccggcattcctgca cgcttcagtggatcaggaagcggaacagagtttaccctgacaatc tctagtctgcagtccgaagacttcgctgtctactattgtcagcag tacaatgattggccccctatcacatttggccaggggactagactg gagatcaagc

Предпочтительно, последовательность молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, соответствующей последовательностям SEQ ID NO: 10-18, 28-36, 46-54, 64-72 и 82-90; или функционального варианта этой последовательности.

Также предпочтительно, чтобы последовательностями нуклеиновых кислот по настоящему изобре

- 42 043940 тению были такие последовательности нуклеиновых кислот, которые, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 75, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 85, по меньшей мере, на 88, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 92, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 96, по меньшей мере, на 97, по меньшей мере, на 98 или по меньшей мере, на 99% идентичны нуклеиновой кислоте, кодирующей CDR, последовательность VH и/или последовательность VL, представленную в табл. 1 и 2, например, к последовательностям, представленным в табл. 3.

В общем, молекула нуклеиновой кислоты может быть изменена путем инсерции, делеции или изменения определенных последовательностей нуклеиновых кислот. Изменения от таких манипуляций включают, но ими не ограничиваются, изменения для интродукции сайтов рестрикции, для изменения использования кодонов, для добавления или оптимизации транскрипционных и/или трансляционных регуляторных последовательностей и т.д. Также можно изменить нуклеиновую кислоту, чтобы изменить закодированные аминокислоты. Например, может быть полезным интродуцировать одно или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) аминокислотных замещений, делеций и/или инсерций в последовательность аминокислот антитела. Такие точечные мутации могут модифицировать эффекторные функции, антигенсвязывающую аффинность, посттрансляционные модификации, иммуногенность и т. д., могут интродуцировать аминокислоты для присоединения ковалентных групп (например, меток) или могут интродуцировать метки (например, с целью очистки). Мутации могут быть интродуцированы в определенные сайты или могут быть интродуцированы случайным образом с последующим отбором (например, молекулярная эволюция). Например, одна или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих какую-либо из областей CDR, последовательность VH и/или последовательность VL (типичного) антитела по настоящему изобретению, могут быть случайно или направленно мутированы для внедрения различных свойств в кодируемые аминокислоты. Такие изменения могут быть результатом случайного процесса, причем первоначальные изменения сохраняются и интродуцируются новые изменения в других положениях нуклеотидов. Кроме того, изменения, достигнутые на независимых стадиях, могут быть объединены. Различные свойства, интродуцируемые в кодируемые аминокислоты, могут включать, но этим не ограничиваются, повышенную аффинность.

Другой объект настоящего изобретения также относится к множеству молекул нуклеиновой кислоты, согласно описанному выше, причем каждая молекула нуклеиновой кислоты содержит, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий фрагмент антитела, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению, согласно описанному выше. Предпочтительно, множество фрагментов, кодируемых множеством молекул нуклеиновой кислоты, формирует антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению. Иначе говоря, предпочтительно, если множество молекул нуклеиновой кислоты по-настоящему изобретению кодирует (полное) антитело, или (полный) его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению. Это означает, что, в частности, дополнительные молекулы нуклеиновой кислоты (дополнительно к множеству молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению) не требуются для кодирования/получения (полного) антитела, или (полного) его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению. Например, множество молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, кодирует все полипептидные цепи антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению.

Предпочтительным примером множества молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению являются (точно) две молекулы нуклеиновой кислоты, причем каждая из молекул нуклеиновой кислоты содержит единственный или более чем один (например, два или три) полинуклеотида, и каждый полинуклеотид кодирует (отличную от других) полипептидную цепь антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению. Соответственно, молекулы нуклеиновой кислоты такого множества молекул нуклеиновой кислоты предпочтительно являются моно- или бицистронными.

Примером являются две молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие вместе антитело FIT-Ig по настоящему изобретению, согласно описанному выше (например, одна молекула бицистронной нуклеиновой кислоты в комбинации с соответствующей молекулой моноцистронной нуклеиновой кислоты, сочетанные таким образом, что полипептиды 1, 2 и 3 FIT-Ig кодируются двумя молекулами нуклеиновых кислот, согласно описанному выше).

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают (точно) три молекулы нуклеиновой кислоты, причем каждая из молекул нуклеиновой кислоты содержит один полинуклеотид, кодирующий (отличную) полипептидную цепь антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению. Соответственно, молекулы нуклеиновой кислоты в таком множестве молекул нуклеиновой кислоты предпочтительно являются моноцистронными. Примерами являются три молекулы нуклеиновой кислоты, совместно кодирующие антитело FIT-Ig по настоящему изобретению, согласно описанному выше (например, три (например, моноцистронные) молекулы нуклеиновой кислоты, одна из которых кодирует полипептид 1 из FIT-Ig, вторая кодирует полипептид 2 из FIT-Ig и третья кодирует полипептид 3 из FIT-Ig, согласно описанному выше).

Вектор.

В настоящем изобретении также описывают векторы, например, векторы экспрессии, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Предпочтительно, вектор содержит моле

- 43 043940 кулу нуклеиновой кислоты, согласно описанному выше. Понятие вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, предпочтительно к рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты, то есть к молекуле нуклеиновой кислоты, которая не встречается в природе. Вектор в контексте настоящего изобретения применим для включения или хранения требуемой последовательности нуклеиновой кислоты. Такие векторы могут быть векторами хранения, векторами экспрессии, векторами клонирования, векторами переноса и т.д. Вектором хранения является вектор, который обеспечивает удобное хранение молекулы нуклеиновой кислоты. Например, вектор может содержать последовательность, соответствующую, например, требуемому антителу, или фрагменту этого антитела, по настоящему изобретению. Вектор экспрессии может быть использован для получения продуктов экспрессии, например, РНК, например, мРНК, или пептидов, полипептидов или белков. Например, вектор экспрессии может содержать последовательности, необходимые для транскрипции отрезка последовательности вектора, например, последовательности промотора. Вектор клонирования обычно является вектором, который содержит сайт клонирования, применимый для включения последовательностей нуклеиновых кислот в вектор. Клонирующим вектором может быть, например, плазмидный вектор или бактериофаговый вектор. Вектор переноса может быть вектором, который применим для переноса молекул нуклеиновой кислоты в клетки или организмы, например, вирусные векторы. Вектор в контексте настоящего изобретения может быть, например, РНК-овым вектором или ДНК-овым вектором. Предпочтительно вектор представляет собой молекулу ДНК, например, плазмидной ДНК. Например, вектор в контексте настоящего изобретения содержит сайт клонирования, селективный маркер, например, признак устойчивости к антибиотику, и последовательность, применимую для размножения вектора, например, точки начала репликации. Предпочтительно вектор в контексте настоящего изобретения является плазмидным вектором.

Другой объект настоящего изобретения также предусматривает множество векторов по настоящему изобретению, предпочтительно кодирующих антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению. Соответственно, предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения и примеры множества молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, описанные выше, также применимы для множества векторов по настоящему изобретению.

Клетки.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения также предусматривают клетки, экспрессирующие антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению; и/или включающие вектор по настоящему изобретению или множество векторов по настоящему изобретению.

Примерами таких клеток являются, но ими не ограничиваются, эукариотические клетки, например дрожжевые клетки, клетки животных или растительные клетки. Предпочтительно, клетки являются клетками млекопитающих, более предпочтительно, линиями клеток млекопитающих. Предпочтительные примеры включают клетки человека, клетки CHO, клетки HEK293T, клетки PER.C6, клетки NS0, клетки печени человека, клетки миеломы или клетки гибридомы.

В частности, клетка может быть трансфецирована вектором по настоящему изобретению или множеством векторов по настоящему изобретению, предпочтительно вектором экспрессии или их множеством. Понятие трансфекция относится к введению молекул нуклеиновой кислоты, например, молекулы ДНК или РНК (например, мРНК), в клетки, предпочтительно в эукариотические клетки. В контексте настоящего изобретения понятие трансфекция охватывает какой-либо метод, известный специалисту, для интродукции молекул нуклеиновой кислоты в клетки, предпочтительно, в эукариотические клетки, например, в клетки млекопитающих. Такие методы включают, например, электропорацию, липофекцию, например, на основе катионных липидов и/или липосом, осаждение фосфатом кальция, трансфекцию на основе наночастиц, трансфекцию на основе вирусов или трансфекцию на основе катионных полимеров, например, DEAE-декстрана или полиэтиленимина и т.д. Предпочтительно интродукция на основана на вирусах.

Более того, клетки по настоящему изобретению могут быть трансфецированы стабильно или временно вектором по настоящему изобретению или множеством векторов по настоящему изобретению, например, для экспрессии антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению. Предпочтительно, клетки стабильно трансфецируют вектором по настоящему изобретению или множеством векторов по настоящему изобретению, кодирующих антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления настоящего изобретения предпочтительно, чтобы клетки были временно трансфецированы вектором по настоящему изобретению или множеством векторов по настоящему изобретению, кодирующих антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению.

Необязательные дополнительные свойства антител.

Антитела по настоящему изобретению могут быть объединены, например, с лекарственным средством доставки к месту лечения или связаны с обнаруживаемой меткой для облегчения визуализации места, содержащего исследуемые клетки. Методы связывания антител с лекарственными средствами и обнаруживаемыми метками известны специалистам в данной области, также, как и методы визуализации с использованием обнаруживаемых меток. Антитела с меткой могут быть использованы в самых разных анализах с использованием самых разных меток. Обнаружение образования комплекса антитело-антиген

- 44 043940 между антителом по настоящему изобретению и представляющим интерес эпитопом может быть облегчено присоединением обнаруживаемого вещества к антителу. Приемлемые средства обнаружения включают, например, такие метки, как радионуклиды, ферменты, коферменты, флуорофоры, хемилюминесцирующие соединения, хромогены, ферментные субстраты или кофакторы, ингибиторы ферментов, комплексы простетических групп, свободные радикалы, частицы, красители и другие. Примеры применимых ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, Р-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетической группы включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеина, дансилхлорид или фикоэритрин; примером люминесцентного материала является люминол; примеры биолюминесцентных материалов включают люциферазу, люциферин и экворин; примеры подходящих радиоактивных материалов включают ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S или ³H. Такие меченые реагенты могут быть применены в разных известных анализах, таких как радиоиммуноанализы, иммуноферментные анализы, например, ELISA, флуоресцентные иммуноанализы и другие. Таким образом, меченые антитела по настоящему изобретению могут быть использованы в таких анализах, например, согласно описанию в патентах US 3766162; US 3791932; US 3817837; US 4233402.

Антитело по настоящему изобретению может быть конъюгировано с лекарственной составляющей, например, с фрагментом терапевтической молекулы, например, с цитотоксином, терапевтическим агентом или радиоактивным металлом или радиоизотопом. К примерам радиоизотопов относятся, но ими не ограничиваются, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, Bi-213, Pd-109, Tc-99, In111 и другие. Такие конъюгаты антител могут быть применены для модификации данного биологического ответа; лекарственная составляющая не должна рассматриваться как ограниченная классическими химическими терапевтическими агентами. Например, фрагмент лекарственной молекулы может быть белком или полипептидом, обладающим требуемой биологической активностью. К таким белкам могут относиться, например, токсин, например, такой как абрин, рицин A, экзотоксин синегнойной палочки или дифтерийный токсин.

Способы конъюгирования такого терапевтического фрагмента с антителами хорошо известны. См., например, Arnon с соавт., в кн.: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, под ред. Reisfeld с соавт., 1985, (Alan R. Liss, Inc.), 243-256; Hellstrom с соавт. в кн.: Controlled Drug Delivery под ред. Robinson с соавт., 1987, (2е издание; Marcel Dekker, Inc.), 623-653; Thorpe, в кн.: Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, под ред. Pinchera с соавт., 1985, 475-506 (Editrice Kurtis, Милан, Италия, 1985); в кн.: Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, под ред. Baldwin с соавт., 1985, (Academic Press, Нью-Йорк, 1985), 303-316; Thorpe с соавт., Immunol. Rev. 62, 1982, 119-158.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело или фрагмент антитела может быть конъюгировано со вторым антителом, или фрагментом этого антитела, для формирования гетероконъюгата антитела согласно описанию в US 4676980. Кроме того, линкеры могут быть применены между метками и антителами по настоящему изобретению, например, согласно описанию в US 4831175. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты могут быть непосредственно помечены радиоактивным йодом, индием, иттрием или другими радиоактивными частицами, известными в данной области техники, например, согласно описанию в US 5595721. Лечение может состоять из комбинации лечения конъюгированными и неконъюгированными антителами, вводимыми одновременно или последовательно, например, согласно описанию в WO 00/52031; WO 00/52473.

Антитела по настоящему изобретению также могут быть присоединены к твердой подложке. Дополнительно, антитела по настоящему изобретению или функциональные фрагменты этих антител могут быть химически модифицированы путем ковалентного конъюгирования с полимером, например, для увеличения их периода полужизни в кровотоке. Примеры полимеров и методов присоединения к ним пептидов показаны в US 4766106, US 4179337, US 4495285 и US 4609546. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полимеры могут быть выбраны из полиоксиэтиленированных полиолов и полиэтиленгликоля (polyethylene glycol - PEG). PEG растворим в воде при комнатной температуре и имеет общую формулу: R(O-CH2-CH2)_nO-R, в которой R может быть водородом или защитной группой, например, алкильной или алканольной группой. Предпочтительно, защитная группа может содержать от 1 до 8 атомов углерода. Например, защитной группой является метил. Буква n обозначает положительное целое число. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения n означает число от 1 до 1000. В другом варианте осуществления настоящего изобретения n означает число от 2 до 500. Предпочтительно, средняя молекулярная масса PEG составляет от 1000 до 40000, более предпочтительно молекулярная масса PEG составляет от 2000 до 20000, еще более предпочтительно молекулярная масса PEG составляет от 3000 до 12000. Кроме того, PEG может содержать, по меньшей мере, одну гидроксильную группу, например, PEG может содержать одну концевую гидроксильную группу. Например, это концевая гидроксильная группа, которая активируется для взаимодействия со свободной аминогруппой в ингибиторе. Однако следует учитывать, что тип и количество реакционноспособных групп может варьироваться для достижения ковалентно конъюгированных ПЭГ/антитела по настоящему изобретению.

Водорастворимые полиоксиэтилированные полиолы также применимы в настоящем изобретении. К

- 45 043940 ним относятся полиоксиэтилированный сорбит, полиоксиэтилированная глюкоза, полиоксиэтилированный глицерин (polyoxyethylated glycerol - POG) и другие. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения используют POG. Не опираясь на какую-либо теорию, авторы высказывают предположение, что поскольку глицериновый каркас молекулы полиоксиэтилированного глицерина такой же, как в природной молекуле, например, у животных и людей в моно-, ди- и триглицеридах, такое разветвление не обязательно будет рассматриваться в качестве чужеродных агентов в организме. POG может иметь молекулярную массу в том же диапазоне, что и PEG. Другой системой доставки лекарств, которая может быть использована для увеличения периода полужизни в кровеносной системе, является липосома. Методы приготовления систем доставки липосом известны специалистам в данной области. Другие системы доставки лекарств известны в данной области и описаны, например, в ссылках на Poznansky с соавт. (1980) и Poznansky (1984).

Антитела по настоящему изобретению могут быть получены в очищенной форме. Обычно антитело может содержаться в композиции, которая практически не содержит других полипептидов, например, менее 90% (по массе), обычно менее 60 и чаще менее 50% композиции состоит из других полипептидов.

Антитела по настоящему изобретению могут быть иммуногенными в организме гетерологичных хозяев (не людей), например у мышей. В частности, антитела могут иметь идиотоп, который является иммуногенным для хозяина, не являющегося человеком, но не для хозяина человека. В частности, антитела по настоящему изобретению для применения людьми включают антитела, которые сложно выделить из хозяев, например, из мышей, коз, кроликов, крыс, млекопитающих, не относящихся к приматам, и т.д., и которые, как правило, не могут быть получены гуманизированием или от ксено-мышей.

Фармацевтическая композиция.

Настоящее изобретение также предусматривает фармацевтическую композицию, включающую один или несколько следующих компонентов:

(i) антитело, или фрагмент этого антитела, по настоящему изобретению, (ii) молекулу нуклеиновой кислоты или множество молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, (iii) вектор или множество векторов по настоящему изобретению, и/или (iv) клетки по настоящему изобретению.

Иначе говоря, настоящее изобретение также предусматривает фармацевтическую композицию, включающую антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению, молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множество молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектор по настоящему изобретению, множество векторов по настоящему изобретению и/или клетки по настоящему изобретению.

Фармацевтическая композиция предпочтительно также может содержать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или эксципиент. Хотя носитель или эксципиент могут облегчить введение, сам по себе он не должен вызывать выработку антител, вредных для индивидуума, которому вводят композицию. Кроме того. Они не должны быть токсичными. Подходящими носителями могут быть крупные медленно метаболизируемые макромолекулы, например, белки, полипептиды, липосомы, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, аминокислотные сополимеры и неактивные вирусные частицы. В общем, фармацевтически приемлемые носители в фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут быть активными компонентами или неактивными компонентами. Предпочтительно, фармацевтически приемлемый носитель в фармацевтической композиции по настоящему изобретению не является активным компонентом в отношении инфекции вирусом Зика.

Можно использовать фармацевтически приемлемые соли, например, соли минеральных кислот, например, гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты и сульфаты, или соли органических кислот, например, ацетаты, пропионаты, малонаты и бензоаты.

Фармацевтически приемлемые носители в фармацевтической композиции могут дополнительно содержать жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол. Кроме того, в таких композициях могут присутствовать вспомогательные вещества, например, смачивающие или эмульгирующие агенты или pH-буферные вещества. Такие носители позволяют составлять фармацевтические композиции в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, суспензий и суспензий для приема внутрь субъектом.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть приготовлены в различных формах. Например, композиции могут быть приготовлены в виде инъекционных препаратов, в виде либо жидких растворов, либо суспензий. Также могут быть приготовлены твердые формы, которые могут быть в форме раствора или суспензии, в жидких носителях, приготавливаемых перед инъекцией (например, лиофилизированная композиция типа Synagis ™ и Herceptin ™, для разведения стерильной водой, содержащей консервант). Композиция может быть приготовлена для местного введения, например, в виде мази, крема или порошка. Композиция может быть приготовлена для перорального введения, например, в виде таблеток или капсул, в виде спрея или в виде сиропа (необязательно ароматизированного). Композиция может быть приготовлена для введения в легкие, например, в виде ингалятора, с ис

- 46 043940 пользованием мелкого порошка или спрея. Композиция может быть приготовлена в виде суппозитория или пессария. Композиция может быть приготовлена для назального, ушного или глазного введения, например, в виде капель. Композиция может быть в форме набора, составленного таким образом, что комбинированную композицию восстанавливают непосредственно перед введением субъекту. Например, лиофилизированное антитело может быть представлено в форме набора со стерильной водой или стерильным буфером.

Предпочтительно, чтобы активный ингредиент в композиции был молекулой антитела, фрагментом антитела, его вариантом или производным, в частности, чтобы активный ингредиент в композиции представлял антитело, фрагмент антитела или его варианты и производные по настоящему изобретению. Активный ингредиент может быть подвержен деградации в желудочно-кишечном тракте. Так, если композицию следует вводить через желудочно-кишечный тракт, композиция может содержать агенты, которые защищают антитело от разрушения, но которые высвобождают антитело после его всасывания в желудочно-кишечном тракте.

Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей приведено в кн.: Gennaro Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 2000, 20-e изд., ISBN: 0683306472.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению обычно имеют pH от 5,5 до 8,5, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения это может быть от 6 до 8, в других вариантах осуществления настоящего изобретения - около 7. Величина pH может поддерживаться за счет использования буфера. Композиция может быть стерильной и/или пирогенной. Композиция может быть изотонической по отношению к человеку. В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтические композиции по настоящему изобретению поставляются в герметично закрытых контейнерах.

В рамки охвата настоящего изобретения входят композиции, разработанные в нескольких формах введения; формы включают, но ими не ограничиваются, формы, пригодные для парентерального введения, например, инъекцией или инфузией, например болюсной инъекцией или непрерывной инфузией. Если продукт предназначен для инъекции или инфузии, он может принимать форму суспензии, раствора или эмульсии в масляном или водном растворителе и может содержать рецептурные агенты, например, суспендирующие, консервирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекула антитела может находиться в сухой форме, и для восстановления перед применением его восстанавливают соответствующей стерильной жидкостью. Под растворителем обычно понимают материал, который пригоден для хранения, транспортировки и/или введения соединения, например, фармацевтически активного соединения, в частности, антитела по настоящему изобретению. Например, растворитель может быть физиологически приемлемой жидкостью, которая подходит для хранения, транспортировки и/или введения фармацевтически активного соединения, в частности антител по настоящему изобретению. После составления композиции по настоящему изобретению, ее можно вводить непосредственно субъекту. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, композиции адаптированы для введения млекопитающим, например, людям.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут вводиться многочисленными способами, включая, но не ограничиваясь ими, пероральный, внутривенный, внутримышечный, внутриартериальный, интрамедуллярный, внутрибрюшинный, интратекальный, интравентрикулярный, трансдермальный, чрескожный, местный, подкожный, интраназальный, энтеральный, подъязычный, интравагинальный или ректальный. Гипоспреи (безыгольные инжекторы) также могут быть использованы для введения фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Предпочтительно, фармацевтическая композиция может быть приготовлена для перорального введения, например, в виде таблеток, капсул и других форм, для местного применения, или в виде инъекционных форм, например, в виде жидких растворов или суспензий, причем особенно предпочтительно, если фармацевтическая композиция представляет инъекционный препарат. Твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидких носителях для инъекций, также являются предпочтительными, например, фармацевтическая композиция в лиофилизированной форме.

Для инъекции, например, внутривенной, кожной или подкожной инъекции, или инъекции в место поражения, активный ингредиент предпочтительно будет в форме парентерально приемлемого водного раствора, который не содержит пирогенов и имеет подходящие pH, изотоничность и стабильность. Специалисты в данной области могут приготовить подходящие растворы, используя, например, такие изотонические растворители, как, например, инъекционный раствор хлорида натрия, инъекционный раствор Рингера, инъекционный раствор Рингера с лактозой. При необходимости могут быть внесены консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие добавки. Будь то полипептид, пептид или молекула нуклеиновой кислоты, другое фармацевтически полезное соединение по настоящему изобретению, его введение индивидууму предпочтительно осуществляют в профилактически эффективном количестве или в терапевтически эффективном количестве (в зависимости от случая), достаточном для проявления полезного для человека эффекта. Фактически введенное количество, а также скорость и продолжительность введения будут зависеть от характера и тяжести состояния, подвергаемого лечению. Для инъекций фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть представлена, например, в заранее заполненном шприце.

- 47 043940

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, согласно описанному выше, также можно вводить перорально в любой перорально приемлемой лекарственной форме, включая, но ими не ограничиваясь, капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы. В случае таблеток для перорального применения обычно используемые носители включают лактозу и кукурузный крахмал. Также обычно добавляют смазывающие агенты, например, стеарат магния. Для перорального введения в форме капсул полезные разбавители включают лактозу и сухой кукурузный крахмал. Когда для перорального применения требуются водные суспензии, активный ингредиент, то есть конъюгат молекулы с переносимы грузом по настоящему изобретению, согласно описанному выше, объединяют с эмульгирующими и суспендирующими агентами. При желании также могут быть добавлены определенные подсластители, ароматизаторы или красители.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению также можно вводить местно, особенно когда цель лечения включает области или органы, легко доступные для местного применения, например, включая заболевания кожи или любой другой доступной эпителиальной ткани. Составы, пригодные для местного применения, могут быть легко приготовлены для таких областей или органов. Для местного применения фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть разработана в виде соответствующей мази, содержащей фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, особенно описанные выше компоненты, суспендированные или растворенные в одном или более носителях. Носители для местного применения включают, но ими не ограничиваются, минеральное масло, жидкий вазелин, белый вазелин, пропиленгликоль, полиоксиэтилен, полиоксипропиленовое соединение, эмульгирующий воск и воду. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть разработана в виде соответствующего лосьона или крема. В контексте настоящего изобретения к соответствующим носителям относятся, но ими не ограничиваются, минеральное масло, моностеарат сорбитана, полисорбат 60, воск цетиловых эфиров, цетеариловый спирт, 2-октилдодеканол, бензиловый спирт и вода.

Дозировка лечения может осуществляться по схеме разовых доз или по схеме множественных доз. В частности, фармацевтическая композиция может быть представлена виде одной дозы. Предпочтительно, количество антитела в фармацевтической композиции - в частности, если она предоставлена в виде однократной дозы - не превышает 200, более предпочтительно не превышает 100 и еще более предпочтительно не превышает 50 мг.

Например, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может вводиться ежедневно, например, от одного до нескольких раз в день, например, один, два, три или четыре раза в день, предпочтительно, один или два раза в день, более предпочтительно один раз в день на протяжении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 дня или более, например, ежедневно на протяжении 1, 2, 3, 4, 5, 6 месяцев. Предпочтительно, по настоящему изобретению можно вводите еженедельно, например, один или два раза в неделю на протяжении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 недели или более, например, еженедельно на протяжении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев, или еженедельно на протяжении 2, 3, 4 или 5 лет. Более того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению предпочтительно может вводиться ежемесячно, например, один раз в месяц или, более предпочтительно, через месяц на протяжении 1, 2, 3, 4 или 5 или более лет. Также предпочтительно, чтобы введение проводили пожизненно. Кроме того, также предусматривается только одно введение, в частности, в отношении определенных показаний, например, для предотвращения заражения вирусом Зика при случайной экспозиции, например, субъектам, не прошедшим иммунизации.

Однако наиболее предпочтительным режимом лечения является постконтактная профилактика (post-exposure prophylaxis - PEP), при которой одну или более разовых доз вводят как можно скорее после заражения вирусом Зика. Профилактическая установка, согласно которой вводят одну или более разовых доз для предотвращения инфекции Зика (то есть до заражения вирусом Зика, особенно лицам, не иммунизированным против вируса Зика), также является предпочтительной.

В частности, предпочтительно, чтобы для однократной дозы, например суточной, еженедельной или ежемесячной дозы, предпочтительно для еженедельной дозы, количество антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, в фармацевтической композиции по настоящему изобретению не превышало 1 г, предпочтительно не превышало 500 мг, более предпочтительно не превышало 200, еще более предпочтительно не превышало 100, и, особенно предпочтительно не превышало 50 мг.

Фармацевтические композиции обычно включают эффективное количество одного или более антител по настоящему изобретению, то есть количество, достаточное для лечения, улучшения состояния, ослабления симптомов или предотвращения определенного заболевания или состояния, или для проявления очевидного терапевтического эффекта. Терапевтические эффекты также включают снижение или ослабление тяжести заболевания или симптомов заболевания. Точное эффективное количество для любого конкретного субъекта будет зависеть от размера, веса и состояния здоровья, природы заболевания и его тяжести, а также от терапевтических средств или комбинации терапевтических средств, выбранных для введения. Эффективное количество для данной ситуации определяется обычными экспериментами и находится на усмотрении врача. Для целей настоящего изобретения эффективная доза обычно составляет примерно от 0,005 до примерно 100, предпочтительно примерно от 0,0075 до примерно 50, более пред- 48 043940 почтительно примерно от 0,01 до примерно 10 и еще более предпочтительно примерно от 0,02 до примерно 5 мг/кг антитела по настоящему изобретению (например, количество антитела в фармацевтической композиции) по отношению к массе тела (в кг) индивидуума, которому вводят дозу.

Более того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению также может включать дополнительный активный компонент, который может быть дополнительным антителом или компонентом, не являющимся антителом. Дополнительный активный компонент предпочтительно является ингибитором иммунных контрольных точек. Также предпочтительно, если ZIKV-нейтрализующее антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем изобретении, были скомбинированы с ZIKV NS1-связывающим антителом, или его антигенсвязывающим фрагментом, как описано в настоящем изобретении в качестве дополнительного активного компонента (сопутствующего агента). Таким образом, патогенная роль NS1 может блокироваться в дополнение к нейтрализации ZIKV. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать один или несколько дополнительных активных компонентов, например, описанных ниже в качестве сопутствующих агентов в контексте комбинированной терапии.

Антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению может содержаться или в той же фармацевтической композиции, что и дополнительный активный компонент, или, предпочтительно антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению состоит из первой фармацевтической композиции, и дополнительный активный компонента входит в состав второй фармацевтической композиции, отличной от первой фармацевтической композиции. Соответственно, если предусматривают более одного дополнительного активного компонента, каждый дополнительный активный компонент и антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по-настоящему изобретению предпочтительно входят в состав разных фармацевтических композиций. Такие разные фармацевтические композиции можно вводить либо в сочетании/одновременно, либо в разное время, либо в разные части (например, в разные части тела).

Предпочтительно, антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению и дополнительный активный компонент обеспечивают дополнительный терапевтический эффект или, предпочтительно, синергетический терапевтический эффект. Понятие синергизм применяют для описания комбинированного эффекта двух или более активных агентов, который больше, чем сумма отдельных эффектов каждого соответствующего активного агента. Таким образом, когда объединенное действие двух или более агентов приводит к синергетическому ингибированию активности или процесса, подразумевают, что ингибирование активности или процесса больше, чем сумма ингибирующих эффектов каждого соответствующего активного агента. Понятие синергетический терапевтический эффект относится к терапевтическому эффекту, наблюдаемому при комбинировании двух или более видов терапии, причем терапевтический эффект (измеряемый каким-либо из ряда параметров) больше, чем сумма отдельных терапевтических эффектов, наблюдаемых от соответствующих индивидуальных методов лечения.

Фармацевтическая композиция, содержащая антитело, соответствующее gZKA190, gZKA64, gZKA230, gZKA185, gZKA78 или их антигенсвязывающему фрагменту, и фармацевтически приемлемый носитель, является предпочтительной.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению может включать антитела по настоящему изобретению, причем антитела могут составлять, по меньшей мере, 50 мас.% (например, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 мас.% или более) от массы общего белка в композиции. В такой композиции антитела предпочтительно находятся в очищенной форме.

Настоящее изобретение также предусматривает способ получения фармацевтической композиции, включающей стадии: (i) получения антитела по настоящему изобретению; и (ii) смешивание очищенного антитела с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения способ получения фармацевтической композиции включает стадию смешивания антитела с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, причем антитело является моноклональным антителом, которое получают от трансформированной B-клетки или культивируемой плазматической клетки по настоящему изобретению.

В качестве альтернативы доставке антител или B-клеток в терапевтических целях, можно доставлять субъекту нуклеиновую кислоту (обычно ДНК), которая кодирует требуемое моноклональное антитело (или его активный фрагмент), производное от B-клеток или культивируемых плазматических клеток, причем нуклеиновая кислота может экспрессироваться в организме субъекта in situ для обеспечения желаемого терапевтического эффекта. Соответствующая генная терапия и векторы доставки нуклеиновых кислот известны в данной области.

Фармацевтические композиции могут включать антимикробное средство, особенно если они упакованы в формате многократных доз. Фармацевтические композиции могут включать детергент, например, твин (полисорбат), например, твин 80. Концентрация детергентов обычно низкая, например, менее 0,01%. Композиции также могут включать соли натрия (например, хлорид натрия) для придания тоничности. Например, обычная концентрация NaCl равна 10±2 мг/мл.

- 49 043940

Кроме того, фармацевтические композиции могут содержать сахарный спирт (например, маннит) или дисахарид (например, сахарозу или трегалозу), например, в количестве примерно 15-30 мг/мл (например, 25 мг/мл), особенно если они должны быть лиофилизированы или если они включают материал, который был восстановлен из лиофилизированного материала. Показатель pH композиции для лиофилизации может быть доведен до величины от 5 до 8, или от 5,5 до 7, или примерно 6,1 до лиофилизации.

Композиции по настоящему изобретению также могут содержать один или более иммунорегуляторных агентов. В одном варианте осуществления настоящего изобретения один или более из иммунорегуляторных агентов включают адъювант.

Медицинские процедуры, наборы и применение.

Медицинские процедуры.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают применение антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектора по настоящему изобретению, множества молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множества векторов по настоящему изобретению, клеток по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для (i) предупреждения и/или лечения инфекции вируса Зика; или для (ii) диагностики инфекции вируса Зика. Таким образом, применение антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, в соответствии с настоящим изобретением (и особенно его предпочтительными вариантами осуществления, согласно описанному выше), или (множества) молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, кодирующих антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению является предпочтительным для (i) предупреждения и/или лечения инфекции вируса Зика, согласно описанному выше; или для (ii) диагностики инфекции вируса Зика согласно описанному выше.

Методы диагностики могут включать контактирование антитела или фрагмента антитела с образцом. Такие образцы могут быть выделены от субъекта, например, из взятого образца ткани, например, из носовых ходов, синусовых пазух, слюнных желез, легких, печени, поджелудочной железы, почек, ушей, глаз, плаценты, желудочно-кишечного тракта, сердца, яичников, гипофиза, надпочечников, щитовидной железы, мозга, кожи или крови, предпочтительно плазмы или сыворотки. Методы диагностики также могут включать обнаружение комплекса антиген/антитело, в частности, после контакта антитела или фрагмента антитела с образцом. Такая стадия обнаружения обычно выполняется на стенде, то есть без какого-либо контакта с телом человека или животного. Примеры методов детектирования хорошо известны специалистам в данной области и включают, например, метод ELISA (иммуноферментный анализ).

Профилактика инфекции, вызываемой вирусом Зика, относится, в частности, к профилактическим мерам, когда у субъекта не было обнаружено инфекции вируса Зика (либо диагноз не был поставлен, либо результаты диагностики были отрицательными), и/или у субъекта не проявляются симптомы вирусной инфекции Зика. Соответственно, профилактика инфекции вируса Зика включает в себя профилактику после контакта (ППК), то есть профилактическую обработку после после возможного инфицирования вирусом Зика, например, после укуса комара в зоне поражения вирусом Зика. Профилактика заражения вирусом Зика особенно полезна для субъектов высокой степени риска, например, для беременных и/или субъектов, находящиеся в районах, пораженных вирусом Зика (например, субъектов, проживающих в районах, пораженных вирусом Зика, или путешествующих в районы, пораженные вирусом Зика).

В терапевтических установках, напротив, субъект обычно является зараженным вирусом Зика, у него диагностирована инфекция вируса Зика и/или проявляются симптомы инфицирования вирусом Зика. Следует отметить, что термины лечение и терапия/терапевтические инфекции ZIKV включают (полное) излечение, а также ослабление инфекции ZIKV.

Соответственно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению, молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектор по настоящему изобретению, множество молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множество векторов по настоящему изобретению, клетка по настоящему изобретению или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению предпочтительно применяются для лечения инфекции вируса Зика у субъектов, у которых диагностирована инфекция вируса Зика или у субъектов с симптомами инфицирования вирусом Зика.

Также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению, молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектор по настоящему изобретению, множество молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множество векторов по настоящему изобретению, клетки по настоящему изобретению или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению применяются для предупреждения и/или лечения инфекции вируса Зика у бессимптомных субъектов. У таких субъектов может быть диагностирована или не диагностирована инфекция вируса Зика.

Предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению, молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектор по настоящему изобретению, множество молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множество векторов по настоящему

- 50 043940 изобретению, клетки по настоящему изобретению или фармацевтическую композиция по настоящему изобретению применяют для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной вирусом Зика, у беременных, в частности, для предупреждения врожденной инфекции. Например, это может быть выполнено так же, как для профилактики врожденной инфекции HCMV согласно описанию в публикации Nigro G. с соавт, N Engl J Med 353, 2005, 1350-1362.

Без отсылки к какой-либо теории, сделано заключение, что антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению может проходить через плаценту при взаимодействии с FcRn, например, если вводится беременной, например, путем (внутривенной) инъекции или каким-либо другим способом введения согласно описанию настоящего изобретении. Важно, что взаимодействие вариантов антител LALA, согласно описанию настоящего изобретения, с FcRn не подвергается опасности. Предполагают, что FcRn уже экспрессируется в первом триместре в плаценте.

В другом варианте антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, или (множество) молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению также может быть введено в экстроамниотическое пространство.

Предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению, молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектор по настоящему изобретению, множество молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множество векторов по настоящему изобретению, клетки по настоящему изобретению или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению применимы для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной вирусом Зика, причем антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, нуклеиновую кислоту, вектор, множество нуклеиновых кислот, множество векторов, клетки или фармацевтическую композицию вводят в течение семи дней после (возможной) инфекции вирусом Зика, вплоть до пяти дней после (возможной) инфекции вирусом Зика, более предпочтительно вплоть до четырех дней после (возможной) инфекции вирусом Зика, еще более предпочтительно вплоть до трех дней после (возможной) инфекции вирусом Зика, и наиболее предпочтительно в течение одного-двух дней после (возможной) инфекции вирусом Зика. Такая схема лечения может быть полезна как в терапевтических, так и в профилактических целях, в частности, в профилактике после контакта (ППК).

При ППК обычно первое введение антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектора по настоящему изобретению, множества молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множества векторов по настоящему изобретению, клеток по настоящему изобретению или фармацевтической композиция по настоящему изобретению осуществляют как можно скорее после возможной инфекции ZIKV, например, после укуса комаром в зоне поражения ZIKV. Соответственно, при ППК первое введение антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектора по настоящему изобретению, множества молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множества векторов по настоящему изобретению, клеток по настоящему изобретению или фармацевтической композиция по настоящему изобретению осуществляют обычно не позднее одного или более дней после (возможной) инфекции ZIKV, как описано выше.

Также предпочтительно, если антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению, молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектор по настоящему изобретению, множество молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множество векторов по настоящему изобретению, клетки по настоящему изобретению или фармацевтическую композиция по настоящему изобретению применяют для предупреждения и/или лечения инфекции вируса Зика, причем антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, нуклеиновую кислоту, вектор, множество нуклеиновых кислот, множество векторов, клетки или фармацевтическую композицию вводят за три месяца до (возможного) инфицирования вирусом Зика, предпочтительно за месяц до (возможного) инфицирования вирусом Зика, более предпочтительно за две недели до (возможного) инфицирования вирусом Зика, еще более предпочтительно за неделю до (возможного) инфицирования вирусом Зика, и наиболее предпочтительно за день до (возможного) инфицирования вирусом Зика. Такая схема лечения, в частности, относится к профилактическим мерам.

В общем - и, в частности, при ППК - после первого введения антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектора по настоящему изобретению, множества молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множества векторов по настоящему изобретению, клеток по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению, может последовать одно или более последующих введений, предпочтительно одной дозы один или два раза в день в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 1, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 дня.

Также предпочтительно, если после первого введения антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектора по настоящему изобретению, множества молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множества векторов по настоящему изобретению, клеток по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению, может последовать одно или более последую- 51 043940 щих введений, предпочтительно одной дозы один или два раза в неделю в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,

10, 11, 12, 13, 1, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 недели.

Также предпочтительно, если после первого введения антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектора по настоящему изобретению, множества молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множества векторов по настоящему изобретению, клеток по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению, может последовать одно или более последующих введений, предпочтительно одной дозы каждые две или четыре недели в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 1, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 недели. Также предпочтительно, если после первого введения антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектора по настоящему изобретению, множества молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множества векторов по настоящему изобретению, клеток по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению, может последовать одно или более последующих введений, предпочтительно одной дозы каждые два или четыре месяца в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 1, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 месяца. Также предпочтительно, если после первого введения антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектора по настоящему изобретению, множества молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множества векторов по настоящему изобретению, клеток по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению, может последовать одно или более последующих введений, предпочтительно одной дозы один или два раза в год в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 лет.

Предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению, молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектор по настоящему изобретению, множество молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множество векторов по настоящему изобретению, клетку по настоящему изобретению или фармацевтическую композиция по настоящему изобретению вводят в (разовой) дозе от 0,005 до 100, предпочтительно в (разовой) дозе от 0,0075 до 50, более предпочтительно в (разовой) дозе от 0,01 до 10, еще более предпочтительно в (разовой) дозе от 0,05 до 5, и особенно предпочтительно в (разовой) дозе от 0,1 до 1 мг/кг массы тела.

Антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению, молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектор по настоящему изобретению, множество молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множество векторов по настоящему изобретению, клетка по настоящему изобретению или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению могут быть введены каким-либо путем, например, пероральным, внутривенным, внутримышечным, внутриартериальным, интрамедуллярным, внутрибрюшинным, интратекальным, интравентрикулярным, трансдермальным, чрескожный, местным, интраназальным, энтеральным, подъязычным, интравагинальным или ректальным. Внутривенное введение, или подкожное введение, или внутримышечное введение являются предпочтительными, и внутривенное введение или подкожное введение являются более предпочтительными.

Беременным антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, или молекула (множество молекул) нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению также могут быть введены интра- или экстраамниотическим путем, например, инъекцией.

Таким образом, настоящее изобретение также предусматривает способ предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной вирусом Зика, причем этот способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектора по настоящему изобретению, множества молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множества векторов по настоящему изобретению, клеток по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Предпочтительные варианты осуществления такого способа соответствуют предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения, касающимся медицинского применения, согласно описанному выше (и ниже, касательно комбинированной терапии). Например, предпочтительным субъектом в данном способе является субъект, у которого диагностировано инфицирование вирусом Зика. Другими предпочтительными субъектами в данном способе являются беременные женщины.

Комбинированная терапия.

Введение антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектора по настоящему изобретению, множества молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множества векторов по настоящему изобретению, клеток по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению в методы и применения по настоящему изобретению может быть выполнено отдельно или в комбинации с сопутствующими агентами (также называемым в настоящем изобретении дополнительным активным компонентом), который, в частности, применим для предупреждения и/или лечения инфекции ZIKV.

Настоящее изобретение охватывает введение антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента,

- 52 043940 по настоящему изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектора по настоящему изобретению, множества молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множества векторов по настоящему изобретению, клеток по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению, причем введение осуществляют субъекту до, одновременно или после других схем лечения или лечения сопутствующими агентами, полезными для лечения и/или предупреждения инфекции ZIKV. Указанное антитело, нуклеиновая кислота, вектор, клетка или фармацевтическая композиция, которые вводят одновременно с указанными сопутствующими агентами, можно вводить в одной и той же или разных композициях и одинаковыми или разными путями введения.

Указанные другие схемы лечения или сопутствующие агенты могут быть, например, ингибитором контрольной точки.

Таким образом, в другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению, молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектор по настоящему изобретению, множество молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множество векторов по настоящему изобретению, клетки по настоящему изобретению или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят в комбинации с ингибитором контрольной точки для (медицинского) использования, согласно описанному в настоящем изобретении.

Предпочтительные ингибиторы контрольных точек направлены на блокирование PD-1/PD-L1 и/или CTLA4 и, таким образом, включают анти-PD-1 антитела, анти-PD-L1 антитела и анти-CTLA4 антитела. Таким образом, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может включать один или более дополнительных активных компонентов.

Также предпочтительно, если нейтрализующее ZIKV антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, согласно описанию настоящего изобретения, объединено с ZIKV NS1-связывающим антителом, или его антигенсвязывающим фрагментом, в качестве дополнительного активного компонента (совместно применяемого агента). Таким образом, патогенная роль NS1 может блокироваться в дополнение к нейтрализации ZIKV. Соответственно, ZIKV NS1-связывαющее антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, например, описанный в патенте PCT/EP2017/067581, включенным в настоящее изобретение в виде ссылки, является предпочтительным активным компонентом (сопутствующим агентом).

Антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению, молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектор по настоящему изобретению, множество молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множество векторов по настоящему изобретению, или клетки по настоящему изобретению могут быть в одной фармацевтической композиции в качестве дополнительного активного компонента (сопутствующего агента), или, предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению, молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектор по настоящему изобретению, множество молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множество векторов по настоящему изобретению, или клетки по настоящему изобретению содержатся в первой фармацевтической композиции, а дополнительный активный компонент (сопутствующий агент) содержится во второй фармацевтической композиции, отличающейся от первой фармацевтической композиции. Соответственно, если применяют более одного дополнительного активного компонента (сопутствующего агента), каждый дополнительный активный компонент (сопутствующий агент) предпочтительно включен в другую фармацевтическую композицию. Такие разные фармацевтические композиции могут быть введены комбинированно/одновременно, или раздельно в разное время, или в разной локализации (например, для разных частей организма).

Предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению и аддитивный активный компонент (сопутствующий агент) обеспечивают аддитивный терапевтический эффект, или, предпочтительно, синергетический терапевтический эффект. Понятие синергия применяют для описания комбинированного эффекта двух или более активных агентов, совместное действие которых превышает сумму отдельных эффектов каждого соответствующего активного агента. Таким образом, когда комбинированное действие двух или более агентов приводит к синергетическому ингибированию активности или процесса, подразумевают, что ингибирование активности или процесса больше, чем сумма ингибирующих эффектов каждого соответствующего активного агента. Понятие синергетический терапевтический эффект относится к терапевтическому эффекту, наблюдаемому при комбинировании двух или более тератевтических средств, причем терапевтический эффект (оцененный по какому-либо числу параметров) выше, чем сумма индивидуальных терапевтических эффектов, наблюдаемых при соответствующих отдельных терапиях.

Дополнительные применения и наборы.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают применение антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектора по настоящему изобретению, множества молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множества векторов по настоящему изобретению, клеток по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для мониторинга качества вакцины против вируса Зика путем проверки того, что антиген указанной вакцины содержит

- 53 043940 определенный эпитоп в правильной конформации. Предпочтительные антигены, входящие в состав такой вакцины против Зика, подлежащей проверке, включают белок оболочки ZIKV или какую-либо другую молекулу/комплекс, содержащие или состоящие из (i) домена III белка E ZIKV (EDIII), согласно описанному выше, или (ii) четвертичного эпитопа ZIKV, согласно описанному выше.

Более того, настоящее изобретение также предусматривает применение антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектора по настоящему изобретению, множества молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множества векторов по настоящему изобретению, клеток по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению (in vitro) для диагностики инфекции вируса Зика.

Кроме того, предусматривают применение антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектора по настоящему изобретению, множества молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множества векторов по настоящему изобретению, клеток по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для определения, является ли взятый образец крови (например, цельной крови, сыворотки и/или плазмы) инфицированным вирусом Зика.

Выше было описано, что способы диагностики могут включать контактирование антитела или фрагмента антитела с образцом. Такие образцы могут быть получены от субъекта, например, из выделенного образца ткани, взятого, например, из носовых ходов, пазух носа, слюнных желез, легких, печени, поджелудочной железы, почек, ушей, глаз, плаценты, желудочно-кишечного тракта, сердца, яичников, гипофиза, надпочечников, щитовидной железы, мозга, кожи или крови, сыворотки или плазмы. Методы диагностики могут также включать обнаружение комплекса антиген/антитело, в частности, после контакта антитела или фрагмента антитела с образцом. Такая стадия обнаружения обычно выполняется на стенде, то есть без какого-либо контакта с телом человека или животного. Примеры методов обнаружения хорошо известны специалистам в данной области и включают, например, метод ELISA (иммуноферментный анализ).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения также предусматривают набор частей, содержащий, по меньшей мере, одно антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по настоящему изобретению, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, множество нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, по меньшей мере, один вектор по настоящему изобретению, множество векторов по настоящему изобретению, по меньшей мере, одну клетку по настоящему изобретению, и/или по меньшей мере, одну фармацевтическую композицию по настоящему изобретению. Кроме того, набор может включать средства введения антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, по настоящему изобретению, молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектор по настоящему изобретению, множество молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, множество векторов по настоящему изобретению, клетки по настоящему изобретению или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, например, шприц или флакон, вкладыш и/или сопутствующий агент, предназначенные для введения согласно описанному выше.

Описание фигур

Фиг. 1. Реактивность (методом ELISA) и нейтрализующая активность ZIKV и DENV1 антителами, полученными от четырех иммунных доноров ZIKV (ZKA, ZKB, ZKC и ZKD) к E белку ZIKV и DENV14, а также к EDIII-домену E белка ZIKV; NNB - нейтрализующие, не связывающиеся с E белком антитела (neutralizing, non-E-protein binding antibodies).

Фиг. 2. Связывание антител ZKA190, ZKA78 и ZKA64 с E белками ZIKV и DENV1 с ZIKV EDIII по данным анализа методом ELISA.

Фиг. 3. Связывание антител ZKA185 и ZKA190 с ZIKV E, DENV1 VLP и ZIKV EDIII белками по данным анализа методом ELISA.

Фиг. 4. В примере 3 показывают нейтрализующую активность антител ZKA190, ZKA64, ZKA64LALA, ZKA230 и ZKA78 против ZIKV (штамм H/PF/2013) и DENV1 на клетках Vero по данным жидкостной цитометрии (% инфицированных клеток).

Фиг. 5. В примере 3 показывают нейтрализующую активность антител ZKA190, ZKA64, ZKA185, ZKA230 и ZKA78 против ZIKV (штамм H/PF/2013) на клетках Vero, измеренную считыванием жизнеспособности клеток (wst-1, фирма Roche).

Фиг. 6. В примере 4 показывают усиливающую инфицирующую активность (ADE, антителозависимое усиление) антител ZKA190, ZKA64, ZKA64-LALA, ZKA185, ZKA230 и ZKA78 к ZIKV (штамм H/PF/2013) на непермиссивных клетках K562 по данным жидкостной цитометрии (% инфицированных клеток).

Фиг. 7. В примере 4 показывают, что четыре ZIKV-иммунные плазмы и одна DENV-иммунная плазма проявляют сходную способность усиливать ZIKV-инфекцию клеток K562 (верхняя панель). Этот эффект ADE был полностью блокируется во всех пяти иммунных плазмах с помощью EDIIIспецифического антитела ZKA64-LALA (нижняя панель).

Фиг. 8. Аминокислотное выравнивание области EDIII 39 штаммов ZIKV из азиатской линии от 2013

- 54 043940 года (включая прототипный штамм MR766 африканской линии, выделенный в 1947 году).

Фиг. 9. В примере 3 показывают нейтрализующую активность антител ZKA190 и ZKA190-LALA против трех штаммов ZIKV (H/PF/2013, MR766 и MRS_OPY_Martinique_PaRi_2015) на клетках Vero по данным жидкостной цитометрии (% инфицированных клеток).

Фиг. 10. В примере 5 показывают нейтрализацию mAb ZKA190 и C8, исследованных против панели из четырех штаммов ZIKV, которую определяли по проценту инфицированных клеток Vero в присутствии возрастающих количеств mAb (А). Также показаны значения IC₅₀ (Б) и статистика (В). Данные представляют, по меньшей мере, два независимых эксперимента.

Фиг. 11. В примере 6 показывают нейтрализацию и усиление инфекции ZIKV антителом ZKA190. (А) Нейтрализация заражения штаммов ZIKV PRVABC59 hNPC моноклональными антителами (mAb) ZKA190, ZKA190-LALA и контрольным mAb, установленная с помощью анализа бляшек на клетках Vero (левая панель) и непрямой иммунофлюоресценцией инфицированных hNPC с использованием меченных флуорофором антител против E белка (правая панель). (Б) ADE инфекции ZIKV в непермиссивных клетках K562 ZKA190 и ZKA190-LALA. (В) ADE индуцируется в клетках K562, когда ZIKV предварительно инкубируют с серийными разведениями сыворотки плазмы от разных ZIKV-позитивных пациентов (левая панель). При добавлении ZKA190 LALA в комплексы ZIKV-сыворотка, ингибируется ADE (правая панель). (Г) ADE индуцируется в клетках K562, когда ZIKV предварительно инкубируют с серийными разведениями prM перекрестно-реактивного mAb (DV62), полученного от DENV-иммунного донора. ZKA190-LALA ингибирует ADE ZIKV при образовании комплекса с prM-реактивным антителом DV62. (Д) Влияние на ADE, вызванное усилением пика разведением плазмы DENV2 (левая панель) или анти-prM DV62 mAb (правая панель) последовательными разведениями указанных mAb.

Фиг. 12. В примере 7 показывают идентификацию эпитопа ZKA190 и анализ его сохранения в штаммах ZIKV.

(А) Наложение спектров [¹⁵N,1H]-HSQC ¹⁵N-меченного ZIKV EDIII в отсутствие (черный цвет) или в присутствии (красный цвет) немеченого Fab ZKA190. Различия определяют остатки EDIII, на которые влияет связывание антитела.

(Б) ЯМР-картирование эпитопа Fab ZKA190 в комплексе с ZKV EDIII. Возмущение химического сдвига (chemical shift perturbation - CSP, Y-ось) наносится на график против номера остатка EDIII. Остатки, на которые влияет связывание антител, выделены красным.

(B) Остатки в петле FG, идентифицированные путем ЯМР-картирования эпитопа, частично скрытые E белка в молекулах А, но в значительной степени экспонированные в молекулах Б и В. EDIII белка E окрашен в синий цвет. Остатки, идентифицированные путем ЯМР-картирования эпитопа, окрашены в пурпурный цвет, за исключением тех, которые в петле FG окрашены в зеленый цвет. Смежные белки E показаны в виде серой поверхности.

(Г) Уровень сохранения аминокислотного остатка в эпитопе ZKA190, рассчитанный путем анализа последовательностей из 217 штаммов ZIKV, обнаруженных в базах данных ZIKV Resources (NCBI) по состоянию на 24 ноября 2016 г.

(Д) Представление открытой книги, показывающее взаимодополняемость заряда между эпитопом и паратопом по результату докинга. Границы эпитопа и паратопа обведены зеленым. Границы между тяжелыми и легкими цепями Fab и соответствующем им области узнавания на EDIII показаны желтыми пунктирными линиями.

Фиг. 13. В примере 7 показывают эпитоп ZKA190, идентифицированный с помощью ЯМР и докинга. (А) Схематичное представление 12 структур ЯМР с самой низкой энергией ZIKV EDIII, с остатками, на которые влияет связывание ZKA190, в красном цвете. Гибкость в N-конце конструкции очевидна. (Б) Модель комплекса ZKA190: EDIII, полученная вычисленным докингом и молекулярным моделированием, и подтвержденная результатами ЯМР. ЯМР-идентифицированный эпитоп на EDIII (серый) выделен красным. Тяжелая и легкая цепь ZKA190 окрашены в темный и светло-зеленый цвета, соответственно. Остатки EDIII, которые влияют или не связываются с антителом в результате мутирования, выделены оранжевым и синим цветом, соответственно. (В) ЯМР-идентифицированный эпитоп ZKA190 (красный) доступен на поверхности вируса (белый).

Фиг. 14. В примерах 7 и 10 показывают связывание wt или мутировавшего EDIII с ZKA190 IgG. Показаны данные SPR и кинетика связывания. Мутанты EDIII, которые влияют (выделены красным цветом) или не влияют на связывание, отмечены.

Фиг. 15. В примере 8 показаны результаты экспериментов по конфокальной микроскопии. ZIKV, инкубированный с Fab ZKA190 или полным IgG, взятыми в концентрации, которая в 10000 раз превышает IC50, добавляют к клеткам Vero. Комплекс ZIKV:антитело обнаруживают внутри клеток (зеленый цвет); комплекс локализован вместе с эндосомами (наложение красного и желтого). Эндосомы и кислотные органеллы отмечены красителем Lysotracker красным; конъюгированный с ZKA190 краситель Alexa488 зеленого цвета. Ядра окрашены DAPI (синий цвет).

Фиг. 16. В примере 9 показана профилактическая и терапевтическая эффективность ZKA190. (А) ZKA190 эффективно защищает от инфицирования ZIKV при профилактическом введении мышам (A129 в (А) и AG129 в (Б)), которых заражают летальной дозой вируса ZIKV штамм MP17451. В экспериментах

- 55 043940 в группах было по 4-8 мышей. Представлены кривые выживаемости Каплана-Мейера (А).

Значимость определяют с использованием теста логарифмического ряда Мантеля-Кокса. Панель А, вверху слева: ZKA190 в количестве 5, 1 и 0,2 мг/кг против Ctr mAb, P=0,0031; ZKA190 в количестве 0,04 мг/кг против контрольного mAb, P=0,0116; ZKA190-LALA в количестве 5, 1, 0,2 и 0,04 мг/кг против контрольного mAb, P=0,0031. Панель А, вверху справа: показатель заболеваемости мышей, наблюдаемых в течение 14-15 дней (используют два различных метода оценки; см. (Dowall S.D. с соавт., PLoS Negl Trop Dis 10, 2016, e0004658-13). Панель А, панели внизу: масса тела мышей. Панели Б: ZKA190 или ZKA190LALA вводят в дозе 15 мг/кг в различные моменты времени после заражения ZIKV. Панель Б, вверху слева: показана кривая выживаемости Каплана-Мейера. В экспериментах используют по 5 мышей в группе. Значимость определяют с использованием теста логарифмического ряда Мантеля-Кокса. ZKA190 и ZKA190-LALA дают в 1, 2, 3 или 4 день против контроля, P=0,0016. Панель Б, вверху справа: Показатель заболеваемости мышей контролируют в течение 14 дней в соответствии с Dowall с соавт., 2016. Мышей подвергают мониторингу в течение 14 дней, оценивая потерю массы тела (панель Б, нижние панели). Контрольным является антитело MPE8, специфичным для E белка RSV (Corti D. с соавт., Nature 501, 2013, 439-443).

Фиг. 17. В примере 9 показана профилактическая эффективность анти-ZIKV EDШ-специфического mAb ZKA190 против штаммов ZIKV MP1741. (А) Показана виремия, измеренная как БОЕ/мл на 5 день в крови всех животных. (Б) Вирусную нагрузку измеряют в виде геномных копий/мл с помощью qPCR на 5-й день в крови всех животных и в крови и определенных тканях, когда животных отбирают в конце исследования или когда достигают гуманных конечных точек. (В) Мышей подвергают мониторингу в течение 14-дневного периода для определения снижения массы тела. (Г) Концентрация IgG человека в сыворотке крови в 5-й день в образцах крови. Значимость определяют по сравнению с обработкой контрольным антителом с помощью непараметрического непарного U-критерия Манна-Уитни. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.

Фиг. 18. В примере 9 показана терапевтическая эффективность анти-ZIKV EDIII-специфического mAb ZKA190. (А) Вирусные нагрузки измеряют как БОЕ на 5 день в крови всех животных. (Б) Вирусные нагрузки измеряют в виде копий генома с помощью qPCR на 5-й день в крови всех животных и в определенных тканях, когда животных отбирают в конце исследования или когда достигают гуманных конечных точек. Значимость определяют сравнением с контрольной обработкой антителами с помощью непараметрического непарного U-критерия Манна-Уитни. *p<0,05; **p<0,01. (В) Концентрация IgG человека в сыворотке крови на 5-е сутки.

Фиг. 19. В примерах 11 и 12 описано встраивание ZKA190 в биспецифическое mAb FIT-1 и его характеристика in vitro. (А) Моноклональные антитела (mAb) ZKA185 и ZKA230 тестируют на нейтрализацию четырех штаммов ZIKV, которую определяют по проценту инфицированных клеток Vero в присутствии увеличивающихся количеств mAb. Данные представляют, по меньшей мере, два независимых эксперимента. (Б) Связывание ZKA185, ZKA230 IgG и Fab с рекомбинантными антигенами VLP, E и DIII ZIKV оценивают методом ELISA. (В) ZKA190, ZKA185 и ZKA230 протестируют на способность нейтрализовывать H/PF/2013 (вес) и MARM 1-4. (Г) Поверхностное представление двух димеров белка E, связанных ZKA190 (зеленый); эпитоп, производный от ZKA190 NMR, имеет красную окраску; положения, мутированные в MARM, обозначены желтым (E370), синим (T335), оранжевым (D67) и пурпурным (K84). (Д) Модель FIT-1. Природные линкеры между внутренним и внешним Fab обеспечивают гибкое перемещение Fab в антителе FIT-1. Вариабельные области ZKA185 и ZKA190 выделены синим и зеленым цветом, соответственно. (Е) Связывание FIT-1 IgG и Fab с рекомбинантными антигенами VLP, E и DIII ZIKV оценивают методом ELISA. (Ж) mAb ZKA190, ZKA185 и FIT-1 тестируют на способность нейтрализовать четыре штамма (значения IC50, Ж) и четырех MARM (3) ZIKV. (И) Нейтрализация штамма ZIKV H/PF/2013 с помощью ZKA185, ZKA230 и FIT-1 IgG и Fab, определенных в (А). (К) Эксперименты по конфокальной микроскопии, показанные на фиг. 3. (Л) Эффект на ADE, индуцированный пиковым усилением разведения анти-prM DV62 mAb или DENV2 плазмы путем серийных разведений FIT-1 IgG и Fab.

Фиг. 20. Терапевтическая эффективность FIT-1. FIT-1 очень эффективен против инфекции ZIKV при терапевтическом введении мышам (A129) в различные моменты времени, которым вводят смертельную дозу штамма ZIKV MP17451. В экспериментах используют по 5-6 мышей на группу. (А) Кривые выживания Каплана-Мейера. Значимость определяют с использованием критерия логарифмического ранга Мантеля-Кокса. FIT-1 в дозах 15, 5 и 1 мг/кг вводят в 1-й день, во 2-й день в зависимости от контрольного mAb, P=0,0012; ZKA190 в дозах 15 и 5 мг/кг в 3-й день в зависимости от контрольного mAb, P=0,0012; ZKA190 в дозе 1 мг/кг дано на 3-й день в зависимости от контрольного mAb, P=0,0170. (Б) Оценка заболеваемости мышей, наблюдаемых в течение 21 дня (Dowall с соавт., 2016). (В) Вирусные нагрузки измеряют как БОЕ на 5 день в крови всех животных. (Г) Мышей контролируют в течение 21дневного периода на предмет потери массы тела. Контрольным mAb на панели А является MPE8 mAb (F белок, специфичный для RSV (Corti D. с соавт., Nature 501, 2013, 439-443). (Д) Нагрузку вируса измеряют методом qPCR и выражают в виде количества копий генома в 5-й день в крови всех животных и в крови и определенных тканях, когда животных отбирают в конце исследования или когда достигают гу- 56 043940 манных конечных точек. Значимость определяют путем сравнения с контрольной обработкой антителами с помощью непараметрического непарного U-критерия Манна-Уитни. *p<0,05; **p<0,01.

Фиг. 21. В примере 14 показывают, что самки мышей AG129, получавшие FIT-1 после заражения малазийским ZIKV, защищены от смертности по сравнению с мышами, получавшими плацебо.

Фиг. 22. В примере 14 показывают внутриутробное ограничение роста (IUGR) у мышат, рожденных от самок, получавших FIT-1 и зараженных ZIKV.

Фиг. 23. В примере 14 показывают средний вес мышат на дату рождения, рожденных от самок, получавших FIT-1 и инфицированных ZIKV.

Фиг. 24. В примере 14 показывают вес плацент, собранных на 11 сутки после инфицирования от смок, получавших FIT-1.

Фиг. 25. В примере 14 показывают количественное определение вирусной РНК у (А) плода, (Б) плаценты, (В) материнской селезенки и (Г) материнского мозга (***P<0,001, **P<0,01, по сравнению с лечением MPE8).

Фиг. 26. В примере 15 показывают выживаемость самцов мышей AG129, инфицированных ZIKV и получавших FIT-1 через 24 или 72 ч после заражения вирусом (*P<0,05 по сравнению с обработкой отрицательным контролем MPE8).

Фиг. 27. В примере 15 показывают среднее процентное изменение веса мышей AG129, получавших FIT-1, в разное время после заражения ZIKV.

Фиг. 28. В примере 15 показывают оценку болезни А) семенников или Б) придатков самцов мышей AG129, получавших FIT-1 через 24 или 72 ч после заражения ZIKV. Лечение реакционноспособными Ab приводит к снижению заболеваемости семенников и придатков.

Фиг. 29. В примере 16 показывают нагрузку вируса в сыворотке крови в трех протестированных группах. Горизонтальная линия показывает LLOQ 860 GC/мл.

Примеры

Возможные варианты осуществления настоящего изобретения представлены ниже в примерах. Эти примеры представлены только в качестве иллюстрации и для помощи специалистам в осуществлении настоящего изобретения. Эти примеры никоим образом не предназначены для ограничения рамок охвата настоящего изобретения.

Пример 1. Выделение ZIKV-специфичных антител и выработка моноклональных антител.

IgG+ B-клетки памяти выделяют из криоконсервированных мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) четырех инфицированных ZIKV доноров (ZKA, ZKB, ZKC и ZKD) с использованием микрогранул CD22 (фирма Miltenyi Biotec) с последующим истощением клеток, несущих IgM, IgD и IgA, путем сортировки клеток. B-клетки памяти от ZIKV-инфицированных доноров затем иммортализуют EBV (вирус Эпштейна-Барра) и CpG (CpG-олигодезоксинуклеотид 2006) в нескольких повторяющихся лунках, согласно описанному ранее (Traggiai E. с соавт., Nat. Med. 10, 2004, 871- 875) и затем культуральные супернатанты тестируют при первичном скрининге с использованием параллельно 384луночного анализа микро-нейтрализации и анализа связывания (ELISA) для тестирования их связывания с белком NS1 вируса ZIKV или белком E вируса ZIKV. Результаты анализа связывания (связывания с белком E вируса ZIKV) показаны на фиг. 1.

В-клетки памяти от ZIKV-инфицированных доноров затем иммортализуют EBV (вирус ЭпштейнаБарра) и CpG (CpG-олигодезоксинуклеотид 2006) в нескольких повторяющихся лунках, согласно описанному ранее (Traggiai E. с соавт., Nat. Med. 10, 2004, 871-875) и затем культуральные супернатанты тестируют при первичном скрининге с использованием параллельно 384-луночного анализа микронейтрализации и анализа связывания (ELISA) для тестирования их связывания с белком NS1 вируса ZIKV или белком E вируса ZIKV. Результаты анализа связывания (связывания с белком E вируса ZIKV) показаны на фиг. 1.

Анализы нейтрализации проводят на клетках Vero. В 384-луночном планшете ZIKV H/PF/2013 при уровне множественности инфекции 0,35 (multiplicity of infection - MOI), инкубируют с супернатантами в течение 1 ч при 37°C (5% CO₂) перед добавлением к предварительно высеянным 5000 клеток Vero. Их инкубируют в течение еще 5 дней, после чего супернатант удаляют и добавляют реагент WST-1 (фирма Roche). Положительные культуры были собраны и размножены. Из положительных культур последовательности VH и VL извлекают с помощью RT-PCR. Антитела клонируют в векторах экспрессии IgG1 и Ig-каппа или лямбда-Ig человека (любезно предоставлены Michel Nussenzweig, Университет Рокфеллера, Нью-Йорк, США), по существу, согласно описанию (Tiller T. с соавт., J Immunol Methods 329, 2008, 112124). Моноклональные антитела получают из EBV-иммортализованных B-клеток, или путем временной трансфекции клеток 293 Freestyle (фирма Invitrogen). Супернатанты из B-клеток или трансфецированных клеток собирали и IgG подвергали аффинной очистке с помощью хроматографии на белке А или белке G (фирма GE Healthcare) и обессоливали против ФСБ.

Фиг. 1 предусматривает обзор по отдельным нейтрализующим ZIKV антителам (см. табл. 1 и 2 для аминокислотных последовательностей их CDR и вариабельных областей тяжелых/легких цепей). В последних двух столбцах фиг. 1 представлена активность, направленная на нейтрализацию (IC₅₀) ZIKV и DENV1 (при тестировании). Другие столбцы представляют связывающую активность (EC₅₀) антител с E

- 57 043940 белком ZIKV (ZIKV E), E белком DENV1 (DENV1 E), E белком DENV2 (DENV2), E белком DENV3 E (DENV3), E белком DENV4 (DENV4)), вирусоподобной частицей DENV1 (VLP DENV1), вирусоподобными частицами DENV2 (VLP DENV2), вирусоподобными частицами DENV3 (VLP DENV3), вирусоподобными частицами DENV4 (VLP DENV4) и EDШ-доменом E белка ZIKV (DIII ZKA).

Пример 2. Описание антител ZKA190, ZKA185, ZKA230, ZKA64 и ZKA78.

В примере 1 большое количество ZIKV-нейтрализующих антител идентифицируют и характеризуют по их специфичности к ZIKV, в частности к E белку ZIKV и EDIII ZIKV, а также по их перекрестной реактивности по отношению к DENV. Антитела ZKA190 (SEQ ID NO: 1-18), ZKA185 (SEQ ID NO: 1936), ZKA230 (SEQ ID NO: 37-54), ZKA64 (SEQ ID NO: 73-90) и ZKA 78 (SEQ ID NO: 55-72), описанные в примере 1, затем отбирают и дополнительно тестируют против E белка ZIKV (ZIKV), EDIII ZIKV (DIIIZI), а также против белка E вируса денге (DENV, серотип номер 1) методом ELISA. Для этого используют стандартный иммуноферментный анализ (ELISA). Вкратце, планшеты для ELISA покрывают E белком ZIKV в концентрации 1 или 3 мкг/мл, блокируют 10% ФСТ в ФСБ, инкубируют с сыворотками или антителами человека и промывают. Связанные антитела выявляют путем инкубирования с APконъюгированным козьим антителом против IgG человека (goat anti-human IgG; фирма Southern Biotech). Затем планшеты промывают, добавляют субстрат (p-NPP, фирма Sigma) и планшеты считывали при 405 нм. Относительную аффинность связывания моноклонального антитела определяют путем измерения концентрации антитела (EC₅₀), необходимой для достижения 50% максимального связывания при насыщении.

Результаты представлены на фиг. 3 и 4. Следует отметить, что ZKA64 и ZKA190 связывают с E ZIKV и EDIII ZIKV (DIIIZI) с низкими значениями EC₅₀, что указывает на то, что ZKA64 и ZKA190 связываются с доменом III E белка ZIKV (EDIII). ZKA78 связывается с E белком ZIKV, но не с EDIII ZIKV, что указывает на то, что ZKA78 связывается с E ZIKV, но не нацеливается на область EDIII. Несмотря на значительную нейтрализующую активность ZIKV (см. фиг. 1), антитела ZKA185 и ZKA230 не обнаруживают какого-либо выявляемого связывания с E ZIKV и EDIII ZIKV (фиг. 3). Соответственно, ZKA185 и ZKA230 называют нейтрализующими-не-связывающими E (neutralizing-non-E-binding NNB) антителами. Предполагают, что эти NNB-антитела распознают четвертичные эпитопы, которые представлены на инфекционных вирионах ZIKV, но не на растворимых белках.

Более того, ни один из ZKA190, ZKA185, ZKA230 и ZKA64 не показывает какого-либо детектируемого связывания с E белками DENV (фиг. 1, серотипы DENV1-4 и фиг. 3 и 4), что указывает на то, что ZKA190, ZKA185, ZKA230 и ZKA64 специфичны для ZIKV и перекрестно не реагирует на вирус денге. ZKA78, напротив, связывается с белками E DENV (фиг. 1 и 3), но не с ZIKV EDIII (см. фиг. 2), что указывает на то, что ZKA78 является перекрестно-реактивным антителом, связывающимся и с ZIKV, и с DENV.

Чтобы дополнительно подтвердить эти результаты, антитела ZKA190, ZKA64 и ZKA78, связывающие E белок ZIKV, дополнительно тестируют против E белка вируса денге (DENV, серотипы № 1-4). ZKA64 и ZKA190 не связываются с E белком DENV1-4, тем самым подтверждая, что ZKA64 и ZKA190 специфичны для ZIKV. ZKA78, напротив, связан с E белком DENV1-4 E, подтверждая, что ZKA78 является перекрестно-реактивным антителом, связывающимся с E белком как ZIKV, так и DENV (см. фиг. 1).

Пример 3. Выделенные антитела активно нейтрализуют инфекцию ZIKV.

Определяют способность антител ZKA190, ZKA185, ZKA230, ZKA64 и ZKA78 нейтрализовать инфекции ZIKV и DENV1 in vitro.

Нейтрализацию антителами инфекций, вызванных DENV и ZIKV, измеряют с использованием метода микро-нейтрализации на основе проточной цитометрии. Различные разведения антител смешивают с ZIKV (MOI 0,35) или с ослабленным DENV1 (все с MOI 0,04) в течение 1 ч при 37° и добавляют к 5000 клеткам Vero/лунку в 96-луночных планшетах с плоским дном. Через четыре дня для ZIKV и пяти дней для DENV клетки фиксире.п 2% формальдегидом, насыщают сапонином в 1% ФСБ 0,5% и окрашивают mAb 4G2 мыши. Клетки инкубируют с козьим антителом против IgG мыши, конъюгированным с Alexa Fluor488 (фирма Jackson Immuno-Research, 115485164), и анализируют методом жидкостной цитометрии. В других случаях данные по нейтрализации ZIKV также определяют путем измерения жизнеспособности клеток с использованием реагента WST-1 (фирма Roche).

Титр нейтрализации (50% ингибирующая концентрация [IC₅₀]) выражают как концентрацию антител, которая снижает инфекцию на 50% по сравнению с контрольными лунками, содержащими только клетки.

Результаты представлены на фиг. 4, 5 и 9. EDIII-специфические mAb ZKA64 и ZKA190, а также NNB mAb ZKA230, являются высоко активными при нейтрализации ZIKV (штамм H/PF/2013), с величиной IC50 93, 9 и 10 нг/мл, соответственно (фиг. 4, верхняя панель). Напротив, кроссреакционноспособные антитела ZKA78 только частично нейтрализуют инфекционность ZIKV и инфекционность перекрестно нейтрализуемых DENV1 (фиг. 4, нижние панели). Аналогичные данные получают путем измерения ZIKV-индуцированного цитопатического эффекта, измеренного с помощью реагента WST-1 (фиг. 5). В этом втором анализе NNB антитело ZKA185 также включают в панель тестируемых антител, и оно показало величину IC50, сходную с наиболее сильнодействующими антителами ZKA190

- 58 043940 (EDШ-специфичные) и ZKA230 (NNB).

Важно отметить, что ультра-сильные антитела ZKA64 и ZKA190 в дополнение к их способности нейтрализовать штамм ZIKV H/PH/2013 (настоящий пример) также связаны с белком E и EDIII, полученными из штаммов ZIKV MR766 и SPH2015, соответственно (фиг. 1 и 2). Также было подтверждено, что ZKA190 и ZKA190-LALA эффективно нейтрализуют два дополнительных штамма ZIKV (MR766 и MRS_OPY_Martinique_PaRi_2015) (фиг. 9). Взятые вместе, результаты показывают, что ультра-сильные антитела ZKA64 и ZKA190 перекрестно реагируют с несколькими штаммами ZIKV, принадлежащими к различным генотипам и имеющими разное происхождение (восточноафриканский и азиатский из Уганды, Французской Полинезии, Мартиники и Бразилии).

Пример 4. Мутация LALA подавляет антитело-зависимое усиление инфекции ZIKV сывороточными антителами.

Нейтрализующие антитела также тестируют HA способность усиливать инфекцию ZIKV в непермиссивных клетках K562 (антителозависимое усиление; antibody-dependent enhancement, ADE). ADE измеряют методом на основе потока с использованием клеток K562. Антитела и ZIKV H/PF/2013 (MOI 0,175) смешивают в течение 1 ч при 37°C и добавляют к 5000 клеток К562/лунку. Через четыре дня клетки фиксируют, пропитывают и окрашивают m4G2. Количество инфицированных клеток определяют жидкостной цитометрией.

Результаты представлены на фиг. 6. Все антитела усиливают инфекцию ZIKV в непермиссивных клетках K562 в широком диапазоне концентраций, включая те, которые полностью нейтрализовали инфекцию ZIKV на клетках Vero (фиг. 6). Следует отметить, что хотя EDIII-специфические антитела ZKA64 и ZKA190 полностью нейтрализуют ZIKV-инфекции клеток K562 в концентрации выше 1 мкг/мл, NNB-антитело ZKA230 такого результата не вызывает, что может быть связано с различными механизмами нейтрализации свободных вирусов по сравнению с Fc-гамма-рецепторинтернализированных вирусов. Напротив, перекрестно-реактивное ZKA78, которое только частично нейтрализует инфекционность ZIKV, эффективно усиливает ZIKV-инфекцию клеток K562. Эти результаты показывают, что перекрестно-реактивные антитела, вызванные инфекцией ZIKV или DENV, могут опосредовать гетерологичное антителозависимое усиление (ADE).

Ввиду этого было исследовано, может ли ADE также индуцироваться иммунной сывороткой и может ли оно блокироваться нейтрализующими антителами, такими как вариант LALA. Чтобы получить вариант LALA, каждую из тяжелых цепей мутируют в аминокислотах 4 и 5 домена CH2 путем замены аланином природного лейцина, используя сайт-направленный мутагенез. Выше было описано, что варианты LALA (антител IgG1 человека) не связываются с Fc-гамма-рецепторами и комплементом.

Для изучения эффекта антитела ZKA64-LALA в ZIKV ADE, применяют анализ ингибирования ADE. Поскольку ADE вируса ZIKV наблюдают при использовании ZIKV- или DENV-иммунной плазмы, ZIKV (MOI 0,175) смешивают с плазмой от первичных ZIKV- или DENV-инфицированных доноров в течение 30 мин при 37°C . Антитело ZKA64-LALA добавляют в концентрации 50 мкг/мл, смешивают с 5000 клеток К562/лунку и инкубируют в течение трех дней. Затем клетки окрашивают 4G2 и анализируют жидкостной цитометрией.

Результаты представлены на фиг. 7. В гомологичном окружении четыре образца ZIKV-иммунной плазмы, взятые у выздоравливающих пациентов, и одна DENV-иммунная плазма показывают сходную способность усиливать ZIKV-инфицирование клеток K562 (фиг. 7, верхняя панель), и этот эффект ADE полностью блокирует EDIII-специфическое ZKA64-LALA антитело (фиг. 7, нижняя панель).

Следует отметить, что ADE-эффект ZIKV- и DENV-иммунной плазмы полностью блокирует EDIIIспецифическое антитело ZKA64-LALA. Способность ADE блокировать единственное EDIIIспецифическое антитело LALA может быть связано не только с его способностью превосходить антитела, усиливающие сыворотку, но также и нейтрализовать вирус после интернализации в эндосомы.

Эти результаты показывают, что сильнодействующие нейтрализующие антитела, например, ZKA190, ZKA230, ZKA185 или ZKA64, разработанные в форме LALA, обладают сильным потенциалом для использования в профилактических или терапевтических условиях для предотвращения врожденной инфекции ZIKV, например, у беременных женщин и/или у людей, живущих в зонах повышенного риска. Использование формы LALA позволяет избежать риска развития ADE ZIKV и, как показано выше, может также блокировать ADE уже существующих перекрестно-реактивных антител, например, у пациентов, уже имеющих иммунитет к DENV.

Пример 5. ZKA190 нейтрализует ZIKV сильнее, чем антитело известного антитело из предшествующего уровня техники EDE1 mAb C8.

Для сравнения выделенных нейтрализующих антител с высоко нейтрализующими анти-ZIKVантителами предшествующего уровня техники эффективность нейтрализации ZKA190 сравнивают с показателями высоко нейтрализующего mAb EDE1 C8 предшествующего уровня техники (Barba-Spaeth G. с соавт., Nature, 536 (7614), 2016, 48-53). Нейтрализацию обоих антител тестируют на панели из четырех различных штаммов (H/PF/2013; MR766, MRS-OPY и PV10552).

Вкратце, нейтрализацию инфекции ZIKV с помощью mAb измеряют, используя анализ микронейтрализации на основе жидкостной цитометрии. Различные разведения mAb смешивают с ZIKV (MOI

- 59 043940

0,35), инкубируют в течение 1 ч при 37° и добавляют к 5000 клеток Vero/лунку в 96-луночных планшетах с плоским дном. Через четыре дня для ZIKV клетки фиксируют 2% формальдегидом, насыщают в ФСБ, содержащем 1% фетальной сыворотки теленка (фирма Hyclone) и 0,5% сапонина, и окрашивают мышиным mAb 4G2. Клетки инкубируют с козьим антителом против IgG мыши (goat anti-mouse IgG), конъюгированным с Alexa Fluor488 (фирма Jackson Immuno-Research, номер в каталоге 115485164), и анализируют жидкостной цитометрией. Титр нейтрализации (50% ингибирующую концентрацию [IC₅₀]) выражают как концентрацию антител, которая снижает инфекцию на 50% по сравнению с контрольными лунками, в которые вносят только вирус.

Результаты представлены на фиг. 10. ZKA190 mAb сильно нейтрализуют африканские, азиатские и американские штаммы с величиной IC₅₀, в диапазоне от 0,6 до 8 нг/мл. Для сравнения, известное в предшествующем уровне техники антитело C8 примерно в 24 раза менее активно.

Пример 6. Дополнительное описание антитела ZKA190.

Активность антитела ZKA190 дополнительно исследуют in vitro и in vivo. С этой целью mAb синтезировали в формате IgG1 дикого типа (wt) и в формате IgG1 Fc-LALA. Вкратце, последовательности VH и VL клонируют в векторы человека для экспрессии Igy1, IgK и Igλ, (любезно предоставлены Michel Nussenzweig, Университет Рокфеллера, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США), по существу, в соответствии с публикацией (Tiller T. с соавт., J Immunol Methods, 329, 2008, 112-124). Рекомбинантные mAb получают путем временной трансфекции клеток EXPI293 (фирма Invitrogen), очищают с помощью хроматографии на белке А (фирма GE Healthcare) и обессоливают против ФСБ. Чтобы получить вариант LALA, каждую из тяжелых цепей мутируют в аминокислотах 4 и 5 домена CH2 путем замены аланином природного лейцина с использованием сайт-направленного мутагенеза. Как описано выше, варианты LALA (антител IgG1 человека) не связываются с Fc-гамма-рецепторами и комплементом.

Как показано на фиг. 10А и описано в примере 5, ZKA190 тестируют на панели из четырех штаммов ZIKV. ЗКА190 mAb мощно нейтрализуют африканские, азиатские и американские штаммы с IC50 в диапазоне от 0,004 до 0,05 нМ (фиг. 10А; 0,6-8 нг/мл).

Поскольку было показано, что ZIKV инфицирует нейрональные клетки-предшественники у человека (human neural progenitor cell - hNPC), что приводит к повышенной токсичности клеток, нарушению регуляции клеточного цикла и снижению роста клеток, ZKA190 и ZKA190-LALA тестируют на hNPC. С этой целью взрослые мужские фибробласты, полученные из Movement Disorders Bio-Bank (Отделение нейрогенетики Неврологического института Carlo Besta, Милан), перепрограммируют с использованием набора CytoTune-iPS 2.0 Sendai (фирма Life Technologies). Клетки hiPSC поддерживают в условиях без фидера в mTeSR1 (фирма Stem Cell Technologies). Для создания эмбриоидных телец (EB) диссоциированные hiPSC высевают в планшеты с низкой адгезией в mTeSR1 с добавлением N2 (0,5x) (фирма ThermoFisher Scientific), Noggin человека (0,5 мг/мл, фирма R & D System), SB431542 (5 мкМ, фирма Sigma), Y27632 (10 мкМ, фирма Miltenyi Biotec) и пенициллин/стрептомицин (1%, фирма Sigma) (согласно описанию Marchetto M.C.N. с соавт., Cell, 143, 2010, 527-539). Для получения розеток EB высевают через 10 дней на покрытые матригелем чашки (1: 100, фактор роста матригеля уменьшен, фирма Corning) в DMEM/F12 (фирма Sigma) с N2 (1: 100), не являющимися незаменимыми аминокислотами (1%, фирма ThermoFisher Scientific) и смесью пенициллин/стрептомицин. Через 10 дней клетки пассируют с Accutase (фирма Sigma) и высевают в колбы с матригелем в среду NPC, содержащую DMEM/F12, N2 (0,25%), B27 (0,5%, фирма ThermoFisher Scientific), пенициллин/стрептомицин и FGF2 (20 нг/мл, фирма ThermoFisher Scientific). hNPC (3х10⁴) высевают на покровные стекла в 24-луночные планшеты за 3 дня до заражения штаммом PRVABC59. Исходный материал вируса инкубируют с mAb за 1 ч до добавления к hNPC для получения MOI 0,5. После 4 ч адсорбции вируса культуральный супернатант удаляют и повторно добавляют свежую среду, содержащую mAb. Супернатант собирают через 96 ч после заражения для измерения титров вируса с помощью анализа бляшек на клетках Vero. Клетки фиксируют в 4% растворе параформальдегида (PFA, фирма Sigma) в фосфатно-солевом буфере (ФСБ, фирма Euroclone) в течение 30 мин для непрямой иммунофлюоресценции. Фиксированные клетки насыщают в течение 30 мин в блокирующем растворе, содержащем 0,2% Triton X-100 (фирма Sigma) и 10% сыворотки осла (фирма Sigma), и инкубируют в течение ночи при 4° с первичными антителами в блокирующем растворе. Следующее антитело используют для обнаружения анти-оболочки (1: 200, фирма Millipore, MAB10216). Затем клетки промывают ФСБ и инкубируют в течение 1 ч с вторичными антителами Hoechst и против Alexa Fluor-488 мыши (anti-mouse Alexa Fluor-488) (1:1000 в блокирующем растворе, фирма ThermoFisher Scientific). После промывки ФСБ клетки снова промывают и подвергают мониторингу. Результаты показаны на фиг. 11А. Оба антитела, и ZKA190, и ZKA190-LALA, полностью устраняют инфекцию и подавляют репликацию ZIKV в hNPC.

Затем способность ZKA190 и ZKA190-LALA вызывать ADE тестируют на линии клеток K562, что описано в Примере 4. Вкратце, ADE измеряют анализом на основе потока с использованием клеток K562. Вкратце, ZKA190, ZKA190 и ZIKV H/PF/2013 (MOI 0,175) смешивают в течение 1 ч при 37° и добавляют к 5000 клеток К562/лунку. Через четыре дня клетки фиксируют, насыщают и окрашивают mAb m4G2. Количество инфицированных клеток определяют проточной цитометрией. Для ZKA190-LALA,

- 60 043940

ZIKV (MOI 0,175) смешивают с плазмой от первичных ZIKV-инфицированных доноров в течение 30 мин при 37°C. ZKA190-LALA добавляют в концентрации 50 мкг/мл, смешивают с 5000 клеток К562/лунку и инкубируют в течение трех дней. Затем клетки окрашивают 4G2 и анализируют проточной цитометрией. Результаты показаны на фиг. 11Б. ZKA190 поддерживает ADE от 0,0001 до 1 нМ; как и ожидалось, ZKA190-LALA не проявляет активности ADE. Была также протестирована способность ZKA190-LALA ингибировать ADE, индуцированную плазмой от четырех ZIKV-иммунных доноров в клетках K562. Результаты показаны на фиг. 11В. Было обнаружено, что ZKA190-LALA полностью ингибирует ADE, индуцированную антителами плазмы (фиг. 11В).

Антитела против prM (anti-prM) образуют часть преобладающих антител, вызываемых во время иммунного ответа человека против флавивирусов, и, как было показано, усиливают вирусную инфекцию in vitro (Dejnirattisai W. с соавт., 2010). Перекрестно реагирующие антитела усиливают вирусную инфекцию денге у людей (Science 328, 745-748). Клетки K562 предварительно инкубируют с серийными разведениями prM перекрестно-реактивного антитела DV62 (Beltramello M. с соавт., Cell Host Microbe 8, 2010, 271-283), полученного от иммунного донора DENV. Результаты показаны на фиг. 11Д. DV62 перекрестно реагирует с белком prM ZIKV и вызывает ADE в широком диапазоне концентраций (фиг. 11Г). ZKA190-LALA может полностью блокировать анти-prM DV62 mAb-индуцированную ADE незрелых или частично незрелых частиц ZIKV (фиг. 11Г).

В итоге, была протестирована способность различных концентраций FAB ZKA190, ZKA190-LALA и ZKA190 вызывать или блокировать ADE ZIKV в присутствии повышающих концентраций человеческой плазмы против DENV2 или DV62. Результаты показаны на рисунке 11Е. ZKA190 в низких концентрациях увеличивает prM DV62-опосредованную ADE инфекции ZIKV, что согласуется с его способностью стимулировать проникновение как незрелых, так и зрелых вирионов, в то время как при концентрациях выше 1,3 нМ (т.е. 200 нг/мл) ZKA190 блокирует ADE, индуцированную как плазмой DENV, так и mAb DV62. ZKA190-LALA, а также его Fab фрагмент снижает ADE в концентрациях выше 0,06 нМ, что указывает на ингибирование в обоих случаях вирусной инфекции на стадии после прикрепления, например, стадии слияния.

Пример 7. ZKA190 связывается с консервативной и высокоактивной областью EDIII.

Для определения эпитопа ZKA190 на остаточном уровне используют разрешающую ЯМРспектроскопию, описанную в публикациях Bardelli M. с соавт., J. Mol. Recognit. 28, 2015, 393-400; Simonelli L. С соавт., J Mol Biol 396, 2010, 1491-1507; Simonelli L. с соавт, PLoS ONE 8, 2013, e55561.

Вкратце, спектры записывают на ЯМР-спектрометре Bruker Avance 700 МГц при 300 К. Для отведения резонансов в магистрали используют эксперименты с тройным резонансом (HNCO, HN(CA)CO, HN(CO)CABC, HNCACB, в то время как боковые цепи аннотируют с использованием экспериментов HCCH-TOCSY и HBHA(CO)NH. Все эксперименты ЯМР обрабатывают с использованием Topspin 2.1 (фирма Bruker Biospin) и анализируют с помощью CARA. Перекрестные пики NOESY автоматически назначают с помощью макроса CYANA noeassign на основе проводимых вручную химических сдвигов. Ограничения на расстояниях используют для расчета структуры в CYANA с использованием стандартного протокола имитированного отжига, получают из спектров NOESY с разрешением 70 мс при ¹⁵N и ¹³C. Динамику магистрали ZIKV ED III получают из измерений релаксации ¹⁵N, записанных на спектрометрах 600 и 700 МГц. Протон-детектированные версии CPMG (R2), инверсии-восстановления (R1) и используют ¹⁵N{1H}-устойчивого NOE. Настройки задержки для серий Т2 находятся в диапазоне от 0 до 0,25 с и для серии Т1 от 0,02 до 2 с. В эксперименте ¹⁵N{1H}-NOE используюи задержка релаксации 5 с. Скорости релаксации R1 и R2 производны от подгонки методом наименьших квадратов соответствующих экспоненциальных функций применительно к полученным данным с использованием заранее написанных сценариев. Данные релаксации анализируют безмодельным подходом с использованием программного пакета DYNAMICS. Программу ROTDIF используют для расчета общего времени корреляции по данным релаксации (8,5 нс). Картирование эпитопов ЯМР проводят согласно описанию (Bardelli с соавт., 2015; Simonelli с соавт., 2010; 2013). Вкратце, наложение спектров 15NHSQC меченого EDIII, свободного или связанного с Fab ZKA190, позволило идентифицировать остатки EDIII, сигнал ЯМР от которых изменялся при образовании комплекса, указывая на то, что на них влияло связывание ZKA190. Изменения были выявлены путем ручной проверки и с помощью возмущения химического сдвига (CSP), CSP=((Δδн)²+(Δδ_N/10)²)^1/2. Образцы ЯМР обычно представляют 800 мкМ EDIII-меченого [¹⁵N, ¹³C] в 20 мМ фосфате натрия, 50 мМ NaCl, pH 6,0. Пердейтерированные (номинально 70%) образцы ²H, ¹⁵N EDIII используют для картирования ЯМР-эпитопа с соотношением EDIII:ZKA190 Fab 1: 1,1; концентрация EDIII обычно составляет 0,4 мМ.

Поскольку сигнал ЯМР сильно зависит от локальной химической среды, изменения при образовании комплекса выявляют остатки антигена, на которые влияет связывание антител, либо непосредственно, либо через аллостерические эффекты. Сравнивая спектры ЯМР свободного и связанного EDIII (фиг. 12А), остатки, затронутые ZKA190, были сопоставляют с LR EDIII, в частности с петлями BC, DE и FG, а также с частью петли EDI-EDIII (фиг. 13А). Эти остатки почти идентичны среди 217 известных штаммов ZIKV, за исключением замен по положениям V341I и E393D в изоляте Uganda 1947 (фиг. 12Г). Эти мутации также присутствуют в штамме MR766, который был эффективно нейтрализован ZKA190 (фиг.

- 61 043940

10А). Анализ эпитопа ZKA190 на несложной структуре ZIKV показывает, что эпитоп является высоко доступным, за исключением петли FG в 5-кратной вершине (фиг. 13Б и 12В, молекула A).

Рассчитанный докинг с последующим моделированием молекулярной динамики при направлении и подтверждении полученной от ЯМР информации об эпитопах, а также мутагенез EDIII, показывают, что ZKA190 связывается через область контакта, характеризующийся формой и комплементарностью заряда (фиг. 13Б и 12Д). Докинг указывает на отсутствие прямых контактов между ZKA190 и петлей FG на EDIII, подтверждая, что изменения в ЯМР сигналах при связывании антител происходят из-за аллостерических эффектов. Это мнение подтверждается тем фактом, что мутации остатков петли FG в рекомбинантном EDIII, но не в других эпитопных областях, не влияют на аффинность связывания ZKA190 для EDIII (фиг. 13Б и 14).

Пример 8. Механизмы нейтрализации ZKA190.

Способность ZKA190 эффективно нейтрализовать вирус может включать ингибирование, прикрепление клеток, либо слияния мембран. Еще один механизм может включать инактивацию вируса путем перекрестного сшивания вирусных частиц.

Fab ZKA190 может нейтрализовать ZIKV, хотя и менее эффективно, чем соответствующий IgG. Связываясь с линкером EDI-EDIII, ZKA190 (как Fab, так и IgG) может ингибировать поворот DIII на ~70 градусов, необходимый для слияния вируса с мембраной клетки-хозяина (Bressanelli S. с соавт., Embo J 23, 2004, 728-738; Modis Y. с соавт., Nature 427, 2004, 313-319). В другом варианте, ZKA190 может предотвращать прикрепление ZIKV к клеткам-мишеням.

Способность ZKA190 ингибировать слияние мембран подтверждают анализом конфокальной микроскопии. Для этого клетки Vero высевают в количестве 7500 клеток/лунку на покровные стекла диаметром 12 мм в 24-луночные планшеты и инкубируют в течение ночи. Клетки инфицируют ZIKV H/PF/2013 (MOI 100) в присутствии или в отсутствие нейтрализующих концентраций mAb, конъюгированных с Alexa-488 (0,7 мкМ), при 37°C в течение 3 ч, промывают ФСБ и фиксируют 2% параформальдегид в ФСБ в течение 30 мин при комнатной температуре. Эндосому с кислой средой идентифицируют с помощью красителя Lysotracker red (фирма Invitrogen) путем добавления красителя (50 нМ) к клеткам в течение последних 30 мин инкубации перед фиксацией. За фиксацией следуют обильные промывания в ФСБ и 50 мМ глицине и, наконец, покровные стекла оказываются подготовленными для микроскопического анализа с использованием постоянно монтируемой среды Vectashield для флуоресценции с DAPI (фирма Vector Laboratories). Образцы анализируют с помощью конфокальной микроскопии с использованием микроскопа Leica TCS SP5 с объективом 63 х/1,4 H.A. Анализ и обработку изображений проводят с помощью программного обеспечения FIJI.

Результаты представлены на фиг. 15. Анализ конфокальной микроскопии показывает, что ZKA190 (Fab или IgG) может проникать в клетки Vero только в комплексе с ZIKV, при нейтрализующих концентрациях, превышающих IC₅₀ в 10000 раз (фиг. 15).

Пример 9. Описание in vivo EDIII-специфического mAb ZKA190.

ZKA190 и ZKA190-LALA тестируют на мышах A129, зараженных смертельной дозой штамма ZIKV MP1751 (африканское происхождение), для оценки их профилактических и терапевтических свойств.

Для проверки их профилактической активности ZKA190 и ZKA190-LALA вводят за один день до заражения вирусом.

Самкам мышей A129 (IFN-альфа/бета-рецептор -/-) и мышам 129Sv/Ev дикого типа в возрасте 5-8 недель вводят mAb (ZKA190, ZKA190-LALA и контрольное антитело MPE8 (Corti D.C соавт., Nature 501, 2013, 439-443), разведенные в ФСБ в различных дозах внутрибрюшинным путем в объеме 500 мкл. Моноклональные антитела (mAb) вводят за 1 день до, или через 1, 2, 3 или 4 дня после заражения вирусом. Животных заражают подкожно 10² БОЕ ZIKV (штамм MP1751) и наблюдают в течение 14 дней. Вес и температуру контролируют ежедневно, а клинические наблюдения регистрируют по меньшей мере два раза в день. Через 5 после заражения 50 мкл крови берут у каждого животного в пробирки RNAprotect фирма (Qiagen, Великобритания) и замораживают при -80°C. В конце исследования (14 дней после заражения) или когда животные достигают гуманных конечных точек, проводят вскрытия и берут образцы крови, срезы мозга, селезенки, печени, почек и яичников для вирусологического анализа.

Образцы ткани от мышей A129 взвешивали и гомогенизировали в ФСБ, используя керамические шарики и автоматический гомогенизатор (фирма Precellys, Великобритания), используя шесть 5секундных циклов при 6500 об/мин с 30-секундным промежутком. Двести мкл гомогената ткани или раствора крови переносят в 600 мкл буфера RLT (фирма Qiagen, Великобритания) для экстракции РНК с использованием набора для экстракции RNeasy Mini (фирма Qiagen, Великобритания); образцы пропускают через гомогенизатор QIAshredder (Qiagen, Великобритания) в качестве начального этапа. Для выявления вирусной РНК у подопытных животных используют специфичный для ZIKV анализ ПЦР реального времени (RT-PCR).

Последовательности праймеров и зондов были взяты и адаптированы из работы (Quick с соавт., Nat Protoc, 12, 2017, 1261-1276) с оптимизацией и валидацией для обеспечения оптимального мастермикса и циклических условий. RT-PCR проводят с использованием одностадийного набора qRT-ПЦР Superscript

- 62 043940

III Platinum (фирма Life Technologies, Великобритания). Конечный мастермикс (15 мкл) состоит из 10 мкл 2x реакционной смеси, 1,2 мкл воды для ПЦР, 0,2 мкл 50 мМ MgSO₄, 1 мкл каждого праймера (ZIKV 1086 и ZIKV 1162с, оба при рабочей концентрации 18 мкМ) 0,8 мкл зонда (ZIKV 1107-FAM при 25 мкМ рабочей концентрации) и 0,8 мкл ферментной смеси SSIII. Пять мкл матричной РНК добавляют в мастермикс, получая конечный реакционный объем 20 мкл. Используемые условия проведения циклических реакций: 50° в течение 10 мин, 95° в течение 2 мин, затем 45 циклов при 95° в течение 10 с и 60° в течение 40 с, плюс конечная стадия охлаждения 40° в течение 30 с. Количественный анализ с использованием флуоресценции проводят в конце каждой стадии 60°. Реакции проводят и анализируют на платформе 7500 Fast (фирма Life Technologies, Великобритания) с использованием программного обеспечения 7500 версии 2.0.6. Количественное определение вирусной нагрузки в образцах проводят с использованием серийных разведений олигонуклеотида РНК с установленной концентрацией (фирма Integrated DNA Technologies). Олигонуклеотид, содержащий 77 оснований РНК ZIKV, на которые нацелен анализ, основан на информации GenBank AY632535.2, и был синтезирован в количестве 250 нмоль с очисткой ВЭЖХ.

Результаты представлены на фиг. 16, 17 и 18. Было показано, что ZKA190 и ZKA190-LALA защищают мышей от смерти и заболеваемости в концентрациях 5, 1 или 0,2 мг/кг (фиг. 16А, Б). ZKA190LALA и, в меньшей степени, ZKA190, замедляют заболеваемость и смертность по сравнению с контрольной группой при 0,04 мг/кг. Титры вируса в крови и органах были значительно снижены по сравнению с контрольными животными, которых лечили антителами, еще при наличии уровней сывороточных антител ниже 1 мкг/мл (фиг. 17А-Г).

Чтобы оценить терапевтический потенциал ZKA190, в настоящем исследовании вводят ZKA190 и ZKA190-LALA в разные моменты времени после инфицирования ZIKV. При дозе 15 мг/кг выживаемость достигает 80-100%, а заболеваемость значительно снижается, когда лечение проводят через четыре дня после заражения (фиг. 16А, Б). Лечение ZKA190 и ZKA190-LALA во все моменты времени после заражения приводит к значительному снижению титров вируса по сравнению с животными, получавшими контрольное антитело, с явной тенденцией к большему снижению при более раннем начале лечения (фиг. 18А-16В). Следует отметить, что ZKA190-LALA проявляет существенно заниженную противовирусную активность в образце крови на 5-й день по сравнению с ZKA190, когда mAb давали через четыре дня после заражения, что может быть связано с нарушением способности варианта LALA способствовать быстрому клиренсу из вирионов с покрытием.

Из 16 обработанных мышей был выделен один антитело-избегающий мутант in vivo (устойчивый к моноклональным антителам мутант 1; Monoclonal Antibody Resistant Mutant 1 - MARM1), содержащий аминокислотную замену в DIII (T335R, в центре эпитопа), тогда как вирусы от других обработанных мышей не обладают какими-либо E-мутациями. Интродукция мутации T335R в рекомбинантный DIII показало, что он отменяет связывание ZKA190, что было определено с помощью SPR (фиг. 14; см. экспериментальные методы примера 7).

Пример 10. Отбор in vivo ускользающих мутантов ZIKV.

Использование антитело-терапевтических средств может привести к отбору антитело-избегающих мутантов. Чтобы оценить способность ZKA190 отбирать устойчивые мутанты (MARM) in vitro, ZIKV (H/ PF/2013) пассируют в присутствии суб-нейтрализующих концентраций ZKA190.

Вкратце, две тысячи TCID50 H/PF/2013 ZIKV в 500 мкл инкубируют с 250 мкл, содержащими различные концентрации mAb (8 различных концентраций, начиная с конечной концентрации 200 мкг/мл и выполняя серийные разведения 1:4). Смесь инкубируют в течение 45 мин при 37°, после чего добавляют 250 мкл суспензии клеток Vero (3,2x106 клеток) и инкубируют в 24-луночном планшете в течение трехчетырех дней при 37°, чтобы обеспечить размножение вируса. После каждого этапа отбора берут 500 мкл супернатантов из трех вариантов: самая низкая концентрация mAb, при которой наблюдают полная защита монослоя, одна концентрация, при которой наблюдают частичный эффект CPE на клеточный монослой, и одна концентрация, при которой 100% клеточного монослоя было разрушено ZIKV CPE. Пробирку центрифугируют в течение 5 мин при 1000xg, отбирают аликвоту и хранят при -80°. Половину объема снова предварительно смешивают с различными концентрациями mAb, чтобы повторить процесс отбора и размножения. Оставшийся супернатант используют для анализов микро-нейтрализации и последующего секвенирования вируса.

Для идентификации антитело-избегающих мутантов отобранного вируса MARM проводят экстракцию геномной РНК с последующей одностадийной ПЦР для амплификации и секвенирования ампликона E белка ZIKV. Супернатант клеток (140 мкл) в результате селекции MARM используют для экстракции РНК с помощью мини-набора QIAamp Viral RNA (фирма Qiagen). Синтез кДНК и амплификацию ПЦР проводили вместе, используя Superscript III One-Step RT-PCR с платиновой меткой (Platinium Taq, фирма Invitrogen). Для одной реакции используют 25 мкл реакционной смеси, 8 мкл стерильной воды, 2 мМ каждого праймера, 1 мкл РНКазы (фирма Life Technologies), 2 мкл Superscript III RT/Platinum TaqMix и 12 мкл РНК, что в итоге составляет конечный объем реакции 50 мкл. Для N-концевой части E белка пара праймеров Zika-E-F1 5'-TGCAAACGCGGTCGCAAACCTGGTTG-3' (SEQ ID NO: 266) и ZIKV-E-R1 5'

- 63 043940

CGTGCCAAGGTAATGGAATGTCGTG-3' (SEQ ID NO: 267) и для C-концевой части пары праймеров ZIKV-Ef1530 5'-AGCCTAGGACTTGATTGTGAACCGA-3' (SEQ ID NO: 268) и ZIKV-E-R2769 5'TTACAGATCCCACAACGACCGTCAG-3' (SEQ ID NO: 269) используют. Условия циклирования: 54° в течение 40 мин, 94° в течение 2 мин, затем 45 циклов при 94° в течение 45 с, 50° в течение 45 с и 68° в течение 1,5 мин с конечной стадией элонгации при 68° в течение 5 мин и заключительный этап охлаждения при 4°. Продукты ПЦР анализируют и экстрагируют из 1,5% агарозного геля и дополнительно очищают с помощью набора для очистки ДНК и гелевой полосы GFX (фирма GE Healthcare). Для реакции секвенирования 8 мкл очищенного продукта ПЦР смешивают с 2 мкМ праймера в конечном объеме 10 мкл и отправляют для секвенирования (фирма Microsynth). E белка N-концевые продукты секвенируют с ZIKV-E-F2 5'-ACTTGGTCATGATACTGCTGATTGC-3' (SEQ ID NO: 270) и ZIKV-E-R2 5'TCGGTTCACAATCAAGTCCTAGGCT-3' (SEQ ID NO: 271), C-концевые PCR с ZIKV-E-f2058 5'GCTAACCCCGTAATCACTGAAAGCA-3' (SEQ ID NO: 272) и ZIKV-E-r2248 5'AAGACTGCCATTCTCTTGGCACCTC-3' (SEQ ID NO: 273). Последовательности собирают и анализируют с помощью программного обеспечения CLC Main Workbench (фирма CLC Bio, версия 5).

Устойчивый мутант MARM2 был выделен после трех раундов отбора, и его E белок проявил мутацию E370K в DHL Мутация отменяет нейтрализацию с помощью ZKA190, хотя антитело может связываться с мутантным DIII (фиг. 14). Мутации в MARMS in vivo (T335R) и in vitro (E370K) расположены на BC и DE петлях DIII, соответственно, и согласуются с эпитопом, идентифицированным ЯМР.

Пример 11. Разработка биспецифических антител по настоящему изобретению.

Вирусные антитело-избегающие мутанты могут значительно снизить эффективность терапевтических антител. Чтобы преодолеть эту проблему, авторы настоящего изобретения выдвинули гипотезу, что вероятность выхода вируса будет значительно уменьшена при объединении двух высоко нейтрализующих антител. В связи с этим был получен ряд биспецифических антител, сочетающих ZKA190 с другими мощно нейтрализующими mAb, направленными на разные сайты на E белке. Таким образом, задача была сфокусирован на двух mAb, ZKA185 и ZKA230, которые являются высоко нейтрализующими и не конкурируют с ZKA190.

Во-первых, их способность к перекрестной нейтрализации четырех штаммов ZIKV была проанализирована, согласно описанному выше. ZKA185 и, в меньшей степени, ZKA230, сильно нейтрализуют африканские, азиатские и американские штаммы с IC50 в диапазоне от 0,02 до 0,62 нМ (фиг. 19А). ZKA185 связывается с высокой аффинностью с рекомбинантным белком ZIKV E и с вирусоподобными частицами Zika (VLP), но не с выделенным DIII (фиг. 19Б). Наоборот, ZKA230 связывается с VLP ZIKV, но не с рекомбинантным E или DIII, отсюда предположение, что оно распознает четвертичный эпитоп, отображаемый только на вирусной поверхности (фиг. 19Б). Было показано с помощью ELISA, что IgKA и Fab ZKA185 связываются с антигенами E и VLP с аналогичным высоким сродством.

Чтобы идентифицировать эпитопы ZKA185 и ZKA230, а также их склонность к образованию антитело-избегающих мутантов, MARM против ZKA185 (MARM3) и ZKA230 (MARM4) выделяют пассированием вируса в присутствии суб-нейтрализующих концентраций антител, как описано выше. MARM3 содержит замещения в K84E и D67H, которые оба расположены в DII (фиг. 19Г). MARM4 показал смесь различных аминокислотных замен в положении 84 (K на G, E или R), подтвержденную в экспериментах с множественным секвенированием. Кроме того, MARM с 1 по 4 были протестированы против ZKA190, ZKA185 и ZKA230. ZKA190 нейтрализует MARM ZKA185 и ZKA230, а также родительский вирус (фиг. 19В). ZKA185 нейтрализует как ZKA190, так и ZKA230 MARM. ZKA230 нейтрализует только ZKA190 MARM2 и не нейтрализует ни ZKA190 MARM1, ни ZKA185 MARM3.

Чтобы получить представление о разработке MARM, способных к выходу из-под давления нескольких антител, ZKA190 MARM2 (E370K) серийно пассировали в присутствии ZKA185 или ZK230. Таким образом, было обнаружено, что двойные MARM возникают после 3-4 пассажей. ZKA230 содержит дополнительную мутацию K84E, в то время как ZKA185 выбран для мутации D76G. Эти данные указывают на то, что ZIKV может избежать нейтрализации несколькими антителами, нацеленными на разные сайты, когда отбор проводится поэтапно, и подтвердили высокую пластичность E белка ZIKV.

Таким образом, ZKA185 было выбрано для использования вместе с ZKA190 для разработки биспецифического антитела, поскольку он сильно перекрестно нейтрализует штаммы ZIKV, связывается с альтернативным сайтом и не конкурирует с ZKA190. Биспецифическое антитело было получено в четырехвалентном симметричном формате, называемом Fabs-in-tandem-Ig (FIT-Ig). FIT-Ig подробно описаны, например, в WO 2015/103072 A1 и в работе Gong S. с соавт., MAbs 2017.

FIT-Ig может быть получен с использованием трех полипептидов. Полипептид 1 обычно содержит легкую цепь внешнего Fab, слитого, без линкеров, с N-концевой областью внутренней тяжелой цепи Fab. Полипептид 2 обычно содержит вариабельные области тяжелой цепи и области CH1 внешнего Fab, а полипептид 3 обычно содержит легкую цепь внутреннего Fab. Соответственно, антитело формата FIT-Ig обычно содержит внутренний Fab и внешний Fab. Два типа FIT-Ig были получены с Fab ZKA190 либо во внешнем, либо во внутреннем положении. Вкратце, три гена, кодирующих FIT-Ig, были оптимизированы по кодонам, синтезированы фирмой Genscript и клонированы следующим образом: i) VL внешнего Fab, за которым следует полная константная область (лямбда или каппа), сливают с VH из внутренне- 64 043940 го и клонируют в вектор экспрессии Igy1 (модифицированный для кодирования мутации LALA). Полученный полипептид 1 образован VL и CL внешнего Fab, VH внутреннего Fab слит с доменами IgG1 CH1шарнир-CH2-CH3; ii) ген VH внешнего Fab (кодирующий полипептид 2, образованный VH и CH1 внешнего Fab) клонируют в вектор экспрессии Fab (вектор экспрессии Igy1, в который введен стоп-кодон после кодона, кодирующего цистеин CH1) остаток 220); iii) ген VL внутреннего Fab клонируют в векторы экспрессии IgK или Igλ (кодирующие полипептид 3, образованный VL и CL внутреннего Fab). Рекомбинантные mAb FIT-Ig получают путем временной трансфекции клеток EXPI293 (фирма Invitrogen) с использованием мольного соотношения 1:3:3 трех конструкций, описанных выше (как описано в WO 2015/103072 A1), очищенных хроматографией на белке A (GE Healthcare) и обессоленные против ФСБ. Белки анализируют с помощью SDS-PAGE в восстановленных и невосстановленных условиях, а их концентрации определяют с помощью BCA (фирма Pierce, Rockford, США). В невосстановленных условиях FIT-Ig движется как одна большая полоса массой приблизительно 250 кДа. В восстанавливающих условиях каждый из белков FIT-Ig дает две полосы, одна с большей молекулярной массой полоса представляет собой полипептид 1 приблизительно из 75 кДа, а вторая, с меньшей массой, соответствует обоим полипептидам 2 и 3, перекрывающимся приблизительно при 25 кДа. Для дальнейшего изучения физических свойств FIT-Ig в растворе для анализа каждого белка используют эксклюзионную хроматографию (size exclusion chromatography - SEC). Очищенный FIT-Ig в ФСБ наносили на колонку Superdex 200 Increase 5/150 GL. Все белки определяли с использованием УФ-детекции при 280 и 214 нм. Белки FIT-Ig демонстрируют один основной пик, свидетельствуя о физической гомогенности в виде мономерных белков.

Пример 12. Описание in vitro антитела по настоящему изобретению (FIT-1).

Биспецифическое антитело FIT-Ig (в настоящем изобретении обозначаемое как FIT-1) с ZKA190 во внешнем и ZKA185 во внутренних положениях Fab (фиг. 19Д) было отобрано и дополнительно охарактеризовано. ELISA показывает, что FIT-1 связывает DIII, E и VLP (фиг. 19Е). FIT-1 сохраняет высокую нейтрализующую активность в отношении штаммов ZIKV, причем значения IC50 в значительной степени сходны со значениями родительских антител ZKA190 и ZKA185 (фиг. 19Ж). FIT-1 был получен с использованием основного антитела IgG1 в формате LALA, таким образом исключая любую возможность вызывать ADE. Некоторые данные свидетельствуют о том, что оба фрагмента ZKA190 и ZKA185 в формате FIT-1 являются активными. Во-первых, FIT-1 связывается с E белком с более высокой аффинностью, чем у родительских антител ZKA190 и ZKA185 (значения KD: ZKA185 1,8 нМ, ZKA190 9,3 нМ и FIT-1 KD <1 пМ из-за более низкой скорости диссоциации, предположительно благодаря эффектам авидности). Во-вторых, FIT-1 эффективно нейтрализует все MARM ZKA190, ZKA185 и ZKA230 (фиг. 19Н) в отличие от отдельных mAb. Нейтрализующая активность Fab-фрагмента FIT-1 (каждый из которых содержит один ZKA190 и один ZKA185) была снижена только примерно в 6 раз (фиг. 19И, правая панель).

Затем была проверена способность FIT-1 отбирать MARM (описано выше). Тем не менее, несмотря на восемь раундов серийных пассажей, МАРМ не были изолированы. Напротив, MARM появлялись после 3-4 пассажей, когда использовались отдельные mAb. Эти результаты свидетельствуют о том, что использование FIT-1 в качестве терапевтического средства более безопасно, поскольку вероятность одновременных мутаций как в DIII, так и в DII меньше.

Исследования конфокальной микроскопии с использованием клеток Vero также показали, что FIT1, как ZKA190, вероятно, ингибируют вирусную инфекцию на этапе после прикрепления, вероятно, на этапе слияние (фиг. 19К).

Наконец, FIT-1, а также его фрагмент Fab блокируют ADE плазмы человека против DENV2 или DV62 в концентрациях выше 0,1 нМ и 10 нМ, соответственно (фиг. 19К), демонстрируя, что FIT-1 не вызывает ADE и может блокировать ADE моноцитарных клеток путем плохо нейтрализующих перекрестно-реактивных антител.

Пример 13. Терапевтический потенциал FIT-1 in vivo.

Для оценки терапевтического потенциала FIT-1, три разные дозы (15, 5 и 1 мг/кг) вводят в три разные временные точки самкам мышей A129 после инфецирования ZIKV. Вкратце, самок мышей A129 распределяют по 10 разным группам (контрольная и три группы с разными дозировками с тремя разными временными точками введения для каждой дозы). Всех животных заражали подкожно 10² БОЕ ZIKV (штамм MP1751) и наблюдают в течение 14 дней. Мышам из девяти групп лечения биспецифическое антитело FIT-1, разведенное в ФСБ, в дозах 15, 5 или 1 мг/кг вводят внутрибрюшинно в объеме 500 мкл в день 1, день 2 или день 3 после заражения вирусом ZIKV. Вес и температуру всех животных контролируют ежедневно, клинические наблюдения регистрируют, по меньшей мере, два раза в день. На 5 день после заражения отбирают 50 мкл крови от каждого животного в пробирку RNAprotect (фирма Qiagen, Великобритания) и замораживают при -80°C . В конце исследования (через 14 дней после заражения) или когда животные достигают конечных точек человека, проводят вскрытия и собирают кровь, участки мозга и яичника для вирусологического анализа.

Результаты представлены на фиг. 20. Данные показывают, что при дозе 15 мг/кг выживаемость со- 65 043940 ставляет 100% без признаков заболеваемости, когда лечение проводилось через три дня после заражения (фиг. 20А); титры вируса обнуляются, а также не было обнаружено escape мутантов, что указывает на высокую эффективность in vivo. Введение 5 мг/кг приводит к выживаемости 70-100%, также не обнаруживают escape мутантов на 5 день после заражения. Наименьшая испытанная доза (т.е. 1 мг/кг) защищает, если ее вводят в 1 или 2 день, но на день 3 после заражения.

Пример 14. Воздействие FIT-1 на заболевание на модели врожденной инфекции у мышей AG129.

Эффект лечения FIT-1 зараженных беременных самок, отразившийся на мышатах, рожденных от инфицированных и обработанных матерей, был оценен на мышиной модели врожденной инфекции ZIKV, от которых получают живое потомство после врожденного воздействия ZIKV. В этой модели используют мышей AG129 с дефицитом рецепторов IFN, что приводит к репликации вируса в плаценте, передаче вируса плоду и потенциальным долгосрочным последствиям, например, к внутриутробным ограничениям роста и нарушениям слуха.

Проверяют влияние лечения FIT-1 на различные параметры в контексте внутриутробной инфекции. С этой целью мышей заражают ZIKV через 7 дней после полового акта (ДППА) и обрабатывают FIT-1 через 1 или 3 дня после заражения вирусом (см. пример 13). Различные результаты заболевания, такие как титр вируса у плода и плаценты и ограничение внутриутробного роста, оценивают для определения эффекта лечения FIT-1.

Материалы и методы.

Животные. Используют 42 самок мышей AG129. Животных случайным образом распределяют по экспериментальным группам, и каждое животное помечают ушными бирками. Гормональное лечение используют для стимулирования периода течки. Самки были индивидуально помещают вместе с самцами и исследуют на предмет влагалищной пробки через 0,5 дня после полового акта (ДППА).

Вирус. Используют вирус Зика штамм Malaysia (P6-740). Требуемую дозу заражения вводят подкожно в количестве 0,1 мл.

Тест-агент. FIT-1 вводят в дозе 45 мг/кг. Неспецифическое контрольное антитело MPE8-LALA Ctr IgG1 применяют в качестве изотипического контроля в лечении плацебо.

Количественная оценка вируса. Титр вируса в различных тканях определяют количественно методом полимеразной цепной реакции реального времени (RT-PCR). Тотальную РНК экстрагируют из образцов ткани с использованием TRIzol (фирма ThermoFisher Scientific, номер в каталоге 15596018). Объем 2 мкл препарата РНК используют для амплификации. Серийные разведения синтетической РНК, охватывающие область амплификации, используют для получения положительного контроля; неразбавленная синтетическая РНК ZIKV содержит 10^8,0 копий/мкл. Образцы подвергают 40 циклам по 15 с при 95° и 60 с при 60°, после одного начального цикла длительностью 30 мин при 50° и 10 мин при 95°. Образцы неизвестного количества определяют количественно путем экстраполяции значений C (t) с использованием кривой, полученной из серийных разведений синтетической РНК ZIKV.

Построение эксперимента. Беременных самок подвергают заражению через 7 дней после полового акта (ДППА) и обрабатывают FIT-1 через 24 или 72 ч после заражения вирусом. Двух самок из каждой группы вскрывают через 11 дней после заражения вирусом. Плаценту, ткани плода, ткани головного мозга и ткани селезенки собирают для определения титра вируса методом QRT-PCR. По две самки в каждой группе рожают. Регистрируют затылочно-лобный диаметр головы (occipito-frontal diameter - OF) и длину от головы до конца туловища (crown rump length - CRL) цифровым штангенциркулем; внутриутробный рост мышат определяют по формуле: CRLxOF. Вес щенков и самок измеряют в различное время.

Статистический анализ. Данные по выживаемости анализируют методом Wilcoxon log-rank survival analysis (Prism 5, фирма GraphPad Software, Inc).

Результаты и обсуждение.

Лечение FIT-1 оценивают на мышиной модели с врожденной инфекцией и заболеванием, связанным с инфекцией ZIKV. Лечение с помощью FIT-1 является защитным для беременных женщин, причем подавляющее большинство обработанных самок защищают от смерти, независимо от того, когда проводят лечение (фиг. 21). Самки, получавшие неспецифическое отрицательное контрольное антитело, имеют уровень смертности, сходный с тем, который наблюдали в предыдущих исследованиях.

Наблюдают тенденцию к улучшению результатов определения среднего размера мышат. Средний размер мышат от самок, обработанных FIT-1, выше, чем у мышат от самок контрольной группы с обработкой MPE8, и был близок показателям ложно инфицированных животных (фиг. 22). Это различие менее выражено в отношении веса плода, и по этому показателю во всех группах получены близкие средние значения (фиг. 23). Отмечают тенденцию к увеличению веса плаценты у самок, обработанных FIT-1 (фиг. 24).

Титр вируса в разных тканях показан на фиг. 25. Наблюдалось значительное снижение вирусной РНК у плода и плаценты у самок, обработанных FIT-1 (соответственно, фиг. 25А и Б). Снижение было особенно очевидным в тканях плаценты с приблизительно 5-log₁₀ снижением уровней РНК ZIKV. У самок, получавших FIT-1, в материнской селезенке и мозге также значительно понижена вирусная РНК (на несколько log₁₀) по сравнению с самками, получавшими MPE8 (соответственно, фиг. 25В и Г).

Обсуждение.

- 66 043940

В целом, эти данные подтверждают защитную роль FIT-1 в профилактике или лечении заболеваний у плодов, врожденно подверженных воздействию ZIKV. Наблюдают тенденцию к улучшению параметров размера плода и плаценты со значительным снижением титра вируса в различных тканях матери и плода.

Пример 15. Влияние FIT-1 на заболевание на примере модели инфекции семенников у мышей AG129.

Передача половым путем и постоянное заражение мужского репродуктивного тракта были зарегистрированы у мужчин, инфицированных вирусом Зика (D'Ortenzio E. с соавт., N Engl J Med 2016; 374, 2016, 2195-2198). У мышиного мышей AG129 тяжелое заболевание обычно наблюдают примерно через 2 недели после заражения вирусом, включая значительную репликацию вируса в семенниках мышей (Julander J.G. с соавт., Antiviral Res 137, 2016, 14-22). Ключевые сайты репликации вируса в репродуктивном тракте самцов мышей AG129 включают эпидидимис и семенники, а также различные сопутствующие половые железы.

В настоящем исследовании влияние FIT-1 на самцов мышей, инфицированных ZIKV, оценивают на модели инфекции семенников. С этой целью самцов мышей AG129 инфицируют ZIKV и оценивают патологию в мужском репродуктивном тракте после заражения ZIKV и лечения FIT-1.

Материалы и методы.

Животные. Используют самцов мышей AG129. Животных случайным образом распределяют по экспериментальным группам и каждое животное помечают ушными бирками.

Вирус. Используют вирус Зика штамм Puerto Rican (PRVABC-59). Дозу для заражения 10² CCID₅₀ вводят подкожной инъекцией в паховую складку в количестве 0,1 мл. Эта доза заражения обычно летальна у мышей AG129, не прошедших лечения, смерть наступает примерно через 2 недели после заражения.

Тест-агент. FIT-1 вводят в дозе 15 мг/кг. Неспецифическое контрольное антитело MPE8-LALA Ctr IgG1 применяют в качестве изотипического контроля (плацебо) в лечении.

Гистопатология. Ткани собирают и инкубируют в течение 24 ч в нейтральном забуференном формалине. После соответствующей фиксации все собранные ткани обрезают и хранят в 70% этаноле до проведения обычной обработки, заливки в парафин и резки. Все ткани анализирует независимым слепым методом патологоанатом ветеринарной службы и выдает подробный сертификат. Система оценки была разработана для оценки степени тяжести воспаления в репродуктивных путях.

Построение эксперимента. Мышей заражают ZIKV и подвергают мониторингу в течение 28 дней после заражения вирусом на предмет выживания и изменения веса. Лечение 15 мг/кг FIT-1 проводят через 24 или 72 ч после заражения вирусом. Однократное лечение проводят внутрибрюшинным введением 0,1 мл. Контрольное антитело MPE8-LALA Crt IgG1, соответствующее изотипу, вводят согласно описанному выше, через 24 ч после заражения вирусом. Для контроля токсичности в исследование включают группу мышей с имитацией заражения вирусом, которых обрабатывали FIT-1, а также просто контрольную группу без какого-либо воздействия. Индивидуальные веса самок мышей определяют в точке 0 и через день на протяжении 7-21 суток после ДППА. Мышей ежедневно наблюдают на наличие признаков заболевания, включая конъюнктивит, сгорбленность, слабость конечностей или паралич, и регистрируют начальные признаки заболевания. Группу из 3 животных вскрывают на 6 сутки ДППА и образцы ткани собирают для гистопатологического анализа.

Статистический анализ. Данные по выживаемости анализируют методом Wilcoxon log-rank survival analysis (Prism 5, фирма GraphPad Software, Inc).

Результаты и обсуждение.

Вирус Зика (ZIKV) может сохраняться в мужских репродуктивных тканях в течение длительных периодов, до шести месяцев, что является очевидной мишенью противовирусного лечения. Чтобы определить эффективность биспецифического антитела против ZIKV для профилактики или уменьшения патологии мужского репродуктивного пути, группы мышей обрабатывали через 24 или 72 ч после заражения пуэрториканским изолятом вируса ZIKV. Выживание, изменение веса и гистопатологию определяют для оценки эффективности лечения mAb. В качестве плацебо-терапии используют mAb контрольного изотипа MPE8-LALA Ctr IgG1.

Значительное (P<0,05) улучшение выживаемости наблюдают по сравнению с лечением плацебо mAb (фиг. 26). Полную выживаемость наблюдают у мышей, обработанных через 24 ч после заражения FIT-1, хотя среди мышей, обработанных через 72 ч после инокуляции вирусом, появилось одно животное, которое погибло от вирусной инфекции. Это единственное животное было умерщвлено через 24 дня после заражения вирусом, что было намного позже, чем у животных, получавших плацебо (фиг. 26). Поскольку заражение мышей AG129 вирусом ZIKV приводит к летальности, которая намного более серьезная, чем при обычной естественная инфекция этим вирусом, высокие уровни защиты, которые наблюдают при применении FIT-1, являются очень многообещающими.

Изменение среднего веса у мышей, обработанных FIT-1, было сходным с таковым у мышей с ложно инфицированными контрольными обработками, в то время как средний вес мышей, обработанных MPE8, быстро снижался после 7 ДППА, что дополнительно демонстрирует мощную защиту мышей от заболе- 67 043940 вания (фиг. 27).

Поскольку основная цель настоящего исследования заключается в том, чтобы оценить влияние лечения на мужской репродуктивный путь, а в предыдущих исследованиях семенники и придатки были наиболее сильно поражены после инфекции, особое внимание было уделено гистопатологии этих тканей. Никакого проявления заболевания не наблюдают в семенниках или придатках мышей, получавших FIT1, за исключением одного животного в 24-часовой лечебной группе (фиг. 28), что дополнительно демонстрирует эффективность лечения FIT-1. FIT-1 также защищает мышей от заболевания, когда лечение начинают через 72 ч после заражения вирусом, поскольку ни у одной из мышей, которых лечили в это время, не наблюдалось заболевания семенников или придатков (фиг. 28). У большинства мышей в группе, получавшей плацебо, было воспаление семенников (2/3) и придатков (3/3) (фиг. 28), хотя тяжесть заболевания в этом исследовании была довольно легкой.

Заключение.

Лечение с применением FIT-1 было эффективным в плане снижения всех оцениваемых параметров заболевания. Терапевтическое лечение до 72 ч после заражения вирусом было очень эффективным.

Пример 16. Профилактическая и терапевтическая эффективность FIT-1 у макак-резус, зараженных ZIKV.

В этом исследовании оценивают профилактическую и терапевтическую эффективность биспецифического антитела, нацеленного на вирус Зика (ZIKV), у индийских макак-резус (IRM), зараженных штаммом ZIKV PRVABC59. Шестнадцать (16) IRM были рандомизируют на три лечебные группы. Одна группа получает FIT-1 за один день до заражения (5 мг/кг), а вторая получает лечение через один день после заражения (15 мг/кг). Третья группа получает контроль изотипа (FIT-3, 5 мг/кг) за день до заражения. В день 0 всех IRM заражают 1х10⁵ БОЕ штамма ZIKV PRVABC59, введенного путем подкожной инъекции. Сыворотку, мочу и слюну собирают в заранее определенные моменты времени и определяют нагрузку ZIKV, измеренную методом количественной RT-PCR.

Методы.

До начала исследования (дня 0) шестнадцать (16) IRM рандомизируют по соответствующим группам в соответствии с полом/весом с использованием программного обеспечения Provantis. В дни -1 или 1 животные получают либо FIT-1, либо FIT-3 контрольного изотипа, путем внутривенного введения в дозе, указанной в табл. 4 ниже. В день 0 всех макак анестезируют и заражают 0,5 мл штамма ZIKV дикого типа PRVABC59 с целевой контрольной дозой 1,0х10⁵ БОЕ на животное путем подкожной инъекции. Образцы крови, мочи и слюны собирают в заранее установленные моменты времени, указанные в табл. 5, для оценки вирусной нагрузки методом RT-qPCR.

Таблица 4

Разделение животных по группам

Группа	Лечение	Сутки лечения	Способ лечения, доза	Стимуляция антигеном1
1 (3 самца/ 3 самки)	FIT-1	Сутки -1	Внутривенное введение, 5 мг/кг
2 (3 самца/3 самки)	FIT-1	Сутки +1	Внутривенное введение, 15 мг/кг
3 (2 самца/2 самки)	FIT-3	Сутки -1	Внутривенное введение, 5 мг/кг

1Подкожная стимуляция антигеном в 0 сутки в виде 0,5 мл ZIKV дикого типа.

Таблица 5

Ключевые активности

Сутки лечения	-1	0	1	5	10	15	20	25	30
Лечение
Стимуляция антигеном ZIKV (подкожное введение)
Число наблюдений в сутки		Всех животных наблюдают два раза в сутки
Масса тела		Ежедневно			л/
Температура тела		Ежедневно			л/	V
Взятие крови на анализ1		Ежедневно			у/	у/
Взятие проб мочи/слюны на анализ		1		1 1	1	V
Нагрузка вируса: РВ-кПЦР		Ежедневно		у/	у/	у/
Объем крови (мл)		2	2	2	2	20
Эвтаназия									л/

1В нулевые и 1 сутки кровь на анализ берут до стимуляции антигеном и до лечения.

В дни исследования -1 (группы 1 и 3) и 1 (группа 2) анестезированным животным вводят либо FIT-1 (исходная концентрация: 3,67 мг/мл), либо FIT-3 (исходная концентрация: 3,79 мг/мл) посредством внутривенной инъекции в правую подкожную или головную вену.

ZIKV, штамм PRVABC59; Human/2015/Puerto Rico (американский изолят) используют в этом исследовании. Приготовление инокулята вируса проводят в кабинете биологической безопасности класса II

- 68 043940 в условиях BSL-2. Исходный материал вируса оттаивают на водяной бане при 37±1°, встряхивают и разбавляют VP-SFM, получая инокулят с соответствующей концентрацией 2x105 БОЕ/мл. Каждый шприц заполняют 0,5 мл инокулята вируса и хранят на льду до тех пор, пока не доставляют в помещение для животных для введения. В день исследования 0 всех животных анестезируют, в месте инъекции делают надрез, протирают спиртом и наносят несмываемую метку. Животных инокулируют подкожно на передней поверхности левого предплечья 0,5 мл изолята ZIKV в дозе, указанной в табл. 4.

Всех макак наблюдают два раза в день на протяжении всего периода карантина и исследуют на наличие признаков заболеваемости или смерти. Животных наблюдают два раза в день (с интервалом не менее 8 ч) на чувствительность и клинические проявления, включая сыпь, эритему, конъюнктивит, выделения из глаз и отечность. Для всех животных кровь собирают во время, указанное в табл. 5, для тестирования вирусной нагрузки in vitro методом RT-qPCR. На 30-й день во время терминального кровотечения берут кровь, не более 20 мл от одного животного. У всех животных собирают мочу во время, указанное в табл. 5, для тестирования in vitro с помощью метода RT-qPCR мониторинга выделения вируса. Животных содержат в отдельных помещениях в течение периодов сбора мочи на протяжении исследования. Мочу собирают непосредственно из поддонов клеток, после сбора помещают на тающий лед, разделяют на аликвоты и хранят при -70°C или ниже до готовности к проведению анализа. Слюну собирают у анестезированных животных непосредственно в пробирки (примерно до 0,5 мл). Образцы хранят после сбора на тающем льду и хранят при -70°C или ниже до готовности к проведению анализа.

Вирусные нагрузки измеряют с использованием метода RT-qPCR для обнаружения геномов ZIKV в образцах сыворотки, мочи и слюны, собранных в моменты времени, указанные в табл. 5. Образцы, выделенные от зараженных вирусом животных, тестируют с использованием праймеров и зондов, предназначенных для обнаружения ZIKV штамма PRVABC59. Опубликовано описание методов ПЦР, включая последовательности праймеров и зондов (Goebel с соавт., J. Virol. 2016). Вирусную РНК выделяют из биологических жидкостей с использованием мини-набора QIAmp Viral RNA (фирма Qiagen, 52906). Вирусную РНК элюируют стерильной водой, не содержащей РНКазу и ДНКазу, и хранят при -70° или ниже. Нижний предел количественного определения (LLOQ) этого анализа был определен как 10 копий на реакцию.

Аликвоту инокулята инфицирующего вируса подвергают обратному титрованию с помощью стандартного анализа бляшек на клетках Vero для подтверждения фактически доставленной дозы. Десятикратные серийные разведения инокулята для контрольного заражения используют для инфицирования слившихся монослоев клеток Vero в 6-луночных планшетах, которые высевали накануне. Планшеты инкубируют при 37° и 5% CO₂ в течение 1 ч перед добавлением верхнего слоя среды, содержащей 0,5% агарозы. Планшеты инкубируют в течение 3 дней до образования выраженных бляшек, после чего их фиксируют, окрашивают кристаллическим фиолетовым и подсчитывают.

Результаты.

Макак подвергали мониторингу два раза в день на предмет заболеваемости и смертности протяжении всего исследования. Все животные дожили до установленного срока. Массу тела и температуру у всех животных измеряли в моменты времени, указанные в табл. 5. В ходе исследования не наблюдали существенного снижения массы тела. У всех животных температура тела поддерживалась в нормальном диапазоне на протяжении всего исследования. Клинические наблюдения заключались только в умеренном покраснении в месте заражения у нескольких животных.

Вирусные нагрузки измеряли с использованием метода RT-qPCR (количественной полимеразной цепной реакции реального времени) для обнаружения геномов ZIKV в образцах сыворотки, мочи и слюны, собранных в моменты времени, указанные в табл. 5. Вирусная нагрузка в сыворотке представлена на фиг. 29.

Животные в группе 3, получавшие контроль изотипа, обладали выявляемой вирусной нагрузкой в сыворотке на следующий день после заражения. Вирусная нагрузка у трех из четырех животных достигла пика выше 1x105 копий генома/мл (кг/мл) либо на 2-й, либо на 3-й день. Пик средней вирусной нагрузки в сыворотке достиг максимума в этой группе на 3-й день и составлял 1,15x105 кг/мл. Вирусные нагрузки снизились ниже LLOQ анализа (860 кг/мл) к 4-му дню у одного животного и к 5-му дню у остальных трех.

Животные в группе 2, получавшие 15 мг/кг FIT-1 на следующий день после заражения, имели среднюю вирусную нагрузку 3,99x103 GC/мл до лечения. На 2-й день средняя вирусная нагрузка в сыворотке снизилась до 96,5 кг/мл. Хотя низкие уровни вирусной РНК спорадически фиксировали после 1-го дня, ни в одной из точек контроля после лечения не было обнаружено вирусных нагрузок у животных во 2-й группе на уровне или ниже LLOQ по данным анализа RT-qPCR.

Предварительная обработка 5 мг/кг FIT-1 снизила средние вирусные нагрузки в сыворотке в первый день более чем в 50 раз по сравнению с животными в группе 3. Ни в одной из временных точек контроля после заражения вирусные нагрузки не были обнаружены на уровне или выше LLOQ, a ко второму дню вирусная РНК не была обнаружена в сыворотке ни у одного из животных из группы 1.

Только спорадические, низкие уровни РНК ZIKV были обнаружены в моче или слюне каких-либо

- 69 043940 животных. Ни в одной временной точке вирусные нагрузки не были обнаружены на уровне или выше

LLOQ в моче или слюне какого-либо животного.

Аликвоту инокулята вируса, использовавшуюся для заражения, подвергали обратному титрованию стандартным методом подсчета бляшек на клетках Vero для подтверждения фактически введенной дозы.

Метод бляшек показал титр 1,7x105 бляшкообразующих единиц/мл (БОЕ/мл).

Заключение и выводы.

В этом исследовании оценивают профилактическую и терапевтическую эффективность FIT-1 на макаках IRM, зараженных ZIKV. На протяжении всего исследования смертности не было, и клинические наблюдения ограничивались умеренным покраснением в месте заражения у нескольких животных. Вирусная нагрузка, определенная методом RT-qPCR в сыворотке, собранной после заражения, является первичной конечной точкой исследования. Вирусная РНК четко обнаруживается в сыворотке всех животных, получавших контроль изотипа, с вирусными нагрузками, достигающими пика во 2 или 3 день и поддерживающимися на уровнях выше LLOQ, равных 860 GC/мл, до 4 или 5 дней. Средняя пиковая нагрузка составляет 1,15х10⁵. GC/мл на 3-й день. Напротив, профилактическое лечение 5 мг/кг FIT-1 эффективно снижает пиковые вирусные нагрузки и время до вирусного клиренса в IRM, зараженных ZIKV. Низкие уровни вирусной РНК обнаруживают у всех шести животных из этой группы в первый день, но ко второму дню вирусную РНК не обнаруживают ни у одного из животных. Ни в одной точке не обнаруживают РНК ZIKV выше LLOQ 860 GC/мл в сыворотке крови какого-либо животного из этой группы. Аналогично, терапевтическое лечение 15 мг/кг FIT-1 на следующий день после заражения уменьшает как пиковые вирусные нагрузки, так и время до выведения вируса из сыворотки по сравнению с животными, получавшими контроль изотипа. У макак в группе 2 средняя пиковая вирусная нагрузка составляет 3,99x103 GC/мл в 1-й день, но после лечения в 1-й день средняя вирусная нагрузка в сыворотке этой группы снижается до 96,5 ГЦ/мл ко 2-му дню. В этой группе не было животных, у которых вирусные нагрузки превышают LLOQ 860 GC/мл на протяжении оставшегося периода наблюдения.

Таблица последовательностей и их номеров SEQ ID

ZKA190	SEQ ID NO	Аминокислотные последовательности
CDRH1	1	GFTFSKYG
CDRH2	2	ISYEGSNK
CDRH3	3	AKSGTQYYDTTGYEYRGLEYFGY
CDRL1	4	QSVSSSY
CDRL2	5	DAS
CDRL2	6	LIYDASSRA
long
CDRL3	7	QQYGRSRWT
VH	8	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSKYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYEG SNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSGTQYYDTTGYE YRGLEYFGYWGQGTLVTVSS
VL	9	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKRGQAPRLLIYDASSR ATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGRSRWTFGQGTKVEIK
ZKA190	SEQ ID NO	Последовательности нуклеиновых кислот
CDRH1		10	ggattcaccttcagtaaatatggc
CDRH2		11	atatcatatgagggaagtaataaa
CDRH3		12	gcgaaatcggggacccaatactatgatactactggttatgagtataggg gtttggaatactttggctac
CDRL1		13	cagagtgttagtagcagttac
CDRL2		14	gatgcatcc
CDRL2		15	ctcatctatgatgcatccagcagggcc
long
CDRL3		16	cagcagtatggtaggtcaaggtggaca
VH		17	caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggt ccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaaatatgg catgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggca gttatatcatatgagggaagtaataaatattatgcagactccgtgaagg gccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgca aatgaacagcctgagagctgaggacacggcagtgtattactgtgcgaaa tcggggacccaatactatgatactactggttatgagtataggggtttgg aatactttggctactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcag
VL		18	gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccagggg aaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagtagcagtta cttagcctggtaccagcagaaacgtggccaggctcccaggctcctcatc tatgatgcatccagcagggccactggcatcccagacaggttcagtggca gtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctga agattttgcagtgtattactgtcagcagtatggtaggtcaaggtggaca ttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaac

- 70 043940

ZKA185	SEQ ID NO	Аминокислотные последовательности
CDRH1	19	GYSFTSYW
CDRH2	20	FDPSDSQT
CDRH3	21	ARRYCSSSSCYVDN
CDRL1	22	ALPNKF
CDRL2	23	EDN
CDRL2 long CDRL3 VH VL ZKA185 CDRH1 CDRH2 CDRH3 CDRL1 CDRL2 CDRL2 Ion CDRL3 VH	24 25 26 27 SEQ ID 28 29 30 31 32 g 33 34 3i	VIYEDNKRP YSTDSSSNPLGV EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFTSYWITWVRQMPGKGLEWMAKFDP SDSQTNYSPSFQGHVTISVDKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARRYCSSSSC YVDNWGQGTLVTIFS SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPNKFAYWYRQKSGQAPVLVIYEDNKR PSGIPERFSGSSSGTMATLTISGAQVEDEADYHCYSTDSSSNPLGVFGGGTKL TVL NO. Последовательности нуклеиновых кислот ggatatagttttaccagttactgg tttgatcctagtgactctcaaacc gcgagaagatattgtagtagtagtagttgttatgtggacaat gcattgccaaataaattt gaggacaac gtcatctatgaggacaacaaacgaccc tactcaacagacagcagttctaatcccctgggagta Gaagtgcagctggtgcagtccggagcagaggtgaaaaagc

Ccggggagtctctgaggatctcctgtaagggttctggata Tagttttaccagttactggatcacctgggtgcgccagatg Cccgggaaaggcctggagtggatggcgaagtttgatccta Gtgactctcaaaccaactacagcccgtccttccaaggcca Cgtcaccatctcagttgacaagtccatcagcactgcctac Ttgcagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgccatgt attactgtgcgagaagatattgtagtagtagtagttgtta tgtggacaattggggccagggaaccctggtcaccatcttc tcag

VL	36	Tcctatgagctgacacagccaccctcggtgtcagtgtcc Ccaggacaaacggccaggatcacctgctctggagatgca Ttgccaaataaatttgcttattggtaccggcagaagtca Ggccaggcccctgttctggtcatctatgaggacaacaaa Cgaccctccgggatccctgagagattctctggctccagc Tcagggacaatggccaccttgactatcagtggggcccag Gtggaggatgaagctgactaccactgttactcaacagac Agcagttctaatcccctgggagtattcggcggagggacc aagctgaccgtcctag
ZKA230 SEQ ID NO		Аминокислотные последовательности
CDRH1	37	GGSISSDY
CDRH2	38	IYYSGST
CDRH3	39	ARRRKYD S LWG S FAFDI
CDRL1	40	SSNIGGNY
CDRL2	41	IND
CDRL2 long	42	LICINDHRP
CDRL3	43	ATWDDSLGGLV
VH	44	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGGSISSDYWSWIRQPPGKG LEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNHFSLKLNSVTAA DTAVYYCARRRKYDSLWGSFAFDIWGQGTMVTVSS
VL	45	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGGNYVYWYQQLPGTA PKLLICINDHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYY CATWDDSLGGLVFGGGTKLTVL
ZKA230 SEQ ID NO		Последовательности нуклеиновых кислот
CDRH1	46	ggtggctccatcagtagtgactac
CDRH2	47	atctattacagtgggagcacc
CDRH3	48	gcgaggaggaggaagtatgattccctttgggggagttttgcttttgatat c
CDRL1	49	agctccaacatcggaggtaattat

- 71 043940

CDRL2	50	attaatgat
CDRL2 long	51	ctcatctgtattaatgatcaccggccc
CDRL3	52	gcaacatgggatgacagcctgggtggccttgta
VH	53	caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggcctggtgaagccttcggagac cctgtccctcacctgcgcagtctctggtggctccatcagtagtgactact ggagctggatccggcagcccccagggaagggactggagtggattgggtat atctattacagtgggagcaccaactacaacccctccctcaagagtcgagt caccatatcagtagacacgtccaagaaccacttctccctgaagctgaact ctgtgaccgctgcggacacggccgtgtattactgtgcgaggaggaggaag tatgattccctttgggggagttttgcttttgatatctggggccaagggac aatggtcaccgtctcttcag
VL	54	cagtctgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagag ggtcaccatctcttgttctggaagcagctccaacatcggaggtaattatg tatactggtaccagcagctcccaggaacggcccccaaactcctcatctgt attaatgatcaccggccctcaggggtccctgaccgattctctggctccaa gtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccagtccgaggatg aggctgattattactgtgcaacatgggatgacagcctgggtggccttgta ttcggcggagggaccaagctgaccgtcctag
ZKA78	SEQ ID NO	Аминокислотные последовательности
CDRH1	55	GFTFSNYA
CDRH2	56	IGRNGDSI
CDRH3	57	VKDLAIPESYRIEADY
CDRL1	58	QSVLYRSNNKNY
CDRL2	59	WAS
CDRL2 long	60	LIYWASTRE
CDRL3	61	QQYYSSPRT
VH	62	EVQLAESGGGLVQPGGSLTLSCSGSGFTFSNYAMVWARQAPGKGLEYVSG IGRNGDSIYYTDSVKGRFTISRDNSKSMVYLQMSSLRTEDTAVYYCVKDL AIPESYRIEADYWGQGTLVIVSA
VL	63	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYRSNNKNYLSWYQQKPGQPP KLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISPLQAEDVAVYYCQQYYSS PRTFGQGTKVEIК
ZKA78	SEQ ID NO	Последовательности нуклеиновых кислот
CDRH1	64	ggcttcacttttagtaactatgca
CDRH2	65	atcgggcgcaacggggactctatc
CDRH3	66	gtgaaagatctggccatccccgagtcctacagaattgaagctgattat
CDRL1	67	cagtccgtgctgtaccgctctaacaacaagaattac
CDRL2	68	tgggcttca
CDRL2 long	69	ctgatctattgggcttcaacccgggaa
CDRL3	70	cagcagtactattctagtcctcgaact
VH	71	gaggtgcagctggcagaatcaggcgggggactggtccagcctggcggca gcctgacactgtcttgcagtggatcaggcttcacttttagtaactatgc aatggtgtgggcaaggcaggctcctgggaagggactggagtatgtctct ggcatcgggcgcaacggggactctatctactatactgatagtgtgaagg gccggttcaccatcagcagagacaatagcaaatccatggtgtacctgca gatgagctccctgcgaaccgaagacacagcagtgtactattgcgtgaaa gatetggccatccccgagtcctacagaattgaagctgattattgggga c agggcaccctggtcatcgtgagcgccg
VL	72	gacatcgtgatgacacagtctccagatagtctggcagtcagtctggggg agagggccactattaaetgeaagagetcccagtccgtgctgtaccgctc taacaacaagaattacctgtcttggtatcagcagaagcccggacagccc cctaaactgctgatctattgggcttcaacccgggaaagcggcgtcccag acagattctcaggcagcgggtccggaacagacttcaccctgacaattag ccccctgcaggcagaggacgtggctgtctactattgtcagcagtactat tctagtcctcgaactttcggccaggggaccaaggtggaaatcaaac

-72043940

ZKA64	SEQ ID NO			Аминокислотная последовательность
CDRH1	73	GYTFTGYH
CDRH2	74	INPNSGGT
CDRH3	75	ARMSSSIWGFDH
CDRL1	76	QSVLIN
CDRL2	77	GAS
CDRL2 long	78	LIYGASSRA
CDRL3	79	QQYNDWPPIT
VH	80	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHIDWVRQARGQGLEWMGRINPNS GGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMQLSRLRSDDSAVYYCARMSSSIWGFDHWG QGTLVTVSS
VL ZKA64 CDRH1 CDRH2 CDRH3 CDRL1 CDRL2 CDRL2 long CDRL3 VH VL Констаг облас IgGl CHl-( aa IgGl CHl-( LALA IgG CI IgG CI IgGl CHl-( nuc	81 SEQ II 82 83 84 85 86 87 88 89 90 1ТННЯ :ть 2H2-CH: 2H2-CH: . aa C aa 1 aa 2H2-CH 1	E T 3 3 3	IVMTQSP7 GIPARFSC Ю ggct atta gctc cagt ggag ctga cage cage agte tegs atta agte cccc tcct cagt gaga aege ette gcat egga etgt cage SEQ ID NO 91 92 93 94 95	iTLSVSPGERATLSCRASQSVLINLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRA JSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNDWPPITFGQGTRLEIK Последовательность нуклеиновой кислоты ;acaccttcacagggtatcac laccctaattctggcgggacc :ggatgagcteetctatttggggcttcgateat ;ctgtgctgattaac rcatcc itctatggagcatcctccagggct :agtacaatgattggccccctatcaca [tgcagctggtccagagcggagcagaggtgaagaaacccggcgcctc [aaggtcagctgcaaagcttccggctacaccttcacagggtatcaca ictgggtgaggcaggcaagaggacagggactggaatggatgggacgg laccctaattctggcgggaccaactacgcccagaagtttcagggccg [actatgaccagagacaccagcatctccacagcttatatgcagctgt [getgagatctgaegatagtgeegtetaetattgtgctcggatgagc ictatttggggcttcgatcattgggggcagggaacactggtgactgt :tcag itcgtgatgactcagtctccagccaccctgtcagtcagcccaggaga [gcaaccctgtcttgcagagcctcccagtctgtgctgattaacctgg [gtaccagcagaagccaggccaggcaccccgactgctgatctatgga ;cctccagggctaccggcattcctgcacgcttcagtggatcaggaag lacagagtttaccctgacaatctctagtctgcagtccgaagacttcg :ctactattgtcagcagtacaatgattggccccctatcacatttggc [ggactagactggagatcaagc Последовательности ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK RTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADS SPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHE GSTVEKTVAPTECS gcgtcgaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctcca agagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaagga ctacttccccgaacctgtgacggtctcgtggaactcaggcgccctg accagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggac tctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttggg cacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacacc aaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcaca catgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagt cttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccgg acccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaAgaCc ctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataa tgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgt gtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggca aggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccat cgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacag gtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccagg tcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgc

- 73 043940

		cgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacc acgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagca agctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaag agcctctccctgtccccgggtaaa
IgGl CH1-CH2-CH3 LALA nucl	96	gcgtcgaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctcca agagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaagga ctacttccccgaacctgtgacggtctcgtggaactcaggcgccctg accagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggac tctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttggg cacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacacc aaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcaca catgcccaccgtgcccagcacctgaaGCCGCGgggggaccgtcagt cttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccgg acccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagacc ctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataa tgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgt gtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggca aggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccat cgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacag gtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccagg tcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgc cgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacc acgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagca agctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaag agcctctccctgtccccgggtaaa
IgG CK nucl	97	cgTacGgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatg agcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataa cttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgcc ctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagca aggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagc agactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcag ggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
IgG CL nucl	98	ggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccctcct ctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataag tgacttctacccgggagccgtgacagtggcttggaaagcagatagc agccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaa gcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctga gcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaa gggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttca

ZKA3	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	99	GFIFSNYA
CDRH2	100	IGGKGDSI
CDRH3	101	VKD LAVLE S DRLEVD Q
VH	102	EVQLAESGGGLVQPGGSLRLSCSGSGFIFSNYAMVWARQAPGKGLEYVS GIGGKGDSIYHIDSVKGRFTISRDNSKRTVYLQMSRLRTEDTAVYYCVK DLAVLESDRLEVDQWGQGTLVIVSA
ZKA4	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	103	GFTFSSYV
CDRH2	104	TSYDGSNK
CDRH3	105	ARGPVPYWS GE S Y S GAY FD F
VH	106	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYVMHWVRQAPGKGLEWVT VTSYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRGEDTAIYYCAR GPVPYWSGESYSGAYFDFWGQGILVTVSS

- 74 043940

ZKA5	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	107	GFTFSNYY
CDRH2	108	MSSSETIK
CDRH3	109	ARSGIETVAGSIDYYGMDV
VH	110	QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAGSGFTFSNYYMTWIRQAPGKGLELVS YMSSSETIKYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRADDTARYYCAR SGIETVAGSIDYYGMDVWGHGTPVTVSS
ZKA6	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	111	DFTVSNYA
CDRH2	112	VSYDGSNK
CDRH3	113	ATGVTMFQGAQTNAEYLHY
VH	114	QVHLVESGGGVVQPGRSLRLSCEASDFTVSNYAMHWVRQAPGKGLEWVA WSYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCAT GVTMFQGAQTNAEYLHYWGQGSLVTISS
ZKA7	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	115	GFTFSRYG
CDRH2	116	VSGDGSST
CDRH3	117	VKDFWSGDQSLESDF
VH	118	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFTFSRYGMVWARQAPGKGLEYLS GVSGDGSSTYYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLHMSRLRDEDTAMYYCVK DFWSGDQSLESDFWGQGALVTVS S
ZKA8	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	119	GFTFSAHA
CDRH2	120	ISRNEDYT
CDRH3	121	VKDFGTSPQTDF
VH	122	DERLVESGGGLVQPGGSLRLVCSASGFTFSAHAMHWVRQPPGKGLEYVS TISRNEDYTYYADSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMRRLRPEDTAIYYCVK DFGTSPQTDFWGQGTLVAVSS
ZKA76	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	123	GFTFSTYF
CDRH2	124	ISSTGSYK
CDRH3	125	ARPFHSEYTYGLDAFDI
VH	126	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYFMHWVRQAPGKGLEWVA SISSTGSYKFYADSVKGRFTISRDNTKNSLFLQMNSLRAEDTAVFYCAR PFHSEYTYGLDAFDIWGQGTMLTVS S
ZKA117	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	127	GGSIRRTNSY
CDRH2	128	ISYSGST
CDRH3	129	ARLNDGSTVTTSSYFDY
VH	130	QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRRTNSYWGWIRQTTGKGLQW IGSISYSGSTFYNPSLKSRVTISLDTSKDHFSLELSSVTAADTAIYYCA RLNDGSTVTTSSYFDYWGQGTLVTVSS
ZKB27	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	131	GYSFTSSW
CDRH2	132	IDPSDSYT
CDRH3	133	ARHDYSVSENGMDV
VH	134	EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKASGYSFTSSWINWVRQMPGKGLEWMG RIDPSDSYTTYNPSFQGHVTISVDKSIGTAYLQWNSLRASDTAMYYCAR HDYSVSENGMDVWGQGTTVTVS S
ZKB29	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность

- 75 043940

CDRHl	135	GFTFSSYT
CDRH2	136	ISYDGSHK
CDRH3	137	ARRSYSISCFDY
VH	138	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVA VISYDGSHKFYADSVKGRFTISRDNSKDTLYLQMNSLRAEDTALYYCAR RSYSISCFDYWGQGTLVTISS
ZKB34	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRHl	139	GFTFSRSG
CDRH2	140	VSYDGSNK
CDRH3	141	AKD L TMVRGVHΥ Υ Y YVMDV
VH	142	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRSGMHWVRQAPGKGLEWVA WSYDGSNKYYSDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCAK DLTMVRGVHYYYYVMDVWGQGTTVTVS S
ZKB39	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRHl	143	GYTFDDYY
CDRH2	144	INPHRGGT
CDRH3	145	VRDQYCDGGNCYGIHQPHYGMDV
VH	146	QVQLVQSGAEVKKPGASLKVSCKASGYTFDDYYIHWVRQAPGQGLEWLG RINPHRGGTNYAQKFQGRVIMTLDMSISTTYMELRRITSDDAAVYYCVR DQYCDGGNCYGIHQPHYGMDVWGQGTTVTVSS
ZKB46	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRHl	147	GYSFTSYW
CDRH2	148	IDPSDSYT
CDRH3	149	ARREYSSSSGQEDWFDP
VH	150	EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFTSYWISWVRQMPGKGLEWMG RIDPSDSYTNYSPSFQGHVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCAR REYSSSSGQEDWFDPWGQGTLVTVSS
ZKB53	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRHl	151	GFTFSSYA
CDRH2	152	ISYDGSNR
CDRH3	153	ARHVEQLPSSGYFQH
VH	154	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQTPGKGLEWVT VISYDGSNRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRSEDTAVYYCAR HVEQLPSSGYFQHWGQGTLVTVSS
ZKC26	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRHl	155	GFIFSDFY
CDRH2	156	IGHDGSYI
CDRH3	157	ARAHGGFRH
VH	158	QVQVVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFIFSDFYMSWMRQAPGKGLEWVA YIGHDGSYILYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLRMNSLRVEDTAVYYCAR AHGGFRHWGQGTVVAVS P
ZKD5	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRHl	159	GFTFTSYG
CDRH2	160	ISYDGSNK
CDRH3	161	ARDRDHYDLWNAYTFDY
VH	162	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTSYGMHWVRQTPGKGLDWVA VISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKDTLYLQMNSLRAADTALYYCAR DRDHYDLWNAYTFDYWGQGTLVTVS S
ZKD7	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRHl	163	GFTFSNYA

- 76 043940

CDRH2	164	ISYDVSDK
CDRH3	165	AGGPLGVWIKPSNAEHFHH
VH	166	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMHWVRQAPGKGLEWVA VISYDVSDKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAAYYCAG GPLGVWIKPSNAEHFHHWGQGTLVTVSS
ZKD8	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	167	GFTFINYA
CDRH2	168	ISYDGSNK
CDRH3	169	ATDADAY GD S GANFHY
VH	170	QVQLVESGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFINYAIHWVRQAPGKGLEWVA VISYDGSNKFYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRADDTAVYYCAT DADAYGDSGANFHYWGQGTLVTVSS
ZKD15	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	171	DASISSGGFS
CDRH2	172	IYSSGDT
CDRH3	173	ARAHTPTSKFYYYYAMDV
VH	174	QLQLQESGSGLVKPSQTLSLTCTVSDASISSGGFSWSWIRQPLGKGLEW LGYIYSSGDTFYNPSLQGRVTMSVDIFRSQFSLKLTSVTAADTAMYYCA RAHTPTSKFYYYYAMDVWGQGTTVTVS S
ZKD16	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	175	GFTFSDHF
CDRH2	176	SRNKPNSYTT
CDRH3	177	AKVGGCYGGDCHVENDY
VH	178	EVQLVESGGDLVQPGGSLRLSCVASGFTFSDHFMDWVRQAPGKGLEWVG RSRNKPNSYTTEYAASVKGRFSISRDDSKKALYLQMNSLQTEDTAVYYC AKVGGCYGGDCHVENDYWGQGTLVTVSS
ZKD17	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	179	GFIFSDYA
CDRH2	180	ISYDGSSR
CDRH3	181	ARGYCSSGTCFSTNAEYFHP
VH	182	QVQMVE S GGGVVQ P GT S LRL S CAT S GFIFSDYAMHWVRQAP GKGLEWVA VISYDGSSRLYADSVKGRFTVSRDNSKNTLYLQMHSLRAGDTAVYYCAR GYCSSGTCFSTNAEYFHPWGQGTLATISS
ZKD20	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	183	GFTFSDHF
CDRH2	184	SRNKPNSYTT
CDRH3	185	ARVGGCNGGDCHVENDY
VH	186	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSDHFMDWVRQAPGKGLEWVG RSRNKPNSYTTEYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLQTEDTAVYYC ARVGGCNGGDCHVENDYWGQGTLVTVSS
ZKA134	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	187	GGTFSAYA
CDRH2	188	IIPFFGTA
CDRH3	189	ARSDIVSTTRGYHHYGMDV
VH	190	QVHLVQSGAEVKKPGSSVNVSCKASGGTFSAYAISWVRQAPGQGLEWMG GIIPFFGTAYYAQKFKGRVTVTADKSTSTVYMEMTSLRSEDTAVYYCAR SDIVSTTRGYHHYGMDVWGQGTTVTVS S
ZKA246	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	191	GYTFSDYY

- 77 043940

CDRH2	192	INPYSGGT
CDRH3	193	ARGFTMISDREFDP
VH	194	QVQLVQSGAEVKRPGASVKVSCKASGYTFSDYYMHWVRQAPGQGLEWMG RINPYSGGTNYAQKFHGRVTVTRDTSISTVYMELRGLRSDDTAVYYCAR GFTMISDREFDPWGQGTLVTVSS
ZKA256	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	195	GFTFSTYW
CDRH2	196	IKQDGSEK
CDRH3	197	ARDPGYDDFWSGSYSGSFDI
VH	198	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYWMTWVRQAPGKGLEWVA NIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNTKNSLYLQVNSLRAEDTAIYYCAR DPGYDDFWSGSYSGSFDIWGQGTMVTVS S
ZKB42	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	199	GFTFNNYG
CDRH2	200	ISYDGNKK
CDRH3	201	VKYGERINGYSDPFDH
VH	202	QVQVVESGGGVVQPGRSLRLFCAASGFTFNNYGMHWVRQAPGKGLEWVA LISYDGNKKYYADSVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNRLRSGDTAVYHCVK YGERINGYSDPFDHWGQGTLVTVSS
ZKB85	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	203	GYTFTTYA
CDRH2	204	INTNTGNP
CDRH3	205	ARVIVPYAFDI
VH	206	QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTYAMNWVRQAPGQGPEWVG WINTNTGNPTYAQGFTGRFVLSLDTSVSTAFLQISSLKAEDTAVYYCAR VIVPYAFDIWGQGTMVTVS S
ZKB47	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	207	GYTFTNYY
CDRH2	208	INPSGGPT
CDRH3	209	ARDQYGGYARYGMDV
VH	210	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCQASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEWMG IINPSGGPTSYAQKFQGRVTMTTDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR DQYGGYARYGMDVWGQGTTVTVS S
ZKC6	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	211	GYTFTGYY
CDRH2	212	INPNSGGT
CDRH3	213	ARVSDWGFAFDI
VH	214	QVQLVQSGTEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMG RINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSGLRSDDTAVYYCAR VSDWGFAFDIWGQGTMVTVSQ
ZKA160	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	215	GGSITSYS
CDRH2	216	IFYSGST
CDRH3	217	ARDQTMPVWVGGMDV
VH	218	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSITSYSWSWIRQPPGKGLEWIG YIFYSGSTDYNPSLKSRVTISVDTSKDQFSLRLRSVTAADTAVYYCARD QTMPVWVGGMDVWGQGTTVTVS S
ZKA172	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	219	GYIFTRYW
CDRH2	220	IDPSDSYT
CDRH3	221	ARQE TARED GMAV

- 78 043940

VH	222	EVQLVQSGAEVKKPGKSLRISCKGSGYIFTRYWISWVRQMPGKGLEWMG RIDPSDSYTNYSPSFQGHVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCAR QETAREDGMAVWGQGTTVTVSS
ZKA174	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	223	GGSMSNSYYH
CDRH2	224	IYYSGST
CDRH3	225	ARNPVFNPLTLTHDAFDI
VH	226	QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSMSNSYYHWGWIRQPPGKGLEW IGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCA RNPVFNPLTLTHDAFDIWGQGTMVTVS S
ZKA189	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	227	GFTFSSYA
CDRH2	228	ISGSGDNT
CDRH3	229	AKWPYYDFWSGSESYFDP
VH	230	GVQLLESGGALVQPGKSLRLSCAASGFTFSSYALTWVRQAPGKGLQWVS AISGSGDNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK WPYYDFWSGSESYFDPWGQGTLVTVSS
ZKA195	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	231	GYNFPSYW
CDRH2	232	IDPSDSYT
CDRH3	233	ARADCRSTSCYLVFE
VH	234	EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKDSGYNFPSYWIHWVRQMPGKGLEWMG TIDPSDSYTNYSPSFQGHVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCAR ADCRSTSCYLVFEGQGTLVTVSS
ZKA215	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	235	GYTFTSYW
CDRH2	236	IDPSDSHT
CDRH3	237	ARHALPNYFDS
VH	238	EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYTFTSYWISWVRQMPGKGLEWMG RIDPSDSHTDYSPSFQGHVTISADKSISAAYLQWSSLKASDTAMYYCAR HALPNYFDSWGQGTLVTVS S
ZKA218	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	239	GFPFSSYW
CDRH2	240	INSDGRNT
CDRH3	241	ARGGYDYDSSGCFDY
VH	242	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFSSYWMHWVRQAPGKGLVWVS RINSDGRNTNYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR GGYDYDSSGCFDYWGQGTLVTVSS
ZKB75	SEQ ID NO.	Аминокислотная последовательность
CDRH1	243	GFTFSNYA
CDRH2	244	ISGTGGST
CDRH3	245	AKDSASRGGYCSGGVCYLNPGHHDY
VH	246	EVQVLESGGGLLQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVS TISGTGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK DSASRGGYCSGGVCYLNPGHHDYWGQGTLVTVSS
ZKB83	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	247	GYSFTNYW
CDRH2	248	IDPSDSYT
CDRH3	249	ARLRGSLYCSGGRCYSVPGETPNWFDP
VH	250	EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFTNYWITWVRQMPGKGLEWMG SIDPSDSYTNYSPSFQGHVTISADWSINTAYLQWSSLKASDTAKYYCAR
		LRGSLYCSGGRCYSVPGETPNWFDPWGQGTLVTVSS
ZKC3	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	251	GGSITSYY
CDRH2	252	IYYSGST
CDRH3	253	ARVGGAPYYYYGMDV
VH	254	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSITSYYWSWIRQPPGKGLEWIG YIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARV GGAPYYYYGMDVWGQGTTVTVS S
ZKC18	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	255	GFTFGDYA
CDRH2	256	IRSKAYGGTT
CDRH3	257	SRDHTGTTYAFDI
VH	258	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFGDYAMSWFRQAPGKGLEWVG FIRSKAYGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYC SRDHTGTTYAFDIWGQGTMVTVSQ
ZKD1	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
CDRH1	259	GFTFSSYG
CDRH2	260	IWYDGSNK
CDRH3	261	ARDRRGY GD YVGY Y Y GMDV
VH	262	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVA VIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DRRGYGDYVGYYYGMDVWGQGTTVTVS S

- 79 043940

Обозначение	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность
ZIKV EDIII генерическая	263	TAAFTFTKXPAEXXHGTVTVEXQYXGXDGPCKXPXQMAVDXQTLTPV GRLITANPVITEXTENSKMMLELDPPFGDSYIVIGXGXKKITHHWHR S
ZIKV H/PF/2013 EDIII	264	TAAFTFTKIPAETLHGTVTVEVQYAGTDGPCKVPAQMAVDMQTLTPV GRLITANPVITESTENSKMMLELDPPFGDSYIVIGVGEKKITHHWHR S
ZIKV EDIII генерическая	265	x1gx2x3yslctaaftftkx4paex5x6hgtvtvex7qyx8gx9dg PCKXwPXnQMAVDXnQTLTPVGRLITANPVITEXnTXnNSKM MLELDPPFGDSYIVIGX15GX16X17KITHHWHRSG где XI может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно К, А или Е, Х2 может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно V, F или L, ХЗ может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно S или F, Х4 может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно I или V, Х5 может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно Т или V, Х6 может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно L или D, Х7 может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно V или G, Х8 может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно А или G, Х9 может быть какой-либо (природной) аминокислотой, за исключением R, предпочтительно Т или А, ХЮ может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно V или I, XII может быть какой-либо (природной) аминокислотой,
		предпочтительно А или V, Х12 может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно М или Т, XI3 может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно S или G, Х14 может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно Е или К, XI5 может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно V или I, Х16 может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно Е, А, К или D, Х17 может быть какой-либо (природной) аминокислотой, предпочтительно Е, А или К, более предпочтительно К или А
Zika-E-Fl праймер	266	TGCAAACGCGGTCGCAAACCTGGTTG
ZIKV-E-R1 праймер	267	CGTGCCAAGGTAATGGAATGTCGTG
ZIKV-Efl530 праймер	268	AGCCTAGGACTTGATTGTGAACCGA
ZIKV-E-R2769 праймер	269	Т ТACAGAT С С СACAAC GAC С GT СAG
ZIKV-E-F2	270	ACTTGGTCATGATACTGCTGATTGC
ZIKV-E-R2	271	TCGGTTCACAATCAAGTCCTAGGCT
ZIKV-E-f2058	272	GCTAACCCCGTAATCACTGAAAGCA
ZIKV-E-r2248	273	AAGACTGCCATTCTCTTGGCACCTC

*Последовательности, выделенные жирным шрифтом, представляют собой области CDR (нуклеотидные или аминокислотные (аа)), а подчеркнутые остатки являются мутантными остатками по сравнению с последовательностью зародышевой линии.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> ХУМАБС БИОМЕД СА <12 0> МУЛЬТИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ В ОТНОШЕНИИ ЭПИТОПОВ ВИРУСА ЗИКА, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ <130> HB01P034WO1 <160>273 <170> Patentin version 3.5 <210>1 <211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA190 CDRH1 <400> 1

-80043940

Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr Gly < 210> 2 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA190 CDRH2 < 400>2

Ile Ser Tyr Glu Gly Ser Asn Lys <210>3 <211>23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA190 CDRH3 <400>3

Ala Lys Ser Gly Thr Gln Tyr

Tyr Asp Thr Thr Gly Tyr Glu Tyr Arg

1015

Gly Leu Glu Tyr Phe Gly Tyr <210>4 <211>7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA190 CDRL1 <400>4

Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr <210>5 <400>5

000 <210>6 <211>9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA190 CDRL2 long <400> 6

Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala

5

- 81 043940 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA190 CDRL3 <400>7

Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Arg Trp Thr <210>8 <211>130 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA190 VH < 400>8

Gln 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Val

Val

Gln

Pro

Gly 15

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser 25

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser 30

Lys

Tyr

Gly

Met

His 35

Trp

Val

Arg

Gln

Ala 40

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Val

Ala

Val 50

Ile

Ser

Tyr

Glu

Gly 55

Ser

Asn

Lys

Tyr

Tyr 60

Ala

Asp

Ser

Val

Lys 65

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile 70

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser 75

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr 80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser 85

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Lys

Ser

Gly 100

Thr

Gln

Tyr

Tyr

Asp 105

Thr

Thr

Gly

Tyr

Glu 110

Tyr

Arg

Gly

Leu

Glu 115

Tyr

Phe

Gly

Tyr

Trp 120

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu 125

Val

Thr

Val

Ser

Ser 130

< 210>9 < 211>108 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA190 VL <400> 9

- 82 043940

Glu Ile Val 1

Glu Arg Ala

Tyr Leu Ala 35

Leu

Thr 20

Trp

Thr 5

Leu

Tyr

Gln

Ser

Gln

Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1015

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 2530

Gln Lys Arg Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 4045

Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile

55

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90

Pro 60

Ile

Tyr

Asp Arg

Phe Ser

Ser Arg

Gly Arg

Leu Glu

Ser Arg 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 <210> 10 <211> 24 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA190 CDRH1 <400> 10 ggattcacct tcagtaaata tggc <210> 11 <211> 24 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA190 CDRH2 < 400> 11 atatcatatg agggaagtaa taaa <210> 12 <211> 69 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA190 CDRH3 <400> 12 gcgaaatcgg ggacccaata ctatgatact actggttatg agtatagggg tttggaatac tttggctac <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence

- 83 043940 <220>

<223> ZKA190 CDRL1 <400>13 cagagtgtta gtagcagtta c21 <210>14 <400>14

000 <210>15 <211>27 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA190 CDRL2 long < 400>15 ctcatctatg atgcatccag cagggcc27 < 210>16 < 211>27 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA190 CDRL3 < 400>16 cagcagtatg gtaggtcaag gtggaca27 < 210>17 < 211>391 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA190 VH <400> 17

caggtgcagc	tggtggagtc	tgggggaggc	gtggtccagc	ctgggaggtc	cctgagactc	60
tcctgtgcag	cctctggatt	caccttcagt	aaatatggca	tgcactgggt	ccgccaggct	120
ccaggcaagg	ggctggagtg	ggtggcagtt	atatcatatg	agggaagtaa	taaatattat	180
gcagactccg	tgaagggccg	attcaccatc	tccagagaca	attccaagaa	cacgctgtat	240
ctgcaaatga	acagcctgag	agctgaggac	acggcagtgt	attactgtgc	gaaatcgggg	300
acccaatact	atgatactac	tggttatgag	tataggggtt	tggaatactt	tggctactgg	360
ggccagggaa	ccctggtcac	cgtctcctca	g			391

< 210> 18 < 211> 325 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA190 VL <400> 18

- 84 043940 gaaattgtgt ctctcctgca cgtggccagg gacaggttca cctgaagatt caagggacca tgacgcagtc gggccagtca ctcccaggct gtggcagtgg ttgcagtgta aggtggaaat tccaggcacc gagtgttagt cctcatctat gtctgggaca ttactgtcag caaac ctgtctttgt agcagttact gatgcatcca gacttcactc cagtatggta ctccagggga tagcctggta gcagggccac tcaccatcag ggtcaaggtg aagagccacc ccagcagaaa tggcatccca cagactggag gacattcggc

120

180

240

300

325 < 210> 19 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA185 CDRH1 < 400>19

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp < 210>20 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA185 CDRH2 < 400>20

Phe Asp Pro Ser Asp Ser Gln Thr < 210>21 < 211>14 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA185 CDRH3 < 400>21

Ala Arg Arg Tyr Cys Ser Ser Ser Ser Cys Tyr Val Asp Asn

510 < 210>22 < 211>6 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA185 CDRL1 < 400> 22

Ala Leu Pro Asn Lys Phe

5 <210> 23

- 85 043940 <400>23

000 <210>24 < 211>9 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA185 CDRL2 long < 400>24

Val Ile Tyr Glu Asp Asn Lys Arg Pro < 210>25 < 211>12 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA185 CDRL3 < 400>25

Tyr Ser Thr Asp Ser Ser Ser Asn Pro Leu Gly Val

510 <210>26 <211>121 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA185 VH <400> 26

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 1 5

Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly 20

Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Met

40

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 45

Ala Lys Phe Asp Pro Ser Asp Ser

55

Gln Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe 60

Gln Gly His Val Thr Ile Ser Val 65 70

Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala 85

Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

95

Ala Arg Arg Tyr Cys Ser Ser Ser

100

Ser Cys Tyr Val Asp Asn Trp Gly

105 110

- 86 043940

Gln Gly Thr Leu Val Thr Ile	Phe 120	Ser
115
<210> 27 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZKA185 VL
<400> 27
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro 1 5	Pro	Ser	Val 10
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser 20	Gly	Asp 25	Ala
Tyr Trp Tyr Arg Gln Lys Ser 35	Gly 40	Gln	Ala
Glu Asp Asn Lys Arg Pro Ser 50 55	Gly	Ile	Pro
Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr 65 70	Leu	Thr	Ile
Asp Glu Ala Asp Tyr His Cys 85	Tyr	Ser	Thr 90
Leu Gly Val Phe Gly Gly Gly 100 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZKA185 CDRH1 <400> 28 ggatatagtt ttaccagtta ctgg <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZKA185 CDRH2 <400> 29 tttgatccta gtgactctca aacc <210> 30 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence	Thr	Lys 105	Leu

Val Ser Pro Gly Gln

Pro Asn Lys Phe Ala 30

Val Leu Val Ile Tyr 45

Arg Phe Ser Gly Ser 60

Gly Ala Gln Val Glu

Ser Ser Ser Asn Pro

Val Leu

- 87 043940 <220>

<223> ZKA185 CDRH3 <400>30 gcgagaagat attgtagtag tagtagttgt tatgtggaca at <210>31 < 211>18 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA185 CDRL1 < 400>31 gcattgccaa ataaattt < 210>32 < 400>32

000 < 210>33 < 211>27 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA185 CDRL2 long < 400>33 gtcatctatg aggacaacaa acgaccc27 < 210>34 < 211>36 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA185 CDRL3 < 400>34 tactcaacag acagcagttc taatcccctg ggagta36 < 210>35 < 211>364 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA185 VH

<400> 35 gaagtgcagc	tggtgcagtc	cggagcagag	gtgaaaaagc	ccggggagtc	tctgaggatc	60
tcctgtaagg	gttctggata	tagttttacc	agttactgga	tcacctgggt	gcgccagatg	120
cccgggaaag	gcctggagtg	gatggcgaag	tttgatccta	gtgactctca	aaccaactac	180
agcccgtcct	tccaaggcca	cgtcaccatc	tcagttgaca	agtccatcag	cactgcctac	240
ttgcagtgga	gcagcctgaa	ggcctcggac	accgccatgt	attactgtgc	gagaagatat	300
tgtagtagta	gtagttgtta	tgtggacaat	tggggccagg	gaaccctggt	caccatcttc	360

- 88 043940 tcag

364 <210> 36 <211> 328 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA185 VL <400> 36 tcctatgagc tgacacagcc accctcggtg tcagtgtccc caggacaaac ggccaggatc acctgctctg gagatgcatt gccaaataaa tttgcttatt ggtaccggca gaagtcaggc caggcccctg ttctggtcat ctatgaggac aacaaacgac cctccgggat ccctgagaga ttctctggct ccagctcagg gacaatggcc accttgacta tcagtggggc ccaggtggag gatgaagctg actaccactg ttactcaaca gacagcagtt ctaatcccct gggagtattc ggcggaggga ccaagctgac cgtcctag

120

180

240

300

328 <210> 37 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA230 CDRH1 <400> 37

Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asp Tyr

5 <210> 38 < 211> 7 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA230 CDRH2 < 400> 38

Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr

5 <210> 39 <211> 17 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA230 CDRH3 <400> 39

Ala Arg Arg Arg Lys Tyr Asp Ser Leu

Trp Gly Ser Phe Ala Phe Asp

Ile

- 89 043940 <210> 40 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA230 CDRL1 <400> 40

Ser Ser Asn Ile Gly Gly Asn Tyr

5 <210>41 <400>41

000 <210>42 <211>9 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA230 CDRL2 long < 400> 42

Leu Ile Cys Ile Asn Asp His Arg Pro

5 <210> 43 <211> 11 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA230 CDRL3 <400> 43

Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu Gly Gly Leu Val

5 10 <210> 44 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA230 VH <400> 44

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro 1 5

Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser

25

Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asp

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro

40

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 45

- 90 043940

Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 5560

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn His Phe Ser Leu 65 70 7580

Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 9095

Arg Arg Arg Lys Tyr Asp Ser Leu Trp Gly Ser Phe Ala Phe Asp Ile

100 105110

Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115120 <210>45 <211>110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA230 VL <400>45

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

5 1015

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Gly Asn 20 2530

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 4045

Ile Cys Ile Asn Asp His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 5560

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 7580

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu 85 9095

Gly Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105110 <210>46 <211>24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA230 CDRH1 <400> 46 ggtggctcca tcagtagtga ctac

- 91 043940 <210> 47 <211> 21 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA230 CDRH2 < 400>47 atctattaca gtgggagcac c21 < 210>48 < 211>51 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA230 CDRH3 < 400>48 gcgaggagga ggaagtatga ttccctttgg gggagttttg cttttgatat c51 < 210>49 < 211>24 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA230 CDRL1 < 400>49 agctccaaca tcggaggtaa ttat24 < 210>50 < 400>50

000 < 210>51 < 211>27 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA230 CDRL2 long < 400>51 ctcatctgta ttaatgatca ccggccc < 210>52 < 211>33 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA230 CDRL3 <400>52 gcaacatggg atgacagcct gggtggcctt gta <210>53 <211>370 <212> DNA <213> Artificial Sequence

- 92 043940 <220>

<223> ZKA230 VH <400> 53 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccaggc ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc acctgcgcag tctctggtgg ctccatcagt agtgactact ggagctggat ccggcagccc ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca cttctccctg aagctgaact ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag gaggaggaag tatgattccc tttgggggag ttttgctttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc gtctcttcag <210> 54 <211> 331 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA230 VL <400> 54 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga ggtaattatg tatactggta ccagcagctc ccaggaacgg cccccaaact cctcatctgt attaatgatc accggccctc aggggtccct gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca acatgggatg acagcctggg tggccttgta ttcggcggag ggaccaagct gaccgtcctag

120

180

240

300

360

370

120

180

240

300

331 <210>55 <211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA78 CDRH1 < 400>55

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala < 210>56 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA78 CDRH2 < 400> 56

Ile Gly Arg Asn Gly Asp Ser Ile

5 <210> 57

- 93 043940 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA78 CDRH3 <400>57

Val Lys Asp Leu Ala Ile Pro Glu

Ser Tyr Arg Ile Glu Ala Asp Tyr <210>58 <211>12 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA78 CDRL1 < 400>58

Gln Ser Val Leu Tyr Arg Ser Asn Asn Lys Asn Tyr

510 < 210>59 < 400>59

000 < 210>60 < 211>9 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA78 CDRL2 long < 400>60

Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu < 210>61 < 211>9 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA78 CDRL3 < 400>61

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Arg Thr < 210>62 < 211>123 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA78 VH <400> 62

- 94 043940

Glu Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly

5 10

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ser Gly Ser Gly

25

Ala Met Val Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly 35 40

Ser Gly Ile Gly Arg Asn Gly Asp Ser Ile

55

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 65 70

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Thr Glu Asp

90

Val Lys Asp Leu Ala Ile Pro Glu Ser Tyr

100 105

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ile Val Ser

115 120 <210> 63 <211> 113 <212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA78 VL < 400> 63

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser 1 5 10

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser

25

Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr

40

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser

55

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 65 70

Ile Ser Pro Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala

90

Tyr Tyr Ser Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gln

100 105

Val Gln Pro Gly Gly

Thr Phe Ser Asn Tyr 30

Gly Leu Glu Tyr Val 45

Tyr Thr Asp Ser Val 60

Lys Ser Met Val Tyr 80

Ala Val Tyr Tyr Cys 95

Ile Glu Ala Asp Tyr 110

Ala Val Ser Leu Gly

Ser Val Leu Tyr Arg 30

Gln Lys Pro Gly Gln 45

Arg Glu Ser Gly Val 60

Asp Phe Thr Leu Thr 80

Tyr Tyr Cys Gln Gln

Thr Lys Val Glu Ile 110

- 95 043940

Lys <210> 64 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA78 CDRH1 <400>64 ggcttcactt ttagtaacta tgca24 <210>65 <211>24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA78 CDRH2 <400>65 atcgggcgca acggggactc tatc24 <210>66 <211>48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA78 CDRH3 <400>66 gtgaaagatc tggccatccc cgagtcctac agaattgaag ctgattat48 <210>67 <211>36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA78 CDRL1 <400>67 cagtccgtgc tgtaccgctc taacaacaag aattac <210>68 <400>68

000 <210>69 <211>27 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA78 CDRL2 long < 400> 69 ctgatctatt gggcttcaac ccgggaa <210> 70

- 96 043940 <211> 27 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA78 CDRL3 <400>70 cagcagtact attctagtcc tcgaact27 <210>71 <211>370 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA78 VH < 400>71 gaggtgcagc tggcagaatc aggcggggga ctggtccagc ctggcggcag cctgacactg60 tcttgcagtg gatcaggctt cacttttagt aactatgcaa tggtgtgggc aaggcaggct120 cctgggaagg gactggagta tgtctctggc atcgggcgca acggggactc tatctactat180 actgatagtg tgaagggccg gttcaccatc agcagagaca atagcaaatc catggtgtac240 ctgcagatga gctccctgcg aaccgaagac acagcagtgt actattgcgt gaaagatctg300 gccatccccg agtcctacag aattgaagct gattattggg gacagggcac cctggtcatc360 gtgagcgccg370 < 210>72 < 211>340 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA78 VL < 400>72 gacatcgtga tgacacagtc tccagatagt ctggcagtca gtctggggga gagggccact60 attaactgca agagctccca gtccgtgctg taccgctcta acaacaagaa ttacctgtct120 tggtatcagc agaagcccgg acagccccct aaactgctga tctattgggc ttcaacccgg180 gaaagcggcg tcccagacag attctcaggc agcgggtccg gaacagactt caccctgaca240 attagccccc tgcaggcaga ggacgtggct gtctactatt gtcagcagta ctattctagt300 cctcgaactt tcggccaggg gaccaaggtg gaaatcaaac340 < 210>73 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA64 CDRH1 < 400> 73

Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr His

5

- 97 043940 <210> 74 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA64 CDRH2 < 400>74

Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr <210>75 <211>12 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA64 CDRH3 < 400>75

Ala Arg Met Ser Ser Ser Ile Trp Gly Phe Asp His

510 < 210>76 < 211>6 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA64 CDRL1 < 400>76

Gln Ser Val Leu Ile Asn < 210>77 < 400>77

000 < 210>78 < 211>9 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA64 CDRL2 long < 400>78

Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala <210>79 <211>10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA64 CDRL3

- 98 043940 <400> 79

Gln Gln Tyr Asn Asp Trp Pro Pro Ile Thr

5 10 <210> 80 <211> 119 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA64 VH < 400> 80

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

5 10

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly

25

His Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly

40

Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr

55

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr 65 70

Met Gln Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp 85 90

Ala Arg Met Ser Ser Ser Ile Trp Gly Phe

100 105

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 <210> 81 <211> 108 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA64 VL < 400> 81

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr

5 10

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser

25

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

40

Lys Lys Pro Gly Ala

Thr Phe Thr Gly Tyr 30

Gly Leu Glu Trp Met 45

Tyr Ala Gln Lys Phe 60

Ile Ser Thr Ala Tyr

Ala Val Tyr Tyr Cys 95

His Trp Gly Gln Gly

110

Ser Val Ser Pro Gly 15

Ser Val Leu Ile Asn

Pro Arg Leu Leu Ile 45

- 99 043940

Tyr

Gly 50

Ala

Ser

Ser

Arg

Ala 55

Thr

Gly

Ile

Pro Ala 60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 65

Gly

Ser

Gly

Thr

Glu 70

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile 75

Ser

Ser

Leu

Gln

Ser 80

Glu

Asp

Phe

Ala

Val 85

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln 90

Tyr

Asn

Asp

Trp

Pro 95

Pro

Ile

Thr

Phe

Gly 100

Gln

Gly

Thr

Arg

Leu 105

Glu

Ile

Lys

<210> 82 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA64 CDRH1 <400> 82 ggctacacct tcacagggta tcac <210> 83 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA64 CDRH2 <400> 83 attaacccta attctggcgg gacc <210> 84 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA64 CDRH3 <400> 84 gctcggatga gctcctctat ttggggcttc gatcat <210> 85 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA64 CDRL1 <400> 85 cagtctgtgc tgattaac

<210>	86
<400>	86
000
<210>	87

- 100 043940 <211> 27 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA64 CDRL2 long <400>87 ctgatctatg gagcatcctc cagggct <210>88 <211>30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA64 CDRL3 <400>88 cagcagtaca atgattggcc ccctatcaca <210>89 <211>358 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA64 VH <400> 89

caggtgcagc	tggtccagag	cggagcagag	gtgaagaaac	ccggcgcctc	agtgaaggtc
agctgcaaag	cttccggcta	caccttcaca	gggtatcaca	tcgactgggt	gaggcaggca
agaggacagg	gactggaatg	gatgggacgg	attaacccta	attctggcgg	gaccaactac
gcccagaagt	ttcagggccg	agtgactatg	accagagaca	ccagcatctc	cacagcttat
atgcagctgt	cccggctgag	atctgacgat	agtgccgtct	actattgtgc	tcggatgagc
tcctctattt	ggggcttcga	tcattggggg	cagggaacac	tggtgactgt	cagttcag

120

180

240

300

358 <210> 90 <211> 325 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA64 VL <400> 90 gagatcgtga ctgtcttgca ggccaggcac cgcttcagtg gaagacttcg tgactcagtc gagcctccca cccgactgct gatcaggaag ctgtctacta tccagccacc gtctgtgctg gatctatgga cggaacagag ttgtcagcag ctgtcagtca attaacctgg gcatcctcca tttaccctga tacaatgatt gcccaggaga cttggtacca gggctaccgg caatctctag ggccccctat acgggcaacc gcagaagcca cattcctgca tctgcagtcc cacatttggc caggggacta gactggagat caagc

120

180

240

300

325 <210> 91 <211> 330 <212> PRT

- 101 043940

Ala Pro Ser Ser Lys <213> Artificial Sequence <220>

<223> IgGl CH1-CH2-CH3 aa <400> 91

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 1 5 10

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

25

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

40

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 50 55

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 65 70

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 85 90

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

100 105

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

115 120

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

130 135

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

145 150

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

165 170

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

180 185

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

195 200

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

210 215

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

225 230

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

245 250

Leu Val Lys Asp Tyr 30

Gly Ala Leu Thr Ser 45

Ser Gly Leu Tyr Ser 60

Leu Gly Thr Gln Thr

Thr Lys Val Asp Lys 95

Thr Cys Pro Pro Cys 110

Phe Leu Phe Pro Pro

125

Pro Glu Val Thr Cys 140

Val Lys Phe Asn Trp

160

Thr Lys Pro Arg Glu

175

Val Leu Thr Val Leu

190

Cys Lys Val Ser Asn

205

Ser Lys Ala Lys Gly 220

Pro Ser Arg Glu Glu

240

Val Lys Gly Phe Tyr

255

- 102 043940

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

260 265

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

275 280

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

290 295

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 305 310

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330 <210> 92 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> IgG1 CH1-CH2-CH3 LALA aa <400> 92

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 1 5 10

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

25

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

40

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

55

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 65 70

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

90

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

100 105

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

115 120

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

130 135

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 145 150

Gly Gln Pro Glu Asn 270

Asp Gly Ser Phe Phe

285

Trp Gln Gln Gly Asn 300

His Asn His Tyr Thr

320

Ala Pro Ser Ser Lys 15

Leu Val Lys Asp Tyr 30

Gly Ala Leu Thr Ser 45

Ser Gly Leu Tyr Ser 60

Leu Gly Thr Gln Thr

Thr Lys Val Asp Lys 95

Thr Cys Pro Pro Cys

110

Phe Leu Phe Pro Pro

125

Pro Glu Val Thr Cys 140

Val Lys Phe Asn Trp

160

- 103 043940

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

165 170

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

180 185

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

195 200

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

210 215

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

225 230

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

245 250

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

260 265

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

275 280

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

290 295

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

305 310

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330 <210> 93 <211> 107 <212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> IgG CK aa < 400> 93

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile 1 5 10

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val

25

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys

40

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu

55

Thr Lys Pro Arg Glu

175

Val Leu Thr Val Leu

190

Cys Lys Val Ser Asn

205

Ser Lys Ala Lys Gly 220

Pro Ser Arg Asp Glu

240

Val Lys Gly Phe Tyr

255

Gly Gln Pro Glu Asn 270

Asp Gly Ser Phe Phe 285

Trp Gln Gln Gly Asn 300

His Asn His Tyr Thr

320

Pro Pro Ser Asp Glu

Leu Leu Asn Asn Phe

Asp Asn Ala Leu Gln 45

Asp Ser Lys Asp Ser 60

- 104 043940

Thr Tyr Ser Leu 65

Ser Ser Thr Leu Thr

Leu Ser Lys Ala Asp 75

Tyr Glu 80

Lys His Lys Val

Tyr Ala Cys Glu Val 85

Thr His Gln Gly Leu 90

Ser Ser 95

Pro Val Thr Lys

100

Ser Phe Asn Arg Gly

105

Glu Cys <210> 94 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> IgG CL aa <400>94

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

5 1015

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 2530

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 35 4045

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 5560

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 7580

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 9095

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100105 <210>95 <211>990 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> IgG1 CH1-CH2-CH3 nucl <400> 95 gcgtcgacca ggcacagcgg tggaactcag ggactctact tacatctgca agggcccatc ccctgggctg gcgccctgac ccctcagcag acgtgaatca ggtcttcccc cctggtcaag cagcggcgtg cgtggtgacc caagcccagc ctggcaccct gactacttcc cacaccttcc gtgccctcca aacaccaagg cctccaagag ccgaacctgt cggctgtcct gcagcttggg tggacaagag cacctctggg gacggtctcg acagtcctca cacccagacc agttgagccc

120

180

240

300

- 105 043940

aaatcttgtg	acaaaactca	cacatgccca	ccgtgcccag	cacctgaact	cctgggggga	360
ccgtcagtct	tcctcttccc	cccaaaaccc	aaggacaccc	tcatgatctc	ccggacccct	420
gaggtcacat	gcgtggtggt	ggacgtgagc	cacgaagacc	ctgaggtcaa	gttcaactgg	480
tacgtggacg	gcgtggaggt	gcataatgcc	aagacaaagc	cgcgggagga	gcagtacaac	540
agcacgtacc	gtgtggtcag	cgtcctcacc	gtcctgcacc	aggactggct	gaatggcaag	600
gagtacaagt	gcaaggtctc	caacaaagcc	ctcccagccc	ccatcgagaa	aaccatctcc	660
aaagccaaag	ggcagccccg	agaaccacag	gtgtacaccc	tgcccccatc	ccgggaggag	720
atgaccaaga	accaggtcag	cctgacctgc	ctggtcaaag	gcttctatcc	cagcgacatc	780
gccgtggagt	gggagagcaa	tgggcagccg	gagaacaact	acaagaccac	gcctcccgtg	840
ctggactccg	acggctcctt	cttcctctat	agcaagctca	ccgtggacaa	gagcaggtgg	900
cagcagggga	acgtcttctc	atgctccgtg	atgcatgagg	ctctgcacaa	ccactacacg	960
cagaagagcc	tctccctgtc	cccgggtaaa				990

<210> 96
<211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 CH1-CH2-CH3 LALA nucl <400> 96 gcgtcgacca agggcccatc ggtcttcccc	ctggcaccct	cctccaagag	cacctctggg	60
ggcacagcgg	ccctgggctg	cctggtcaag	gactacttcc	ccgaacctgt	gacggtctcg	120
tggaactcag	gcgccctgac	cagcggcgtg	cacaccttcc	cggctgtcct	acagtcctca	180
ggactctact	ccctcagcag	cgtggtgacc	gtgccctcca	gcagcttggg	cacccagacc	240
tacatctgca	acgtgaatca	caagcccagc	aacaccaagg	tggacaagag	agttgagccc	300
aaatcttgtg	acaaaactca	cacatgccca	ccgtgcccag	cacctgaagc	cgcgggggga	360
ccgtcagtct	tcctcttccc	cccaaaaccc	aaggacaccc	tcatgatctc	ccggacccct	420
gaggtcacat	gcgtggtggt	ggacgtgagc	cacgaagacc	ctgaggtcaa	gttcaactgg	480
tacgtggacg	gcgtggaggt	gcataatgcc	aagacaaagc	cgcgggagga	gcagtacaac	540
agcacgtacc	gtgtggtcag	cgtcctcacc	gtcctgcacc	aggactggct	gaatggcaag	600
gagtacaagt	gcaaggtctc	caacaaagcc	ctcccagccc	ccatcgagaa	aaccatctcc	660
aaagccaaag	ggcagccccg	agaaccacag	gtgtacaccc	tgcccccatc	ccgggaggag	720
atgaccaaga	accaggtcag	cctgacctgc	ctggtcaaag	gcttctatcc	cagcgacatc	780
gccgtggagt	gggagagcaa	tgggcagccg	gagaacaact	acaagaccac	gcctcccgtg	840
ctggactccg	acggctcctt	cttcctctat	agcaagctca	ccgtggacaa	gagcaggtgg	900
cagcagggga	acgtcttctc	atgctccgtg	atgcatgagg	ctctgcacaa	ccactacacg	960
cagaagagcc	tctccctgtc	cccgggtaaa				990

<210> 97

- 106 043940 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> IgG CK nucl <400>97 cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag300 agcttcaaca ggggagagtg t321 <210>98 <211>318 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

<223> IgG	CL nucl
<400> 98 ggtcagccca	aggctgcccc	ctcggtcact	ctgttcccgc	cctcctctga	ggagcttcaa	60
gccaacaagg	ccacactggt	gtgtctcata	agtgacttct	acccgggagc	cgtgacagtg	120
gcttggaaag	cagatagcag	ccccgtcaag	gcgggagtgg	agaccaccac	accctccaaa	180
caaagcaaca	acaagtacgc	ggccagcagc	tatctgagcc	tgacgcctga	gcagtggaag	240
tcccacagaa	gctacagctg	ccaggtcacg	catgaaggga	gcaccgtgga	gaagacagtg	300
gcccctacag	aatgttca					318

< 210>99 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA3 CDRH1 < 400>99

Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr Ala <210>100 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA3 CDRH2 < 400> 100

Ile Gly Gly Lys Gly Asp Ser Ile

5

- 107 043940 <210> 101 <211> 16 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA3 CDRH3 < 400> 101

Val Lys Asp Leu Ala Val Leu Glu Ser Asp 1 5 10 <210> 102 <211> 123 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA3 VH < 400> 102

Glu Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly

5 10

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Gly Ser Gly

25

Ala Met Val Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly 35 40

Ser Gly Ile Gly Gly Lys Gly Asp Ser Ile

55

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 65 70

Leu Gln Met Ser Arg Leu Arg Thr Glu Asp

90

Val Lys Asp Leu Ala Val Leu Glu Ser Asp

100 105

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ile Val Ser

115 120

Leu Glu Val Asp Gln

Val Gln Pro Gly Gly

Ile Phe Ser Asn Tyr 30

Gly Leu Glu Tyr Val 45

His Ile Asp Ser Val 60

Lys Arg Thr Val Tyr 80

Ala Val Tyr Tyr Cys 95

Leu Glu Val Asp Gln

110 <210> 103 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA4 CDRH1 <400> 103

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Val 1 5

- 108 043940 <210> 104 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA4 CDRH2 < 400>104

Thr Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys < 210>105 < 211>20 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA4 CDRH3 <400>105

Ala Arg Gly Pro Val Pro Tyr

Trp Ser Gly Glu Ser Tyr Ser Gly Ala

1015

Tyr Phe Asp Phe <210>106 <211>127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA4 VH <400> 106

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

25

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro

40

Thr Val Thr Ser Tyr Asp Gly Ser Asn

55

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 65 70

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 30

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 45

Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 60

Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Gly Glu Asp

90

Thr Ala

Ile Tyr Tyr Cys 95

Ala Arg Gly Pro Val

100

Pro Tyr Trp Ser Gly

105

Glu Ser

Tyr Ser Gly Ala

110

- 109 043940

Tyr Phe Asp Phe Trp

115

Gly Gln Gly Ile Leu

120

Val Thr Val Ser Ser

125 <210> 107 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA5 CDRH1 <400>107

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Tyr 15 <210>108 <211>8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA5 CDRH2 <400>108

Met Ser Ser Ser Glu Thr Ile Lys 15 <210>109 <211>19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA5 CDRH3 <400>109

Ala Arg Ser Gly Ile Glu Thr Val Ala Gly Ser

510

Ile Asp Tyr Tyr Gly

Met Asp Val <210>110 <211>126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA5 VH <400> 110

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu 20

Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe 25

Thr Phe Ser Asn Tyr

Tyr Met Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro

Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val

- 110 043940

Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

Ser Tyr Met Ser Ser Ser Glu Thr Ile

55

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 65 70

Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp 85

Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys

95

Ala Arg Ser Gly Ile Glu Thr Val Ala 100 105

Met Asp Val Trp Gly His Gly Thr Pro

115 120

Gly Ser Ile Asp Tyr Tyr Gly

110

Val Thr Val Ser Ser

125 <210> 111 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA6 CDRH1 <400> 111

Asp Phe Thr Val Ser Asn Tyr Ala 1 5 <210> 112 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA6 CDRH2 <400> 112

Val Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

5 <210> 113 < 211> 19 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA6 CDRH3 < 400> 113

Ala Thr Gly Val Thr Met Phe Gln Gly Ala Gln 1 5 10

Thr Asn Ala Glu Tyr

Leu His Tyr <210> 114

- 111 043940 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA6 VH <400>114

Gln Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Asp Phe Thr Val Ser Asn Tyr 20 2530

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 4045

Ala Val Val Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 5560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 7580

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 9095

Ala Thr Gly Val Thr Met Phe Gln Gly Ala Gln Thr Asn Ala Glu Tyr

100 105110

Leu His Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Ile Ser Ser

115 120125 <210>115 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA7 CDRH1 <400>115

Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Gly 15 <210>116 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA7 CDRH2 < 400> 116

Val Ser Gly Asp Gly Ser Ser Thr

5 <210> 117

- 112 043940

Ser Leu Glu Ser Asp Phe

15 <211> 15 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA7 CDRH3 < 400>117

Val Lys Asp 1

Phe Trp Ser Gly Asp Gln 5 < 210>118 < 211>122 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA7 VH < 400>118

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ser

Ala

Ser 25

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser 30

Arg

Tyr

Gly

Met

Val 35

Trp

Ala

Arg

Gln

Ala 40

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Glu

Tyr

Leu

Ser

Gly 50

Val

Ser

Gly

Asp

Gly 55

Ser

Ser

Thr

Tyr

Tyr 60

Ala

Asn

Ser

Val

Lys 65

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile 70

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser 75

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr 80

Leu

His

Met

Ser

Arg 85

Leu

Arg

Asp

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr 95

Cys

Val

Lys

Asp

Phe 100

Trp

Ser

Gly

Asp

Gln 105

Ser

Leu

Glu

Ser

Asp 110

Phe

Trp

Gly

Gln

Gly 115

Ala

Leu

Val

Thr

Val 120

Ser

Ser

< 210>119 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA8 CDRH1 < 400> 119

Gly Phe Thr Phe Ser Ala His Ala 1 5 <210> 120

- 113 043940 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA8 CDRH2 < 400>120

Ile Ser Arg Asn Glu Asp Tyr Thr <210>121 <211>12 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA8 CDRH3 < 400>121

Val Lys Asp Phe Gly Thr Ser Pro Gln Thr Asp Phe

510 < 210>122 < 211>119 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA8 VH <400> 122

Asp 1

Glu

Arg

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu 20

Val

Cys

Ser

Ala

Ser 25

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser 30

Ala

His

Ala

Met

His 35

Trp

Val

Arg

Gln

Pro 40

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Glu

Tyr

Val

Ser

Thr 50

Ile

Ser

Arg

Asn

Glu 55

Asp

Tyr

Thr

Tyr

Tyr 60

Ala

Asp

Ser

Val

Lys 65

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile 70

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser 75

Lys

Asn

Ser

Leu

Tyr 80

Leu

Gln

Met

Arg

Arg 85

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Ile

Tyr

Tyr 95

Cys

Val

Lys

Asp

Phe 100

Gly

Thr

Ser

Pro

Gln 105

Thr

Asp

Phe

Trp

Gly 110

Gln

Gly

Thr

Leu

Val 115

Ala

Val

Ser

Ser

<210> 123

- 114 043940 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA76 CDRH1 <400>123

Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Phe 15 <210>124 <211>8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA76 CDRH2 <400>124

Ile Ser Ser Thr Gly Ser Tyr Lys 15 <210>125 <211>17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA76 CDRH3 <400> 125

Ala Arg Pro Phe His Ser Glu Tyr Thr Tyr Gly Leu Asp Ala Phe Asp

5 10 15

Ile

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

126 124 PRT Artificial Sequence ZKA76 VH 126

Glu Val 1

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Gly

Ser Leu

Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser 25

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser 30

Thr

Tyr

Phe Met

His 35

Trp

Val

Arg

Gln

Ala 40

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Val

Ala Ser 50

Ile

Ser

Ser

Thr

Gly 55

Ser

Tyr

Lys

Phe

Tyr 60

Ala

Asp

Ser

Val

- 115 043940

Lys 65

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile 70

Ser

Arg

Asp

Asn

Thr 75

Lys

Asn

Ser

Leu

Phe 80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser 85

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Phe

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Pro

Phe 100

His

Ser

Glu

Tyr

Thr 105

Tyr

Gly

Leu

Asp

Ala 110

Phe

Asp

Ile

Trp

Gly 115

Gln

Gly

Thr

Met

Leu 120

Thr

Val

Ser

Ser

<210> 127 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA117 CDRH1 <400>127

Gly Gly Ser Ile Arg Arg Thr Asn Ser Tyr 1 510 <210>128 <211>7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA117 CDRH2 <400>128

Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr <210>129 <211>17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA117 CDRH3 <400>129

Ala Arg Leu Asn Asp Gly Ser Thr Val

Thr Thr Ser Ser Tyr Phe Asp

1015

Tyr <210>130 <211>125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA117 VH

- 116 043940 <400> 130

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly

5 10

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly

25

Asn Ser Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Thr 35 40

Trp Ile Gly Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Ser

55

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp 65 70

Ser Leu Glu Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala

90

Cys Ala Arg Leu Asn Asp Gly Ser Thr Val

100 105

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

115 120

Val Lys Pro Ser Glu

Ser Ile Arg Arg Thr 30

Gly Lys Gly Leu Gln 45

Phe Tyr Asn Pro Ser 60

Ser Lys Asp His Phe 80

Thr Ala Ile Tyr Tyr 95

Thr Ser Ser Tyr Phe 110

Ser Ser

125 <210> 131 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB27 CDRH1 <400> 131

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Ser Trp 1 5 <210> 132 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB27 CDRH2 <400> 132

Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr 1 5 <210> 133 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKB27 CDRH3

- 117 043940 <400> 133

Ala Arg His Asp Tyr Ser Val

Ser Glu Asn Gly Met Asp Val 10 <210> 134 <211> 121 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB27 VH < 400> 134

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 1 5

Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Ala 20

Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Ser 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Met

40

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ser Asp Ser

55

Tyr Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Phe 60

Gln Gly His Val Thr Ile Ser Val 65 70

Asp Lys Ser Ile Gly Thr Ala Tyr

80

Leu Gln Trp Asn Ser Leu Arg Ala 85

Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

95

Ala Arg His Asp Tyr Ser Val Ser

100

Glu Asn Gly Met Asp Val Trp Gly

105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115120 <210>135 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB29 CDRH1 < 400>135

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr 15 < 210>136 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKB29 CDRH2

- 118 043940 <400>136

Ile Ser Tyr Asp Gly Ser His Lys < 210>137 < 211>12 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB29 CDRH3 < 400>137

Ala Arg Arg Ser Tyr Ser Ile Ser Cys Phe Asp Tyr

510 <210>138 <211>119 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB29 VH < 400> 138

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

5

Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala

40

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser

55

His Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70

Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr

80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 85

Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

95

Ala Arg Arg Ser Tyr Ser Ile Ser

100

Cys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

105 110

Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser

115 <210> 139 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKB34 CDRH1

- 119 043940 <400> 139

Gly Phe Thr Phe Ser Arg Ser Gly 1 5 <210> 140 <211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB34 CDRH2 <400> 140

Val Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

5 <210> 141 <211> 19 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB34 CDRH3 <400> 141

Ala Lys Asp Leu Thr Met Val Arg Gly Val 1 5 10

Met Asp Val <210> 142 <211> 126 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB34 VH < 400> 142

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

5 10

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

25

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

40

Ala Val Val Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

55

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 65 70

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp

Tyr Tyr Tyr Tyr Val

Val Gln Pro Gly Arg

Thr Phe Ser Arg Ser 30

Gly Leu Glu Trp Val 45

Tyr Ser Asp Ser Val 60

Lys Asn Thr Leu Tyr 80

Ala Val Tyr Tyr Cys

- 120 043940

His Tyr Tyr Tyr Tyr Val

110

Ala Lys Asp Leu Thr Met Val Arg Gly Val

100 105

Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

115 120

Thr Val Ser Ser

125 <210> 143 <211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB39 CDRH1 <400> 143

Gly Tyr Thr Phe Asp Asp Tyr Tyr 1 5 <210> 144 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB39 CDRH2 <400> 144

Ile Asn Pro His Arg Gly Gly Thr 1 5 <210> 145 <211> 23 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB39 CDRH3 <400> 145

Val Arg Asp Gln Tyr Cys Asp Gly Gly Asn Cys 1 5 10

Tyr Gly Ile His Gln

Pro His Tyr Gly Met Asp Val <210> 146 <211> 130 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB39 VH < 400> 146

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu 1 5 10

Val Lys

Lys Pro Gly Ala 15

- 121 043940

Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala 20

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala 3540

Gly Arg Ile Asn Pro His Arg Gly 5055

Ser Gly Tyr Thr Phe Asp Asp Tyr 2530

Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu 45

Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 60

Gln 65

Met

Val

Pro

Gly Arg Val Ile Met 70

Glu Leu Arg Arg Ile 85

Arg Asp Gln Tyr Cys 100

His Tyr Gly Met Asp

115

Thr Leu Asp Met Ser Ile Ser Thr Thr Tyr 75 80

Thr Ser Asp Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys

95

Asp Gly Gly Asn Cys Tyr Gly Ile His Gln

105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

120 125

Ser Ser

130 <210> 147 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB46 CDRH1 < 400>147

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp 15 < 210>148 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB46 CDRH2 < 400>148

Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr 15 < 210>149 < 211>17 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKB46 CDRH3 < 400>149

- 122 043940

Ala Arg Arg Glu Tyr Ser Ser Ser Ser Gly 1 5 10

Pro <210> 150 <211> 124 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB46 VH < 400> 150

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

5 10

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly

25

Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly

40

Gly Arg Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr

55

Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys 65 70

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp

90

Ala Arg Arg Glu Tyr Ser Ser Ser Ser Gly

100 105

Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120

Glu Asp Trp Phe Asp

Lys Lys Pro Gly Glu 15

Ser Phe Thr Ser Tyr 30

Gly Leu Glu Trp Met 45

Tyr Ser Pro Ser Phe 60

Ile Ser Thr Ala Tyr 80

Ala Met Tyr Tyr Cys

Glu Asp Trp Phe Asp

110

Ser <210> 151 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB53 CDRH1 <400> 151

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 152 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence

- 123 043940 <220>

<223> ZKB53 CDRH2 <400>152

Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Arg < 210>153 < 211>15 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB53 CDRH3 < 400> 153

Ala Arg His Val Glu Gln Leu Pro

Ser Ser Gly Tyr Phe Gln His

15 < 210>154 < 211>122 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

<223>

ZKB53 VH

<400>

154

Gln 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Val

Val

Gln

Pro

Gly 15

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser 25

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser 30

Ser

Tyr

Ala

Met

His 35

Trp

Val

Arg

Gln

Thr 40

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Val

Thr

Val 50

Ile

Ser

Tyr

Asp

Gly 55

Ser

Asn

Arg

Tyr

Tyr 60

Ala

Asp

Ser

Val

Lys 65

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile 70

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser 75

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr 80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser 85

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

His

Val 100

Glu

Gln

Leu

Pro

Ser 105

Ser

Gly

Tyr

Phe

Gln 110

His

Trp

Gly

Gln

Gly 115

Thr

Leu

Val

Thr

Val 120

Ser

Ser

< 210>155 < 211>8 < 212> PRT <213> Artificial Sequence

- 124 043940 <220>

<223> ZKC26 CDRH1 <400>155

Gly Phe Ile Phe Ser Asp Phe Tyr <210>156 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKC26 CDRH2 < 400>156

Ile Gly His Asp Gly Ser Tyr Ile < 210>157 < 211>9 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKC26 CDRH3 < 400>157

Ala Arg Ala His Gly Gly Phe Arg His 15 < 210>158 < 211>116 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKC26 VH < 400> 158

Gln 1

Val

Gln

Val

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser 25

Gly

Phe

Ile

Phe

Ser 30

Asp

Phe

Tyr

Met

Ser 35

Trp

Met

Arg

Gln

Ala 40

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Val

Ala

Tyr 50

Ile

Gly

His

Asp

Gly 55

Ser

Tyr

Ile

Leu

Tyr 60

Ala

Asp

Ser

Val

Lys 65

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile 70

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala 75

Lys

Asn

Ser

Leu

Phe 80

Leu

Arg

Met

Asn

Ser 85

Leu

Arg

Val

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

- 125 043940

Ala Arg Ala His Gly Gly Phe Arg His

100105

Ala Val Ser Pro

115 <210>159 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKD5 CDRH1 <400>159

Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr Gly 15 <210>160 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKD5 CDRH2 <400>160

Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys 15 <210>161 <211>17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKD5 CDRH3 <400>161

Ala Arg Asp Arg Asp His Tyr Asp Leu 15

Trp Gly Gln Gly Thr Val Val

110

Trp Asn Ala Tyr Thr Phe Asp

15

Tyr <210>162 <211>124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKD5 VH <400> 162

Gln Val Gln Leu 1

Val Glu Ser Gly 5

Gly Gly Val Val 10

Gln Pro Gly Arg 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr

- 126 043940

Gly Leu Asp Trp Val

25

Gly Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly

40

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

55

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 65 70

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Ala Asp

90

Ala Arg Asp Arg Asp His Tyr Asp Leu Trp

100 105

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 <210> 163 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKD7 CDRH1 <400> 163

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala 1 5 <210> 164 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKD7 CDRH2 < 400> 164

Ile Ser Tyr Asp Val Ser Asp Lys

5 <210> 165 <211> 20 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKD7 CDRH3 <400> 165

Ala Gly Gly Pro Leu Gly Val Val Val Ile 1 5 10

Tyr Ala Asp Ser Val 60

Lys Asp Thr Leu Tyr 80

Ala Leu Tyr Tyr Cys 95

Ala Tyr Thr Phe Asp 110

Ser

Pro Ser Asn Ala Glu

His Phe His His

- 127 043940 <210> 166 < 211> 127 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKD7 VH < 400>166

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val 1 510

Gln Pro Gly Arg

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 2530

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 4045

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Val Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 5560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 7580

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys 85 9095

Ala Gly Gly Pro Leu Gly Val Val Val Ile Lys Pro Ser Asn Ala Glu

100 105110

His Phe His His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120125 < 210>167 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKD8 CDRH1 < 400>167

Gly Phe Thr Phe Ile Asn Tyr Ala 15 < 210>168 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKD8 CDRH2 < 400> 168

Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

- 128 043940 < 210> 169 < 211> 16 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKD8 CDRH3 < 400>169

Ala Thr Asp Ala Asp Ala Tyr Gly Asp 15

Ser Gly Ala Asn Phe His Tyr

15 < 210>170 < 211>123 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence < 220>

< 223> ZKD8 VH < 400>170

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys

5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Asn Tyr 20 2530

Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 4045

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Thr Asp Ser Val 50 5560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 7580

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095

Ala Thr Asp Ala Asp Ala Tyr Gly Asp Ser Gly Ala Asn Phe His Tyr

100 105110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115120 < 210>171 < 211>10 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKD15 CDRH1 < 400> 171

Asp Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Phe Ser

- 129 043940

5 10 <210> 172 < 211> 7 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKD15 CDRH2 <400> 172

Ile Tyr Ser Ser Gly Asp Thr

5 <210> 173 <211> 18 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKD15 CDRH3 <400> 173

Ala Arg Ala His Thr Pro Thr Ser Lys Phe 1 5 10

Asp Val <210> 174 <211> 126 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKD15 VH < 400> 174

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ser Gly

5 10

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Asp

25

Gly Phe Ser Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro

40

Trp Leu Gly Tyr Ile Tyr Ser Ser Gly Asp

55

Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Ser Val Asp 65 70

Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala 85 90

Cys Ala Arg Ala His Thr Pro Thr Ser Lys

Tyr Tyr Tyr Ala Met 15

Val Lys Pro Ser Gln

Ser Ile Ser Ser Gly 30

Gly Lys Gly Leu Glu 45

Phe Tyr Asn Pro Ser 60

Phe Arg Ser Gln Phe 80

Thr Ala Met Tyr Tyr 95

Tyr Tyr Tyr Tyr Ala

- 130 043940

Thr Val Ser Ser

125

100

105

110

Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

115 120 <210> 175 <211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKD16 CDRH1 <400> 175

Gly Phe Thr Phe Ser Asp His Phe 1 5 <210> 176 <211> 10 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKD16 CDRH2 < 400> 176

Ser Arg Asn Lys Pro Asn Ser Tyr Thr Thr

5 10 <210> 177 <211> 17 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKD16 CDRH3 < 400> 177

Ala Lys Val Gly Gly Cys Tyr Gly Gly Asp Cys

5 10

His Val Glu Asn Asp

Tyr <210> 178 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKD16 VH <400> 178

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val 1 5 10

Gln Pro Gly Gly

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser 20 25

Gly Phe Thr Phe Ser Asp His 30

- 131 043940

Phe Met Asp Trp Val Arg Gln Ala

40

Pro Gly Lys Gly

Leu Glu Trp Val 45

Gly Arg Ser Arg Asn Lys Pro Asn

55

Ser Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile 65 70

Ser Tyr Thr Thr 60

Ser Arg Asp Asp 75

Glu Tyr Ala Ala

Ser Lys Lys Ala 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Gln Thr

90

Glu Asp

Thr

Ala Val Tyr 95

Tyr Cys Ala Lys Val Gly Gly Cys Tyr Gly

100 105

Gly Asp

Cys

His Val Glu 110

Asn Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

115 120

Thr Val

Ser

125

Ser <210> 179 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKD17 CDRH1 < 400>179

Gly Phe Ile Phe Ser Asp Tyr Ala 15 < 210>180 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKD17 CDRH2 < 400>180

Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Arg <210>181 <211>20 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKD17 CDRH3 <400> 181

Ala Arg Gly Tyr Cys Ser Ser Gly Thr Cys 1 5 10

Phe Ser Thr Asn Ala Glu

Tyr Phe His Pro 20

- 132 043940 < 210> 182 < 211> 127 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKD17 VH < 400>182

Gln Val Gln Met Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Thr 1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asp Tyr 20 2530

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 4045

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Arg Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 5560

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 7580

Leu Gln Met His Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095

Ala Arg Gly Tyr Cys Ser Ser Gly Thr Cys Phe Ser Thr Asn Ala Glu

100 105110

Tyr Phe His Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ala Thr Ile Ser Ser

115 120125 < 210>183 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKD20 CDRH1 < 400>183

Gly Phe Thr Phe Ser Asp His Phe 15 < 210>184 < 211>10 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKD20 CDRH2 < 400> 184

Ser Arg Asn Lys Pro Asn Ser Tyr Thr Thr

5 10

- 133 043940 <210> 185 <211> 17 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKD20 CDRH3 <400> 185

Ala Arg Val Gly Gly Cys Asn Gly Gly Asp 1 5 10

Tyr <210> 186 <211> 126 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKD20 VH < 400> 186

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

5 10

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly

25

Phe Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

40

Gly Arg Ser Arg Asn Lys Pro Asn Ser Tyr

55

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Gln Thr

90

Tyr Cys Ala Arg Val Gly Gly Cys Asn Gly

100 105

Asn Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

115 120

His Val Glu Asn Asp

Val Gln Pro Gly Gly

Thr Phe Ser Asp His 30

Gly Leu Glu Trp Val 45

Thr Glu Tyr Ala Ala 60

Asp Ser Lys Asn Ser 80

Asp Thr Ala Val Tyr 95

Asp Cys His Val Glu 110

Val Ser Ser

125 <210> 187 <211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA134 CDRH1 <400> 187

- 134 043940

Gly Gly Thr Phe Ser Ala Tyr Ala 1 5 <210> 188 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA134 CDRH2 <400> 188

Ile Ile Pro Phe Phe Gly Thr Ala 1 5 <210> 189 <211> 19 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA134 CDRH3 <400> 189

Ala Arg Ser Asp Ile Val Ser Thr Thr Arg

5 10

Met Asp Val <210> 190 <211> 126 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA134 VH < 400> 190

Gln Val His Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

5 10

Ser Val Asn Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly

25

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 35 40

Gly Gly Ile Ile Pro Phe Phe Gly Thr Ala 50 55

Lys Gly Arg Val Thr Val Thr Ala Asp Lys 65 70

Met Glu Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp 85 90

Tyr His His Tyr Gly

Lys Lys Pro Gly Ser

Thr Phe Ser Ala Tyr 30

Gly Leu Glu Trp Met 45

Tyr Ala Gln Lys Phe 60

Thr Ser Thr Val Tyr 80

Ala Val Tyr Tyr Cys 95

- 135 043940

Ala Arg Ser Asp Ile Val Ser

100

Thr Thr

105

Arg Gly Tyr His His Tyr Gly

110

Met Asp Val

115

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

120

Thr Val Ser Ser

125 <210> 191 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA246 CDRH1 <400>191

Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr 15 <210>192 <211>8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA246 CDRH2 <400>192

Ile Asn Pro Tyr Ser Gly Gly Thr <210>193 <211>14 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA246 CDRH3 <400> 193

Ala Arg Gly Phe Thr Met Ile

Ser Asp Arg Glu Phe Asp Pro <210> 194 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA246 VH <400> 194

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val

Ser Cys

Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro

Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

- 136 043940

Gly Arg Ile Asn Pro Tyr 50

Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 55 60

His Gly Arg Val Thr Val 65 70

Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Val Tyr

80

Met Glu Leu Arg Gly Leu 85

Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

95

Ala Arg Gly Phe Thr Met

100

Ile Ser Asp Arg Glu Phe Asp Pro Trp Gly

105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 <210> 195 <211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA256 CDRH1 <400> 195

Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Trp 1 5 <210> 196 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA256 CDRH2 <400> 196

Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys

5 <210> 197 <211> 20 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA256 CDRH3 <400> 197

Ala Arg Asp Pro Gly Tyr Asp Asp Phe Trp Ser Gly Ser Tyr Ser Gly

5 10 15

Ser Phe Asp Ile 20 <210> 198

- 137 043940 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA256 VH <400>198

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 2530

Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 4045

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 5560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 7580

Leu Gln Val Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 9095

Ala Arg Asp Pro Gly Tyr Asp Asp Phe Trp Ser Gly Ser Tyr Ser Gly

100 105110

Ser Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120125 <210>199 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB42 CDRH1 < 400>199

Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Gly 15 < 210>200 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKB42 CDRH2 <400> 200

Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Lys Lys 1 5 <210> 201

- 138 043940 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKB42 CDRH3 <400>201

Val Lys Tyr Gly Glu Arg Ile Asn Gly Tyr 1 510 <210>202 <211>123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKB42 VH <400>202

Gln Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly

510

Ser Leu Arg Leu Phe Cys Ala Ala Ser Gly

2025

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

3540

Ala Leu Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Lys Lys

5055

Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn 6570

Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ser Gly Asp

8590

Val Lys Tyr Gly Glu Arg Ile Asn Gly Tyr

100105

Asp	Pro	Phe	Asp 15	His
Val	Gln	Pro	Gly 15	Arg
Thr	Phe	Asn 30	Asn	Tyr
Gly	Leu 45	Glu	Trp	Val
Tyr 60	Ala	Asp	Ser	Val
Lys	Asn	Thr	Leu	Tyr 80
Ala	Val	Tyr	His 95	Cys
Asp	Pro	Phe 110	Asp	His

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115120 <210>203 <211>8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKB85 CDRH1 <400> 203

Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Ala 1 5 <210> 204

- 139 043940 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB85 CDRH2 < 400>204

Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro <210>205 <211>11 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB85 CDRH3 < 400>205

Ala Arg Val Ile Val Pro Tyr Ala Phe Asp Ile

510 < 210>206 < 211>118 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB85 VH < 400> 206

Gln 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Gln

Ser

Gly

Ser

Glu 10

Leu

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val 20

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser 25

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr 30

Thr

Tyr

Ala

Met

Asn 35

Trp

Val

Arg

Gln

Ala 40

Pro

Gly

Gln

Gly

Pro 45

Glu

Trp

Val

Gly

Trp 50

Ile

Asn

Thr

Asn

Thr 55

Gly

Asn

Pro

Thr

Tyr 60

Ala

Gln

Gly

Phe

Thr 65

Gly

Arg

Phe

Val

Leu 70

Ser

Leu

Asp

Thr

Ser 75

Val

Ser

Thr

Ala

Phe 80

Leu

Gln

Ile

Ser

Ser 85

Leu

Lys

Ala

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Val

Ile 100

Val

Pro

Tyr

Ala

Phe 105

Asp

Ile

Trp

Gly

Gln 110

Gly

Thr

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 <210> 207

- 140 043940 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB47 CDRH1 <400> 207

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr 1 5 <210> 208 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB47 CDRH2 <400> 208

Ile Asn Pro Ser Gly Gly Pro Thr 1 5 <210> 209 <211> 15 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB47 CDRH3 <400> 209

Ala Arg Asp Gln Tyr Gly Gly Tyr Ala Arg

5 10 <210> 210 <211> 122 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB47 VH < 400> 210

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

5 10

Ser Val Lys Val Ser Cys Gln Ala Ser Gly

25

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

40

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Pro Thr 50 55

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr 65 70

Gly Met Asp Val

Lys Lys Pro Gly Ala

Thr Phe Thr Asn Tyr 30

Gly Leu Glu Trp Met 45

Tyr Ala Gln Lys Phe 60

Thr Ser Thr Val Tyr 80

- 141 043940

Met Glu Leu Ser

Ser Leu Arg Ser Glu 85

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

95

Ala Arg Asp Gln

100

Tyr Gly Gly Tyr Ala

105

Arg Tyr Gly Met Asp Val Trp

110

Gly Gln Gly Thr

115

Thr Val Thr Val Ser Ser

120 <210> 211 <211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKC6 CDRH1 <400> 211

Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr 1 5 <210> 212 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKC6 CDRH2 < 400> 212

Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr 1 5 <210> 213 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKC6 CDRH3 <400> 213

Ala Arg Val Ser Asp Trp Gly Phe Ala Phe Asp Ile

5 10 <210> 214 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKC6 VH <400> 214

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val

5 10

Lys Lys Pro Gly Ala 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

- 142 043940

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln

40

Gly Leu Glu 45

Trp Met

Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn

55

Tyr Ala Gln 60

Lys Phe

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser 65 70 75

Ile Ser Thr

Ala Tyr 80

Met Glu Leu

Ser Gly Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val

90

Tyr Tyr Cys 95

Ala Arg Val

Ser Asp Trp Gly Phe Ala Phe Asp Ile Trp 100 105

Gly Gln Gly 110

Thr Met Val Thr Val Ser Gln

115 <210> 215 <211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA160 CDRH1 <400> 215

Gly Gly Ser Ile Thr Ser Tyr Ser 1 5 <210> 216 < 211> 7 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA160 CDRH2 < 400> 216

Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr

5 <210> 217 <211> 15 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA160 CDRH3 < 400> 217

Ala Arg Asp Gln Thr Met Pro Val

Trp Val Gly Gly Met Asp Val

15 <210> 218

- 143 043940 <211> 121 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA160 VH < 400> 218

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly

5 10

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly

25

Ser Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly

40

Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Asp

55

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser 65 70

Arg Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr 85 90

Arg Asp Gln Thr Met Pro Val Trp Val Gly

100 105

Val Lys Pro Ser Glu

Ser Ile Thr Ser Tyr 30

Gly Leu Glu Trp Ile 45

Asn Pro Ser Leu Lys 60

Asp Gln Phe Ser Leu 80

Val Tyr Tyr Cys Ala

Met Asp Val Trp Gly 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 <210> 219 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA172 CDRH1 <400> 219

Gly Tyr Ile Phe Thr Arg Tyr Trp 1 5 <210> 220 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA172 CDRH2 <400> 220

Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr 1 5 <210> 221

- 144 043940 <211> 13 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA172 CDRH3 < 400>221

Ala Arg Gln Glu Thr Ala Arg Glu Asp Gly Met Ala Val 1 510 < 210>222 < 211>120 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA172 VH <400>222

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Gln

Ser

Gly

Ala

Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Lys

Ser

Leu

Arg

Ile 20

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser 25

Gly

Tyr

Ile

Phe

Thr 30

Arg

Tyr

Trp

Ile

Ser 35

Trp

Val

Arg

Gln

Met 40

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Met

Gly

Arg 50

Ile

Asp

Pro

Ser

Asp 55

Ser

Tyr

Thr

Asn

Tyr 60

Ser

Pro

Ser

Phe

Gln 65

Gly

His

Val

Thr

Ile 70

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser 75

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr 80

Leu

Gln

Trp

Ser

Ser 85

Leu

Lys

Ala

Ser

Asp 90

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Gln

Glu 100

Thr

Ala

Arg

Glu

Asp 105

Gly

Met

Ala

Val

Trp 110

Gly

Gln

Gly

Thr

Thr 115

Val

Thr

Val

Ser

Ser 120

<210>223 <211>10 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA174 CDRH1 < 400> 223

Gly Gly Ser Met Ser Asn Ser Tyr Tyr His

5 10 <210> 224

- 145 043940 < 211> 7 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA174 CDRH2 < 400>224

Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr < 210>225 < 211>18 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA174 CDRH3 <400>225

Ala Arg Asn Pro Val Phe Asn Pro Leu 15

Thr Leu Thr His Asp Ala Phe

15

Asp Ile <210>226 <211>126 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA174 VH < 400>226

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

5 1015

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Met Ser Asn Ser 20 2530

Tyr Tyr His Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 4045

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 5560

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 7580

Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 9095

Cys Ala Arg Asn Pro Val Phe Asn Pro Leu Thr Leu Thr His Asp Ala

100 105110

Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

- 146 043940

115 120125 < 210>227 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA189 CDRH1 < 400>227

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala < 210>228 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA189 CDRH2 < 400>228

Ile Ser Gly Ser Gly Asp Asn Thr < 210>229 < 211>18 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA189 CDRH3 < 400> 229

Ala Lys Trp Pro Tyr Tyr Asp Phe

Trp Ser Gly Ser Glu Ser Tyr Phe

15

Asp Pro < 210> 230 < 211> 125 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA189 VH <400>230

Gly Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Lys

5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 2530

Ala Leu Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val 35 4045

- 147 043940

Ser Ala Ile Ser

Lys Gly Arg Phe 65

Leu Gln Met Asn

Ala Lys Trp Pro

100

Asp Pro Trp Gly

115

Gly	Ser	Gly 55	Asp	Asn	Thr	Tyr	Tyr 60	Ala	Asp	Ser	Val
Thr	Ile 70	Ser	Arg	Asp	Asn	Ser 75	Lys	Asn	Thr	Leu	Tyr 80
Ser 85	Leu	Arg	Ala	Glu	Asp 90	Thr	Ala	Val	Tyr	Tyr 95	Cys
Tyr	Tyr	Asp	Phe	Trp 105	Ser	Gly	Ser	Glu	Ser 110	Tyr	Phe
Gln	Gly	Thr	Leu 120	Val	Thr	Val	Ser	Ser 125

<210> 231 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA195 CDRH1 <400>231

Gly Tyr Asn Phe Pro Ser Tyr Trp 15 <210>232 <211>8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA195 CDRH2 <400>232

Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr 15 <210>233 <211>15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA195 CDRH3 <400>233

Ala Arg Ala Asp Cys Arg Ser Thr Ser Cys 1 510

Tyr Leu Val Phe Glu <210>234 <211>121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA195 VH

- 148 043940 <400>234

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

5 1015

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Asp Ser Gly Tyr Asn Phe Pro Ser Tyr 20 2530

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 4045

Gly Thr Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe 50 5560

Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 7580

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 9095

Ala Arg Ala Asp Cys Arg Ser Thr Ser Cys Tyr Leu Val Phe Glu Gly

100 105110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115120 <210>235 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA215 CDRH1 <400>235

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 15 < 210>236 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA215 CDRH2 < 400>236

Ile Asp Pro Ser Asp Ser His Thr <210>237 <211>11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA215 CDRH3

- 149 043940 <400> 237

Ala Arg His Ala Leu Pro Asn Tyr Phe Asp 1 5 10 <210> 238 <211> 118 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA215 VH < 400> 238

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

5 10

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly

25

Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly

40

Gly Arg Ile Asp Pro Ser Asp Ser His Thr

55

Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys 65 70

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp

90

Ala Arg His Ala Leu Pro Asn Tyr Phe Asp

100 105

Lys Lys Pro Gly Glu 15

Thr Phe Thr Ser Tyr 30

Gly Leu Glu Trp Met 45

Tyr Ser Pro Ser Phe 60

Ile Ser Ala Ala Tyr

Ala Met Tyr Tyr Cys 95

Trp Gly Gln Gly Thr 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115 <210> 239 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA218 CDRH1 <400> 239

Gly Phe Pro Phe Ser Ser Tyr Trp 1 5 <210> 240 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKA218 CDRH2

- 150 043940 <400>240

Ile Asn Ser Asp Gly Arg Asn Thr < 210>241 < 211>15 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKA218 CDRH3 < 400> 241

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Tyr Asp

Ser Ser Gly Cys Phe Asp Tyr

15 < 210> 242 < 211> 122 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence < 220>

< 223> ZKA218 VH < 400>242

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Ser Tyr 20 2530

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 4045

Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Arg Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 5560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr 65 70 7580

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Tyr Asp Ser Ser Gly Cys Phe Asp Tyr Trp

100 105110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115120 < 210>243 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB75 CDRH1

- 151 043940 <400> 243

Gly Phe 1	Thr Phe Ser Asn Tyr	Ala
5
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Ile Ser 1 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Ala Lys	244 8 PRT Artificial Sequence ZKB75 CDRH2 244 Gly Thr Gly Gly Ser 5 245 25 PRT Artificial Sequence ZKB75 CDRH3 245 Asp Ser Ala Ser Arg	Thr Gly	Gly	Tyr
1 Tyr Leu	5 Asn Pro Gly His His	Asp	Tyr	10
<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Glu Val	20 246 132 PRT Artificial Sequence ZKB75 VH 246 Gln Val Leu Glu Ser	Gly	25 Gly	Gly
1 Ser Leu	5 Arg Leu Ser Cys Ala	Ala	Ser	10 Gly
Ala Met	20 Ser Trp Val Arg Gln	Ala	25 Pro	Gly
Ser Thr	35 Ile Ser Gly Thr Gly	40 Gly	Ser	Thr
50 Lys Gly	55 Arg Phe Thr Ile Ser	Arg	Asp	Asn
65 Leu Gln	70 Met Asn Ser Leu Arg	Ala	Glu	Asp

Ser Gly Gly Val Cys

Leu Gln Pro Gly Gly

Thr Phe Ser Asn Tyr 30

Gly Leu Glu Trp Val 45

Tyr Ala Asp Ser Val 60

Lys Asn Thr Leu Tyr 80

Ala Val Tyr Tyr Cys

- 152 043940

Ala Lys Asp Ser Ala Ser Arg Gly Gly Tyr Cys Ser Gly Gly Val Cys

100 105110

Tyr Leu Asn Pro Gly His His Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

115 120125

Thr Val Ser Ser

130 <210>247 <211>8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKB83 CDRH1 <400>247

Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp 15 <210>248 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKB83 CDRH2 <400>248

Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr 15 <210>249 <211>27 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB83 CDRH3 <400>249

Ala Arg Leu Arg Gly Ser Leu Tyr Cys 15

Ser Gly Gly Arg Cys Tyr Ser

15

Val Pro Gly Glu Thr Pro Asn Trp Phe Asp Pro

2025 < 210>250 < 211>134 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKB83 VH < 400> 250

- 153 043940

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 1015

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 2530

Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 4045

Gly Ser Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe 50 5560

Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Trp Ser Ile Asn Thr Ala Tyr 65 70 7580

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Lys Tyr Tyr Cys 85 9095

Ala Arg Leu Arg Gly Ser Leu Tyr Cys Ser Gly Gly Arg Cys Tyr Ser

100 105110

Val Pro Gly Glu Thr Pro Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr

115 120125

Leu Val Thr Val Ser Ser

130 <210>251 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKC3 CDRH1 < 400>251

Gly Gly Ser Ile Thr Ser Tyr Tyr 15 < 210>252 < 211>7 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKC3 CDRH2 < 400>252

Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr <210>253 <211>15 <212> PRT <213> Artificial Sequence

- 154 043940 <220>

<223> ZKC3 CDRH3 <400> 253

Ala Arg Val 1

Gly Gly Ala Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met

10

Asp Val <210> 254 <211> 121 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKC3 VH < 400> 254

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly 1 5

Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val 20

Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Tyr 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro

40

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 45

Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser

55

Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp 65 70

Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala 85

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

95

Arg Val Gly Gly Ala Pro Tyr Tyr

100

Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly

105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115120 <210>255 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

<223> ZKC18 CDRH1 <400>255

Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr Ala 15 <210>256 <211>10 <212> PRT <213> Artificial Sequence

- 155 043940 <220>

<223> ZKC18 CDRH2 <400>256

Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr

510 < 210>257 < 211>13 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKC18 CDRH3 < 400>257

Ser Arg Asp His Thr Gly Thr Thr Tyr Ala Phe Asp 1 510

Ile < 210>258 < 211>122 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKC18 VH < 400> 258

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 1 5

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala 20

Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr 25 30

Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala

40

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 45

Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr

55

Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 65 70

Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile

80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 85

Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

95

Tyr Cys Ser Arg Asp His Thr Gly

100

Thr Thr Tyr Ala Phe Asp Ile Trp

105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Gln

115120 < 210>259 < 211>8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence

- 156 043940 <220>

<223> ZKD1 CDRH1 <400> 259

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly 1 5 <210> 260 < 211> 8 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKD1 CDRH2 < 400> 260

Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

5 <210> 261 < 211> 19 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZKD1 CDRH3 < 400> 261

Ala Arg Asp Arg Arg Gly Tyr Gly Asp 1 5

Tyr Val Gly Tyr Tyr Tyr Gly

15

Met Asp Val <210> 262 <211> 126 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence < 220>

< 223> ZKD1 VH < 400> 262

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

55

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 65 70

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 75 80

- 157 043940

Leu Gln Met Asn Ser

Ala Arg Asp Arg Arg

100

Met Asp Val Trp Gly 115

Leu	Arg	Ala	Glu	Asp 90	Thr	Ala	Val
Gly	Tyr	Gly	Asp 105	Tyr	Val	Gly	Tyr
Gln	Gly	Thr 120	Thr	Val	Thr	Val	Ser 125

Tyr Tyr Cys 95

Tyr Tyr Gly 110

Ser

<210>	263
<211>	95
<212>	PRT
<213>	Zika virus

<220> <221> <222> <223>		naturally	occurring	amino	acid
misc_feature
(9)..(9)
Xaa can be any
<220> <221> <222> <223>	misc_feature (13) . . (14) Xaa can be any	naturally	occurring	amino	acid
<220> <221> <222> <223>	misc_feature (22).. (22) Xaa can be any	naturally	occurring	amino	acid
<220> <221> <222> <223>	misc_feature (25) . . (25) Xaa can be any	naturally	occurring	amino	acid
<220> <221> <222> <223>	misc_feature (27) . . (27) Xaa can be any	naturally	occurring	amino	acid
<220> <221> <222> <223>	misc_feature (33) .. (33) Xaa can be any	naturally	occurring	amino	acid
<220> <221> <222> <223>	misc_feature (35) .. (35) Xaa can be any	naturally	occurring	amino	acid
<220> <221> <222> <223>	misc_feature (41) .. (41) Xaa can be any	naturally	occurring	amino	acid
<220> <221> <222> <223>	misc_feature (60)..(60) Xaa can be any	naturally	occurring	amino	acid
<220> <221> <222> <223>	misc_feature (83)..(83) Xaa can be any	naturally	occurring	amino	acid

<220>

- 158 043940 < 221> misc_feature < 222> (85) .. (85) < 223> Xaa can be any naturally occurring amino acid < 400>263

Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Xaa Pro Ala Glu Xaa Xaa His Gly

5 1015

Thr Val Thr Val Glu Xaa Gln Tyr Xaa Gly Xaa Asp Gly Pro Cys Lys 20 2530

Xaa Pro Xaa Gln Met Ala Val Asp Xaa Gln Thr Leu Thr Pro Val Gly 35 4045

Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr Glu Xaa Thr Glu Asn Ser 50 5560

Lys Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val 65 70 7580

Ile Gly Xaa Gly Xaa Lys Lys Ile Thr His His Trp His Arg Ser

9095 < 210>264 < 211>95 < 212> PRT < 213> Zika virus < 400>264

Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu Thr Leu His Gly

5 1015

Thr Val Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys

2530

Val Pro Ala Gln Met Ala Val Asp Met Gln Thr Leu Thr Pro Val Gly

4045

Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr Glu Ser Thr Glu Asn Ser 50 5560

Lys Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val 65 70 7580

Ile Gly Val Gly Glu Lys Lys Ile Thr His His Trp His Arg Ser

9095 < 210>265 < 211>104 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZIKV EDIII generic

- 159 043940

misc_feature (1)..(1) X may be any or E	(naturally	occurring)	amino	acid,	preferably	K,	A,
misc_feature (3) . . (3) X may be any or L	(naturally	occurring)	amino	acid,	preferably	V,	F,
misc_feature (4)..(4) X may be any	(naturally	occurring)	amino	acid,	preferably	S	or	F
misc_feature (17) .. (17) X may be any	(naturally	occurring)	amino	acid,	preferably	I	or	V
misc_feature (21) . . (21) X may be any	(naturally	occurring)	amino	acid,	preferably	T	or	V
misc_feature (22).. (22) X may be any	(naturally	occurring)	amino	acid,	preferably	L	or	D
misc_feature (30).. (30) X may be any	(naturally	occurring)	amino	acid,	preferably	V	or	G
misc_feature (33) .. (33) X may be any	(naturally	occurring)	amino	acid,	preferably	A	or	G
misc_feature (35) .. (35) X may be any preferably T	(naturally or A	occurring)	amino	acid	except R,
misc_feature (41) . . (41) X may be any	(naturally	occurring)	amino	acid,	preferably	V	or	I
misc_feature (43) .. (43) X may be any	(naturally	occurring)	amino	acid,	preferably	A	or	V
misc_feature (49).. (49) X may be any	(naturally	occurring)	amino	acid,	preferably	M	or	T
misc_feature (68)..(68) X may be any	(naturally	occurring)	amino	acid,	preferably	S	or	G

misc_feature

- 160 043940 < 222> (70).. (70) < 223> X may be any (naturally occurring) amino acid, preferably E or K <220>

< 221> misc_feature < 222> (91) .. (91) < 223> X may be any (naturally occurring) amino acid, preferably V or I <220>

< 221> misc_feature < 222> (93)..(93) < 223> X may be any (naturally occurring) amino acid, preferably E, A, K, or D <220>

< 221> misc_feature < 222> (94) .. (94) <223> X may be any (naturally occurring) amino acid, preferably E, A, or K, more preferably K or A <400>265

Xaa Gly Xaa Xaa Tyr Ser Leu Cys Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys

5 1015

Xaa Pro Ala Glu Xaa Xaa His Gly Thr Val Thr Val Glu Xaa Gln Tyr 20 2530

Xaa Gly Xaa Asp Gly Pro Cys Lys Xaa Pro Xaa Gln Met Ala Val Asp

4045

Xaa Gln Thr Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val 50 5560

Ile Thr Glu Xaa Thr Xaa Asn Ser Lys Met Met Leu Glu Leu Asp Pro 65 70 7580

Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Xaa Gly Xaa Xaa Lys Ile 85 9095

Thr His His Trp His Arg Ser Gly

100 <210>266 <211>26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Zika-E-F1 primer <400>266 tgcaaacgcg gtcgcaaacc tggttg <210>267 <211>25 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZIKV-E-R1 primer

- 161 043940 <400> 267 cgtgccaagg taatggaatg tcgtg <210> 268 <211> 25 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZIKV-Ef1530 primer < 400> 268 agcctaggac ttgattgtga accga <210> 269 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZIKV-E-R2769 primer <400> 269 ttacagatcc cacaacgacc gtcag <210> 270 <211> 25 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> ZIKV-E-F2 < 400> 270 acttggtcat gatactgctg attgc <210> 271 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZIKV-E-R2 <400> 271 tcggttcaca atcaagtcct aggct <210> 272 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> ZIKV-E-f2058 <400> 272 gctaaccccg taatcactga aagca <210> 273 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

- 162 043940 <223> ZIKV-E-r2248 <400> 273 aagactgcca ttctcttggc acctc 25

Claims (53)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающееся/специфически связывающийся с эпитопами вируса Зика на белке оболочки вируса Зика (белок ZIKV Е), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит сайт связывания эпитопа, содержащий аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3, а также аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 (i) согласно SEQ ID NO: 19-23 и 25, соответственно; или (ii) согласно SEQ ID NO: 19-22 и 24, 25, соответственно.
2. 2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент нейтрализует инфекцию вируса Зика.
3. 3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент элиминирует размножение ускользающих мутантов вируса Зика.
4. 4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-3, отличающееся/отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не способствует антителозависимому усилению инфекции вируса Зика.
5. 5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, отличающееся/отличающийся тем, что каждая CDR или каждая вариабельная область, включенная в антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, является CDR человека или гуманизированной вариабельной областью, соответственно.
6. 6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-5, отличающееся/отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является моноклональным антителом.
7. 7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому пп.1-6, отличающееся/отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является биспецифическим, триспецифическим, тетраспецифическим или пентаспецифическим.
8. 8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-7, отличающееся/отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является бивалентным, трехвалентным, тетравалентным, гексавалентным или октавалентным.
9. 9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пп.1-8, отличающееся тем, что молекула антитела содержит две копии сайтов, специфически связывающихся с эпитопами вируса Зика.
10. 10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-9, отличающееся/отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент относится к типу IgG.
11. 11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-10, отличающееся/отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает Fc фрагмент.
12. 12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11, отличающееся/отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает мутацию в Fc фрагменте, причем указанная мутация снижает связывание антитела с рецептором Fc.
13. 13. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.10 или 12, отличающееся/отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает мутацию CH2 L4A, мутацию CH2 L5A или обе.
14. 14. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-13, отличающееся/отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет формат антитела Fabsin-tandem-Ig.
15. 15. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-13, отличающееся/отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет формат антитела DVD-Ig.
16. 16. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-9, отличающееся/отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не включает сайта связывания для рецептора Fc.
17. 17. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-16, отличающееся/отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с доменом белка оболочки вируса Зика (EDIII).
18. 18. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-17, отличающееся/отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с эпитопом белка оболочки вируса Зика, который включает один или несколько аминокислотных остатков латерального гребня (LR) в EDIII и/или один или несколько аминокислотных остатков шарнирной области EDI-EDIII.
19. 19. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-18, отличающееся/отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может ингибировать стадию

    - 163 043940 после присоединения ZIKV.
20. 20. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.19, отличающееся/отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может предупредить мембранное слияние.
21. 21. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-20, отличающееся/отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может вызвать агрегацию (частиц) ZIKV.
22. 22. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-21, отличающееся/отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно включает аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, (i) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 1-5 и 7; или функциональные варианты этих последовательностей, которые по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичны этим последовательностям; (ii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 1-4 и 6, 7; или функциональные варианты этих последовательностей, которые по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичны этим последовательностям; (iii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 37-41 и 43; или функциональные варианты этих последовательностей, которые по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичны этим последовательностям; (iv) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 37-40 и 42, 43; или функциональные варианты этих последовательностей, которые по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичны этим последовательностям; (v) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 55-59 и 61; или функциональные варианты этих последовательностей, которые по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичны этим последовательностям; (vi) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 55-58 и 60, 61; или функциональные варианты этих последовательностей, которые по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичны этим последовательностям; (vii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 7377 и 79; или функциональные варианты этих последовательностей, которые по меньшей мере на по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичны этим последовательностям; или (viii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 73-76 и 78, 79; или функциональные варианты этих последовательностей, по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичны этим последовательностям.
23. 23. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.22, отличающееся/отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает (а) первый сайт связывания эпитопа вируса Зика, содержащий аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3, а также аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, (i) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 1-5 и 7; или функциональные варианты этих последовательностей, которые по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичны этим последовательностям; или (ii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 1-4 и 6, 7; или функциональные варианты этих последовательностей, которые по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичны этим последовательностям; и (б) второй сайт связывания эпитопа вируса Зика, содержащий аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3, а также аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, (i) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 19-23 и 25; или (ii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 19-22 и 24, 25.
24. 24. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-23, отличающееся/отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), причем вариабельная область тяжелой цепи (VH) содержит или состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей последовательности SEQ ID NO: 26; или функциональный вариант этой последовательности, который по

    - 164 043940 меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичен этой последовательности; и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO: 27 или ее варианта функциональной последовательности, который по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичен этой последовательности.
25. 25. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.24, отличающееся/отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит (i) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 8, или функциональный вариант этой последовательности, который по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичен этой последовательности, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 9, или функциональный вариант этой последовательности, который по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичен этой последовательности; (ii) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 44, или функциональный вариант этой последовательности, который по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичен этой последовательности, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 45, или функциональный вариант этой последовательности, который по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичен этой последовательности; (iii) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 62, или функциональный вариант этой последовательности, который по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичен этой последовательности, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 63, или функциональный вариант этой последовательности, который по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичен этой последовательности; или (iv) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 80, или функциональный вариант этой последовательности, который по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичен этой последовательности, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 81, или функциональный вариант этой последовательности, который по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичен этой последовательности.
26. 26. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.25, отличающееся/отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит (а) первый сайт связывания эпитопа, содержащий аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 8, или функциональный вариант этой последовательности, который по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичен этой последовательности, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 9, или функциональный вариант этой последовательности, который по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичен этой последовательности; и (б) второй сайт связывания эпитопа, содержащий аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 26, или функциональный вариант этой последовательности, который по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичен этой последовательности,

    - 165 043940 и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 27, или функциональный вариант этой последовательности, который по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичен этой последовательности.
27. 27. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-26, отличающееся/отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент находится в формате Fabsin-tandem-Ig (FIT-Ig) и внешний Fab формата FIT-Ig содержит сайт связывания эпитопа, включающий аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, (i) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 1-5 и 7; или функциональные варианты этих последовательностей, которые по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичны этим последовательностям; или (ii) соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 1-4 и 6, 7; или функциональные варианты этих последовательностей, которые по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичны этим последовательностям; и внутренний Fab формата FIT-Ig содержит сайт связывания эпитопа, содержащий аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3, а также аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 (i) согласно SEQ ID NO: 19-23 и 25; или (ii) согласно SEQ ID NO: 19-22 и 24, 25.
28. 28. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.27, отличающееся/отличающийся тем, что внешний Fab формата FIT-Ig включает аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 8, или функциональный вариант этой последовательности, который по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичен этой последовательности, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 9, или функциональный вариант этой последовательности, который по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичен этой последовательности.
29. 29. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.27 или 28, отличающееся/отличающийся тем, что внутренний Fab формата FIT-Ig включает сайт связывания эпитопа, содержащий аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 26, или функциональный вариант этой последовательности, который по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичен этой последовательности, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (VL), соответствующую последовательности SEQ ID NO: 27, или функциональный вариант этой последовательности, который по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 88, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 92, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 96, по меньшей мере на 97, по меньшей мере на 98 или по меньшей мере на 99% идентичен этой последовательности.
30. 30. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предыдущих пунктов, отличающееся/отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является очищенным антителом или одноцепочечным антителом, например scFv.
31. 31. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из предыдущих пунктов в качестве лекарственного средства.
32. 32. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-30.
33. 33. Молекула нуклеиновой кислоты по п.32, которая является моно-, би- или полицистронной молекулой нуклеиновой кислоты.
34. 34. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.32, 33, которая является ДНК или РНК.
35. 35. Молекула нуклеиновой кислоты по п.34, причем молекула нуклеиновой кислоты является плазмидной ДНК или мРНК.
36. 36. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.32-35.
37. 37. Набор молекул нуклеиновых кислот, причем каждая молекула нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий фрагмент антитела или его антигенсвязывающий фрагмент любому из пп.1-30, где набор нуклеиновых кислот кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-30.
38. 38. Набор векторов, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-30.
39. 39. Клетка, экспрессирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-

    - 166 043940

    30, содержащая вектор по п.36 или набор векторов по п.38.
40. 40. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-30, молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.32-35, вектор по п.36, набор молекул нуклеиновых кислот по п.37, набор векторов по п.38 и/или клетку по п.39, причем фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый эксципиент, разбавитель или носитель.
41. 41. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-30 для предупреждения или лечения инфекции, вызванной вирусом Зика.
42. 42. Применение по п.41 для предупреждения или лечения инфекции, вызванной вирусом Зика, у субъектов с диагнозом инфекции вирусом Зика или у субъекта с проявлением симптомов инфекции вирусом Зика.
43. 43. Применение по п.41 у субъектов без проявления симптомов.
44. 44. Применение по любому из пп.41-43 у беременных.
45. 45. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-30 для мониторинга качества вакцины против вируса Зика путем проверки того, что антиген указанной вакцины содержит специфический эпитоп в правильной конформации.
46. 46. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-30 для (in vitro) диагностики инфекции вирусом Зика.
47. 47. Набор для профилактики или лечения инфекции вируса Зика, содержащий по меньшей мере одно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-30, по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту по любому из пп.32-35, по меньшей мере один вектор по п.36, набор молекул нуклеиновой кислоты по п.37, набор векторов по п.38, по меньшей мере одну клетку по п.39 или по меньшей мере одну фармацевтическую композицию по п.40.
48. 48. Способ профилактики или лечения инфекции вируса Зика у субъекта, который включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-30, молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.32-35, вектора по п.36, набора молекул нуклеиновой кислоты по п.37, набора векторов по п.38, клетки по п.39 или фармацевтической композиции по п.40.
49. 49. Способ по п.48, в котором у субъекта было диагностировано инфицирование вирусом Зика или обнаружены симптомы вирусной инфекции Зика.
50. 50. Способ по п.48 или 49, в которых субъектом является беременная.
51. 51. Способ по любому из пп.48-50, в которых антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в течение семи дней после (возможного) инфицирования вирусом Зика.
52. 52. Способ по любому из пп.48-51, в которых антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в комбинации с ингибитором контрольной точки.
53. 53. Способ по любому из пп.48-52, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в (разовой) дозе от 0,005 до 100 мг.