BR112021008217A2 - anticorpos humanos que têm como alvo vírus zika ns1, polipeptídeos ns1 e seus usos - Google Patents

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Peter Palese
Gene Tan
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Abstract

ANTICORPOS HUMANOS QUE TÊM COMO ALVO VÍRUS ZIKA NS1, POLIPEPTÍDEOS NS1 E SEUS USOS. Em um aspecto, a presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam à proteína 1 (NS1) não estrutural do vírus Zika e composições que compreendem os mesmos. Em uma modalidade específica, tais anticorpos ou composições dos mesmos podem ser usados para imunizar passivamente um indivíduo contra o vírus Zika. Em outra modalidade, tais anticorpos ou composições dos mesmos podem ser usados para diagnosticar uma infecção por vírus Zika. Em outro aspecto, são fornecidos aqui polipeptídeos NS1 recombinantes e composições compreendendo os mesmos que podem ser usados para imunizar um indivíduo contra a doença do vírus Zika.

Description

ANTICORPOS HUMANOS QUE TÊM COMO ALVO VÍRUS ZIKA NS1, POLIPEPTÍDEOS NS1 E SEUS USOS
REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório US N° 62/753,727, depositado em 31 de outubro de 2018, que está aqui incorporado por referência na sua totalidade.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0002] Este pedido incorpora por referência uma Listagem de Sequência apresentada junto com este pedido.
1. INTRODUÇÃO
[0003] Em um aspecto, são fornecidos neste documento anticorpos que se ligam à proteína 1 (NS1) não estrutural do vírus da Zika e composições que compreendem os mesmos. Em uma modalidade específica, tais anticorpos ou composições dos mesmos podem ser usados para imunizar passivamente um indivíduo contra o vírus da Zika. Em uma modalidade específica, tais anticorpos ou composições dos mesmos podem ser usados para imunizar passivamente um indivíduo contra o vírus da Zika. Em outro aspecto, são aqui fornecidos polipeptídeos NS1 recombinantes e composições que compreendem os mesmos que podem ser usados para imunizar um indivíduo contra a doença do vírus da Zika.
2. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0004] O vírus da Zika (ZIKV) é um flavivírus transmitido por artrópodes intimamente relacionado aos vírus da dengue, da febre amarela e do Nilo Ocidental, que causou uma epidemia emergente nas Américas, Caribe e regiões do Pacífico. Embora o ZIKV seja transmitido principalmente pela picada de um mosquito da espécie Aedes infectado, também foram relatados casos de transmissão sexual1,2. A infecção pelo ZIKV está associada às doenças graves em humanos, incluindo microcefalia e defeitos congênitos em recém- nascidos3–5 e síndrome de Guillain-Barré em adultos6,7.
Consequentemente, a infecção pelo ZIKV representa ameaças significativas à saúde global.
[0005] Para compreender os determinantes moleculares da imunidade à infecção pelo ZIKV, vários grupos isolaram anticorpos monoclonais (mAbs) de pacientes infectados pelo ZIKV8–12. Esses estudos revelaram importantes sítios antigênicos na proteína de envelope (E) necessária para a neutralização do vírus. Os epítopos quaternários, como o “epítopo do dímero do envelope”, que são dependentes da montagem dimérica nativa da proteína E, são vacinas e alvos terapêuticos promissores, pois os mAbs gerados contra esses locais tendem a ser potentemente neutralizantes10. No entanto, uma das principais preocupações no desenvolvimento de vacinas de flavivírus direcionadas à proteína E é o fenômeno do aumento da doença dependente de anticorpos (ADE). Isso ocorre quando a replicação viral é aumentada por anticorpos preexistentes que opsonizam, mas não neutralizam totalmente o vírion, resultando em captação aumentada do complexo vírion-anticorpo por células-alvo portadoras de FcγR. O vírus é então capaz de se replicar nessas células, aumentando a gravidade da doença13. Embora não haja evidências epidemiológicas de que o vírus da Zika possa causar ADE em humanos, estudos mostraram que os anticorpos monoclonais induzidos pelo ZIKV direcionados à proteína E podem aumentar a infecção do ZIKV ou do vírus da Dengue (DENV) in vitro e induzir a mortalidade em ratos infectados com DENV8. Além disso, a transferência passiva de plasma imune do DENV ou do vírus do Nilo Ocidental (WNV) para ratos imunocomprometidos resultou em progressão da doença mais grave após a infecção pelo ZIKV in vivo14.
Consequentemente, o ADE pode limitar a aplicação terapêutica de anticorpos específicos da proteína E e vacinas contra o vírus da Zika.
[0006] Outras proteínas virais, incluindo a proteína não estrutural 1 (NS1), surgiram como alvos promissores, pois é improvável que os anticorpos que não se ligam ao vírion aumentem a doença. Em um estudo recente de quatro pacientes infectados pelo ZIKV, 34,4% dos mAbs específicos do vírus têm como alvo a proteína NS18. Esta glicoproteína imunogênica desempenha um papel essencial na replicação do RNA viral e na evasão imunológica. A proteína NS1 é inicialmente traduzida como um monômero, torna-se glicosilada no ER e, subsequentemente, forma um dímero que pode potencialmente trafegar para vários locais distintos dentro da célula15. A proteína NS1 de muitos flavivírus é conhecida por se associar ao complexo de replicação viral na superfície da membrana do retículo endoplasmático, associar-se à membrana plasmática por um ligante glicosilfosfatidilinositol, sair das células para formar um hexâmero lipofílico e, potencialmente, se ligar a células não infectadas via glicosaminoglicano interações16.
[0007] Anticorpos protetores contra patógenos virais são capazes de proteger por meio de múltiplos mecanismos: neutralização, depuração viral mediada pelo receptor Fcγ e citotoxicidade dependente do complemento (CDC)17. Os anticorpos contra a proteína NS1 mostraram ser protetores contra várias espécies de flavivírus diferentes. No vírus da encefalite japonesa, anticorpos específicos para NS1 foram encontrados para reduzir a produção viral de células infectadas18. Fragmentos NS1 do vírus da febre amarela foram usados como vacina e ratos imunizados tiveram neurovirulência reduzida após o desafio viral19.
Posteriormente, descobriu-se que anticorpos específicos para NS1 protegem contra encefalite por febre amarela em ratos20. Além disso, os mAbs direcionados à proteína NS1 do vírus da febre amarela protegeram os macacos contra o desafio letal, invocando funções efetoras mediadas por Fcγ20-22. Outro trabalho mostrou que os mAbs contra a proteína NS1 do vírus do Nilo Ocidental previnem a infecção letal em ratos através da fagocitose mediada pelo receptor Fcγ, bem como um mecanismo indeterminado independente de Fc23,24. A proteína NS1 do vírus da dengue foi amplamente estudada no contexto da imunidade antiviral. Estudos de proteção passiva bem-sucedidos foram realizados em ratos com anticorpos monoclonais específicos para NS1, bem como vacinas baseadas em proteínas e DNA plasmídeo25-30. Recentemente, foi demonstrado que a proteína NS1 do vírus da dengue induz a ruptura das barreiras endoteliais em ratos, o que também pode ser evitado pela vacinação com a proteína NS131.
Finalmente, uma vacina baseada em NS1 para o vírus da Zika foi testada com sucesso em um modelo de desafio em rato, provando que a imunidade mediada por NS1 por si só é suficiente para uma vacina protetora32. Esses estudos em muitos flavivírus relacionados sugerem que os mAbs contra a proteína ZIKV NS1 são provavelmente protetores.
[0008] Tratamentos e vacinas específicas para o vírus da Zika não estão disponíveis no momento. Assim, há necessidade de tratamentos e vacinas específicas para o vírus da Zika.
3. SUMÁRIO
[0009] Em um aspecto, são fornecidos neste documento anticorpos que se ligam especificamente a um vírus da Zika NS1. Em uma modalidade, um anticorpo aqui descrito ou uma composição do mesmo pode ser usado para imunizar passivamente um indivíduo contra o vírus da Zika. Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito ou uma composição do mesmo pode ser usado para tratar uma infecção pelo vírus da Zika ou uma doença pelo vírus da Zika. Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito ou uma composição do mesmo pode ser usado em um imunoensaio. Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito ou uma composição do mesmo pode ser usado para detectar ou imunizar passivamente um indivíduo contra o vírus da Zika.
[0010] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga especificamente a um vírus da Zika NS1, em que o anticorpo incluiu: (1) uma região determinante da complementariedade (CDR)1 da região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos GFTVSSNY (SEQ ID NO: 143), (2) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos IYSGGST (SEQ ID NO: 144), (3) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARDRRGFDY (SEQ ID NO: 145), ARWGGKRGGAFDI (SEQ ID NO: 146), ARLIAAAGDY (SEQ ID NO: 147), ou ARGPVQLERRPLGAFDI (SEQ ID NO: 148), (4) uma região variável de cadeia leve (VL) CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSX, X é Y ou H (SEQ ID NO: 134), (5) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos X1X2S, X1 é A ou Q, X2 é A ou D (SEQ ID NO: 135), e (6) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQX1YSTPX2T, X1 é T ou S, X2 é L, Y ou W (SEQ ID NO: 136). Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga especificamente a um vírus da Zika NS1, em que o anticorpo incluiu: (1) uma região de ligação do anticorpo VH (ABR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos FTVSSNYMS (SEQ ID NO: 149), (2) uma VL ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos WVSVIYSGGSTYYA (SEQ
ID NO: 150), (3) uma VL ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARDRRGFDY (SEQ ID NO: 151), ARWGGKRGGAFDI (SEQ ID NO: 152), ARLIAAAGDY (SEQ ID NO: 153), ou ARGPVQLERRPLGAFDI (SEQ ID NO: 154), (4) uma VL ABR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSX1LN, X1 é Y ou H (SEQ ID NO: 137), (5) uma VL ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos X1LIYAASSLQS, X1 é F ou L (SEQ ID NO: 138), e (6) uma VL ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQX1YSTPX2, X1 é T ou S, X2 é L, Y ou W (SEQ ID NO: 139).
[0011] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga especificamente a um vírus da Zika NS1, em que o anticorpo incluiu: (1) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos GFTVSSNY (SEQ ID NO: 17), (2) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos IYSGGST (SEQ ID NO: 18), (3) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARDRRGFDY (SEQ ID NO: 19), (4) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSY (SEQ ID NO: 20), (5) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos AAS (SEQ ID NO: 21), e (6) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQTYSTPLT (SEQ ID NO: 22).
[0012] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga especificamente a um vírus da Zika NS1, em que o anticorpo incluiu: (1) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos GFTVSSNY (SEQ ID NO: 45), (2) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos IYSGGST (SEQ ID NO: 46), (3) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARWGGKRGGAFDI (SEQ ID NO: 47), (4) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSH (SEQ ID NO: 48), (5) uma VL CDR 2 compreendendo a sequência de aminoácidos AAS (SEQ ID NO: 49), e (6) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQSYSTPYT (SEQ ID NO: 50).
[0013] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga especificamente a um vírus da Zika NS1, em que o anticorpo incluiu: (1) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos GFTVSSNY (SEQ ID NO: 73), (2) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos IYSGGST (SEQ ID NO: 74), (3) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARLIAAAGDY (SEQ ID NO: 75), (4) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSY (SEQ ID NO: 76), (5) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos AAS (SEQ ID NO: 77), e (6) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQSYSTPWT (SEQ ID NO: 78).
[0014] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga especificamente a um vírus da Zika NS1, em que o anticorpo incluiu: (1) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos GFTVSSNY (SEQ ID NO: 101), (2) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos IYSGGST (SEQ ID NO: 102), (3) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos
ARGPVQLERRPLGAFDI (SEQ ID NO: 103), (4) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos KLGDKY (SEQ ID NO: 104), (5) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos QDS (SEQ ID NO: 105), e (6) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QAWDSSTVV (SEQ ID NO: 106).
[0015] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga especificamente a um vírus da Zika NS1, em que o anticorpo incluiu: (1) uma região de ligação de anticorpo VH (ABR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos FTVSSNYMS (SEQ ID NO: 31), (2) uma VL ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos WVSVIYSGGSTYYA (SEQ ID NO: 32), (3) uma VL ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARDRRGFDY (SEQ ID NO: 33), (4) uma VL ABR1 compreendendo o aminoácido sequência QSISSYLN (SEQ ID NO: 34), (5) uma VL ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos LLIYAASSLQS (SEQ ID NO: 35), e (6) uma VL ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQTYSTPL (SEQ ID NO: 36).
[0016] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga especificamente a um vírus da Zika NS1, em que o anticorpo incluiu: (1) uma VL ABR1 compreendendo a sequência de aminoácidos FTVSSNYMS (SEQ ID NO: 59), (2) uma VL ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos WVSVIYSGGSTYYA (SEQ ID NO: 60), (3) uma VL ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARWGGKRGGAFDI (SEQ ID NO: 61), (4) uma VL ABR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSHLN (SEQ ID NO: 62), (5) uma VL ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos FLIYAASSLQS (SEQ ID NO: 63), e (6) uma VL ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQSYSTPY (SEQ ID NO: 64).
[0017] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga especificamente a um vírus da Zika NS1, em que o anticorpo incluiu: (1) uma VL ABR1 compreendendo a sequência de aminoácidos FTVSSNYMS (SEQ ID NO: 87), (2) uma VL ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos WVSVIYSGGSTYYA (SEQ ID NO: 88), (3) uma VL ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARLIAAAGDY (SEQ ID NO: 89), (4) uma VL ABR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSYLN (SEQ ID NO: 90), (5) uma VL ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos LLIYAASSLQS (SEQ ID NO: 91), e (6) uma VL ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQSYSTPW (SEQ ID NO: 92).
[0018] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga especificamente a um vírus da Zika NS1, em que o anticorpo incluiu: (1) uma VL ABR1 compreendendo a sequência de sequência de aminoácidos FTVSSNYMS (SEQ ID NO: 115), (2) uma VL ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos WVSVIYSGGSTYYA (SEQ ID NO: 116), (3) uma VL ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARGPVQLERRPLGAFDI (SEQ ID NO: 117), (4) uma VL ABR1 compreendendo a sequência de aminoácidos KLGDKYAC (SEQ ID NO: 118), (5) uma VL ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos
LVIYQDSKRPS (SEQ ID NO: 119), e (6) uma VL ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QAWDSSTV (SEQ ID NO: 120).
[0019] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga especificamente a um vírus da Zika NS1, em que o anticorpo inclui uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga especificamente a um vírus da Zika NS1, em que o anticorpo inclui uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12. Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga especificamente a um vírus da Zika NS1, em que o anticorpo inclui uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14. Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga especificamente a um vírus da Zika NS1, em que o anticorpo compreendia uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16.
[0020] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga especificamente a um vírus da Zika NS1, em que o anticorpo inclui uma região variável da cadeia pesada que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 e uma luz variável região da cadeia que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Em certas modalidades, a região variável da cadeia pesada inclui uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos GFTVSSNY (SEQ ID NO: 17), (2) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos IYSGGST (SEQ ID NO: 18), e (3) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARDRRGFDY (SEQ ID NO: 19); e a região de cadeia leve variável inclui (1) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSY (SEQ ID NO: 20), (2) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos AAS (SEQ ID NO: 21), e (3) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQTYSTPLT (SEQ ID NO: 22).
[0021] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga especificamente a um vírus da Zika NS1, em que o anticorpo inclui uma região variável da cadeia pesada que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 e uma região variável da cadeia leve que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12. Em certas modalidades, a região variável da cadeia pesada inclui (1) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos GFTVSSNY (SEQ ID NO: 45), (2) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos
IYSGGST (SEQ ID NO: 46), e (3) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARWGGKRGGAFDI (SEQ ID NO: 47); e a região de cadeia leve variável inclui (1) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSH (SEQ ID NO: 48), (2) uma VL CDR 2 compreendendo a sequência de aminoácidos AAS (SEQ ID NO: 49), e (3) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQSYSTPYT (SEQ ID NO: 50).
[0022] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga especificamente a um vírus da Zika NS1, em que o anticorpo inclui uma região variável da cadeia pesada que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 e uma região variável da cadeia leve que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14. Em certas modalidades, a região variável da cadeia pesada inclui (1) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos GFTVSSNY (SEQ ID NO: 73), (2) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos IYSGGST (SEQ ID NO: 74), e (3) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARLIAAAGDY (SEQ ID NO: 75); e a região variável da cadeia leve inclui (1) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSY (SEQ ID NO: 76), (2) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos AAS (SEQ ID NO: 77), e (3) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQSYSTPWT (SEQ ID NO: 78).
[0023] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga especificamente a um vírus da Zika NS1, em que o anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16. Em certas modalidades, a região variável da cadeia pesada inclui (1) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos GFTVSSNY (SEQ ID NO: 101), (2) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos IYSGGST ( SEQ ID NO: 102), e (3) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARGPVQLERRPLGAFDI (SEQ ID NO: 103); e a região de cadeia leve variável inclui (1) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos KLGDKY (SEQ ID NO: 104), (2) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos QDS (SEQ ID NO: 105), e (3) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QAWDSSTVV (SEQ ID NO: 106).
[0024] Em certas modalidades, um anticorpo fornecido aqui é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido aqui é um anticorpo de cadeia única. Em certas modalidades, um anticorpo fornecido aqui é um fragmento Fab ou F(ab’)2. Em uma modalidade específica, um anticorpo fornecido aqui é um anticorpo recombinante.
[0025] Em outro aspecto, é aqui fornecido um conjugado de anticorpo que compreende (a) uma porção de anticorpo que é o anticorpo monoclonal recombinante conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 11; (b) uma porção de fármaco ou porção detectável; e (c) opcionalmente, um ligante, em que a porção de fármaco ou porção detectável é conjugada à porção de anticorpo diretamente ou é conjugada à porção de anticorpo por meio de um ligante. Em certas modalidades, a porção de fármaco é citotóxica.
Em uma modalidade, um conjugado de anticorpo aqui descrito ou uma composição do mesmo pode ser usado para imunizar passivamente um indivíduo contra o vírus da Zika. Em uma modalidade específica, um conjugado de anticorpo aqui descrito ou uma composição do mesmo pode ser usado para tratar uma infecção por vírus da Zika ou uma doença por vírus da Zika. Em uma modalidade específica, um conjugado de anticorpo aqui descrito ou uma composição do mesmo pode ser usado em um imunoensaio. Em uma modalidade específica, um conjugado de anticorpo aqui descrito ou uma composição do mesmo pode ser usado para detectar ou imunizar passivamente um indivíduo contra o vírus da Zika
[0026] Em outro aspecto, é aqui fornecido um conjugado de anticorpo que compreende (a) uma fração de anticorpo que é um anticorpo aqui descrito; (b) uma porção detectável (por exemplo, uma substância detectável); e (c) opcionalmente, um ligante, em que a fração detectável é conjugada à porção de anticorpo diretamente ou é conjugada à porção de anticorpo por meio de um ligante. Em algumas modalidades, a porção detectável é peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, acetilcolinesterase, estreptavidina/biotina, avidina/biotina, um material fluorescente ou um metal emissor de pósitrons.
[0027] Em outro aspecto, é fornecida aqui uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de um anticorpo aqui descrito em uma mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outro aspecto, é fornecida aqui uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de um conjugado de anticorpo aqui descrito em uma mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0028] Em outro aspecto, é aqui fornecido um método para detectar uma infecção pelo vírus da Zika em uma amostra biológica, compreendendo o contato de um anticorpo aqui descrito com a amostra biológica e a detecção da ligação do anticorpo ou conjugado de anticorpo a um vírus da Zika NS1. Em outro aspecto, é aqui fornecido um método para detectar uma infecção pelo vírus da Zika em uma amostra biológica, compreendendo o contato de um conjugado de anticorpo aqui descrito com a amostra biológica e a detecção da ligação do anticorpo ou conjugado de anticorpo a um vírus da Zika NS1. Em certas modalidades, a amostra biológica é de um indivíduo.
Uma amostra biológica pode ser sangue, soro, plasma, células ou uma amostra de tecido.
[0029] Em outro aspecto, é aqui fornecido um método para diagnosticar uma infecção por vírus da Zika em um indivíduo,
compreendendo o contato de um anticorpo aqui descrito com uma amostra biológica do indivíduo e da detecção da ligação do anticorpo ou conjugado de anticorpo a um vírus da Zika NS1 em que um o aumento na detecção da ligação do anticorpo ou conjugado de anticorpo na amostra biológica em relação à detecção da ligação do anticorpo ou conjugado de anticorpo a uma amostra de controle negativo indica que o indivíduo tem uma infecção pelo vírus da Zika. Em outro aspecto, é fornecido neste documento um método para diagnosticar uma infecção por vírus da Zika em um indivíduo, compreendendo o contato ou um conjugado de anticorpo aqui descrito com uma amostra biológica do indivíduo e a detecção da ligação do anticorpo ou conjugado de anticorpo vírus NS1, em que um aumento na detecção da ligação do anticorpo ou conjugado do anticorpo na amostra biológica em relação à detecção da ligação do anticorpo ou conjugado do anticorpo a uma amostra de controle negativo indica que o indivíduo tem uma infecção pelo. Em certas modalidades, a amostra biológica é de um indivíduo. Uma amostra biológica pode ser sangue, soro, plasma, células ou uma amostra de tecido.
[0030] Em outro aspecto, é aqui fornecido um método para distinguir o vírus da Zika do vírus da Dengue em uma amostra biológica, compreendendo o contato de um anticorpo aqui descrito com a amostra biológica e a detecção da ligação do anticorpo ou conjugado de anticorpo a um vírus da Zika NS1, em que um aumento na detecção da ligação do anticorpo ou conjugado do anticorpo em relação à detecção da ligação do anticorpo ou conjugado do anticorpo a uma amostra contendo o vírus da dengue indica a presença do vírus da Zika na amostra biológica. Em outro aspecto, é aqui fornecido um método para distinguir o vírus da Zika do vírus da Dengue em uma amostra biológica, compreendendo o contato de um conjugado de anticorpo aqui descrito com a amostra biológica e a detecção da ligação do anticorpo ou conjugado de anticorpo a um vírus da Zika NS1, em que um aumento na detecção da ligação do anticorpo ou conjugado do anticorpo em relação à detecção da ligação do anticorpo ou conjugado do anticorpo a uma amostra contendo o vírus da dengue indica a presença do vírus da Zika na amostra biológica. Em certas modalidades, a amostra biológica é de um indivíduo. A amostra biológica pode ser sangue, soro, plasma, células ou uma amostra de tecido.
[0031] Em outro aspecto, é aqui fornecido um método para prevenir uma infecção pelo vírus da Zika em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica aqui descrita. Em outro aspecto, é fornecido neste documento um método para tratar uma infecção pelo vírus da Zika ou uma doença pelo vírus da Zika em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica aqui descrita. Em modalidades específicas, o indivíduo é um ser humano.
[0032] Em outro aspecto, é fornecida aqui uma sequência de ácido nucleico isolada que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo aqui descrito. Em outro aspecto, é aqui fornecido um ou mais vetores (por exemplo, um ou mais vetores de expressão) compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo aqui descrito. Em uma modalidade específica, é fornecido neste documento um vetor (por exemplo, um vetor de expressão) que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma região variável da cadeia pesada ou cadeia pesada de um anticorpo aqui descrito. Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um vetor (por exemplo, um vetor de expressão) que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma região variável de cadeia leve ou cadeia leve de um anticorpo aqui descrito.
[0033] Em outro aspecto, é fornecida aqui uma célula hospedeira que compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo aqui descrito.
Em uma modalidade específica, é fornecida aqui uma célula hospedeira projetada para expressar uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo aqui descrito. Em uma modalidade específica, é fornecida aqui uma célula hospedeira compreendendo um primeiro vetor (por exemplo, um vetor de expressão) e um segundo vetor (por exemplo, um vetor de expressão), em que o primeiro vetor inclui uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia pesada variável região ou cadeia pesada de um anticorpo aqui descrito e o segundo vetor inclui uma sequência de nucleotídeos que codifica uma região variável de cadeia leve ou cadeia leve do anticorpo aqui descrito. Em uma modalidade específica, a(s) célula(s) hospedeira(s) são isoladas.
[0034] Em outro aspecto, é aqui fornecido um método para a produção de um anticorpo aqui descrito, compreendendo a cultura de uma célula hospedeira que expressa um anticorpo aqui descrito e o isolamento do anticorpo da cultura de células.
[0035] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um polipeptídeo NS1 compreendendo a sequência de aminoácidos de um NS1 do vírus da Zika e a sequência de aminoácidos de um fragmento de uma proteína de envelope do vírus da Zika, em que a sequência de aminoácidos do fragmento da proteína de envelope do vírus da Zika é no terminal N da sequência de aminoácidos do vírus da Zika NS1. Em uma modalidade específica, o fragmento da proteína de envelope do vírus da Zika incluiu os últimos 20 a 50 resíduos de aminoácidos do terminal carboxi da proteína de envelope do vírus da Zika. Em certas modalidades, o fragmento da proteína de envelope do vírus da Zika incluiu os últimos 24 resíduos de aminoácidos do terminal carboxi da proteína de envelope do vírus da Zika. Em uma modalidade específica, o fragmento da proteína de envelope do vírus da Zika inclui a sequência de aminoácidos NGSISLMCLALGGVLIFLSTAVSA (SEQ ID NO: 131). Em certas modalidades, o vírus da Zika NS1 compreende a sequência de aminoácidos NS1 do vírus da Zika PRVABC59. Em algumas modalidades, o polipeptídeo NS1 compreendeu ainda um local de clivagem e uma etiqueta. Em uma modalidade específica, o local de clivagem é LEVLFNGPG (SEQ ID NO: 132). Em uma modalidade específica, a etiqueta é um motivo hexahistidina.
Em uma modalidade específica, o local de clivagem e a etiqueta estão no terminal carboxi do polipeptídeo NS1. Em uma modalidade particular, um polipeptídeo NS1 fornecido aqui é um polipeptídeo NS1 recombinante.
[0036] Em outro aspecto, é fornecida aqui uma sequência de ácido nucleico isolada que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo NS1 aqui descrito. Em uma modalidade específica, a sequência de nucleotídeos é otimizada para códons humanos.
[0037] Em outro aspecto, é aqui fornecido um vetor (por exemplo, um vetor de expressão) que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo NS1 aqui descrito. Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um vetor viral que compreende um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo NS1 aqui descrito.
[0038] Em outro aspecto, é fornecida aqui uma célula hospedeira que compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo NS1 aqui descrito. Em uma modalidade específica, é fornecida aqui uma célula hospedeira projetada para expressar um polipeptídeo NS1 recombinante. Em uma modalidade específica, a célula ou células hospedeiras são isoladas.
[0039] Em outro aspecto, é aqui fornecido um método para a produção de um polipeptídeo NS1 descrito, compreendendo a cultura de uma célula hospedeira que expressa um polipeptídeo NS1 aqui descrito e o isolamento do anticorpo da cultura celular.
[0040] Em outro aspecto, é fornecida aqui uma composição farmacêutica (por exemplo, uma composição imunogênica) que compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo NS1 aqui descrito em uma mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outro aspecto, é fornecida aqui uma composição farmacêutica (por exemplo, uma composição imunogênica) compreendendo um polipeptídeo NS1 aqui descrito em uma mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0041] Em outro aspecto, é aqui fornecido um método para imunizar contra o vírus da Zika, compreendendo a administração a um indivíduo de uma dose de um polipeptídeo NS1 aqui descrito ou uma composição farmacêutica do mesmo (por exemplo, uma composição imunogênica). Em outro aspecto, é aqui fornecido um método para prevenir uma doença mediada pelo vírus da Zika, compreendendo a administração a um indivíduo de uma dose de um polipeptídeo NS1 aqui descrito ou uma composição farmacêutica do mesmo (por exemplo, uma composição imunogênica). Em outro aspecto, é fornecido neste documento um método para induzir uma resposta imune a um vírus da Zika NS1, compreendendo a administração a um indivíduo de uma dose de uma dose de um polipeptídeo NS1 aqui descrito ou uma composição farmacêutica do mesmo (por exemplo, uma composição imunogênica).
Em certas modalidades, o método compreendeu ainda a administração de uma ou mais doses de reforço de um polipeptídeo NS1 aqui descrito ou uma composição farmacêutica do mesmo (por exemplo, uma composição imunogênica). Em uma modalidade específica, o indivíduo é um humano. Em uma modalidade específica, o indivíduo é uma mulher grávida.
[0042] Em outro aspecto, é aqui fornecido um método para imunizar contra o vírus da Zika, compreendendo: (a) administrar a um indivíduo uma dose de uma primeira composição farmacêutica (por exemplo, uma composição imunogênica) compreendendo uma sequência de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo NS1 aqui descrito ou uma composição do mesmo; e (b) após um primeiro determinado período de tempo administrar ao indivíduo uma dose de uma segunda composição farmacêutica (por exemplo, uma composição imunogênica) compreendendo um polipeptídeo NS1 aqui descrito. Em outro aspecto, é aqui fornecido um método para imunizar contra o vírus da Zika, compreendendo: (a) administrar a um indivíduo uma dose de uma primeira composição farmacêutica compreendendo um vetor com uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo NS1 aqui descrito ou uma composição do mesmo; e (b) após um primeiro certo período de tempo, administrar ao indivíduo uma dose de uma segunda composição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo NS1 aqui descrito. Em certas modalidades, o método compreende ainda a administração de uma segunda dose da segunda composição farmacêutica após um segundo determinado período de tempo. Em algumas modalidades, o primeiro certo período de tempo, o segundo certo período de tempo ou ambos são 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 3 meses ou 6 meses. Em uma modalidade específica, o indivíduo é um ser humano. Em uma modalidade específica, o indivíduo é uma mulher grávida.
4. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0043] Figuras 1A-1C. Os anticorpos específicos para o ZIKV humano se ligam à proteína NS1 dos vírus da Zika MR766 e PRVABC59.
Figura 1A. As células Vero foram infectadas com os vírus indicados a um MOI de 1 por 24 horas. As células foram fixadas com paraformaldeído a 0,5% e bloqueadas com 5% de leite desnatado. Os MAbs AA12, FC12, EB9 e GB5 foram usados a uma concentração de 5 μg/mL e um anticorpo anti-humano conjugado com Alexa Fluor 488 foi usado como anticorpo secundário. O mAb 4G2 de pan-flavivírus murino foi usado como um controle positivo e um anticorpo anti-rato conjugado com Alexa Fluor 488 foi usado como um anticorpo secundário. As células coradas com mAb 4G2 foram fixadas e permeabilizadas usando 80% de acetona. Figuras 1B, 1C. Os ensaios
ELISA foram realizados usando proteína NS1 recombinante de vírus MR766 ou PRVABC59 para avaliar a atividade de ligação dos mAbs AA12, FC12, EB9 e GB5. Os testes ELISAs foram realizados em duplicata. Os dados plotados representam os valores médios e o erro padrão da média (SEM); uma linha de regressão não linear foi gerada usando GraphPad Prism 5.
[0044] Figuras 2A-2D. Os anticorpos específicos de NS1 ativam as funções efetoras Fc-FcR in vitro. Para examinar a capacidade de anticorpos específicos de NS1 para ativar funções efetoras mediadas por Fc-FcR. Figuras 2A, 2B. As células Vero foram infectadas com os vírus da Zika MR766 e PRVABC59 ou figuras 2C, 2D. As células HEK 293T foram transfectadas com NS1 dos vírus da Zika MR766 e PRVABC59. Células Vero infectadas ou células HEK 293T transfectadas foram usadas como alvos para medir funções efetoras mediadas por anticorpos com uma linha de células Jurkat geneticamente modificada que expressa o FcRγIIIa humano com um gene repórter de luciferase induzível. A indução dobrada foi medida em unidades de luz relativa e calculada subtraindo o sinal de fundo dos poços sem células efetoras, em seguida, dividindo os poços com anticorpo por poços sem adição de anticorpo. Todos os mAbs foram testados em uma concentração inicial de 10 μg/mL e foram diluídos em série quatro vezes. Os ensaios foram realizados duas vezes como duplicatas técnicas e uma das duas repetições é mostrada. Uma curva de melhor ajuste de regressão não linear foi gerada para cada conjunto de dados usando GraphPad Prism 5. As barras de erro representam SEM.
[0045] Figuras 3A-3B. Os anticorpos específicos de NS1 não causam aumento dependente de anticorpos (ADE) de infecção in vitro.
Para examinar se o aumento da infecção por ZIKV in vitro é observado por anticorpos específicos de NS1, mAbs ou soro reunidos de um doador positivo para DENV foram incubados FIG. 3A. PRVABC59 ou FIG. 3B. Vírus DENV-3 e adicionados a células K562 contendo FcγR. Todos os mAbs foram testados a uma concentração inicial de 100 ng/mL e foram diluídos em série quatro vezes. O controle positivo para DENV foi diluído cinco vezes inicialmente e em série quatro vezes. O ensaio foi executado em duplicado e a indução duplicada foi medida como o número de células infectadas conforme medido por citometria de fluxo dividido por células infectadas sem anticorpo ou soro adicionado. Os soros foram obtidos por meio de uma triagem de doações de sangue em Porto Rico, conforme descrito anteriormente em Bardina et al. [14]. Os valores traçados representam o valor médio e o desvio padrão.
[0046] Figuras 4A-4E. Os anticorpos específicos de NS1 protegem os ratos contra o desafio letal in vivo. As figuras 4A-4C. Grupos de 6 a 9 ratos B6.129-Stat2-/- machos e fêmeas tomaram injeções IP com 20 mg por kg de AA12 antes de um desafio com 10 mLD50 de ZIKV MR766 por via intradérmica. Um mAb (CR9114) contra o vírus influenza A foi usado como um controle de IgG. As figuras 4D, 4E.
Os ratos foram tratados com 10 mg por kg de AA12 ou 10 mg por kg de controle de isotipo antes de um desafio com 500 PFU de ZIKV
PAN/2015 retro-orbitalmente.
A perda de peso foi monitorada diariamente.
Para ratos infectados com ZIKV MR766, a pontuação clínica foi conduzida usando os critérios predefinidos com uma pontuação máxima possível de 7: impacto na caminhada (1), falta de resposta (1), perna traseira esquerda paralisada (1), perna traseira direita paralisada (1), perna dianteira esquerda paralisada (1) e perna dianteira direita paralisada (1). Os animais que morreram receberam uma pontuação de 7. As razões nas figuras indicam o número de animais que sobreviveram ao desafio sobre o número total de animais por grupo.
Os estudos de desafio com murinos foram realizados como duas réplicas independentes com pelo menos três ratos por grupo de tratamento e os dados mostrados aqui foram agrupados.
Os testes de Mantel-Cox e Gehan-Breslow-Wilcoxon foram usados para analisar a significância estatística da sobrevida entre os dois grupos.
Um teste t múltiplo e o método
Holm-Sidak foram usados para determinar a significância estatística em cada ponto de tempo para a curva de peso e o escore clínico.
Asterisco(s) indicam significância estatística de um grupo (* = p <0,05 e ** = p <0,005) em comparação com o controle
IgG.
Nenhuma diferença significativa entre os grupos foi detectada na FIG. 4D.
[0047] Figuras 5A-5D. A mutação LALAPG promove a abalação das funções efetoras mediadas por Fc-FcR sem afetar a afinidade. A região variável de AA12 foi clonada em IgG1 humana ou IgG1 humana com mutações L234A, L235A e P329G (LALAPG) na estrutura. As figuras 5A, 5B. Os ensaios de ELISA foram realizados usando NS1 recombinante dos vírus MR766 e PRVABC59 para avaliar as atividades de ligação dos mAbs AA12 e AA12 LALAPG. Figuras 5C, 5D. As funções efetoras mediadas por Fc-FcR foram testadas em células Vero infectadas com os vírus da Zika MR766 e PRVABC59. AA12 foi capaz de eliciar funções efetoras mediadas por Fc-FcR, enquanto AA12 LALAPG não foi. Os ensaios foram realizados duas vezes como técnicas duplicadas e uma das duas repetições é mostrada. Uma curva de melhor ajuste de regressão não linear foi gerada para cada conjunto de dados usando GraphPad Prism 5. As barras de erro representam SEM.
[0048] Figuras 6A-6C. Os anticorpos específicos de NS1 protegem os ratos contra o desafio letal in vivo de uma maneira dependente de Fc. Figuras 6A-6C. Grupos de 4 a 13 ratos B6.129-Stat2-/- machos e fêmeas tomaram injeções IP com 10 mg por kg de variantes AA12, AA12 LALAPG, AA12 LALA ou AA12 PG Fc antes de um desafio com 10 mLD50 de ZIKV MR766. O mAb CR9114 contra o vírus influenza A foi usado como um controle de isotipo IgG. A perda de peso foi monitorada diariamente. A pontuação clínica foi conduzida usando os critérios predefinidos com uma pontuação máxima possível de 7:
impacto na caminhada (1), indiferença (1), perna traseira esquerda paralisada (1), perna traseira direita paralisada (1), perna dianteira esquerda paralisada (1), e perna dianteira direita paralisada (1). Os animais mortos receberam uma pontuação de 7. As razões nas figuras indicam o número de animais que sobreviveram ao desafio sobre o número total de animais por grupo. Os estudos de desafio com murinos foram realizados como três réplicas independentes com pelo menos quatro ratos por grupo de tratamento e os dados mostrados aqui foram agrupados. As análises estatísticas foram realizadas usando os testes de Mantel-Cox e Gehan-Breslow- Wilcoxon para as curvas de sobrevivência e um teste t múltiplo e o método de Holm-Sidak para a curva de peso e o escore clínico. A significância (* = p <0,05) é indicada em comparação com o controle IgG. Nenhuma diferença significativa entre os grupos foi detectada na FIG 6A.
[0049] Figuras 7A-7B. Ativação de células assassinas naturais primárias humanas. As células Vero foram infectadas com PRVABC59 a um MOI de 0,5. A 48 hpi, diluições de mAb (começando em 20 µg/mL), mAb irrelevante ou meio sem mAb (controle negativo) foram adicionados às células Vero infectadas com ZIKV e incubadas por 1 hora a 37ºC. Células NK humanas primárias do doador 1 (FIG. 7A) e 2 (FIG. 7B) foram então adicionadas (razão efetora para alvo de 2) e a cultura foi incubada adicionalmente a 37ºC por três horas. As células foram então coradas com CD56 (FITC) e CD107a (PE). A ativação de células NK (expressão de CD107a) foi detectada usando um citômetro de fluxo e analisada usando o software Flowjo. Os dados representam a porcentagem de células NK que expressam CD107a e são o valor médio de duplicatas e o SEM. Um teste t múltiplo e o método Holm-Sidak foram realizados usando GraphPad Prism. A significância (* = p <0,05) é indicada em comparação com o controle IgG. A linha pontilhada no eixo y representa o valor médio do grupo de controle negativo (mídia sem mAb).
[0050] Figuras 8A-8C. Modelo de desafio de anticorpos específicos para NS1 contra PAN/2015. Grupos de 4 ratos B6.129- Stat2-/- machos e fêmeas tomaram injeções IP com 10 mg por kg de EB9, FC12 ou controle de IgG antes de um desafio com 500 PFU de ZIKV PAN/2015 retro-orbitalmente. Figuras 8A, 8B. A perda de peso foi monitorada diariamente e os ratos que perderam 25% de seu peso original foram sacrificados. Figura 8C. A pontuação clínica foi conduzida usando os critérios predefinidos com uma pontuação máxima possível de 7: impacto na caminhada (1), indiferença (1), perna traseira esquerda paralisada (1), perna traseira direita paralisada (1), perna dianteira esquerda paralisada (1), e perna dianteira direita paralisada (1). Os animais mortos receberam uma pontuação de 7. As razões nas figuras indicam o número de animais que sobreviveram ao desafio sobre o número total de animais por grupo. As análises estatísticas foram realizadas usando os testes de Mantel-Cox e Gehan-Breslow-Wilcoxon para as curvas de sobrevivência e um teste t múltiplo e o método de Holm-Sidak para a curva de peso e o escore clínico. Nenhuma diferença significativa entre os grupos foi detectada nas figuras 8A, 8B e 8C.
[0051] Figuras 9A-9B. Carga viral em cérebros e baços de ratos infectados. Grupos de 6 ratos B6.129-Stat2-/- machos e fêmeas tomaram injeções IP com 10 mg por kg de AA12 ou controle de IgG antes de um desafio com 500 PFU de ZIKV PAN/2015 retro- orbitalmente. A Figura 9A. Brains e figura 9B. os baços foram colhidos nos dias 3 e 6 após a infecção. Os títulos virais foram determinados por ensaio de placa. Barras de erro representam SEM.
Uma ANOVA de duas vias seguida por uma análise de comparação múltipla Holm-Sidak foi realizada usando GraphPad Prism 5 e rendeu uma diferença significativa entre o controle e os ratos tratados com AA12 no baço em 3 dpi.
[0052] Figuras 10A-10D. LALA e variantes PG Fc de AA12. Figuras 10A, 10B. Os ensaios de ELISA foram realizados usando NS1 recombinante de vírus MR766 e PRVABC59 para avaliar as atividades de ligação dos mAbs AA12 e variantes de AA12. Figuras 10C, 10D. As funções efetoras mediadas por Fc-FcR foram testadas em células Vero infectadas com os vírus da Zika MR766 e PRVABC59. AA12 foi capaz de induzir funções efetoras mediadas por Fc-FcR, enquanto as variantes de AA12 não foram.
[0053] Figura 11. Os níveis de complemento aumentam durante a infecção aguda pelo ZIKV. Grupos de 3 a 4 ratos B6.129-Stat2-/-
machos e fêmeas tomaram injeções IP com 10 mg por kg de AA12 de tipo selvagem, AA12 LALAPG, AA12 LALA, AA12 PG ou controle de IgG antes de um desafio com 10 mLD50 de ZIKV MR766 por via intradérmica. No dia 6 após a infecção, os níveis de C3 foram determinados por ELISA de acordo com as instruções do fabricante.
Uma ANOVA unilateral e testes de comparação múltipla de Dunnett foram realizados para determinar a significância estatística dos grupos tratados com mAb para os ratos ingênuos não infectados (* = p <0,05 ** = p <0,005).
[0054] Figuras 12A-12D. Geração de plasmídeos de expressão que codificam ZIKV NS1. (FIG. 12A) O NS1 otimizado para códons humanos de ZIKV PRVABC59 foi subclonado em um vetor de expressão de mamífero, pCAGGS, que inclui os últimos 24 aminoácidos da proteína de envelope no terminal amino seguido pela região de codificação NS1 (pCAGGS NS1). Digno de nota, o primeiro aminoácido da região de codificação NS1 é indicado por um resíduo de ácido aspártico vermelho em negrito. (FIG. 12B) Uma segunda versão (pCAGGS NS1- HIS) também codifica o ZIKV PRVABC59 NS1 seguido por um local de clivagem de protease de pré-sucessão (LEVLFNGPG (SEQ ID NO: 132; região azul) e um motivo hexahistidina (HHHHHH (SEQ ID NO: 133); região laranja) no terminal carboxi. (FIG. 12C) As células HEK 293T foram transfectadas com pCAGGS NS1, pCAGGS NS1-HIS ou não transfectadas (simulação). 24 horas após a transfecção, as células foram fixadas com paraformaldeído a 0,5% e a expressão de superfície de NS1 foi detectada usando um anticorpo monoclonal AA12 anti-ZIKV NS1 ou um anticorpo policlonal anti-histidina.
Anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor 488 foram usados para visualizar a ligação usando um citômetro de imagem Celigo. As barras de escala são iguais a 500 mícrons. (FIG. 12D) Células HEK 293F foram transfectadas com pCAGGS NS1-HIS e quatro dias após a transfecção, NS1 solúvel do sobrenadante e lisados celulares foram coletados e purificados em uma coluna NI-NTA. NS1 solúvel do sobrenadante e lisados foram resolvido em um SDS-PAG E gel e detectado usando um anticorpo policlonal anti-histidina em um ensaio de Western blot. BSA foi usado como um controle negativo e uma hemaglutinina solúvel marcada com HIS de A/Perth/16/09 (H3N2) foi usada como um controle positivo. Figuras 13A-13G. A vacina NS1 do vírus da Zika induz uma resposta de anticorpo robusta e funcional em ratos (FIG. 13A), delineando a estratégia de vacinação, onde os ratos foram imunizados com 80 µg de plasmídeo de DNA pCAGGS NS1 por eletroporação e seguido por duas imunizações de reforço de proteínas NS1 solúveis. Todas as vacinações foram administradas por via intramuscular. (FIG. 13B) Grupos de ratos vacinados, com cada adjuvante sendo usado para os componentes da proteína. (Figuras 13C-13E) A resposta do anticorpo a NS1 (PRVABC59 ZIKV) foi medida por ELISA. Cada ponto de dados denota um animal individual, enquanto cada cor representa um grupo de ratos. Os pontos de tempo são após o primer de DNA no dia 21, após o reforço de proteína no dia 42, ou soro do sangramento terminal no dia 84.
Os dados de ELISA foram executados em duplicata e mostrados como área sob a curva (AUC). Um teste não paramétrico de comparações múltiplas de Kruskal-Wallis foi usado para determinar a significância estatística em cada momento. Os asteriscos indicam significância estatística de um grupo (* = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001, **** = p <0,0001) em comparação com soro ingênuo.
Não foi observada significância entre os grupos de controle e o grupo ingênuo. (Figuras 13F-13G). Para examinar a capacidade dos anticorpos específicos de NS1 para ativar funções efetoras mediadas por Fc, as células Vero foram infectadas com PRVABC59 ZIKV ou células HEK 293T foram transfectadas com um plasmídeo de expressão NS1 (PCAGGS-NS1). Células Vero infectadas ou células HEK 293T transfectadas foram usadas como alvos para medir funções efetoras mediadas por anticorpos com uma linha de células Jurkat geneticamente modificada que expressa o FcRγIV murino com um gene repórter de luciferase induzível. A indução dobrada foi medida em unidades de luz relativa e calculada subtraindo o sinal de fundo dos poços sem células efetoras, em seguida, dividindo os poços com soro por poços sem adição de soro. Todos os soros foram testados com uma diluição inicial de 1:75 e foram diluídos em série três vezes em duplicado. Uma curva de melhor ajuste de regressão não linear foi gerada para cada conjunto de dados usando GraphPad Prism
6. As barras de erro representam SEM.
[0055] Figura 14A-14F. A transferência passiva de soro de ratos vacinados protege contra o desafio letal (Figuras 14A-14C) Grupos de 4 a 5 ratos B6.129-Stat2-/- machos e fêmeas tomaram injeções IP com 200 μL de soro agrupado antes de um desafio com 10LD50 (158 PFU por rato) de MR766 ZIKV por via intradérmica. (Figuras 14D-14F).
Grupos de 4 ratos B6.129-Stat2-/- machos e fêmeas tomaram injeções IP com 200 μL de soro agrupado antes de um desafio com 1000 PFU de PRVABC59 ZIKV por via intradérmica. A perda de peso foi monitorada diariamente. A pontuação clínica foi conduzida usando os critérios predefinidos com uma pontuação máxima possível de 7: impacto na caminhada (1), indiferença (1), perna traseira esquerda paralisada (1), perna traseira direita paralisada (1), perna dianteira esquerda paralisada (1), e perna dianteira direita paralisada (1).
Os animais mortos receberam uma pontuação de 7. As razões nas figuras indicam o número de animais que sobreviveram ao desafio sobre o número total de animais por grupo. Os testes de Mantel- Cox e Gehan-Breslow-Wilcoxon foram usados para analisar a significância estatística da sobrevida entre os dois grupos. Um teste t múltiplo e o método Holm-Sidak foram usados para determinar a significância estatística em cada ponto de tempo para a curva de peso e o escore clínico. Os asteriscos indicam significância estatística de um grupo (* = p <0,05) em comparação com ratos vacinados com BSA.
[0056] Figuras 15A-15F. Os anticorpos específicos de NS1 têm vida longa e são funcionais em humanos infectados com ZIKV. Dados de ELISA de soros humanos individuais contra a proteína NS1 recombinante de PRVABC59 ZIKV. Os dados de ELISA foram executados em duplicado e os valores representam a área sob a curva (AUC).
(FIG. 15B) Dados de ELISA de amostras humanas selecionadas com coleta de sangue repetida. Cada cor representa um paciente individual (FIG. 15C-15F). Para testar a capacidade de soros humanos para ativar funções efetoras mediadas por Fc, células Vero foram infectadas com PRVABC59 ZIKV e um ensaio repórter Fc-FcgR foi realizado como mostrado anteriormente. A legenda inclui o número identificador do paciente e os dias após o início dos sintomas (DPO). Todos os soros foram testados com uma diluição inicial de 1:75 e foram diluídos em série três vezes em duplicado.
Uma curva de melhor ajuste de regressão não linear foi gerada para cada conjunto de dados usando GraphPad Prism 6. As barras de erro representam SEM.
[0057] Figura 16A-16D. Os soros humanos podem envolver FcgRs ao alvejar células transfectadas com NS1. Para examinar a capacidade de soros humanos para ativar funções efetoras mediadas por Fc específicas de NS1, (Figuras 16A-16D) células HEK 293T foram transfectadas com um plasmídeo de expressão NS1 (PCAGGS-NS1). Cada cor representa uma amostra individual e a legenda inclui o número identificador do paciente e dias após o início (DPO) dos sintomas.
Um ensaio repórter in vitro substituto para medir as interações Fc-FcgR foi realizado como mostrado anteriormente. Todos os soros foram testados com uma diluição inicial de 1:75 e foram diluídos em série três vezes em duplicado. Uma curva de melhor ajuste de regressão não linear foi gerada para cada conjunto de dados usando GraphPad Prism 6. As barras de erro representam SEM.
[0058] As figuras 17A-17C. Os anticorpos específicos do envelope com reatividade cruzada não induzem respostas mediadas por Fc. Os soros de pacientes vacinados com TBEV foram analisados quanto à ligação às proteínas ZIKV e à capacidade de induzir funções efetoras mediadas por Fc. Os soros foram obtidos por meio de uma triagem de amostras de vacinados contra TBEV, conforme descrito anteriormente em Duehr et al. (FIG. 17A) Ensaios ELISAs realizados na proteína de envelope de ZIKV recombinante ou (FIG.
17B) proteína NS1 recombinante de PRVABC59 ZIKV. Todos os soros foram testados com uma diluição inicial de 1:40 e foram diluídos em série quatro vezes em duplicado. “Infecção aguda por ZIKV” é o soro de um paciente com infecção aguda confirmada por RT-PCR. (FIG.
17C) As células Vero foram infectadas com PRVABC59 ZIKV e um ensaio repórter substituto in vitro foi realizado para medir as interações Fc-FcgR. Todos os soros foram testados com uma diluição inicial de 1:25 e foram diluídos em série três vezes em duplicado.
[0059] Figura 18. Imunofluorescência de soro de rato reunido.
As células Vero foram infectadas com PRVABC59 ZIKV a um MOI de 0,5 durante 24 horas. As células foram fixadas com paraformaldeído a 0,5% e bloqueadas com 5% de leite desnatado. O soro foi adicionado a uma diluição de 1: 100 e um anticorpo anti-rato conjugado com Alexa Fluor 488 foi usado como um anticorpo secundário. As barras de escala são iguais a 200 mícrons.
[0060] Figuras 19A-B. As sequências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada e leve do anticorpo humano AA12 (SEQ ID NOs: 9 e 10, respectivamente) com as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) delineadas pelo sistema de numeração IMGT na FIG. 19A e as regiões de ligação do anticorpo (ABR) delineadas pelo sistema de Paratome na FIG. 19B.
[0061] Figuras 20A a 20B. As sequências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada e leve do anticorpo humano EB9 (SEQ ID NOs: 11 e 12, respectivamente) com as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) delineadas pelo sistema de numeração IMGT na FIG. 20A e as regiões de ligação do anticorpo (ABR) delineadas pelo sistema Paratome na FIG. 20B.
[0062] Figuras 21A a 21B. As sequências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada e leve do anticorpo humano GB5 (SEQ ID NOs:.: 13 e 14, respectivamente) com as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) delineadas pelo sistema de numeração IMGT na FIG. 21A e as regiões de ligação do anticorpo (ABR) delineadas pelo sistema de Paratome na FIG. 21B. Figura 22A a 22B. As sequências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada e leve do anticorpo humano FC12 (SEQ ID NOs: 15 e 16, respectivamente) com as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) delineadas pelo sistema de numeração IMGT na FIG. 22A e as regiões de ligação do anticorpo (ABR) delineadas pelo sistema de Paratome na figura 22B.
5. DESCRIÇÃO DETALHADA
5.1 ZIKA VIRUS NS1
[0063] São aqui fornecidos imunógenos NS1 do vírus da Zika recombinante (por exemplo, polipeptídeos NS1). Em um aspecto, é aqui fornecido um polipeptídeo NS1 compreendendo a sequência de aminoácidos de um NS1 do vírus da Zika e a sequência de aminoácidos de um fragmento da proteína de envelope do vírus da Zika, em que o fragmento da proteína de envelope do vírus da Zika é N-terminal para o sequência de aminoácidos do vírus da Zika NS1. Em modalidades específicas, o polipeptídeo NS1 compreende a sequência de aminoácidos de comprimento total de um NS1 do vírus da Zika. Em outras modalidades, o polipeptídeo NS1 compreende uma sequência de aminoácidos de um NS1 do vírus da Zika que não é a sequência de aminoácidos de comprimento total do NS1 do vírus da Zika. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo NS1 compreendia de 1 a 5, 1 a 10 ou 5 a 10 resíduos de aminoácidos menos do que a sequência de aminoácidos de comprimento total de um NS1 do vírus da Zika. Em algumas modalidades, o polipeptídeo NS1 compreendia de 1 a 5, 1 a 10 ou 5 a 10 resíduos de aminoácidos menos do que a sequência de aminoácidos de comprimento total de um NS1 do vírus da Zika no terminal N ou terminal C.
Em certas modalidades, o polipeptídeo
NS1 compreendia de 1 a 5, 1 a 10 ou 5 a 10 resíduos de aminoácidos menos do que a sequência de aminoácidos de comprimento total de um
NS1 do vírus da Zika no terminal N e terminal C.
Em modalidades específicas, o fragmento da proteína de envelope do vírus da Zika tem 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 aminoácidos de comprimento.
Em algumas modalidades, o fragmento da proteína de envelope do vírus da Zika tem 20 a 25, 20 a 30, 25 a 30 aminoácidos de comprimento.
Em certas modalidades, o fragmento da proteína de envelope do vírus da Zika tem 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75,
80, 85, 90, 95, 100 ou mais aminoácidos de comprimento, mas mais curto do que o envelope de comprimento total do vírus da Zika.
Em algumas modalidades, o fragmento da proteína de envelope do vírus da Zika é 100, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170,
175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250 , 275, 300, 325, 350, 375 ou 400 aminoácidos de comprimento, mas mais curto do que o envelope do vírus da Zika de comprimento total.
Em algumas modalidades, o fragmento da proteína de envelope do vírus da Zika tem 25 a 50, 30 a 40, 40 a 50, 25 a 75, 50 a 75, 50 a 100 ou 75 a 100 aminoácidos de comprimento.
Em certas modalidades, o fragmento da proteína de envelope do vírus da Zika é do terminal C da proteína de envelope do vírus da Zika de comprimento total.
Em uma modalidade específica, o fragmento da proteína de envelope do vírus da Zika inclui (ou consiste em) os resíduos de aminoácidos C-terminais 20 a 25, 20 a 30, 25 a 30 do envelope do vírus da Zika. Em algumas modalidades, o fragmento da proteína de envelope do vírus da Zika inclui (ou consiste em) os resíduos C-terminais 20 a 25, 20 a 30, 25 a 30 aminoácidos da proteína de envelope do vírus da Zika. Em certas modalidades, o fragmento da proteína de envelope do vírus da Zika inclui (ou consiste em) o terminal C 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 resíduos de aminoácidos da proteína de envelope do vírus da Zika. Em uma modalidade específica, o fragmento da proteína de envelope do vírus da Zika inclui (ou consiste em) os 24 resíduos de aminoácidos C-terminais da proteína de envelope do vírus da Zika. Em algumas modalidades, o fragmento da proteína de envelope do vírus da Zika tem pelo menos 24 resíduos de aminoácidos de comprimento do terminal C da proteína de envelope do vírus da Zika.
[0064] Em uma modalidade específica, um polipeptídeo NS1 fornecido neste documento inclui ou consiste na sequência de aminoácidos de qualquer NS1 do vírus da Zika conhecido pelos versados na técnica. Exemplos de vírus da Zika incluem vírus da Zika/Homo sapiens/Cuba 2017, vírus da Zika/H.sapiens- wt/BRA/2016/FC-DQ192D1-URI, vírus da Zika/H.sapiens- wt/DOM/2016/MA-WGS16-011-SER, vírus da Zika/H.sapiens- wt/DOM/2016/BB-0085-SER, vírus da Zika/H.sapiens-wt/HTI/2016/MA- WGS16-022-SER, vírus da Zika/H.sapiens-wt/PRI/2016/MA-WGS16-005-
SER, vírus da Zika/H.sapiens-wt/BRA/2016/FC-DQ62D1-PLA, vírus da Zika/H.sapiens-wt/BRA/2016/FC-DQ60D1-URI, vírus da Zika/H.sapiens-wt/COL/2016/SU-2293A-SER, vírus da Zika/H.sapiens- wt/COL/2016/SU-1856A-SER, vírus da Zika/H.sapiens-wt/BRA/2016/FC- DQ68D1-URI, vírus da Zika/A.aegypti-wt/ USA/2016/FL-08-MOS, vírus da Zika/H.sapiens-wt/COL/2016/SU-2724A-SER, vírus da Zika/H.sapiens-wt/DOM/2016/MA-WGS16-014-SER, vírus da Zika/H.sapiens-wt/HND /2016/HU-SZ76-SER, vírus da Zika/A.aegypti- wt/EUA/2016/FL-06-MOS, vírus da Zika/H.sapiens-wt/DOM/2016/BB- 0180-URI, vírus da Zika/H.sapiens-wt/DOM/2016/BB-0091-SER, vírus da Zika/H.sapiens-wt/USA/2016/FL-036-SER e vírus da Zika/H.sapiens-wt/DOM/2016/MA-WGS16-013-SER. Exemplos específicos de NS1 do vírus da Zika incluem, por exemplo, as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico do NS1 do vírus da Zika MR766, que podem ser encontrados no GenBank No. de Acesso MK105975, as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico de NS1 de PRVABC59 vírus da Zika, que pode ser encontrado no GenBank No. de Acesso KU501215, e a sequência de aminoácidos de NS1 de Pan/2015, que pode ser encontrada no GenBank No. de Acesso KX156774.
[0065] Em certas modalidades, um polipeptídeo NS1 é modificado por processamento pós-tradução, como glicosilação (por exemplo, glicosilação ligada a N.).
[0066] Em certas modalidades, um polipeptídeo NS1 fornecido neste documento inclui ainda um ou mais domínios polipeptídicos.
Domínios polipeptídicos úteis incluem domínios que facilitam a purificação, dobragem e clivagem de um polipeptídeo ou porções de um polipeptídeo. Por exemplo, uma etiqueta His (His-His-His-His- His-His; por exemplo, SEQ ID NO: 133), um epítopo FLAG ou outra etiqueta de purificação pode facilitar a purificação de um polipeptídeo NS1 aqui fornecido. Em algumas modalidades, a etiqueta His tem a sequência, (His) n, em que n é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20 ou superior.
Os locais de clivagem podem ser usados para facilitar a clivagem de uma porção de um polipeptídeo, por exemplo a clivagem de um marcador de purificação. Sítios de clivagem úteis incluem um local de clivagem de trombina, por exemplo, um com a sequência de aminoácidos LVPRGSP (SEQ ID NO: 141). Em certas modalidades, o local de clivagem é um local de clivagem reconhecido pela protease do vírus de ataque do tabaco (TEV) (por exemplo, sequência de aminoácidos Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser), SEQ ID NO: 142). Em uma modalidade específica, o local de clivagem inclui ou consiste na sequência de aminoácidos LEVLFNGPG (SEQ ID NO: 132).
[0067] Em uma modalidade específica, um polipeptídeo NS1 compreendendo a sequência de aminoácidos de NS1 de um vírus da Zika e os últimos 24 resíduos de aminoácidos de uma proteína de envelope do vírus da Zika, em que os 24 resíduos de aminoácidos da proteína de envelope são N-terminais para a sequência de aminoácido da sequência de aminoácidos do NS1 do vírus da Zika. Em certas modalidades, o polipeptídeo NS1 incluiu ainda um local de clivagem de protease de pré-sucessão (SEQ ID NO: 132), um motivo hexahistidina (SEQ ID NO: 133) ou ambos no terminal carboxi do NS1 do vírus da Zika.
[0068] Em uma modalidade específica, um polipeptídeo NS1 compreendendo a sequência de aminoácidos do NS1 do vírus da Zika PRVABC59 e os últimos 24 resíduos de aminoácidos da proteína de envelope (SEQ ID NO: 131), em que os 24 resíduos de aminoácidos da proteína de envelope são N-terminal da sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos NS1 do vírus da Zika PRVABC59. Em certas modalidades, o polipeptídeo NS1 incluiu ainda um local de clivagem de protease de pré-sucessão (SEQ ID NO: 132) e um motivo hexahistidina (SEQ ID NO: 133) no terminal carboxi de NS1 do vírus da Zika PRVABC59.
[0069] Em uma modalidade específica, um polipeptídeo NS1 é aquele descrito na Seção 6 (por exemplo, 6.2, infra). Em outra modalidade específica, um polipeptídeo NS1 fornecido neste documento inclui ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 166 ou 167.
[0070] Em modalidades específicas, os polipeptídeos NS1 fornecidos neste documento são capazes de formar uma estrutura tridimensional que é semelhante à estrutura tridimensional de um NS1 do vírus da Zika nativo. A similaridade estrutural pode ser avaliada com base em qualquer técnica considerada adequada por aqueles versados na técnica. Por exemplo, a reação, por exemplo, sob condições não desnaturantes, de um polipeptídeo NS1 com um anticorpo neutralizante ou antissoro que reconhece um vírus da Zika NS1 nativo pode indicar similaridade estrutural. Em certas modalidades, o anticorpo ou antissoro é um anticorpo ou antissoro que reage com um epítopo não contíguo (isto é, não contíguo na sequência primária) que é formado pela estrutura terciária ou quaternária de um Zika NS1.
[0071] Em uma modalidade, um polipeptídeo NS1 se liga ao anticorpo AA12 aqui descrito. Em outra modalidade, um polipeptídeo NS1 se liga ao anticorpo EB9 aqui descrito. Em outra modalidade, um polipeptídeo NS1 se liga ao anticorpo GB5 aqui descrito. Em outra modalidade, um polipeptídeo NS1 se liga ao anticorpo FC12 aqui descrito.
[0072] Em uma modalidade específica, os polipeptídeos NS1 fornecidos aqui são solúveis. Em outra modalidade específica, os polipeptídeos NS1 têm uma, duas ou mais das funções de um NS1 do vírus da Zika. Por exemplo, o polipeptídeo NS1 funciona como um NS1 do vírus da Zika na replicação do RNA viral, evasão imune ou ambos. Em outra modalidade, um dímero de um polipeptídeo NS1 fornecido aqui se associa à membrana plasmática de células infectadas pelo vírus da Zika. Em outra modalidade, um polipeptídeo NS1 aqui descrito se associa ao complexo de replicação viral na superfície do retículo endoplasmático.
[0073] Em uma modalidade específica, um polipeptídeo NS1 aqui descrito é produzido e isolado de forma recombinante. Em outra modalidade, um polipeptídeo NS1 aqui descrito é usado para imunizar um indivíduo contra o vírus da Zika. Em outra modalidade, um polipeptídeo NS1 aqui descrito é usado para produzir anticorpos, tal como descrito na Seção 5.2, infra. Os anticorpos podem ser produzidos em um indivíduo humano ou não humano (por exemplo, um rato, rato etc.). Em uma modalidade, o indivíduo não humano é capaz de produzir anticorpos humanos.
5.2 ANTICORPOS NSI ANTI-ZIKA
[0074] Em um aspecto, são aqui fornecidos anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais e fragmentos de ligação ao antígeno) que se ligam a uma proteína não estrutural 1 do vírus da Zika (NS-1). Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga a NS1 de uma, duas, três ou mais cepas de um vírus da Zika (por exemplo, uma cepa do vírus da Zika descrita na Seção 6, infra). Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito é isolado ou purificado.
[0075] Os anticorpos podem incluir, por exemplo, anticorpos monoclonais, anticorpos produzidos de forma recombinante, anticorpos monoespecíficos, anticorpos multiespecíficos (incluindo anticorpos biespecíficos), anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos sintéticos, anticorpos tetraméricos compreendendo duas moléculas de cadeia pesada e duas de cadeia leve, uma monômero de cadeia leve de anticorpo, um monômero de cadeia pesada de anticorpo, um dímero de cadeia leve de anticorpo, um dímero de cadeia pesada de anticorpo, um par de cadeia leve de anticorpo de cadeia pesada,
intracorpos, anticorpos heteroconjugados, anticorpos de domínio único, anticorpos monovalentes, anticorpos de cadeia simples ou
Fvs de cadeia (scFv), anticorpos camelizados, affybodies,
fragmentos Fab, fragmentos F(ab’), Fvs ligados por dissulfeto
(sdFv), anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-anti-Id), e fragmentos de ligação ao antígeno de qualquer um dos acima.
Em certas modalidades, os anticorpos aqui descritos se referem às populações de anticorpos policlonais.
Os anticorpos podem ser de qualquer tipo (por exemplo,
IgG, IgE, IgM, IgD, IgA ou IgY), qualquer classe (por exemplo,
IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 ou IgA2), ou qualquer subclasse (por exemplo, IgG2a ou IgG2b) da molécula de imunoglobulina.
Em certas modalidades, os anticorpos descritos neste documento são IgG, ou uma classe (por exemplo, IgG1 humana) ou subclasse dos mesmos.
Em certas modalidades, os anticorpos aqui descritos são IgA.
Em uma modalidade específica, um anticorpo inclui qualquer molécula com um local de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno.
Em algumas modalidades, um anticorpo inclui um fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, a região ou regiões de uma imunoglobulina que se liga a um antígeno ou um epítopo, como uma sequência compreendendo regiões determinantes de complementaridade (por exemplo, a cadeia pesada e/ou leve regiões variáveis)). Em outras modalidades, um anticorpo não VH inclui fragmentos de ligação ao antígeno.
[0076] Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito é um anticorpo monoclonal. Tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo monoclonal" se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos homogêneos ou substancialmente homogêneos. O termo "monoclonal" não está limitado a qualquer método particular para fazer o anticorpo. Geralmente, uma população de anticorpos monoclonais pode ser gerada por células, uma população de células ou uma linha celular. Em modalidades específicas, um "anticorpo monoclonal", tal como aqui utilizado, é um anticorpo produzido por uma única célula (por exemplo, hibridoma ou célula hospedeira que produz um anticorpo recombinante), em que o anticorpo se liga a um vírus da Zika NS1 conforme determinado, por exemplo, por ELISA ou outro ensaio de ligação ao antígeno ou de ligação competitiva conhecido na técnica ou nos exemplos aqui fornecidos. Em certas modalidades, um anticorpo monoclonal pode ser um anticorpo quimérico, um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado. Em certas modalidades, um anticorpo monoclonal é um anticorpo monovalente ou anticorpo multivalente (por exemplo, bivalente). Em certas modalidades, um anticorpo monoclonal é um anticorpo monoespecífico ou multiespecífico (por exemplo, anticorpo biespecífico). Os anticorpos monoclonais aqui descritos podem, por exemplo, ser produzidos pelo método do hibridoma conforme descrito em Kohler et al.; Nature, 256: 495 (1975) ou pode, por exemplo, ser isolado de bibliotecas de fagos usando as técnicas aqui descritas, por exemplo. Outros métodos para a preparação de linhas celulares clonais e de anticorpos monoclonais assim expressos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Capítulo 11 em: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel et al., Eds., John Wiley e Sons, New York).
[0077] Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito é uma imunoglobulina, tal como uma IgG, IgE, IgM, IgD, IgA ou IgY.
Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito é um IgG2a. Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito é um IgG1. Em outra modalidade, o anticorpo aqui descrito é um fragmento de ligação ao antígeno, tal como, por exemplo, um fragmento Fab ou fragmento F(ab’)2. Em outra modalidade, um anticorpo aqui descrito é um scFv.
Em outra modalidade, são aqui fornecidos anticorpos policlonais ou anticorpos monoclonais produzidos usando um polipeptídeo NS1 descrito na Seção 5.1, supra, ou Seção 6, infra.
[0078] Em uma modalidade específica, os termos "NS1" e "proteína não estrutural 1" se referem a qualquer vírus da Zika NS1 conhecido pelos versados na técnica. Exemplos de vírus da Zika incluem aqueles fornecidos na Seção 5.1, supra e 6, infra. Em certas modalidades, NS1 é modificado por processamento pós-tradução, como glicosilação (por exemplo, glicosilação ligada a N.).
[0079] Em outro aspecto, os anticorpos fornecidos neste documento se ligam a um vírus da Zika NS1 com uma certa afinidade.
"Afinidade de ligação" geralmente se refere à força da soma total de interações não covalentes entre um único local de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indicado de outra forma, tal como aqui utilizado, "afinidade de ligação" se refere à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno).
A afinidade de uma molécula X por seu parceiro Y geralmente pode ser representada pela constante de dissociação (KD). A afinidade pode ser medida e/ou expressa de várias maneiras conhecidas na técnica, incluindo, mas não se limitando a constante de dissociação de equilíbrio (KD), constante de associação de equilíbrio (KA) e IC50. O KD é calculado a partir do quociente de Kon/koff, enquanto KA é calculado a partir do quociente de Kon/koff. kon se refere à constante de taxa de associação de, por exemplo, um anticorpo para um antígeno, e koff se refere à dissociação de, por exemplo, um anticorpo para um antígeno. O Kon e koff podem ser determinados por técnicas conhecidas por um especialista na técnica, tais como BIAcore™, Kinexa ou interferometria de biocamada. Ver, por exemplo, as técnicas descritas na Seção 6, infra.
[0080] A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles aqui descritos. Por exemplo, constantes de taxa de associação individual (Kon) e dissociação (koff) podem ser calculadas a partir das curvas de ligação resultantes usando o software de avaliação disponível através do fornecedor. Os dados podem então ser ajustados a um modelo de ligação 1:1, que inclui um termo para corrigir a ligação limitada ao transporte de massa, caso ela seja detectada. A partir dessas constantes de taxa, a constante de ligação de dissociação aparente (KD) para a interação do anticorpo (por exemplo, IgG) com o antígeno (por exemplo, vírus da Zika NS1) pode ser calculada a partir do quociente de Kon/koff. Os anticorpos de baixa afinidade geralmente se ligam ao antígeno lentamente e tendem a se dissociar prontamente, enquanto os anticorpos de alta afinidade geralmente se ligam ao antígeno mais rápido e tendem a permanecer ligados por mais tempo. Uma variedade de métodos de medição da afinidade de ligação são conhecidos na técnica, qualquer um dos quais pode ser usado para os fins descritos neste documento.
[0081] Em uma modalidade específica, são aqui fornecidos anticorpos que se ligam a um vírus da Zika NS1 com um Kon, koff e/ou KD dentro do intervalo ou conforme divulgado na Tabela 10. Em certas modalidades, a afinidade dos anticorpos é determinada usando uma técnica descrita aqui (por exemplo, na Seção 6, infra) ou um por uma pessoa versada na técnica, como, por exemplo,
tecnologia de ressonância plasmônica de superfície BIAcore™, Kinexa ou interferometria de biocamada.
[0082] Em algumas modalidades, um anticorpo fornecido aqui se liga a um vírus da Zika NS1 com um KD de cerca de 10-7 molar, 5 x 10-7 molar, 10-8 molar, 5 x10-8 molar, 10-9 molar, 5 x 10-9 molar ou 10-10 molar. Em certas modalidades, um anticorpo fornecido aqui se liga a um vírus da Zika NS1 com um KD de 10-7 a 10-8 molar, 10-8 a 10-9 molar, 10-8 a 10-10 molar, 10-7 a 10-10 molar, ou 10-7 a 10-9 molar.
[0083] Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito tem uma alta avidez para um vírus da Zika NS1, conforme avaliado por uma técnica conhecida por uma pessoa versada na técnica, tal como um imunoensaio, ressonância plasmônica de superfície ou ensaio de exclusão cinética, interferometria de biocamada ou aqui descrito. Em particular, um anticorpo fornecido aqui tem uma avidez maior do que o anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12.
[0084] Em uma modalidade, são aqui fornecidos anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais, como anticorpos humanos, quiméricos ou humanizados e fragmentos de ligação ao antígeno) que se ligam ao NS1 do vírus da Zika MR766, PRVABC59, Pan/2015 ou uma combinação dos mesmos. por uma técnica conhecida por uma pessoa versada na técnica, tal como um imunoensaio, ressonância plasmônica de superfície ou ensaio de exclusão cinética, interferometria de biocamada ou aqui descrito. Em outra modalidade, um anticorpo aqui descrito se liga a um vírus da Zika NS1 que tem 90%, 95%, 98%, 99% ou maior identidade com a proteína NS1 do vírus da Zika MR766, PRVABC59 ou Pan/2015, conforme avaliado por uma técnica conhecida para uma pessoa versada na técnica, tal como um imunoensaio, ressonância plasmônica de superfície ou ensaio de exclusão cinética, interferometria de biocamada ou aqui descrito.
[0085] Em outra modalidade, são aqui fornecidos anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais, como anticorpos humanos, quiméricos ou humanizados e fragmentos de ligação ao antígeno) que se ligam ao NS1 de diferentes cepas do vírus da Zika (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais cepas) conforme avaliado por uma técnica conhecida por uma pessoa versada na técnica, tal como um imunoensaio, ressonância plasmônica de superfície ou ensaio de exclusão cinética, ou aqui descrito. Em outra modalidade, são aqui fornecidos anticorpos que se ligam a NS1 de linhagens africanas do vírus da Zika, linhagens asiáticas do vírus da Zika ou ambos.
[0086] Em outra modalidade, um anticorpo aqui descrito se liga a células infectadas com um vírus da Zika. Em outra modalidade, um anticorpo aqui descrito se liga a células infectadas com o vírus da Zika MR766, PRVABC59 ou Pan/2015. Em outra modalidade, um anticorpo aqui descrito se liga a células infectadas com um vírus da Zika que expressa um NS1 que tem 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% ou maior identidade com o NS1 do vírus da Zika MR766, PRVABC59 ou Pan/2015.
[0087] Em outra modalidade, um anticorpo aqui descrito se liga a uma proteína NS1 recombinante (por exemplo, uma forma recombinante de um NS1 do vírus da Zika), tal como descrito neste documento (por exemplo, na Seção 5.1, supra, ou 6, infra. Aqui descrito se liga a um recombinante Proteína NS1 que tem 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou maior identidade com a proteína NS1 do vírus da Zika MR766, PRVABC59 ou Pan/2015, conforme avaliado por uma técnica conhecida para uma pessoa versada na técnica, tal como um imunoensaio, ressonância plasmônica de superfície de superfície ou ensaio de exclusão cinética, interferometria de biocamada ou descrito neste documento, descrito na Seção 5.1, supra, ou 6, infra.
[0088] Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito se liga ao vírus da Zika NS1 e inibe a atividade do NS1. Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito se liga ao vírus da Zika NS1 e inibe o papel do vírus da Zika NS1 na replicação do genoma, inibe uma, duas ou mais funções imunomoduladoras do vírus da Zika NS1, ambos inibem o papel do vírus da Zika NS1 na replicação do genoma e uma, duas ou mais funções imunomoduladoras do vírus da Zika NS1. A inibição do papel do vírus da Zika NS1 na replicação do genoma pode ser completa ou parcial, conforme avaliado por uma técnica conhecida por uma pessoa versada na técnica ou aqui descrita (por exemplo, Seção 6, infra). A inibição de uma, duas ou mais funções imunomoduladoras do vírus da Zika NS1 pode ser completa ou parcial, conforme avaliado por uma técnica conhecida por uma pessoa versada na técnica.
[0089] Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito que se liga a NS1 do vírus da Zika é um anticorpo não neurtralizante. Em outra modalidade, um anticorpo aqui descrito que se liga a NS1 do vírus da Zika não exibe nenhum aumento dependente de anticorpos da infecção pelo vírus da Zika in vitro, conforme avaliado por uma técnica conhecida na técnica ou aqui descrita (por exemplo, Seção 6, infra). Em outras modalidades, um anticorpo aqui descrito que se liga ao NS1 do vírus da Zika ativa as células Natural Killer (NK).
[0090] Em outro aspecto, um anticorpo fornecido neste documento demonstra funções efetoras de anticorpo mediadas por Fc em um ensaio in vitro conhecido por uma pessoa versada na técnica ou aqui descrito (por exemplo, na Seção 6, infra). Em outra modalidade, um anticorpo fornecido aqui demonstra um, dois ou todos os seguintes: citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), fagocitose mediada por células dependente de anticorpos (ADCP) e lise mediada por complemento dependente de anticorpos conforme avaliado por técnicas conhecidas por uma pessoa versada na técnica ou aqui descritas. Em uma modalidade específica, um anticorpo fornecido neste documento demonstra citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC).
Em uma modalidade específica, um anticorpo fornecido neste documento demonstra a atividade ADCC em um ensaio in vitro conhecido por uma pessoa versada na técnica. Por exemplo, a atividade ADCC pode ser avaliada usando o ADCC Reporter Assay Core Kit da Promega.
[0091] Em outro aspecto, um anticorpo fornecido neste documento tem uma, duas ou mais ou todas as características/propriedades de um dos anticorpos descritos na Seção 6, infra. Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito tem uma, duas ou mais ou todas as características/propriedades do anticorpo AA12 aqui descrito. Em outra modalidade específica, um anticorpo fornecido neste documento tem uma, duas ou mais ou todas as características/propriedades do anticorpo EB9 aqui descrito. Em outra modalidade específica, um anticorpo fornecido aqui tem uma, duas ou mais ou todas as características/propriedades do anticorpo GB5 aqui descrito. Em outra modalidade específica, um anticorpo fornecido aqui tem uma, duas ou mais ou todas as características/propriedades do anticorpo FC12 aqui descritas.
[0092] Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito se liga a NS1 do vírus da Zika. Em outra modalidade, é fornecido neste documento um anticorpo que se liga especificamente a um NS1 de uma, duas, três ou mais cepas de vírus da Zika em relação a um antígeno não vírus da Zika (por exemplo, um não vírus da Zika NS1)
conforme avaliado por técnicas conhecidas na arte, por exemplo, ELISA, Western blot, interferometria de biocamada, FACS ou BIACore, ou aqui descrito. Em outras palavras, o anticorpo se liga a um NS1 de uma, duas, três ou mais cepas de vírus da Zika com uma afinidade maior do que o anticorpo se liga a um antígeno não vírus da Zika (por exemplo, um não vírus da Zika NS1) conforme avaliado por técnicas conhecidas na arte, por exemplo, ELISA, Western blot, interferometria de biocamada, FACS ou BIACore, ou aqui descritas.
Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito se liga a um NS1 de uma, duas, três ou mais cepas do vírus da Zika com uma taxa de 1 vez, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, mais de 10 vezes, 1 a 2 vezes, 1 a 5 vezes, 1 a 10 vezes, 2 a 5 vezes, 2 a 10 vezes, 5 a 10 vezes, 10 a 15 vezes ou 10 a 20 vezes maior afinidade do que aquela com a qual o anticorpo se liga a um antígeno do vírus não Zika (por exemplo, um NS1 não-Zika) conforme avaliado por técnicas conhecidas na arte, por exemplo, ELISA, Western blot, interferometria de biocamada, FACS ou BIACore, ou aqui descrito.
Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito se liga a um NS1 de uma, duas, três ou mais cepas de vírus da Zika com um log de 0,5, 1 log, 1,5 log, 2 log, 2,5 log, 3 log, 3,5 log ou 4 log maior afinidade do que aquela com a qual o anticorpo se liga a um antígeno não vírus da Zika (por exemplo, um não vírus da Zika NS1) conforme avaliado por técnicas conhecidas, por exemplo, ELISA, Western blot, interferometria de biocamada, FACS ou BIACore, ou aqui descrito. Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito se liga a um NS1 de uma, duas, três ou mais cepas do vírus da Zika com 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ou afinidade maior do que aquela com a qual o anticorpo se liga a um antígeno do vírus não Zika, conforme medido por, por exemplo, um radioimunoensaio, ressonância plasmônica de superfície, ensaio de exclusão cinética, ou interferometria de biocamada, ou aqui descrito.
[0093] Em outra modalidade, um anticorpo aqui descrito não apresenta reação cruzada com um NS1 de outro flavivírus, conforme avaliado por técnicas conhecidas na arte, por exemplo, ELISA, Western blot, interferometria de biocamada, FACS ou BIACore, ou aqui descrito. Em certas modalidades, é aqui fornecido um anticorpo que se liga especificamente a um NS1 de uma, duas, três ou mais cepas de vírus da Zika em relação a um NS1 de outro flavivírus, conforme avaliado por técnicas conhecidas na arte, por exemplo, ELISA, Western blot, interferometria de biocamada, FACS ou BIACore, ou aqui descrito. Em outras palavras, o anticorpo se liga a um NS1 de uma, duas, três ou mais cepas do vírus da Zika com uma afinidade maior do que o anticorpo se liga a um NS1 de outro flavivírus, conforme avaliado por técnicas conhecidas na arte, por exemplo, ELISA, Western blot, interferometria de biocamada, FACS ou BIACore, ou aqui descrito. Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito se liga a um NS1 de uma, duas, três ou mais cepas do vírus da Zika com uma taxa de 1 vez, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes,
4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes,
mais de 10 vezes, 1 a 2 vezes, 1 a 5 vezes, 1 a 10 vezes, 2 a 5 vezes, 2 a 10 vezes, 5 a 10 vezes, 10 a 15 vezes ou 10 a 20 vezes maior afinidade do que aquela que o anticorpo se liga a um NS1 de outro flavivírus, conforme avaliado por técnicas conhecidas na arte, por exemplo, ELISA, Western blot, interferometria de biocamada, FACS ou BIACore, ou aqui descrito.
Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito se liga a um NS1 de uma,
duas, três ou mais cepas de vírus da Zika com um log de 0,5, 1 log, 1,5 log, 2 log, 2,5 log, 3 log, 3,5 log ou 4 log maior afinidade do que aquela que o anticorpo se liga a um NS1 de outro flavivírus, conforme avaliado por técnicas conhecidas na arte, por exemplo, ELISA, Western blot, interferometria de biocamada, FACS ou BIACore, ou aqui descrito.
Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito se liga a um NS1 de uma, duas, três ou mais cepas do vírus da Zika com 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,
55%, 60%, 65%, 70% ou afinidade maior do que aquela que o anticorpo se liga a um NS1 de outro flavivírus, conforme medido por, por exemplo, um radioimunoensaio, ressonância plasmônica de superfície, ensaio de exclusão cinética ou interferometria de biocamada, ou aqui descrito.
[0094] Em outra modalidade, um anticorpo aqui descrito não apresenta reação cruzada com um NS1 de um vírus da Dengue conforme avaliado por técnicas conhecidas na arte, por exemplo, ELISA,
Western blot, interferometria de biocamada, FACS ou BIACore, ou aqui descrito.
Em certas modalidades, é aqui fornecido um anticorpo que se liga especificamente a um NS1 de uma, duas, três ou mais cepas do vírus da Zika em relação a um NS1 de um vírus da Dengue conforme avaliado por técnicas conhecidas na arte, por exemplo,
ELISA, Western blot, interferometria de biocamada, FACS ou
BIACore, ou aqui descrito.
Em outras palavras, o anticorpo se liga a um NS1 de uma, duas, três ou mais cepas do vírus da Zika com uma afinidade maior do que o anticorpo se liga a um NS1 de um vírus da
Dengue conforme avaliado por técnicas conhecidas na arte, por exemplo, ELISA, Western blot, interferometria de biocamada, FACS ou BIACore, ou aqui descrito.
Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito se liga a um NS1 de uma, duas, três ou mais cepas do vírus da Zika com uma taxa de 1 vez, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes,
4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes,
mais de 10 vezes, 1 a 2 vezes, 1 a 5 vezes, 1 a 10 vezes, 2 a 5 vezes, 2 a 10 vezes, 5 a 10 vezes, 10 a 15 vezes ou 10 a 20 vezes maior afinidade do que aquela que o anticorpo se liga a um NS1 de um vírus da Dengue, conforme avaliado por técnicas conhecidas na arte, por exemplo, ELISA, Western blot, interferometria de biocamada, FACS ou BIACore, ou aqui descritas.
Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito se liga a um NS1 de uma, duas, três ou mais cepas de vírus da Zika com um log de 0,5, 1 log, 1,5 log, 2 log, 2,5 log, 3 log, 3,5 log ou 4 log maior afinidade do que aquela que o anticorpo se liga a um NS1 de um vírus da Dengue conforme avaliado por técnicas conhecidas na arte, por exemplo, ELISA, Western blot, interferometria de biocamada, FACS ou BIACore, ou aqui descrito. Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito se liga a NS1 de uma, duas, três ou mais cepas do vírus da Zika com 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45 %, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ou afinidade maior do que aquela que o anticorpo se liga a um NS1 de um vírus da Dengue conforme medido por, por exemplo, um radioimunoensaio, ressonância plasmônica de superfície, ensaio de exclusão cinética ou interferometria de biocamada, ou aqui descrito. Em modalidades específicas, um anticorpo aqui descrito se liga a NS1 do vírus da Zika e não se liga ao vírus Dengue NS1 (por exemplo, DENV3 NS1) conforme avaliado por técnicas conhecidas na arte, por exemplo, ELISA, Western blot, interferometria de biocamada, FACS ou BIACore, ou aqui descrito (por exemplo, na Seção 6, infra).
[0095] Em certas modalidades, são aqui fornecidos anticorpos que: (i) se ligam a um epítopo não linear de NS1 de um vírus da Zika e (ii) inibem uma, duas ou mais funções do NS1, conforme avaliado por uma técnica conhecida por uma pessoa versada na técnica ou aqui descrito. Em algumas modalidades, são aqui fornecidos anticorpos que: (i) se ligam a um epítopo linear de NS1 de um vírus da Zika e (ii) inibem uma, duas ou mais funções do NS1, conforme avaliado por uma técnica conhecida por uma pessoa versada na técnica ou aqui descrito.
[0096] Em outro aspecto, um anticorpo aqui descrito é o anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em outro aspecto, um anticorpo fornecido neste documento inclui a região variável da cadeia pesada ("VH) ou região variável da cadeia leve ("VL") do anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12.
Em outro aspecto, um anticorpo fornecido neste documento inclui a região variável da cadeia pesada ("VH") e a região variável da cadeia leve ("VL") do anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12. Em uma modalidade específica, um anticorpo fornecido neste documento é codificado por uma ou mais sequências de ácido nucleico que compreendem (1) as sequências de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 1 e 2; (2) sequências de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 3 e 4; (3) sequências de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 5 e 6; ou (4) sequências de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 7 e 8. Em uma modalidade específica, um anticorpo fornecido aqui é um anticorpo descrito na Seção 6.1, infra.
[0097] Conforme usado neste documento, os termos "região variável" ou "domínio variável" são usados indistintamente e são comuns na técnica. Às vezes, uma região variável da cadeia pesada é aqui referida como um domínio VH ou VH. Às vezes, uma região variável de cadeia leve é referida como um domínio VL ou VL. A região variável se refere tipicamente a uma porção de um anticorpo, geralmente, uma porção de uma cadeia leve ou pesada, tipicamente cerca do terminal amino de 110 a 120 aminoácidos em uma cadeia pesada madura e cerca do terminal amino de 90 a 100 aminoácidos em uma cadeia leve madura, que difere extensivamente em sequência entre os anticorpos e é usada na ligação e especificidade de um anticorpo particular para seu antígeno particular. A variabilidade na sequência está concentrada nas regiões chamadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), enquanto as regiões mais altamente conservadas no domínio variável são chamadas regiões estruturais (FR). As CDRs são flanqueadas por FRs.
Geralmente, a orientação espacial das CDRs e FRs é a seguinte, em uma direção do terminal N para o terminal C: FR1-CDR1-FR2-CDR2- FR3-CDR3-FR4. Sem desejar estar limitado por qualquer mecanismo ou teoria particular, acredita-se que as CDRs das cadeias leve e pesada são as principais responsáveis pela interação e especificidade do anticorpo com o antígeno.
[0098] Em certas modalidades, a região variável é uma região variável de roedor (por exemplo, rato ou rato). Em certas modalidades, a região variável é uma região variável humana. Em certas modalidades, a região variável compreendia CDRs de roedores (por exemplo, rato ou rato) e regiões estruturais humanas (FRs).
Em certas modalidades, a região variável é uma região variável de primata (por exemplo, primata não humano). Em certas modalidades, a região variável abrange CDRs de roedores ou murinos e regiões estruturais (FRs) de primatas (por exemplo, primatas não humanos).
[0099] Em outro aspecto, um anticorpo fornecido neste documento inclui uma, duas ou três das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da região variável da cadeia pesada (domínio "VH") ou uma, duas ou três das CDRs da região variável da cadeia leve (“VL”) do anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12. Em outro aspecto, um anticorpo fornecido neste documento inclui uma, duas ou três das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da região variável da cadeia pesada ("VH") e uma, duas ou três das CDRs da região variável da cadeia leve ("VL”) do anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12. Em outro aspecto, um anticorpo fornecido neste documento incluiu as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da região variável da cadeia pesada ("VH") e as CDRs da região variável da cadeia leve ("VL") de AA12, EB9, GB5 ou anticorpo FC12. Em algumas modalidades, o anticorpo compreendeu ainda regiões estruturais de um anticorpo não murino (por exemplo, um anticorpo humano) ou regiões estruturais derivadas de um anticorpo não murino (por exemplo, um anticorpo humano).
[00100] Em certos aspectos, as CDRs de um anticorpo podem ser determinadas de acordo com o sistema de numeração de Kabat. O termo "numeração de Kabat" e termos semelhantes são reconhecidos na técnica e se referem a um sistema de numeração de resíduos de aminoácidos nas regiões variáveis da cadeia pesada e leve de um anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo. Em certos aspectos, as CDRs de um anticorpo podem ser determinadas de acordo com o sistema de numeração de Kabat (ver, por exemplo, Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190: 382-391 e Kabat et al. (1991)) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91- 3242). No que diz respeito ao sistema de numeração de Kabat, (i) a VH CDR1 está tipicamente presente nas posições de aminoácidos 31 a 35 da cadeia pesada, que pode incluir opcionalmente um ou dois aminoácidos adicionais após a posição de aminoácido 35 (referido no Kabat esquema de numeração como 35A e 35B); (ii) a VH CDR2 está tipicamente presente nas posições de aminoácidos 50 a 65 da cadeia pesada; e (iii) a VH CDR2 está tipicamente presente nas posições de aminoácidos 95 a 102 da cadeia pesada (Kabat, Elvin A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda: National Institutes of Health, 1983). No que diz respeito ao sistema de numeração de Kabat, (i) a VL CDR1 está tipicamente presente nas posições de aminoácidos 24 a 34 da cadeia leve; (ii) a VL CDR2 está tipicamente presente nas posições de aminoácidos 50 a 56 da cadeia leve; e (iii) a VL CDR3 está tipicamente presente nas posições de aminoácidos 89 a 97 da cadeia leve (Kabat, Elvin A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest.
Bethesda: National Institutes of Health, 1983). Como é bem conhecido pelos versados na técnica, usando o sistema de numeração de Kabat, a sequência de aminoácidos linear real do domínio variável do anticorpo pode conter menos ou mais aminoácidos devido a um encurtamento ou alongamento de uma FR e/ou CDR e, como tal, o número de Kabat de um aminoácido não é necessariamente igual ao seu número de aminoácido linear.
[00101] Em certos aspectos, as CDRs de um anticorpo podem ser determinadas de acordo com o esquema de numeração de Chothia, que se refere à localização de laços estruturais de imunoglobulina (ver, por exemplo, Chothia e Lesk, 1987, J. Mol. Biol., 196: 901- 917; Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273: 927-948; Chothia et al., 1992, J. Mol. Biol., 227: 799-817; Tramontano A et al., 1990, J. Mol. Biol. 215 (1): 175-82; e Patente US No. 7,709,226).
A definição de Chothia é baseada na localização das regiões do laço estrutural (Chothia et al., (1987) J Mol Biol 196: 901-917; e Patente US No. 7.709.226). O termo "CDRs de Chothia" e termos semelhantes são reconhecidos na técnica e se referem a sequências de CDR de anticorpos conforme determinado de acordo com o método de Chothia e Lesk, 1987, J. Mol. Biol., 196: 901-917, que será referido neste documento como "CDRs de Chothia" (ver também, por exemplo, Patente US No. 7,709,226 e Martin, A., "Protein Sequência and Structure Analysis of Anticorpo Variable Domains", em Anticorpo Engineering, Kontermann e Dübel, eds., Capítulo 31, pp.
422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001)). No que diz respeito ao sistema de numeração de Chothia, usando o sistema de numeração de Kabat de resíduos de aminoácidos de numeração na região VH, (i) a CDR1 de VH está tipicamente presente nas posições de aminoácidos 26 a 32 da cadeia pesada; (ii) a VH CDR2 está tipicamente presente nas posições de aminoácidos 53 a 55 da cadeia pesada; e (iii) a VH CDR3 está tipicamente presente nas posições de aminoácidos 96 a 101 da cadeia pesada. Em uma modalidade específica, com relação ao sistema de numeração de Chothia, usando o sistema de numeração de Kabat de resíduos de aminoácidos de numeração na região VH, (i) a CDR1 de VH está tipicamente presente nas posições de aminoácidos 26 a 32 ou 34 da cadeia pesada; (ii) a VH CDR2 está tipicamente presente nas posições de aminoácidos 52 a 56 (em uma modalidade, CDR2 está nas posições 52A a 56, em que 52A segue a posição 52) da cadeia pesada; e (iii) a VH CDR3 está tipicamente presente nas posições de aminoácidos 95 a 102 da cadeia pesada (em uma modalidade, não há aminoácido nas posições numeradas de 96 a 100).
No que diz respeito ao sistema de numeração de Chothia, usando o sistema de numeração de Kabat de resíduos de aminoácidos de numeração na região VL, (i) a CDR1 de VL está tipicamente presente nas posições de aminoácidos 26 a 33 da cadeia leve; (ii) a VL CDR2 está tipicamente presente nas posições de aminoácidos 50 a 52 da cadeia leve; e (iii) a VL CDR3 está tipicamente presente nas posições de aminoácidos 91 a 96 da cadeia leve. Em uma modalidade específica, com relação ao sistema de numeração de Chothia, usando o sistema de numeração de Kabat de resíduos de aminoácidos de numeração na região VL, (i) a CDR1 de VL está tipicamente presente nas posições de aminoácidos 24 a 34 da cadeia leve; (ii) a VL CDR2 está tipicamente presente nas posições de aminoácidos 50 a 56 da cadeia leve; e (iii) a VL CDR3 está tipicamente presente nas posições de aminoácidos 89 a 97 da cadeia leve (em uma modalidade, não há aminoácido nas posições numeradas de 96 a 100). Estas posições de CDR de Chothia podem variar dependendo do anticorpo e podem ser determinadas de acordo com métodos conhecidos na técnica.
[00102] Em certos aspectos, as CDRs de um anticorpo podem ser determinadas de acordo com o sistema de numeração IMGT conforme descrito em Lefranc, M.-P., 1999, The Immunologist, 7: 132-136 e Lefranc, M.-P. et al., 1999, Nucleic Acids Res., 27: 209-212. A definição IMGT vem do IMGT ("IMGT®, o site internacional do sistema de informação ImMunoGeneTics® imgt.org, fundador e diretor: Marie- Paule Lefranc, Montpellier, França; ver, por exemplo, Lefranc, M.- P., 1999, The Immunologist, 7: 132-136 e Lefranc, M.-P. et al., 1999, Nucleic Acids Res., 27: 209-212, ambos os quais são aqui incorporados por referência na sua totalidade). Sistema de numeração IMGT, (i) a VH CDR1 está tipicamente presente nas posições de aminoácidos 25 a 35 da cadeia pesada; (ii) a VH CDR2 está tipicamente presente nas posições de aminoácidos 51 a 57 da cadeia pesada; e (iii) a VH CDR2 está tipicamente presente nas posições de aminoácidos 93 a 102 da cadeia pesada. Com relação ao sistema de numeração IMGT, (i) a VL CDR1 está tipicamente presente nas posições de aminoácidos 27 a 32 da cadeia leve; (ii) a VL CDR2 é tipicamente presente nas posições de aminoácidos 50 a 52 da cadeia leve; e (iii) a VL CDR3 está tipicamente presente nas posições de aminoácidos 89 a 97 da cadeia leve.
[00103] Em certos aspectos, as CDRs de um anticorpo podem ser determinadas de acordo com MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 262: 732-745. Ver também, por exemplo, Martin, A., "Protein Sequência and Structure Analysis of Anticorpo Variable Domains", em Anticorpo Engineering, Kontermann e Dübel, eds., Capítulo 31, pp. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001).
[00104] Em certos aspectos, as CDRs de um anticorpo podem ser determinadas de acordo com o esquema de numeração AbM, que se refere às regiões hipervariáveis AbM que representam um compromisso entre as CDRs Kabat e laços estruturais Chothia, e são usados pelo software de modelagem de anticorpos AbM da Oxford Molecular. Em certos aspectos, as CDRs ou regiões de ligação de anticorpos (ABRs) de um anticorpo podem ser determinados de acordo com Paratome (Kunik et al., 2012, Nucleic Acids Res. Vol. 40, Web Server issue W521-W524 e consulte o site de ranservices.
biu.ac.il/site/services/paratome/index.html). Em alguns casos aqui, o termo CDRs é usado em vez de ABRs quando se refere aos ABRs delineados usando o sistema Paratome.
[00105] Em um aspecto específico, um anticorpo fornecido neste documento que se liga ao vírus da Zika NS1 (por exemplo, um vírus da Zika NS1, tal como descrito na Seção 6, infra), em que o anticorpo inclui uma região variável da cadeia pesada ("VH") ou cadeia pesada compreendendo: (1) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos GFTVSSNY (SEQ ID NO: 143), (2) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos IYSGGST (SEQ ID NO: 144), e (3) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARDRRGFDY (SEQ ID NO: 145), ARWGGKRGGAFDI (SEQ ID NO: 146), ARLIAAAGDY (SEQ ID NO: 147) ou ARGPVQLERRPLGAFDI (SEQ ID NO: 148).
Em outro aspecto, um anticorpo fornecido neste documento que se liga ao vírus da Zika NS1 (por exemplo, um vírus da Zika NS1, tal como descrito na Seção 6, infra), em que o anticorpo inclui uma região variável de cadeia leve ("VL") ou cadeia leve compreendendo: (1) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSX, X é Y ou H (SEQ ID NO: 134), (2) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos X1X2S, X1 é A ou Q, X2 é A ou D (SEQ ID NO: 135), e (3) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QQX1YSTPX2T, X1 é T ou S, X2 é L, Y ou W (SEQ ID NO: 136). Em outro aspecto, é fornecido neste documento um anticorpo que se liga ao vírus da Zika NS1 (por exemplo, um vírus da Zika NS1, tal como descrito na Seção 6, infra), em que o anticorpo inclui uma região variável da cadeia pesada (VH") e uma variável leve região de cadeia, em que a região variável da cadeia pesada compreende (1) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos GFTVSSNY (SEQ ID NO: 143), e (2) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos IYSGGST (SEQ ID NO: 144) , e em que a região variável da cadeia leve compreendia (1) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSX, X é Y ou H (SEQ ID NO: 134), (2) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos X1X2S, X1 é A ou Q, X2 é A ou D (SEQ ID NO: 135), e (3) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQX1YSTPX2T, X1 é T ou S, X2 é L, Y ou W (SEQ ID NO: 136). Em outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo que se liga ao vírus da Zika NS1 (por exemplo, um vírus da Zika NS1, tal como descrito na Seção 6, infra), em que o anticorpo inclui uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada incluía (1) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos GFTVSSNY (SEQ ID NO: 143), e (2) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos IYSGGST (SEQ ID NO: 144), e em que a cadeia leve inclui (1) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSX, X é Y ou H (SEQ ID NO: 134), (2) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos X1X2S, X1 é A ou Q, X2 é A ou D (SEQ ID NO: 135), e (3) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQX1YSTPX2T, X1 é T ou S, X2 é L, Y ou W (SEQ ID NO: 136).
[00106] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, um vírus da Zika NS1, tal como descrito na Seção 6, infra), em que o anticorpo inclui uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada inclui (1) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos
GFTVSSNY (SEQ ID NO: 143), (2) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos IYSGGST (SEQ ID NO: 144), e (3) uma VH
CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARDRRGFDY (SEQ ID
NO: 145), ARWGGKRGGAFDI (SEQ ID NO: 146), ARLIAAAGDY (SEQ ID NO:
147) ou ARGPVQLERRPLGAFDI (SEQ ID NO: 148), e em que a região variável da cadeia leve incluí (1) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSX, X é Y ou H (SEQ ID NO: 134), (2)
uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos X1X2S, X1 é
A ou Q, X2 é A ou D (SEQ ID NO: 135), e (3) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQX1YSTPX2T, X1 é T ou S, X2 é L, Y ou
W (SEQ ID NO: 136). Em outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo compreendendo: (1) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos GFTVSSNY (SEQ ID NO: 143), (2) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos IYSGGST (SEQ ID NO: 144),
(3) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARDRRGFDY
(SEQ ID NO: 145), ARWGGKRGGAFDI (SEQ ID NO: 146), ARLIAAAGDY (SEQ
ID NO: 147), ou ARGPVQLERRPLGAFDI (SEQ ID NO: 148), (4) uma VL
CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSX, X é Y ou H
(SEQ ID NO: 134), (5) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos X1X2S, X1 é A ou Q, X2 é A ou D (SEQ ID NO: 135), e
(6) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQX1YSTPX2T, X1 é T ou S, X2 é L, Y ou W (SEQ ID NO: 136).
[00107] Em um aspecto específico, um anticorpo fornecido neste documento que se liga ao vírus da Zika NS1 (por exemplo, um vírus da Zika NS1, tal como descrito na Seção 6, infra), em que o anticorpo inclui uma região variável da cadeia pesada ou cadeia pesada compreendendo: (1) uma VL ABR1 compreendendo a sequência de aminoácidos FTVSSNYMS (SEQ ID NO: 149), (2) uma VL ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos WVSVIYSGGSTYYA (SEQ ID NO: 150), e (3) uma VL ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARDRRGFDY (SEQ ID NO: 151), ARWGGKRGGAFDI (SEQ ID NO: 152), ARLIAAAGDY (SEQ ID NO: 153) ou ARGPVQLERRPLGAFDI (SEQ ID NO: 154). Em outro aspecto, um anticorpo fornecido neste documento que se liga ao vírus da Zika NS1 (por exemplo, um vírus da Zika NS1, tal como descrito na Seção 6, infra), em que o anticorpo inclui uma região variável de cadeia leve ou cadeia leve compreendendo: (1) uma VL ABR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSX1LN, X1 é Y ou H (SEQ ID NO: 137), (2) uma VL ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos X1LIYAASSLQS, X1 é F ou L (SEQ ID NO: 138), e (3) uma VL ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQX1YSTPX2, X1 é T ou S, X2 é L, Y ou W (SEQ ID NO: 139).
[00108] Em outro aspecto específico, um anticorpo fornecido neste documento que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, um vírus da Zika NS1, tal como descrito na Seção 6, infra), em que o anticorpo inclui uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende: (1) uma VL ABR1 compreendendo a sequência de aminoácidos FTVSSNYMS (SEQ ID NO: 149), (2) uma VL ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos WVSVIYSGGSTYYA (SEQ ID
NO: 150), e (3) uma VL ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARDRRGFDY (SEQ ID NO: 151), ARWGGKRGGAFDI (SEQ ID NO:
152), ARLIAAAGDY (SEQ ID NO: 153) ou ARGPVQLERRPLGAFDI (SEQ ID NO:
154), e compreendendo a região de cadeia leve variável que inclui:
(1) uma VL ABR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSX1LN,
X1 é Y ou H (SEQ ID NO: 137), (2) uma VL ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos X1LIYAASSLQS, X1 é F ou L (SEQ ID NO:
138), e (3) uma VL ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos
QQX1YSTPX2, X1 é T ou S, X2 é L, Y ou W (SEQ ID NO: 139). Em outro aspecto específico, um anticorpo fornecido aqui que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, um vírus da Zika NS1, tal como descrito na Seção 6, infra), em que o anticorpo contém uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada inclui: (1) uma
VL ABR1 compreendendo a sequência de aminoácidos FTVSSNYMS (SEQ ID
NO: 149), (2) uma VL ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos
WVSVIYSGGSTYYA (SEQ ID NO: 150), e (3) uma VL ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARDRRGFDY (SEQ ID NO: 151),
ARWGGKRGGAFDI (SEQ ID NO: 152), ARLIAAAGDY (SEQ ID NO: 153) ou
ARGPVQLERRPLGAFDI (SEQ ID NO: 154), e em que a cadeia leve inclui:
(1) uma VL ABR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSX1LN, X1 é Y ou H (SEQ ID NO: 137), (2) uma VL ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos X1LIYAASSLQS, X1 é F ou L (SEQ ID NO: 138), e (3) uma VL ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQX1YSTPX2, X1 é T ou S, X2 é L, Y ou W (SEQ ID NO: 139). Em outro aspecto específico, um anticorpo fornecido neste documento que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, um vírus da Zika NS1, tal como descrito na Seção 6, infra), em que o anticorpo inclui: (1) uma VL ABR1 compreendendo a sequência de aminoácidos FTVSSNYMS (SEQ ID NO: 149), (2) uma VL ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos WVSVIYSGGSTYYA (SEQ ID NO: 150), (3) uma VL ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARDRRGFDY (SEQ ID NO: 151), ARWGGKRGGAFDI (SEQ ID NO: 152), ARLIAAAGDY (SEQ ID NO: 153), ou ARGPVQLERRPLGAFDI (SEQ ID NO: 154), (4) uma VL ABR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSX1LN, X1 é Y ou H (SEQ ID NO: 137), (5) uma VL ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos X1LIYAASSLQS, X1 é F ou L (SEQ ID NO: 138), e (6) uma VL ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQX1YSTPX2, X1 é T ou S, X2 é L, Y ou W (SEQ ID NO: 139).
[00109] Em um aspecto específico, um anticorpo fornecido aqui é o anticorpo designado AA12 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. O anticorpo AA12 é um anticorpo humano. As sequências de nucleotídeos deduzidas da região da cadeia pesada variável e da região da cadeia leve variável do anticorpo AA12 são mostradas na
Tabela 1. As sequências de aminoácidos deduzidas dos domínios VH e VL do anticorpo AA12 são mostradas nas figuras 19A a 19B e na Tabela 1. As CDRs e as regiões de estrutura do domínio VH e do domínio VL são indicadas nas figuras 19A a 19B. Além disso, a Tabela 1, infra, apresenta as sequências de aminoácidos das CDRs e as regiões estruturais das regiões variáveis do anticorpo AA122 conforme determinado pelo sistema de numeração IMGT. As CDRs e as regiões de estrutura foram determinadas usando o sistema de numeração International ImMunoGeneTics (“IMGT”). Ver Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77 (2003), que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade, para uma descrição do sistema de numeração IMGT. Como alternativa ao sistema de numeração IMGT, pode-se utilizar o sistema Paratome. A Tabela 2, infra, apresenta as sequências de aminoácidos das ABRs e regiões estruturais das regiões variáveis do anticorpo AA12 conforme determinado usando o sistema Paratome. Como alternativa ao sistema de numeração IMGT, pode ser usado o sistema de numeração Kabat.
Tabela 2 de Lefranc et al. mostra a correspondência entre o IMGT e as numerações de Kabat. Outra alternativa ao sistema de numeração IMGT é o Chothia. Veja Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), que é incorporado aqui por referência na sua totalidade.
Além disso, o sistema AbM da Oxford pode ser usado em vez do sistema de numeração IMGT. Uma pessoas versada na técnica seria capaz de determinar as CDRs e as regiões estruturais das regiões variáveis da sequência do anticorpo AA12 com base no sistema de numeração de Kabat, sistema Chothia e/ou sistema AbM da Oxford.
Tabela 1 AA12 Anticorpo
SEQ ID Descrição da sequência Sequência NO: 1 Isolar mRNA da região gaggtgcagctggtggagtccggaggaggcttg variável da cadeia pesada atccagcctggggggtccctgagactctcctgt de imunoglobulina AA12, gcagcctctgggttcaccgtcagtagcaactac CDS parcial [organismo = atgagctgggtccgccaggctccagggaagggg Homo sapiens] ctggagtgggtctcagttatttatagcggtggt agcacatactacgcagactccgtgaagggccga ttcaccatctccagagacaattccaagaacacg ctgtatcttcaaatgaacagcctgagagccgag gacacggccgtgtattactgtgcgagagatcga agggggtttgactactggggccagggaacaatg gtcaccgtctcttca
SEQ ID Descrição da sequência Sequência NO:
2 Isolar o mRNA da região gacatccagatgacccagtctccactctccctg variável da cadeia leve da tctgcatctgtaggagacagagtcaccatcact imunoglobulina AA12, CDS tgccggacaagtcagagcattagcagctattta parcial [organismo = Homo aattggtatcagcagaaaccagggaaagcccct sapiens] aagctcctgatctatgctgcatccagtttgcaa agtggggtcccatcaaggttcagtggcagtgga tctgggacagatttcactcttaccatcagcagt ctgcaacctgaagattttgcaacttactactgt caacagacttacagtacccctctcactttcggc ggagggaccaaggtggaaatcaaa
9 Isolar a sequência de EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSSNY aminoácidos da região MSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSTYYADSVKGR variável da cadeia pesada FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDR de imunoglobulina AA12 RGFDYWGQGTMVTVSS
[organismo = Homo sapiens]
10 Isolar a sequência de DIQMTQSPLSLSASVGDRVTITCRTSQSISSYL aminoácidos da região NWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSG variável da cadeia leve da SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYSTPLTFG imunoglobulina AA12 GGTKVEIK
[organismo = Homo sapiens]
SEQ ID Descrição da sequência Sequência NO:
17 Isolar a sequência de GFTVSSNY aminoácidos CDR1 da região variável de imunoglobulina
AA12 (IMGT)
18 Isolar a sequência de IYSGGST aminoácidos CDR2 da região variável de imunoglobulina
AA12 (IMGT)
19 Isolar a sequência de ARDRRGFDY aminoácidos CDR da região variável de imunoglobulina
AA12 (IMGT)
20 Isolar a sequência de QSISSY aminoácidos de CDR1 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina
AA12 (IMGT)
21 Isolar a sequência de AAS aminoácidos de CDR2 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina
AA12 (IMGT)
SEQ ID Descrição da sequência Sequência NO:
22 Isolar a sequência de QQTYSTPLT aminoácidos de CDR da região variável de cadeia leve de imunoglobulina
AA12 (IMGT)
23 Isolar a sequência de EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAAS aminoácidos da região estrutural 1 da região variável de imunoglobulina
AA12 (IMGT)
24 Isolar a sequência de MSWVRQAPGKGLEWVSV aminoácidos da região estrutural 2 da região variável de imunoglobulina
AA12 (IMGT)
25 Isolar a sequência de YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT aminoácidos da região AVYYC estrutural 3 da região variável de imunoglobulina
AA12 (IMGT)
SEQ ID Descrição da sequência Sequência NO:
26 Isolar a sequência de WGQGTMVTVSS aminoácidos da região estrutural 4 da região variável de imunoglobulina
AA12 (IMGT)
27 Isolar a sequência de DIQMTQSPLSLSASVGDRVTITCRTS aminoácidos da região estrutural 1da região variável de cadeia leve de imunoglobulina AA12 (IMGT)
28 Isolar a sequência de LNWYQQKPGKAPKLLIY aminoácidos da região estrutural 2 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina AA12 (IMGT)
29 Isolar a sequência de SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAT aminoácidos da região YYC estrutural 3 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina AA12 (IMGT)
SEQ ID Descrição da sequência Sequência NO: 30 Isolar a sequência de FGGGTKVEIK aminoácidos da região estrutural 4 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina AA12 (IMGT) Tabela 2 Anticorpo AA12 (Paratome)
SEQ ID Descrição da sequência Sequência NO: 31 Isolar a sequência de FTVSSNYMS aminoácidos ABR1 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina AA12 (Paratome) 32 Isolar a sequência de WVSVIYSGGSTYYA aminoácidos ABR2 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina AA12 (Paratome) 33 Isolar a sequência de ARDRRGFDY aminoácidos ABR3 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina AA12 (Paratome)
SEQ ID Descrição da sequência Sequência NO:
34 Isolar a sequência de QSISSYLN aminoácidos ABR1 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina AA12 (Paratome)
35 Isolar a sequência de LLIYAASSLQS aminoácidos ABR2 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina AA12 (Paratome)
36 Isolar a sequência de QQTYSTPL aminoácidos ABR3 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina AA12 (Paratome)
37 Isolar a sequência de EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASG aminoácidos da região estrutural 1 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina AA12 (Paratome)
38 Isolar a sequência de WVRQAPGKGLE aminoácidos da região estrutural 2 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina AA12 (Paratome)
SEQ ID Descrição da sequência Sequência NO:
39 Isolar a sequência de DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT aminoácidos da região AVYYC estrutural 3 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina AA12 (Paratome)
40 Isolar a sequência de WGQGTMVTVSS aminoácidos da região estrutural 4 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina AA12 (Paratome)
41 Isolar a sequência de DIQMTQSPLSLSASVGDRVTITCRTS aminoácidos da região estrutural 1 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina AA12 (Paratome)
42 Isolar a sequência de WYQQKPGKAPK aminoácidos da região estrutural 2 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina AA12 (Paratome)
43 Isolar a sequência de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY aminoácidos da região YC estrutural 3 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina AA12 (Paratome)
SEQ ID Descrição da sequência Sequência NO: 44 Isolar a sequência de TFGGGTKVEIK aminoácidos da região estrutural 4 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina AA12 (Paratome)
[00110] Em um aspecto específico, um anticorpo fornecido aqui é o anticorpo designado EB9 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. O anticorpo EB9 é um anticorpo humano. As sequências de nucleotídeos deduzidas da região variável da cadeia pesada (domínio "VH") e região de cadeia leve variável (domínio "VL") do anticorpo EB9 são mostradas na Tabela 3. As sequências de aminoácidos deduzidas dos domínios VH e VL do anticorpo EB9 é mostrado nas figuras 20A a 20B e na Tabela 3. As CDRs e as regiões de estrutura do domínio VH e do domínio VL são indicadas nas figuras 20A a 20B. Além disso, a Tabela 3, infra, apresenta as sequências de aminoácidos das CDRs e regiões estruturais das regiões variáveis do anticorpo EB9. As CDRs e as regiões de estrutura foram determinados usando o sistema de numeração International ImMunoGeneTics (“IMGT”). Ver Lefranc et al., Dev.
Comp. Immunol. 27: 55-77 (2003), que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade, para uma descrição do sistema de numeração IMGT. Como alternativa ao sistema de numeração IMGT,
pode-se utilizar o sistema Paratome. A Tabela 4, infra, apresenta as sequências de aminoácidos das ABRs e regiões estruturais das regiões variáveis do anticorpo EB9 conforme determinado usando o sistema Paratome. Como alternativa ao sistema de numeração IMGT, pode ser usado, o sistema de numeração Kabat. Tabela 2 de Lefranc et al. mostra a correspondência entre o IMGT e as numerações de Kabat. Outra alternativa ao sistema de numeração IMGT é o Chothia.
Veja Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), que é incorporado aqui por referência na sua totalidade. Além disso, o sistema AbM da Oxford pode ser usado em vez do sistema de numeração IMGT. Uma pessoa versada na técnica seria capaz de determinar as CDRs e as regiões estruturais das regiões variáveis da sequência do anticorpo EB9 com base no sistema de numeração de Kabat, sistema Chothia e/ou sistema AbM da Oxford.
Tabela 3 Anticorpo EB9
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
3 Isolar o mRNA da região gaggtgcagctggtggagtctggaggaggc variável da cadeia ttgatccagcctggggggtccctgagactc pesada da tcctgtgcagcctctgggttcaccgtcagt imunoglobulina EB9, CDS agcaactacatgagctgggtccgccaggct parcial [organismo = ccagggaaggggctggagtgggtctcagtt Homo sapiens] atttatagcggtggtagcacatactacgca gactccgtgaagggccgattcaccatctcc agagacaattccaagaacacgctgtatctt caaatgaacagcctgagagccgaggacacg gccgtgtattactgtgcgagatggggaggg aaacgggggggggcttttgatatctggggc caagggacaatggtcaccgtctcttca
4 Isolar o mRNA da região gacatccagatgacccagtctccattctcc variável da cadeia leve ctgtctgcatctgtaggagacagagtcacc da imunoglobulina EB9, atcacttgccgggcaagtcagagcattagc CDS parcial [organismo agccatttaaattggtatcagcagaaacca = Homo sapiens] gggaaagcccctaagttcctgatctatgct gcatccagtttgcaaagtggggtcccatca aggttcagtggcagtggatctgggacagac ttcactctcaccatcagcagtctgcaacct gaagattttgcaacttactactgtcaacag agttacagtactccgtacacttttggccag gggaccaaggtggaaatcaaac
11 Isolar a sequência de EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVS aminoácidos da região SNYMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSTYYA variável da cadeia DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT pesada de AVYYCARWGGKRGGAFDIWGQGTMVTVSS imunoglobulina EB9 [organismo = Homo sapiens]
12 Isolar a sequência de DIQMTQSPFSLSASVGDRVTITCRASQSIS aminoácidos da região SHLNWYQQKPGKAPKFLIYAASSLQSGVPS variável da cadeia leve RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ da imunoglobulina EB9 SYSTPYTFGQGTKVEIK [organismo = Homo sapiens]
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
45 Isolar a sequência de GFTVSSNY aminoácidos CDR1 da região variável de imunoglobulina EB9 (IMGT)
46 Isolar a sequência de IYSGGST aminoácidos CDR2 da região variável de imunoglobulina EB9 (IMGT)
47 Isolar a sequência de ARWGGKRGGAFDI aminoácidos CDR3 da região variável de imunoglobulina EB9 (IMGT)
48 Isolar a sequência de QSISSH aminoácidos da região variável de CDR1 da imunoglobulina EB9 (IMGT)
49 Isolar a sequência de AAS aminoácidos da região variável de CDR2 da imunoglobulina EB9 (IMGT)
50 Isolar a sequência de QQSYSTPYT aminoácidos da região variável de CDR3 da imunoglobulina EB9 (IMGT)
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
51 Isolar a sequência de EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAAS aminoácidos da região estrutural 1 da região variável de imunoglobulina EB9 (IMGT)
52 Isolar a sequência de MSWVRQAPGKGLEWVSV aminoácidos da região estrutural 2 da região variável de imunoglobulina EB9 (IMGT)
53 Isolar a sequência de YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA aminoácidos da região EDTAVYYC estrutural 3 da região variável de imunoglobulina EB9 (IMGT)
54 Isolar a sequência de WGQGTMVTVSS aminoácidos da região estrutural 4 da região variável de imunoglobulina EB9 (IMGT)
55 Isolar a sequência de DIQMTQSPFSLSASVGDRVTITCRAS aminoácidos da região de framework da região variável 1 da imunoglobulina EB9 (IMGT)
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO: 56 Isolar a sequência de LNWYQQKPGKAPKFLIY aminoácidos da região de framework da região variável 2 da imunoglobulina EB9 (IMGT) 57 Isolar a sequência de SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPED aminoácidos da região FATYYC de framework da região variável 3 da imunoglobulina EB9 (IMGT) 58 Isolar a sequência de FGQGTKVEIK aminoácidos da região de framework da região variável 4 da imunoglobulina EB9 (IMGT) Tabela 4: Anticorpo EB9 (Paratome)
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO: 59 Isolar a sequência de FTVSSNYMS aminoácidos ABR1 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina EB9 (Paratome)
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
60 Isolar a sequência de WVSVIYSGGSTYYA aminoácidos ABR2 da região variável da cadeia pesada de imunoglobulina EB9 (Paratome)
61 Isolar a sequência de ARWGGKRGGAFDI aminoácidos ABR3 da região variável da cadeia pesada de imunoglobulina EB9 (Paratome)
62 Isolar a sequência de QSISSHLN aminoácidos ABR1 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina EB9 (Paratome)
63 Isolar a sequência de FLIYAASSLQS aminoácidos ABR2 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina EB9 (Paratome)
64 Isolar a sequência de QQSYSTPY aminoácidos ABR3 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina EB9 (Paratome)
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
65 Isolar a sequência de EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASG aminoácidos da região estrutural 1 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina EB9 (Paratome)
66 Isolar a sequência de WVRQAPGKGLE aminoácidos da região estrutural 2 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina EB9 (Paratome)
67 Isolar a sequência de DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT aminoácidos da região AVYYC estrutural 3 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina EB9 (Paratome)
68 Isolar a sequência de WGQGTMVTVSS aminoácidos da região estrutural 4 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina EB9 (Paratome)
69 Isolar a sequência de DIQMTQSPFSLSASVGDRVTITCRAS aminoácidos da região estrutural 1 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina EB9 (Paratome)
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO: 70 Isolar a sequência de WYQQKPGKAPK aminoácidos da região estrutural 2 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina EB9 (Paratome) 71 Isolar a sequência de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY aminoácidos da região YC estrutural 3 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina EB9 (Paratome) 72 Isolar a sequência de TFGQGTKVEIK aminoácidos da região estrutural 4 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina EB9 (Paratome)
[00111] Em um aspecto específico, um anticorpo fornecido aqui é o anticorpo designado por GB5 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. O anticorpo GB5 é um anticorpo humano. As sequências de nucleotídeos deduzidas da região variável da cadeia pesada (domínio "VH") e região de cadeia leve variável (domínio "VL") do anticorpo GB5 são mostradas na Tabela 5. As sequências de aminoácidos deduzidas dos domínios VH e VL do o anticorpo GB5 é mostrado nas figuras 21A a 21B e na Tabela 5. As CDRs e as regiões de estrutura do domínio VH e do domínio VL são indicadas nas figuras 21A a 21B. Além disso, a Tabela 5, infra, apresenta as sequências de aminoácidos das CDRs e regiões estruturais das regiões variáveis do anticorpo EB9. As CDRs e as regiões de estrutura foram determinadas usando o sistema de numeração International ImMunoGeneTics (“IMGT”). Ver Lefranc et al., Dev.
Comp. Immunol. 27: 55-77 (2003), que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade, para uma descrição do sistema de numeração IMGT. Como alternativa ao sistema de numeração IMGT, pode-se utilizar o sistema Paratome. A Tabela 6, infra, apresenta as sequências de aminoácidos das ABRs e regiões estruturais das regiões variáveis do anticorpo GB5 conforme determinado usando o sistema Paratome. Como alternativa ao sistema de numeração IMGT, pode ser usado o sistema de numeração Kabat. Tabela 2 de Lefranc et al. mostra a correspondência entre o IMGT e as numerações de Kabat. Outra alternativa ao sistema de numeração IMGT é o Chothia.
Veja Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), que é incorporado aqui por referência na sua totalidade. Além disso, o sistema AbM da Oxford pode ser usado em vez do sistema de numeração IMGT. Uma pessoa versada na técnica seria capaz de determinar as CDRs e as regiões estruturais das regiões variáveis da sequência do anticorpo GB5 com base no sistema de numeração de Kabat, sistema Chothia e/ou sistema AbM da Oxford.
Tabela 5 Anticorpo GB5
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
5 Isolar mRNA da região gaggtgcagctggtggagtctggaggaggc variável da cadeia ttgatccagcctggggggtccctgagactc pesada de tcctgtgcagcctctgggttcaccgtcagt imunoglobulina GB5, CDS agcaactacatgagctgggtccgccaggct parcial [organismo = ccagggaaggggctggagtgggtctcagtt Homo sapiens] atttatagcggtggtagcacatactacgca gactccgtgaagggccgattcaccatctcc agagacaattccaagaacacgctgtatctt caaatgagcagcctgagagccgaggacacg gccgtgtattactgtgcgagactcatagca gcagctggtgactactggggccagggaaca atggtcaccgtctcttcag
6 Isolar mRNA da região gacatccagatgacccagtctccattcacc variável da cadeia leve ctgtctgcatctgtaggagacagagtcacc da imunoglobulina GB5, atcacttgccgggcaagtcagagcattagc CDS parcial [organismo agctatttaaattggtatcagcagaaacca = Homo sapiens] gggaaagcccctaagctcctgatctatgct gcatccagtttgcaaagtggggtcccatca aggttcagtggcagtgaatctgggacagat ttcactctcaccatcagcagtctgcaacct gaagattttgcaacttactactgtcaacag agttacagtaccccctggacgttcggccaa gggaccaaggtggagatcaaac
13 Isolar a sequência de EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVS aminoácidos da região SNYMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSTYYA variável da cadeia DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDT pesada de AVYYCARLIAAAGDYWGQGTMVTVSS imunoglobulina GB5 [organismo = Homo sapiens]
14 Isolar a sequência de DIQMTQSPFTLSASVGDRVTITCRASQSIS aminoácidos da região SYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS variável da cadeia leve RFSGSESGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ da imunoglobulina GB5 SYSTPWTFGQGTKVEIK [organismo = Homo sapiens]
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
73 Isolar a sequência de GFTVSSNY aminoácidos CDR1 da região variável da imunoglobulina GB5 (IMGT)
74 Isolar a sequência de IYSGGST aminoácidos da região variável de CDR2 da imunoglobulina GB5 (IMGT)
75 Isolar a sequência de ARLIAAAGDY aminoácidos CDR3 da região variável da imunoglobulina GB5 (IMGT)
76 Isolar a sequência de QSISSY aminoácidos de CDR1 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina GB5 (IMGT)
77 Isolar a sequência de AAS aminoácidos CDR2 da região variável da cadeia leve da imunoglobulina GB5 (IMGT)
78 Isolar a sequência de QQSYSTPWT aminoácidos CDR3 da região variável da cadeia leve da imunoglobulina GB5 (IMGT)
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
79 Isolar a sequência de EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAAS aminoácidos da região estrutural 1 da região variável de imunoglobulina GB5 (IMGT)
80 Isolar a sequência de MSWVRQAPGKGLEWVSV aminoácidos da região estrutural 2 da região variável de imunoglobulina GB5 (IMGT)
81 Isolar a sequência de YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRA aminoácidos da região EDTAVYYC estrutural 3 da região variável de imunoglobulina GB5 (IMGT)
82 Isolar a sequência de WGQGTMVTVSS aminoácidos da região estrutural 4 da região variável de imunoglobulina GB5 (IMGT)
83 Isolar a sequência de DIQMTQSPFTLSASVGDRVTITCRAS aminoácidos da região estrutural 1da região variável de cadeia leve da região variável de imunoglobulina GB5 (IMGT)
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO: 84 Isolar a sequência de LNWYQQKPGKAPKLLIY aminoácidos da região estrutural 2 da região variável de cadeia leve da região variável de imunoglobulina GB5 (IMGT) 85 Isolar a sequência de SLQSGVPSRFSGSESGTDFTLTISSLQPED aminoácidos da região FATYYC estrutural 3 da região variável de cadeia leve da região variável de imunoglobulina GB5 (IMGT) 86 Isolar a sequência de FGQGTKVEIK aminoácidos da região estrutural 4 da região variável de cadeia leve da região variável de imunoglobulina GB5 (IMGT) Tabela 6 Anticorpo GB5 (Paratome)
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO: 87 Isolar a sequência de FTVSSNYMS aminoácidos ABR1 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina GB5 (Paratome)
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
88 Isolar a sequência de WVSVIYSGGSTYYA aminoácidos ABR2 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina GB5 (Paratome)
89 Isolar a sequência de ARLIAAAGDY aminoácidos ABR3 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina GB5 (Paratome)
90 Isolar a sequência de QSISSYLN aminoácidos ABR1 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina GB5 (Paratome)
91 Isolar a sequência de LLIYAASSLQS aminoácidos ABR2 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina GB5 (Paratome)
92 Isolar a sequência de QQSYSTPW aminoácidos ABR3 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina GB5 (Paratome)
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
93 Isolar a sequência de EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASG aminoácidos da região estrutural 1 da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina GB5 (Paratome)
94 Isolar a sequência de WVRQAPGKGLE aminoácidos da região estrutural 2 da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina GB5 (Paratome)
95 Isolar a sequência de DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDT aminoácidos da região AVYYC estrutural 3 da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina GB5 (Paratome)
96 Isolar a sequência de WGQGTMVTVSS aminoácidos da região estrutural 4 da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina GB5 (Paratome)
97 Isolar a sequência de DIQMTQSPFTLSASVGDRVTITCRAS aminoácidos da região estrutural 1 da região variável da cadeia leve da imunoglobulina GB5 (Paratome)
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO: 98 Isolar a sequência de WYQQKPGKAPK aminoácidos da região estrutural 2 da região variável da cadeia leve da imunoglobulina GB5 (Paratome) 99 Isolar a sequência de GVPSRFSGSESGTDFTLTISSLQPEDFATY aminoácidos da região YC estrutural 3 da região variável da cadeia leve da imunoglobulina GB5 (Paratome) 100 Isolar a sequência de TFGQGTKVEIK aminoácidos da região estrutural 4 da região variável da cadeia leve da imunoglobulina GB5 (Paratome)
[00112] Em um aspecto específico, um anticorpo fornecido aqui é o atributo determinado FC12 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. O anticorpo FC12 é um anticorpo humano. As sequências de nucleotídeos deduzidas da região variável da cadeia pesada (domínio "VH") e região de cadeia leve variável (domínio "VL") do anticorpo FC12 são mostradas na Tabela 7. As sequências de aminoácidos deduzidas dos domínios VH e VL anticorpo FC12 são mostradas nas figuras 22A a 22B e na Tabela 7. As CDRs e as regiões de estrutura do domínio VH e do domínio VL são indicadas nas figuras 22A a 22B. Além disso, a Tabela 7, infra, apresenta as sequências de aminoácidos das CDRs e regiões das regiões variáveis do FC12. As CDRs e as regiões de estruturas foram determinadas usando o sistema de numeração International ImMunoGeneTics (“IMGT”). Ver Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77 (2003), que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade, para uma descrição do sistema de numeração IMGT. Como alternativa ao sistema de numeração IMGT, pode-se utilizar o sistema Paratome.
Na Tabela 8, infra, apresenta as sequências de aminoácidos das ABRs e regiões estruturais, das regiões das variáveis do anticorpo FC12, conforme determinado usando o sistema Paratome. Como alternativa ao sistema de numeração IMGT, pode ser usado o sistema de numeração Kabat. Tabela 2 de Lefranc et al. mostra a correspondência entre o IMGT e as numerações de Kabat. Outra alternativa ao sistema de numeração IMGT é o Chothia. Veja Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), que é incorporado aqui por referência na sua totalidade. Além disso, o sistema AbM da Oxford pode ser usado em vez do sistema de numeração IMGT. Uma pessoa versada na técnica seria capaz de determinar as CDRs e conforme as regiões das regiões variáveis da sequência do anticorpo FC12 com base no sistema de numeração de Kabat, sistema Chothia e/ou sistema AbM da Oxford.
Tabela 7 Anticorpo FC12
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
7 Isolar o mRNA da região gaggtgcagctggtggagtctggaggaggc variável da cadeia ttgatccagcctggggggtccctgagactc pesada de tcctgtgcagcctctgggttcaccgtcagt imunoglobulina FC12, agcaactacatgagctgggtccgccagact CDS parcial [organismo ccagggaaggggctggagtgggtctcagtt = Homo sapiens] atttatagcggtggtagcacatactacgca gactccgtgaagggccgattcaccatctcc agagacaattccaagaacacgctgtatctt caaatgaacagcctgagagccgaggacacg gccgtgtattactgtgcgagagggcccgta caactggaacgacggcctctgggtgctttt gatatctggggccaagggacaatggtcacc gtctcttca
8 Isolar o mRNA da região Tcctatgagctgactcagccaccctcagtg variável da cadeia leve tccgtgtccccaggacagacagccagcatc da imunoglobulina FC12, acctgctctggagataaattgggggataaa CDS parcial [organismo tatgcttgctggtatcagcagaagccaggc = Homo sapiens] cagtcccctgtgctggtcatctatcaagat agcaagcggccctcagggatccctgagcga ttctctggctccaactctgggaacacagcc actctgaccatcagcgggacccaggctatg gatgaggctgactattactgtcaggcgtgg gacagcagcaccgtggtattcggcggaggg accaagctgaccgtcctag
15 Isolar a sequência de EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVS aminoácidos da região SNYMSWVRQTPGKGLEWVSVIYSGGSTYYA variável da cadeia DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT pesada de AVYYCARGPVQLERRPLGAFDIWGQGTMVT imunoglobulina FC12 VSS [organismo = Homo sapiens]
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
16 Isolar a sequência de SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDK aminoácidos da região YACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPER variável da cadeia leve FSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAW da imunoglobulina FC12 DSSTVVFGGGTKLTVL [organismo = Homo sapiens]
101 Isolar a sequência de GFTVSSNY aminoácidos de CDR1 da região variável de imunoglobulina FC12 (IMGT)
102 Isolar a sequência de IYSGGST aminoácidos de CDR2 da região variável de imunoglobulina FC12 (IMGT)
103 Isolar a sequência de ARGPVQLERRPLGAFDI aminoácidos de CDR3 da região variável de imunoglobulina FC12 (IMGT)
104 Isolar a sequência de KLGDKY aminoácidos de CDR1 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (IMGT)
105 Isolar a sequência de QDS aminoácidos de CDR2 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (IMGT)
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
106 Isolar a sequência de QAWDSSTVV aminoácidos de CDR3 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (IMGT)
107 Isolar a sequência de EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAAS aminoácidos da região estrutural 1 da região variável de imunoglobulina FC12 (IMGT)
108 Isolar a sequência de MSWVRQTPGKGLEWVSV aminoácidos da região estrutural 2 da região variável de imunoglobulina FC12 (IMGT)
109 Isolar a sequência de YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA aminoácidos da região EDTAVYYC estrutural 3 da região variável de imunoglobulina FC12 (IMGT)
110 Isolar a sequência de WGQGTMVTVSS aminoácidos da região estrutural 3 da região variável de imunoglobulina FC12 (IMGT)
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
111 Isolar a sequência de SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGD aminoácidos da região estrutural 1 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (IMGT)
112 Isolar a sequência de ACWYQQKPGQSPVLVIY aminoácidos da região estrutural 2 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (IMGT)
113 Isolar a sequência de KRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMD aminoácidos da região EADYYC estrutural 3 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (IMGT)
114 Isolar a sequência de FGGGTKLTVL aminoácidos da região estrutural da região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (IMGT)
Tabela 8 Anticorpo FC12 (Paratome)
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
115 Isolar a sequência de FTVSSNYMS aminoácidos ABR1 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina FC12 (Paratome)
116 Isolar a sequência de WVSVIYSGGSTYYA aminoácidos ABR2 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina FC12 (Paratome)
117 Isolar a sequência de ARGPVQLERRPLGAFDI aminoácidos ABR3 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina FC12 (Paratome)
118 Isolar a sequência de KLGDKYAC aminoácidos ABR1 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (Paratome)
119 Isolar a sequência de LVIYQDSKRPS aminoácidos ABR2 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (Paratome)
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
120 Isolar a sequência de QAWDSSTV aminoácidos ABR3 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (Paratome)
121 Isolar a sequência de EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASG aminoácidos da região estrutural 1 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina FC12 (Paratome)
122 Isolar a sequência de WVRQTPGKGLE aminoácidos da região estrutural 2 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina FC12 (Paratome)
123 Isolar a sequência de DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT aminoácidos da região AVYYC estrutural 3 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina FC12 (Paratome)
124 Isolar a sequência de WGQGTMVTVSS aminoácidos da região estrutural 4 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina FC12 (Paratome))
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO: 125 Isolar a sequência de SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGD aminoácidos da região estrutural 1 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (Paratome) 126 Isolar a sequência de WYQQKPGQSPV aminoácidos da região estrutural 2 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (Paratome) 127 Isolar a sequência de GIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADY aminoácidos da região YC estrutural 3 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (Paratome) 128 Isolar a sequência de VFGGGTKLTVL aminoácidos da região estrutural 4 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (Paratome)
[00113] Em uma modalidade específica, a posição de uma CDR ao longo do domínio VH e/ou VL de um anticorpo aqui descrito pode variar em uma, duas, três ou quatro posições de aminoácidos, desde que a ligação ao vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrita, como na Seção 6, infra) é mantida ou substancialmente mantida (por exemplo, em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, em pelo menos 95% em um ensaio conhecido na técnica ou aqui descrito, como um ELISA). Por exemplo, em uma modalidade, a posição que define uma CDR do anticorpo AA12 pode variar mudando o limite N-terminal e/ou C-terminal da CDR em um, dois, três ou quatro aminoácidos, em relação à posição da CDR representada nas figuras 19A a 19B (por
IMGT ou Paratome), desde que a ligação ao vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika aqui descrita, como na
Seção 6, infra) seja mantida ou substancialmente mantida (por exemplo, em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% em um ensaio conhecido na técnica ou aqui descrito, como um ELISA). Em outro exemplo, em uma modalidade, a posição que define uma CDR do anticorpo EB9 pode variar mudando o limite N-terminal e/ou C-terminal da CDR em um,
dois, três ou quatro aminoácidos, em relação a posição da CDR representada nas figuras 20A a 20B (por IMGT ou Paratome), desde que a ligação ao vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika aqui descrita, como na Seção 6, infra) seja mantida ou substancialmente mantida (por exemplo, em pelo menos
50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos
90%, pelo menos 95% em um ensaio conhecido na técnica ou aqui descrito, tal como um ELISA). Em outro exemplo, em uma modalidade,
a posição que define uma CDR do anticorpo GB5 pode variar mudando o limite N-terminal e/ou C-terminal da CDR em um, dois, três ou quatro aminoácidos, em relação à posição da CDR representada nas figuras 21A a 21B (por IMGT ou Paratome), desde que a ligação ao vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika aqui descrita, como na Seção 6, infra) seja mantida ou substancialmente mantida (por exemplo, em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% em um ensaio conhecido na técnica ou aqui descrito, tal como um ELISA). Em outro exemplo, em uma modalidade, a posição que define uma CDR do anticorpo FC12 pode variar mudando o limite N- terminal e/ou C-terminal da CDR em um, dois, três ou quatro aminoácidos, em relação à posição da CDR representada nas figuras 22A a 22B (por IMGT ou Paratome), desde que a ligação ao vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika aqui descrita, como na Seção 6, infra) seja mantida ou substancialmente mantida (por exemplo, em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% em um ensaio conhecido na técnica ou aqui descrito, tal como um ELISA).
[00114] Em outro aspecto, são aqui fornecidos anticorpos que se ligam a um vírus da Zika NS1 compreendendo uma, duas ou três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da região variável da cadeia pesada do anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12 e uma, duas ou três CDRs da região variável da cadeia leve do anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12. Em certas modalidades, um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, um vírus da Zika NS1 descrito na Seção 6, infra), inclui (ou alternativamente, consiste em) uma VH CDR1 e uma VL CDR1; uma VH
CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR2 e uma
VL CDR1; VH CDR2 e uma VL CDR2; uma VH CDR2 e uma VL CDR3; uma VH
CDR3 e uma VL CDR1; uma VH CDR3 e uma VL CDR2; uma VH CDR3 e uma
VL CDR3; uma VH1 CDR1, uma VH CDR2 e uma VL CDR1; uma VH CDR1, uma
VH CDR2 e uma VL CDR2; uma VH CDR1, uma VH CDR2 e uma VL CDR3; uma
VH CDR2, uma VH CDR3 e uma VL CDR1; uma VH CDR2, uma VH CDR3 e uma
VL CDR2; uma VH CDR2, uma VH CDR3 e uma VL CDR3; uma VH CDR1, uma
VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR1, uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma
VH CDR2, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR2, uma VL CDR1 e uma
VL CDR3; uma VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR3, uma
VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3 e uma VL
CDR1; uma VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3 e uma VL CDR2; uma VH CDR1,
a VH CDR2, a VH CDR3 e uma VL CDR3; uma VH CDR1, uma VH CDR2, uma
VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR1, uma VH CDR2, uma VL CDR1 e uma
VL CDR3; uma VH CDR1, uma VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma
VH CDR1, uma VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR2, uma
VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR2, uma VH CDR3, uma
VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR2, uma VH CDR3, uma VL CDR2 e uma
VL CDR3; uma VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL
CDR2; uma VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR3;
uma VH CDR1, uma VH CDR2, uma VL CDR1, uma VL CDR2, e uma VL CDR3;
uma VH CDR1, uma VH CDR3, uma VL CDR1, uma VL CDR2, e uma VL CDR3;
uma VH CDR2, uma VH CDR3, uma VL CDR1, uma VL CDR2, e uma VL CDR3; uma VH CDR1, VH CDR2, uma VH CDR3, uma VL CDR1, uma VL CDR2, e uma VL CDR3; ou qualquer combinação destas das VH CDRs e VL CDRs do anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12.
[00115] Em um aspecto específico, são aqui fornecidos anticorpos que se ligam a um vírus da Zika NS1 compreendendo uma, duas ou três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da região variável da cadeia pesada do anticorpo AA12 e uma, duas ou três CDRs da região variável da cadeia leve do anticorpo AA12. Em certas modalidades, um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, um vírus da Zika NS1 descrito na Seção 6, infra), inclui (ou alternativamente, consiste em) uma VH CDR1 e uma VL CDR1; uma VH CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR2 e uma VL CDR1; VH CDR2 e uma VL CDR2; uma VH CDR2 e uma VL CDR3; uma VH CDR3 e uma VL CDR1; uma VH CDR3 e uma VL CDR2; uma VH CDR3 e uma VL CDR3; uma VH1 CDR1, uma VH CDR2 e uma VL CDR1; uma VH CDR1, uma VH CDR2 e uma VL CDR2; uma VH CDR1, uma VH CDR2 e uma VL CDR3; uma VH CDR2, uma VH CDR3 e uma VL CDR1; uma VH CDR2, uma VH CDR3 e uma VL CDR2; uma VH CDR2, uma VH CDR3 e uma VL CDR3; uma VH CDR1, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR1, uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR2, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR2, uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3 e uma VL CDR1; uma VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3 e uma VL CDR2; uma VH
CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3 e uma VL CDR3; uma VH CDR1, uma VH CDR2, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR1, uma VH CDR2, uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR1, uma VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR1, uma VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR2, uma VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR2, uma VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR2, uma VH CDR3, uma VL CDR2 e uma VL CDR3; uma VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR1, uma VH CDR2, uma VL CDR1, uma VL CDR2, e uma VL CDR3; uma VH CDR1, uma VH CDR3, uma VL CDR1, uma VL CDR2, e uma VL CDR3; uma VH CDR2, uma VH CDR3, uma VL CDR1, uma VL CDR2, e uma VL CDR3; uma VH CDR1, VH CDR2, uma VH CDR3, uma VL CDR1, uma VL CDR2, e uma VL CDR3; ou uma combinação destas das VH CDRs e VL CDRs do anticorpo AA12.
[00116] Em um aspecto específico, são aqui fornecidos anticorpos que se ligam a um vírus da Zika NS1 compreendendo uma, duas ou três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da região variável da cadeia pesada do anticorpo EB9 e uma, duas ou três CDRs da região variável da cadeia leve do anticorpo EB9. Em certas modalidades, um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, um vírus da Zika NS1 descrito na Seção 6, infra), inclui (ou alternativamente, consiste em) uma VH CDR1 e uma VL CDR1; uma VH CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR2 e uma VL CDR1; VH CDR2 e uma VL CDR2; uma VH CDR2 e uma VL CDR3; uma
VH CDR3 e uma VL CDR1; uma VH CDR3 e uma VL CDR2; uma VH CDR3 e uma VL CDR3; uma VH1 CDR1, uma VH CDR2 e uma VL CDR1; uma VH CDR1,
uma VH CDR2 e uma VL CDR2; uma VH CDR1, uma VH CDR2 e uma VL CDR3;
uma VH CDR2, uma VH CDR3 e uma VL CDR1; uma VH CDR2, uma VH CDR3 e uma VL CDR2; uma VH CDR2, uma VH CDR3 e uma VL CDR3; uma VH CDR1,
uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR1, uma VL CDR1 e uma VL CDR3;
uma VH CDR2, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR2, uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR3,
uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3 e uma
VL CDR1; uma VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3 e uma VL CDR2; uma VH
CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3 e uma VL CDR3; uma VH CDR1, uma VH CDR2,
uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR1, uma VH CDR2, uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR1, uma VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR2;
uma VH CDR1, uma VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR2,
uma VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR2, uma VH CDR3,
uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR2, uma VH CDR3, uma VL CDR2 e uma VL CDR3; uma VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3, uma VL CDR1 e uma
VL CDR3; uma VH CDR1, uma VH CDR2, uma VL CDR1, uma VL CDR2, e uma
VL CDR3; uma VH CDR1, uma VH CDR3, uma VL CDR1, uma VL CDR2, e uma
VL CDR3; uma VH CDR2, uma VH CDR3, uma VL CDR1, uma VL CDR2, e uma
VL CDR3; uma VH CDR1, VH CDR2, uma VH CDR3, uma VL CDR1, uma VL
CDR2, e uma VL CDR3; ou qualquer combinação destas das VH CDRs e
VL CDRs do anticorpo EB9.
[00117] Em um aspecto específico, são aqui fornecidos anticorpos que se ligam a um vírus da Zika NS1 compreendendo uma, duas ou três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da região variável da cadeia pesada do anticorpo GB5 e uma, duas ou três
CDRs da região variável da cadeia leve do anticorpo GB5. Em certas modalidades, um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, um vírus da Zika NS1 descrito na Seção 6, infra), inclui
(ou alternativamente, consiste em) uma VH CDR1 e uma VL CDR1; uma
VH CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR2 e uma VL CDR1; VH CDR2 e uma VL CDR2; uma VH CDR2 e uma VL CDR3; uma
VH CDR3 e uma VL CDR1; uma VH CDR3 e uma VL CDR2; uma VH CDR3 e uma VL CDR3; uma VH1 CDR1, uma VH CDR2 e uma VL CDR1; uma VH CDR1,
uma VH CDR2 e uma VL CDR2; uma VH CDR1, uma VH CDR2 e uma VL CDR3;
uma VH CDR2, uma VH CDR3 e uma VL CDR1; uma VH CDR2, uma VH CDR3 e uma VL CDR2; uma VH CDR2, uma VH CDR3 e uma VL CDR3; uma VH CDR1,
uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR1, uma VL CDR1 e uma VL CDR3;
uma VH CDR2, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR2, uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR3,
uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3 e uma
VL CDR1; uma VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3 e uma VL CDR2; uma VH
CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3 e uma VL CDR3; uma VH CDR1, uma VH CDR2,
uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR1, uma VH CDR2, uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR1, uma VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR2;
uma VH CDR1, uma VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR2,
uma VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR2, uma VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR2, uma VH CDR3, uma VL CDR2 e uma VL CDR3; uma VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR1, uma VH CDR2, uma VL CDR1, uma VL CDR2, e uma VL CDR3; uma VH CDR1, uma VH CDR3, uma VL CDR1, uma VL CDR2, e uma VL CDR3; uma VH CDR2, uma VH CDR3, uma VL CDR1, uma VL CDR2, e uma VL CDR3; uma VH CDR1, VH CDR2, uma VH CDR3, uma VL CDR1, uma VL CDR2, e uma VL CDR3; ou uma combinação destas das VH CDRs e VL CDRs do anticorpo GB5.
[00118] Em um aspecto específico, são aqui fornecidos anticorpos que se ligam a um vírus da Zika NS1 compreendendo uma, duas ou três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da região variável da cadeia pesada do anticorpo FC12 e uma, duas ou três CDRs da região variável da cadeia leve do anticorpo FC12. Em certas modalidades, um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, um vírus da Zika NS1 descrito na Seção 6, infra), inclui (ou alternativamente, consiste em) uma VH CDR1 e uma VL CDR1; uma VH CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR2 e uma VL CDR1; VH CDR2 e uma VL CDR2; uma VH CDR2 e uma VL CDR3; uma VH CDR3 e uma VL CDR1; uma VH CDR3 e uma VL CDR2; uma VH CDR3 e uma VL CDR3; uma VH1 CDR1, uma VH CDR2 e uma VL CDR1; uma VH CDR1, uma VH CDR2 e uma VL CDR2; uma VH CDR1, uma VH CDR2 e uma VL CDR3; uma VH CDR2, uma VH CDR3 e uma VL CDR1; uma VH CDR2, uma VH CDR3 e uma VL CDR2; uma VH CDR2, uma VH CDR3 e uma VL CDR3; uma VH CDR1, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR1, uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR2, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR2, uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3 e uma VL CDR1; uma VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3 e uma VL CDR2; uma VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3 e uma VL CDR3; uma VH CDR1, uma VH CDR2, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR1, uma VH CDR2, uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR1, uma VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR1, uma VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR2, uma VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR2, uma VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR2, uma VH CDR3, uma VL CDR2 e uma VL CDR3; uma VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR2; uma VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3, uma VL CDR1 e uma VL CDR3; uma VH CDR1, uma VH CDR2, uma VL CDR1, uma VL CDR2, e uma VL CDR3; uma VH CDR1, uma VH CDR3, uma VL CDR1, uma VL CDR2, e uma VL CDR3; uma VH CDR2, uma VH CDR3, uma VL CDR1, uma VL CDR2, e uma VL CDR3; uma VH CDR1, VH CDR2, uma VH CDR3, uma VL CDR1, uma VL CDR2, e uma VL CDR3; ou qualquer combinação destas das VH CDRs e VL CDRs do anticorpo FC12.
[00119] Em outra modalidade, um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika aqui descrito, como na Seção 6, infra), inclui uma, duas, três, quatro, cinco ou todas as seis regiões determinantes de complementaridade
(CDRs) do anticorpo AA12. Em certas modalidades, um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, tal como na Seção 6, infra), incluindo o domínio VL ou cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1, VL CDR2, e VL CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 20-22, respectivamente.
Em certas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL inclui uma, duas ou três regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 27-30, respectivamente. Em algumas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL compreende as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 27-30, respectivamente. Em outras modalidades, a cadeia leve ou domínio VL incluem outras regiões estruturais humanas ou regiões estruturais derivadas de outro anticorpo humano.
[00120] Em algumas modalidades, um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, como na Seção 6, infra), inclui um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 17-19, respectivamente. Em certas modalidades, a cadeia pesada ou domínio VH inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 23-26, respectivamente. Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou domínio VH inclui as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 23-26, respectivamente. Em outras modalidades, a cadeia pesada ou domínio VH inclui regiões estruturais humanas ou regiões estruturais derivadas de um anticorpo humano.
[00121] Em modalidades específicas, um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, como na Seção 6, infra), inclui: domínio VL ou cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1, VL CDR2, e VL CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 20-22, respectivamente; e um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 17-19, respectivamente. Em certas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 27-30, respectivamente, e a cadeia pesada ou o domínio VH inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 23-26, respectivamente. Em algumas modalidades, a cadeia leve ou a região estrutural inclui o domínio VL (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 27- 30, respectivamente, e a cadeia pesada ou o domínio VH incluem as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 23-26, respectivamente. Em outras modalidades, a cadeia leve ou domínio VL e a cadeia pesada ou domínio VH incluem outras regiões estruturais humanas ou regiões estruturais derivadas de outro anticorpo humano.
[00122] Em certas modalidades, um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, como na Seção 6, infra), incluindo o domínio VL ou cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1, VL CDR2, e VL CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 34-36, respectivamente.
Em certas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 41-44, respectivamente. Em algumas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL compreendendo as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 41-44, respectivamente. Em outras modalidades, a cadeia leve ou domínio VL incluem outras regiões estruturais humanas ou regiões estruturais derivadas de outro anticorpo humano.
[00123] Em algumas modalidades, um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, como na Seção 6, infra), inclui um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2, e VH CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 31-33,
respectivamente. Em certas modalidades, a cadeia pesada ou domínio VH inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 37-40, respectivamente. Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou domínio VH inclui as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 37-40, respectivamente. Em outras modalidades, a cadeia pesada ou domínio VH incluiu outras regiões de estrutura humana ou regiões de estrutura derivadas de outro anticorpo humano.
[00124] Em modalidades específicas, um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, como na Seção 6, infra), inclui: domínio VL ou cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1, VL CDR2, e VL CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 34-36, respectivamente; e um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 31-33, respectivamente. Em certas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 41-44, respectivamente, e a cadeia pesada ou o domínio VH inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 37-40, respectivamente. Em algumas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL inclui as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 41-44, respectivamente, e a cadeia pesada ou domínio VH inclui regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 37-40, respectivamente.
Em outras modalidades, a cadeia leve ou domínio VL e a cadeia pesada ou domínio VH incluem outras regiões estruturais humanas ou regiões estruturais derivadas de outro anticorpo humano.
[00125] Em outra modalidade, um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, tal como na Seção 6, infra), inclui uma, duas, três, quatro, cinco ou todas as seis regiões determinantes de complementaridade (CDRs) do anticorpo EB9. Em certas modalidades, um anticorpo que se liga ao vírus da Zika NS1 (por exemplo,NS1 de uma cepa do vírus da Zika aqui descrito, tal como na Seção 6, infra), incluindo o domínio VL ou a cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1, VL CDR2, e VL CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 48-50, respectivamente. Em certas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 55-58, respectivamente. Em algumas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL compreende as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID
NOs: 55-58, respectivamente. Em outras modalidades, a cadeia leve ou domínio VL incluem outras regiões estruturais humanas ou regiões estruturais derivadas de outro anticorpo humano.
[00126] Em algumas modalidades, um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, como na Seção 6, infra), inclui um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2, e VH CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 45-47, respectivamente. Em certas modalidades, a cadeia pesada ou domínio VH inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 51-54, respectivamente. Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou domínio VH inclui as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 51-54, respectivamente. Em outras modalidades, a cadeia pesada ou domínio VH incluía outras regiões estruturais humanas ou regiões estruturais derivadas de outro anticorpo humano.
[00127] Em modalidades específicas, um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, como na Seção 6, infra), inclui: domínio VL ou cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1, VL CDR2, e VL CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 48-50, respectivamente; e um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1, VH
CDR2 e VH CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 45-47, respectivamente. Em certas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL inclui uma, duas ou três regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 55-58, respectivamente, e a cadeia pesada ou o domínio VH inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 51-54, respectivamente. Em algumas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL inclui as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 55-58, respectivamente, e a cadeia pesada ou domínio VH inclui regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 51-54, respectivamente.
Em outras modalidades, a cadeia leve ou domínio VL e a cadeia pesada ou domínio VH incluem outras regiões estruturais humanas ou regiões estruturais derivadas de outro anticorpo humano.
[00128] Em certas modalidades, um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, como na Seção 6, infra), inclui o domínio VL ou cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1, VL CDR2, e VL CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 62-64, respectivamente.
Em certas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL inclui uma, duas ou três regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 59-61, respectivamente. Em algumas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL compreende as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 69-72, respectivamente. Em outras modalidades, a cadeia leve ou domínio VL incluem outras regiões estruturais humanas ou regiões estruturais derivadas de outro anticorpo humano.
[00129] Em algumas modalidades, um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, como na Seção 6, infra), inclui um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2, e VH CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 59-61, respectivamente. Em certas modalidades, a cadeia pesada ou domínio VH inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 65-68, respectivamente. Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou domínio VH inclui as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 65-68, respectivamente. Em outras modalidades, a cadeia pesada ou domínio VH incluía outras regiões estruturais humanas ou regiões estruturais derivadas de outro anticorpo humano.
[00130] Em modalidades específicas, um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, como na Seção 6, infra), inclui: domínio VL ou cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1, VL CDR2, e VL CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 62-64, respectivamente; e um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 59-61, respectivamente. Em certas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 69-72, respectivamente, e a cadeia pesada ou o domínio VH inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 65-68, respectivamente. Em algumas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL inclui as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 69-72, respectivamente, e a cadeia pesada ou domínio VH inclui as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 65-68, respectivamente.
Em outras modalidades, a cadeia leve ou domínio VL e a cadeia pesada ou domínio VH incluem outras regiões estruturais humanas ou regiões estruturais derivadas de outro anticorpo humano.
[00131] Em outra modalidade, um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, tal como na Seção 6, infra), inclui uma, duas, três, quatro, cinco ou todas as seis regiões determinantes de complementaridade (CDRs) do anticorpo GB5. Em certas modalidades, um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, como na Seção 6, infra), incluindo o domínio VL ou cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1, VL CDR2, e VL CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 76-78, respectivamente. Em certas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 83-86, respectivamente. Em algumas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL compreende as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 83-86, respectivamente. Em outras modalidades, a cadeia leve ou domínio VL incluem outras regiões estruturais humanas ou regiões estruturais derivadas de outro anticorpo humano.
[00132] Em algumas modalidades, um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, como na Seção 6, infra), inclui um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 73-75, respectivamente. Em certas modalidades, a cadeia pesada ou domínio VH inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 79-82, respectivamente. Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou domínio VH inclui as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 79-82, respectivamente. Em outras modalidades, a cadeia pesada ou domínio VH incluía outras regiões estruturais humanas ou regiões estruturais derivadas de outro anticorpo humano.
[00133] Em modalidades específicas, um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, como na Seção 6, infra), inclui: domínio VL ou cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1, VL CDR2, e VL CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 76-78, respectivamente; e um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 73-75, respectivamente. Em certas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 83-86, respectivamente, e a cadeia pesada ou o domínio VH inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 79-82, respectivamente. Em algumas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL inclui as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 83-86, respectivamente, e a cadeia pesada ou domínio VH inclui regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 79-82, respectivamente.
Em outras modalidades, a cadeia leve ou domínio VL e a cadeia pesada ou domínio VH incluem outras regiões estruturais humanas ou regiões estruturais derivadas de outro anticorpo humano.
[00134] Em certas modalidades, um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, como na Seção 6, infra), incluindo o domínio VL ou cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1, VL CDR2, e VL CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 90-92, respectivamente.
Em certas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 97-100, respectivamente. Em algumas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL compreende as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 97-100, respectivamente. Em outras modalidades, a cadeia leve ou domínio VL incluem outras regiões estruturais humanas ou regiões estruturais derivadas de outro anticorpo humano.
[00135] Em algumas modalidades, um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, como na Seção 6, infra), inclui um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2, e VH CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 87-89,
respectivamente. Em certas modalidades, a cadeia pesada ou domínio VH inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 93-96, respectivamente. Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou domínio VH inclui as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 93-96, respectivamente. Em outras modalidades, a cadeia pesada ou domínio VH inclui outras regiões estruturais humanas ou regiões estruturais derivadas de outro anticorpo humano.
[00136] Em modalidades específicas, um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, como na Seção 6, infra), inclui: domínio VL ou cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1, VL CDR2, e VL CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 90-92, respectivamente; e um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 87-89, respectivamente. Em certas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL inclui uma, duas ou três regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 97-100, respectivamente, e a cadeia pesada ou o domínio VH inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 93-96, respectivamente. Em algumas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL inclui as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 97- 100, respectivamente, e a cadeia pesada ou domínio VH inclui as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 93-96, respectivamente. Em outras modalidades, a cadeia leve ou domínio VL e a cadeia pesada ou domínio VH incluem outras regiões estruturais humanas ou regiões estruturais derivadas de outro anticorpo humano.
[00137] Em outra modalidade, um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, tal como na Seção 6, infra), inclui uma, duas, três, quatro, cinco ou todas as seis regiões determinantes de complementaridade (CDRs) do anticorpo FC12. Em certas modalidades, um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, como na Seção 6, infra), incluindo o domínio VL ou cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1, VL CDR2, e VL CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 104-106, respectivamente. Em certas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 101-103, respectivamente. Em algumas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL compreende as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID
NOs: 111-114, respectivamente. Em outras modalidades, a cadeia leve ou domínio VL inclui regiões estruturais humanas ou regiões estruturais derivadas de um anticorpo humano.
[00138] Em algumas modalidades, um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, como na Seção 6, infra), inclui um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2, e VH CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 101- 103, respectivamente. Em certas modalidades, a cadeia pesada ou domínio VH inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 107-110, respectivamente. Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou domínio VH inclui as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 107-110, respectivamente. Em outras modalidades, a cadeia pesada ou domínio VH inclui regiões estruturais humanas ou regiões estruturais derivadas de um anticorpo humano.
[00139] Em modalidades específicas, um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, tal como na Seção 6, inclui: domínio VL ou cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1, VL CDR2, e VL CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 104-106, respectivamente; e um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 101-103, respectivamente. Em certas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL inclui uma, duas ou três regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 111-114, respectivamente, e a cadeia pesada ou domínio VH inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 107-110, respectivamente. Modalidades, a cadeia leve ou domínio VL compreende a região de framework (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 111-114, respectivamente, e a cadeia pesada ou domínio VH compreendendo as regiões de framework (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 107-110, respectivamente. Em outras modalidades, a cadeia leve ou domínio VL e a cadeia pesada ou domínio VH incluem outras regiões estruturais humanas ou regiões estruturais derivadas de outro anticorpo humano.
[00140] Em certas modalidades, um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, como na Seção 6, infra), incluindo o domínio VL ou cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1, VL CDR2, e VL CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 118-120,
respectivamente. Em certas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL inclui uma, duas ou três regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 125-128, respectivamente. Em algumas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL compreende as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 125- 128, respectivamente. Em outras modalidades, a cadeia leve ou domínio VL incluem outras regiões estruturais humanas ou regiões estruturais derivadas de outro anticorpo humano.
[00141] Em algumas modalidades, um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito, como na Seção 6, infra), inclui um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2, e VH CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 115- 117, respectivamente. Em certas modalidades, a cadeia pesada ou domínio VH inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 121-124, respectivamente. Em algumas modalidades, a cadeia pesada ou domínio VH inclui as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 121-124, respectivamente. Em outras modalidades, a cadeia pesada ou domínio VH inclui regiões estruturais humanas ou regiões estruturais derivadas de um anticorpo humano.
[00142] Em modalidades específicas, um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da
Zika aqui descrito, como na Seção 6, infra), inclui: domínio VL ou cadeia leve compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR)1, VL CDR2, e VL CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 118-120,
respectivamente; e um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 115-117, respectivamente.
Em certas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL inclui uma, duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 125-128,
respectivamente, e a cadeia pesada ou o domínio VH inclui uma,
duas ou três das regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 121-
124, respectivamente.
Em algumas modalidades, a cadeia leve ou domínio VL inclui as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 125-
128, respectivamente, e a cadeia pesada ou domínio VH inclui as regiões estruturais (FR)1, FR2, FR3 e FR4 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 121-124,
respectivamente.
Em outras modalidades, a cadeia leve ou domínio
VL e a cadeia pesada ou domínio VH incluem regiões estruturais humanas ou regiões estruturais derivadas de um anticorpo humano.
[00143] Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80%, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui um domínio VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntico à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10; e um domínio VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9. De acordo com essas modalidades, as CDRs do anticorpo podem, em certas modalidades, ser idênticas a uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs do anticorpo AA12.
[00144] Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12.
Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui um domínio VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11.
Em algumas modalidades, um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12; e um domínio VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11. De acordo com essas modalidades, as CDRs do anticorpo podem, em certas modalidades, ser idênticas a uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs do anticorpo EB9.
[00145] Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80%, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14.
Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui um domínio VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13.
Em algumas modalidades, um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14; e um domínio VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13. De acordo com essas modalidades, as CDRs do anticorpo podem, em certas modalidades, ser idênticas a uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs do anticorpo EB9.
[00146] Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80%, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16.
Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui um domínio VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15.
Em algumas modalidades, um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16; e um domínio VH compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15. De acordo com essas modalidades, as CDRs do anticorpo podem, em certas modalidades, ser idênticas a uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs do anticorpo EB9.
[00147] Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1, inclui um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10; um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9; ou um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
10 e o domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 9. Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1, inclui um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12; um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11; ou um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
12 e o domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 11. Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1, inclui um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14; um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13; ou um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
14 e o domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 13. Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1, inclui um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16; um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15; ou um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
16 e o domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15.
[00148] Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80%, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% identi cal para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10; e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9. De acordo com essas modalidades, as CDRs do anticorpo podem, em certas modalidades, idênticas a um, dois, três, quatro, cinco ou todos seis das CDRs do anticorpo AA12.
[00149] Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80%, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12.
Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11.
Em algumas modalidades, um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12; e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11. De acordo com essas modalidades, as CDRs do anticorpo podem, em certas modalidades, idênticos a uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs do anticorpo EB9.
[00150] Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80%, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14.
Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13.
Em algumas modalidades, um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14; e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13.
De acordo com essas modalidades, as CDRs do anticorpo podem, em certas modalidades, idênticos a um, dois, três, quatro, cinco ou todos seis das CDRs do anticorpo GB5.
[00151] Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80%, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16.
Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15.
Em algumas modalidades, um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é de pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16; e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15.
De acordo com essas modalidades, as CDRs do anticorpo podem, em certas modalidades, idênticos a um, dois, três, quatro, cinco ou todos seis das CDRs do anticorpo FC12.
[00152] Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1, compreende uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10; uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9; ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1, compreende uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12; uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11; ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1, compreende uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14; uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13; ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1, compreende uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16; uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15; ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15.
[00153] As técnicas conhecidas pelos versados na técnica podem ser usadas para determinar a porcentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos. Geralmente, para determinar a porcentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos ou de duas sequências de ácido nucleico, as sequências são alinhadas para fins de comparação ideal (por exemplo, lacunas podem ser introduzidas na sequência de um primeiro aminoácido ou sequência de ácido nucleico para alinhamento ideal com um segundo aminoácido ou sequência de ácido nucleico). Os resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos nas posições de aminoácidos ou posições de nucleotídeos correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo que a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição. A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências (por exemplo, % identidade = número de posições sobrepostas idênticas/número total de posições X 100%). Em uma modalidade, as duas sequências têm o mesmo comprimento. Em uma determinada modalidade, a porcentagem de identidade é determinada ao longo de todo o comprimento de uma sequência de aminoácidos ou sequência de nucleotídeos.
[00154] A determinação da porcentagem de identidade entre duas sequências (por exemplo, sequências de aminoácidos ou sequências de ácido nucleico) também pode ser realizada usando um algoritmo matemático. A família de programas BLAST exemplifica um exemplo específico e não limitativo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin & Altschul, 1990, proc. Natl. acad. Sci. USA 87:2264-2268 (modificada como em Karlin & Altschul, 1993, proc. Natl. acad.
Sci. USA 90:5873-5877. Tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403.
As pesquisas de nucleotídeos do BLAST podem ser realizadas com os parâmetros do programa de nucleotídeos NBLAST definidos, por exemplo, para pontuação = 100, comprimento de palavra = 12 para obter sequências de nucleotídeos homólogas às moléculas de ácido nucleico aqui descritas. As pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com os parâmetros do programa XBLAST definidos, por exemplo, para marcar 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácidos homólogas a uma molécula de proteína aqui descrita. Para obter alinhamentos com lacunas para fins de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389 3402.
Alternativamente, PSI BLAST pode ser usado para realizar uma pesquisa iterada que detecta relações remotas entre moléculas (Id.). Ao utilizar os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI Blast, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, de XBLAST e NBLAST) podem ser usados (consulte, por exemplo, National Center for Biotechnology Information (NCBI) na rede mundial, ncbi.nlm.nih.gov). Outro exemplo preferido e não limitativo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller, 1988, CABIOS 4:11 17. Tal algoritmo está incorporado no programa ALIGN (versão 2.0) que faz parte do o pacote de software de alinhamento de sequência GCG. Ao utilizar o programa ALIGN para comparar sequências de aminoácidos, uma tabela de resíduos de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4 podem ser usadas.
[00155] A percentagem de identidade entre duas sequências pode ser determinada usando técnicas semelhantes às descritas acima, com ou sem permitir lacunas. Ao calcular a porcentagem de identidade, normalmente apenas correspondências exatas são contadas.
[00156] Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika na Seção 6, infra), inclui a VH ou VL de AA12 com um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou adições em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 ou 10. Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika na Seção 6, infra), incluindo a VH ou VL de AA12 com um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 ou 10. Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika na Seção 6, infra), inclui a VH ou VL de AA12 com um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 ou 10, em que uma ou mais substituições de aminoácidos estão em uma, duas, três ou mais das regiões estruturais. Em modalidades específicas, nenhuma das substituições de aminoácidos está localizada dentro das CDRs (por exemplo, SEQ ID NOs: 17-22 ou SEQ ID NOs: 31-36). Em modalidades específicas, todas as substituições de aminoácidos estão nas regiões estruturais (por exemplo, SEQ ID NOs: 23-30 ou SEQ ID NOs: 37-44).
[00157] Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika na Seção 6, infra), inclui (1) o domínio VH de AA12 com um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou
20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou adições em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 e (2) o domínio VL de
AA12 com uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, aminoácido conservador substituições), deleções ou adições em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da
Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika na Seção
6, infra), inclui (1) o domínio VH de AA12 com uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) em relação à sequência de aminoácidos do SEQ ID NO:
9 e (2) o domínio VL de AA12 com uma ou mais (por exemplo, 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos
(por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da
Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika na Seção
6, infra), inclui (1) o domínio VH de AA12 com um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
9, em que aquele ou mais substituições de aminoácidos em uma, duas,
três ou mais das regiões estruturais; e (2) o domínio VL de AA12 com uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, em que uma ou mais substituições de aminoácidos estão em uma, duas, três ou mais das regiões estruturais. Em modalidades específicas, nenhuma das substituições de aminoácidos está localizada dentro das CDRs (por exemplo, SEQ ID NOs: 17-22 ou 31-36). Em modalidades específicas, todas as substituições de aminoácidos estão nas regiões estruturais (por exemplo, SEQ ID NOs: 23-30 ou 37-44).
[00158] Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) na sequência de aminoácidos de uma, duas ou mais das seguintes: a VL CDR1, a VL CDR2, a VL CDR3, a VL CDR1 e VL CDR2, a VL CDR2 e VL CDR3, a VL CDR1 e VL CDR3, ou a VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 do anticorpo AA12.
Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) na sequência de aminoácidos de uma, duas ou mais das seguintes: a VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3, a VH CDR1 e VH CDR2, a VH CDR2 e VH CDR3, a VH CDR1 e VH CDR3, ou VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 do anticorpo AA12.
Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) na sequência de aminoácidos de uma, duas ou mais das seguintes: a VL CDR1; a VL CDR2; a VL CDR3; a VH CDR1; a VH CDR2; e/ou a VH CDR3 do anticorpo AA12.
[00159] Tal como aqui utilizado, uma "substituição conservativa de aminoácido" é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral com uma carga semelhante. Famílias de resíduos de aminoácidos possuindo cadeias laterais com cargas semelhantes foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais ramificadas beta (por exemplo,
treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).
[00160] Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika na Seção 6, infra), inclui a VH ou VL de EB9 com um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou adições em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 ou 12. Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika na Seção 6, infra), incluindo a VH ou VL de EB9 com um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 ou 12. Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika na Seção 6, infra), inclui a VH ou VL de EB9 com um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 ou 12, em que uma ou mais substituições de aminoácidos estão em uma, duas, três ou mais das regiões estruturais. Em modalidades específicas, nenhuma das substituições de aminoácidos está localizada dentro das CDRs (por exemplo, SEQ ID NOs: 45-50 ou SEQ ID No: 59-64). Em modalidades específicas, todas as substituições de aminoácidos estão nas regiões estruturais (por exemplo, SEQ ID NOs: 51-58 ou SEQ ID NOs: 65-72).
[00161] Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika na Seção 6, infra), inclui (1) o domínio VH de EB9 com um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou adições em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 e (2) o domínio VL de EB9 com uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, aminoácido conservador substituições), deleções ou adições em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12. Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika na Seção 6, infra), inclui (1) o domínio VH de EB9 com uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) em relação à sequência de aminoácidos do S EQ ID NO: 11 e (2) o domínio VL de EB9 com uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservadoras de aminoácidos) em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12. Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika na Seção 6, infra), incluído (1) o domínio VH de EB9 com uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, aminoácidos conservativos substituições de ácido) em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, em que uma ou mais substituições de aminoácidos estão em uma, duas, três ou mais das regiões estruturais; e (2) o domínio VL de EB9 com uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, em que uma ou mais substituições de aminoácidos estão em uma, duas, três ou mais das regiões estruturais. Em modalidades específicas, nenhuma das substituições de aminoácidos está localizada dentro das CDRs (por exemplo, SEQ ID NOs: 45-50 ou 59-64). Em modalidades específicas, todas as substituições de aminoácidos estão nas regiões estruturais (por exemplo, SEQ ID NOs: 51-58 ou 65-72).
[00162] Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) na sequência de aminoácidos de uma, duas ou mais das seguintes: a VL CDR1, a VL CDR2, a VL CDR3, a VL CDR1 e VL CDR2, a VL CDR2 e VL CDR3, a VL CDR1 e VL CDR3, ou a VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 do anticorpo EB9.
Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) na sequência de aminoácidos de uma, duas ou mais das seguintes: a VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3, a VH CDR1 e VH CDR2, a VH CDR2 e VH CDR3, a VH CDR1 e VH CDR3, ou VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 do anticorpo EB9. Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) na sequência de aminoácidos de uma, duas ou mais das seguintes: a VL CDR1; a VL CDR2; a VL CDR3; a VH CDR1; a VH CDR2; e/ou a VH CDR3 do anticorpo EB9.
[00163] Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika na Seção 6, infra), incluindo a VH ou VL de GB5 com um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou adições em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 ou 14. Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika na Seção 6, infra), incluindo a VH ou VL de GB5 com um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições de aminoácidos conservativas) em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 ou 14. Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika na Seção 6, infra), inclui a VH ou VL de GB5 com um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 ou 14, em que uma ou mais substituições de aminoácidos estão em uma, duas, três ou mais das regiões estruturais. Em modalidades específicas, nenhuma das substituições de aminoácidos está localizada dentro das CDRs (por exemplo, SEQ ID NOs: 73-78 ou SEQ ID No: 87-92). Em modalidades específicas, todas as substituições de aminoácidos estão nas regiões estruturais (por exemplo, SEQ ID NOs: 79-86 ou SEQ ID NOs: 93- 100).
[00164] Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika na Seção 6, infra), inclui (1) o domínio VH de GB5 com um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou
20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou adições em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 e (2) o domínio VL de
GB5 com uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, aminoácido conservador substituições), deleções ou adições em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14. Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da
Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika na Seção
6, infra), inclui (1) o domínio VH de GB5 com uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) em relação à sequência de aminoácidos do S EQ ID NO:
13 e (2) o domínio VL de GB5 com uma ou mais (por exemplo, 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos
(por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14. Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da
Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika na Seção
6, infra), inclui (1) o domínio VH de GB5 com um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, em que aquele ou mais substituições de aminoácidos em uma, duas, três ou mais das regiões estruturais; e (2) o domínio VL de EB9 com uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14, em que uma ou mais substituições de aminoácidos estão em uma, duas, três ou mais das regiões estruturais. Em modalidades específicas, nenhuma das substituições de aminoácidos está localizada dentro das CDRs (por exemplo, SEQ ID NOs: 73-78 ou 87-92). Em modalidades específicas, todas as substituições de aminoácidos estão nas regiões estruturais (por exemplo, SEQ ID NOs: 79-86 ou 93-100).
[00165] Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) na sequência de aminoácidos de uma, duas ou mais das seguintes: a VL CDR1, a VL CDR2, a VL CDR3, a VL CDR1 e VL CDR2, a VL CDR2 e VL CDR3, a VL CDR1 e VL CDR3, ou a VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 do anticorpo GB5.
Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui uma ou mais (por exemplo,
1, 2, 3, 4, 5 ou 6) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) na sequência de aminoácidos de uma, duas ou mais das seguintes: a VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3, a VH CDR1 e VH CDR2, a VH CDR2 e VH CDR3, a VH CDR1 e VH CDR3, ou VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 do anticorpo GB5. Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) na sequência de aminoácidos de uma, duas ou mais das seguintes: a VL CDR1; a VL CDR2; a VL CDR3; a VH CDR1; a VH CDR2; e/ou a VH CDR3 do anticorpo GB5.
[00166] Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika na Seção 6, infra), inclui a VH ou VL de FC12 com um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou adições em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 ou 16. Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika na Seção 6, infra), inclui a VH ou VL de FC12 com um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 ou 16. Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika na Seção 6, infra), inclui a VH ou VL de FC12 com um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 ou 16, em que uma ou mais substituições de aminoácidos estão em um, dois, três ou mais dos regiões estruturais. Em modalidades específicas, nenhuma das substituições de aminoácidos está localizada dentro das CDRs (por exemplo, SEQ ID NOs: 101-106 ou SEQ ID No: 115-120). Em modalidades específicas, todas as substituições de aminoácidos estão nas regiões estruturais (por exemplo, SEQ ID NOs: 107-114 ou SEQ ID NOs: 121- 128).
[00167] Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika na Seção 6, infra), inclui (1) o domínio VH de FC12 com um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos), deleções ou adições em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 e (2) o domínio VL de FC12 com uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, aminoácido conservador substituições), deleções ou adições em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16. Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da
Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika na Seção
6, infra), inclui (1) o domínio VH de FC12 com uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
15 e (2) o domínio VL de FC12 com uma ou mais (por exemplo, 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos
(por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16. Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da
Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika na Seção
6, infra), inclui (1) o domínio VH de FC12 com uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, conservador substituições de aminoácidos) em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
15, em que uma ou mais substituições de aminoácidos estão em uma,
duas, três ou mais das regiões estruturais; e (2) o domínio VL de
FC12 com uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
15 ou 20) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16, em que uma ou mais substituições de aminoácidos estão em uma, duas, três ou mais das regiões estruturais. Em modalidades específicas, nenhuma das substituições de aminoácidos está localizada dentro das CDRs (por exemplo, SEQ ID NOs: 101-106 ou 115-120). Em modalidades específicas, todas as substituições de aminoácidos estão nas regiões estruturais (por exemplo, SEQ ID NOs: 107-114 ou 121-128).
[00168] Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) na sequência de aminoácidos de uma, duas ou mais das seguintes: a VL CDR1, a VL CDR2, a VL CDR3, a VL CDR1 e VL CDR2, a VL CDR2 e VL CDR3, a VL CDR1 e VL CDR3, ou a VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 do anticorpo FC12.
Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) na sequência de aminoácidos de uma, duas ou mais das seguintes: a VH CDR1, a VH CDR2, a VH CDR3, a VH CDR1 e VH CDR2, a VH CDR2 e VH CDR3, a VH CDR1 e VH CDR3, ou VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 do anticorpo FC12.
Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), inclui uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) substituições de aminoácidos (por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos) na sequência de aminoácidos de uma, duas ou mais das seguintes: a VL CDR1; a VL CDR2; a VL CDR3; a VH CDR1; a VH CDR2; e/ou a VH CDR3 do anticorpo FC12.
[00169] Em outro aspecto, são fornecidos neste documento anticorpos que se ligam ao mesmo ou a um epítopo de sobreposição de um anticorpo aqui descrito (por exemplo, um anticorpo descrito na Seção 6, infra), por exemplo, anticorpos que competem pela ligação a um vírus da Zika NS1 com um anticorpo aqui descrito, ou anticorpos que se ligam a um epítopo que se sobrepõe a um epítopo ao qual se liga um anticorpo aqui descrito. Conforme usado neste documento, um "epítopo" é um termo na técnica e normalmente se refere a uma região localizada de um antígeno ao qual um anticorpo pode se ligar especificamente. Um epítopo pode ser, por exemplo, aminoácidos contíguos de um polipeptídeo (epítopo linear ou contínuo) ou um epítopo pode, por exemplo, vir junto de duas ou mais regiões não contíguas de um polipeptídeo ou polipeptídeos (conformacional, não linear, epítopo descontínuo ou não contíguo).
Em certos aspectos, os ensaios de mapeamento de epítopo, bem conhecidos por aqueles versados na técnica, podem ser realizados para determinar o epítopo (por exemplo, epítopo conformacional) ao qual um anticorpo aqui descrito se liga. Em certas modalidades, o epítopo pode ser determinado por, por exemplo, mapeamento estrutural usando microscopia eletrônica negativa (ver, por exemplo, Seção 6, infra), estudos de cristalografia de difração de raios-X (ver, por exemplo, Blechman et al., 1993, J. Biol. Chem.
268: 4399-4406; Cho et al., 2003, Nature, 421: 756-760), ensaios de ELISA, troca de hidrogênio/deutério acoplada a espectrometria de massa (por exemplo, espectrometria de massa MALDI), oligo- ensaios de varredura de peptídeos, mapeamento de mutagênese (por exemplo, mapeamento de mutagênese direcionada ao local) e/ou ensaios de ligação de escape.
[00170] Os anticorpos que reconhecem tais epítopos podem ser identificados usando técnicas de rotina, como um imunoensaio, por exemplo, mostrando a capacidade de um anticorpo para bloquear a ligação de outro anticorpo a um antígeno alvo, isto é, um ensaio de ligação competitivo. Os ensaios de ligação de competição também podem ser usados para determinar se dois anticorpos têm especificidade de ligação semelhante para um epítopo. A ligação competitiva pode ser determinada em um ensaio em que a imunoglobulina em teste inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum, tal como um vírus da Zika NS1.
Numerosos tipos de ensaios de ligação competitiva são conhecidos, por exemplo: radioimunoensaio direto ou indireto em fase sólida (RIA), imunoensaio enzimático direto ou indireto em fase sólida
(EIA), ensaio de competição em sanduíche (ver Stahli et al., (1983) Methods in Enzymology 9: 242); EIA de biotina-avidina direto em fase sólida (ver Kirkland et al., (1986) J. Immunol. 137: 3614); ensaio de marcação direta em fase sólida, ensaio em sanduíche de marcação direta em fase sólida (ver Harlow e Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA de marcação direta em fase sólida usando marcação I-125 (ver Morel et al., (1988) Mol. Immunol. 25 (1): 7); EIA biotina-avidina direto em fase sólida (Cheung et al., (1990) Virology 176: 546); e RIA rotulado direto. (Moldenhauer et al., (1990) Scand J. Immunol.
32:77). Normalmente, tal ensaio envolve o uso de antígeno purificado (por exemplo, um vírus da Zika NS1 aqui descrito, como na Seção 6, infra) ligado a uma superfície sólida ou células contendo qualquer um destes, uma imunoglobulina de teste não marcada e uma imunoglobulina de referência marcada. A inibição competitiva pode ser medida determinando a quantidade de marcador ligado à superfície sólida ou células na presença da imunoglobulina de teste. Normalmente, o teste de imunoglobulina está presente em excesso. Normalmente, quando um anticorpo competidor está presente em excesso, ele inibirá a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum em pelo menos 50-55%, 55-60%, 60- 65%, 65-70% 70-75% ou mais. Um ensaio de ligação de competição pode ser configurado em um grande número de formatos diferentes usando antígeno marcado ou anticorpo marcado. Em uma versão comum deste ensaio, o antígeno é imobilizado em uma placa de 96 poços.
A capacidade dos anticorpos não marcados de bloquear a ligação dos anticorpos marcados ao antígeno é então medida usando marcadores radioativos ou enzimáticos. Para mais detalhes ver, por exemplo, Wagener et al., J. Immunol., 1983, 130: 2308-2315; Wagener et al., J. Immunol. Methods, 1984, 68: 269-274; Kuroki et al., Cancer Res., 1990, 50: 4872-4879; Kuroki et al., Immunol. Invest., 1992, 21: 523-538; Kuroki et al., Hybridoma, 1992, 11: 391-407, e Using Antibodies: A Laboratory Manual, editores Ed Harlow e David Lane (Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Springs Harbor, N.Y., 1999), pp. 386-389.
[00171] Em certos aspectos, os ensaios de ligação de competição podem ser usados para determinar se um anticorpo é bloqueado competitivamente, por exemplo, de uma maneira dependente da dose, por outro anticorpo, por exemplo, um anticorpo se liga essencialmente ao mesmo epítopo, ou epítopos sobrepostos, como um anticorpo de referência, quando os dois anticorpos reconhecem epítopos idênticos ou estericamente sobrepostos em ensaios de ligação de competição, como os ensaios de ELISA de competição, que podem ser configurados em vários formatos diferentes, usando antígeno marcado ou anticorpo marcado. Em uma modalidade particular, um anticorpo pode ser testado em ensaios de ligação de competição com um anticorpo aqui descrito, por exemplo, anticorpo
AA12, EB9, GB5 ou FC12, ou um anticorpo compreendendo VH CDRs e VL CDRs de anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12.
[00172] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de um vírus da Zika descrito na Seção 6, infra), em que o referido anticorpo compete (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) pela ligação para o vírus da Zika NS1 com um anticorpo de referência compreendendo: um domínio VL ou cadeia leve compreendendo uma VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 20-22, respectivamente; e um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 17-19, respectivamente. Em outra modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de um vírus da Zika descrito na Seção 6, infra), em que o referido anticorpo compete (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) pela ligação para o vírus da Zika NS1 com um anticorpo de referência compreendendo: um domínio VL ou cadeia leve compreendendo uma VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 34-36, respectivamente; e um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 31-33, respectivamente.
[00173] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de um vírus da Zika descrito na Seção 6, infra), em que o referido anticorpo compete (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) pela ligação para o vírus da Zika NS1 com um anticorpo de referência compreendendo: um domínio VL ou cadeia leve compreendendo uma VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 48-50, respectivamente; e um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 45-47, respectivamente. Em outra modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de um vírus da Zika descrito na Seção 6, infra), em que o referido anticorpo compete (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) pela ligação ao vírus da Zika NS1 com um anticorpo de referência compreendendo: um domínio VL ou cadeia leve compreendendo uma VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 62-64, respectivamente; e um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 59-61, respectivamente.
[00174] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de um vírus da Zika descrito na Seção 6, infra), em que o referido anticorpo compete (por exemplo, de uma maneira dependente da dose)
pela ligação para o vírus da Zika NS1 com um anticorpo de referência compreendendo: um domínio VL ou cadeia leve compreendendo uma VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 76-78, respectivamente; e um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 73-75, respectivamente. Em outra modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de um vírus da Zika descrito na Seção 6, infra), em que o referido anticorpo compete (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) pela ligação para o vírus da Zika NS1 com um anticorpo de referência compreendendo: um domínio VL ou cadeia leve compreendendo uma VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 90-92, respectivamente; e um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 87-89, respectivamente.
[00175] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de um vírus da Zika descrito na Seção 6, infra), em que o referido anticorpo compete (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) pela ligação para o vírus da Zika NS1 com um anticorpo de referência compreendendo: um domínio VL ou cadeia leve compreendendo uma VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 104-106, respectivamente; e um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 101- 103, respectivamente. Em outra modalidade específica, é aqui fornecido um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de um vírus da Zika descrito na Seção 6, infra), em que o referido anticorpo compete (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) pela ligação para o vírus da Zika NS1 com um anticorpo de referência compreendendo: um domínio VL ou cadeia leve compreendendo uma VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 118-120, respectivamente; e um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 115-117, respectivamente.
[00176] Em outra modalidade, é aqui fornecido um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de um vírus da Zika descrito na Seção 6, infra), em que o referido anticorpo compete (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) para se ligar a o vírus da Zika NS1 com um anticorpo de referência compreendendo um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10; e o domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9. Em outra modalidade, é aqui fornecido um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de um vírus da Zika descrito na Seção 6, infra),
em que o referido o anticorpo compete (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) pela ligação ao vírus da Zika NS1 com um anticorpo de referência que compreende um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12; e o domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11. Em outra modalidade, é aqui fornecido um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de um vírus da Zika descrito na Seção 6, infra), em que o referido o anticorpo compete (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) pela ligação ao vírus da Zika NS1 com um anticorpo de referência que compreende um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14; e o domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13. Em outra modalidade, é aqui fornecido um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de um vírus da Zika descrito na Seção 6, infra), em que o referido o anticorpo compete (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) pela ligação ao vírus da Zika NS1 com um anticorpo de referência que compreende um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16; e domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15.
[00177] Em uma modalidade, um anticorpo aqui descrito se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo AA12 aqui descrito. Em outra modalidade, um anticorpo aqui descrito se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo EB9 aqui descrito. Em outra modalidade, um anticorpo aqui descrito se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo GB5 aqui descrito. Em outra modalidade, um anticorpo aqui descrito se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo FC12 aqui descrito.
[00178] Em outra modalidade específica, um anticorpo fornecido neste documento compete pela ligação ao NS1 recombinante ou ao vírus da Zika NS1 com um anticorpo que compreende as regiões variáveis (domínios VL e VH) ou cadeias leve e pesada do anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12. Em outra modalidade particular, um anticorpo compete pela ligação ao NS1 recombinante ou ao vírus da Zika NS1 com o anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12. Em uma modalidade particular, a competição entre um anticorpo para a ligação ao NS1 recombinante ou ao vírus da Zika NS1 com o anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12 não é assimétrica.
[00179] Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1, inclui um domínio VH ou cadeia pesada compreendendo FR1, FR2, FR3 e FR4 do domínio VH ou cadeia pesada do anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12. Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1, inclui um domínio VL ou cadeia leve compreendendo FR1, FR2, FR3 e FR4 do domínio VL ou cadeia leve do anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12. Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1, compreende as regiões estruturais do anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12.
[00180] Em modalidades específicas, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1, compreende regiões estruturais (por exemplo, regiões estruturais do domínio VL e/ou domínio VH) que são regiões estruturais humanas ou derivadas de regiões estruturais humanas. A região de estrutura pode ser de ocorrência natural ou regiões de estrutura de consenso (ver, por exemplo, Sui et al., 2009, Nature Structural & Molecular Biology 16: 265-273).
Exemplos não limitativos de regiões estruturais humanas são descritos na técnica, por exemplo, ver Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.
91-3242). Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito inclui regiões estruturais (por exemplo, regiões estruturais do domínio VL e/ou domínio VH) que são regiões estruturais de primatas (por exemplo, primata não humano) ou derivadas de primata (por exemplo, primata não humano) regiões estruturais.
[00181] Por exemplo, as CDRs de anticorpos não humanos específicos do antígeno, tipicamente de origem de roedores (por exemplo, rato ou rato), são enxertados em estruturas aceitadoras homólogas de primatas humanos ou não humanos. Em uma modalidade, as estruturas aceitadoras de primatas não humanos são de macacos do Velho Mundo. Em uma modalidade específica, a estrutura aceitadora de macacos do Velho Mundo é de Pan troglodytes, Pan paniscus ou Gorilla gorilla. Em uma modalidade particular, as estruturas aceitadoras de primatas não humanos são de chimpanzés Pan troglodytes. Em uma modalidade particular, as estruturas aceitadoras de primatas não humanos são estruturas aceitadoras de macacos do Velho Mundo. Em uma modalidade específica, as estruturas aceitadoras de macacos do Velho Mundo são do gênero Macaca. Em uma determinada modalidade, as estruturas aceitadoras de primatas não humanos são derivadas do macaco cynomolgus Macaca cynomolgus. As sequências estruturais de primatas não humanos são descritas na Publicação do Pedido de Patente US 2005/0208625.
[00182] Em aspectos específicos, é aqui fornecido um anticorpo que compreende uma cadeia leve e uma cadeia pesada de anticorpo, por exemplo, uma cadeia leve e uma cadeia pesada separadas.
[00183] No que diz respeito à cadeia leve, em uma modalidade específica, a cadeia leve de um anticorpo aqui descrito é uma cadeia leve kapa. Em outra modalidade específica, a cadeia leve de um anticorpo aqui descrito é uma cadeia leve lambda. Em ainda outra modalidade específica, a cadeia leve de um anticorpo aqui descrito é uma cadeia leve kappa humana ou uma cadeia leve lambda humana.
Em uma modalidade particular, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1, inclui uma cadeia leve em que a sequência de aminoácidos do domínio VL pode compreender qualquer sequência de aminoácidos aqui descrita e em que a região constante da cadeia leve incluída a sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia leve kappa ou lamda humana. Exemplos não limitativos de sequências da região constante humana foram descritos na técnica, por exemplo, ver Patente US No. 5.693.780 e Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242.
[00184] Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito inclui (i) uma cadeia pesada compreendendo um domínio VH aqui descrito e uma região constante; ou (ii) uma cadeia leve compreendendo um domínio VL aqui descrito e uma região constante.
Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito inclui (i) uma cadeia pesada compreendendo um domínio VH aqui descrito e uma região constante; e (ii) uma cadeia leve compreendendo um domínio VL aqui descrito e uma região constante. Conforme usado neste documento, o termo "região constante" ou "domínio constante" é intercambiável e tem seu significado comum na técnica. A região constante se refere a uma porção do anticorpo, por exemplo, uma porção do terminal carboxila de uma cadeia leve e/ou pesada que não está diretamente envolvida na ligação de um anticorpo ao antígeno, mas que pode exibir várias funções efetoras, como a interação com o receptor Fc. Os termos se referem a uma porção de uma molécula de imunoglobulina tendo uma sequência de aminoácidos geralmente mais conservada em relação a um domínio variável de imunoglobulina.
[00185] Tal como aqui utilizado, o termo "cadeia pesada" quando usado em referência a um anticorpo pode se referir a quaisquer tipos distintos, por exemplo, alfa (α), delta (δ), épsilon (ε), gama (γ) e mu (µ), com base na sequência de aminoácidos do domínio constante, que dá origem às classes de anticorpos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, incluindo subclasses de IgG, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
[00186] Tal como aqui utilizado, o termo "cadeia leve", quando usado em referência a um anticorpo, pode se referir a quaisquer tipos distintos, por exemplo, kappa (κ) de lambda (λ) com base na sequência de aminoácidos dos domínios constantes. As sequências de aminoácidos de cadeia leve são bem conhecidas na técnica. Em modalidades específicas, a cadeia leve é uma cadeia leve humana.
[00187] Com relação à cadeia pesada, em uma modalidade específica, a cadeia pesada de um anticorpo aqui descrito pode ser uma cadeia pesada alfa (α), delta (δ), épsilon (ε), gama (γ) ou mi (µ). Em outra modalidade específica, a cadeia pesada de um anticorpo descrito pode compreender uma cadeia pesada humana alfa (α), delta (δ), épsilon (ε), gama (γ) ou mi (µ). Em uma modalidade particular, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1, inclui uma cadeia pesada em que a sequência de aminoácidos do domínio VH pode compreender qualquer sequência de aminoácidos aqui descrita e em que a região constante da cadeia pesada inclui a sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada gama (γ) humana. Exemplos não limitativos de sequências da região constante humana foram descritos na técnica, por exemplo, ver Patente US 5,693,780 e Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.
91-3242.
[00188] Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika aqui descrito na Seção 6, infra) inclui um domínio VL e um domínio VH compreendendo quaisquer sequências de aminoácidos aqui descritas, e em que as regiões constantes compreendendo as sequências de aminoácidos das regiões constantes de uma molécula de imunoglobulina IgG, IgE, IgM, IgD, IgA ou IgY (por exemplo, uma molécula de imunoglobulina IgG, IgE, IgM, IgD, IgA ou IgY humana). Em outra modalidade específica, um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika aqui descrito na Seção 6, infra) inclui um domínio VL e um domínio VH compreendendo quaisquer sequências de aminoácidos aqui descritas, e as regiões constantes que compreendem as sequências de aminoácidos das regiões constantes de uma molécula de imunoglobulina IgG, IgE, IgM, IgD, IgA ou IgY, qualquer classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), ou qualquer subclasse (por exemplo, IgG2a e IgG2b) da molécula de imunoglobulina. Em uma modalidade particular, as regiões constantes que compreendem as sequências de aminoácidos das regiões constantes de uma molécula de imunoglobulina IgG, IgE, IgM, IgD, IgA ou IgY humana, qualquer classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), ou qualquer subclasse (por exemplo, IgG2a e IgG2b) da molécula de imunoglobulina.
[00189] Os anticorpos descritos neste documento podem ser amadurecidos por afinidade usando técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica. Os anticorpos descritos neste documento podem ser quimerizados usando técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica. Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual diferentes porções do anticorpo são derivadas de diferentes moléculas de imunoglobulina. Os métodos para a produção de anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Morrison, 1985, Science 229: 1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4: 214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125: 191-202; e Patentes US 5,807,715, 4,816,567, 4,816,397 e 6,331,415, que são incorporados neste documento por referência em sua totalidade.
[00190] Os anticorpos aqui descritos podem ser humanizados. Um anticorpo humanizado é capaz de se ligar a um antígeno predeterminado e compreende uma região estrutural tendo substancialmente a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e CDRs tendo substancialmente a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina não humana. Um anticorpo humanizado incluiu substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois,
domínios variáveis (Fab, Fab′, F(ab′)2, Fab, Fv) em que todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana (isto é, anticorpo doador) e todas ou substancialmente todas as regiões estruturais são aquelas de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana.
De preferência, um anticorpo humanizado também inclui pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana.
Normalmente, o anticorpo conterá tanto a cadeia leve quanto pelo menos a região variável de uma cadeia pesada.
O anticorpo também pode incluir as regiões CH1, dobradiça,
CH2, CH3 e CH4 da cadeia pesada.
O anticorpo humanizado pode ser selecionado de qualquer classe de imunoglobulinas, incluindo IgM,
IgG, IgD, IgA e IgE, e qualquer isotipo, incluindo IgG1, IgG2,
IgG3 e IgG4. Normalmente, o domínio constante é um domínio constante de fixação do complemento, onde se deseja que o anticorpo humanizado exiba atividade citotóxica e a classe é tipicamente
IgG1. Quando tal atividade citotóxica não for desejável, o domínio constante pode ser da classe IgG2. Exemplos de domínios constantes
VL e VH que podem ser usados em certas modalidades incluem, mas não estão limitados a, C-kappa e C-gama-1 (nG1m) descritos em
Johnson et al. (1997) J.
Infect.
Dizer. 176, 1215-1224 e aqueles descritos na Patente US 5,824,307. O anticorpo humanizado pode incluir sequências de mais de uma classe ou isotipo, e a seleção de domínios constantes particulares para otimizar as funções efetoras desejadas está dentro da habilidade comum na técnica. As regiões de estrutura e CDR de um anticorpo humanizado não precisam corresponder precisamente às sequências parentais, por exemplo, o CDR do doador ou a estrutura de consenso podem ser mutagenizados por substituição, inserção ou deleção de pelo menos um resíduo de modo que o CDR ou resíduo da estrutura naquele local não corresponde ao consenso ou ao anticorpo de importação. Essas mutações, no entanto, não serão extensas. Normalmente, pelo menos 75% dos resíduos de anticorpos humanizados corresponderão àqueles da estrutura parental e sequências de CDR, mais frequentemente 90%, e mais preferencialmente maior do que 95%.
[00191] Os anticorpos fornecidos neste documento incluem derivados que são quimicamente modificados, isto é, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo. Por exemplo, mas não como limitação, os derivados de anticorpos incluem anticorpos que foram quimicamente modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou outra proteína etc.
Qualquer uma das inúmeras modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo, mas não se limitando a clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina etc. Além disso, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos.
[00192] Em certas modalidades, a glicosilação de anticorpos aqui descritos, em particular a glicosilação de uma região variável de um anticorpo aqui descrito, é modificada. Por exemplo, um anticorpo aglicoslado pode ser feito (isto é, o anticorpo não tem glicosilação) ou um anticorpo que compreende uma mutação ou substituição em um ou mais locais de glicosilação para eliminar a glicosilação em um ou mais locais de glicosilação pode ser feito.
A glicosilação pode ser alterada para, por exemplo, aumentar a afinidade do anticorpo para o vírus da Zika NS1. Essas modificações de carboidratos podem ser realizadas, por exemplo, alterando um ou mais locais de glicosilação na sequência de anticorpo. Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácidos podem ser feitas que resultam na eliminação de uma ou mais regiões variáveis (por exemplo, VL e/ou VH CDRs ou VL e/ou VH FRs) locais de glicosilação para, desse modo, eliminar a glicosilação nesse local. Essa aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo por um NS1 do vírus da Zika. Tal abordagem é descrita em mais detalhes nas Patentes US Nos. 5,714,350 e 6,350,861.
[00193] A glicosilação pode ocorrer por meio de glicosilação ligada a N (ou ligada a asparagina) ou glicosilação ligada a O. A glicosilação ligada a N envolve a modificação de carboidratos no grupo NH2 da cadeia lateral de um aminoácido asparagina em um polipeptídeo. A glicosilação ligada a O envolve a modificação de carboidratos no grupo hidroxila na cadeia lateral de um aminoácido serina, treonina ou hidroxilisina.
[00194] Em certas modalidades, os anticorpos aglicosilados podem ser produzidos em células bacterianas que não possuem a maquinaria de glicosilação necessária. As células com maquinaria de glicosilação alterada foram descritas na técnica e podem ser usadas como células hospedeiras nas quais expressam anticorpos recombinantes aqui descritos para, desse modo, produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Ver, por exemplo, Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 26733-26740; Umana et al.
(1999) Nat. Biotech. 17: 176-1, bem como, Patente Europeia No: EP
1.176.195; Publicações PCT WO 03/035835; WO 99/54342.
[00195] Foi relatado que anticorpos com conteúdo de fucose reduzido têm uma afinidade aumentada para receptores Fc, como, por exemplo, FcγRIIIa. Por conseguinte, em certas modalidades, os anticorpos aqui descritos têm teor de fucose reduzido ou nenhum teor de fucose. Esses anticorpos podem ser produzidos utilizando técnicas conhecidas por um especialista na técnica. Por exemplo, os anticorpos podem ser expressos em células deficientes ou sem a capacidade de fucosilar. Em um exemplo específico, as linhas celulares com um nocaute de ambos os alelos de α1,6- fucosiltransferase podem ser usadas para produzir anticorpos com conteúdo de fucose reduzido. O sistema Potelligent® (Lonza) é um exemplo de tal sistema que pode ser usado para produzir anticorpos com reduzido teor de fucose.
[00196] Em certas modalidades, uma, duas ou mais mutações (por exemplo, substituições de aminoácidos) são introduzidas na região Fc de um anticorpo aqui descrito ou um fragmento deste (por exemplo, domínio CH2 (resíduos 231-340 de IgG1 humana) e/ou CH3 domínio (resíduos 341-447 de IgG1 humana) e/ou a região de dobradiça, com numeração de acordo com o sistema de numeração de Kabat (por exemplo, o índice EU em Kabat)) para aumentar a afinidade do anticorpo para um receptor Fc (por exemplo, um receptor Fc ativado) na superfície de uma célula efetora. Mutações na região Fc de um anticorpo ou fragmento do mesmo que aumentam a afinidade de um anticorpo para um receptor Fc e técnicas para a introdução de tais mutações no receptor Fc ou fragmento do mesmo são conhecidas por aqueles versados na técnica. Exemplos de mutações no receptor Fc de um anticorpo que podem ser feitas para aumentar a afinidade do anticorpo para um receptor Fc são descritos em, por exemplo, Smith, P., et al. (2012) PNAS. 109: 6181-6186, que é incorporado neste documento por referência.
5.2.1 Anticorpos com meias-vidas aumentadas
[00197] São aqui fornecidos anticorpos, em que os referidos anticorpos são modificados para ter uma meia-vida estendida (ou aumentada) in vivo. Em particular, são aqui fornecidos anticorpos modificados que têm uma meia-vida em um indivíduo, de preferência um mamífero e mais preferencialmente um humano, de cerca de 3 dias a cerca de 180 dias (ou mais), e em algumas modalidades superior a 3 dias, maior que 7 dias, maior que 10 dias, maior que 15 dias, maior que 20 dias, maior que 25 dias, maior que 30 dias, maior que 35 dias, maior que 40 dias, maior que 45 dias, maior que 50 dias, pelo menos cerca de 60 dias, maior do que 75 dias, maior do que 90 dias, maior do que 105 dias, maior do que 120 dias, maior do que 135 dias, maior do que 150 dias, maior do que 165 dias ou maior do que 180 dias.
[00198] Em uma modalidade específica, os anticorpos modificados com uma meia-vida aumentada in vivo são gerados pela introdução de uma ou mais modificações de aminoácidos (ou seja, substituições, inserções ou deleções) em um domínio constante de IgG, ou fragmento de ligação a FcRn do mesmo (de preferência um Fc ou fragmento de domínio Fc de dobradiça). Ver, por exemplo, Publicações Internacionais WO 02/060919; WO 98/23289; e WO 97/34631; e Patente US No. 6,277,375; cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Em uma modalidade específica, os anticorpos modificados podem ter uma ou mais modificações de aminoácidos no segundo domínio CH2 constante (resíduos 231-340 de IgG1 humana) e/ou no terceiro domínio CH3 constante (resíduos 341- 447 de IgG1 humana), com numeração de acordo com o sistema de numeração de Kabat (por exemplo, o índice da UE em Kabat).
[00199] Em algumas modalidades, para prolongar a circulação de soro in vivo de anticorpos, moléculas de polímero inertes, como polietilenoglicol de alto peso molecular (PEG), são anexadas aos anticorpos com ou sem um ligante multifuncional por meio de conjugação específica do local do PEG ao N- ou terminal C dos anticorpos ou via grupos épsilon-amino presentes nos resíduos de lisina. Será utilizada a derivatização de polímero linear ou ramificado que resulte em perda mínima de atividade biológica. O grau de conjugação pode ser monitorado de perto por SDS-PAGE e espectrometria de massa para garantir a conjugação adequada das moléculas de PEG aos anticorpos. O PEG que não reagiu pode ser separado dos conjugados de anticorpo-PEG por exclusão de tamanho ou por cromatografia de troca iônica. Os anticorpos derivados de PEG podem ser testados quanto à atividade de ligação, bem como quanto à eficácia in vivo, usando métodos bem conhecidos dos versados na técnica, por exemplo, por imunoensaios aqui descritos.
[00200] Em outra modalidade, os anticorpos são conjugados com albumina para tornar o anticorpo mais estável in vivo ou ter uma meia-vida mais longa in vivo. As técnicas são bem conhecidas na técnica, ver, por exemplo, Publicações Internacionais Nos. WO 93/15199, WO 93/15200 e WO 01/77137; e Patente Europeia No. EP
413.622, todas aqui incorporadas por referência.
5.3 ANTICORPO CONJUGADOS
[00201] Em alguns aspectos, são aqui fornecidos anticorpos, conjugados ou fundidos de forma recombinante a um agente diagnóstico, detectável ou terapêutico ou qualquer outra molécula.
Os anticorpos conjugados ou fundidos de forma recombinante podem ser úteis, por exemplo, para monitorar ou prognosticar o início, desenvolvimento, progressão e/ou gravidade de uma doença pelo vírus da Zika como parte de um procedimento de teste clínico, tal como determinar a eficácia de uma terapia particular. Em certos aspectos, os anticorpos conjugados ou fundidos de forma recombinante podem ser úteis na prevenção e/ou tratamento de uma doença ou infecção pelo vírus da Zika. Em alguns aspectos, os anticorpos conjugados ou fundidos de forma recombinante podem ser usados para detectar o vírus da Zika ou diagnosticar uma infecção pelo vírus da Zika ou doença pelo vírus da Zika. Os anticorpos aqui descritos também podem ser conjugados a uma molécula (por exemplo, polietilenoglicol) que pode afetar uma ou mais propriedades biológicas e/ou moleculares dos anticorpos, por exemplo, estabilidade (por exemplo, no soro), meia-vida, solubilidade e antigenicidade.
[00202] Em modalidades específicas, um conjugado entendeu um anticorpo aqui descrito e uma molécula (por exemplo, terapêutica ou fração de droga), em que o anticorpo está ligado diretamente à molécula ou por meio de um ou mais ligantes. Em certas modalidades, um anticorpo é conjugado covalentemente a uma molécula. Em uma modalidade particular, um anticorpo é conjugado não covalentemente a uma molécula.
[00203] Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito é conjugado a uma ou mais moléculas (por exemplo, fração terapêutica ou de droga) direta ou indiretamente por meio de uma ou mais moléculas de ligação. Em certas modalidades, um ligante inclui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 20 resíduos de aminoácidos. Em certas modalidades, um ligante consiste em 1 a 10 resíduos de aminoácidos, 1 a 15 resíduos de aminoácidos, 5 a 20 resíduos de aminoácidos, 10 a 25 resíduos de aminoácidos, 10 a 30 resíduos de aminoácidos ou 10 a 50 resíduos de aminoácidos. Em certas modalidades, um ligante é um ligante clivável por enzima ou um ligante dissulfeto. Em uma modalidade específica, o ligante clivável é clivável através de uma enzima, tal uma aminopeptidase, uma aminoesterase, uma dipeptidil carboxipeptidase ou uma protease da cascata de coagulação do sangue. Em uma modalidade específica, o ligante que pode ser conjugado ao anticorpo não interfere com a ligação do anticorpo a um polipeptídeo NS1 recombinante, vírus da Zika NS1 ou ambos, usando técnicas conhecidas na técnica ou aqui descritas. Em uma modalidade específica, a molécula que pode ser conjugada ao anticorpo não interfere com a ligação do anticorpo a um polipeptídeo NS1 recombinante, vírus da Zika NS1 ou ambos, usando técnicas conhecidas na técnica ou aqui descritas.
[00204] Em aspectos específicos, o diagnóstico e a detecção podem ser realizados, por exemplo, acoplando o anticorpo a uma(s) substância(s) detectável(is) incluindo, mas não se limitando às várias enzimas, tais como, mas não se limitando ao peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou acetilcolinesterase; grupos prostéticos, tais como, mas não limitados a, estreptavidina/biotina e avidina/biotina; materiais fluorescentes, tais como, mas não limitados a, umbeliferona, fluoresceína, isotiocinato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansilo ou ficoeritrina; materiais luminescentes, tais como, mas não se limitando a, luminol; materiais bioluminescentes, tais como, mas não se limitando a, luciferase, luciferina e aequorina; materiais radioativos, tais como, mas não limitados a, iodo 131I, 125I, 123I, and 121I,), carbono ( 14C), enxofre (35S), trítio (3H), índio (115In, 113In, 112In, and 111In,), tecnécio (99Tc), tálio (201Ti), gálio (68Ga, 67Ga), paládio (103Pd), molibdênio (99Mo), xenônio (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re,142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, e 117Sn; e metais emissores de pósitrons usando várias tomografias de emissão de pósitrons e íons metálicos paramagnéticos não radioativos.
[00205] São fornecidos anticorpos aqui descritos conjugados ou fundidos de forma recombinante a uma fração terapêutica (ou uma ou mais frações terapêuticas) e usos de tais anticorpos. O anticorpo pode ser conjugado ou fundido de forma recombinante a uma fração terapêutica, tal como uma citotoxina, por exemplo, um agente citostático ou citocida, um agente terapêutico ou um íon metálico radioativo, por exemplo, emissores alfa.
[00206] Além disso, são fornecidos neste documento os usos dos anticorpos conjugados ou fundidos de forma recombinante a uma fração terapêutica ou fração de droga que modifica uma determinada resposta biológica. Porções terapêuticas ou porções de fármaco não devem ser interpretadas como limitadas a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção de fármaco pode ser uma proteína, peptídeo ou polipeptídeo possuindo uma atividade biológica desejada. Essas proteínas podem incluir, por exemplo, β- interferon, γ-interferon, α-interferon, interleucina-2 (“IL-2”), interleucina-4 (“IL-4”), interleucina-6 (“IL-6"), Interleucina-7 ("IL-7"), interleucina 9 ("IL-9"), interleucina-10 ("IL-10"), interleucina-12 (“IL-12"), interleucina-15 ("IL-15"), interleucina-18 ("IL-18"), interleucina-23 ("IL-23"), fator estimulador de colônia de granulócitos macrófagos ("GM-CSF"), fator estimulador de colônias de granulócitos ("G-CSF”)), um fator de crescimento ou uma defensina. A porção terapêutica ou fármaco conjugada ou fundida de forma recombinante a um anticorpo deve ser escolhida para atingir os efeitos profiláticos ou terapêuticos desejados. Em certas modalidades, um conjugado de anticorpo pode ser usado para os usos profiláticos ou terapêuticos aqui descritos.
Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo modificado. Um clínico ou outro pessoal médico deve considerar o seguinte ao decidir sobre qual fração terapêutica ou fármaco para conjugar ou fundir de forma recombinante a um anticorpo: a natureza da doença, a gravidade da doença e a condição do indivíduo.
[00207] Além disso, um anticorpo aqui descrito pode ser conjugado a frações terapêuticas, como um íon de metal radioativo, como emissores alfa, como 213Bi ou quelantes macrocíclicos úteis para conjugar íons radiometais, incluindo, mas não se limitando a, 131In, 131LU, 131Y, 131Ho, 131Sm, para polipeptídeos. Em certas modalidades, o quelante macrocíclico é 1,4,7,10-tetraazaciclododecano- N,N',N',N''-ácido tetraacético (DOTA) que pode ser ligado ao anticorpo por meio de uma molécula ligante. Tais moléculas de ligação são comumente conhecidas na técnica e descritas em Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4 (10): 2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10 (4): 553-7; e Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26 (8): 943-50, cada um incorporado por referência em sua totalidade.
[00208] São aqui fornecidos anticorpos fundidos de forma recombinante ou conjugados quimicamente (incluindo conjugações covalentes e não covalentes) a uma proteína ou polipeptídeo heterólogo (ou fragmento deste, de preferência a um polipeptídeo de cerca de 10, cerca de 20, cerca de 30, cerca de 40, cerca de 50 cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90 ou cerca de 100 aminoácidos) para gerar proteínas de fusão. Em particular, são fornecidas aqui proteínas de fusão compreendendo um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo monoclonal (por exemplo, um fragmento Fab, fragmento Fd, fragmento Fv, fragmento F(ab) 2, um domínio VH, uma VH CDR, um domínio VL ou uma VL CDR) e uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo heterólogo. Em uma modalidade específica, a proteína, polipeptídeo ou peptídeo heterólogo ao qual o anticorpo é fundido é útil para direcionar o anticorpo para um tipo de célula particular.
[00209] Em uma modalidade, uma proteína de fusão fornecida neste documento inclui o anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12 e um polipeptídeo heterólogo. Em outra modalidade, uma proteína de fusão aqui fornecida inclui um fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12 e um polipeptídeo heterólogo. Em outra modalidade, uma proteína de fusão aqui fornecida inclui (i) um domínio VH tendo a sequência de aminoácidos do domínio VH do anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12 ou um domínio VL tendo a sequência de aminoácidos do domínio VL de o anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12; e (ii) um polipeptídeo heterólogo. Em outra modalidade, uma proteína de fusão aqui fornecida inclui um, dois ou mais VH CDRs com a sequência de aminoácidos das CDRs VH do anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12 e um polipeptídeo heterólogo. Em outra modalidade, uma proteína de fusão inclui uma, duas ou mais VL CDRs com a sequência de aminoácidos das VL CDRs do anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12 e um polipeptídeo heterólogo. Em certas modalidades, os anticorpos mencionados acima incluem um domínio constante de IgG (por exemplo, IgG1) modificado ou fragmento de ligação FcRn do mesmo (por exemplo, o domínio Fc ou o domínio Fc de dobradiça), aqui descrito.
[00210] Em outra modalidade, uma proteína de fusão aqui fornecida inclui pelo menos um domínio VH e pelo menos um domínio VL do anticorpo AA12 e um polipeptídeo heterólogo. Em ainda outra modalidade, uma proteína de fusão aqui fornecida inclui pelo menos uma VH CDR e pelo menos uma VL CDR do anticorpo AA12 e um polipeptídeo heterólogo. Em certas modalidades, os anticorpos mencionados acima incluem um domínio constante de IgG (por exemplo, IgG1) modificado ou seu fragmento de ligação FcRn (por exemplo, o domínio Fc ou o domínio Fc de dobradiça), aqui descrito. Em certas modalidades, os anticorpos mencionados acima incluem um domínio constante de IgG (por exemplo, IgG1) modificado ou seu fragmento de ligação FcRn (por exemplo, o domínio Fc ou o domínio Fc de dobradiça), aqui descrito.
[00211] Em outra modalidade, uma proteína de fusão aqui fornecida inclui pelo menos um domínio VH e pelo menos um domínio VL do anticorpo EB9 e um polipeptídeo heterólogo. Em ainda outra modalidade, uma proteína de fusão aqui fornecida inclui pelo menos uma VH CDR e pelo menos uma VL CDR do anticorpo EB9 e um polipeptídeo heterólogo. Em certas modalidades, os anticorpos mencionados acima incluem um domínio constante de IgG (por exemplo, IgG1) modificado ou seu fragmento de ligação FcRn (por exemplo, o domínio Fc ou o domínio Fc de dobradiça), aqui descrito.
[00212] Em outra modalidade, uma proteína de fusão aqui fornecida inclui pelo menos um domínio VH e pelo menos um domínio VL do anticorpo GB5 e um polipeptídeo heterólogo. Em ainda outra modalidade, uma proteína de fusão aqui fornecida inclui pelo menos uma VH CDR e pelo menos uma VL CDR do anticorpo GB5 e um polipeptídeo heterólogo. Em certas modalidades, os anticorpos mencionados acima incluem um domínio constante de IgG (por exemplo, IgG1) modificado ou seu fragmento de ligação FcRn (por exemplo, o domínio Fc ou o domínio Fc de dobradiça), aqui descrito.
[00213] Em outra modalidade, uma proteína de fusão aqui fornecida inclui pelo menos um domínio VH e pelo menos um domínio VL do anticorpo FC12 e um polipeptídeo heterólogo. Em ainda outra modalidade, uma proteína de fusão aqui fornecida inclui pelo menos uma VH CDR e pelo menos uma VL CDR do anticorpo FC12 e um polipeptídeo heterólogo. Em certas modalidades, os anticorpos mencionados acima incluem um domínio constante de IgG (por exemplo, IgG1) modificado ou seu fragmento de ligação FcRn (por exemplo, o domínio Fc ou o domínio Fc de dobradiça), aqui descrito.
[00214] Além disso, os anticorpos podem ser fundidos a sequências marcadoras, como um peptídeo para facilitar a purificação. Em modalidades preferidas, a sequência de aminoácidos do marcador é um peptídeo hexa-histidina (isto é, His-tag), tal como o tag fornecido em um vetor pQE (QIIDADEN, Inc.), entre outros, muitos dos quais estão comercialmente disponíveis. Conforme descrito em Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824, por exemplo, hexa-histidina proporciona purificação conveniente da proteína de fusão. Outros marcadores de peptídeo úteis para purificação incluem, mas não estão limitados ao marcador de hemaglutinina ("HA"), que corresponde a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina da gripe (Wilson et al., 1984, Cell 37: 767), e o Tag “Sinalizar”.
[00215] Métodos para fundir ou conjugar frações terapêuticas (incluindo polipeptídeos) aos anticorpos são bem conhecidos, ver, por exemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2ª Ed.), Robinson et al.
(eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Anticorpo Carriers Of Cytotoxic agents In Cancer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); “Análise, resultados e perspectiva futura do uso terapêutico de anticorpo marcado com rádio na terapia do câncer”, em Anticorpos monoclonais para detecção e terapia do câncer, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16
(Academic Press 1985), Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 119- 58; Patente US 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851, 5,723,125, 5,783,181, 5,908,626, 5,844,095 e 5,112,946; EP 307,434; EP 367.166; EP 394.827; Publicações PCT WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631 e WO 99/04813; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-10539,1991; Traunecker et al., Nature, 331: 84-86, 1988; Zheng et al., J. Immunol., 154: 5590-5600, 1995; Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 11337- 11341, 1992; que são incorporados neste documento por referência em sua totalidade.
[00216] Em particular, as proteínas de fusão podem ser geradas, por exemplo, através das técnicas de embaralhamento de genes, embaralhamento de motivos, embaralhamento de exon e/ou embaralhamento de códons (coletivamente referidos como "embaralhamento de DNA"). O embaralhamento de DNA pode ser empregado para alterar as atividades dos anticorpos monoclonais aqui descritos (ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) (por exemplo, anticorpos com afinidades mais altas e taxas de dissociação mais baixas). Ver, em geral, as Patentes US 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252 e 5,837,458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8: 724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16 (2): 76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol.
287: 265-76; e Lorenzo e Blasco, 1998, Biotechniques 24 (2): 308- 313 (cada uma dessas patentes e publicações são aqui incorporadas por referência em sua totalidade). Os anticorpos, ou os anticorpos codificados, podem ser alterados sendo submetidos a mutagênese aleatória por PCR propensa a erros, inserção aleatória de nucleotídeos ou outros métodos antes da recombinação. Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo monoclonal aqui descrito (ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) pode ser recombinado com um ou mais componentes, motivos, seções, partes, domínios, fragmentos etc. de uma ou mais moléculas heterólogas.
[00217] Um anticorpo também pode ser conjugado a um segundo anticorpo para formar um heteroconjugado de anticorpo como descrito por Segal na Patente US No. 4,676,980, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
[00218] Um anticorpo também pode ser ligado direta ou indiretamente a um ou mais anticorpos para produzir anticorpos biespecíficos/multiespecíficos.
[00219] Um anticorpo também pode ser ligado aos suportes sólidos, que são particularmente úteis para imunoensaios ou purificação de um antígeno. Esses suportes sólidos incluem, mas não estão limitados a, vidro, celulose, poliacrilamida, náilon, poliestireno, cloreto de polivinila ou polipropileno.
5.4 SEQUÊNCIAS DE ÁCIDO NUCLEICO
5.4.1 Sequências de ácido nucleico que codificam anticorpos
[00220] Em certos aspectos, são aqui fornecidos polinucleotídeos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo aqui descrito ou um fragmento do mesmo (por exemplo, um domínio VL, um domínio VH ou ambos) que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de um vírus da Zika cepa descrita na Seção 6, infra), e vetores, por exemplo, vetores compreendendo tais polinucleotídeos para expressão recombinante em células hospedeiras (por exemplo, E. coli e células de mamíferos). São aqui fornecidos polinucleotídeos que compreendem sequências de nucleotídeos que codificam qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento (ver, por exemplo, Seção 5.2), bem como vetores que compreendem tais sequências de polinucleotídeos, por exemplo, vetores de expressão para sua expressão eficiente em células hospedeiras, por exemplo, células de mamíferos.
[00221] Tal como aqui utilizado, um polinucleotídeo, sequência de ácido nucleico ou molécula de ácido nucleico "isolados" são aqueles que são separados de outras moléculas de ácido nucleico que estão presentes na fonte natural (por exemplo, em um rato ou humano) da molécula de ácido nucleico. Além disso, uma molécula de ácido nucleico "isolada", como uma molécula de cDNA ou molécula de RNA, pode ser substancialmente livre de outro material celular ou meio de cultura quando produzida por técnicas recombinantes, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizada. Por exemplo, a linguagem
"substancialmente livre” inclui preparações de polinucleotídeo, sequência de ácido nucleico ou molécula de ácido nucleico com menos de cerca de 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% (em particular menos do que cerca de 10%) de outro material, por exemplo, material celular, meio de cultura, outras moléculas de ácido nucleico, precursores químicos e/ou outros produtos químicos. Em uma modalidade específica, moléculas de ácido nucleico que codificam um anticorpo aqui descritas são isoladas ou purificadas.
[00222] Tal como aqui utilizado, os termos "polinucleotídeo(s)", "ácido nucleico" e "nucleotídeo” incluem desoxirribonucleotídeos, ácidos desoxirribonucleicos, ribonucleotídeos e ácidos ribonucleicos e suas formas poliméricas e incluem formas de fita simples ou dupla. Em certas modalidades, os termos "polinucleotídeo(s)", "ácido nucleico" e "nucleotídeo” incluem análogos conhecidos de nucleotídeos naturais, por exemplo, ácidos nucleicos de peptídeo ("PNA’s"), que têm propriedades de ligação semelhantes às do ácido nucleico de referência. Em algumas modalidades, os termos “polinucleotídeo(s)”, “ácido nucleico” e “nucleotídeo” se referem aos ácidos desoxirribonucleicos (por exemplo, cDNA ou DNA). Em outras modalidades, os termos "polinucleotídeo(s)", "ácido nucleico" e "nucleotídeo" se referem aos ácidos ribonucleicos (por exemplo, mRNA ou RNA).
[00223] Em aspectos particulares, são aqui fornecidos polinucleotídeos compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo (por exemplo, um anticorpo murino, quimérico ou humanizado, ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo), que se liga a um NS1 do vírus da Zika (por exemplo, NS1 de um Zika cepa de vírus descrita na Seção 6, infra) e incluindo uma sequência de aminoácidos conforme descrito neste documento, bem como anticorpos que competem com tais anticorpos pela ligação a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra) (por exemplo, de uma maneira dependente da dose), ou que se liga ao mesmo epítopo de tais anticorpos. Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico aqui descrita codifica um anticorpo que inclui um domínio VL e um domínio VH do anticorpo AA12, EB9, GB5. ou FC12.
[00224] Em certa modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo que inclui um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 e/ou um domínio VH compreendendo o ID NO: 9. Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica tal domínio VL (por exemplo, um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10). Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica tal domínio VH (por exemplo, um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica para um anticorpo que se liga ao vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika expresso na Seção 6, infra), no anticorpo 1, 2 ou 3 VH CDRs e/ou 1, 2 ou 3 VL CDRs do anticorpo AA12.
[00225] Em certa modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo que inclui um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 e/ou um domínio VH compreendendo o ID NO: 11. Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica tal domínio VL (por exemplo, um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12). Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica tal domínio VH (por exemplo, um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica para um anticorpo que se liga ao vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika expresso na Seção 6, infra), em que o anticorpo 1, 2 ou 3 VH CDRs e/ou 1, 2 ou 3 VL CDRs do anticorpo EB9.
[00226] Em certa modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo que inclui um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 e/ou um domínio VH compreendendo o ID NO: 13. Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica tal domínio VL (por exemplo, um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14). Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica tal domínio VH (por exemplo, um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica para um anticorpo que se liga ao vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika imediato na Seção 6, infra), em que o anticorpo 1, 2 ou 3 VH CDRs e/ou 1, 2 ou 3 VL CDRs do anticorpo GB5.
[00227] Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo que inclui um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 e/ou um domínio VH compreendendo o aminoácido de SEQ ID NO: 15. Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica tal domínio VL (por exemplo, um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16). Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica tal domínio VH (por exemplo, um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15). Em algumas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica para um anticorpo que se liga ao vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa do vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), em que o anticorpo incluiu 1, 2 ou 3 VH CDRs e/ou 1, 2 ou 3 VL CDRs do anticorpo FC12.
[00228] Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), compreendendo VL CDRs e/ou VH CDRs de anticorpo AA12. Por exemplo, em uma modalidade específica, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo que inclui um domínio VL que compreende CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 20-22, respectivamente, e/ou um domínio VH compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 17-19, respectivamente. Em outra modalidade específica, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo que inclui um domínio VL compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 34-36, respectivamente, e/ou uma VH domínio compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 31-33, respectivamente. Em certos aspectos, são aqui fornecidos polinucleotídeos que compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia leve ou a cadeia pesada de um anticorpo aqui descrito. Os polinucleotídeos podem compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia leve ou um domínio VL, compreendendo as VL FRs e CDRs de um anticorpo aqui descrito. Os polinucleotídeos podem compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada, ou um domínio VH, compreendendo as VH FRs e CDRs de anticorpos aqui descritos. Em modalidades específicas, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Em modalidades específicas, um polinucleotídeo aqui descrito codifica um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9.
[00229] Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), compreendendo VL CDRs e/ou VH CDRs de anticorpo EB9. Por exemplo, em uma modalidade específica, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo que inclui um domínio VL compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 48-50, respectivamente, e/ou um domínio VH compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 45-47, respectivamente. Em outra modalidade específica, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo que inclui um domínio VL compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 62-64, respectivamente, e/ou uma VH domínio compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 59-61, respectivamente. Em certos aspectos, são aqui fornecidos polinucleotídeos que compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia leve ou a cadeia pesada de um anticorpo aqui descrito. Os polinucleotídeos podem compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia leve ou um domínio VL, compreendendo as VL FRs e CDRs de um anticorpo aqui descrito. Os polinucleotídeos podem compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada, ou um domínio VH, compreendendo as VH FRs e CDRs de anticorpos aqui descritos. Em modalidades específicas, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12. Em modalidades específicas, um polinucleotídeo aqui descrito codifica um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11.
[00230] Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), compreendendo VL CDRs e/ou VH CDRs de anticorpo GB5. Por exemplo, em uma modalidade específica, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo que inclui um domínio VL compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 76-78, respectivamente, e/ou um domínio VH compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 73-75, respectivamente. Em outra modalidade específica, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo que inclui um domínio VL compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 90-92, respectivamente, e/ou uma VH domínio compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 87-89, respectivamente.
Em certos aspectos, são aqui fornecidos polinucleotídeos que compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia leve ou a cadeia pesada de um anticorpo aqui descrito. Os polinucleotídeos podem compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia leve ou um domínio VL, compreendendo as VL FRs e CDRs de um anticorpo aqui descrito. Os polinucleotídeos podem compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada, ou um domínio VH, compreendendo as VH FRs e CDRs de anticorpos aqui descritos. Em modalidades específicas, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14. Em modalidades específicas, um polinucleotídeo aqui descrito codifica um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13.
[00231] Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo, que se liga a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, NS1 de uma cepa de vírus da Zika descrita na Seção 6, infra), compreendendo VL CDRs e/ou VH CDRs de anticorpo FC12. Por exemplo, em uma modalidade específica, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo que inclui um domínio VL compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 104-106, respectivamente, e/ou um domínio VH compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 101-103, respectivamente. Em outra modalidade específica, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo que inclui um domínio VL compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 118-120, respectivamente, e/ou uma VH domínio compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 115-117, respectivamente. Em certos aspectos, são aqui fornecidos polinucleotídeos que compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia leve ou a cadeia pesada de um anticorpo aqui descrito. Os polinucleotídeos podem compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia leve ou um domínio VL,
compreendendo as VL FRs e CDRs de um anticorpo aqui descrito. Os polinucleotídeos podem compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada, ou um domínio VH, compreendendo as VH FRs e CDRs de anticorpos aqui descritos. Em modalidades específicas, um polinucleotídeo aqui descrito inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16. Em modalidades específicas, um polinucleotídeo aqui descrito codifica um domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15.
[00232] Em certas modalidades, é aqui fornecido um polinucleotídeo que codifica um domínio VL, em que o polinucleotídeo inclui a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:
2. Em certas modalidades, é aqui fornecido um polinucleotídeo que codifica um domínio VH, em que o polinucleotídeo incluiu o ácido nucleico sequência da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, é aqui fornecido um polinucleotídeo que codifica um anticorpo aqui descrito, em que o polinucleotídeo inclui a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2 que codifica um domínio VL e a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 codificando um domínio VH.
[00233] Em certas modalidades, é aqui fornecido um polinucleotídeo que codifica um domínio VL, em que o polinucleotídeo inclui a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:
4. Em certas modalidades, é aqui fornecido um polinucleotídeo que codifica um domínio VH, em que o polinucleotídeo incluiu o ácido nucleico sequência de SEQ ID NO: 3. Em certas modalidades, é aqui fornecido um polinucleotídeo que codifica um anticorpo aqui descrito, em que o polinucleotídeo inclui a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 que codifica um domínio VL e a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 codificando um domínio VH.
[00234] Em certas modalidades, fornecido aqui é um polinucleotídeo que codifica um domínio VL, em que o polinucleotídeo inclui a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:
6. Em certas modalidades, fornecido aqui é um polinucleotídeo que codifica um domínio VH, em que o polinucleotídeo incluiu o ácido nucleico sequência da SEQ ID NO: 5. Em certas modalidades, é aqui fornecido um polinucleotídeo que codifica um anticorpo aqui descrito, em que o polinucleotídeo inclui a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6 que codifica um domínio VL e a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5 codificando um domínio VH.
[00235] Em certas modalidades, é aqui fornecido um polinucleotídeo que codifica um domínio VL, em que o polinucleotídeo inclui a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:
8. Em certas modalidades, é aqui fornecido um polinucleotídeo que codifica um domínio VH, em que o polinucleotídeo incluiu o ácido nucleico sequência da SEQ ID NO: 7. Em certas modalidades, é aqui fornecido um polinucleotídeo que codifica um anticorpo aqui descrito, em que o polinucleotídeo inclui a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 8 que codifica um domínio VL e a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7 codificando um domínio VH.
[00236] Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito codifica um domínio VL, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97% ou 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8. Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito codifica um domínio VH, em que o polinucleotídeo inclui uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 3 , 5 ou
7.
[00237] Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito inclui sequências de ácido nucleico que codificam um domínio VL e um domínio VH, em que a sequência de ácido nucleico que codifica o domínio VL é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2 e a sequência de ácido nucleico que codifica o domínio VH é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1.
[00238] Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito inclui sequências de ácido nucleico que codificam um domínio VL e um domínio VH, em que a sequência de ácido nucleico que codifica o domínio VL é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,
96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 e a sequência de ácido nucleico que codifica o domínio VH é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3.
[00239] Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito inclui sequências de ácido nucleico que codificam um domínio VL e um domínio VH, em que a sequência de ácido nucleico que codifica o domínio VL é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6 e a sequência de ácido nucleico que codifica o domínio VH é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5.
[00240] Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito inclui sequências de ácido nucleico que codificam um domínio VL e um domínio VH, em que a sequência de ácido nucleico que codifica o domínio VL é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 8 e a sequência de ácido nucleico que codifica o domínio VH é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7.
[00241] Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito codifica uma cadeia leve, em que o polinucleotídeo inclui a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8. Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito codifica uma cadeia pesada, em que o polinucleotídeo compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7.
[00242] Em certas modalidades, os polinucleotídeos aqui descritos codificam uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que os polinucleotídeos incluem a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2 e a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, os polinucleotídeos aqui descritos codificam uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que os polinucleotídeos incluem a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 e a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3. Em particular modalidades, os polinucleotídeos aqui descritos codificam uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que os polinucleotídeos incluem a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6 e a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5. Em certas modalidades, os polinucleotídeos aqui descritos codificam uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que os polinucleotídeos incluem a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 8 e a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7.
[00243] Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito inclui sequências de ácido nucleico que codificam uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que a sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia leve inclui uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2 e/ou a sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada inclui uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%,
92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito inclui sequências de ácido nucleico que codificam uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que a sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia leve inclui uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,
95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ
ID NO: 4 e/ou a sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada com tomada uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos
80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3. Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito inclui sequências de ácido nucleico que codificam uma cadeia leve e uma cadeia pesada,
em que a sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia leve inclui uma sequência de nucleotídeo que é pelo menos 80%, 85%, 90
%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6 e/ou a sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada incluída uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%
ou 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5. Em certas modalidades, um polinucleotídeo aqui descrito inclui sequências de ácido nucleico que codificam uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que a sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia leve inclui uma sequência de nucleotídeo que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 8 e/ou a sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada inclui um sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7
[00244] Em aspectos específicos, é aqui fornecido um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo fornecido neste documento (por exemplo, anticorpo murino, quimérico, humano ou humanizado) que bloqueia competitivamente (por exemplo, de uma maneira dependente da dose), os anticorpos AA12, EB9, GB5, ou FC12 de ligação a um vírus da Zika NS1, conforme determinado usando ensaios conhecidos por uma pessoa versada na técnica ou descritos neste documento (por exemplo, ensaios competitivos de ELISA).
[00245] Em uma modalidade específica, um polinucleotídeo fornecido neste documento inclui uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve capa (por exemplo, cadeia leve capa humana). Em outra modalidade específica, um polinucleotídeo fornecido neste documento inclui uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve lambda (por exemplo, cadeia leve lambda humana).
[00246] Em uma modalidade específica, um polinucleotídeo fornecido neste documento inclui uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia pesada de IgG1 (por exemplo, cadeia pesada de IgG1 humana) de um anticorpo aqui descrito. Em outra modalidade específica, um polinucleotídeo fornecido neste documento inclui uma sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia pesada de IgG4 (por exemplo, cadeia pesada de IgG4 humana). Em outra modalidade específica, um polinucleotídeo fornecido neste documento inclui uma sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia pesada de IgG2 (por exemplo, cadeia pesada de IgG2 humana).
[00247] Em uma modalidade específica, um polinucleotídeo fornecido neste documento codifica um domínio de ligação ao antígeno, por exemplo, um Fab ou F (ab’)2.
[00248] Em outra modalidade particular, um polinucleotídeo fornecido neste documento inclui uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1, em que o anticorpo inclui uma cadeia leve e uma cadeia pesada e em que (i) a cadeia leve inclui um domínio VL compreendendo uma VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das VL CDRs do anticorpo AA12; (ii) a cadeia pesada compreendia um domínio VH compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das CDRs VH do anticorpo AA12; (iii) a cadeia leve compreendendo ainda um domínio de cadeia leve constante compreendendo a sequência de aminoácidos do domínio constante de uma cadeia leve kappa humana; e (iv) a cadeia pesada compreendendo ainda um domínio constante da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos do domínio constante de uma cadeia pesada de IgG1 humana ou cadeia pesada de IgG2a humana.
[00249] Em outra modalidade particular, um polinucleotídeo fornecido neste documento inclui uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1, em que o anticorpo inclui uma cadeia leve e uma cadeia pesada, e em que (i) a cadeia leve inclui um domínio VL compreendendo uma VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 tendo as sequências de aminoácidos dos VL CDRs do anticorpo EB9; (ii) a cadeia pesada inclui um domínio VH compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das CDRs VH do anticorpo EB9; (iii) a cadeia leve compreendendo ainda um domínio de cadeia leve constante compreendendo a sequência de aminoácidos do domínio constante de uma cadeia leve kappa humana; e (iv) a cadeia pesada compreendendo ainda um domínio constante da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos do domínio constante de uma cadeia pesada de IgG1 humana ou cadeia pesada de IgG2a humana.
[00250] Em outra modalidade particular, um polinucleotídeo fornecido neste documento inclui uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1, em que o anticorpo inclui uma cadeia leve e uma cadeia pesada, e em que (i) a cadeia leve inclui um domínio VL compreendendo uma VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 tendo as sequências de aminoácidos dos VL CDRs do anticorpo GB5; (ii) a cadeia pesada inclui um domínio VH compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das CDRs VH do anticorpo GB5; (iii) a cadeia leve compreendendo ainda um domínio de cadeia leve constante compreendendo a sequência de aminoácidos do domínio constante de uma cadeia leve kappa humana; e (iv) a cadeia pesada compreendendo ainda um domínio constante da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos do domínio constante de uma cadeia pesada de IgG1 humana ou cadeia pesada de IgG2a humana.
[00251] Em outra modalidade particular, um polinucleotídeo fornecido neste documento inclui uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1, em que o anticorpo inclui uma cadeia leve e uma cadeia pesada e em que (i) a cadeia leve inclui um domínio VL compreendendo uma VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 tendo as sequências de aminoácidos dos VL CDRs do anticorpo FC12; (ii) a cadeia pesada inclui um domínio VH compreendendo uma VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 tendo as sequências de aminoácidos das CDRs VH do anticorpo FC12; (iii) a cadeia leve compreendendo ainda um domínio de cadeia leve constante compreendendo a sequência de aminoácidos do domínio constante de uma cadeia leve kappa humana; e (iv) a cadeia pesada compreendendo ainda um domínio constante da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos do domínio constante de uma cadeia pesada de IgG1 humana ou cadeia pesada de IgG2a humana.
[00252] Em certas modalidades, no que diz respeito a um polinucleotídeo fornecido neste documento compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um domínio VL e um domínio VH de qualquer um dos anticorpos descritos neste documento, o polinucleotídeo do domínio VL compreende ainda regiões estruturais de primatas (por exemplo, humanos); e o domínio VH compreende ainda regiões estruturais de primatas (por exemplo, humanos).
[00253] Em uma modalidade específica, são aqui fornecidos polinucleotídeos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo, ou um fragmento ou domínio do mesmo (por exemplo, domínio VL ou domínio VH), designado aqui como anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12.
[00254] Também são fornecidos polinucleotídeos que hibridizam sob condições de hibridização de alto rigor, rigor intermediário ou baixo para polinucleotídeos antisense de polinucleotídeos que codificam um anticorpo aqui descrito ou um fragmento do mesmo (por exemplo, domínio VL ou domínio VH). Em modalidades específicas, um polinucleotídeo aqui descrito hibridiza em condições de alta restringência ou de hibridização de restringência intermediária com um polinucleotídeo antisense de um polinucleotídeo que codifica um domínio VL, por exemplo, SEQ ID NO: 2 e/ou domínio VH, por exemplo, SEQ ID NO: 1, fornecido aqui. Em modalidades específicas, um polinucleotídeo aqui descrito hibridiza em condições de alta restringência ou de hibridização de restringência intermediária com um polinucleotídeo antisense de um polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 1 ou 2.
[00255] Em modalidades específicas, um polinucleotídeo aqui descrito hibridiza sob condições de alto rigor, ou condições de hibridização de rigor intermediário com um polinucleotídeo antisense de um polinucleotídeo que codifica um domínio VL, por exemplo, SEQ ID NO: 4 e/ou domínio VH, por exemplo, SEQ ID NO: 3, fornecido aqui. Em modalidades específicas, um polinucleotídeo aqui descrito hibridiza em condições de alta severidade, ou condições de hibridização de severidade intermediária com um polinucleotídeo antisense de um polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 3 ou 4.
[00256] Em modalidades específicas, um polinucleotídeo aqui descrito hibridiza sob condições de alto rigor, ou condições de hibridização de estringência intermediária para um polinucleotídeo antisense de um polinucleotídeo que codifica um domínio VL, por exemplo, SEQ ID NO: 6 e/ou domínio VH, por exemplo, SEQ ID NO: 5, fornecido aqui. Em modalidades específicas, um polinucleotídeo aqui descrito hibridiza em condições de alta restringência ou de hibridização de restringência intermediária com um polinucleotídeo antisense de um polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 5 ou 6.
[00257] Em modalidades específicas, um polinucleotídeo aqui descrito hibridiza sob condições de alto rigor, ou condições de hibridização de estringência intermediária para um polinucleotídeo antisense de um polinucleotídeo que codifica um domínio VL, por exemplo, SEQ ID NO: 8, e/ou domínio VH, por exemplo, SEQ ID NO: 7, fornecido aqui. Em modalidades específicas, um polinucleotídeo aqui descrito hibridiza sob condições de alta restringência ou de hibridização de restringência intermediária com um polinucleotídeo antisense de um polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 7 ou 8.
[00258] As condições de hibridação foram descritas na técnica e são conhecidas por aqueles versados na técnica. Por exemplo, a hibridização sob condições rigorosas pode envolver a hibridização para DNA ligado ao filtro em 6x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C seguido por uma ou mais lavagens em 0,2 x SSC/0,1% SDS a cerca de 50 a 65°C; a hibridização sob condições altamente rigorosas pode envolver a hibridização com ácido nucleico ligado ao filtro em 6xSSC a cerca de 45°C seguida por uma ou mais lavagens em 0,1xSSC/0,2% SDS a cerca de 68°C. A hibridização sob outras condições de hibridização rigorosas é conhecida por aqueles versados na técnica e foram descritos, ver, por exemplo, Ausubel, FM et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., New York nas páginas 6.3.1-6.3.6 e 2.10.3.
[00259] Também são aqui fornecidos polinucleotídeos que codificam um anticorpo ou um fragmento do mesmo (por exemplo, um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) que são otimizados, por exemplo, por otimização de códon/RNA, substituição com sequências de sinal heterólogas e eliminação de elementos de instabilidade de mRNA. Métodos para gerar ácidos nucleicos otimizados que codificam um anticorpo ou um fragmento do mesmo (por exemplo, cadeia leve, cadeia pesada, domínio VH ou domínio VL) para a expressão recombinante através da introdução de alterações de códons e/ou eliminação de regiões inibidoras no mRNA podem ser realizados por adaptar os métodos de otimização descritos, por exemplo, nas patentes US 5,965,726; 6,174,666; 6,291,664; 6,414,132; e 6,794,498, em conformidade. Por exemplo, locais de junção potenciais e elementos de instabilidade (por exemplo, elementos ricos em A/T ou A/U) dentro do RNA podem ser mutados sem alterar os aminoácidos codificados pelas sequências de ácido nucleico para aumentar a estabilidade do RNA para a expressão recombinante. As alterações utilizam a degenerescência do código genético, por exemplo, usando um códon alternativo para um aminoácido idêntico.
Em algumas modalidades, pode ser desejável alterar um ou mais códons para codificar uma mutação conservadora, por exemplo, um aminoácido semelhante com estrutura química e propriedades semelhantes e/ou função como o aminoácido original. Tais métodos podem aumentar a expressão de um anticorpo ou fragmento do mesmo em pelo menos 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes ou 100 vezes ou mais em relação à expressão de um anticorpo codificado por polinucleotídeos que não foram otimizados.
[00260] Em certas modalidades, uma sequência de polinucleotídeo otimizada que codifica um anticorpo aqui descrito ou um fragmento do mesmo (por exemplo, região VL e/ou região VH) pode hibridizar com um polinucleotídeo antisense de um polinucleotídeo não otimizado que codifica um anticorpo aqui descrito ou um fragmento deste (por exemplo, região VL e/ou região VH). Em modalidades específicas, uma sequência de nucleotídeos otimizada que codifica um anticorpo aqui descrito ou um fragmento do mesmo (por exemplo, região VL e/ou região VH) hibridiza sob condições de alto rigor com um polinucleotídeo antisense de um polinucleotídeo não otimizado que codifica um anticorpo aqui descrito ou um fragmento do mesmo (por exemplo, região VL e/ou região VH). Em uma modalidade específica, uma sequência de nucleotídeos otimizada que codifica um anticorpo aqui descrito ou um fragmento do mesmo (por exemplo, região VL e/ou região VH) hibridiza sob condições de hibridização de rigor intermediário ou inferior para um polinucleotídeo antisense de um polinucleotídeo não otimizado que codifica um anticorpo aqui descrito ou um fragmento deste (por exemplo, região VL e/ou região VH). As informações sobre as condições de hibridização foram descritas, ver, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente US 2005/0048549 (por exemplo, parágrafos 72-73), que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[00261] Os polinucleotídeos podem ser obtidos e a sequência de nucleotídeos dos polinucleotídeos determinada, por qualquer método conhecido na técnica. As sequências de nucleotídeos que codificam os anticorpos descritos neste documento e as formas modificadas desses anticorpos podem ser determinadas usando métodos bem conhecidos na técnica, isto é, os códons de nucleotídeos conhecidos por codificarem aminoácidos específicos são montados de modo a gerar um ácido nucleico que codifica o anticorpo. Tal polinucleotídeo que codifica o anticorpo pode ser montado a partir de oligonucleotídeos sintetizados quimicamente (por exemplo, como descrito em Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17: 242), que, resumidamente, envolve a síntese de oligonucleotídeos sobrepostos contendo porções da sequência que codifica o anticorpo, emparelhamento e ligação desses oligonucleotídeos e, em seguida, amplificação dos oligonucleotídeos ligados por PCR.
[00262] Alternativamente, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo aqui descrito pode ser gerado a partir de ácido nucleico de uma fonte adequada (por exemplo, um hibridoma) usando métodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, PCR e outros métodos de clonagem molecular). Por exemplo, a amplificação por PCR usando iniciadores sintéticos hibridizáveis para as extremidades 3' e 5'
de uma sequência conhecida pode ser realizada usando DNA genômico obtido a partir de células de hibridoma que produzem o anticorpo de interesse. Tais métodos de amplificação por PCR podem ser usados para obter ácidos nucleicos compreendendo a sequência que codifica a cadeia leve e/ou cadeia pesada de um anticorpo. Tais métodos de amplificação por PCR podem ser usados para obter ácidos nucleicos que compreendem a sequência que codifica o domínio leve variável e/ou o domínio pesado variável de um anticorpo. Os ácidos nucleicos amplificados podem ser clonados em vetores para expressão em células hospedeiras e para clonagem adicional, por exemplo, para gerar anticorpos quiméricos e humanizados.
[00263] Se um clone contendo um ácido nucleico que codifica um determinado anticorpo não está disponível, mas a sequência da molécula de anticorpo é conhecida, um ácido nucleico que codifica a imunoglobulina pode ser quimicamente sintetizado ou obtido de uma fonte adequada (por exemplo, uma biblioteca de cDNA de anticorpo ou um Biblioteca de cDNA gerada a partir de, ou ácido nucleico, de preferência poli A + RNA, isolado de, qualquer tecido ou células que expressam o anticorpo, tais como células de hibridoma selecionadas para expressar um anticorpo aqui descrito) por amplificação por PCR usando iniciadores sintéticos hibridizáveis com extremidades 3' e 5' da sequência ou por clonagem usando uma sonda oligonucleotídica específica para a sequência do gene particular para identificar, por exemplo, um clone de cDNA de uma biblioteca de cDNA que codifica o anticorpo. Os ácidos nucleicos amplificados gerados por PCR podem então ser clonados em vetores de clonagem replicáveis usando qualquer método bem conhecido na técnica.
[00264] O DNA que codifica um anticorpo pode ser facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo). As células de hibridoma podem servir como uma fonte desse DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras, como células de E. coli, células COS de símio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que não produzem proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos nas células hospedeiras recombinantes.
[00265] Em métodos de exibição de fago, domínios de anticorpo funcionais são exibidos na superfície de partículas de fago que carregam as sequências de polinucleotídeo que as codificam. Em particular, uma biblioteca de sequências de DNA que codificam os domínios VH e VL são geradas (por exemplo, amplificadas a partir de bibliotecas de cDNA de animais, tais como bibliotecas de cDNA humano ou bibliotecas aleatórias são geradas por síntese química).
O DNA que codifica os domínios VH e VL é recombinado juntamente com um ligante scFv por PCR e clonado em um vetor fagemídeo. O vetor é eletroporado em E. coli e a E. coli é infectada com fago auxiliar. O fago que expressa um domínio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno particular pode ser selecionado ou identificado com o antígeno, por exemplo, usando antígeno marcado ou ligado ao antígeno ou capturado em uma superfície sólida ou grânulo. Após a seleção do fago, as regiões codificadoras de anticorpos do fago podem ser isoladas e usadas para gerar anticorpos inteiros, incluindo anticorpos humanos ou qualquer outro fragmento de ligação ao antígeno desejado, e expressos em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamíferos, células de insetos, células vegetais, leveduras e bactérias, por exemplo, conforme descrito abaixo. Técnicas para produzir de forma recombinante fragmentos de anticorpo, como os fragmentos Fab, Fab’e F(ab')2, também podem ser empregadas usando métodos conhecidos na técnica, como os divulgados na publicação PCT Nº WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12 (6): 864-869; Sawai et al., 1995, AJRI 34: 26-34; e Better et al., 1988, Science 240: 1041-1043.
[00266] Os anticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagos de anticorpos geradas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) descreve o isolamento de anticorpos murinos e humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fago. O embaralhamento da cadeia pode ser usado na produção de anticorpos humanos de alta afinidade (gama nM) (Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)), bem como infecção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para construir bibliotecas de fagos muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)).
[00267] Para gerar anticorpos inteiros, iniciadores de PCR incluindo sequências de nucleotídeos VH ou VL, um local de restrição e uma sequência de flanqueamento para proteger o local de restrição podem ser usados para amplificar as sequências de VH ou VL em clones de scFv. Utilizando técnicas de clonagem conhecidas pelos versados na técnica, os domínios VH amplificados por PCR podem ser clonados em vetores que expressam uma região constante de cadeia pesada, por exemplo, a região constante gama 4 humana e os domínios VL amplificados por PCR podem ser clonados em vetores que expressam uma região constante de cadeia leve, por exemplo, regiões constantes kappa ou lambda humanas. Em certas modalidades, os vetores para expressar os domínios VH ou VL incluem um promotor, um sinal de secreção, um local de clonagem para o domínio variável, domínios constantes e um marcador de seleção, como neomicina. Os domínios VH e VL também podem ser clonados em um vetor que expressa as regiões constantes necessárias. Os vetores de conversão de cadeia pesada e vetores de conversão de cadeia leve são então cotransfectados em linhas celulares para gerar linhas celulares estáveis ou transitórias que expressam anticorpos de comprimento total, por exemplo, IgG, usando técnicas conhecidas pelos versados na técnica.
[00268] Em uma modalidade específica, são aqui fornecidos dois vetores (por exemplo, plasmídeos ou vírus), em que um vetor incluía o domínio VH de um anticorpo aqui descrito e o segundo vetor incluía o domínio VL de um anticorpo aqui descrito.
[00269] Em um exemplo não limitativo, a plataforma de tecnologia Dyax (Cambridge, MA) pode ser usada para converter Fab-fago ou Fabs em anticorpos IgG completos, tais como os vetores de reformatação rápida Dyax pR (RR). Resumidamente, por PCR, um fragmento de DNA que codifica Fab é inserido em um Dyax pR-RRV entre uma sequência líder eucariótica e um cDNA da região constante da cadeia pesada de IgG. A expressão do anticorpo é conduzida pelo citomegalovírus humano (hCMV). Em uma segunda etapa de clonagem, os elementos reguladores bacterianos são substituídos pelas sequências eucarióticas apropriadas (isto é, o motivo IRES (local de entrada do ribossomo interno)). O vetor de expressão também pode incluir a origem de replicação do SV40. O Dyax pRh1 (a, z), pRh1 (f), pRh4 e pRm2a são vetores de expressão que permitem a expressão de FAbs reformatados como IgG1 humana (isotipo a, z), IgG1 humana (isotipo F), IgG4 humana e IgG2a de rato, respectivamente. Os vetores de expressão podem ser introduzidos em uma célula hospedeira adequada (por exemplo, células HEK293T, células CHO)) para expressão e purificação.
[00270] O DNA também pode ser modificado, por exemplo, substituindo a sequência de codificação para domínios constantes de cadeia pesada e leve humana no lugar de, por exemplo, sequências de murino, ou por união covalente à sequência de codificação de imunoglobulina de toda ou parte da sequência de codificação por um não -polipeptídeo de imunoglobulina.
[00271] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos que codificam um anticorpo fornecidos aqui são isolados. Em outras modalidades, os polinucleotídeos que codificam um anticorpo fornecidos aqui não são isolados. Em ainda outras modalidades, os polinucleotídeos que codificam um anticorpo fornecido aqui é integrado, por exemplo, em DNA cromossômico ou um vetor de expressão. Em modalidades específicas, os polinucleotídeos que codificam um anticorpo fornecido aqui não está integrado no DNA cromossômico.
5.4.2 Sequências de ácido nucleico que codificam polipeptídeos NS1
[00272] São aqui fornecidos polinucleotídeos que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo NS1 aqui descrito. Devido à degenerescência do código genético, qualquer sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo NS1 aqui descrito é aqui englobada. Em uma modalidade específica, os polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo NS1 aqui descrito é uma sequência de RNA (por exemplo, mRNA) ou uma sequência de cDNA.
[00273] Também são fornecidos neste documento polinucleotídeos capazes de hibridizar com um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo NS1. Em certas modalidades, são aqui fornecidos polinucleotídeos capazes de hibridizar com um fragmento de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo NS1 aqui descrito. Em outras modalidades, são aqui fornecidos polinucleotídeos capazes de hibridizar com o comprimento total de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo NS1 aqui descrito. Os parâmetros gerais para as condições de hibridação para ácidos nucleicos são descritos em Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2ª Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1989) e em Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, Current Protocols Publishing, New York (1994). A hibridização pode ser realizada em condições de alto rigor, médio rigor ou baixo rigor. Os versados na técnica entenderão que as condições de baixo, médio e alto rigor dependem de vários fatores, todos os quais interagem e também são dependentes dos ácidos nucleicos em questão. Por exemplo, condições de alto rigor podem incluir temperaturas dentro de 5°C de temperatura de fusão dos ácidos nucleicos, uma baixa concentração de sal (por exemplo, menos de 250 mM) e uma alta concentração de cossolventes (por exemplo, 1-20% de cossolvente, por exemplo, DMSO). As condições de baixo rigor, por outro lado, podem incluir temperaturas superiores a 10°C abaixo da temperatura de fusão dos ácidos nucleicos, uma alta concentração de sal (por exemplo, superior a 1000 mM) e a ausência de co-solventes.
[00274] Qualquer técnica de otimização de códon conhecida por uma pessoa versada na técnica pode ser usada para otimizar o códon ou a sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de interesse (por exemplo, um polipeptídeo NS1 aqui descrito). Em uma modalidade específica, uma sequência polinucleotídica que codifica um polipeptídeo NS1 é otimizada por códons ou a sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento do polipeptídeo NS1 compreendendo (ou consistindo na) a região de codificação NS1 do vírus da Zika é otimizada por códons. Como um método exemplar para otimização de códons, cada códon no quadro aberto da sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo NS1 ou uma região de codificação NS1 do mesmo é substituído pelo códon mais frequentemente usado em proteínas de mamíferos (por exemplo, humanos). Os métodos de otimização de códons são conhecidos na técnica, por exemplo, o protocolo OptimumGene™ (GenScript®) e o protocolo Genewiz®, que são incorporados aqui por referência em sua totalidade. Ver também a Patente US No. 8,326,547 para métodos para otimização de códons, que é incorporada neste documento por referência em sua totalidade. Em uma modalidade específica, a sequência de ácido nucleico é otimizada para códons humanos. A otimização de códons pode ser feita usando um programa baseado na web (www.encorbio.com/protocols/Codon.htm) que usa o Codon Usage Database, mantido pelo Department of Plant Gene Research em Kazusa, Japão.
[00275] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo NS1 aqui descrito é isolado.
5.5 PRODUÇÃO DE ANTICORPOS
[00276] Em um aspecto, são aqui fornecidos métodos para fazer um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1. Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito (por exemplo, um fragmento de ligação ao antígeno), que se liga a um vírus da Zika NS1, pode ser preparado, expresso, criado ou isolado por qualquer meio que envolve a criação, por exemplo, via síntese ou engenharia genética de sequências. Em modalidades específicas, tal anticorpo compreende sequências que são codificadas por sequências de DNA que não existem naturalmente dentro do repertório da linha germinativa do anticorpo de um animal ou mamífero (por exemplo, um humano).
[00277] Em certos aspectos, um método para produzir um anticorpo aqui descrito, que se liga a um vírus da Zika NS1, incluindo a etapa de cultura de uma célula (por exemplo, célula hospedeira ou célula de hibridoma) que expressa o anticorpo. Em certas modalidades, o método para preparar um anticorpo aqui descrito inclui ainda a etapa de purificação do anticorpo expresso pela célula. Em certos aspectos, um método para fazer um anticorpo aqui descrito (por exemplo, um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo), que se liga a um vírus da Zika NS1, incluiu a etapa de cultura de uma célula (por exemplo, célula hospedeira ou célula de hibridoma) que incluiu polinucleotídeos ou vetores que codificam o anticorpo. Em um aspecto particular, são aqui fornecidos métodos para a produção de um anticorpo aqui descrito (por exemplo, um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo), compreendendo a expressão de tal anticorpo a partir de uma célula hospedeira. Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um método para a produção de um anticorpo que compreende a cultura de células hospedeiras que expressam um anticorpo aqui descrito e o isolamento do anticorpo das células.
[00278] Em certos aspectos, são aqui fornecidos células (por exemplo, células hospedeiras) que expressam (por exemplo, expressando de forma recombinante) os anticorpos aqui descritos (por exemplo, um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) e vetores de expressão relacionados. Em outro aspecto, são aqui fornecidos vetores (por exemplo, vetores de expressão) compreendendo polinucleotídeos que inclui sequências de nucleotídeos que codificam anticorpos (por exemplo, um fragmento de ligação ao antígeno) para a expressão recombinante em células hospedeiras, de preferência em células de mamíferos. Também são fornecidas aqui células hospedeiras que compreendem um polinucleotídeo que codifica um anticorpo, ou vetores que compreendem um polinucleotídeo que codifica um anticorpo para expressar de forma recombinante um anticorpo aqui descrito (por exemplo, anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12, ou outro anticorpo descrito na Seção 5.2, supra). Em uma modalidade específica, é fornecida aqui uma célula hospedeira compreendendo dois vetores, em que o primeiro vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifica um domínio VH ou cadeia pesada de um anticorpo aqui descrito (por exemplo, anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12, ou outro anticorpo descrito na Seção 5.2, supra) e o segundo vetor inclui um polinucleotídeo que codifica um domínio VL ou cadeia leve do anticorpo. Exemplos de células que podem ser usadas incluem aquelas descritas nesta seção e na Seção 6, infra. As células podem ser células primárias ou linhas celulares. Em um aspecto particular, são fornecidas aqui células de hibridoma que expressam um anticorpo aqui descrito, por exemplo, anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12. Em uma modalidade particular, a célula hospedeira é isolada de outras células. Em outra modalidade, a célula hospedeira não é encontrada dentro do corpo de um indivíduo.
[00279] Os anticorpos descritos neste documento (por exemplo, anticorpos monoclonais, tais como anticorpos quiméricos, humanos ou humanizados, ou um fragmento de ligação ao antígeno dos mesmos) que se ligam a um vírus da Zika NS1 podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica para a síntese de anticorpos,
para por exemplo, por síntese química ou por técnicas de expressão recombinante.
Os métodos descritos neste documento empregam, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais em biologia molecular, microbiologia, análise genética, DNA recombinante, química orgânica, bioquímica, PCR, síntese e modificação de oligonucleotídeos, hibridização de ácido nucleico e campos relacionados dentro da perícia da técnica.
Essas técnicas são descritas nas referências aqui citadas e são totalmente explicadas na literatura.
Ver, por exemplo, Maniatis et al. (1982)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory
Press; Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John
Wiley & Sons (1987 e atualizações anuais); Current Protocols in
Immunology, John Wiley & Sons (1987 e atualizações anuais) Gait
(ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL
Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A
Practical Approach, IRL Press; Birren et al. (eds.) (1999) Genome
Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press.
[00280] Os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando uma ampla variedade de técnicas conhecidas na técnica, incluindo o uso de tecnologias de hibridoma, recombinante e de exibição de fago, ou uma combinação das mesmas. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos utilizando técnicas de hibridoma incluindo aquelas conhecidas na arte e ensinadas, por exemplo, em Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed. 1988); Hammerling et al., In: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981).
O termo "anticorpo monoclonal", tal como aqui utilizado, não está limitado aos anticorpos produzidos através da tecnologia de hibridoma.
[00281] Métodos para produzir e rastrear anticorpos específicos usando tecnologia de hibridoma são rotineiros e bem conhecidos na técnica. Por exemplo, no método de hibridoma, um rato ou outro animal hospedeiro apropriado, como uma ovelha, cabra, coelho, rato, hamster ou macaco macaque, é imunizado para induzir linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligam ao proteína (por exemplo, vírus da Zika NS1) usada para imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são então fundidos com células de mieloma usando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press,
1986)). Além disso, uma técnica RIMMS (vários locais de imunização repetitiva) pode ser usada para imunizar um animal (Kilptrack et al., 1997 Hybridoma 16: 381-9, incorporado por referência na sua totalidade).
[00282] As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e cultivadas em um meio de cultura adequado que, de preferência, contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma parentais não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma parentais carecem da enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas normalmente incluirá hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), cujas substâncias impedem o crescimento de deficientes em HGPRT células.
[00283] As modalidades específicas empregam células de mieloma que se fundem com eficiência, suportam a produção estável de anticorpo de alto nível pelas células produtivas de filtros selecionados e são armazenados em um meio ou meio HAT. Entre essas linhagens celulares de mieloma estão linhas de mieloma murino, como derivadas de tumores de ratos MOPC-21 e MPC-11, disponíveis no Centro de Distribuição Celular Salk Institute, San Diego, CA, EUA e SP-2 ou X63- Ag8.653 células disponíveis na American Type Culture Collection, Rockville, MD, EUA. Também foram descritas linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma de rato- humano para produção de monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol.,
133: 3001 (1984); Brodeur et al., Technodes e Applications of production of monoclonais, 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987)).
[00284] O meio de cultura em que as células de hibridoma estão crescendo é analisado quanto à produção de filtros monoclônicos direcionados contra o vírus da Zika NS1. A especificidade de ligação de monoblocos capturados por células de hibridoma é especificada por métodos conhecidos, por exemplo, imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA).
[00285] Após a identificação de células de hibridoma que produzem o uso de especificidade, afinidade e/ou atividade desejáveis, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitantes e crescentes por métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Meios de cultura qualificados para esse fim de uso, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI 1640. Alternativamente, como células clonais podem ser usadas usando um meio semissólido suplementado com HAT (Stemcell Technologies). Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores de ascite em um animal.
[00286] Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascite ou soro por procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina, como, por exemplo, proteína A-Sepharose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.
[00287] Em algumas modalidades, ratos (ou outros animais, como ratos, macacos, burros, porcos, ovelhas, cabras, hamsters ou cães) podem ser imunizados com um antígeno (por exemplo, um vírus da Zika NS1 ou polipeptídeo NS1 recombinante, como descrito aqui) e uma vez que uma resposta imune é detectada, por exemplo, anticorpos específicos para o antígeno são detectados no soro do rato, o baço do rato é colhido e os esplenócitos isolados. Os esplenócitos são então fundidos por técnicas bem conhecidas a quaisquer células de mieloma adequadas, por exemplo células da linhagem celular SP20, disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC®) (Manassas, VA), para formar hibridomas. Os hibridomas são selecionados e clonados por diluição limitada. Em certas modalidades, os linfonodos dos ratos imunizados são colhidos e fundidos com células de mieloma NS0.
[00288] Os clones de hibridoma são então analisados por métodos conhecidos na técnica para células que secretam anticorpos capazes de se ligar a um polipeptídeo do antígeno (por exemplo, um vírus da Zika NS1 ou um polipeptídeo NS1 recombinante, tal como aqui descrito). O fluido de ascite, que geralmente contém altos níveis de anticorpos, pode ser gerado imunizando ratos com clones de hibridoma positivos.
[00289] Consequentemente, são descritos aqui métodos de produção de anticorpos descritos aqui por cultura de uma célula de hibridoma que secreta um anticorpo. Em certas modalidades, o método de produção de um anticorpo aqui descrito inclui ainda a etapa de purificação do anticorpo.
[00290] Em modalidades específicas, o hibridoma é gerado pela fusão de esplenócitos isolados de um rato (outro animal, como rato, macaco, burro, porco, ovelha ou cachorro) imunizado com um vírus da Zika NS1 com células do mieloma e depois rastreando os hibridomas resultantes da fusão de clones de hibridoma que secretam um anticorpo capaz de se ligar ao vírus da Zika NS1. Em certas modalidades, o hibridoma é gerado pela fusão de linfonodos isolados de um rato (outro animal, como rato, macaco, burro, porco, ovelha ou cachorro) imunizado com um vírus da Zika NS1 com células de mieloma e, em seguida, rastreando os hibridomas resultantes da fusão de clones de hibridoma que secretam um anticorpo capaz de se ligar ao vírus da Zika NS1.
[00291] Os anticorpos aqui descritos incluem fragmentos de anticorpo que reconhecem um vírus da Zika NS1 e podem ser gerados por qualquer técnica conhecida pelos versados na técnica. Por exemplo, os fragmentos Fab e F(ab')2 descritos aqui podem ser produzidos por clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, usando enzimas como papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab’)2). Um fragmento Fab corresponde a um dos dois braços idênticos de uma molécula de anticorpo e contém a cadeia leve completa emparelhada com os domínios VH e CH1 da cadeia pesada. Um fragmento F(ab’)2 contém os dois braços de ligação ao vírus da Zika NS1 de uma molécula de anticorpo ligada por ligações dissulfeto na região de dobradiça.
[00292] Além disso, os anticorpos aqui descritos também podem ser gerados usando vários métodos de exibição de fagos conhecidos na técnica. Nos métodos de apresentação de fagos, os domínios funcionais de anticorpos são apresentados na superfície das partículas de fagos que transportam as sequências polinucleotídicas que os codificam. Em particular, as sequências de DNA que codificam VHCR e VLCR são amplificadas a partir de bibliotecas de cDNA de animais (por exemplo, bibliotecas de cDNA humanas ou murinas dos tecidos afetados). O DNA que codifica o VHCR e o VLCR são recombinados em conjunto com um ligante scFv por PCR e clonados em um vetor fagomídeo. O vetor é eletroporado em E.
coli e o E. coli é infectado com fago auxiliar. Os fagos utilizados nestes métodos são tipicamente fagos filamentosos, incluindo fd e M13, e o VHCR e o VLCR são geralmente fundidos de forma recombinante ao gene do fago III ou ao gene VIII. O fago que expressa um domínio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno específico pode ser selecionado ou identificado com o antígeno, por exemplo, usando o antígeno ou antígeno marcado ligado ou capturado em uma superfície ou pérola sólida. Exemplos de métodos de exibição de fagos que podem ser utilizados para produzir os anticorpos aqui descritos incluem aqueles divulgados em Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Métodos 182: 41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Métodos 184: 177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24: 952-958; Persic et al., 1997, Gene 187: 9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57: 191-280; Pedido PCT No. PCT/GB91/01134; Publicações Internacionais Nos. WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/1 1236, WO 95/15982, WO 95/20401 e WO97/13844; e Patentes US Nos. 5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727, 5,733,743 e 5,969,108.
[00293] Como descrito nas referências acima, após a seleção do fago, as regiões codificadoras de anticorpos do fago podem ser isoladas e usadas para gerar anticorpos inteiros, incluindo anticorpos humanos ou qualquer outro fragmento de ligação ao antígeno desejado, e expressos em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamíferos, células de insetos, células vegetais, leveduras e bactérias, por exemplo, conforme descrito abaixo. Técnicas para produzir de forma recombinante fragmentos de anticorpo, como os fragmentos Fab, Fab’e F(ab')2, também podem ser empregadas usando métodos conhecidos na técnica, como os divulgados na publicação PCT Nº WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12 (6): 864-869; Sawai et al., 1995, AJRI 34: 26- 34; e Better et al., 1988, Science 240: 1041-1043.
[00294] Em um aspecto, para gerar anticorpos inteiros, os iniciadores de PCR incluindo sequências de nucleotídeos VHCR ou VLCR, um local de restrição e uma sequência de flanqueamento para proteger o local de restrição podem ser utilizados para amplificar as sequências VHCR ou VLCR a partir de um modelo, por exemplo, clones scFv. Usando técnicas de clonagem conhecidas dos especialistas na técnica, a VHCR amplificado por PCR pode ser clonado em vetores que expressam uma região constante pesada variável, e o VLCR amplificado por PCR pode ser clonado em vetores que expressam uma região constante leve variável, por exemplo, kappa humano ou regiões constantes lambda. O VHCR e o VLCR também podem ser clonados em um vetor que expressa as regiões constantes necessárias. Os vetores de conversão de cadeia pesada e vetores de conversão de cadeia leve são então co-transfectados em linhagens celulares para gerar linhagens celulares estáveis ou transitórias que expressam anticorpos de comprimento total, por exemplo, IgG, utilizando técnicas conhecidas dos versados na técnica.
[00295] Para algumas utilizações, incluindo a utilização in vivo de anticorpos em humanos e ensaios de detecção in vitro, pode ser preferível utilizar anticorpos humanos, humanizados ou quiméricos.
Anticorpos completamente humanos são particularmente desejáveis para o tratamento terapêutico de indivíduos humanos. Os anticorpos humanos podem ser produzidos por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo métodos de exibição de fagos descritos acima, utilizando bibliotecas de anticorpos derivadas de sequências de imunoglobulinas humanas. Ver também as Patentes US Nos. 4.444.887 e 4.716.111; e Publicações Internacionais Nos. WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 e WO 91/10741.
[00296] Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual diferentes porções do anticorpo são derivadas de diferentes moléculas de imunoglobulina. Por exemplo, um anticorpo quimérico pode conter uma região variável de um anticorpo monoclonal de rato fundido a uma região constante de um anticorpo humano. Os métodos para a produção de anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Morrison, 1985, Science 229: 1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4: 214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125: 191-202; e Patentes US Nos. 5.807.715, 4.816.567, 4.816.397 e 6.331.415.
[00297] Em algumas modalidades, anticorpos humanizados são produzidos. Um anticorpo humanizado é capaz de se ligar a um antígeno predeterminado e compreende uma região estrutural tendo substancialmente a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e CDRs tendo substancialmente a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina não humana (por exemplo, uma imunoglobulina murina). Os anticorpos humanizados podem ser produzidos usando uma variedade de técnicas conhecidas na arte, incluindo, mas não se limitando ao enxerto de CDR (Patente Europeia No. EP 239.400; Publicação Internacional No. WO 91/09967; e Patentes US Nos.
5,225,539, 5,530,101, e 5,585,089), revestimento ou recapeamento (Patentes Europeias Nos. EP 592,106 e EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28 (4/5): 489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7 (6): 805-814 e Roguska et al., 1994, PNAS 91: 969-973), baralhamento de cadeias (Patente US No. 5.565.332) e técnicas divulgadas, por exemplo, nas patentes US 6,407,213, US 5,666,886 e WO 9317105, Tan et al., J. Immunol. 169:1119 25 (2002), Caldas et al., Protein Eng. 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods 20(3):267 79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem.
272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895 904 (1996), Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s- 5977s (1995), Couto et al., Cancer Res. 55(8):1717-22 (1995), Sandhu JS, Gene 150(2):409-10 (1994), e Pedersen et al., J. Mol. Biol.
235(3):959-73 (1994). Veja também a publicação de patente No. US 2005/0042664 A1 (Feb. 24, 2005), que é incorporada aqui por referência na sua totalidade.
[00298] Em algumas modalidades, são produzidos anticorpos humanizados. Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que se liga ao mesmo epítopo de um vírus da Zika NS1 como o anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12, é um anticorpo humanizado. Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, que bloqueia competitivamente (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) o anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12 de se ligar a um vírus da Zika NS1, é um anticorpo humanizado.
[00299] Os anticorpos humanos podem ser produzidos usando qualquer método conhecido na técnica. Em certas modalidades, são aqui fornecidos anticorpos humanos que podem competir com o anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12 para ligação específica a um NS1 do vírus da Zika ou um polipeptídeo NS1 recombinante, tal como aqui descrito. Em certas modalidades, são aqui fornecidos anticorpos humanos que se ligam ao mesmo epítopo de um NS1 do vírus da Zika ou um polipeptídeo NS1 recombinante como o epítopo ao qual o anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12 se liga. Por exemplo, podem ser usados ratinhos transgénicos que são incapazes de expressar imunoglobulinas endógenas funcionais, mas que podem expressar genes de imunoglobulinas humanas. Em particular, os complexos de genes de imunoglobulina de cadeia pesada e leve humana podem ser introduzidos aleatoriamente ou por recombinação homóloga em células-tronco embrionárias de rato. Alternativamente, a região variável humana, região constante e região de diversidade podem ser introduzidas em células-tronco embrionárias de rato, além dos genes de cadeia leve e pesada humana. Os genes de imunoglobulina de cadeia pesada e leve de rato podem ser tornados não funcionais separadamente ou simultaneamente com a introdução de loci de imunoglobulina humana por recombinação homóloga. Em particular, a deleção homozigótica da região JH impede a produção de anticorpos endógenos. As células-tronco embrionárias modificadas são expandidas e microinjetadas em blastocistos para produzir ratos quiméricos. Os ratos quiméricos são então criados para produzir descendentes homozigóticos que expressam anticorpos humanos. Os ratos transgênicos são imunizados da maneira normal com um antígeno selecionado, por exemplo, todo ou uma porção de um antígeno (por exemplo, um vírus da Zika NS1). Os anticorpos monoclonais dirigidos contra o antígeno podem ser obtidos a partir de ratos transgênicos imunizados usando tecnologia de hibridoma convencional. Os transgênicos de imunoglobulina humana abrigados pelos ratos transgênicos se reorganizam durante a diferenciação de células B e, subsequentemente, passam por troca de classe e mutação somática.
Assim, utilizando essa técnica, é possível produzir anticorpos IgG, IgA, IgM e IgE terapeuticamente úteis. Para uma visão geral desta tecnologia para a produção de anticorpos humanos, ver Lonberg e Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13: 65-93. Para uma discussão detalhada desta tecnologia para a produção de anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos para a produção de tais anticorpos, ver, por exemplo, as publicações PCT Nos. WO 98/24893, WO 96/34096 e WO 96/33735; e Patentes US Nos. 5,413,923,
5,625,126, 5,633,425, 5,569,825, 5,661,016, 5,545,806, 5,814,318 e 5,939,598.
[00300] Em algumas modalidades, os anticorpos humanos podem ser produzidos usando hibridomas rato-humano. Por exemplo, linfócitos do sangue periférico humano transformados com o vírus Epstein-Barr (EBV) podem ser fundidos com células de mieloma de rato para produzir hibridomas rato-humano secretando anticorpos monoclonais humanos, e esses hibridomas rato-humano podem ser rastreados para determinar aqueles que secretam anticorpos monoclonais humanos que se ligam a um antígeno alvo (por exemplo, um vírus da Zika NS1).
Tais métodos são conhecidos e são descritos na técnica, ver, por exemplo, Shinmoto et al., Cytotechnology, 2004, 46: 19-23; Naganawa et al., Human Antibodies, 2005, 14: 27-31.
[00301] Em algumas modalidades, os anticorpos humanos podem ser gerados através da inserção de polinucleotídeos que codificam CDRs humanos (por exemplo, CDRs VLCR e/ou CDRs VHCR) de um anticorpo em um vetor de expressão contendo sequências nucleotídicas que codificam sequências da região estrutural humana. Em certas modalidades, esses vetores de expressão compreendem ainda sequências nucleotídicas que codificam uma região constante de uma cadeia humana leve e/ou pesada. Em algumas modalidades, os anticorpos humanos podem ser gerados através da inserção de CDRs humanas (por exemplo, VLCR CDRs e/ou VHCR CDRs) de um anticorpo obtido a partir de uma biblioteca de fagos em tais vetores de expressão humanos.
[00302] Em certas modalidades, um anticorpo humano pode ser gerado pela seleção de sequências de CDR humanas que são homólogas (ou substancialmente homólogas) às sequências de CDR não humanas de um anticorpo não humano e pela seleção de sequências estruturais humanas que são homólogas (ou substancialmente homólogas) às sequências estruturais não humanas de um anticorpo não humano.
[00303] Os anticorpos de domínio único, por exemplo, anticorpos sem as cadeias leves, podem ser produzidos por métodos bem conhecidos na técnica. Ver Riechmann et al., 1999, J. Immunol.
231: 25-38; Nuttall et al., 2000, Curr. Pharm. Biotechnol. 1 (3): 253-263; Muylderman, 2001, J. Biotechnol. 74 (4): 277302; Patente US No. 6,005,079; e Publicações Internacionais Nos. WO 94/04678, WO 94/25591 e WO 01/44301.
[00304] Anticorpos biespecíficos são anticorpos que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes. Anticorpos biespecíficos exemplificativos podem se ligar a dois epítopos diferentes de um antígeno ou a dois epítopos diferentes de dois antígenos diferentes. Em modalidades específicas, um anticorpo biespecífico tem dois domínios de ligação a antígeno distintos, em que cada domínio se liga especificamente a um antígeno diferente. Outros anticorpos podem se ligar a um primeiro antígeno (por exemplo, PD-1 humano) e ainda se ligar a um segundo antígeno. Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos completos ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, F(ab'): anticorpos biespecíficos).
[00305] Os métodos para produzir anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. (veja, por exemplo, Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983); Traunecker et al., EMBO J., 10:3655- 3659 (1991); Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986); Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992); Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993); Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994); U.S. Patent Nos. 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,81; 95,731,168; 4,676,980; and 4,676,980, WO 94/04690; WO 91/00360; WO 92/200373; WO 93/17715; WO 92/08802; e EP 03089).
[00306] Além disso, os anticorpos que se ligam a um Zika vírus NS1 podem, por sua vez, ser utilizados para gerar anticorpos anti- idiotipo que "mimetizam" um antígeno usando técnicas bem conhecidas dos versados na técnica. (Ver, por exemplo, Greenspan & Bona, 1989, FASEB J. 7 (5): 437-444; e Nissinoff, 1991, J.
Immunol. 147 (8): 2429-2438).
[00307] Expressão recombinante de um anticorpo aqui descrito (por exemplo, um anticorpo completo, cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo ou um anticorpo de cadeia única aqui descrito) que se liga a um vírus da Zika NS1 ou um NS1 recombinante, pode, por exemplo, envolver a construção de vetores (por exemplo, vetores de expressão) contendo um polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou seus fragmentos (por exemplo, VLCR e/ou VHCR). Uma vez que um polinucleotídeo que codifica uma molécula de anticorpo, cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao vírus da Zika NS1 aqui descrito tenha sido obtido, um vetor para a produção da molécula de anticorpo pode ser produzido por tecnologia de DNA recombinante usando técnicas conhecido na arte.
Os métodos para preparar uma proteína expressando um polinucleotídeo contendo uma sequência nucleotídica que codifica um anticorpo são descritos aqui. Os métodos que são bem conhecidos dos especialistas na técnica podem ser utilizados para construir vetores de expressão contendo sequências codificadoras de anticorpos e sinais de controle transcricionais e de tradução apropriados. Esses métodos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo. Também são fornecidos vetores replicáveis compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo aqui descrita, uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, um domínio variável de cadeia pesada ou leve de um anticorpo ou um fragmento deste, ou um CDR de cadeia pesada ou leve, operacionalmente ligado para um promotor. Tais vetores podem, por exemplo, incluir a sequência nucleotídica que codifica a região constante da molécula de anticorpo (ver, por exemplo, Publicações Internacionais Nos. WO 86/05807 e WO 89/01036; e Patente US No.
5.122.464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado nesse vetor para expressão de toda a cadeia pesada, toda a cadeia leve ou de todas as cadeias pesada e leve.
[00308] Um vetor de expressão pode ser transferido para uma célula (por exemplo, célula hospedeira) por técnicas convencionais e as células resultantes podem ser cultivadas por técnicas convencionais para produzir um anticorpo aqui descrito ou um fragmento do mesmo. Assim, são fornecidas aqui células hospedeiras contendo um polinucleotídeo que codifica um anticorpo aqui descrito ou fragmentos do mesmo, ou uma cadeia pesada ou leve do mesmo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou um anticorpo de cadeia única aqui descrito, operacionalmente ligado a um promotor para a expressão de tais sequências na célula hospedeira. Em certas modalidades, por exemplo, para a expressão de anticorpos de cadeia dupla, os vetores que codificam as cadeias pesada e leve individualmente podem ser co-expressos na célula hospedeira para a expressão de toda a molécula de imunoglobulina, conforme detalhado abaixo. Em certas modalidades, uma célula hospedeira contém um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada e a cadeia leve de um anticorpo aqui descrito, ou um fragmento do mesmo. Em modalidades específicas, uma célula hospedeira contém dois vetores diferentes, um primeiro vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada de um anticorpo aqui descrito, ou um fragmento do mesmo
(por exemplo, um domínio VH) e um segundo vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma luz cadeia de um anticorpo aqui descrito, ou um fragmento do mesmo (por exemplo, um domínio VL).
Em outras modalidades, uma primeira célula hospedeira compreende um primeiro vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada de um anticorpo aqui descrito, ou um fragmento do mesmo (por exemplo, um domínio VH), e uma segunda célula hospedeira compreende um segundo vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve de um anticorpo aqui descrito, ou um fragmento do mesmo (por exemplo, um domínio VL).
[00309] Uma variedade de sistemas de vetor de expressão de hospedeiro pode ser utilizada para expressar moléculas de anticorpo aqui descritas (ver, por exemplo, Patente US No.
5,807,715). Tais sistemas de expressão de hospedeiro representam veículos pelos quais as sequências de codificação de interesse podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas também representam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências de codificação de nucleotídeos apropriadas, expressar uma molécula de anticorpo aqui descrita in situ. Estes incluem, mas não estão limitados aos microrganismos, tais como bactérias (por exemplo, E. coli e B. subtilis) transformadas com DNA de bacteriófago recombinante, DNA de plasmídeo ou vetores de expressão de DNA cosmídeo contendo sequências de codificação de anticorpos; levedura (por exemplo,
Saccharomyces Pichia) transformada com vetores de expressão de levedura recombinantes contendo sequências codificadoras de anticorpos; sistemas de células de inseto infectados com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, baculovírus)
contendo sequências codificadoras de anticorpos; sistemas de células vegetais (por exemplo, algas verdes como Chlamydomonas reinhardtii) infectados com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, vírus do mosaico de couve-flor, CaMV;
vírus de mosaico do tabaco, TMV) ou transformados com vetores de expressão de plasmídeo recombinante (por exemplo, plasmídeo Ti)
contendo codificação de anticorpos sequências; ou sistemas de células de mamíferos (por exemplo, COS, CHO, BHK, MDCK, HEK 293,
NS0, PER.C6, VERO, CRL7O3O, HsS78Bst, HeLa, é células NIH 3T3) que abrigam construções de expressão recombinantes contendo promotores derivados do genoma de células de mamíferos (por exemplo, promotor de metalotioneína) ou a partir de vírus de mamíferos (por exemplo,
o promotor tardio de adenovírus; o promotor de 7,5K do vírus vaccinia). Em uma modalidade específica, um vetor de expressão em mamífero é pOptiVEC™ ou pcDNA3.3. Preferencialmente, células bacterianas como Escherichia coli e, mais preferencialmente,
células eucarióticas, especialmente para a expressão de uma molécula de anticorpo recombinante completa, são usadas para a expressão de uma molécula de anticorpo recombinante.
Por exemplo,
células de mamíferos, como células de ovário de hamster chinês
(CHO), em conjunto com um vetor, como o principal elemento promotor de genes intermediários iniciais do citomegalovírus humano, é um sistema de expressão eficaz para anticorpos (Foecking et al., 1986, Gene 45: 101 e Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2). Em certas modalidades, os anticorpos aqui descritos são produzidos por células CHO ou células NS0. Em uma modalidade específica, a expressão de sequências de nucleotídeos que codificam anticorpos aqui descritos (ou fragmentos dos mesmos) que se ligam ao vírus da Zika NS1 é regulada por um promotor constitutivo, promotor induzível ou promotor específico de tecido.
[00310] Em sistemas bacterianos, vários vetores de expressão podem ser selecionados com vantagem, dependendo do uso pretendido para a molécula de anticorpo sendo expressa. Por exemplo, quando é produzida uma grande quantidade desse anticorpo, para a geração de composições farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, podem ser vetores desejáveis que direcionam a expressão de altos níveis de produtos de proteínas de fusão que são facilmente purificados.
Tais vetores incluem, mas não estão limitados ao vetor de expressão de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO 12: 1791), no qual a sequência de codificação do anticorpo pode ser ligada individualmente ao vetor no quadro com a região codificante lac Z para que uma proteína de fusão seja produzida; vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509); e similar. Os vetores pGEX também podem ser usados para expressar polipeptídeos estranhos como proteínas de fusão com glutationa 5-transferase (GST). Em geral, essas proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas a partir de células lisadas por adsorção e ligação a esferas de agarose de glutationa de matriz seguidas de eluição na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são projetados para incluir locais de clivagem de trombina ou protease fator Xa, de modo que o produto do gene alvo clonado possa ser liberado da fração GST.
[00311] Em um sistema de insetos, o vírus da poliedrose nuclear Autographa californica (AcNPV) é usado como vetor para expressar genes estranhos. O vírus cresce nas células de Spodoptera frugiperda. A sequência de codificação do anticorpo pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais (por exemplo, o gene da poliedrina) do vírus e colocada sob controle de um promotor de AcNPV (por exemplo, o promotor de poliedrina).
[00312] Nas células hospedeiras de mamíferos, podem ser utilizados vários sistemas de expressão baseados em vírus. Nos casos em que um adenovírus é usado como um vetor de expressão, a sequência de codificação de anticorpos de interesse pode ser ligada a um complexo de controle de transcrição/tradução de adenovírus, por exemplo, o promotor tardio e a sequência líder tripartida.
Este gene quimérico pode então ser inserido no genoma do adenovírus por recombinação in vitro ou in vivo. A inserção em uma região não essencial do genoma viral (por exemplo, região El ou E3) resultará em um vírus recombinante viável e capaz de expressar a molécula de anticorpo em hospedeiros infectados (por exemplo, ver Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8 1: 355-359). Sinais de iniciação específicos também podem ser necessários para tradução eficiente de sequências codificadoras de anticorpos inseridas.
Estes sinais incluem o codão de iniciação ATG e sequências adjacentes. Além disso, o codão de iniciação deve estar em fase com o quadro de leitura da sequência de codificação desejada para garantir a tradução de toda a inserção. Esses sinais de controle de tradução exógenos e códons de iniciação podem ser de várias origens, naturais e sintéticas. A eficiência da expressão pode ser aumentada pela inclusão de elementos intensificadores de transcrição apropriados, terminadores de transcrição etc. (ver, por exemplo, Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 51- 544).
[00313] Como usado aqui, o termo "célula hospedeira" se refere a qualquer tipo de célula, por exemplo, uma célula primária ou uma célula de uma linhagem celular. Em modalidades específicas, o termo "célula hospedeira" se refere a uma célula transfectada com um polinucleotídeo e a progênie ou progênie potencial de tal célula.
A descendência de uma célula desse tipo pode não ser idêntica à célula-mãe transfectada com o polinucleotídeo devido a mutações ou influências ambientais que podem ocorrer nas gerações seguintes ou na integração do polinucleotídeo no genoma da célula hospedeira.
Em uma modalidade específica, uma célula hospedeira aqui descrita é isolada.
[00314] Além disso, pode ser escolhida uma cepa de célula hospedeira que modula a expressão das sequências inseridas ou modifica e processa o produto do gene da maneira específica desejada. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtos proteicos podem ser importantes para a função da proteína. Diferentes células hospedeiras possuem mecanismos característicos e específicos para o processamento pós-tradução e modificação de proteínas e produtos gênicos. Linhagens celulares ou sistemas hospedeiros apropriados podem ser escolhidos para garantir a modificação e o processamento corretos da proteína estranha expressa. Para este fim, podem ser utilizadas células hospedeiras eucarióticas que possuem o mecanismo celular para o processamento adequado do transcrito primário, glicosilação e fosforilação do produto genético. Tais células hospedeiras de mamíferos incluem, mas não estão limitadas a, CHO, VERO, BHK, Hela, COS, MDCK, HEK 293, NIH 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O e T47D, NS0 (uma linhagem celular de mieloma murino que não possui produz endogenamente quaisquer cadeias de imunoglobulina), células CRL7O3O e HsS78Bst. Em certas modalidades, os anticorpos monoclonais humanizados aqui descritos são produzidos em células de mamíferos, como células CHO.
[00315] Para uma produção a longo prazo e de alto rendimento de proteínas recombinantes, é preferível a expressão estável. Por exemplo, as linhagens celulares que expressam estavelmente a molécula de anticorpo podem ser manipuladas. Em vez de usar vetores de expressão que contêm origens virais de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas com o DNA controlado por elementos de controle de expressão apropriados (por exemplo, promotor, intensificador, sequências, terminadores de transcrição, locais de poliadenilação etc.) e um marcador selecionável. Após a introdução do DNA estranho, as células manipuladas podem crescer por 1 a 2 dias em um meio enriquecido e depois são trocadas para um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células integrem estavelmente o plasmídeo em seus cromossomos e cresçam para formar focos que, por sua vez, podem ser clonados e expandidos em linhagens celulares. Este método pode ser vantajosamente utilizado para projetar linhagens celulares que expressam a molécula de anticorpo. Tais linhagens celulares manipuladas podem ser particularmente úteis na triagem e avaliação de composições que interagem direta ou indiretamente com a molécula de anticorpo.
[00316] Vários sistemas de seleção podem ser utilizados, incluindo, entre outros, o vírus do herpes simplex timidina quinase (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl.
Acad. Sci. EUA 48: 202) e os genes da adenina fosforibosiltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22: 8-17) podem ser empregados nos genes de células tk-, hgprt- ou aprt-, respectivamente. Além disso, a resistência ao antimetabólito pode ser usada como base de seleção para os seguintes genes: dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler et al., 1980, Natl.
Acad. Sci. USA 77: 357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad.
Sei. USA 78: 1527); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 2072); neo, que confere resistência ao aminoglicosídeo G-418 (Wu e Wu, 1991, Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev.
Pharmacol. Toxicol. Toxicol. 32: 573-596; Mulligan, 1993, Science 260: 926-932 e Morgan e Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; maio de 1993, TIB TECH 11 (5): l55-215); e hygro, que confere resistência à higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147). Os métodos comumente conhecidos na arte da tecnologia de DNA recombinante podem ser aplicados rotineiramente para selecionar o clone recombinante desejado, e esses métodos são descritos, por exemplo, em Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer e Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); e nos capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994);
Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1, que são incorporados por referência aqui na sua totalidade.
[00317] Os níveis de expressão de uma molécula de anticorpo podem ser aumentados pela amplificação do vetor (para uma revisão, consulte Bebbington e Hentschel, O uso de vetores baseados na amplificação de genes para a expressão de genes clonados em células de mamíferos na clonagem de DNA, Vol. 3 (Academic Press Nova Iorque, 1987)). Quando um marcador no sistema vetorial que expressa anticorpo é amplificável, o aumento no nível de inibidor presente na cultura da célula hospedeira aumentará o número de cópias do gene marcador. Uma vez que a região amplificada está associada ao gene do anticorpo, a produção do anticorpo também aumentará (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 257).
[00318] A célula hospedeira pode ser co-transfectada com dois ou mais vetores de expressão aqui descritos, o primeiro vetor que codifica um polipeptídeo derivado da cadeia pesada e o segundo vetor que codifica um polipeptídeo derivado da cadeia leve. Em uma modalidade específica, uma célula hospedeira inclui dois vetores de expressão: um vetor compreendendo uma sequência polinucleotídica compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica uma região variável da cadeia pesada de um anticorpo aqui descrito (por exemplo, AA12, EB9, GB5 ou FC12) e um segundo vetor compreendendo uma sequência polinucleotídica compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica uma região variável da cadeia leve de um anticorpo aqui descrito (por exemplo, AA12, EB9, GB5 ou FC12). Os dois vetores podem conter marcadores selecionáveis idênticos que permitem a expressão igual de polipeptídeos de cadeia pesada e leve. As células hospedeiras podem ser co-transfectadas com diferentes quantidades de dois ou mais vetores de expressão.
[00319] Alternativamente, pode ser utilizado um único vetor que codifica e é capaz de expressar polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Em tais situações, a cadeia leve deve ser colocada antes da cadeia pesada para evitar um excesso de cadeia pesada livre de tóxicos (Proudfoot, 1986, Nature 322: 52; e Kohler, 1980, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 77: 2197-2199). As sequências de codificação para as cadeias pesada e leve podem compreender cDNA ou DNA genômico. O vetor de expressão pode ser monocistrônico ou multicistrônico. Uma construção de ácido nucleico multicistrônico pode codificar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais, ou nas faixas de 2 a 5, 5 a 10 ou 10 a 20 genes/sequências de nucleotídeos. Por exemplo, uma construção de ácido nucleico bicistrônico pode compreender na seguinte ordem um promotor, um primeiro gene (por exemplo, cadeia pesada de um anticorpo aqui descrito) e um segundo gene e (por exemplo, cadeia leve de um anticorpo aqui descrito).
Nesse vetor de expressão, a transcrição de ambos os genes pode ser conduzida pelo promotor, enquanto a tradução do mRNA do primeiro gene pode ser por um mecanismo de varredura dependente de tampa e a tradução do mRNA do segundo gene pode ser por um mecanismo independente de limite, por exemplo, por um IRES.
[00320] Uma vez que uma molécula de anticorpo aqui descrita tenha sido produzida por expressão recombinante, ela pode ser purificada por qualquer método conhecido na técnica para purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, particularmente por afinidade para o antígeno específico após proteína A e cromatografia em coluna de dimensionamento), centrifugação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Além disso, os anticorpos aqui descritos podem ser fundidos com sequências polipeptídicas heterólogas aqui descritas ou de outro modo conhecidas na técnica para facilitar a purificação.
[00321] Em modalidades específicas, um anticorpo (por exemplo, um anticorpo monoclonal, tal como um anticorpo humanizado ou quimérico ou um seu fragmento de ligação ao antígeno) aqui descrito é isolado ou purificado. Geralmente, um anticorpo isolado é aquele que está substancialmente livre de outros anticorpos com especificidades antigênicas diferentes do anticorpo isolado. Por exemplo, em uma modalidade específica, uma preparação de um anticorpo aqui descrito é substancialmente livre de material celular e/ou precursores químicos. A linguagem "substancialmente livre de material celular ”Inclui preparações de um anticorpo no qual o anticorpo é separado dos componentes celulares das células das quais é isolado ou produzido de forma recombinante. Assim, um anticorpo que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de anticorpos com menos de cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% (em peso seco) de proteína heteróloga (também aqui referida como uma "proteína contaminante") e/ou variantes de um anticorpo, por exemplo, diferentes formas pós-traducionais modificadas de um anticorpo ou outras versões diferentes de um anticorpo (por exemplo, fragmentos de anticorpo). Quando o anticorpo é produzido de forma recombinante, geralmente também é substancialmente livre de meio de cultura, ou seja, o meio de cultura representa menos de cerca de 20%, 10%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% do volume da preparação das proteínas. Quando o anticorpo é produzido por síntese química, é geralmente substancialmente livre de precursores químicos outros produtos químicos, isto é, é separado de precursores químicos outros produtos químicos que estão envolvidos na síntese da proteína. Por conseguinte, essas preparações do anticorpo têm menos de cerca de 30%, 20%, 10%, 5% (em peso seco) de precursores químicos ou compostos que não sejam o anticorpo de interesse. Em uma modalidade específica, os anticorpos aqui descritos são isolados ou purificados.
[00322] Em certos aspectos, um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1, como um anticorpo aqui descrito, pode ser gerado por imunização de um indivíduo (por exemplo, um indivíduo não humano)
com um imunógeno. Em modalidades específicas, um método para gerar um anticorpo que se liga a um vírus da Zika NS1, tal como um anticorpo aqui descrito, incluindo a administração a um indivíduo (por exemplo, um indivíduo não humano) uma, duas ou mais doses de um ou mais imunógenos (por exemplo, um vírus da Zika NS1 conhecido na técnica ou descrito aqui, ou um polipeptídeo NS1 recombinante conhecido na técnica ou descrito aqui). O baço do indivíduo pode ser colhido, hibridomas produzidos e rastreados para anticorpos que se ligam a uma ou mais cepas de vírus da Zika diferentes e/ou NS1 de uma ou mais cepas de vírus da Zika diferentes. As técnicas conhecidas por uma pessoa versada na técnica ou aqui descritas podem ser usadas para colher o baço, produzir hibridomas e rastrear a ligação. Os anticorpos de interesse podem então ser isolados.
[00323] Em uma modalidade específica, um anticorpo se liga a um vírus da Zika NS1, tal como um anticorpo aqui descrito, pode ser gerado seguindo a metodologia descrita na Seção 6, infra.
5.6 Expressão do Zika NS1
[00324] São aqui fornecidos vetores, incluindo vetores de expressão, contendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo NS1 aqui descrito. Em uma modalidade específica, o vetor é um vetor de expressão que é capaz de direcionar a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo NS1 aqui descrito. Exemplos não limitativos de vetores de expressão incluem, mas não estão limitados a, plasmídeos e vetores virais,
como um paramixovírus (por exemplo, NDV), um adenovírus, um vírus adeno-associado, um baculovírus, um vírus vaccinina, um retrovírus, um vírus da hepatite, um poxvírus, um vírus do herpes, um rabdovírus (por exemplo, vírus da estomatite vesticular) ou outro vírus conhecido por uma pessoa versada na técnica. Os vetores de expressão também podem incluir, sem limitação, animais transgênicos e células/organismos não mamíferos, por exemplo, células/organismos não mamíferos que foram projetados para realizar glicosilação ligada a N de mamíferos.
[00325] Um vetor de expressão inclui um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo NS1 em uma forma adequada para a expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira. Em uma modalidade específica, um vetor de expressão inclui uma ou mais sequências regulatórias, selecionadas com base nas células hospedeiras a serem utilizadas para a expressão, que está operacionalmente ligada ao ácido nucleico a ser expresso. Dentro de um vetor de expressão, "operacionalmente ligado" pretende significar que um polinucleotídeo de interesse está ligado às sequências reguladoras de uma maneira que permite a expressão do ácido nucleico (por exemplo, em um sistema de transcrição/tradução in vitro ou em uma célula hospedeira quando o vetor é introduzido na célula hospedeira). As sequências regulatórias incluem promotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). As sequências regulatórias incluem aquelas que direcionam a expressão constitutiva de um ácido nucleico em muitos tipos de células hospedeiras, aquelas que direcionam a expressão do ácido nucleico apenas em certas células hospedeiras (por exemplo, sequências regulatórias específicas de tecido) e aquelas que direcionam a expressão do ácido nucleico após estimulação com um agente particular (por exemplo, sequências regulatórias induzíveis). Será apreciado por aqueles versados na técnica que o projeto do vetor de expressão pode depender de fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejada etc. Em modalidades específicas, a célula hospedeira é uma linha celular.
[00326] Consulte a Seção 5.5, supra, para exemplos de vetores de expressão e células hospedeiras. Além disso, um vetor viral, partículas semelhantes a vírus, virossomas, vetores bacterianos e vetores de plantas podem ser usados para expressar um polipeptídeo NS1 aqui descrito e/ou pode incluir tal polipeptídeo. Ver, por exemplo, Seções 5.8 a 5.12 da Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 2016/118937, que é incorporada neste documento por referência em sua totalidade, para uma discussão de tais vetores, como produzir tais vetores e como usar tais vetores.
Em uma modalidade específica, uma célula hospedeira de mamífero (por exemplo, uma célula hospedeira humana), tal como descrito na Seção 5.5, é usada para expressar um polipeptídeo NS1 aqui descrito. Em outras modalidades, células insech, bacterianas ou vegetais, como descrito na Seção 5.5, são usadas para expressar um polipeptídeo NS1 aqui descrito.
[00327] Como alternativa à expressão recombinante de um polipeptídeo NS1 aqui descrito usando uma célula hospedeira, um vetor de expressão contendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo NS1 pode ser transcrito e traduzido in vitro usando, por exemplo, sequências regulatórias do promotor T7 e polimerase T7. Em uma modalidade específica, um sistema de transcrição/tradução acoplado, tal como Promega TNT®, ou um lisado celular ou extrato celular compreendendo os componentes necessários para a transcrição e tradução pode ser usado para produzir um polipeptídeo NS1.
[00328] Uma vez que um polipeptídeo NS1 foi produzido, ele pode ser isolado ou purificado por qualquer método conhecido na técnica para isolamento ou purificação de uma proteína, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, particularmente por afinidade para o antígeno específico, por proteína A e cromatografia em coluna de dimensionamento), centrifugação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica padrão para o isolamento ou purificação de proteínas.
[00329] Por conseguinte, são aqui fornecidos métodos para a produção de um polipeptídeo NS1 aqui descrito. Em uma modalidade, o método inclui a cultura de uma célula hospedeira contendo uma sequência de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo NS1 em um meio adequado de modo que o polipeptídeo seja produzido. Em algumas modalidades, o método compreende ainda o isolamento do polipeptídeo do meio ou da célula hospedeira.
[00330] Em uma modalidade específica, um polipeptídeo NS1 é produzido usando métodos descritos na Seção 6, infra.
5.7 COMPOSIÇÕES
5.7.1 Composições Anticorpo
[00331] São fornecidas aqui composições (por exemplo, composições farmacêuticas) compreendendo um anticorpo com o grau de pureza desejado em um transportador, excipiente ou estabilizador fisiologicamente aceitável (Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA).
Em uma modalidade específica, uma composição compreendendo um anticorpo aqui descrito e um transportador ou excipiente aceitável. Em uma modalidade específica, as composições compreendendo um anticorpo conjugado a uma fração, tal como descrito na Seção 5.2.2, supra. Em certas modalidades, as composições que compreendem um anticorpo que foi modificado para aumentar sua meia-vida, tal como descrito na Seção 5.2.1, supra.
Os transportadores, excipientes ou estabilizadores aceitáveis não são tóxicos para os destinatários nas dosagens e concentrações utilizadas e incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (como cloreto de octadecildimetilbenzilamônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, butil ou álcool benzílico; alquilparabenos, como metil ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-iões formadores de sal, tais como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos, tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG).
[00332] Em uma modalidade específica, as composições farmacêuticas incluem um anticorpo e, opcionalmente, um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos adicionais, em um transportador farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade específica, as composições farmacêuticas compreendem uma quantidade eficaz de um anticorpo e, opcionalmente, um ou mais agentes profiláticos adicionais de terapêuticos, em um transportador farmaceuticamente aceitável. Consulte a Seção 5.8.3, infra, para exemplos de agentes profiláticos ou terapêuticos. Em algumas modalidades, o anticorpo é o único ingrediente ativo incluído na composição farmacêutica. As composições farmacêuticas aqui descritas podem ser úteis na prevenção da doença pelo vírus da Zika ou no tratamento de uma infecção pelo vírus da Zika ou doença pelo vírus da Zika. Além disso, as composições farmacêuticas aqui descritas podem ser úteis na prevenção, tratamento e/ou gestão da doença pelo vírus da Zika.
[00333] Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis usados em preparações parenterais incluem veículos aquosos, veículos não aquosos, agentes antimicrobianos, agentes isotônicos, tampões, antioxidantes, anestésicos locais, agentes de suspensão e dispersão, agentes emulsificantes, agentes sequestrantes ou quelantes e outras substâncias farmaceuticamente aceitáveis.
Exemplos de veículos aquosos incluem Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringers, Injeção Isotônica de Dextrose, Injeção de Água Estéril, Injeção de Dextrose e Ringer Lactado. Os veículos parenterais não aquosos incluem óleos fixos de origem vegetal, óleo de semente de algodão, óleo de milho, óleo de gergelim e óleo de amendoim. agentes antimicrobianos em concentrações bacteriostáticas ou fungistáticas podem ser adicionados a preparações parenterais embaladas em recipientes de dose múltipla que incluem fenóis ou cresóis, mercuriais, álcool benzílico, clorobutanol, ésteres de ácido metil e propil p-hidroxibenzóico, timerosal, cloreto de benzalcônio e cloreto de benzetônio. Os agentes isotônicos incluem cloreto de sódio e dextrose. Os tampões incluem fosfato e citrato. Os antioxidantes incluem bissulfato de sódio. Os anestésicos locais incluem cloridrato de procaína. Os agentes de suspensão e dispersão incluem carboximetilcelulose de sódio, hidroxipropilmetilcelulose e polivinilpirrolidona. Os agentes emulsificantes incluem Polissorbato 80 (TWEEN® 80). Um agente sequestrante ou quelante de íons metálicos inclui EDTA. Os veículos farmacêuticos também incluem álcool etílico, polietilenoglicol e propilenoglicol para veículos miscíveis em água; e hidróxido de sódio, ácido clorídrico, ácido cítrico ou ácido láctico para ajuste de pH.
[00334] Uma composição farmacêutica pode ser formulada para qualquer via de administração a um indivíduo. Em certas modalidades, uma composição farmacêutica é formulada para administração sistêmica a um indivíduo. Exemplos específicos de vias de administração incluem intranasal, oral, transdérmica, intradérmica, parenteral e mucosa. Em uma modalidade específica, a composição é formulada para administração intranasal ou intramuscular. Em uma modalidade específica, a composição é uma formulação para administração intramuscular. Em uma modalidade específica, a composição é formulada para administração intranasal ou mucosa. Em uma modalidade particular, a composição é formulada para administração subcutânea ou intravenosa.
[00335] A administração parenteral, caracterizada por injeção subcutânea, intramuscular ou intravenosa, também é contemplada neste documento. Os injetáveis podem ser preparados em formas convencionais, como soluções ou suspensões líquidas, formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da injeção, ou como emulsões. Os injetáveis, soluções e emulsões também contêm um ou mais excipientes. Os excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol ou etanol. Além disso, se desejado, as composições farmacêuticas a serem administradas também podem conter pequenas quantidades de substâncias auxiliares não tóxicas, como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes tamponantes de pH, estabilizantes, intensificadores de solubilidade e outros agentes, tais como, por exemplo, sódio acetato, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina e ciclodextrinas.
[00336] As preparações para administração parenteral de um anticorpo incluem soluções estéreis prontas para injeção, produtos solúveis secos estéreis, como pós liofilizados, prontos para serem combinados com um solvente imediatamente antes do uso, incluindo comprimidos hipodérmicos, suspensões estéreis prontas para injeção, produtos insolúveis secos estéreis pronto para ser combinado com um veículo imediatamente antes do uso e emulsões estéreis. As soluções podem ser aquosas ou não aquosas.
[00337] Se administrados por via intravenosa, os transportadores adequados incluem soro fisiológico ou soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e soluções contendo agentes espessantes e solubilizantes, tais como glicose, polietilenoglicol e polipropilenoglicol e suas misturas.
[00338] Os adesivos transdérmicos, incluindo dispositivos iontoforéticos e eletroforéticos, são bem conhecidos dos versados na técnica e podem ser usados para administrar um anticorpo. Por exemplo, tais remendos são divulgados nas Patentes US Nos.
6,267,983, 6,261,595, 6,256,533, 6,167,301, 6,024,975, 6,010,715, 5,985,317, 5,983,134, 5,948,433 e 5,860,957.
[00339] Em certas modalidades, uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo é um pó liofilizado, que pode ser reconstituído para administração como soluções, emulsões e outras misturas. Também pode ser reconstituído e formulado como sólidos ou géis. O pó liofilizado é preparado por dissolução de um anticorpo fornecido neste documento, ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, em um solvente adequado. Em algumas modalidades, o pó liofilizado é estéril. O solvente pode conter um excipiente que melhora a estabilidade ou outro componente farmacológico do pó ou solução reconstituída, preparada a partir do pó. Excipientes que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a, dextrose, sorbitol, frutose, xarope de milho, xilitol, glicerina, glicose, sacarose ou outro agente adequado. O solvente também pode conter um tampão, tal como citrato, fosfato de sódio ou potássio ou outro tampão conhecido dos versados na técnica em, em uma modalidade, cerca de pH neutro. A filtração estéril subsequente da solução seguida por liofilização sob condições padrão conhecidas dos versados na técnica fornece a formulação desejada. Em uma modalidade, a solução resultante será colocada em frascos para liofilização. Cada frasco conterá uma dosagem única ou dosagens múltiplas do composto. O pó liofilizado pode ser armazenado em condições apropriadas, como a cerca de 4°C até a temperatura ambiente.
[00340] A reconstituição deste pó liofilizado com água para injeção fornece uma formulação para uso em administração parenteral. Para reconstituição, o pó liofilizado é adicionado a água estéril ou outro transportador adequado. A quantidade exata depende do composto selecionado. Esse montante pode ser determinado empiricamente.
[00341] Um anticorpo também pode, por exemplo, ser formulado em lipossomas. Os lipossomas contendo a molécula de interesse são preparados por métodos conhecidos na técnica, tais como descritos em Epstein et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688; Hwang et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030; e Patentes US 4,485,045 e 4,544,545. Lipossomas com tempo de circulação melhorado são divulgados na Patente US No. 5,013,556. Em uma modalidade, as suspensões de lipossomas também podem ser adequadas como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos dos especialistas na técnica. Por exemplo, as formulações de lipossomas podem ser preparadas como descrito na Patente US No. 4,522,811.
Resumidamente, lipossomas tais como vesículas multilamelares (MLV's) podem ser formados por secagem de fosfatidil colina de ovo e fosfatidilserina (proporção molar de 7:3) no interior de um frasco. Uma solução de um composto compreendendo um anticorpo aqui descrito em solução salina tamponada com fosfato sem cátions divalentes (PBS) é adicionada e o frasco agitado até que o filme lipídico seja disperso. As vesículas resultantes são lavadas para remover o composto não encapsulado, sedimentadas por centrifugação e, em seguida, ressuspensas em PBS.
[00342] Um anticorpo também pode ser inserido em uma microcápsula preparada, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsula de gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de distribuição de fármaco coloidal (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA.
[00343] Também podem ser preparadas preparações de liberação sustentada. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o antagonista, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas.
Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) ou poli (álcool vinílico)), polilactídeos (Patente US No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutâmico e etil-L- glutamato, etileno- acetato de vinil não degradável, copolímeros degradáveis de ácido lático-ácido glicólico, como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e poli-D-(-)-3-ácido hidroxibutírico. Enquanto polímeros como etileno-acetato de vinila e ácido lático-ácido glicólico permitem a liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos. Quando encapsulados, os anticorpos permanecem no corpo por um longo tempo, eles podem desnaturar ou agregar como resultado da exposição à umidade a 37ºC, resultando em uma perda de atividade biológica e possíveis alterações na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser planejadas para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação for descoberto como sendo a formação da ligação S--S intermolecular através do intercâmbio tio-dissulfeto, a estabilização pode ser alcançada modificando os resíduos sulfidrila, liofilizando a partir de soluções ácidas, controlando o teor de umidade, usando aditivos apropriados e desenvolvendo matriz polimérica específica composições.
[00344] Os anticorpos e outras composições aqui fornecidos também podem ser formulados para serem direcionados a um determinado tecido, receptor ou outra área do corpo do indivíduo a ser tratado. Muitos desses métodos de direcionamento são bem conhecidos dos versados na técnica. Todos esses métodos de direcionamento são contemplados neste documento para uso nas presentes composições. Para exemplos não limitativos de métodos de direcionamento, consulte, por exemplo, Patentes 6,316,652, 6,274,552, 6,271,359, 6,253,872, 6,139,865, 6,131,570, 6,120,751, 6,071,495, 6,060,082, 6,048,736, 6,039,975, 6,004,534, 5,985,307, 5,972,366, 5,900,252, 5,840,674, 5,759,542 e 5,709,874.
[00345] As composições a serem utilizadas para administração in vivo podem ser estéreis. Isto é facilmente conseguido por filtração através de, por exemplo, membranas de filtração estéreis.
[00346] Em uma modalidade específica, os ácidos nucleicos que compreendem sequências que codificam um anticorpo aqui descrito são administrados a um indivíduo por meio de terapia gênica.
Terapia gênica se refere à terapia realizada pela administração a um indivíduo de um ácido nucleico expresso ou expressável. Estão englobados neste documento qualquer um dos métodos para terapia gênica disponíveis na técnica. Para uma revisão geral dos métodos de terapia genética, ver Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy
12: 488-505; Wu e Wu, 1991, Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mulligan, 1993, Science 260: 926-932; e Morgan e Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; maio de 1993, TIBTECH 11 (5): 155-215. Para uma revisão dos métodos de entrega de transgenes que codificam anticorpos, ver, por exemplo, Deal, 2015, Curr. Opin. Immunol. Agosto de 2015, 35: 113-22; Deal, 2015, Curr Opin HIV AIDS. Maio de 2015, 10 (3): 190-7; Marschall, 2015, MAbs. 7 (6): 1010-35. Em uma modalidade específica, um mRNA que codifica um anticorpo aqui descrito é administrado a um indivíduo. As técnicas conhecidas por uma pessoa versada na técnica podem ser usadas para administrar um mRNA que codifica um anticorpo a um indivíduo. Para métodos de entrega de anticorpos que codificam mRNA, ver, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente US No. US20130244282A1; Publicação do Pedido de Patente US 2016/0158354 A1; e o Pedido de Patente Internacional No. WO2016/014846 A1, cada um dos quais é incorporado aqui por referência na sua totalidade. Métodos comumente conhecidos na técnica de tecnologia de DNA recombinante que podem ser usados são descritos em Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); e Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).
5.7.2 Composições Polipeptídicas NS1
[00347] Em outro aspecto, são fornecidas aqui composições (por exemplo, composições farmacêuticas, tais como composições imunogênicas, por exemplo, vacinas) compreendendo um polipeptídeo NS1 aqui descrito. Em uma modalidade específica, é fornecida aqui uma composição (por exemplo, composições farmacêuticas, tais como composições imunogênicas, por exemplo, vacinas) compreendendo um polipeptídeo NS1 aqui descrito e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas (por exemplo, composições imunogênicas, como por exemplo, vacinas) incluem um ou mais adjuvantes.
[00348] Em uma modalidade específica, as composições farmacêuticas (por exemplo, composições imunogênicas, como por exemplo, vacinas) são formuladas para serem adequadas para a via de administração pretendida a um indivíduo, incluindo qualquer via de administração aqui descrita. Por exemplo, a composição farmacêutica (por exemplo, composições imunogênicas, como por exemplo, vacinas) pode ser formulada para ser adequada para administração parenteral, intradérmica, transdérmica e intraperitoneal. Em uma modalidade específica, as composições farmacêuticas (por exemplo, composições imunogênicas, tais como, por exemplo, vacinas) podem ser formuladas para administração intravenosa, intraperitoneal, intranasal, intratraqueal, subcutânea, intramuscular, tópica, intradérmica, transdérmica ou pulmonar.
[00349] Em certas modalidades, as composições imunogênicas aqui descritas incluem uma sequência de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos (por exemplo, um RNA, um mRNA ou cDNA) que codifica um polipeptídeo NS1. Essas composições podem ser formuladas como uma nanopartícula (por exemplo, uma nanopartícula de lipídeo) encapsulando ou contendo tal polinucleotídeo. Ver, por exemplo, Richner et al., 2017, Cell 168: 1114 e Richner et al., 2017, Cell 170 (2): 273 para exemplos de tais formulações para entrega de mRNA.
[00350] Em modalidades específicas, as composições imunogênicas aqui descritas são formulações monovalentes. Em outras modalidades, as composições imunogênicas aqui descritas são formulações multivalentes.
[00351] Em algumas modalidades, são fornecidas aqui composições imunogênicas compreendendo um vírus vivo contendo um polipeptídeo NS1 aqui descrito. Em certas modalidades, são fornecidas aqui composições imunogênicas compreendendo um vírus vivo que codifica um NS1 aqui descrito. Em algumas modalidades, são fornecidas aqui composições imunogênicas compreendendo uma codificação de vírus vivo e contendo um polipeptídeo NS1 aqui descrito. O vírus vivo pode ser um paramixovírus (por exemplo, NDV), um adenovírus, um AAV, vírus vaccinina, retrovírus, vírus da hepatite, poxvírus, vírus do herpes, rabdovírus (por exemplo, VSV) ou outro vírus descrito ou conhecido por uma pessoa versada na técnica, por exemplo, na Seção 5.9 da Publicação do Pedido de Patente
Internacional No. WO 2016/118937, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[00352] Em algumas modalidades, são fornecidas aqui composições imunogênicas compreendendo um vírus inativado contendo um polipeptídeo NS1 aqui descrito. Essa composição imunogênica pode ser incluída como um adjuvante. Ver, por exemplo, a Seção 5.15.3 da Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 2016/118937, que é incorporada neste documento por referência em sua totalidade, para uma discussão sobre os tipos de vírus inativados e composições que os compreendem.
[00353] Em certas modalidades, uma composição imunogênica compreendendo um polipeptídeo NS1 é vacina dividida. A vacina dividida pode ser incluída como um adjuvante. Consulte, por exemplo, a Seção 5.15.4 da Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 2016/118937, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade, para uma discussão de exemplos de vacinas de subunidade.
[00354] Em certas modalidades, são fornecidas vacinas de subunidade compreendendo um polipeptídeo NS1 aqui descrito. As vacinas podem ser incluídas em um ou mais adjuvantes. Consulte, por exemplo, a Seção 5.15.1 da Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 2016/118937, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade, para uma discussão de exemplos de vacinas de subunidade.
[00355] Em certas modalidades, as composições aqui descritas incluem ou são administradas em combinação com um adjuvante. O adjuvante para administração em combinação com uma composição aqui descrita pode ser administrado antes, concomitantemente ou após a administração da referida composição. Em algumas modalidades, o termo "adjuvante" se refere a um composto que, quando administrado em conjunto com ou como parte de uma composição aqui descrita, melhora e/ou aumenta a resposta imune a um polipeptídeo NS1, mas quando o composto é administrado sozinho, não gera uma resposta imune ao polipeptídeo. Em algumas modalidades, o adjuvante gera uma resposta imune ao polipeptídeo e não produz uma alergia ou outra reação adversa. Os adjuvantes podem aumentar uma resposta imune por vários mecanismos, incluindo, por exemplo, recrutamento de linfócitos, estimulação de células B e/ou T e estimulação de macrófagos.
[00356] Em certas modalidades, um adjuvante aumenta a resposta intrínseca ao polipeptídeo NS1 sem causar alterações conformacionais no polipeptídeo que afetam a forma qualitativa da resposta. Exemplos específicos de adjuvantes incluem, mas não estão limitados aos sais de alumínio (alúmen) (tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio e sulfato de alumínio), monofosforil lipídio A De-O-acilado (MPL) (ver GB 2220211), MF59 (Novartis), AS01 (GlaxoSmithKline), AS03 (GlaxoSmithKline), AS04 (GlaxoSmithKline), AddaVax, compostos de imidazopiridina (ver
Pedido Internacional No. PCT/US2007/064857, publicado como Publicação Internacional No. WO2007/109812), compostos de imidazoquinoxalina (ver publicação internacional No.
WO2007/109812), compostos de imidazoquinoxalina, Pedido Internacional No. PCT/US2007/064858, publicado como Publicação Internacional No. WO2007/109813) e saponinas, tais como QS21 (ver Kensil et al., In Vaccine Design: The Subunit e Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); Patente US No.
5.057.540). Em algumas modalidades, o adjuvante é o adjuvante de Freund (completo ou incompleto). Outros adjuvantes são emulsões de óleo em água (tais como esqualeno ou óleo de amendoim), opcionalmente em combinação com imunoestimulantes, tais como monofosforil lipídeo A (ver Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Outro adjuvante é CpG (Bioworld Today, 15 de novembro de 1998). Esses adjuvantes podem ser usados com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos, como MPL ou 3-DMP, QS21, aminoácidos poliméricos ou monoméricos, como ácido poliglutâmico ou polilisina, ou outros agentes imunopotenciadores.
Em uma modalidade específica, o adjuvante é um descrito na Seção 6, infra.
[00357] Em uma modalidade específica, um polipeptídeo NS1 aqui descrito é encapsulado em um lipossoma ou nanopartícula aqui descrito ou conhecido na técnica. Para exemplos de lipossomas, consulte a Seção 5.7.1, supra. Em certas modalidades, uma composição farmacêutica (por exemplo, uma composição imunogênica) inclui um polipeptídeo NS1 aqui descrito encapsulado por um lipossoma ou nanopartícula. Em outra modalidade específica, um polipeptídeo NS1 aqui descrito pode ser incluído em uma preparação de liberação sustentada. Consulte a Seção 5.7.1, supra, para exemplos de preparações de liberação sustentada. Em certas modalidades, uma composição farmacêutica (por exemplo, uma composição imunogênica) inclui uma preparação de liberação sustentada de um polipeptídeo NS1 aqui descrito.
5.8 USOS PROFILÁTICOS E TERAPÊUTICOS
5.8.1 Imunização Ativa
[00358] Em outro aspecto, são aqui fornecidos métodos para induzir uma imune em um indivíduo utilizando um polipeptídeo NS1 aqui descrito, uma sequência de polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifico tal polipeptídeo (exemplo tal polipeptídeo) um vetor viral, ou uma bactéria) contendo, expressando ou tanto contendo como expressando tal ou tais polipeptídeos, ou uma composição aqui composta. Em uma modalidade específica, um método para induzir uma resposta imune a um vírus da Zika NS1 em um indivíduo incluiu a administração um indivíduo na necessidade de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo NS1 aqui descrito, ou uma composição do imunogênica. Em outra modalidade, um método para induzir uma resposta imune a um vírus da Zika NS1 em um indivíduo compreendeu a administração um indivíduo em necessidade de uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo (por exemplo, mRNA ou DNA) compreendendo uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo NS1 descrito aqui, ou uma composição imunogênica deste.
O polinucleotídeo pode ser administrado usando uma técnica de terapia genética conhecida por uma pessoa versada na técnica ou aqui descrita.
Em uma modalidade específica, o polinucleotídeo pode ser administrado, por exemplo, como um mRNA usando técnicas para aqueles versados na técnica, incluindo, como descrito na, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente US 2016/0158354 e
Richner., 2017, Cell 168: 1114 para exemplos de tais formulações para entrega de mRNA.
Em outra modalidade, um método para induzir uma resposta imune a um vírus da Zika NS1 em um indivíduo compreende a administração em um indivíduo na necessidade de uma quantidade eficaz de um vetor viral contendo, codificando ou tanto contendo como codificando um polipeptídeo NS1 do vírus da Zika aqui descrito, ou uma composição imunogênica deste.
Os métodos necessários neste parágrafo podem ainda ser compreendidos administrando outra terapia (por exemplo, uma terapia avançada na
Seção 5.8.3, infra). A outra terapia pode ser administrada antes,
concomitantemente ou após a administração de um polipeptídeo NS1 aqui descrita, um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, uma sequência de RNA, tal como um RNA autorreplicante) codificando um ou mais polipeptídeos, um vetores
(por exemplo, um vetor viral ou uma bactéria) contendo, expressando ou tanto contendo como expressando tal ou tais polipeptídeos, ou uma composição aqui descrita.
[00359] Em outro aspecto, são aqui fornecidos métodos para imunizar contra o vírus da Zika em um indivíduo utilizando um polipeptídeo NS1 aqui descrito, uma sequência de polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica tal como uma ou mais polipeptídeos, um vetor (por exemplo, um vetor viral, ou uma bactéria) contendo ou expressando tal ou tais polipeptídeo(s), ou uma composição descrita aqui. Em uma modalidade específica, um método para imunizar contra o vírus da Zika inclui administrar a um indivíduo na necessidade deste uma quantidade eficaz de um polipeptídeo NS1 aqui descrito, ou uma composição imunogênica deste. Em outra modalidade, um método para imunizar contra o vírus da Zika inclui administrar a um indivíduo na necessidade deste uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo (por exemplo, mRNA ou DNA) compreendendo uma quantidade eficaz de um polipeptídeo NS1 descrito aqui ou uma composição imunogênica deste. O polinucleotídeo pode ser administrado usando uma técnica de terapia genética conhecida por uma pessoa versada na técnica ou aqui descrita. Em uma modalidade específica, o polinucleotídeo pode ser administrado, por exemplo, como um mRNA usando técnicas de aplicação por uma pessoa versada na técnica, incluindo, como descrito na, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente US
2016/0158354, e Richner et al. 2017, Cell 168: 1114 para exemplos de tais formulações para entrega de mRNA. Em outra modalidade, um método para imunizar contra o vírus da Zika inclui administrar a um indivíduo na necessidade deste uma quantidade eficaz de um vetor viral contendo, codificando ou tanto contendo como codificando um polipeptídeo NS1 do vírus da Zika aqui descrito, ou uma composição imunogênica deste. Os métodos necessários neste parágrafo podem ainda ser compreendidos administrando outra terapia (por exemplo, uma terapia avançada na Seção 5.8.3, infra). A outra terapia pode ser administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um polipeptídeo NS1 aqui descrito, um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica tal ou tais polipeptídeos, um vetor (por exemplo, um vetor viral ou uma bactéria), contendo, expressando ou tanto contendo como expressando tal ou tais polipeptídeos, ou uma composição aqui descrita.
[00360] Em outra modalidade, são aqui fornecidos regimes de imunização envolvendo uma primeira imunização (por exemplo, priming) com uma composição imunogênica (por exemplo, uma vacina) aqui descrita seguida por uma, duas ou mais imunizações adicionais (por exemplo, reforços) com uma composição imunogênica (por exemplo, uma vacina). Em uma modalidade específica, a composição imunogênica (por exemplo, uma vacina) usada na primeira imunização é o mesmo tipo de uma composição imunogênica (por exemplo, uma vacina) usada em uma, duas ou mais imunizações adicionais. Por exemplo, se a composição imunogênica (por exemplo, vacina) usada na primeira imunização for formulação de vacina de polipeptídeo NS1, a composição imunogênica (por exemplo, vacina) usada para uma, duas ou mais imunizações adicionais pode ser o mesmo tipo de formulação de vacina, isto é, formulação de polipeptídeo de vacina NS1. Em outras modalidades específicas, a composição imunogênica (por exemplo, vacina) usada na primeira imunização é diferente do tipo de composição imunogênica (por exemplo, vacina) usada em uma, duas ou mais imunizações adicionais. Por exemplo, se a composição imunogênica (por exemplo, vacina) usada na primeira imunização for uma formulação de vacina baseada em ácido nucleico, a composição imunogênica (por exemplo, vacina) usada para uma, duas ou mais imunizações adicionais pode ser uma formulação de vacina polipeptídica NS1. Em uma modalidade específica, um regime de imunização, como descrito na Seção 6, infra, é usado para imunizar um indivíduo contra o vírus da Zika.
[00361] Em outro aspecto, são aqui fornecidos métodos para prevenir a doença pelo vírus da Zika em um indivíduo utilizando um polipeptídeo NS1 aqui descrito, uma sequência de polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica tal ou tais polipeptídeos, um vetor (por exemplo, um vetor viral ou uma bactéria) contendo, expressando ou tanto contendo como expressando tal ou tais polipeptídeos, ou uma composição aqui descrita. Em uma modalidade específica, um método para prevenir a doença pelo vírus da Zika inclui administrar a um indivíduo na necessidade deste uma quantidade eficaz de um polipeptídeo NS1 aqui descrito, ou uma composição imunogênica deste.
Em outra modalidade, um método para prevenir a doença pelo vírus da Zika inclui administrar a um indivíduo na necessidade deste uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo (por exemplo, mRNA ou DNA) compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo NS1 aqui descrito, ou uma composição imunogênica deste.
O polinucleotídeo pode ser administrado usando uma técnica de terapia genética conhecida por uma pessoa versada na técnica ou aqui descrita.
Em uma modalidade específica, o polinucleotídeo pode ser administrado, por exemplo, como um mRNA usando técnicas conhecidas por uma pessoa versada na técnica, incluindo, como descrito na,
por exemplo, Publicação de Pedido de Patente US 2016/0158354 e
Richner et al., 2017, Cell 168: 1114 para exemplos de tais formulações para entrega de mRNA.
Em outra modalidade, um método para prevenir a doença pelo vírus da Zika incluindo administrar a um indivíduo na necessidade deste uma quantidade eficaz de um vetor viral contendo, codificando ou tanto contendo como codificando um polipeptídeo NS1 do vírus da Zika aqui descrito, ou uma composição imunogênica deste.
Os métodos descritos neste parágrafo podem ainda ser compreendidos administrando outra terapia (por exemplo,
uma terapia descrita na Seção 5.8.3, infra). A outra terapia pode ser administrada antes, simultaneamente ou após a administração de um polipeptídeo NS1 aqui descrito, um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico (sequência de RNA, tal como um replicon de RNA) que codifica tal ou tais polipeptídeos, um vetor (por exemplo, um vetor viral ou uma bactéria) contendo, expressando ou tanto contendo como expressando tal ou tais polipeptídeos, ou uma composição aqui descrita.
[00362] A quantidade de um polipeptídeo NS1 aqui descrito, um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica tal ou tais polipeptídeos, um vetor (por exemplo, um vetor viral ou uma bactéria) contendo, expressando ou tanto contendo como expressando tal ou tais polipeptídeos), ou uma composição aqui descrita que será eficaz na prevenção de uma doença pelo vírus da Zika dependerá da natureza da doença e pode ser determinada por técnicas clínicas padrão.
[00363] A dose precisa a ser empregada na formulação também dependerá da via de administração e da gravidade da infecção ou doença por ela causada, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do médico e das circunstâncias de cada indivíduo. Por exemplo, as doses eficazes também podem variar dependendo do meio de administração, local alvo, estado fisiológico do paciente (incluindo idade, peso corporal, saúde), se o paciente é humano ou animal, outros medicamentos administrados e se o tratamento é profilático ou terapêutico. Normalmente, o paciente é um humano,
mas mamíferos não humanos, incluindo mamíferos transgênicos, também podem ser tratados. As dosagens de tratamento são tituladas de maneira ideal para otimizar a segurança e a eficácia.
[00364] Tal como aqui utilizado, o termo "quantidade eficaz" no contexto da administração de uma terapia a um indivíduo se refere à quantidade de uma terapia que pode ter efeito(s) profilático(s), efeito(s) terapêutico(s) ou efeito(s) profilático(s) e terapêutico(s). Em certas modalidades, uma "quantidade eficaz" no contexto da administração de uma terapia a um indivíduo se refere à quantidade de uma terapia que é suficiente para atingir um, dois, três, quatro ou mais dos seguintes efeitos: (i) reduzir ou melhorar a gravidade de uma infecção, doença ou sintoma pelo vírus da Zika a ele associado; (ii) reduzir a duração de uma infecção, doença ou sintoma pelo vírus da Zika associado a ele; (iii) prevenir a progressão de uma infecção, doença ou sintoma pelo vírus da Zika a ele associado; (iv) causar a regressão de uma infecção, doença ou sintoma pelo vírus da Zika associado a ele; (v) prevenir o desenvolvimento ou início de uma infecção, doença ou sintoma pelo vírus da Zika a ele associado; (vi) prevenir a recorrência de uma infecção, doença ou sintoma pelo vírus da Zika associado a ele; (vii) reduzir ou prevenir a propagação do vírus da Zika de uma célula para outra célula, de um tecido para outro tecido ou de um órgão para outro órgão; (viii) prevenir ou reduzir a propagação do vírus da Zika de um indivíduo para outro; (ix) reduzir a falência de órgãos associada a uma infecção pelo vírus da Zika; (x) reduzir a hospitalização de um indivíduo; (xi) reduzir o tempo de hospitalização; (xii) aumentar a sobrevivência de um indivíduo com infecção pelo vírus da Zika ou doença associada a ele; (xiii) eliminar uma infecção pelo vírus da Zika ou doença associada a ele; (xiv) inibir ou reduzir a replicação do vírus da Zika; (xv) inibir ou reduzir a entrada de um vírus da Zika em uma ou mais células hospedeiras; (xvi) inibir ou reduzir a replicação do genoma do vírus da Zika; (xvii) inibir ou reduzir a síntese de proteínas do vírus da Zika; (xviii) inibir ou reduzir a formação de partículas do vírus da Zika; (xix) inibir ou reduzir a liberação de partículas do vírus da Zika de uma ou mais células hospedeiras; (xx) reduzir o título do vírus da Zika; e/ou (xxi) aumentar ou melhorar os efeitos profiláticos ou terapêuticos de outra terapia.
Em uma modalidade específica, a quantidade eficaz reduz os sintomas neurológicos associados a uma infecção pelo vírus da Zika. Em outra modalidade específica, a quantidade eficaz reduz a letalidade associada a uma infecção pelo vírus da Zika. Em outra modalidade específica, a quantidade eficaz limita a doença associada ou causada por uma infecção pelo vírus da Zika. Em outra modalidade específica, a quantidade eficaz evita a síndrome de Gullian-Barré.
Em outra modalidade específica, a quantidade eficaz evita a microcefalia em um bebê nascido de uma mulher grávida infectada com o vírus da Zika.
[00365] Em certas modalidades, a quantidade eficaz não resulta em proteção completa contra uma doença pelo vírus da Zika, mas resulta em um título mais baixo ou número reduzido de vírus da
Zika em comparação com um indivíduo não tratado com uma infecção pelo vírus da Zika.
Em certas modalidades, a quantidade eficaz resulta em 0,5 vezes, 1 vez, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes,
5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 15 vezes,
20 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 75 vezes, 100 vezes, 125 vezes, 150 vezes, 175 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 750 vezes, ou redução de 1.000 vezes ou maior no título de um vírus da
Zika em relação a um indivíduo não tratado com infecção pelo vírus da Zika.
Em algumas modalidades, a quantidade eficaz resulta em uma redução no título do vírus da Zika em relação a um indivíduo não tratado com uma infecção pelo vírus da Zika de aproximadamente
1 log ou mais, aproximadamente 2 logs ou mais, aproximadamente 3 logs ou mais, aproximadamente 4 logs ou mais , aproximadamente 5 logs ou mais, aproximadamente 6 logs ou mais, aproximadamente 7 logs ou mais, aproximadamente 8 logs ou mais, aproximadamente 9 logs ou mais, aproximadamente 10 logs ou mais, 1 a 3 logs, 1 a 5 logs, 1 a 8 logs, 1 a 9 logs, 2 a 10 logs, 2 a 5 logs, 2 a 7 logs,
2 logs a 8 logs, 2 a 9 logs, 2 a 10 logs 3 a 5 logs, 3 a 7 logs,
3 a 8 logs, 3 a 9 logs, 4 a 6 logs, 4 a 8 logs, 4 a 9 logs, 5 a 6 logs, 5 a 7 logs, 5 a 8 logs, 5 a 9 logs, 6 a 7 logs, 6 a 8 logs,
6 a 9 logs, 7 a 8 logs, 7 a 9 logs ou 8 a 9 logs.
Os benefícios de uma redução no título, número ou carga total do vírus da Zika incluem, mas não estão limitados aos sintomas menos graves da infecção, aos sintomas da infecção e a uma redução na duração da doença associada à infecção.
[00366] Em certas modalidades, uma quantidade eficaz de uma terapia (por exemplo, uma composição da mesma) resulta em um título NS1 do vírus da Zika em uma amostra de sangue de um indivíduo administrado a quantidade eficaz 0,5 vezes a 10 vezes, 0,5 vezes a 4 vezes, 0,5 vezes a 3 vezes, 0,5 vezes a 2 vezes, 0,5 vezes, 1 vez, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes maior pós-imunização em relação ao título NS1 do antivírus da Zika em uma amostra de sangue do indivíduo antes da imunização. Em certas modalidades, uma quantidade eficaz de uma terapia (por exemplo, uma composição da mesma) resulta em um título de haste NS1 antivírus da Zika em uma amostra de sangue de um indivíduo administrado a quantidade eficaz 0,5 vezes a 10 vezes, 0,5 vezes a 4 vezes, 0,5 vezes a 3 vezes, 0,5 vezes a 2 vezes, 0,5 vezes, 1 vez, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes maior após imunização em relação ao título de haste NS1 do antivírus da Zika em uma amostra de sangue do indivíduo antes da imunização.
[00367] Em certas modalidades, é administrada a um indivíduo uma dose de 0,1 a 100 mg/kg (por exemplo, 1 a 15 mg/kg ou 10 a 15 mg/kg) de um polipeptídeo NS1 aqui descrito. Em algumas modalidades, é administrada a um indivíduo uma dose de 1 a 100 µg (por exemplo, 25 µg, 40 µg, 50 µg ou 75 µg) de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo NS1 aqui descrito ou um vetor de expressão compreendendo tal polinucleotídeo. Em certas modalidades, um vetor viral é administrado a um indivíduo em uma dose de 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 106, 5 x 106, ou 107 pfu.
[00368] Um polipeptídeo NS1 aqui descrito, um polinucleotídeo que codifica tal ou tais polipeptídeos, um vetor (por exemplo, um vetor viral ou uma bactéria) contendo, expressando ou tanto contendo como expressando tal ou tais polipeptídeos, ou uma composição aqui descrita pode ser administrado por qualquer via conhecida por uma pessoa versada na técnica ou aqui descrita. Por exemplo, pode ser administrado por via parenteral (por exemplo, por via intravenosa, intramuscular, subcutânea etc.), intranasal, transdérmica etc.
[00369] O indivíduo ao qual pode ser administrado um polipeptídeo NS1 aqui descrito, um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica tal ou tais polipeptídeos, um vetor (por exemplo, um vetor viral ou uma bactéria) contendo, expressando, ou tanto contendo como expressando tal ou tais polipeptídeos, ou uma composição aqui descrita inclui aqueles indivíduos aqui descritos (por exemplo, na Seção 5.8.3, infra). Em certas modalidades, o indivíduo é um animal não humano, como, por exemplo, um animal de estimação ou animal de fazenda (por exemplo,
uma vaca, porco, pássaro, cavalo ou cachorro). Em uma modalidade específica, o indivíduo é um humano.
Em outra modalidade, o indivíduo é um bebê humano, uma criança pequena, um adulto humano ou um ser humano idoso.
Em certas modalidades, um polipeptídeo NS1 aqui descrito, um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica tal ou tais polipeptídeos, um vetor
(por exemplo, um vetor viral ou uma bactéria) contendo, expressando ou tanto contendo como expressando tal ou tais polipeptídeos, ou uma composição aqui descrita pode não ser administrada a um indivíduo que é imunocompetente ou imunocomprometido.
Em algumas modalidades, um polipeptídeo NS1 aqui descrito, um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica tal ou tais polipeptídeos, um vetor (por exemplo, um vetor viral ou uma bactéria) contendo, expressando, ou tanto contendo como expressando tal ou tais polipeptídeos, ou uma composição aqui descrita pode não ser administrada a um indivíduo com uma infecção
(por exemplo, uma infecção bacteriana, fúngica ou viral) ou uma doença causada por uma infecção (por exemplo, uma infecção bacteriana, fúngica ou viral), incluindo, por exemplo, doença aguda e crônica causada por uma infecção (por exemplo, uma infecção bacteriana, fúngica ou viral). Em uma modalidade específica, um polipeptídeo NS1 aqui descrito, um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica tal ou tais polipeptídeos, um vetor (por exemplo, um vetor viral ou uma bactéria) contendo, expressando ou tanto contendo como expressando tal ou tais polipeptídeos, ou uma composição aqui descrita pode não ser administrado a uma mulher grávida.
[00370] Em uma modalidade específica, um polipeptídeo NS1 aqui descrito é usado para gerar anticorpos usando técnicas conhecidas por uma pessoa versada na técnica ou aqui descritas.
5.8.2 Imunização Passiva
[00371] Em um aspecto, são aqui fornecidos métodos para prevenir a doença pelo vírus da Zika, compreendendo a administração de um anticorpo aqui descrito. Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um método para prevenir a doença pelo vírus da Zika em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo aqui descrito. Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um método para prevenir a doença pelo vírus da Zika em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de um anticorpo aqui descrito. Em uma modalidade específica, o anticorpo é uma proteína ou um conjugado de proteína.
Em uma modalidade específica, o anticorpo é uma sequência polinucleotídica que codifica um anticorpo. Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um método para prevenir a doença pelo vírus da Zika em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo aqui descrito e outra terapia, tal como conhecido por uma pessoa versada na técnica ou aqui descrito (por exemplo, na Seção 5.8.3, infra). Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um método para prevenir a doença pelo vírus da Zika em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de um anticorpo aqui descrito e outra terapia, tal como conhecido por uma pessoa versada na técnica ou aqui descrito (por exemplo, na Seção 5.8.3, infra). Em uma modalidade particular, a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo ao indivíduo inibe ou reduz o desenvolvimento ou início de uma doença pelo vírus da Zika.
Em outra modalidade, a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo ao indivíduo inibe ou reduz o início, desenvolvimento e/ou gravidade de um sintoma do mesmo (por exemplo, febre, dor muscular, dor nas articulações, inflamação, erupção cutânea, dor de cabeça etc.) da doença pelo vírus da Zika.
Em outra modalidade, a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo inibe ou reduz a recorrência de uma doença pelo vírus da Zika ou um sintoma associado a ela.
Em uma modalidade específica, a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo reduz os sintomas neurológicos associados a uma infecção pelo vírus da Zika.
Em outra modalidade específica,
a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo reduz a letalidade associada a uma infecção pelo vírus da Zika.
Em outra modalidade específica, a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo limita a doença associada ou causada por uma infecção pelo vírus da Zika. Em outra modalidade específica, a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo evita a síndrome de Gullian- Barré. Em outra modalidade específica, a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo evita a microcefalia em um bebê nascido de uma mulher grávida infectada com o vírus da Zika. O anticorpo administrado à mulher grávida pode ser transferido para o feto.
[00372] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um método para prevenir a doença pelo vírus da Zika em um indivíduo, compreendendo: (a) administrar ao indivíduo uma dose de um polipeptídeo NS1 aqui descrito e (b) após um determinado período de tempo administrar uma dose de um anticorpo aqui descrito. Em algumas modalidades, o determinado período de tempo é de 2 a 3 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses ou 12 meses após a etapa(a). Em outra modalidade, é aqui fornecido um método para prevenir a doença pelo vírus da Zika em um indivíduo, compreendendo a administração de um anticorpo aqui descrito ao indivíduo, em que o indivíduo recebeu um polipeptídeo NS1 aqui descrito um determinado período de tempo antes da administração do anticorpo. Em algumas modalidades, o determinado período de tempo é de 2 a 3 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses ou 12 meses antes da administração do anticorpo.
[00373] Em modalidades específicas, a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo a um indivíduo resulta em um, dois, três, quatro ou mais dos seguintes: (i) a redução ou inibição da propagação do vírus da Zika de uma célula para outra célula; (ii) a redução ou inibição da propagação do vírus da Zika de um órgão ou tecido para outro órgão ou tecido; (iii) a redução ou inibição da propagação do vírus da Zika de uma região de um órgão ou tecido para outra região do órgão ou tecido (por exemplo, a redução da propagação do vírus da Zika do trato respiratório superior para o inferior); (iv) a prevenção da doença pelo vírus da Zika após a exposição a um vírus da Zika; (v) a redução ou inibição da infecção e/ou replicação do vírus da Zika; e/ou (vi) prevenção do início ou desenvolvimento de um ou mais sintomas associados à doença ou infecção pelo vírus da Zika.
[00374] Em outro aspecto, são aqui fornecidos métodos para o tratamento de uma infecção pelo vírus da Zika ou uma doença pelo vírus da Zika compreendendo a administração de um anticorpo aqui descrito. Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um método para tratar uma infecção por vírus da Zika ou uma doença por vírus da Zika em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo aqui descrito. Em outra modalidade específica, é fornecido neste documento um método para tratar uma infecção pelo vírus da Zika ou uma doença pelo vírus da Zika em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de um anticorpo aqui descrito. Em outra modalidade específica, é aqui fornecido um método para o tratamento de uma infecção pelo vírus da Zika ou uma doença pelo vírus da Zika que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo aqui descrito e outra terapia, tal como descrito ou conhecido por uma pessoa versada na técnica aqui (por exemplo, na Seção 5.8.3, infra). Em outra modalidade específica, é aqui fornecido um método para o tratamento de uma infecção pelo vírus da Zika ou uma doença pelo vírus da Zika em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de um anticorpo aqui descrito e outra terapia, tal como descrito ou conhecido por uma pessoa versada na técnica neste documento (por exemplo, na Seção 5.8.3, infra). Em uma modalidade particular, a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo ao indivíduo inibe ou reduz o desenvolvimento de uma doença pelo vírus da Zika. Em outra modalidade, a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo ao indivíduo inibe ou reduz o início, desenvolvimento e/ou gravidade de um sintoma do mesmo (por exemplo, febre, dor muscular, dor nas articulações, inflamação, erupção cutânea, dor de cabeça etc.) da doença pelo vírus da Zika.
Em outra modalidade, a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo inibe ou reduz a duração de uma doença pelo vírus da Zika ou um sintoma associado a ela. Em outra modalidade, a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo reduz a insuficiência de órgãos associada a uma infecção por vírus da Zika ou doença por vírus da Zika. Em outra modalidade, a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo reduz a hospitalização do indivíduo. Em outra modalidade, a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo reduz o tempo de hospitalização do indivíduo.
Em outra modalidade, a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo aumenta a sobrevida geral dos indivíduos com uma infecção pelo vírus da Zika ou uma doença associada a ela. Em outra modalidade, a administração de uma quantidade eficaz do anticorpo evita o início ou progressão de uma infecção secundária associada a uma infecção pelo vírus da Zika.
[00375] Em uma modalidade específica, a administração de um ou mais anticorpos a um indivíduo reduz a incidência de hospitalização em pelo menos 99%, pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 45%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 35%, pelo menos 30%, pelo menos 25%, pelo menos 20%, ou pelo menos 10% em relação à incidência de hospitalização na ausência de administração do(s) referido(s) anticorpo(s).
[00376] Em uma modalidade específica, a administração de um ou mais anticorpos a um indivíduo reduz a mortalidade em pelo menos 99%, pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos
50%, pelo menos 45%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 35%, pelo menos 30%, pelo menos 25%, pelo menos 20%, ou pelo menos pelo menos 10% em relação à mortalidade na ausência de administração do(s) referido(s) anticorpo(s).
[00377] Em certas modalidades, a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo aqui descrito a um indivíduo resulta em um, dois, três, quatro, cinco ou mais dos seguintes efeitos: (i) redução ou melhora na gravidade de um vírus da Zika infecção, uma doença pelo vírus da Zika ou um sintoma associado a ela; (ii) redução na duração de uma infecção pelo vírus da Zika, uma doença pelo vírus da Zika ou um sintoma associado a ela; (iii) prevenção da progressão de uma infecção pelo vírus da Zika, uma doença pelo vírus da Zika ou um sintoma associado a ela; (iv) regressão de uma infecção pelo vírus da Zika, uma doença pelo vírus da Zika ou um sintoma associado a ela; (v) prevenção do desenvolvimento ou início de uma infecção pelo vírus da Zika, uma doença pelo vírus da Zika ou um sintoma associado a ela; (vi) prevenção da recorrência de uma infecção pelo vírus da Zika, uma doença pelo vírus da Zika ou um sintoma associado a ela; (vii) redução ou prevenção da propagação de um vírus da Zika de uma célula para outra célula, de um tecido para outro tecido ou de um órgão para outro órgão; (viii) prevenção ou redução da propagação/transmissão do vírus da Zika de um indivíduo para outro; (ix) redução da falência de órgãos associada a uma infecção pelo vírus da Zika ou a uma doença pelo vírus da Zika; (x) redução na hospitalização de um indivíduo; (xi) redução do tempo de internação; (xii) um aumento na sobrevivência de um indivíduo com infecção por Zika ou uma doença associada a ela; (xiii) eliminação de uma infecção pelo vírus da Zika ou uma doença associada a ela; (xiv) inibição ou redução da replicação do vírus da Zika; (xv) inibição ou redução na ligação ou fusão de um vírus da Zika a uma(s) célula(s) hospedeira; (xvi) inibição ou redução da entrada de um vírus da Zika em uma(s) célula(s) hospedeira; (xvii) inibição ou redução da replicação do genoma do vírus da Zika; (xviii) inibição ou redução na síntese de proteínas do vírus da Zika; (xix) inibição ou redução na formação de partículas do vírus da Zika; (xx) inibição ou redução na liberação de partículas do vírus da Zika de uma(s) célula(s) hospedeira; (xxi) redução no título do vírus da Zika; (xxii) a redução no número de sintomas associados a uma infecção pelo vírus da Zika ou a uma doença pelo vírus da Zika; (xxiii) intensificação, melhoria, suplementação, complementação ou aumento dos efeitos profiláticos ou terapêuticos de outra terapia; e/ou (xxiv) prevenção do início ou progressão de uma infecção secundária associada a uma infecção pelo vírus da Zika.
[00378] Em uma modalidade específica, a administração de um ou mais anticorpos resulta na redução de cerca de 1 vez, cerca de 1,5 vezes, cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 4 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 8 vezes, cerca de 10 vezes, cerca de 15 vezes,
cerca de 20 vezes, cerca de 25 vezes, cerca de 30 vezes, cerca de 35 vezes, cerca de 40 vezes, cerca de 45 vezes, cerca de 50 vezes, cerca de 55 vezes, cerca de 60 vezes, cerca de 65 vezes, cerca de 70 vezes, cerca de 75 vezes, cerca de 80 vezes, cerca de 85 vezes, cerca de 90 vezes, cerca de 95 vezes, cerca de 100 vezes, cerca de 105 vezes, cerca de 110 vezes, cerca de 115 vezes, cerca de 120 vezes, cerca de 125 vezes ou mais no título do vírus da Zika no indivíduo. A redução de vezes no título do vírus da Zika pode ser comparada a um controle negativo, em comparação com outro tratamento ou em comparação com o título no paciente antes da administração do anticorpo.
[00379] Em uma modalidade específica, a administração de um ou mais anticorpos resulta em uma redução de aproximadamente 1 log ou mais, aproximadamente 2 logs ou mais, aproximadamente 3 logs ou mais, 4 logs ou mais, aproximadamente 5 logs ou mais, aproximadamente 6 logs ou mais, aproximadamente 7 logs ou mais, aproximadamente 8 logs ou mais, aproximadamente 9 logs ou mais, aproximadamente 10 logs ou mais, 1 a 5 logs, 2 a 10 logs, 2 a 5 logs ou 2 a 10 logs no título do vírus da Zika no assunto. A redução log no título do vírus da Zika pode ser em comparação com um controle negativo (por exemplo, PBS ou um anticorpo de controle negativo), em comparação com outro tratamento ou em comparação com o título no paciente antes da administração do anticorpo.
[00380] Em uma modalidade específica, a administração de um ou mais anticorpos inibe ou reduz a infecção pelo vírus da Zika de um indivíduo em pelo menos 99%, pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 45%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 35%, pelo menos 30%, pelo menos 25%, pelo menos 20%, ou pelo menos 10% em relação à infecção pelo vírus da Zika de um indivíduo na ausência do(s) referido(s) anticorpo(s) ou na presença de um controle negativo (por exemplo, PBS ou um anticorpo de controle negativo) em um ensaio conhecido por um especialista na técnica ou aqui descrito.
[00381] Em uma modalidade específica, a administração de um ou mais anticorpos inibe ou reduz a propagação do vírus da Zika em um indivíduo em pelo menos 99%, pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, em pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 45%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 35%, pelo menos 30%, pelo menos 25%, pelo menos 20%, ou pelo menos 10% em relação à propagação do vírus da Zika em um indivíduo na ausência do(s) referido(s) anticorpo(s) ou na presença de um controle negativo (por exemplo, PBS ou um anticorpo de controle negativo) em um ensaio conhecido por um especialista na técnica ou aqui descrito.
[00382] Em uma modalidade específica, a administração de um ou mais anticorpos a um indivíduo reduz o número e/ou a frequência dos sintomas da doença ou infecção pelo vírus da Zika no indivíduo (exemplos de sintomas da doença pelo vírus da Zika incluem, mas não estão limitados a, dores no corpo (especialmente nas articulações e na garganta), febre, náuseas, dores de cabeça, olhos irritados, fadiga, dor de garganta, olhos ou pele avermelhados e dor abdominal).
[00383] Um ou mais anticorpos podem ser administrados sozinhos ou em combinação com outro/outro tipo de terapia conhecida na técnica para reduzir a infecção pelo vírus da Zika, para reduzir os títulos do vírus da Zika em um indivíduo e/ou para reduzir a disseminação do vírus da Zika entre os indivíduos.
[00384] Um ou mais dos anticorpos aqui descritos podem ser usados localmente ou sistemicamente no corpo como um agente profilático ou terapêutico.
5.8.2.1 Vias de administração e dosagens
[00385] Um anticorpo (por exemplo, um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) ou composição aqui descrita pode ser entregue a um indivíduo por uma variedade de vias, incluindo qualquer via aqui descrita. Estes incluem, mas não estão limitados a, vias intratraqueal, oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, intravenosa e subcutânea. Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito é administrado a um indivíduo por via subcutânea, intravenosa, intranasal ou intramuscular.
[00386] A quantidade de um anticorpo (por exemplo, um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) ou composição que será eficaz no tratamento e/ou prevenção de uma infecção pelo vírus da Zika ou uma doença pelo vírus da Zika dependerá da natureza da doença e pode ser determinado por técnicas clínicas padrão.
[00387] A dose precisa a ser empregada em uma composição também dependerá da via de administração e da gravidade da infecção ou doença por ela causada, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do médico e das circunstâncias de cada indivíduo. Por exemplo, as doses eficazes também podem variar dependendo do meio de administração, local alvo, estado fisiológico do paciente (incluindo idade, peso corporal, saúde), se o paciente é humano ou animal, outros medicamentos administrados e se o tratamento é profilático ou terapêutico. Normalmente, o paciente é um humano, mas mamíferos não humanos, incluindo mamíferos transgênicos, também podem ser tratados. As dosagens de tratamento são tituladas de maneira ideal para otimizar a segurança e a eficácia.
[00388] Em certas modalidades, um ensaio in vitro é empregado para ajudar a identificar os intervalos de dosagem ideais. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de resposta à dose derivadas de sistemas de teste in vitro ou em modelo animal.
[00389] Para a imunização passiva (por exemplo, com um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo), a dosagem varia de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais geralmente 0,01 a 5 mg/kg, do peso corporal do paciente. Por exemplo, as dosagens podem ser de 1 mg/kg de peso corporal, 10 mg/kg de peso corporal, ou dentro do intervalo de 1 a 10 mg/kg ou em outras palavras, 70 mg ou 700 mg ou dentro do intervalo de 70 a 700 mg, respectivamente, para um paciente de 70 kg. Em algumas modalidades, a dosagem administrada ao paciente é de cerca de 3 mg/kg a cerca de 60 mg/kg do peso corporal do paciente. Preferencialmente, a dosagem administrada a um paciente está entre 0,025 mg/kg e 20 mg/kg do peso corporal do paciente, mais preferencialmente 1 mg/kg a 15 mg/kg do peso corporal do paciente. Em uma modalidade específica, uma dose de um anticorpo administrado a um indivíduo é uma dose descrita na Seção 6, infra. Geralmente, os anticorpos humanos têm uma meia-vida mais longa dentro do corpo humano do que os anticorpos de outras espécies devido à resposta imune aos polipeptídeos estranhos. Assim, doses mais baixas de anticorpos humanos e administração menos frequente são frequentemente possíveis. Além disso, a dosagem e a frequência de administração dos anticorpos aqui descritos (por exemplo, um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) podem ser reduzidas aumentando a captação e a penetração nos tecidos dos anticorpos por modificações, como, por exemplo, lipidação.
[00390] Um regime de tratamento exemplar envolve a administração uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês ou uma vez a cada
3 a 6 meses por um período de um ano ou ao longo de vários anos, ou ao longo de vários intervalos de anos. Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos com diferentes especificidades de ligação são administrados simultaneamente a um indivíduo. Um anticorpo é geralmente administrado em várias ocasiões. Os intervalos entre as doses únicas podem ser semanais, mensais, a cada 3 meses, a cada 6 meses ou anualmente. Os intervalos também podem ser irregulares, conforme indicado pela medição dos níveis sanguíneos de anticorpos para o vírus da Zika NS1 no paciente.
[00391] Em algumas modalidades, o nível de plasma ou soro de um anticorpo aqui descrito em um paciente é medido antes da administração de uma dose subsequente de um anticorpo aqui descrito, ou uma composição do mesmo. O nível de plasma ou soro do anticorpo pode ser considerado na determinação da elegibilidade de um paciente para receber uma dose subsequente de um anticorpo aqui descrito. Por exemplo, um nível de plasma ou soro de um paciente de um anticorpo aqui descrito pode sugerir a não administração de um anticorpo aqui descrito; alternativamente, o nível de plasma de um paciente de um anticorpo aqui descrito pode sugerir a administração de um anticorpo aqui descrito em uma dosagem particular, em uma frequência particular e/ou por um determinado período de tempo.
[00392] Em certas modalidades, a via de administração para uma dose de um anticorpo aqui descrito, ou uma composição do mesmo a um paciente é intramuscular, intravenosa subcutânea ou uma combinação dos mesmos, mas outras vias aqui descritas também são aceitáveis. Cada dose pode ou não ser administrada por uma via de administração idêntica. Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito, ou composição do mesmo, pode ser administrado por meio de múltiplas vias de administração simultaneamente ou subsequentemente a outras doses do mesmo ou de um anticorpo diferente aqui descrito.
5.8.3 Terapias de combinação
[00393] Em várias modalidades, um anticorpo aqui descrito ou um ácido nucleico que codifica tal anticorpo pode ser administrado a um indivíduo em combinação com uma ou mais outras terapias (por exemplo, terapias antivirais ou imunomoduladoras). Em certas modalidades, um polipeptídeo NS1 aqui descrito ou um ácido nucleico que codifica tal polipeptídeo pode ser administrado a um indivíduo em combinação com uma ou mais outras terapias (por exemplo, terapias antivirais ou imunomoduladoras). Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica (por exemplo, uma composição imunogênica) aqui descrita pode ser administrada a um indivíduo em combinação com uma ou mais terapias. Uma ou mais outras terapias podem ser benéficas no tratamento ou prevenção de uma doença pelo vírus da Zika ou podem melhorar uma condição associada a uma doença pelo vírus da Zika. Uma ou mais outras terapias podem ser benéficas no tratamento ou prevenção de uma infecção pelo vírus da Zika ou uma doença associada a ela.
[00394] Em algumas modalidades, uma ou mais outras terapias que são medidas de suporte, como analgésicos, medicamentos antifebril ou terapias que aliviam ou ajudam na respiração. Exemplos específicos de medidas de suporte incluem umidificação do ar por um nebulizador ultrassônico, epinefrina racêmica aerolizada, um anti-inflamatório, dexametasona oral, fluidos intravenosos, intubação, redutores de febre (por exemplo, ibuprofeno, acetometafina) e terapia antibiótica e/ou antifúngica (ou seja, para prevenir ou tratar infecções bacterianas e/ou fúngicas secundárias).
[00395] Em algumas modalidades, um anticorpo aqui descrito ou uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo aqui descrito, ou uma composição do mesmo, é administrado a um indivíduo com um anticorpo que se liga a uma proteína de envelope do vírus da Zika. Em outras modalidades, um anticorpo aqui descrito ou uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo aqui descrito, ou uma composição do mesmo, não é administrado a um indivíduo com um anticorpo que se liga a uma proteína de envelope do vírus da Zika.
[00396] Em certas modalidades, as terapias são administradas com menos de 5 minutos de intervalo, menos de 30 minutos de intervalo, 1 hora de intervalo, cerca de 1 hora de intervalo, cerca de 1 a cerca de 2 horas de intervalo, cerca de 2 horas a cerca de 3 horas de intervalo, em cerca de 3 horas a cerca de 4 horas de intervalo, a cerca de 4 horas a cerca de 5 horas de intervalo, a cerca de 5 horas a cerca de 6 horas de intervalo, a cerca de 6 horas a cerca de 7 horas de intervalo, a cerca de 7 horas a cerca de 8 horas de intervalo, em cerca de 8 horas a cerca de 9 horas de intervalo, em cerca de 9 horas a cerca de 10 horas de intervalo, em cerca de 10 horas a cerca de 11 horas de intervalo, em cerca de 11 horas a cerca de 12 horas de intervalo, em cerca de 12 horas a 18 horas de intervalo, 18 horas a 24 horas de intervalo, 24 horas a 36 horas de intervalo, 36 horas a 48 horas de intervalo, 48 horas a 52 horas de intervalo, 52 horas a 60 horas de intervalo, 60 horas a 72 horas de intervalo, 72 horas a 84 horas de intervalo, 84 horas para 96 horas de intervalo, ou 96 horas a 120 horas parte. Em modalidades específicas, duas ou mais terapias são administradas na mesma visita do paciente. Em algumas modalidades, duas ou mais terapias são administradas simultaneamente. As duas ou mais terapias podem ser administradas na mesma composição ou em uma composição diferente. Além disso, as duas ou mais terapias podem ser administradas pela mesma via de administração de uma via de administração diferente.
[00397] Em uma modalidade específica, um anticorpo aqui descrito é administrado a um indivíduo em combinação com um anticorpo que se liga a uma proteína de envelope do vírus da Zika.
[00398] Em algumas modalidades, uma terapia de combinação incluiu a administração de um ou mais anticorpos aqui descritos.
Em algumas modalidades, uma terapia de combinação incluiu a administração de dois ou mais anticorpos aqui descritos. Em uma modalidade específica, uma terapia de combinação incluiu a administração do anticorpo AA12, EB9, GB5 ou FC12 e uma ou mais outras terapias.
5.8.4 Populações de Pacientes
[00399] Conforme usado neste documento, os termos "indivíduo" e "paciente" são usados indistintamente para se referir a um animal (por exemplo, pássaros, répteis e mamíferos).
[00400] Em uma modalidade, um paciente tratado de acordo com os métodos fornecidos neste documento é um indivíduo ingênuo, ou seja, um indivíduo que não tem uma doença causada por infecção pelo vírus da Zika ou não foi e não está atualmente infectado com uma infecção pelo vírus da Zika. Em outra modalidade, um paciente tratado de acordo com os métodos fornecidos neste documento é um indivíduo que está em risco de adquirir uma infecção pelo vírus da Zika. Em outra modalidade, um paciente tratado de acordo com os métodos fornecidos neste documento é um indivíduo ingênuo que está em risco de adquirir uma infecção pelo vírus da Zika. Em outra modalidade, um paciente tratado de acordo com os métodos fornecidos neste documento é um paciente que sofre ou espera-se que sofra de uma doença pelo vírus da Zika. Em outra modalidade, um paciente tratado de acordo com os métodos fornecidos neste documento é um paciente diagnosticado com uma infecção pelo vírus da Zika ou uma doença associada a ela. Em algumas modalidades, um paciente tratado de acordo com os métodos fornecidos neste documento é um paciente infectado com um vírus da Zika que não manifesta nenhum sintoma da doença pelo vírus da Zika.
[00401] Em outra modalidade, um paciente tratado de acordo com os métodos fornecidos neste documento é um paciente que apresenta um ou mais sintomas da doença pelo vírus da Zika. Os sintomas da doença pelo vírus da Zika incluem, mas não estão limitados a, dores no corpo (especialmente nas articulações, músculos e costas), febre, dores de cabeça, coceira, erupção na pele e olhos avermelhados. Em outra modalidade, um paciente tratado de acordo com os métodos fornecidos neste documento é um paciente com doença pelo vírus da Zika que não manifesta sintomas da doença que são graves o suficiente para exigir hospitalização.
[00402] Em algumas modalidades, um paciente tratado de acordo com os métodos aqui fornecidos é um animal. Em certas modalidades, o animal é um pássaro. Em certas modalidades, o animal é um mamífero, por exemplo, um cavalo, suíno, rato ou primata, de preferência um humano. Em uma modalidade específica, um indivíduo é um pássaro. Em outra modalidade, um indivíduo é um mamífero incluindo um não primata (por exemplo, um camelo, burro, zebra,
vaca, porco, cavalo, cabra, ovelha, gato, cachorro, rato e rato) e um primata (por exemplo, um macaco, chimpanzé e um humano).
[00403] Em uma modalidade específica, um paciente tratado de acordo com os métodos fornecidos neste documento é um humano. Em certas modalidades, um paciente tratado de acordo com os métodos aqui fornecidos é um bebê humano. Em algumas modalidades, um paciente tratado de acordo com os métodos aqui fornecidos é uma criança humana. Em certas modalidades, um paciente tratado de acordo com os métodos aqui fornecidos é uma criança humana. Em outras modalidades, um paciente tratado de acordo com os métodos aqui fornecidos é um adulto humano. Em algumas modalidades, um paciente tratado de acordo com os métodos aqui fornecidos é um ser humano idoso.
[00404] Conforme usado neste documento, o termo "humano adulto" se refere a um ser humano que tem 18 anos ou mais.
[00405] Conforme usado neste documento, o termo "criança humana" se refere a um ser humano que tem de 1 a 18 anos de idade. Conforme usado neste documento, o termo "bebê humano" se refere a um recém- nascido a um ser humano de 1 ano de idade. Conforme usado neste documento, o termo "criança pequena humana" se refere a um ser humano que tem de 1 a 3 anos de idade.
[00406] Em certas modalidades, um paciente tratado de acordo com os métodos fornecidos neste documento é uma paciente que está grávida. Em algumas modalidades, um paciente tratado de acordo com os métodos aqui fornecidos é um paciente é um feto.
[00407] Em algumas modalidades, um paciente tratado ou prevenido de acordo com os métodos fornecidos neste documento é qualquer indivíduo com risco aumentado de infecção pelo vírus da Zika ou doença resultante da infecção pelo vírus da Zika (por exemplo, um indivíduo imunocomprometido ou imunodeficiente).
5.9 USOS DIAGNÓSTICOS
[00408] Os anticorpos aqui descritos (por exemplo, um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) ou um conjugado de anticorpo aqui descrito podem ser usados para fins de diagnóstico para detectar um vírus da Zika, bem como detectar, diagnosticar ou monitorar uma infecção pelo vírus da Zika. Em modalidades específicas, os anticorpos (por exemplo, um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) ou conjugados de anticorpos aqui descritos podem ser usados para discriminar entre uma infecção pelo vírus da Zika e uma infecção pelo vírus Dengue.
[00409] São aqui fornecidos métodos para a detecção de uma infecção pelo vírus da Zika compreendendo: (a) ensaio da expressão de um vírus da Zika NS1 em uma amostra biológica (por exemplo, sangue, soro, plasma, células ou amostras de tecido) de um indivíduo usando um anticorpo descrito aqui (por exemplo, um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) ou um conjugado de anticorpo aqui descrito; e (b) comparar o nível do vírus da Zika NS1 com um nível de controle, por exemplo, os níveis em uma amostra biológica de um indivíduo não infectado com o vírus da Zika, em que um aumento no nível testado do vírus da Zika NS1 em comparação com o nível de controle do vírus da Zika NS1 é indicativo de uma infecção pelo vírus da Zika.
[00410] É aqui fornecido um ensaio de diagnóstico para o diagnóstico de uma infecção pelo vírus da Zika, que compreende: (a) análise do nível de um vírus da Zika NS1 em uma amostra biológica (por exemplo, sangue, soro, plasma, células ou amostras de tecido) de um indivíduo usando um anticorpo aqui descrito (por exemplo, um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) ou um conjugado de anticorpo aqui descrito; e (b) comparar o nível do vírus da Zika NS1 com um nível de controle, por exemplo, níveis em uma amostra biológica de um indivíduo não infectado com o vírus da Zika, em que um aumento no nível do vírus da Zika NS1 em comparação com o nível de controle do vírus da Zika NS1 é indicativo de uma infecção pelo vírus da Zika. Um diagnóstico mais definitivo de uma infecção pelo vírus da Zika pode permitir que os profissionais de saúde empreguem medidas preventivas ou tratamento agressivo mais cedo, evitando assim o desenvolvimento ou progressão da infecção pelo vírus da Zika.
[00411] Em uma modalidade específica, é aqui fornecido um método para detectar um vírus da Zika, compreendendo: (a) contatar uma amostra biológica (por exemplo, sangue, soro, plasma, células,
amostras de tecido, etc.) com o anticorpo descrito aqui ou um anticorpo conjugado aqui descrito; (b) detectar a ligação do anticorpo ou conjugado de anticorpo a um NS1 de um vírus da Zika,
em que o vírus da Zika é detectado se o nível de ligação do anticorpo ou conjugado de anticorpo a um NS1 de um vírus da Zika for maior do que o nível de ligação do anticorpo ou conjugado de anticorpo para células não infectadas com o vírus da Zika (por exemplo, células não infectadas com um vírus ou células infectadas com outro vírus, como o vírus da Dengue) ou uma amostra biológica não infectada com o vírus da Zika (por exemplo, uma amostra biológica não infectado com um vírus ou células infectadas com outro vírus, como o vírus da Dengue ou outro flavivírus). Em uma modalidade particular, a detecção é feita in vitro.
Em outras modalidades, a detecção é feita in vivo.
As técnicas conhecidas por uma pessoa versada na técnica podem ser usadas para detectar a ligação do anticorpo ou do conjugado do anticorpo ao NS1 de um vírus da Zika.
Amostra, compreendendo o contato de um anticorpo aqui descrito ou um conjugado de anticorpo aqui descrito com a amostra biológica e detectar a ligação do anticorpo ou conjugado de anticorpo a um NS1 do vírus da Zika.
Em outra modalidade específica, é aqui fornecido um método para diagnosticar uma infecção pelo vírus da Zika em um indivíduo, compreendendo o contato de um anticorpo aqui descrito ou um conjugado de anticorpo aqui descrito com uma amostra biológica do indivíduo e a detecção da ligação do anticorpo ou conjugado de anticorpo a um vírus da Zika NS1, em que um aumento na detecção da ligação do anticorpo ou conjugado de anticorpo na amostra biológica em relação à detecção de ligação do anticorpo ou conjugado de anticorpo a uma amostra de controle negativo indica que o indivíduo tem uma infecção pelo vírus da Zika. Em outra modalidade específica, é aqui fornecido um método para distinguir o vírus da Zika do vírus da Dengue em uma amostra biológica, compreendendo o contato de um anticorpo aqui descrito ou um conjugado de anticorpo aqui descrito com a amostra biológica e a detecção da ligação do anticorpo ou conjugado de anticorpo a um vírus da Zika NS1, em que um aumento na detecção da ligação do anticorpo ou conjugado do anticorpo em relação à detecção da ligação do anticorpo ou conjugado do anticorpo a uma amostra contendo o vírus da dengue indica a presença do vírus da Zika na amostra biológica. Em uma modalidade específica, a amostra biológica é uma amostra de sangue, soro, plasma, célula ou tecido.
[00412] Os anticorpos descritos neste documento (por exemplo, um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) podem ser usados para testar os níveis de NS1 do vírus da Zika em uma amostra biológica usando métodos imuno-histológicos clássicos como aqui descritos ou como conhecidos pelos versados na técnica (por exemplo, ver Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol.
101: 976-985; e Jalkanen et al., 1987, J. Cell. Biol. 105: 3087-
3096). Os métodos baseados em anticorpo úteis para detectar a expressão de proteínas incluem imunoensaios, tais como o ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) e o radioimunoensaio (RIA). Um anticorpo aqui descrito ou gerado de acordo com os métodos aqui descritos pode ser marcado com um marcador detectável ou um anticorpo secundário que se liga a tal anticorpo pode ser marcado com um marcador detectável. Os marcadores de ensaio de anticorpo adequados são conhecidos na técnica e incluem marcadores de enzima, tais como glicose oxidase; radioisótopos, tais como iodo (125I, 121I), carbono (14C), enxofre (35S), trítio (3H), índio (121In), e tecnécio (99Tc); etiquetas luminescentes, como luminol; e marcadores fluorescentes, tais como fluoresceína e rodamina e biotina. Consulte a Seção 5.2.2, supra, para exemplos de conjugados de anticorpos que podem ser úteis na detecção e diagnóstico da infecção pelo vírus da Zika.
[00413] Também é fornecida neste documento a detecção e o diagnóstico de uma infecção pelo vírus da Zika em um ser humano.
Em uma modalidade, o diagnóstico incluiu: a) administração (por exemplo, parenteral, intranasal, subcutânea ou intraperitoneal) a um indivíduo de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal marcado aqui descrito (por exemplo, um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo); b) aguardar um intervalo de tempo após a administração para permitir que o anticorpo rotulado se concentre preferencialmente em locais no indivíduo (por exemplo, as passagens nasais, pulmões, boca e ouvidos) onde o antígeno do vírus da Zika é expresso (e para a molécula rotulada não ligada a ser limpo para o nível de fundo); c) determinar o nível de fundo; e d) detectar o anticorpo marcado no indivíduo, de modo que a detecção do anticorpo marcado acima do nível de fundo indique que o indivíduo tem uma infecção pelo vírus da Zika ou um sintoma relacionado a ele. O nível de fundo pode ser determinado por vários métodos, incluindo a comparação da quantidade de molécula marcada detectada com um valor padrão previamente determinado para um sistema particular.
[00414] Será entendido na técnica que o tamanho do indivíduo e o sistema de imagem usado irão determinar a quantidade de fração de imagem necessária para produzir imagens de diagnóstico. No caso de uma porção de radioisótopo, para um indivíduo humano, a quantidade de radioatividade injetada variará normalmente de cerca de 5 a 20 milicuries de 99Tc. O anticorpo marcado irá então acumular-se preferencialmente na localização das células que contêm a proteína específica. A imagem tumoral in vivo é descrita em S.W. Burchiel et al., “Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and their Fragments.” (Capítulo 13 em Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel e B.A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982).
[00415] Dependendo de várias variáveis, incluindo o tipo de marcador usado e o modo de administração, o intervalo de tempo após a administração para permitir que o anticorpo marcado se concentre preferencialmente em locais no indivíduo e para que o anticorpo marcado não ligado seja limpo para o nível de fundo é de 6 a 48 horas, ou 6 a 24 horas ou 6 a 12 horas. Em outra modalidade, o intervalo de tempo após a administração é de 5 a 20 dias ou de 5 a 10 dias.
[00416] Em uma modalidade, o monitoramento de uma infecção pelo vírus da Zika é realizado repetindo o método para diagnosticar a infecção pelo vírus da Zika, por exemplo, um mês após o diagnóstico inicial, seis meses após o diagnóstico inicial, um ano após o diagnóstico inicial etc.
[00417] A presença da molécula marcada pode ser detectada no indivíduo usando métodos conhecidos na técnica para varredura in vivo. Esses métodos dependem do tipo de rótulo usado. Os artesãos qualificados serão capazes de determinar o método apropriado para detectar uma etiqueta particular. Métodos e dispositivos que podem ser usados nos métodos de diagnóstico fornecidos neste documento incluem, mas não estão limitados a, tomografia computadorizada (CT), varredura de corpo inteiro, como tomografia por emissão de posição (PET), imagem por ressonância magnética (MRI) e ultrassonografia.
[00418] Em uma modalidade específica, a molécula é marcada com um radioisótopo e é detectada no paciente usando um instrumento cirúrgico responsivo à radiação (Thurston et al., Patente US No.
5,441,050). Em outra modalidade, a molécula é marcada com um composto fluorescente e é detectada no paciente usando um instrumento de varredura responsivo à fluorescência. Em outra modalidade, a molécula é marcada com um metal emissor de pósitrons e é detectada no paciente usando tomografia de emissão de pósitrons. Em ainda outra modalidade, a molécula é marcada com um marcador paramagnético e é detectada em um paciente usando imagem de ressonância magnética (MRI).
[00419] Em uma modalidade específica, um anticorpo ou conjugado de anticorpo aqui descrito é usado em um imunoensaio para detectar vírus da Zika NS1. Os imunoensaios podem incluir Western blots, ELISAs etc. Em outro aspecto, um polipeptídeo NS1 aqui descrito é usado para medir a concentração de anticorpos que se ligam ao vírus da Zika NS1 em uma amostra biológica (por exemplo, uma amostra biológica de um indivíduo). Por exemplo, uma amostra biológica pode ser posta em contato com um polipeptídeo NS1 em um imunoensaio e a ligação do anticorpo na amostra biológica pode ser determinada por técnicas conhecidas por uma pessoa versada na técnica. Em outro aspecto, um polipeptídeo NS1 aqui descrito é usado para detectar um indivíduo que tem ou está infectado com um vírus da Zika. Em um específico, um polipeptídeo NS1 aqui descrito é usado para determinar se um indivíduo foi exposto ao vírus da Zika. Em outro aspecto, um polipeptídeo NS1 aqui descrito pode ser usado para diagnosticar uma infecção pelo vírus da Zika. Por exemplo, uma amostra biológica de um indivíduo pode ser posta em contato com um polipeptídeo NS1 em um imunoensaio e a ligação do anticorpo na amostra biológica pode ser determinada por técnicas conhecidas por uma pessoa versada na técnica. Em certas modalidades, um controle positivo (por exemplo, uma amostra biológica infectada com um vírus da Zika), um controle negativo (por exemplo, uma amostra biológica que não está infectada com um vírus da Zika) ou ambos estão incluídos nos imunoensaios. Em outro aspecto, um polipeptídeo NS1 aqui descrito pode ser usado para prognosticar uma infecção pelo vírus da Zika ou uma doença pelo vírus da Zika. Por exemplo, um nível mais alto de anticorpo que se liga especificamente ao polipeptídeo NS1 detectado em uma amostra biológica de um indivíduo pode indicar que o indivíduo tem uma melhor chance de recuperação com sucesso da infecção ou doença, ou que os sintomas da infecção ou doença não ser severo.
5.10 ENSAIOS BIOLÓGICOS
[00420] Um anticorpo aqui descrito (por exemplo, um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) pode ser usado usando qualquer ensaio conhecido por uma pessoa versada na técnica ou aqui descrito (por exemplo, conforme descrito na Seção 5.2 ou 6 aqui). Além disso, um polipeptídeo NS1 pode ser usado usando qualquer ensaio descrito ou conhecido por uma pessoa versada na técnica neste documento (por exemplo, conforme descrito na Seção 5.1 ou 6 neste documento).
5.10.1 Ensaios para testar a atividade do anticorpo
[00421] Um anticorpo pode ser caracterizado de uma variedade de maneiras conhecidas por uma pessoa versada na técnica (por exemplo, ELISA, interferometria de biocamada, exibição de ressonância plasmônica de superfície (cinética BIAcore), Western blot, imunofluorescência, imunomarcação e/ou ensaios de microneutralização). Em algumas modalidades, um anticorpo é testado quanto à sua capacidade de se ligar a um NS1 do vírus da Zika ou a uma proteína NS1 recombinante.
[00422] A especificidade ou seletividade de um anticorpo para uma proteína NS1 do vírus da Zika e a reatividade cruzada com outros antígenos (por exemplo, o vírus NS1 da Dengue) podem ser avaliadas por qualquer método conhecido na técnica. Os imunoensaios que podem ser usados para analisar a ligação específica e a reatividade cruzada incluem, mas não estão limitados a, sistemas de ensaio competitivos e não competitivos usando técnicas, como Western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaio de imunoabsorção enzimática), imunoensaios "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, reações de precipitina, reações de precipitina de difusão em gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação de complemento, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios fluorescentes, imunoensaios de proteína A, para citar apenas alguns. Tais ensaios são de rotina e bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Ausubel et al., Eds., 1994, Current
Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, que é incorporado por referência aqui em sua totalidade).
[00423] A afinidade de ligação de um anticorpo a uma proteína NS1 do vírus da Zika e a taxa de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno podem ser determinadas por ensaios de ligação competitiva. Um exemplo de um ensaio de ligação competitiva é um radioimunoensaio compreendendo a incubação do antígeno marcado (por exemplo, 3H ou 125I) com o anticorpo de interesse na presença de quantidades crescentes de antígeno não marcado e a detecção do anticorpo ligado ao antígeno marcado. A afinidade do anticorpo para uma proteína NS1 do vírus da Zika ou uma proteína NS1 recombinante e as taxas de desligamento de ligação podem ser determinadas a partir dos dados por análise de gráfico de Scatchard. A competição com um segundo anticorpo também pode ser determinada usando radioimunoensaios. Neste caso, uma proteína NS1 do vírus da Zika é incubada com o anticorpo de teste conjugado a um anticorpo marcado detectável (por exemplo, 3H ou 125I) na presença de quantidades crescentes de um segundo anticorpo não marcado.
[00424] Em algumas modalidades, a análise de ressonância plasmônica de superfície (por exemplo, cinética BIAcore) é usada para determinar as taxas de ligação e desligamento de um anticorpo para uma proteína NS1 do vírus da Zika ou uma proteína NS1 recombinante. A análise cinética BIAcore normalmente incluía a análise da ligação e dissociação de uma proteína NS1 do vírus da
Zika ou uma proteína NS1 recombinante de chips com anticorpos imobilizados para uma proteína NS1 do vírus da Zika ou uma proteína
NS1 recombinante em sua superfície.
Resumidamente, um estudo cinético típico de BIAcore envolve a injeção de 250 μL de um reagente de anticorpo (mAb, Fab) em concentrações variáveis em tampão HBS contendo 0,005% de Tween-20 sobre uma superfície de chip sensor, no qual foi imobilizado o vírus da Zika NS1 proteína ou uma proteína NS1 recombinante.
A taxa de fluxo é mantida constante em 75 μL/Min.
Os dados de dissociação são coletados por
15 minutos ou mais, conforme necessário.
Após cada ciclo de injeção/dissociação, o anticorpo ligado é removido de uma proteína
NS1 do vírus da Zika ou de uma superfície de proteína NS1 recombinante usando pulsos breves de 1 minuto de ácido diluído,
normalmente HCl 10 a 100 mM, embora outros regenerantes sejam empregados conforme as circunstâncias mandado.
Mais especificamente, para a medição das taxas de associação, Kon e dissociação, koff, o polipeptídeo é diretamente imobilizado na superfície do chip sensor através do uso de químicas de acoplamento de amina padrão, ou seja, o método EDC/NHS (EDC= N-
dietilaminopropil)-carbodiimida). Resumidamente, uma solução 5 a
100 nM do polipeptídeo em NaOAc 10 mM, pH 4 ou pH 5 é preparada e passada sobre a superfície ativada por EDC/NHS até aproximadamente
30 a 50 RU de polipeptídeo serem imobilizados.
Em seguida, os ésteres ativos que não reagiram são "tampados" com uma injeção de 1M Et-NH2. Uma superfície em branco, sem polipeptídeo, é preparada em condições de imobilização idênticas para fins de referência.
Uma vez que uma superfície apropriada foi preparada, uma série de diluição adequada de cada um dos reagentes de anticorpo é preparada em HBS/Tween-20, e passada sobre as superfícies do polipeptídeo e da célula de referência, que estão conectadas em série. A faixa de concentrações de anticorpos que são preparadas varia, dependendo de qual é a constante de ligação de equilíbrio, KD, estimada.
Conforme descrito acima, o anticorpo ligado é removido após cada ciclo de injeção/dissociação usando um regenerante apropriado.
[00425] Em uma modalidade específica, a afinidade de um anticorpo aqui descrito para um NS1 do vírus da Zika ou um polipeptídeo NS1 recombinante aqui descrito é determinada por uma técnica descrita na Seção 6, infra. Em outra modalidade, a atividade neutralizante de um anticorpo aqui descrito é medida por uma técnica descrita na Seção 6, infra. Em outra modalidade, um, dois ou todos os seguintes de um anticorpo aqui descrito são avaliados por uma técnica conhecida na técnica ou aqui descrita (por exemplo, na Seção 6, infra): citotoxidade mediada por células dependente de anticorpos, dependente de anticorpos fagocitose mediada por células, lise mediada por complemento dependente de anticorpos. Em outra modalidade, o aumento dependente de anticorpos de uma infecção pelo vírus da Zika é determinado in vitro usando uma técnica conhecida na técnica ou aqui descrita (por exemplo, na Seção 6, infra).
5.10.2 Ensaios para testar a proteína NS1
[00426] Os ensaios para testar a expressão de um polipeptídeo NS1 aqui divulgado podem ser realizados usando qualquer ensaio conhecido na técnica. Por exemplo, um imunoensaio, como um Western blot, pode ser usado para avaliar a expressão de um polipeptídeo NS1. Um ensaio para a incorporação de um polipeptídeo NS1 em um vetor viral pode incluir o cultivo de um vírus como aqui descrito, purificação das partículas virais por centrifugação através de uma almofada de sacarose e análise subsequente para a expressão do polipeptídeo NS1 por um imunoensaio, tal como Western blotting, usando métodos bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade específica, a expressão de um polipeptídeo NS1 é determinada usando uma técnica descrita na Seção 6, infra.
[00427] Em outra modalidade, um polipeptídeo NS1 divulgado neste documento é testado quanto ao dobramento adequado por determinação da estrutura ou conformação do polipeptídeo NS1 usando qualquer método conhecido na técnica, tal como, por exemplo, NMR, métodos cristalográficos de raios-X ou métodos de predição de estrutura secundária, por exemplo, dicroísmo circular.
[00428] Em outra modalidade, um polipeptídeo NS1 divulgado aqui é testado quanto à capacidade de formar dímeros usando uma técnica conhecida na técnica ou aqui descrita (por exemplo, na Seção 6,
infra). Em outra modalidade, um polipeptídeo NS1 divulgado neste documento ou um vírus contendo ou expressando um polipeptídeo NS1 divulgado é avaliado quanto à atividade NS1 do vírus da Zika usando uma técnica conhecida por uma pessoa versada na técnica ou descrita neste documento (por exemplo, na Seção 6, infra).
5.11 Kits
[00429] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um pacote ou kit farmacêutico compreendendo um ou mais recipientes preenchidos com um ou mais dos ingredientes de uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica) aqui descrita, tal como um ou mais anticorpos fornecidos neste documento (por exemplo, um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) ou um ou mais conjugados de anticorpos aqui descritos.
Opcionalmente associado a esse(s) recipiente(s) pode estar um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regulamenta a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, cujo aviso reflete a aprovação da agência de fabricação, uso ou venda para administração humana.
[00430] Os kits aqui abrangidos podem ser usados nos métodos acima. Em uma modalidade, um kit compreendendo um anticorpo aqui descrito, de preferência um anticorpo isolado, em um ou mais recipientes. Em uma modalidade específica, os kits aqui abrangidos contêm um antígeno do vírus da Zika isolado com o qual os anticorpos aqui abrangidos reagem (por exemplo, o anticorpo se liga ao antígeno) como um controle. Em uma modalidade específica, os kits fornecidos neste documento compreendem ainda um anticorpo de controle que não reage com um vírus da Zika NS1 (por exemplo, o anticorpo não se liga ao vírus da Zika NS1, como um IgG de controle). Em outra modalidade específica, os kits fornecidos neste documento contêm um meio para detectar a ligação de um anticorpo a um vírus da Zika NS1 (por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado a um substrato detectável, como um composto fluorescente, um substrato enzimático, um composto radioativo, um composto luminescente, ou outro anticorpo que é conjugado a um substrato detectável (por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado a um segundo anticorpo que reconhece/se liga ao primeiro anticorpo)). Em certas modalidades, os kits compreendem um segundo anticorpo que é marcado com uma substância detectável e que se liga a um anticorpo aqui descrito. Em modalidades específicas, o kit pode incluir um vírus da Zika NS1 produzido de forma recombinante ou sintetizado quimicamente (tal como, por exemplo, descrito na Seção 6, infra). O Zika NS1 fornecido no kit também pode ser conectado a um suporte sólido. Em uma modalidade mais específica, o meio de detecção do kit descrito acima inclui um suporte sólido ao qual um vírus da Zika NS1 é anexado. Esse kit também pode incluir um anticorpo marcado com repórter não ligado.
Nesta modalidade, a ligação do anticorpo ao vírus da Zika NS1 pode ser detectada pela ligação do referido anticorpo marcado com repórter.
[00431] Em outro aspecto, é aqui fornecido um pacote ou kit farmacêutico compreendendo um ou mais recipientes preenchidos com um ou mais dos ingredientes de uma composição (por exemplo, uma composição imunogênica) aqui descrita, tal como um polipeptídeo NS1 aqui descrito. Opcionalmente associado a tais recipientes pode estar um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regulamenta a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, cujo aviso reflete a aprovação da agência de fabricação, uso ou venda para administração humana.
[00432] Em outro aspecto, são aqui fornecidos kits que compreendem um imunógeno aqui descrito em um recipiente. Em uma modalidade específica, são aqui fornecidos kits que compreendem um imunógeno descrito na Seção 5.1 ou 6, supra, em um recipiente. Em uma modalidade específica, são aqui fornecidos kits compreendendo um polipeptídeo NS1 descrito na Seção 5.1 ou 6, supra, em um recipiente.
5.12 SEQUÊNCIAS
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO: 1 Isolar mRNA da região gaggtgcagctggtggagtccggaggaggc variável da cadeia ttgatccagcctggggggtccctgagactc pesada de tcctgtgcagcctctgggttcaccgtcagt imunoglobulina AA12, agcaactacatgagctgggtccgccaggct ccagggaaggggctggagtgggtctcagtt
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
CDS parcial [organismo atttatagcggtggtagcacatactacgca = Homo sapiens] gactccgtgaagggccgattcaccatctcc agagacaattccaagaacacgctgtatctt caaatgaacagcctgagagccgaggacacg gccgtgtattactgtgcgagagatcgaagg gggtttgactactggggccagggaacaatg gtcaccgtctcttca
2 Isolar o mRNA da região gacatccagatgacccagtctccactctcc variável da cadeia leve ctgtctgcatctgtaggagacagagtcacc da imunoglobulina AA12, atcacttgccggacaagtcagagcattagc CDS parcial [organismo agctatttaaattggtatcagcagaaacca = Homo sapiens] gggaaagcccctaagctcctgatctatgct gcatccagtttgcaaagtggggtcccatca aggttcagtggcagtggatctgggacagat ttcactcttaccatcagcagtctgcaacct gaagattttgcaacttactactgtcaacag acttacagtacccctctcactttcggcgga gggaccaaggtggaaatcaaa
3 Isolate EB9 gaggtgcagctggtggagtctggaggaggc immunoglobulin heavy ttgatccagcctggggggtccctgagactc chain variable region tcctgtgcagcctctgggttcaccgtcagt mRNA, partial CDS agcaactacatgagctgggtccgccaggct [organism=Homo sapiens] ccagggaaggggctggagtgggtctcagtt atttatagcggtggtagcacatactacgca gactccgtgaagggccgattcaccatctcc agagacaattccaagaacacgctgtatctt caaatgaacagcctgagagccgaggacacg gccgtgtattactgtgcgagatggggaggg aaacgggggggggcttttgatatctggggc caagggacaatggtcaccgtctcttca
4 Isolar o mRNA da região gacatccagatgacccagtctccattctcc variável da cadeia leve ctgtctgcatctgtaggagacagagtcacc da imunoglobulina EB9, atcacttgccgggcaagtcagagcattagc CDS parcial [organismo agccatttaaattggtatcagcagaaacca = Homo sapiens] gggaaagcccctaagttcctgatctatgct gcatccagtttgcaaagtggggtcccatca
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
aggttcagtggcagtggatctgggacagac ttcactctcaccatcagcagtctgcaacct gaagattttgcaacttactactgtcaacag agttacagtactccgtacacttttggccag gggaccaaggtggaaatcaaac
5 Isolar mRNA da região gaggtgcagctggtggagtctggaggaggc variável da cadeia ttgatccagcctggggggtccctgagactc pesada de tcctgtgcagcctctgggttcaccgtcagt imunoglobulina GB5, CDS agcaactacatgagctgggtccgccaggct parcial [organismo = ccagggaaggggctggagtgggtctcagtt Homo sapiens] atttatagcggtggtagcacatactacgca gactccgtgaagggccgattcaccatctcc agagacaattccaagaacacgctgtatctt caaatgagcagcctgagagccgaggacacg gccgtgtattactgtgcgagactcatagca gcagctggtgactactggggccagggaaca atggtcaccgtctcttcag
6 Isolar mRNA da região gacatccagatgacccagtctccattcacc variável da cadeia leve ctgtctgcatctgtaggagacagagtcacc da imunoglobulina GB5, atcacttgccgggcaagtcagagcattagc CDS parcial [organismo agctatttaaattggtatcagcagaaacca = Homo sapiens] gggaaagcccctaagctcctgatctatgct gcatccagtttgcaaagtggggtcccatca aggttcagtggcagtgaatctgggacagat ttcactctcaccatcagcagtctgcaacct gaagattttgcaacttactactgtcaacag agttacagtaccccctggacgttcggccaa gggaccaaggtggagatcaaac
7 Isolar o mRNA da região gaggtgcagctggtggagtctggaggaggc variável da cadeia ttgatccagcctggggggtccctgagactc pesada de tcctgtgcagcctctgggttcaccgtcagt imunoglobulina FC12, agcaactacatgagctgggtccgccagact CDS parcial [organismo ccagggaaggggctggagtgggtctcagtt = Homo sapiens] atttatagcggtggtagcacatactacgca gactccgtgaagggccgattcaccatctcc agagacaattccaagaacacgctgtatctt
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
caaatgaacagcctgagagccgaggacacg gccgtgtattactgtgcgagagggcccgta caactggaacgacggcctctgggtgctttt gatatctggggccaagggacaatggtcacc gtctcttca
8 Isolar o mRNA da região Tcctatgagctgactcagccaccctcagtg variável da cadeia leve tccgtgtccccaggacagacagccagcatc da imunoglobulina FC12, acctgctctggagataaattgggggataaa CDS parcial [organismo tatgcttgctggtatcagcagaagccaggc = Homo sapiens] cagtcccctgtgctggtcatctatcaagat agcaagcggccctcagggatccctgagcga ttctctggctccaactctgggaacacagcc actctgaccatcagcgggacccaggctatg gatgaggctgactattactgtcaggcgtgg gacagcagcaccgtggtattcggcggaggg accaagctgaccgtcctag
9 Isolar a sequência de EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVS aminoácidos da região SNYMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSTYYA variável da cadeia DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT pesada de AVYYCARDRRGFDYWGQGTMVTVSS imunoglobulina AA12 [organismo = Homo sapiens]
10 Isolar a sequência de DIQMTQSPLSLSASVGDRVTITCRTSQSIS aminoácidos da região SYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS variável da cadeia leve RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ da imunoglobulina AA12 TYSTPLTFGGGTKVEIK [organismo = Homo sapiens]
11 Isolar a sequência de EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVS aminoácidos da região SNYMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSTYYA variável da cadeia DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT pesada de AVYYCARWGGKRGGAFDIWGQGTMVTVSS imunoglobulina EB9
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
[organismo = Homo sapiens]
12 Isolar a sequência de DIQMTQSPFSLSASVGDRVTITCRASQSIS aminoácidos da região SHLNWYQQKPGKAPKFLIYAASSLQSGVPS variável da cadeia leve RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ da imunoglobulina EB9 SYSTPYTFGQGTKVEIK [organismo = Homo sapiens]
13 Isolar a sequência de EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVS aminoácidos da região SNYMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSTYYA variável da cadeia leve DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDT da imunoglobulina EB9 AVYYCARLIAAAGDYWGQGTMVTVSS [organismo = Homo sapiens]
14 Isolar a sequência de DIQMTQSPFTLSASVGDRVTITCRASQSIS aminoácidos da região SYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS variável da cadeia leve RFSGSESGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ da imunoglobulina GB5 SYSTPWTFGQGTKVEIK [organismo = Homo sapiens]
15 Isolar a sequência de EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVS aminoácidos da região SNYMSWVRQTPGKGLEWVSVIYSGGSTYYA variável da cadeia DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT pesada de AVYYCARGPVQLERRPLGAFDIWGQGTMVT imunoglobulina FC12 VSS [organismo = Homo sapiens]
16 Isolar a sequência de SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDK aminoácidos da região YACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPER variável da cadeia leve FSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAW da imunoglobulina FC12 DSSTVVFGGGTKLTVL
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
[organismo = Homo sapiens]
17 Isolar a sequência de GFTVSSNY aminoácidos CDR1 da região variável de imunoglobulina AA12 (IMGT)
18 Isolar a sequência de IYSGGST aminoácidos CDR2 da região variável de imunoglobulina AA12 (IMGT)
19 Isolar a sequência de ARDRRGFDY aminoácidos CDR3 da região variável de imunoglobulina AA12 (IMGT)
20 Isolar a sequência de QSISSY aminoácidos de CDR1 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina AA12 (IMGT)
21 Isolar a sequência de AAS aminoácidos de CDR2 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina AA12 (IMGT)
22 Isolar a sequência de QQTYSTPLT aminoácidos de CDR3 da região variável de cadeia leve de
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
imunoglobulina AA12 (IMGT)
23 Isolar a sequência de EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAAS aminoácidos da região estrutural 1 da região variável de imunoglobulina AA12 (IMGT)
24 Isolar a sequência de MSWVRQAPGKGLEWVSV aminoácidos da região estrutural da região variável de imunoglobulina AA12 (IMGT)
25 Isolar a sequência de YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA aminoácidos da região EDTAVYYC estrutural 3 da região variável de imunoglobulina AA12 (IMGT)
26 Isolar a sequência de WGQGTMVTVSS aminoácidos da região estrutural 4 da região variável de imunoglobulina AA12 (IMGT)
27 Isolar a sequência de DIQMTQSPLSLSASVGDRVTITCRTS aminoácidos da região estrutural 1 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina AA12 (IMGT)
28 Isolar a sequência de LNWYQQKPGKAPKLLIY aminoácidos da região
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
estrutural 2 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina AA12 (IMGT)
29 Isolar a sequência de SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPED aminoácidos da região FATYYC estrutural 3 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina AA12 (IMGT)
30 Isolar a sequência de FGGGTKVEIK aminoácidos da região estrutural 4 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina AA12 (IMGT)
31 Isolar a sequência de FTVSSNYMS aminoácidos ABR1 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina AA12 (Paratome)
32 Isolar a sequência de WVSVIYSGGSTYYA aminoácidos ABR2 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina AA12 (Paratome)
33 Isolar a sequência de ARDRRGFDY aminoácidos ABR3 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina AA12 (Paratome)
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
34 Isolar a sequência de QSISSYLN aminoácidos ABR1 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina AA12 (Paratome)
35 Isolar a sequência de LLIYAASSLQS aminoácidos ABR2 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina AA12 (Paratome)
36 Isolar a sequência de QQTYSTPL aminoácidos ABR3 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina AA12 (Paratome)
37 Isolar a sequência de EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASG aminoácidos da região estrutural 1 da região variável de imunoglobulina AA12 (Paratome)
38 Isolar a sequência de WVRQAPGKGLE aminoácidos da região estrutural 2 da região variável de imunoglobulina AA12 (Paratome)
39 Isolar a sequência de DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT aminoácidos da região AVYYC estrutural 3 da região variável de
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
imunoglobulina AA12 (Paratome)
40 Isolar a sequência de WGQGTMVTVSS aminoácidos da região estrutural 4 da região variável de imunoglobulina AA12 (Paratome)
41 Isolar a sequência de DIQMTQSPLSLSASVGDRVTITCRTS aminoácidos da região estrutural 1 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina AA12 (Paratome)
42 Isolar a sequência de WYQQKPGKAPK aminoácidos da região estrutural 2 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina AA12 (Paratome)
43 Isolar a sequência de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY aminoácidos da região YC estrutural 3 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina AA12 (Paratome)
44 Isolar a sequência de TFGGGTKVEIK aminoácidos da região estrutural 4 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina AA12 (Paratome)
45 Isolar a sequência de GFTVSSNY aminoácidos CDR1 da
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
região variável da cadeia pesada de imunoglobulina EB9 (IMGT)
46 Isolar a sequência de IYSGGST aminoácidos CDR2 da região variável da cadeia pesada de imunoglobulina EB9 (IMGT)
47 Isolar a sequência de ARWGGKRGGAFDI aminoácidos CDR3 da região variável da cadeia pesada de imunoglobulina EB9 (IMGT)
48 Isolar a sequência de QSISSH aminoácidos de CDR1 de região variável de cadeia leve de imunoglobulina EB9 (IMGT)
49 Isolar a sequência de AAS aminoácidos de CDR2 de região variável de cadeia leve de imunoglobulina EB9 (IMGT)
50 Isolar a sequência de QQSYSTPYT aminoácidos de CDR3 de região variável de cadeia leve de imunoglobulina EB9 (IMGT)
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
51 Isolar a sequência de EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAAS aminoácidos da região estrutural 1 da região variável da imunoglobulina EB9 (IMGT)
52 Isolar a sequência de MSWVRQAPGKGLEWVSV aminoácidos da região estrutural 2 da região variável da imunoglobulina EB9 (IMGT)
53 Isolar a sequência de YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA aminoácidos da região EDTAVYYC estrutural 3 da região variável da imunoglobulina EB9 (IMGT)
54 Isolar a sequência de WGQGTMVTVSS aminoácidos da região estrutural 4 da região variável da imunoglobulina EB9 (IMGT)
55 Isolar a sequência de DIQMTQSPFSLSASVGDRVTITCRAS aminoácidos da região estrutural 1 da região variável da imunoglobulina EB9 (IMGT)
56 Isolar a sequência de LNWYQQKPGKAPKFLIY aminoácidos da região estrutural 2 da região variável da
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
imunoglobulina EB9 (IMGT)
57 Isolar a sequência de SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPED aminoácidos da região FATYYC estrutural 3 da região variável da imunoglobulina EB9 (IMGT)
58 Isolar a sequência de FGQGTKVEIK aminoácidos da região estrutural 4 da região variável da imunoglobulina EB9 (IMGT)
59 Isolar a sequência de FTVSSNYMS aminoácidos ABR1 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina EB9 (Paratome)
60 Isolar a sequência de WVSVIYSGGSTYYA aminoácidos ABR2 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina EB9 (Paratome)
61 Isolar a sequência de ARWGGKRGGAFDI aminoácidos ABR3 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina EB9 (Paratome)
62 Isolar a sequência de QSISSHLN aminoácidos ABR1 da
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
região variável da cadeia leve da imunoglobulina EB9 (Paratome)
63 Isolar a sequência de FLIYAASSLQS aminoácidos ABR2 da região variável da cadeia leve da imunoglobulina EB9 (Paratome)
64 Isolar a sequência de QQSYSTPY aminoácidos ABR3 da região variável da cadeia leve da imunoglobulina EB9 (Paratome)
65 Isolar a sequência de EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASG aminoácidos da região estrutural 1 da região variável da imunoglobulina EB9 (Paratome)
66 Isolar a sequência de WVRQAPGKGLE aminoácidos da região estrutural 2 da região variável da imunoglobulina EB9 (Paratome)
67 Isolar a sequência de DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT aminoácidos da região AVYYC estrutural 3 da região variável da imunoglobulina EB9 (Paratome)
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
68 Isolar a sequência de WGQGTMVTVSS aminoácidos da região estrutural 4 da região variável da imunoglobulina EB9 (Paratome)
69 Isolar a sequência de DIQMTQSPFSLSASVGDRVTITCRAS aminoácidos da região estrutural 1 da cadeia leve de imunoglobulina EB9 (Paratome)
70 Isolar a sequência de WYQQKPGKAPK aminoácidos da região estrutural 2 da cadeia leve de imunoglobulina EB9 (Paratome)
71 Isolar a sequência de GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY aminoácidos da região YC estrutural 3 da cadeia leve de imunoglobulina EB9 (Paratome)
72 Isolar a sequência de TFGQGTKVEIK aminoácidos da região estrutural 4 da cadeia leve de imunoglobulina EB9 (Paratome)
73 Isolar a sequência de GFTVSSNY aminoácidos de CDR1 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina GB5 (IMGT)
74 Isolar a sequência de IYSGGST aminoácidos de CDR2 da
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
região variável de cadeia pesada de imunoglobulina GB5 (IMGT)
75 Isolar a sequência de ARLIAAAGDY aminoácidos de CDR3 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina GB5 (IMGT)
76 Isolar a sequência de QSISSY aminoácidos de CDR1 de região variável de cadeia leve de imunoglobulina GB5 (IMGT)
77 Isolar a sequência de AAS aminoácidos de CDR2 de região variável de cadeia leve de imunoglobulina GB5 (IMGT)
78 Isolar a sequência de QQSYSTPWT aminoácidos de CDR3 de região variável de cadeia leve de imunoglobulina GB5 (IMGT)
79 Isolar a sequência de EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAAS aminoácidos da região estrutural 1 da região variável de imunoglobulina GB5 (IMGT)
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
80 Isolar a sequência de MSWVRQAPGKGLEWVSV aminoácidos da região estrutural 2 da região variável de imunoglobulina GB5 (IMGT)
81 Isolar a sequência de YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRA aminoácidos da região EDTAVYYC estrutural 3 da região variável de imunoglobulina GB5 (IMGT)
82 Isolar a sequência de WGQGTMVTVSS aminoácidos da região estrutural 4 da região variável de imunoglobulina GB5 (IMGT)
83 Isolar a sequência de DIQMTQSPFTLSASVGDRVTITCRAS aminoácidos da região estrutural 1 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina GB5 (IMGT)
84 Isolar a sequência de LNWYQQKPGKAPKLLIY aminoácidos da região estrutural 2 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina GB5 (IMGT)
85 Isolar a sequência de SLQSGVPSRFSGSESGTDFTLTISSLQPED aminoácidos da região FATYYC estrutural 3 da região variável de cadeia leve
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
de imunoglobulina GB5(IMGT)
86 Isolar a sequência de FGQGTKVEIK aminoácidos da regiãoestrutural 4 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina GB5 (IMGT)
87 Isolar a sequência de FTVSSNYMS aminoácidos ABR1 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina GB5 (Paratome)
88 Isolar a sequência de WVSVIYSGGSTYYA aminoácidos ABR2 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina GB5 (Paratome)
89 Isolar a sequência de ARLIAAAGDY aminoácidos ABR3 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina GB5 (Paratome)
90 Isolar a sequência de QSISSYLN aminoácidos ABR1 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina GB5 (Paratome)
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
91 Isolar a sequência de LLIYAASSLQS aminoácidos ABR2 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina GB5 (Paratome)
92 Isolar a sequência de QQSYSTPW aminoácidos ABR3 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina GB5 (Paratome)
93 Isolar a sequência de EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASG aminoácidos da região estrutural 1 da região variável de imunoglobulina GB5 (Paratome)
94 Isolar a sequência de WVRQAPGKGLE aminoácidos da região estrutural 2 da região variável de imunoglobulina GB5 (Paratome)
95 Isolar a sequência de DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDT aminoácidos da região AVYYC estrutural 3 da região variável de imunoglobulina GB5 (Paratome)
96 Isolar a sequência de WGQGTMVTVSS aminoácidos da região estrutural 4 da região variável de
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
imunoglobulina GB5 (Paratome)
97 Isolar a sequência de DIQMTQSPFTLSASVGDRVTITCRAS aminoácidos da região estrutural 1 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina GB5 (Paratome)
98 Isolar a sequência de WYQQKPGKAPK aminoácidos da região estrutural 2 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina GB5 (Paratome)
99 Isolar a sequência de GVPSRFSGSESGTDFTLTISSLQPEDFATY aminoácidos da região YC estrutural 3 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina GB5(Paratome)
100 Isolar a sequência de TFGQGTKVEIK aminoácidos da região estrutural da região 4 variável de cadeia leve de imunoglobulina GB5 (Paratome)
101 Isolar a sequência de GFTVSSNY aminoácidos de CDR1 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina FC12 (IMGT)
102 Isolar a sequência de IYSGGST aminoácidos de CDR2 da
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
região variável de cadeia pesada de imunoglobulina FC12 (IMGT)
103 Isolar a sequência de ARGPVQLERRPLGAFDI aminoácidos de CDR3 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina FC12 (IMGT)
104 Isolar a sequência de KLGDKY aminoácidos de CDR1 de região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (IMGT)
105 Isolar a sequência de QDS aminoácidos de CDR2 de região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (IMGT)
106 Isolar a sequência de QAWDSSTVV aminoácidos de CDR3 de região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (IMGT)
107 Isolar a sequência de EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAAS aminoácidos da região estrutural 1 da região variável de cadeia pesada de
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
imunoglobulina FC12 (IMGT)
108 Isolar a sequência de MSWVRQTPGKGLEWVSV aminoácidos da região estrutural 2 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina FC12 (IMGT)
109 Isolar a sequência de YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA aminoácidos da região EDTAVYYC estrutural 3 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina FC12 (IMGT)
110 Isolar a sequência de WGQGTMVTVSS aminoácidos da região estrutural 4 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina FC12 (IMGT)
111 Isolar a sequência de SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGD aminoácidos da região estrutural 1 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (IMGT)
112 Isolar a sequência de ACWYQQKPGQSPVLVIY aminoácidos da região estrutural 2 da região variável de cadeia leve
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
de imunoglobulina FC12 (IMGT)
113 Isolar a sequência de KRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMD aminoácidos da região EADYYC estrutural 3 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (IMGT)
114 Isolar a sequência de FGGGTKLTVL aminoácidos da região estrutural 4 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (IMGT)
115 Isolar a sequência de FTVSSNYMS aminoácidos ABR1 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina FC12
116 Isolar a sequência de WVSVIYSGGSTYYA aminoácidos ABR2 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina FC12
117 Isolar a sequência de ARGPVQLERRPLGAFDI aminoácidos ABR3 da região variável de cadeia pesada de imunoglobulina FC12 (Paratome)
118 Isolar a sequência de KLGDKYAC aminoácidos ABR1 da região variável de cadeia leve de
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
imunoglobulina FC12 (Paratome)
119 Isolar a sequência de LVIYQDSKRPS aminoácidos ABR2 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (Paratome)
120 Isolar a sequência de QAWDSSTV aminoácidos ABR3 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (Paratome)
121 Isolar a sequência de EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASG aminoácidos da região estrutural 1 da região variável da imunoglobulina FC12 (Paratome)
122 Isolar a sequência de WVRQTPGKGLE aminoácidos da região estrutural 2 da região variável da imunoglobulina FC12 (Paratome)
123 Isolar a sequência de DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT aminoácidos da região AVYYC estrutural 3 da região variável da imunoglobulina FC12 (Paratome)
124 Isolar a sequência de WGQGTMVTVSS aminoácidos da região
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
estrutural 4 da região variável da imunoglobulina FC12 (Paratome)
125 Isolar a sequência de SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGD aminoácidos da região estrutural 1 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (Paratome)
126 Isolar a sequência de WYQQKPGQSPV aminoácidos da região estrutural 2 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (Paratome)
127 Isolar a sequência de GIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADY aminoácidos da região YC estrutural 3 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (Paratome)
128 Isolar a sequência de VFGGGTKLTVL aminoácidos da região estrutural 4 da região variável de cadeia leve de imunoglobulina FC12 (Paratome)
129 A sequência de gacgtggggtgctcagtggacttctcaaaa nucleotídeos NS1 do aaggaaacgagatgtggcacgggggtattc vírus MR766 (Rhesus / atctataatgatgttgaagcctggagggac 1947 / Uganda) cggtacaagtaccatcctgactccccccgc agattggcagcagcagtcaagcaggcctgg gaagaggggatctgtgggatctcatccgtt tcaagaatggaaaacatcatgtggaaatca
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO: gtagaaggggagctcaatgctatcctagag gagaatggagttcaactgacagttgttgtg ggatctgtaaaaaaccccatgtggagaggt ccacaaagattgccagtgcctgtgaatgag ctgccccatggctggaaagcctgggggaaa tcgtattttgttagggcggcaaagaccaac aacagttttgttgtcgacggtgacacactg aaggaatgtccgcttgagcacagagcatgg aatagttttcttgtggaggatcacgggttt ggagtcttccacaccagtgtctggcttaag gtcagagaagattactcattagaatgtgac ccagccgtcataggaacagctgttaaggga agggaggccgcgcacagtgatctgggctat tggattgaaagtgaaaagaatgacacatgg aggctgaagagggcccacctgattgagatg aaaacatgtgaatggccaaagtctcacaca ttgtggacagatggagtagaagaaagtgat cttatcatacccaagtctttagctggtcca ctcagccaccacaacaccagagagggttac agaacccaagtgaaagggccatggcacagt gaagagcttgaaatccggtttgaggaatgt ccaggcaccaaggtttacgtggaggagaca tgcggaactagaggaccatctctgagatca actactgcaagtggaagggtcattgaggaa tggtgctgtagggaatgcacaatgccccca ctatcgtttcgagcaaaagacggctgctgg tatggaatggagataaggcccaggaaagaa ccagagagcaacttagtgaggtcaatggtg acagcg 130 Vírus PRVABC59 (número GTTGTTGATCTGTGTGAATCAGACTGCGAC de acesso 2015 /Porto AGTTCGAGTTTGAAGCGAAAGCTAGCAACA Rico: KU501215) GTATCAACAGGTTTTATTTTGGATTTGGAA
ACGAGAGTTTCTGGTCATGAAAAACCCAAA AAAGAAATCCGGAGGATTCCGGATTGTCAA TATGCTAAAACGCGGAGTAGCCCGTGTGAG CCCCTTTGGGGGCTTGAAGAGGCTGCCAGC CGGACTTCTGCTGGGTCATGGGCCCATCAG GATGGTCTTGGCGATTCTAGCCTTTTTGAG
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
ATTCACGGCAATCAAGCCATCACTGGGTCT CATCAATAGATGGGGTTCAGTGGGGAAAAA AGAGGCTATGGAAACAATAAAGAAGTTCAA GAAAGATCTGGCTGCCATGCTGAGAATAAT CAATGCTAGGAAGGAGAAGAAGAGACGAGG CGCAGATACTAGTGTCGGAATTGTTGGCCT CCTGCTGACCACAGCTATGGCAGCGGAGGT CACTAGACGTGGGAGTGCATACTATATGTA CTTGGACAGAAACGATGCTGGGGAGGCCAT ATCTTTTCCAACCACATTGGGGATGAATAA GTGTTATATACAGATCATGGATCTTGGACA CATGTGTGATGCCACCATGAGCTATGAATG CCCTATGCTGGATGAGGGGGTGGAACCAGA TGACGTCGATTGTTGGTGCAACACGACGTC AACTTGGGTTGTGTACGGAACCTGCCATCA CAAAAAAGGTGAAGCACGGAGATCTAGAAG AGCTGTGACGCTCCCCTCCCATTCCACCAG GAAGCTGCAAACGCGGTCGCAAACCTGGTT GGAATCAAGAGAATACACAAAGCACTTGAT TAGAGTCGAAAATTGGATATTCAGGAACCC TGGCTTCGCGTTAGCAGCAGCTGCCATCGC TTGGCTTTTGGGAAGCTCAACGAGCCAAAA AGTCATATACTTGGTCATGATACTGCTGAT TGCCCCGGCATACAGCATCAGGTGCATAGG AGTCAGCAATAGGGACTTTGTGGAAGGTAT GTCAGGTGGGACTTGGGTTGATGTTGTCTT GGAACATGGAGGTTGTGTCACCGTAATGGC ACAGGACAAACCGACTGTCGACATAGAGCT GGTTACAACAACAGTCAGCAACATGGCGGA GGTAAGATCCTACTGCTATGAGGCATCAAT ATCAGACATGGCTTCTGACAGCCGCTGCCC AACACAAGGTGAAGCCTACCTTGACAAGCA ATCAGACACTCAATATGTCTGCAAAAGAAC GTTAGTGGACAGAGGCTGGGGAAATGGATG TGGACTTTTTGGCAAAGGGAGCCTGGTGAC ATGCGCTAAGTTTGCATGCTCCAAGAAAAT GACCGGGAAGAGCATCCAGCCAGAGAATCT GGAGTACCGGATAATGCTGTCAGTTCATGG
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
CTCCCAGCACAGTGGGATGATCGTTAATGA CACAGGACATGAAACTGATGAGAATAGAGC GAAAGTTGAGATAACGCCCAATTCACCGAG AGCCGAAGCCACCCTGGGGGGTTTTGGAAG CCTAGGACTTGATTGTGAACCGAGGACAGG CCTTGACTTTTCAGATTTGTATTACTTGAC TATGAATAACAAGCACTGGTTGGTTCACAA GGAGTGGTTCCACGACATTCCATTACCTTG GCACGCTGGGGCAGACACCGGAACTCCACA CTGGAACAACAAAGAAGCACTGGTAGAGTT CAAGGACGCACATGCCAAAAGGCAAACTGT CGTGGTTCTAGGGAGTCAAGAAGGAGCAGT TCACACGGCCCTTGCTGGAGCTCTGGAGGC TGAGATGGATGGTGCAAAGGGAAGGCTGTC CTCTGGCCACTTGAAATGTCGCCTGAAAAT GGATAAACTTAGATTGAAGGGCGTGTCATA CTCCTTGTGTACTGCAGCGTTCACATTCAC CAAGATCCCGGCTGAAACACTGCACGGGAC AGTCACAGTGGAGGTACAGTACGCAGGGAC AGATGGACCTTGCAAGGTTCCAGCTCAGAT GGCGGTGGACATGCAAACTCTGACCCCAGT TGGGAGGTTGATAACCGCTAACCCCGTAAT CACTGAAAGCACTGAGAACTCTAAGATGAT GCTGGAACTTGATCCACCATTTGGGGACTC TTACATTGTCATAGGAGTCGGGGAGAAGAA GATCACCCACCACTGGCACAGGAGTGGCAG CACCATTGGAAAAGCATTTGAAGCCACTGT GAGAGGTGCCAAGAGAATGGCAGTCTTGGG AGACACAGCCTGGGACTTTGGATCAGTTGG AGGCGCTCTCAACTCATTGGGCAAGGGCAT CCATCAAATTTTTGGAGCAGCTTTCAAATC ATTGTTTGGAGGAATGTCCTGGTTCTCACA AATTCTCATTGGAACGTTGCTGATGTGGTT GGGTCTGAACACAAAGAATGGATCTATTTC CCTTATGTGCTTGGCCTTAGGGGGAGTGTT GATCTTCTTATCCACAGCCGTCTCTGCTGA TGTGGGGTGCTCGGTGGACTTCTCAAAGAA GGAGACGAGATGCGGTACAGGGGTGTTCGT
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
CTATAACGACGTTGAAGCCTGGAGGGACAG GTACAAGTACCATCCTGACTCCCCCCGTAG ATTGGCAGCAGCAGTCAAGCAAGCCTGGGA AGATGGTATCTGCGGGATCTCCTCTGTTTC AAGAATGGAAAACATCATGTGGAGATCAGT AGAAGGGGAGCTCAACGCAATCCTGGAAGA GAATGGAGTTCAACTGACGGTCGTTGTGGG ATCTGTAAAAAACCCCATGTGGAGAGGTCC ACAGAGATTGCCCGTGCCTGTGAACGAGCT GCCCCACGGCTGGAAGGCTTGGGGGAAATC GTATTTCGTCAGAGCAGCAAAGACAAATAA CAGCTTTGTCGTGGATGGTGACACACTGAA GGAATGCCCACTCAAACATAGAGCATGGAA CAGCTTTCTTGTGGAGGATCATGGGTTCGG GGTATTTCACACTAGTGTCTGGCTCAAGGT TAGAGAAGATTATTCATTAGAGTGTGATCC AGCCGTTATTGGAACAGCTGTTAAGGGAAA GGAGGCTGTACACAGTGATCTAGGCTACTG GATTGAGAGTGAGAAGAATGACACATGGAG GCTGAAGAGGGCCCATCTGATCGAGATGAA AACATGTGAATGGCCAAAGTCCCACACATT GTGGACAGATGGAATAGAAGAGAGTGATCT GATCATACCCAAGTCTTTAGCTGGGCCACT CAGCCATCACAATACCAGAGAGGGCTACAG GACCCAAATGAAAGGGCCATGGCACAGTGA AGAGCTTGAAATTCGGTTTGAGGAATGCCC AGGCACTAAGGTCCACGTGGAGGAAACATG TGGAACAAGAGGACCATCTCTGAGATCAAC CACTGCAAGCGGAAGGGTGATCGAGGAATG GTGCTGCAGGGAGTGCACAATGCCCCCACT GTCGTTCCGGGCTAAAGATGGCTGTTGGTA TGGAATGGAGATAAGGCCCAGGAAAGAACC AGAAAGCAACTTAGTAAGGTCAATGGTGAC TGCAGGATCAACTGATCACATGGACCACTT CTCCCTTGGAGTGCTTGTGATCCTGCTCAT GGTGCAGGAAGGGCTGAAGAAGAGAATGAC CACAAAGATCATCATAAGCACATCAATGGC AGTGCTGGTAGCTATGATCCTGGGAGGATT
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
TTCAATGAGTGACCTGGCTAAGCTTGCAAT TTTGATGGGTGCCACCTTCGCGGAAATGAA CACTGGAGGAGATGTAGCTCATCTGGCGCT GATAGCGGCATTCAAAGTCAGACCAGCGTT GCTGGTATCTTTCATCTTCAGAGCTAATTG GACACCCCGTGAAAGCATGCTGCTGGCCTT GGCCTCGTGTCTTTTGCAAACTGCGATCTC CGCCTTGGAAGGCGACCTGATGGTTCTCAT CAATGGTTTTGCTTTGGCCTGGTTGGCAAT ACGAGCGATGGTTGTTCCACGCACTGATAA CATCACCTTGGCAATCCTGGCTGCTCTGAC ACCACTGGCCCGGGGCACACTGCTTGTGGC GTGGAGAGCAGGCCTTGCTACTTGCGGGGG GTTTATGCTCCTCTCTCTGAAGGGAAAAGG CAGTGTGAAGAAGAACTTACCATTTGTCAT GGCCCTGGGACTAACCGCTGTGAGGCTGGT CGACCCCATCAACGTGGTGGGACTGCTGTT GCTCACAAGGAGTGGGAAGCGGAGCTGGCC CCCTAGCGAAGTACTCACAGCTGTTGGCCT GATATGCGCATTGGCTGGAGGGTTCGCCAA GGCAGATATAGAGATGGCTGGGCCCATGGC CGCGGTCGGTCTGCTAATTGTCAGTTACGT GGTCTCAGGAAAGAGTGTGGACATGTACAT TGAAAGAGCAGGTGACATCACATGGGAAAA AGATGCGGAAGTCACTGGAAACAGTCCCCG GCTCGATGTGGCGCTAGATGAGAGTGGTGA TTTCTCCCTGGTGGAGGATGACGGTCCCCC CATGAGAGAGATCATACTCAAGGTGGTCCT GATGACCATCTGTGGCATGAACCCAATAGC CATACCCTTTGCAGCTGGAGCGTGGTACGT ATACGTGAAGACTGGAAAAAGGAGTGGTGC TCTATGGGATGTGCCTGCTCCCAAGGAAGT AAAAAAGGGGGAGACCACAGATGGAGTGTA CAGAGTAATGACTCGTAGACTGCTAGGTTC AACACAAGTTGGAGTGGGAGTTATGCAAGA GGGGGTCTTTCACACTATGTGGCACGTCAC AAAAGGATCCGCGCTGAGAAGCGGTGAAGG GAGACTTGATCCATACTGGGGAGATGTCAA
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
GCAGGATCTGGTGTCATACTGTGGTCCATG GAAGCTAGATGCCGCCTGGGATGGGCACAG CGAGGTGCAGCTCTTGGCCGTGCCCCCCGG AGAGAGAGCGAGGAACATCCAGACTCTGCC CGGAATATTTAAGACAAAGGATGGGGACAT TGGAGCGGTTGCGCTGGATTACCCAGCAGG AACTTCAGGATCTCCAATCCTAGACAAGTG TGGGAGAGTGATAGGACTTTATGGCAATGG GGTCGTGATCAAAAACGGGAGTTATGTTAG TGCCATCACCCAAGGGAGGAGGGAGGAAGA GACTCCTGTTGAGTGCTTCGAGCCCTCGAT GCTGAAGAAGAAGCAGCTAACTGTCTTAGA CTTGCATCCTGGAGCTGGGAAAACCAGGAG AGTTCTTCCTGAAATAGTCCGTGAAGCCAT AAAAACAAGACTCCGTACTGTGATCTTAGC TCCAACCAGGGTTGTCGCTGCTGAAATGGA GGAGGCCCTTAGAGGGCTTCCAGTGCGTTA TATGACAACAGCAGTCAATGTCACCCACTC TGGAACAGAAATCGTCGACTTAATGTGCCA TGCCACCTTCACTTCACGTCTACTACAGCC AATCAGAGTCCCCAACTATAATCTGTATAT TATGGATGAGGCCCACTTCACAGATCCCTC AAGTATAGCAGCAAGAGGATACATTTCAAC AAGGGTTGAGATGGGCGAGGCGGCTGCCAT CTTCATGACCGCCACGCCACCAGGAACCCG TGACGCATTTCCGGACTCCAACTCACCAAT TATGGACACCGAAGTGGAAGTCCCAGAGAG AGCCTGGAGCTCAGGCTTTGATTGGGTGAC GGATCATTCTGGAAAAACAGTTTGGTTTGT TCCAAGCGTGAGGAACGGCAATGAGATCGC AGCTTGTCTGACAAAGGCTGGAAAACGGGT CATACAGCTCAGCAGAAAGACTTTTGAGAC AGAGTTCCAGAAAACAAAACATCAAGAGTG GGACTTTGTCGTGACAACTGACATTTCAGA GATGGGCGCCAACTTTAAAGCTGACCGTGT CATAGATTCCAGGAGATGCCTAAAGCCGGT CATACTTGATGGCGAGAGAGTCATTCTGGC TGGACCCATGCCTGTCACACATGCCAGCGC
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
TGCCCAGAGGAGGGGGCGCATAGGCAGGAA TCCCAACAAACCTGGAGATGAGTATCTGTA TGGAGGTGGGTGCGCAGAGACTGACGAAGA CCATGCACACTGGCTTGAAGCAAGAATGCT CCTTGACAATATTTACCTCCAAGATGGCCT CATAGCCTCGCTCTATCGACCTGAGGCCGA CAAAGTAGCAGCCATTGAGGGAGAGTTCAA GCTTAGGACGGAGCAAAGGAAGACCTTTGT GGAACTCATGAAAAGAGGAGATCTTCCTGT TTGGCTGGCCTATCAGGTTGCATCTGCCGG AATAACCTACACAGATAGAAGATGGTGCTT TGATGGCACGACCAACAACACCATAATGGA AGACAGTGTGCCGGCAGAGGTGTGGACCAG ACACGGAGAGAAAAGAGTGCTCAAACCGAG GTGGATGGACGCCAGAGTTTGTTCAGATCA TGCGGCCCTGAAGTCATTCAAGGAGTTTGC CGCTGGGAAAAGAGGAGCGGCTTTTGGAGT GATGGAAGCCCTGGGAACACTGCCAGGACA CATGACAGAGAGATTCCAGGAAGCCATTGA CAACCTCGCTGTGCTCATGCGGGCAGAGAC TGGAAGCAGGCCTTACAAAGCCGCGGCGGC CCAATTGCCGGAGACCCTAGAGACCATAAT GCTTTTGGGGTTGCTGGGAACAGTCTCGCT GGGAATCTTCTTCGTCTTGATGAGGAACAA GGGCATAGGGAAGATGGGCTTTGGAATGGT GACTCTTGGGGCCAGCGCATGGCTCATGTG GCTCTCGGAAATTGAGCCAGCCAGAATTGC ATGTGTCCTCATTGTTGTGTTCCTATTGCT GGTGGTGCTCATACCTGAGCCAGAAAAGCA AAGATCTCCCCAGGACAACCAAATGGCAAT CATCATCATGGTAGCAGTAGGTCTTCTGGG CTTGATTACCGCCAATGAACTCGGATGGTT GGAGAGAACAAAGAGTGACCTAAGCCATCT AATGGGAAGGAGAGAGGAGGGGGCAACCAT AGGATTCTCAATGGACATTGACCTGCGGCC AGCCTCAGCTTGGGCCATCTATGCTGCCTT GACAACTTTCATTACCCCAGCCGTCCAACA TGCAGTGACCACCTCATACAACAACTACTC
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
CTTAATGGCGATGGCCACGCAAGCTGGAGT GTTGTTTGGCATGGGCAAAGGGATGCCATT CTACGCATGGGACTTTGGAGTCCCGCTGCT AATGATAGGTTGCTACTCACAATTAACACC CCTGACCCTAATAGTGGCCATCATTTTGCT CGTGGCGCACTACATGTACTTGATCCCAGG GCTGCAGGCAGCAGCTGCGCGTGCTGCCCA GAAGAGAACGGCAGCTGGCATCATGAAGAA CCCTGTTGTGGATGGAATAGTGGTGACTGA CATTGACACAATGACAATTGACCCCCAAGT GGAGAAAAAGATGGGACAGGTGCTACTCAT AGCAGTAGCCGTCTCCAGCGCCATACTGTC GCGGACCGCCTGGGGGTGGGGGGAGGCTGG GGCTCTGATCACAGCCGCAACTTCCACTTT GTGGGAAGGCTCTCCGAACAAGTACTGGAA CTCCTCTACAGCCACTTCACTGTGTAACAT TTTTAGGGGAAGTTACTTGGCTGGAGCTTC TCTAATCTACACAGTAACAAGAAACGCTGG CTTGGTCAAGAGACGTGGGGGTGGAACAGG AGAGACCCTGGGAGAGAAATGGAAGGCCCG CTTGAACCAGATGTCGGCCCTGGAGTTCTA CTCCTACAAAAAGTCAGGCATCACCGAGGT GTGCAGAGAAGAGGCCCGCCGCGCCCTCAA GGACGGTGTGGCAACGGGAGGCCATGCTGT GTCCCGAGGAAGTGCAAAGCTGAGATGGTT GGTGGAGCGGGGATACCTGCAGCCCTATGG AAAGGTCATTGATCTTGGATGTGGCAGAGG GGGCTGGAGTTACTACGTCGCCACCATCCG CAAAGTTCAAGAAGTGAAAGGATACACAAA AGGAGGCCCTGGTCATGAAGAACCCGTGTT GGTGCAAAGCTATGGGTGGAACATAGTCCG TCTTAAGAGTGGGGTGGACGTCTTTCATAT GGCGGCTGAGCCGTGTGACACGTTGCTGTG TGACATAGGTGAGTCATCATCTAGTCCTGA AGTGGAAGAAGCACGGACGCTCAGAGTCCT CTCCATGGTGGGGGATTGGCTTGAAAAAAG ACCAGGAGCCTTTTGTATAAAAGTGTTGTG CCCATACACCAGCACTATGATGGAAACCCT
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
GGAGCGACTGCAGCGTAGGTATGGGGGAGG ACTGGTCAGAGTGCCACTCTCCCGCAACTC TACACATGAGATGTACTGGGTCTCTGGAGC GAAAAGCAACACCATAAAAAGTGTGTCCAC CACGAGCCAGCTCCTCTTGGGGCGCATGGA CGGGCCTAGGAGGCCAGTGAAATATGAGGA GGATGTGAATCTCGGCTCTGGCACGCGGGC TGTGGTAAGCTGCGCTGAAGCTCCCAACAT GAAGATCATTGGTAACCGCATTGAAAGGAT CCGCAGTGAGCACGCGGAAACGTGGTTCTT TGACGAGAACCACCCATATAGGACATGGGC TTACCATGGAAGCTATGAGGCCCCCACACA AGGGTCAGCGTCCTCTCTAATAAACGGGGT TGTCAGGCTCCTGTCAAAACCCTGGGATGT GGTGACTGGAGTCACAGGAATAGCCATGAC CGACACCACACCGTATGGTCAGCAAAGAGT TTTCAAGGAAAAAGTGGACACTAGGGTGCC AGACCCCCAAGAAGGCACTCGTCAGGTTAT GAGCATGGTCTCTTCCTGGTTGTGGAAAGA GCTAGGCAAACACAAACGGCCACGAGTCTG CACCAAAGAAGAGTTCATCAACAAGGTTCG TAGCAATGCAGCATTAGGGGCAATATTTGA AGAGGAAAAAGAGTGGAAGACTGCAGTGGA AGCTGTGAACGATCCAAGGTTCTGGGCTCT AGTGGACAAGGAAAGAGAGCACCACCTGAG AGGAGAGTGCCAGAGCTGTGTGTACAACAT GATGGGAAAAAGAGAAAAGAAACAAGGGGA ATTTGGAAAGGCCAAGGGCAGCCGCGCCAT CTGGTATATGTGGCTAGGGGCTAGATTTCT AGAGTTCGAAGCCCTTGGATTCTTGAACGA GGATCACTGGATGGGGAGAGAGAACTCAGG AGGTGGTGTTGAAGGGCTGGGATTACAAAG ACTCGGATATGTCCTAGAAGAGATGAGTCG TATACCAGGAGGAAGGATGTATGCAGATGA CACTGCTGGCTGGGACACCCGCATTAGCAG GTTTGATCTGGAGAATGAAGCTCTAATCAC CAACCAAATGGAGAAAGGGCACAGGGCCTT GGCATTGGCCATAATCAAGTACACATACCA
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
AAACAAAGTGGTAAAGGTCCTTAGACCAGC TGAAAAAGGGAAAACAGTTATGGACATTAT TTCGAGACAAGACCAAAGGGGGAGCGGACA AGTTGTCACTTACGCTCTTAACACATTTAC CAACCTAGTGGTGCAACTCATTCGGAATAT GGAGGCTGAGGAAGTTCTAGAGATGCAAGA CTTGTGGCTGCTGCGGAGGTCAGAGAAAGT GACCAACTGGTTGCAGAGCAACGGATGGGA TAGGCTCAAACGAATGGCAGTCAGTGGAGA TGATTGCGTTGTGAAGCCAATTGATGATAG GTTTGCACATGCCCTCAGGTTCTTGAATGA TATGGGAAAAGTTAGGAAGGACACACAAGA GTGGAAACCCTCAACTGGATGGGACAACTG GGAAGAAGTTCCGTTTTGCTCCCACCACTT CAACAAGCTCCATCTCAAGGACGGGAGGTC CATTGTGGTTCCCTGCCGCCACCAAGATGA ACTGATTGGCCGGGCCCGCGTCTCTCCAGG GGCGGGATGGAGCATCCGGGAGACTGCTTG CCTAGCAAAATCATATGCGCAAATGTGGCA GCTCCTTTATTTCCACAGAAGGGACCTCCG ACTGATGGCCAATGCCATTTGTTCATCTGT GCCAGTTGACTGGGTTCCAACTGGGAGAAC TACCTGGTCAATCCATGGAAAGGGAGAATG GATGACCACTGAAGACATGCTTGTGGTGTG GAACAGAGTGTGGATTGAGGAGAACGACCA CATGGAAGACAAGACCCCAGTTACGAAATG GACAGACATTCCCTATTTGGGAAAAAGGGA AGACTTGTGGTGTGGATCTCTCATAGGGCA CAGACCGCGCACCACCTGGGCTGAGAACAT TAAAAACACAGTCAACATGGTGCGCAGGAT CATAGGTGATGAAGAAAAGTACATGGACTA CCTATCCACCCAAGTTCGCTACTTGGGTGA AGAAGGGTCTACACCTGGAGTGCTGTAAGC ACCAATCTTAATGTTGTCAGGCCTGCTAGT CAGCCACAGCTTGGGGAAAGCTGTGCAGCC TGTGACCCCCCCAGGAGAAGCTGGGAAACC AAGCCTATAGTCAGGCCGAGAACGCCATGG CACGGAAGAAGCCATGCTGCCTGTGAGCCC
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
CTCAGAGGACACTGAGTCAAAAAACCCCAC GCGCTTGGAGGCGCAGGATGGGAAAAGAAG GTGGCGACCTTCCCCACCCTTCAATCTGGG GCCTGAACTGGAGATCAGCTGTGGATCTCC
AGAAGAGGGACTAGTGGTTAGAGGA 131 Sequência de NGSISLMCLALGGVLIFLSTAVSA aminoácidos do envelope
ZIKV 132 Sequência de LEVLFNGPG aminoácidos do local de clivagem da protease PreScission 133 Hexahistidine motif HHHHHH amino acid sequence 134 VL CDR1 (IMGT) QSISSX X is Y or H 135 VL CDR2 (IMGT) X1X2S X1 is A or Q X2 is A or D 136 VL CDR3 (IMGT) QQX1YSTPX2T X1 is T or S X2 is L, Y, or W 137 VL ABR1 (Paratome) QSISSX1LN X1 is Y or H 138 VL ABR2 (Paratome) X1LIYAASSLQS X1 is F or L 139 VL ABR3 (Paratome) QQX1YSTPX2
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
X1 is T or S
X2 is L, Y or W
140 Sequência Sintética LALAPG
141 Exemplo de local de LVPRGSP clivagem da trombina
142 Exemplo de local de ENLYFQX clivagem reconhecido pela protease do vírus X is G or S de ataque do tabaco (TEV)
143 VH CDR1 GFTVSSNY
144 VH CDR2 IYSGGST
145 VH CDR3 ARDRRGFDY
146 VH CDR3 ARWGGKRGGAFDI
147 VH CDR3 ARLIAAAGDY
148 VH CDR3 ARGPVQLERRPLGAFDI
149 VH ABR1 FTVSSNYMS
150 VH ABR2 WVSVIYSGGSTYYA
151 VH ABR3 ARDRRGFDY
152 VH ABR3 ARWGGKRGGAFDI
153 VH ABR3 ARLIAAAGDY
154 VH ABR3 ARGPVQLERRPLGAFDI
155 CDR3 CARDRRGFDYW
156 CDR3 CARGPVQLERRPLGAFDIW
157 CDR3 CARWGGKRGGAFDIW
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO: 158 CDR3 CARLIAAAGDYW 159 CDR3 CQQTYSTPLTF 160 CDR3 CQAWDSSTV 161 CDR3 CQQSYSTPYTF 162 CDR3 CQQSYSTPWTF 163 Peptídeo Sintético NGSISLMCLALGGVLIFLSTAVSADVGCSV
DFSK 164 Peptídeo Sintético LVRSMVTA 165 Peptídeo Sintético LVRSMVTALEVLFNGPGHHHHHH (local de clivagem e motivo hexahistidina) 166 Polipeptídeo NS1 NGSISLMCLALGGVLIFLS sintético (compreendendo um TAVSADVGCSVDFSKKETRC fragmento de uma GTGVFVYNDVEAWRDRYKYH proteína do envelope do Zika vírus e um PDSPRRLAAAVKQAWEDGIC polipeptídeo NS1 do
GISSVSRMENIMWRSVEGEL Zika)
NAILEENGVQLTVVVGSVKN PMWRGPQRLPVPVNELPHGW KAWGKSYFVRAAKTNNSFVV DGDTLKECPLKHRAWNSFLV EDHGFGVFHTSVWLKVREDY SLECDPAVIGTAVKGKEAVH SDLGYWIESEKNDTWRLKRA HLIEMKTCEWPKSHTLWTDG
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
IEESDLIIPKSLAGPLSHHN TREGYRTQMKGPWHSEELEI RFEECPGTKVHVEETCGTRG PSLRSTTASGRVIEEWCCRE CTMPPLSFRAKDGCWYGMEI
RPRKEPESNLVRSMVTA 167 Polipeptídeo NS1 MNGSISLMCLALGGVLIFLS sintético (compreendendo um TAVSADVGCSVDFSKKETRC fragmento de uma GTGVFVYNDVEAWRDRYKYH proteína evelope do vírus da Zika, um PDSPRRLAAAVKQAWEDGIC polipeptídeo NS1 do
GISSVSRMENIMWRSVEGEL vírus da Zika, um local de clivagem e um motivo NAILEENGVQLTVVVGSVKN hexahistidina)
PMWRGPQRLPVPVNELPHGW KAWGKSYFVRAAKTNNSFVV DGDTLKECPLKHRAWNSFLV EDHGFGVFHTSVWLKVREDY SLECDPAVIGTAVKGKEAVH SDLGYWIESEKNDTWRLKRA HLIEMKTCEWPKSHTLWTDG IEESDLIIPKSLAGPLSHHN TREGYRTQMKGPWHSEELEI RFEECPGTKVHVEETCGTRG PSLRSTTASGRVIEEWCCRE
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO:
CTMPPLSFRAKDGCWYGMEI RPRKEPESNLVRSMVTALEV
LFQGPGHHHHHH 168 Sequência de gatgtggggtgctcggtggacttctcaaag nucleotídeos NS1 do aaggagacgagatgcggtacaggggtgttc vírus PRVABC59 gtctataacgacgttgaagcctggagggac aggtacaagtaccatcctgactccccccgt agattggcagcagcagtcaagcaagcctgg gaagatggtatctgcgggatctcctctgtt tcaagaatggaaaacatcatgtggagatca gtagaaggggagctcaacgcaatcctggaa gagaatggagttcaactgacggtcgttgtg ggatctgtaaaaaaccccatgtggagaggt ccacagagattgcccgtgcctgtgaacgag ctgccccacggctggaaggcttgggggaaa tcgtatttcgtcagagcagcaaagacaaat aacagctttgtcgtggatggtgacacactg aaggaatgcccactcaaacatagagcatgg aacagctttcttgtggaggatcatgggttc ggggtatttcacactagtgtctggctcaag gttagagaagattattcattagagtgtgat ccagccgttattggaacagctgttaaggga aaggaggctgtacacagtgatctaggctac tggattgagagtgagaagaatgacacatgg aggctgaagagggcccatctgatcgagatg aaaacatgtgaatggccaaagtcccacaca ttgtggacagatggaatagaagagagtgat ctgatcatacccaagtctttagctgggcca ctcagccatcacaataccagagagggctac aggacccaaatgaaagggccatggcacagt gaagagcttgaaattcggtttgaggaatgc ccaggcactaaggtccacgtggaggaaaca tgtggaacaagaggaccatctctgagatca accactgcaagcggaagggtgatcgaggaa tggtgctgcagggagtgcacaatgccccca ctgtcgttccgggctaaagatggctgttgg
SEQ ID Descrição da Sequência Sequência NO: tatggaatggagataaggcccaggaaagaa ccagaaagcaacttagtaaggtcaatggtg actgca
6. EXEMPLOS
6.1 EXEMPLO 1: ANTICORPOS HUMANOS QUE TÊM COMO ALVO O VÍRUS NS1 DE ZIKA QUE FORNECEM PROTEÇÃO CONTRA DOENÇA EM UM MODELO
DE RATO
[00433] O vírus da Zika é um flavivírus transmitido por mosquito intimamente relacionado ao vírus da dengue que pode causar doenças graves em humanos, incluindo microcefalia em recém-nascidos e síndrome de Guillain-Barré em adultos. Tratamentos e vacinas específicas para o vírus da Zika não estão disponíveis no momento.
Aqui, quatro anticorpos monoclonais (mAbs) de um paciente infectado que têm como alvo a proteína não estrutural NS1 foram isolados e caracterizados. Embora esses anticorpos não sejam neutralizantes, os mAbs específicos de NS1 podem envolver FcγR sem induzir o aumento dependente de anticorpos (ADE) da infecção in vitro. Além disso, os resultados demonstram que o mAb AA12 tem eficácia protetora contra desafios letais de cepas de linhagem africana e asiática do vírus da Zika em ratos Stat2-/-. A proteção é dependente de Fc, pois um anticorpo mutado incapaz de ativar funções efetoras de Fc conhecidas ou complemento não é protetor in vivo. Este estudo destaca a importância da proteína ZIKV NS1 como uma vacina potencial.
6.1.1 Introdução
[00434] Este estudo avalia se os anticorpos monoclonais específicos de NS1 podem fornecer proteção em um modelo murino e se essa proteção depende das funções efetoras do receptor Fcγ.
Usando um protocolo bem estabelecido para a geração de anticorpos monoclonais totalmente humanos33, mAbs específicos de ZIKV foram isolados do compartimento de plasmablast de um paciente recentemente infectado por ZIKV. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves de plasmablastos isolados foram então sequenciadas, clonadas e expressas de forma recombinante. As características de quatro anticorpos específicos de NS1 encontrados em um indivíduo com infecção sintomática por ZIKV são aqui relatadas. Os dados demonstram que, embora os mAbs específicos de NS1 não neutralizem o vírus in vitro, eles podem conferir proteção mediada por FcγR in vivo em um modelo de desafio murino, o que destaca a importância dos epítopos NS1 no desenvolvimento de vacinas.
6.1.1 Métodos e Materiais
[00435] Células e vírus: Células T de rim embrionário humano (KEK) 293 (American Type Culture Collection; ATCC Cat. No. CRL- 1573) e células de rim de macaco verde africano (Vero) foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco)
suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) (Hyclone) e antibióticos (100 unidades/ml de penicilina - 100 µg/ml estreptomicina [Pen-Strep]; Gibco). Células Expi293F de rim embrionário humano (Gibco) foram cultivadas em meio de expressão Expi293. Vírus MR766 (Rhesus/1947/Uganda BEI NR-50065), vírus PRVABC59 (2015/Porto Rico BEI NR-50684) e vírus PAN/2015 (H/PAN/2015/CDC-259359) foram obtidos a partir de recursos BEI.
Células K562 expressando receptor Fcγ foram obtidas através de ATCC (Cat # CCL-243). O anticorpo pan-flavivírus 4G2 foi obtido através do ATCC D1-4G2-4-15 (ATCC® HB-112™). ZIKV foram propagados em células Vero em 1X Minimum Essential Medium (MEM); após 72 horas pós-infecção (hpi), os sobrenadantes da cultura celular foram colhidos, aliquotados e armazenados a -80ºC até o uso.
[00436] Isolamento de plasmablastos humano: Os plasmblastos foram isolados aproximadamente duas semanas após o início dos sintomas. Plasmablastos (CD19+/CD3-/CD20-/CD38high/CD27high) foram isolados e os anticorpos monoclonais foram gerados como previamente descritos33 de acordo com a Icahn School of Medicine no Mount Sinai Institutional Review Board. Resumidamente, a centrifugação de densidade Ficoll (GE Healthcare) foi realizada para isolar a camada leucocitária, e as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram classificadas em uma única célula em tampão de captura recém-feito (5 mL de água RNAse/50 µL de Tris 1 M pH 8/125 µL de Rnasin) em placas de 96 poços usando um BD
FACSARIA III. Reações de transcrição reversa foram realizadas para gerar cDNA como previamente descrito33,34. Dois PCRs internos incorporando iniciadores específicos para IgG, IgA, IgM, kappa e lambda foram realizados no cDNA para amplificar as cadeias pesadas e leves. O software IMGT/V-QUEST (The International Immunogenetics Information System) foi usado para visualizar os rearranjos produtivos da sequência da imunoglobulina. Dezesseis anticorpos contra o vírus da Zika foram isolados de um paciente, quatro dos quais são específicos para NS1 e posteriormente caracterizados neste estudo. Todos os quatro anticorpos específicos de NS1, AA12, EB9, FC12 e GB5 têm a cadeia pesada VH3-53/JH3 e são do isótipo IgG1 (Tabela 10).
[00437] Anticorpos humanos recombinantes: As regiões variáveis humanas pesadas (VH) e kappa (VK) dos anticorpos AA12, FC12, EB9 e GB5 foram amplificadas por PCR e clonadas em vetores de expressão humanos IgG1 e kappa de mamíferos, respectivamente ((pFUESss-CHIg- hIgG1 e pFUESss-CLIg-hK Invivogen). As mutações L234A, L235A e P329G (LALAPG) na cadeia pesada de IgG1 foram introduzidas por mutagênese dirigida ao local. A região variável da cadeia pesada de AA12 foi então clonada no vetor de expressão modificado para fazer AA12-LALAPG. Anticorpos de tipo selvagem ou LALAPG (cadeia pesada de IgG1 mutada com cadeia kappa de tipo selvagem) foram expressos e purificados como descrito anteriormente33.
[00438] ZIKV NS1 recombinante: Os segmentos do gene NS1 do vírus MR766 (Rhesus/1947/Uganda Accession: NC_012432, SEQ ID NO: 129) e vírus PRVABC59 (2015/Puerto Rico Accession: KU501215, SEQ ID NO: 130) foram códon humano otimizado usando Ferramenta de otimização de códon da DNA Technologies integrada (http://www.idtdna.com/CodonOpt) e modificada para conter uma etiqueta hexahistidina C-terminal. Os segmentos do gene NS1 foram subclonados no plasmídeo de expressão pCAGGS usando endonucleases de restrição NotI e XhoI (New England Biosciences) e inseridos no plasmídeo digerido por recombinação homóloga (In-Fusion, Takara) para construir pCAGGS-MR766-NS1 e pCAGGS-PRVABC59-NS1 . Para gerar proteínas NS1 recombinantes, 30 mL de células Expi293 foram transfectadas com 30 ug de plasmídeos pCAGGS-MR766-NS1 ou pCAGGS- PRVABC59-NS1 e 81 uL de reagente de expifectamina de acordo com as instruções do fabricante. Após 120 horas, os sobrenadantes foram clarificados por centrifugação de baixa velocidade e incubados com resina Ni-NTA durante a noite a 4˚C. A mistura resina-sobrenadante foi então passada por colunas de polipropileno de 10 mL (Qiagen).
A resina retida foi lavada quatro vezes com 15 ml de tampão de lavagem (Na2HCO3, 300 mM NaCl, 300 mM imidazol, pH 8) e a proteína foi eluída com tampão de eluição (Na2HCO3 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 300 mM, pH 8). O eluato foi concentrado usando unidades de centrifugação Amicon Ultracell (Millipore) com um corte de 10 kDa e o tampão foi mudado para solução salina tamponada com fosfato
(PBS) de pH 7,4. A concentração de proteína foi quantificada usando Pierce Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit (Thermo Scientific) com uma curva padrão de albumina de soro bovino. As proteínas NS1 solúveis purificadas foram resolvidas em um gel SDS-PIDADE redutor e desnaturado (em formas monoméricas de cerca de 45 kDa e formas homodiméricas de cerca de 90 kDa) e visualizadas usando SimplyBlue SafeStain (Thermofisher, Inc.).
[00439] Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA): As placas foram revestidas com ZIKV NS1 recombinante a 2 μg/ML em tampão de carbonato de pH 9,41 durante a noite a 4˚C. Após o bloqueio em 5% de leite desnatado (NF) por 1 hora, os mAbs foram incubados em uma concentração inicial de 10 μg/ML e diluídos em série 3 vezes e incubados 2 horas em temperatura ambiente. O anticorpo IgG anti- humano conjugado com peroxidase de rábano (HRP) (AP504P; Millipore Sigma) foi usado para detectar a ligação dos mAbs, seguido pelo desenvolvimento com substrato HRP (Sigmafast OPD; Sigma-Aldrich).
As reações foram interrompidas pela adição de HCl 3M e a absorvância foi medida a 490 nm em um espectrofotômetro de microplaca (BioRad). Os experimentos foram realizados em duplicata e repetidos duas vezes. O Graphpad Prism 5 foi usado para visualizar os valores médios e o erro padrão da média (SEM) e gerar uma curva de regressão não linear.
[00440] Imunofluorescência: células Vero foram infectadas com ZIKV MR766, ZIKV PRVABC59 ou vírus da dengue tipo 3,
Filipinas/H87/1956 com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1.
Após 24 horas após a infecção, a monocamada de células Vero foi fixada em 0,5% de paraformaldeído (PFA)/1X PBS. As células foram bloqueadas com 5% de leite desnatado por 30 minutos em temperatura ambiente. O tampão de bloqueio foi então descartado e mAbs específicos de NS1 foram adicionados a uma concentração de 5 µg/mL em leite desnatado. Os anticorpos primários foram incubados durante 2 horas à temperatura ambiente, após o que a monocamada foi lavada três vezes com 1X PBS. Um anticorpo secundário IgG anti- humano ou anti-rato conjugado com Alexa Fluor 488 (ThermoFisher) diluído (1:000) em leite desnatado foi adicionado à monocamada e incubado no escuro em temperatura ambiente por 1 hora. A monocamada foi então lavada três vezes com 1X PBS. As células foram então visualizadas usando um microscópio fluorescente invertido (Olympus IX70).
[00441] Ensaio de microneutralização (MN): Para avaliar a atividade de neutralização in vitro dos mAbs, realizamos um ensaio de MN. Anticorpo diluído em série três vezes (começando em 100 μg/mL) em meio essencial mínimo sem soro (MEM) foi misturado com um volume igual de vírus (100 TCID50) e incubado por 1 hora em temperatura ambiente. Monocamadas de células Vero foram lavadas uma vez com PBS e a mistura de vírus/anticorpo foi adicionada às células e incubada por 1 hora a 37°C. Após a infecção, a mistura de vírus/anticorpo foi removida e substituída por MEM sem soro com anticorpo adicionado na diluição apropriada. As células foram então incubadas a 37˚C por 72 horas. O efeito citopático (CPE) foi avaliado três dias após a infecção e o IC50 foi quantificado pelo método de Reed e Muench.
[00442] Funções efetoras anticorpo-dependentes: Para experiências envolvendo células infectadas, células Vero foram semeadas em placas de fundo branco plano de 96 poços (Corning) e infectadas após 24 horas com ZIKV (MR766 ou PRVABC59) a um MOI de 0,01. Para experiências envolvendo células transfectadas, células HEK 293T foram semeadas em placas de fundo branco plano de 96 poços revestidas com poli-D-lisina (Corning). Após 24 horas, as células foram transfectadas com 100 ng por poço de plasmídeo de expressão que codifica NS1 de MR766 ou PRVABC59. Às 16 horas após a transfecção ou 40 horas após a infecção, o meio foi removido e 25 μL de tampão de ensaio (RPMI 1640 com FBS de IgG baixo a 4%) foram adicionados a cada poço. Em seguida, os mAbs foram adicionados em um volume de 25 μL a 30 μg/mL e diluídos em série quatro vezes em tampão de ensaio (em duplicata). Os mAbs foram então incubados com as células transfectadas ou infectadas durante 30 minutos a 37°C.
Células Jurkat geneticamente modificadas que expressam o FcγRIIIa humano com um gene repórter de luciferase sob o controle da transcrição do promotor de células T ativadas por fator nuclear (NFAT) foram adicionadas a 7,5 x 104 células a 25 μL por poço, que é aproximadamente uma proporção de 1:2 de células-alvo para células efetoras, seguido de incubação por mais 6 h a 37˚C (Promega). O reagente de ensaio Bio-Glo Luciferase foi adicionado após 6 h e a luminescência foi quantificada usando um leitor de placas. A indução dobrada foi medida em unidades de luz relativa e calculada subtraindo o sinal de fundo dos poços sem células efetoras, em seguida, dividindo os poços com anticorpo por sem adição de anticorpo. Especificamente, a indução de dobra foi calculada da seguinte forma: (RLUinduzido- RLUbackground)/(RLUnão induzido - RLUbackground).
Os valores médios e SEM foram relatados e uma curva de regressão não linear foi gerada usando GraphPad Prism 5.
[00443] Alternativamente, medimos as funções efetoras dependentes de anticorpos detectando a ativação de células assassinas naturais humanas primárias (NK) (expressão de CD107a), conforme descrito anteriormente47. Resumidamente, as células Vero foram semeadas a 2 x 104 células/poço em placas tratadas com cultura de células de 96 poços e infectadas com PRVABC59 ZIKV com um MOI de 0,5 (ajustado para crescimento celular durante a noite). A 48 hpi, o meio de crescimento de células Vero infectadas foi aspirado e incubado com diluições (50 µL de volume total) de mAbs específicos de NS1 (diluídos em 1X meio de Iscove suplementado com 10% de FBS) começando com 20 µg/mL, diluído em série 3-dobras e incubado a 37ºC, CO2 por 1,5 horas. Um mAb humano específico para a hemaglutinina do vírus influenza B, II2C7, foi usado como um mAb irrelevante e um grupo não contendo mAb foi usado como controle de fundo. As células NK humanas foram isoladas (Lymphoprep; Stemcell Technologies, Inc.) de doadores de capa leucocitária (San Diego Blood Center) por meio de seleção negativa (kit de isolamento de células EasySep Human NK; Stemcell Technologies, Inc.) e 8 x 105 células CD56+/poço (em 50 µL de meio de Iscoves 1X suplementado com FBS a 10%; razão de células efetoras para alvo de 2) foram subsequentemente adicionados às células Vero infectadas com ZIKV e à mistura de mAb (volume total de 100 µL). As células foram incubadas por 3 horas a 37ºC, CO2. As células foram então lavadas com tampão de lavagem (1X PBS/1% BSA) e coradas com CD56-FITC (Clone B159 BD Biosciences; 5 µL por células 1e6) e CD107a-PE (Clone H4A3 BD Biosciences; 20 µL por células 1e6) para 15 minutos a 4ºC (no escuro). As amostras foram então resolvidas em um classificador de citômetro de fluxo BD FACS ARIA II (BD Biosciences) e analisadas usando FlowJo 10.5.0. Os experimentos foram realizados em duplicatas e a média/erro padrão foram representados graficamente usando GraphPad Prism 5.
[00444] Determinação KD. Os ensaios de interferometria de biocamada foram realizados com um instrumento Octet RED (ForteBio, Inc.) para determinar os valores de KD. NS1 recombinante purificado foi carregado em um biossensor Ni-NTA (ForteBio, Inc.) em tampão cinético (1X PBS pH 7,4, 0,01% BSA, 0,002% Tween-20) por 3 min.
Para determinar o kon, a associação foi medida por 3 min, expondo os sensores a sete concentrações de anticorpo diluído em tampão cinético. Para determinar o koff, a dissociação foi medida durante 3 min em tampão cinético. Os valores de KD foram calculados como as razões de kon para koff. Usamos um modelo de ligação 2:1 para refletir dois locais de ligação idênticos de proteínas NS1 homodiméricas. K1 e K2 refletem as constantes cinéticas da primeira e segunda interação de ligação entre o mAb e um NS1 homodimérico.
[00445] Aumento da infecção anticorpo-dependente: O aumento da infecção pelo ZIKV foi medido usando um ensaio baseado em citometria de fluxo14. Diluições em série de anticorpo monoclonal purificado foram misturadas com ZIKV (PRVABC59 MOI de 1) por 1 hora a 37˚C em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina e antibióticos (100 unidades/ml de penicilina-100 µg/mL estreptomicina [Pen-Strep]; Gibco). A mistura foi então adicionada a células K562 em placas de fundo U de 96 poços. Após dois dias, as células foram fixadas com 4% de PFA/1X PBS, permeabilizadas com PBS contendo 0,2% de BSA e 0,05% de saponina e coradas com anticorpo anti-envelope 4G2 pan-flavivírus (1 μg/mL) por 1 h em RT. As células foram então incubadas com IgG anti-rato de cabra conjugado com ficoeritrina (1 μg/mL; Invitrogen) por 1 h em temperatura ambiente. O número de células infectadas foi determinado por citometria de fluxo usando um calibre FACS e analisado usando o software FlowJo2 versão 10.1.r7. A área sob a curva foi calculada usando GraphPad Prism.
[00446] Estudos de transferência passiva: Todos os experimentos com animais foram realizados em uma instalação de nível 2 de biossegurança animal, de acordo com a Icahn School of Medicine em Mount Sinai e a Universidade da Califórnia, Riverside Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Grupos de 5 a 9 ratos B6.129-Stat2-/- machos e fêmeas (gentilmente cedidos pelo Dr. Christian Schindler) foram transferidos passivamente com 20 mg/kg ou 10 mg/kg de AA12, ou 10 mg/kg de anticorpo AA12-LALAPG intraperitonealmente. Os ratos de controle receberam o anticorpo humano anti-influenza CR911454 numa dose de 10 mg/kg. Os ratos foram desafiados intradermicamente com 10 LD50 ZIKV MR766 ou retro- orbitalmente com 500 PFU de ZIKV PAN/2015 e avaliados por 14 dias.
Os ratos foram monitorados diariamente para peso e sinais clínicos.
A pontuação clínica foi conduzida usando os critérios pré- definidos com uma pontuação máxima possível de 7: impacto na caminhada, falta de resposta, perna traseira esquerda paralisada, perna traseira direita paralisada, perna dianteira esquerda paralisada e perna dianteira direita paralisada. Os animais mortos receberam uma pontuação de 714,55. Os animais que apresentaram perda de peso superior a 25% ou paralisia total foram sacrificados humanamente. Os experimentos foram conduzidos com uma quantidade equilibrada de ratos machos e fêmeas e com uma distribuição uniforme de ratos de ninhadas diferentes, sempre que possível.
Para determinar a significância estatística, os testes de Mantel-
Cox e Gehan-Breslow-Wilcoxon foram usados para curvas de sobrevivência e um teste t múltiplo e o método de Holm-Sidak utilizado para analisar a curva de peso e os escores clínicos.
Asteriscos nos gráficos indicam significância estatística (* = p value < 0,05 e ** = p value < 0,005) de um grupo em comparação com o grupo de controle IgG.
[00447] Títulos virais: Amostras de tecido foram colhidas de ratos infectados, colocadas em PBS e homogeneizadas usando esferas de cerâmica. A quantificação de ZIKV foi realizada por meio de ensaio de placa. Resumidamente, células Vero foram semeadas em placas de 24 poços e infectadas após 24 horas com diluições de vírus feitas em meio MEM 1X sem soro. O meio infeccioso foi aspirado e 600μL de meio equivalente de ágar metilcelulose foram adicionados a cada poço. No dia 4 pós-infecção, as placas foram fixadas com PFA 4% por 1 hora à temperatura ambiente, lavadas e coradas com 4G2 no leite a 5μg/mL. HRP anti-rato secundário foi então adicionado a 1:5000 no leite e o ensaio foi resolvido com TrueBlue Peroxidase Substrate (VWR). As placas foram contadas manualmente e as unidades formadoras de placa (PFU) por mL de tecido homogeneizado foram calculadas.
[00448] ELISA de complemento: Um kit de ELISA de complemento de rato C3 (Abcam: ab157711) foi usado de acordo com as instruções do fabricante para medir os níveis de C3 no soro de ratos infectados ou virgens. Resumidamente, o soro foi diluído 1:50.000 e pipetado em poços designados. Em paralelo, uma curva padrão foi gerada a partir de concentrações conhecidas de C3. A placa foi incubada durante vinte minutos, lavada e foi adicionado um conjugado enzima- anticorpo 1X. Após incubação por vinte minutos e lavagem adicional, substrato TMB foi adicionado e a absorbância foi medida a 450 nm em um espectrofotômetro de microplaca (BioRad).
[00449] Aprovação do estudo: Um consentimento informado por escrito aprovado pelo IRB foi obtido do paciente antes da participação no estudo. Nenhum outro dado demográfico é incluído aqui para proteger a privacidade do participante.
[00450] Análise estatística: Os resultados de vários experimentos são apresentados como média ± SEM. Os testes t de Student foram usados para testar as diferenças estatísticas entre os valores médios. Os dados foram analisados com o software GraphPad Prism 7 e valores de p <0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
6.1.3 Resultados
[00451] Anticorpos direcionados à proteína NS1 do vírus da Zika são induzidos em humanos
[00452] Para investigar a resposta de anticorpos à infecção por ZIKV, células mononucleares de plasma e sangue periférico isoladas (PBMCs) foram obtidas de um paciente que foi infectado com ZIKV enquanto viajava pela América Central. O paciente provavelmente não foi pré-exposto à dengue com base na história e em viagens anteriores. O sangue foi coletado dez dias após o paciente apresentar teste positivo para RNA do ZIKV por RT-PCR. Um protocolo publicado foi adaptado para isolar mAbs específicos para o vírus da Zika do compartimento de plasmablast do paciente infectado33,34.
[00453] Após a seleção de células B, as regiões variáveis das imunoglobulinas foram sequenciadas, clonadas em um vetor de expressão de IgG1 humana e, subsequentemente, expressas em células HEK 293F, conforme descrito anteriormente33,34. Os mAbs foram, então, inicialmente selecionados para reatividade a células Vero infectadas com ZIKV por imunofluorescência. As células Vero foram infectadas com uma das duas cepas do vírus da Zika: ou a linhagem africana MR766, que foi isolada em Uganda de um macaco rhesus em 1947 e subsequentemente passada em ratos, ou a linhagem asiática PRVABC59, que foi isolada em Porto Rico de um ser humano paciente em 2015 e é representativo da cepa circulante atual. Além disso, um isolado de DENV-3 das Filipinas foi testado para determinar se os anticorpos apresentavam reação cruzada com outros flavivírus.
Três dos mAbs (AA12, EB9 e GB5) ligaram-se às células infectadas por MR766 e PRVABC59 e um anticorpo (FC12) que ligou às células infectadas apenas por PRVABC59 (Figura 1a). Nenhum dos anticorpos apresentou reação cruzada com células infectadas com DENV-3. Em seguida, foi testado se os anticorpos se ligaram por ELISA à proteína NS1 recombinante (Figura 1b, c). NS1 de ambas as cepas MR766 e PRVABC59 de ZIKV foram expressas e purificadas. Como esperado, três anticorpos se ligaram a NS1 (AA12, EB9 e GB5) de ambas as cepas de ZIKV, enquanto o FC12 se ligou apenas a NS1 do isolado recente de ZIKV PRVABC59. Todos os mAbs foram originalmente considerados do isótipo IgG1 e carregavam um baixo número de mutações somáticas (Tabela 10). A atividade de neutralização foi examinada por ensaios de microneutralização e nenhum dos mAbs específicos de NS1 exibiu atividade de neutralização contra PRVABC59 ou MR766 (Tabela 10). As afinidades de ligação de cada anticorpo para PRVABC59 e MR766 foram então determinadas usando interferometria de biocamada (Tabela 9). As constantes de ligação usando interferometria de biocamada (Tabela 9) foram consistentes com os dados ELISA observados (FIG. 1B, 1C). Como esperado, o FC12 se ligou apenas a NS1 do isolado recente de ZIKV PRVABC59, enquanto AA12, GB5 e EB9 se ligaram potentemente a PRVABC59 ou MR766.
[00454] Anticorpos específicos de NS1 ativam funções efetoras mediadas por Fc-FcγR in vitro
[00455] Em seguida, foi avaliada a capacidade de mAbs específicos de NS1 para se envolver em funções efetoras mediadas por Fcγ. Para modelar a ativação de ADCC, o seguinte foi usado uma linha de células Jurkat geneticamente modificada que expressa FcγRIIIa humano e um repórter de luciferase sob um promotor de fator nuclear de células T ativadas (NFAT) como um substituto para examinar a capacidade desses mAbs de se engajarem e então ativar funções efetoras mediadas por Fcγ. Primeiro, as células Vero foram infectadas com MR766 ou PRVABC59 ZIKV. Em seguida, mAbs específicos de NS1 em concentrações que variam de 10 a 0,002 μg/mL foram adicionados. Consistente com os resultados de ELISA anteriores, três mAbs (AA12, EB9 e GB5) induziram funções efetoras em células infectadas com ZIKV MR766 e PRVABC59 e um anticorpo (FC12) induziu funções efetoras apenas em PRVABC59 ZIKV (FIG. 2A, 2B).
[00456] Em seguida, foi determinado se a transfecção de NS1 é suficiente para ativar funções efetoras Fc-FcγR por transfecção de células HEK 293T com um plasmídeo de expressão (pCAGGS) expressando NS1 de MR766 ou PRVABC59 ZIKV. Após a incubação com os mesmos mAbs nas mesmas concentrações, verificou-se que apenas dois dos mAbs (AA12 e EB9) induziram funções efetoras em células transfectadas com ZIKV MR766 e PRVABC59, enquanto os dois anticorpos restantes induziram funções efetoras em células transfectadas por NS1 de PRVABC59 ZIKV (FIG 2C, 2D). A discrepância observada no anticorpo GB5 pode ser devido a uma eficiência de transfecção limitada de NS1 em comparação com NS1 sendo expresso a partir de células infectadas. Alternativamente, a conformação de NS1 transfectada do isolado PRVABC59 ZIKV pode limitar o epítopo GB5 em comparação com a proteína NS1 expressa por células infectadas. No entanto, pode- se concluir que a proteína NS1 de superfície na ausência de infecção viral é suficiente para ativar as funções efetoras mediadas por Fcγ induzidas por mAbs específicos de NS1.
[00457] Por último, foi demonstrado que os mAbs específicos de NS1 podem direcionar a ativação de células NK primárias humanas.
Aqui, as células Vero foram infectadas com PRVABC59 ZIKV a um MOI de 0,5. 48 horas após a infecção, diluições de mAbs de IgG1 específicos de NS1, um mAb irrelevante ou nenhum mAb (começando em 20 µg/mL) em combinação com células NK primárias humanas isoladas foram incubadas com as células Vero infectadas com ZIKV. Após três horas, a ativação das células NK foi medida como porcentagem de células CD56+ que expressam CD107a. Como mostrado na Figura 7, todos os mAbs específicos de NS1 podem ativar de forma mensurável a expressão de CD107a de células NK de dois doadores, variando de 32% a 18% a 20 µg/mL. Digno de nota, a expressão de CD107a entre os grupos de IgG irrelevante e controle de linha de base (sem mAb adicionado) se correlacionarem entre si em cerca de 14,06% para o doador 1 e 22,6% para o doador 2.
[00458] Anticorpos específicos de NS1 não aumentam a infecção pelo vírus da Zika ou dengue in vitro
[00459] Em seguida, foi avaliado se os mAbs específicos de NS1 eram capazes de aumentar a infecção de células-alvo in vitro. ADE é comumente observado quando um anticorpo que opsoniza, mas não neutraliza totalmente um vírion, facilita a infecção de células- alvo portadoras do receptor Fcγ. ADE foi medido usando um ensaio baseado em citometria de fluxo no qual diluições em série de anticorpo monoclonal ou soro foram misturados com PRVABC59 ZIKV e adicionados a células K562 contendo FcγR, que são tipicamente não permissíveis à infecção por ZIKV. Após 48 horas, as células foram fixadas e coradas para a proteína de envelope usando anticorpo 4G2 murino e o número de células infectadas foi determinado por citometria de fluxo. Verificou-se que nenhum dos mAbs específicos de NS1 aumenta a infecção por Zika in vitro (FIG. 3). Em contraste, um alto nível de atividade ADE foi observado quando as células K562 foram infectadas na presença de plasma imune ao DENV, indicando a presença de anticorpos de reação cruzada entre ZIKV e DENV consistente com a literatura publicada14,35.
[00460] O anticorpo monoclonal AA12 fornece proteção contra desafios heterólogos letais
[00461] Para avaliar a capacidade dos mAbs específicos de NS1 para proteger contra a doença ZIKV in vivo, foram realizados experimentos de desafio letal em um modelo de rato. Como o vírus da Zika não se replica em ratos do tipo selvagem, foram usados ratos Stat2-/-, que são permissivos à infecção pelo vírus da Zika e podem apresentar sinais clínicos da doença36. O Anticorpo AA12 foi administrado de modo intraperitoneal a 20 mg/kg duas horas antes do desafio. O mAb irrelevante a 20 mg/kg foi usado como um controle negativo de isotipo. Os ratos foram então infectados com dez doses letais de rato de 50% (10LD50) da cepa do vírus da Zika MR766 e a perda de peso, pontuação clínica e sobrevivência foram monitorados diariamente. Os ratos Stat2-/- foram criados internamente e os tamanhos das colônias foram um fator limitante no número de ratos em cada grupo a ser testado.
Portanto, os estudos de desafio murino foram realizados como duas ou três réplicas independentes com pelo menos três ratos por grupo de tratamento e os dados foram então agrupados.
Os ratos que receberam
20 mg/kg de AA12 mostraram perda de peso mínima (FIG. 4A), taxa de sobrevivência significativamente melhorada (FIG. 4B) e pontuação clínica significativamente mais baixa em 6 a 14 dias após a infecção (dpi) (exceto 8 dpi) em comparação para o controle de IgG
(FIG. 4C). Especificamente, os ratos que receberam 20 mg/kg de
AA12 tiveram uma taxa de sobrevivência de 83%, enquanto o controle de IgG sucumbiu à doença (0% de sobrevivência). Para determinar se a proteção é relevante para o recente surto do vírus da Zika ou limitada à cepa MR766 adaptada a ratos, os mAbs foram testados contra uma cepa contemporânea do Panamá 2015 (H/PAN/2015/CDC-
259359) da linhagem do vírus da Zika asiático (FIG 4D, 4E). Os ratos foram desafiados com o isolado PAN/2015, pois este vírus em particular demonstrou mortalidade consistente na dose de 500 PFU em ratos Stat2-/-. Em linha com os dados anteriores acima, AA12 foi capaz de proteger significativamente os animais da mortalidade com
10 mg/kg (63% de sobrevivência), enquanto o controle de IgG não o foi (0% de sobrevivência). AA12 tendeu a uma maior proteção no desafio da cepa Panamá 2015 do que o desafio MR766, provavelmente devido ao aumento da neurovirulência da cepa MR766 adaptada aos ratos. Os dois outros anticorpos monoclonais EB9 e FC12 também foram testados no mesmo desafio de transferência passiva usando PAN/2015 (FIG. 8). Os resultados demonstram que o EB9 protegeu 50% dos ratos e o FC12 protegeu apenas 25% dos ratos em comparação com o grupo de controle IgG. Uma vez que o AA12 forneceu altos níveis de proteção contra o desafio letal da linhagem histórica africana e asiática mais moderna de vírus da Zika, conforme mostrado nas taxas de sobrevivência e pontuações clínicas da doença, este anticorpo foi usado para todos os experimentos futuros. Além disso, a carga viral foi medida em ratos infectados com PAN/2015 e tratados com 10 mg/kg de AA12 ou controle de IgG (FIG. 9). Nos dias 3 e 6 após a infecção, os ratos foram sacrificados e os baços e cérebros foram colhidos e homogeneizados. Os títulos virais foram então determinados por ensaio de placa. Curiosamente, nenhum vírus foi detectado nos cérebros de ratos infectados no dia 3 após o desafio. No entanto, no dia 6, o vírus foi detectado nos cérebros de todos os três ratos administrados com controle de IgG e apenas um dos três ratos no grupo de tratamento AA12. Nos baços de ratos no dia 3, houve uma redução significativa da carga viral entre os grupos de controle e de tratamento AA12, enquanto apenas um rato que recebeu AA12 teve uma carga detectável de vírus no dia 6.
Coletivamente, os dados demonstram que a administração de AA12 pode melhorar significativamente as taxas de sobrevivência contra duas cepas de ZIKV, prevenir a gravidade da doença e diminuir os títulos virais no baço de ratos.
[00462] A proteção mediada por NS1 é dependente do engajamento de FcγR nas células hospedeiras
[00463] Em seguida, foi examinado se as interações Fc-FcγR ou Fc-complemento são necessárias para fornecer proteção in vivo.
Primeiro, as regiões variáveis da cadeia pesada de AA12 foram clonadas em vetores de expressão contendo a estrutura de IgG1 humana com as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G37-39.
Essas mutações abolem a interação da região Fc com os receptores Fcγ e as proteínas do complemento. Para confirmar que as mutações não interferem com a ligação ao antígeno, ambas as variantes foram testadas por ELISA (FIG. 5A e 5B). Tanto a forma WT quanto a forma mutada de AA12 ligaram-se às proteínas MR766 e PRVABC59 NS1 de forma idêntica. Estas variantes foram testadas novamente em um ensaio de engajamento Fc-FcγR e, como esperado, apenas a variante AA12 de tipo selvagem mostrou atividade (FIG. 5C e 5D).
[00464] Em seguida, foi examinado se a variante AA12 tem alguma atividade protetora in vivo, realizando o mesmo desafio de transferência passiva profilática feito anteriormente com ZIKV MR766. Embora as alterações de peso não tenham sido substancialmente diferentes dos diferentes grupos (Figura 6a), a administração de tipo selvagem AA12 (10 mg/kg) melhorou significativamente a taxa de sobrevivência (~ 53%) e pontuação clínica em relação aos ratos que receberam AA12 com Fc-FcγR ablacionado e interações do complemento (LALAPG) ou o controle de IgG (FIG. 6B). Por último, os dados demonstram que as interações Fc-FcγR ou Fc-complemento são necessárias para prevenir o início da doença grave, pois o tipo selvagem AA12 pode diminuir significativamente a pontuação clínica (dias 10 a 14) (FIG. 6C).
Em seguida, as mutações L234A, L235A ou a mutação P329G sozinhas foram testadas pela introdução das mutações pontuais LALA ou PG no anticorpo AA12. Os anticorpos com qualquer uma dessas mutações sozinhas tinham afinidade de ligação comparável com o tipo selvagem, eram inativos no ensaio de engajamento Fc-FcγR (Figura 10) e foram testados em um desafio de transferência passiva profilática com ZIKV MR766. O AA12 LALA não foi protetor e o AA12 PG protegeu apenas 25% dos ratos. É possível que a mutação de ponto único em PG não interrompa completamente o engajamento de Fc-FcγR e algumas funções efetoras de Fc-FcγR permaneçam resultando em proteção modesta no modelo de desafio. No entanto, como mostrado na FIG. 6C, tanto AA12 LALA quanto AA12 PG falharam em diminuir o início da doença grave. No geral, os dados reforçam as descobertas anteriores de que as funções efetoras Fc-FcγR permanecem críticas na proteção proporcionada pelo mAb AA12. Em seguida, foi determinado se o complemento foi ativado durante a infecção pelo vírus da Zika. Foi testado se o tratamento com as variantes AA12 ablacionou a ativação do complemento em comparação com o AA12 de tipo selvagem. O complemento no soro no dia 6 após a infecção foi medido por ELISA em quatro dos ratos usados no desafio da Figura
6. Esse dia 6 foi escolhido porque os ratos normalmente começam a mostrar sinais clínicos de infecção e alta carga viral neste ponto.
Todos os ratos submetidos ao desafio apresentaram níveis mais elevados de ativação do complemento em comparação com ratos STAT2- /- não infectados ingênuos (FIG. 11). No entanto, os níveis de complemento foram mais elevados em ratos infectados que receberam o controle IgG. Portanto, é provável que esses níveis se correlacionem mais com a morbidade e sejam ativados pelo aumento da replicação viral e pelo estado pró-inflamatório intensificado resultante. Como o AA12 de tipo selvagem protegeu os ratos contra o desafio de forma mais eficaz do que AA12 LALA ou AA12 PG, não é surpreendente que os níveis de complemento foram mais elevados nos últimos dois grupos.
6.1.4 Discussão
[00465] Vários outros grupos isolaram e caracterizaram anticorpos monoclonais humanos para ZIKV8–12; no entanto, o foco principal desses estudos foi na neutralização potente de anticorpos direcionados a E, a glicoproteína de envelope de superfície presente no vírion. Embora uma forte resposta de anticorpos neutralizantes às proteínas virais estruturais contribua para a proteção contra infecções e doenças, pouco se sabe sobre os anticorpos não neutralizantes que têm como alvo as proteínas não estruturais, como NS1. Atualmente, há poucos dados sobre a eficácia protetora dos anticorpos monoclonais que têm como alvo a proteína NS1 do vírus da Zika. Como muitas vacinas de flavivírus candidatas omitem o componente NS140, é possível que os anticorpos direcionados ao NS1 sejam negligenciados na resposta imune protetora à infecção pelo ZIKV em humanos. Digno de nota, um estudo recente destaca a importância de incorporar NS1 em uma vacina multivalente contra ZIKV41. Embora o vírus da Zika tenha um sorotipo em relação à resposta neutralizante42, pouco se sabe sobre se os anticorpos não neutralizantes contra NS1 são capazes de atingir várias cepas do vírus. NS1 é altamente conservado entre as cepas do vírus da Zika, aproximando-se de 99,3% de identidade de sequência43. O alto nível de conservação em proteínas NS1 implica uma resposta imune direcionada a NS1 pode proteger contra todas as cepas circulantes e é um bom alvo candidato para uma vacina. Na verdade, um estudo recente demonstrou que uma vacina baseada em ZIKV NS1 usando um vetor de Vaccinia Ankara modificado (MVA) é protetora contra um desafio de ZIKV heterólogo em ratos32.
Notavelmente, a vacina foi dada a ratos do tipo selvagem que foram posteriormente desafiados intracerebralmente. Como não foram realizados estudos de transferência passiva, não está claro qual braço da resposta imune adaptativa, imunidade de anticorpo mediada por células ou humoral, contribuiu mais para a proteção contra doenças. Os estudos aqui descritos baseiam-se em trabalhos anteriores e indicam que os mAbs específicos de NS1 contribuem para a proteção e devem desempenhar um papel importante na formulação de novas vacinas de flavivírus.
[00466] No presente estudo, plasmablastos isolados de PBMCs de um indivíduo infectado com ZIKV cerca de 15 a 20 dias após a infecção. A clonagem das regiões variáveis das sequências de anticorpos isoladas de plasmablastos revelou quatro mAbs específicos de NS1 que podem se ligar ao isolado recente de ZIKV em Porto Rico (PRVABC59). Curiosamente, apenas o anticorpo FC12 é incapaz de se ligar à cepa histórica de Uganda (MR766) do ZIKV, que foi isolada de macacos rhesus em 1947 e subsequentemente passada em ratos. Embora a proteína ZIKV NS1 seja altamente conservada em muitas cepas, a descoberta de que um (FC12) dos quatro mAbs isolados reconheceu apenas uma cepa recente de ZIKV sugere que pode haver diferentes regiões imunodominantes de NS1 que variam entre os isolados. Ao isolar e caracterizar mais mAbs específicos de NS1, as regiões antigênicas da proteína NS1 podem ser mapeadas e usadas para incorporar a proteína NS1 em vacinas candidatas de ZIKV. Com a interferometria de biocamada, mostramos que a afinidade dos anticorpos está entre 10-7 a 10-8 molar, o que sugere um nível moderado de afinidade. No entanto, a maneira bivalente pela qual os mAbs específicos de NS1 se ligam a NS1 homodimérico sugere que a avidez pode desempenhar um papel no aumento da sua função biológica in vivo. Embora a afinidade calculada seja menor do que a de muitos anticorpos neutralizantes potentes, deve-se notar que esses anticorpos têm níveis mais baixos de hipermutação somática. Especula-se que mais anticorpos específicos para NS1 podem ser encontrados com maiores afinidades e níveis de hipermutação somática no compartimento de células B de memória do mesmo indivíduo ou em indivíduos que tiveram exposições repetidas ao vírus.
[00467] As vacinas que induzem mAbs específicos de NS1 não correm o risco de induzir o aumento da doença dependente de anticorpos (ADE). Em contraste, a recente vacina Dengvaxia®, que induzia anticorpos aos componentes estruturais do vírus da dengue, causou um risco aumentado de doença grave em crianças ingênuas de flavivírus, resultando na suspensão da venda e distribuição da vacina nas Filipinas44,45. Até o momento, não há casos claros envolvendo ADE induzido pela infecção pelo ZIKV em humanos. No entanto, a transferência passiva de plasma imune de DENV ou WNV para ratos imunocomprometidos resultou em progressão da doença mais grave após a infecção por ZIKV14. Além disso, os anticorpos monoclonais induzidos pelo ZIKV podem aumentar a infecção de DENV in vitro8. Essa é uma grande preocupação, pois os vírus ZIKV e dengue estão intimamente relacionados, compartilham o mesmo mosquito vetor e afetam as mesmas regiões geográficas. Os estudos aqui descritos sugerem que, como os mAbs específicos de NS1 são incapazes de aumentar a absorção viral in vitro, uma vacina baseada em NS1 será uma alternativa mais segura para as preparações de vacina de flavivírus atuais.
[00468] Usando um modelo de desafio murino, é demonstrado aqui que os mAbs específicos de NS1 podem prevenir a morte e a doença in vivo. Os estudos neste documento usam ratos B6.129-Stat2-/- que são desafiados intradermicamente com MR766 ou retro-orbitalmente com PAN/2015. Embora as duas sequências do ZIKV sejam altamente conservadas, os vírus foram isolados com 68 anos de intervalo e exibem diferentes fenótipos em ratos. Portanto, ambas as cepas foram testadas nos estudos aqui descritos. A infecção com a cepa MR766 representa um desafio rigoroso, induzindo um nível mais alto de citocinas inflamatórias e sintomas neurológicos graves quando ratos são infectados por via intradérmica36. Os ratos infectados com a cepa de linhagem asiática PAN/2015 foram infectados retro- orbitalmente para exibir letalidade consistente nos modelos de desafio. Descobrimos que o mAb AA12 é capaz de melhorar significativamente as taxas de sobrevivência de ratos com doses de 20 mg/kg (83%) ou 10 mg/kg (53%) durante o desafio com MR766 e com uma dose de 10 mg/kg (63%) durante o desafio do PAN/2015. Além disso, ambas as doses de tipo selvagem AA12 diminuíram significativamente a doença, conforme medido pela pontuação clínica. O tratamento de AA12 também reduziu significativamente a carga viral nos baços de ratos infectados com PAN/2015 no dia 3 após a infecção. Além disso, os dados mostram que EB9 e FC12 tendem a proteção parcial contra o isolado PAN/2015 recente de ZIKV a 10 mg/kg. Experimentos futuros determinarão o intervalo ideal pelo qual a proteção total é alcançada.
[00469] Foi descoberto que a proteção mediada por Fcγ induzida por anticorpos não neutralizantes ou fracamente neutralizantes desempenha um papel importante no contexto de muitas outras infecções virais, incluindo o vírus influenza A46-49, e não é surpreendente que essas funções possam proteger contra a doença pelo vírus da Zika. Para explorar se a imunidade mediada por Fcγ é necessária para proteção contra o desafio de ZIKV, a região variável da cadeia pesada de AA12 foi clonada em um plasmídeo de expressão com as mutações L234A, L235A e P329G na região Fc37-39.
Essas mutações resultaram em funções efetoras de Fcγ ablacionadas, conforme medido por um ensaio repórter substituto. A descoberta de que o mAb AA12 mutante (AA12-LALAPG (SEQ ID NO: 140) é incapaz de proteger ratos contra o desafio letal sugere que a ativação das funções efetoras mediadas por Fcγ é o mecanismo pelo qual a proteção é alcançada. Além disso, os anticorpos AA12 com o L234A, L235A ou as mutações P329G sozinhas também são incapazes de proteger ratos contra o desafio letal. Para determinar se o complemento desempenha um papel na redução da carga viral, os níveis de C3 foram medidos em ratos submetidos ao desafio letal.
Verificou-se que os níveis de C3 são elevados em ratos tratados com AA12 LALAPG, AA12 PG e controle de IgG em comparação com ratos tratados com AA12 de tipo selvagem. Como o AA12 de tipo selvagem suprime a carga viral e diminui a gravidade da doença, é observada uma supressão semelhante da ativação do complemento. No entanto, como os anticorpos mutantes são incapazes para proteger contra o desafio letal, os níveis de complemento são aumentados, provavelmente correlacionando-se com níveis aumentados de doença e carga viral.
[00470] Notavelmente, uma alta concentração de mAbs é necessária para conferir proteção contra o desafio letal. Como esses mAbs não são neutralizantes e têm como alvo uma proteína não estrutural, a imunidade esterilizante não é alcançada. Embora os anticorpos específicos de NS1 possam não proteger contra a infecção inicial, esses anticorpos limitam a gravidade da doença medida pela diminuição da perda de peso e pontuação clínica em animais tratados com anticorpos. A indução de proteção mediada por Fcγ por anticorpos específicos de NS1 pode, portanto, ser um correlato negligenciado de proteção na busca por vacinas promissoras para o vírus da Zika. Uma vacina completa que elicia não apenas anticorpos neutralizantes, mas também anticorpos específicos para NS1 pode aumentar a proteção contra a doença pelo vírus da Zika em humanos.
[00471] A falta de diagnósticos estabelecidos também dificulta o desenvolvimento da vacina contra o vírus ZIKV. Frequentemente, os títulos de anticorpos neutralizantes são usados como uma leitura se os níveis de RNA viral não forem detectados. O teste de soro por meio de testes de neutralização por redução de placa pode ser ainda mais complicado por altos níveis de anticorpos de reação cruzada do vírus da dengue. Como a proteína NS1 é altamente conservada entre as cepas de ZIKV, mas exibe apenas 55% de identidade com o vírus da dengue43, o teste de anticorpos específicos para NS1 pode levar a melhores diagnósticos de ZIKV.
Estudos recentes demonstram um teste rápido de antígeno baseado em NS1 usando anticorpos monoclonais50–52. Os dados aqui acrescentados a este trabalho relatando um anticorpo altamente específico (FC12) capaz apenas de reconhecer o isolado de ZIKV mais recente. Este anticorpo pode fornecer um alto nível de sensibilidade e especificidade na detecção de níveis séricos de ZIKV NS1 em pacientes infectados por surtos recentes.
[00472] Também é notável que todos os quatro anticorpos específicos de NS1 isolados deste paciente tiveram o mesmo rearranjo VH3-53/JH3, mas com cadeias leves diferentes (Tabela 1).
Esse mesmo rearranjo foi encontrado em anticorpos específicos para NS1 isolados de dois pacientes diferentes de um estudo recente separado53. Portanto, esse rearranjo é encontrado em muitos clones de células B expandidos em toda a população humana que têm como alvo o vírus da Zika NS1. É necessária uma investigação mais aprofundada sobre como esse rearranjo da linha germinativa afeta a ligação do anticorpo a NS1. Este também é o primeiro relato de anticorpos recorrentes que compartilham os mesmos genes IGV no contexto do vírus da Zika NS1.
[00473] Os efeitos teratogênicos do ZIKV no desenvolvimento do feto em mães grávidas são uma grande preocupação na epidemia em curso. Na verdade, foi a relação causal entre a infecção pelo ZIKV durante a gravidez e a microcefalia que levou a OMS a declarar o vírus da Zika uma “emergência de saúde pública de interesse internacional”. À luz do trabalho aqui descrito, estudos futuros devem examinar a prevenção da viremia e transferência materno- fetal de vírus por mAbs específicos de NS1 ou vacinas baseadas em NS1.
[00474] Em resumo, o trabalho aqui descrito ajuda a dissecar ainda mais os componentes da resposta do anticorpo contra o vírus da Zika. A importância dos mAbs direcionados à proteína NS1, que pode proteger dramaticamente contra doenças e morte em um modelo de desafio murino, foi destacada. Além disso, é demonstrado que a proteção baseada em anticorpos NS1 contra a doença de ZIKV é mediada por Fc. Por último, a falta de indução de ADE medida por um ensaio in vitro sugere que uma vacina baseada em NS1 pode reduzir o risco de doença grave em pacientes virgens de flavivírus em comparação com uma vacina baseada em proteína estrutural.
6.1.5 Referências citadas no histórico e no exemplo 1
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55. Duehr, J. et al. Tick-Borne Encephalitis Virus Vaccine- Induced Human Antibodies Mediate Negligible Enhancement of Zika Virus Infection In Vitro and in a Mouse Model. mSphere 3, e00011- 18 (2018).
6.2 EXEMPLO 2: ANTICORPOS PRODUZIDOS POR UMA VACINA BASEADA EM NS1 PROTEGEM RATOS CONTRA O VÍRUS DA ZIKA
6.2.1 Introdução
[00475] O vírus da Zika (ZIKV), um flavivírus relacionado ao vírus da dengue (DENV), causou uma epidemia que se espalhou rapidamente pelo mundo na última década1. A infecção pelo ZIKV pode causar doenças graves em humanos, incluindo microcefalia em recém- nascidos e síndrome de Guillain-Barré em adultos2–4. Embora seja transmitido principalmente por mosquitos da espécie Aedes infectados, o ZIKV também pode ser transmitido sexualmente ou da mãe para o feto5,6. A transmissão contínua nas Américas e na Índia sugere que o ZIKV agora é endêmico e grande parte da população mundial está em risco contínuo de infecção7,8. Devido à rápida disseminação do ZIKV e à doença particularmente grave exibida no desenvolvimento de fetos humanos, vacinas e tratamentos eficazes são extremamente necessários.
[00476] Vários estudos em ratos e primatas não humanos demonstraram a eficácia de múltiplas plataformas de vacinas9. As plataformas de DNA, mRNA, adenovírus e vírus inativados purificados têm mostrado resultados promissores em estudos pré- clínicos e de fase I10-14. Muitas dessas vacinas são projetadas para proteger contra a infecção pelo ZIKV, induzindo anticorpos neutralizantes que têm como alvo a glicoproteína E. do envelope de superfície. Esses anticorpos específicos do envelope podem neutralizar potentemente e fornecer imunidade esterilizante15,16.
No entanto, uma preocupação constante no campo da vacinologia com flavivírus, e no vírus da dengue em particular, é o desenvolvimento potencial de realce dependente de anticorpos (ADE) da doença17. O ADE ocorre quando os anticorpos ligados aos vírions não conseguem neutralizar o vírus, mas facilitam a internalização do vírion através dos receptores Fc das células imunes inatas. O aumento da internalização viral e a subsequente replicação levam aos desfechos de doença mais graves. No momento, não há evidência epidemiológica humana de que a imunidade anterior ao ZIKV aumente a dengue ou vice-versa. No entanto, evidências in vitro e in vivo sugerem que o aumento do ZIKV ou do vírus da dengue pode ocorrer em ambientes experimentais18,19. Como tal, uma abordagem de vacina visando proteínas virais não-envelope minimizaria o potencial de ADE da doença.
[00477] A resposta imune à infecção aguda do vírus flavivírus tem como alvo não apenas a proteína E, mas também as proteínas não estruturais, incluindo NS1. A proteína NS1 flaviviral tem sido implicada na evasão imune e replicação viral e tem funções intracelulares e extracelulares20. Intracelularmente, a proteína NS1 localiza-se em locais de síntese de RNA viral e é crítica para a replicação do genoma21. A proteína NS1 também é transportada para a membrana plasmática, onde se liga à superfície das células infectadas por um ligante de glicosilfosfatidilinositol putativo.
A forma secretada existe como hexâmero e se acumula em altos níveis no soro e nos tecidos. A forma extracelular da proteína NS1 é altamente antigênica e parece modular a resposta imune humoral. A forma extracelular da proteína NS1 do vírus da dengue também pode ativar as vias do complemento, potencialmente levando ao vazamento vascular22. No contexto do ZIKV, a proteína NS1 contribui para a evasão da resposta antiviral do hospedeiro e pode aumentar a absorção do vírus pelos mosquitos23,24. Uma resposta imune potente à proteína NS1 pode ter efeitos benéficos multifacetados, incluindo a diminuição da transmissão ao interromper o ciclo de transmissão urbana, bem como reduzir a carga de doenças em humanos pela eliminação das células infectadas por vírus25. Os anticorpos para a proteína NS1 não fornecem imunidade esterilizante porque não são neutralizantes. No entanto, anticorpos específicos de NS1 são conhecidos por ativar funções efetoras mediadas por Fc, como citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), fagocitose mediada por células dependente de anticorpos (ADCP) e lise mediada por complemento dependente de anticorpos26–
29. Além disso, estudos recentes sugerem que a resposta de anticorpos à proteína ZIKV NS1 é altamente específica e pode ser usada para fins diagnósticos30,31. Como mostrado no Exemplo 1, os anticorpos humanos que têm como alvo a proteína ZIKV NS1 podem fornecer proteção em ratos contra o desafio letal pelo ZIKV de uma maneira dependente de Fc32. Foi demonstrada uma diminuição no título viral, bem como redução na morbidade e mortalidade em ratos infectados transferidos passivamente com anticorpos anti-NS1 humanos. Portanto, a NS1 pode ser um componente-chave de uma vacina eficaz contra o ZIKV.
[00478] A proteína NS1 dos flavivírus foi considerada um componente potencial nas preparações de vacinas. A vacinação com a proteína NS1 do vírus da febre amarela preveniu a encefalite em ratos e a letalidade em macacos após o desafio viral33,34. Mais recentemente, a vacinação com a proteína NS1 do vírus da dengue evitou o vazamento vascular e o rompimento das barreiras endoteliais em ratos35. No entanto, a proteína NS1 do vírus da dengue também pode induzir autoanticorpos que apresentam reação cruzada com proteínas do hospedeiro presentes nas células endoteliais e plaquetas, o que pode resultar em dano endotelial36-
39. Esses fenômenos, no entanto, ainda não foram relatados para anticorpos direcionados à proteína Zika NS1. Hoje, alguns grupos estudaram o papel que a imunidade mediada por NS1 pode desempenhar na proteção contra o ZIKV, Brault et al. demonstraram que uma proteína ZIKV NS1 em um vetor Vaccinia Ankara modificado protege ratos do desafio viral intracraniano40. Dois grupos adicionais combinaram NS1 com pré-membrana/membrana (prM/M) e proteínas E e mostraram maior proteção fornecida por NS1-prM/M-E em comparação com prM/M-E sozinho41,42. Notavelmente, uma vez que nenhum desses estudos incluiu experimentos de transferência passiva, não está claro se o anticorpo ou a resposta imune mediada por células contribuíram mais para a proteção contra a doença.
[00479] Este exemplo fornece um regime de vacinação que consiste em um primer de DNA e dois reforços de proteína NS1 que desencadearam altos títulos de anticorpos para a proteína ZIKV NS1 em ratos de tipo selvagem. Este exemplo demonstra que a transferência passiva de soro é suficiente para proteger os ratos STAT2-/- do desafio letal, o que sugere que a resposta imune mediada por anticorpos é crítica para proteger contra doenças. O soro de ratos vacinados envolveu o FcγR em um ensaio repórter Fc-FcγR in vitro.
[00480] Este exemplo também demonstra que a imunidade mediada por NS1 é robusta e duradoura em humanos por meio da análise de amostras de soro de pacientes infectados por ZIKV agudos e convalescentes. Esses anticorpos gerados contra NS1 por infecção viral natural são funcionalmente ativos, conforme medido pelo mesmo ensaio repórter. Notavelmente, este exemplo demonstra que, embora os anticorpos de envelope policlonais de reatividade cruzada tenham desencadeados o ADE dependente de Fc da infecção in vitro, esses anticorpos de reatividade cruzada não ativaram funções efetoras de Fc-FcγR contra células infectadas com ZIKV.
Este exemplo indica que a resposta de anticorpo específico de NS1 permite imunidade mediada por células dependente de Fc robusta, que tem amplas implicações no projeto de vacinas eficazes de flavivírus.
6.2.2 Materiais e Métodos
[00481] Células e vírus. Células de rim embrionário humano 293T (HEK 293T) (American Type Culture Collection [ATCC] número de catálogo CRL-1573) e células de rim de macaco verde africano (Vero) (ATCC) foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Gibco) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) (HyClone) e antibióticos (100 unidades/mL penicilina-100 µg/mL estreptomicina [Pen-Strep]; Gibco). Células Expi293F de rim embrionário humano (Gibco) foram cultivadas em meio de expressão Expi293. O vírus ZIKV PRVABC59 (2015/Puerto Rico, BEI NR-50684) e o vírus ZIKV MR766 (Rhesus/1947/ Uganda, BEI NR-50065) foram obtidos de BEI Resources. Os vírus da Zika foram propagados em células Vero em meio essencial mínimo 1X (MEM); após 72 h pós- infecção (hpi), os sobrenadantes da cultura celular foram colhidos, divididos em alíquotas e armazenados a -80 °C até o uso.
[00482] vírus da Zika recombinante NS1. Dois plasmídeos de expressão de mamífero que expressam NS1 de ZIKV PRV-ABC59 (2015/Porto Rico; número de acesso GenBank KU501215, SEQ ID NO: 130) foram gerados incorporando os últimos 24 aminoácidos do envelope de ZIKV (NGSISLMCLALGGVLIFLSTAVSA, SEQ ID NO: 131) para o terminal amino da região de codificação NS1; a sequência inteira foi otimizada com códons humanos usando a ferramenta de otimização de códons da Integrated DNA Technologies. A primeira construção continha apenas o envelope parcial e as regiões de codificação NS1 inteiras, inserindo a inserção do gene sintético em pCAGGS digerido com NotI e XhoI (New England Biosciences), resultando em pCAGGS NS1 (Fig. 12A). Outro construto, um local de clivagem de PreScission Protease (LEVLFNGPG, SEQ ID NO: 132) e um motivo hexahistidina (HHHHHH, SEQ ID NO: 133) foram adicionados ao terminal carboxi da região de codificação NS1, resultando em pCAGGS NS1-His (Fig. 12B). Ambas as construções foram geradas usando recombinação homóloga (In-Fusion; TaKaRa). Para gerar proteínas
NS1 recombinantes, 30 ml de células Expi293 foram transfectadas com 30 µg de plasmídeos pCAGGS-NS1-His e 81 µl de reagente de transfecção ExpiFectamine (Gibco) de acordo com as instruções do fabricante. Após 120 h, as células foram sedimentadas por centrifugação em baixa velocidade e sonicadas. As células sonicadas foram sedimentadas novamente por centrifugação e o sobrenadante foi removido e incubado com resina Ni-NTA durante a noite a 4°C. A mistura resina-sobrenadante foi então passada por colunas de polipropileno de 10 ml (Qiagen). A resina retida foi lavada quatro vezes com 15 ml de tampão de lavagem (Na2HCO3 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 8), e a proteína foi eluída com tampão de eluição (Na2HCO3 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 300 mM, pH 8). O eluato foi concentrado usando unidades de centrifugação Amicon Ultracel (Millipore) com um corte de 10 kDa e o tampão foi trocado por solução salina tamponada com fosfato (PBS) a pH 7,4.
A concentração de proteína foi quantificada usando um kit de ensaio de proteína de ácido bicinconínico Pierce (Thermo Scientific) com uma curva padrão BSA. Proteínas NS1 solúveis purificadas foram resolvidas em um gel SDS-PIDADE redutor e desnaturado (em formas monoméricas de cerca de 45 kDa e em formas homodiméricas de cerca de 90 kDa) e visualizadas usando SimplyBlue SafeStain (ThermoFisher, Inc.).
[00483] ELISA. As placas Immulon 4 HBX ELISA (Thermo Scientific) foram revestidas com proteína ZIKV PRV-ABC59 NS1 recombinante
(produzida internamente) ou proteína de envelope recombinante (número de acesso MyBioSource MBS319787) a 2 µg/ml em tampão carbonato de pH 9,41 durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas três vezes com PBS entre cada etapa. Após serem bloqueados com 5% de leite desnatado (NF) por 1 h, os soros de ratos foram incubados em uma concentração inicial de 1:50, diluídos em série 4 vezes e incubados por 2h em temperatura ambiente. Para experimentos usando soros humanos, foi usada uma concentração inicial de 1:40.
Anticorpo de cabra anti-IgG humana conjugado com peroxidase (HRP) (AP504P; Millipore Sigma) ou anticorpo IgG anti-rato (AP503P; Millipore Sigma) foi usado para detectar a ligação de anticorpos IgG, seguido pelo desenvolvimento com o substrato HRP (SigmaFast OPD; Sigma-Aldrich). As reações foram interrompidas pela adição de HCl 3 M, e a absorbância foi medida a 490 nm em um espectrofotômetro de microplaca (Bio-Rad). Experimentos foram realizados em duplicidade. Um teste não paramétrico de comparação múltipla de Kruskal-Wallis foi utilizado para examinar a significância entre os grupos. GraphPad Prism 6 foi usado para calcular os valores da área sob a curva (AUC).
[00484] Imunofluorescência. Uma placa de 24 poços foi tratada com 30 µg/ml de poli-D-lisina (Millipore) por 1 h, seguido por três lavagens com 1X PBS e uma lavagem final com meio de cultura celular completo. Células HEK 293T (2 x 105 células/Poço) foram transfectadas em suspensão com 0,5 µg de DNA de plasmídeo (pCAGGS
NS1 ou pCAGGS NS1-His) e 2 µl de Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram fixadas com 0,5% de paraformaldeído (PFA) -1X PBS por 30 min. As células foram bloqueadas com 5% de leite desnatado por 30 minutos em temperatura ambiente, seguido pela incubação de 10 µg/ml de um anticorpo monoclonal humano AA12 (32) ou anticorpo policlonal anti-histidina de coelho (ThermoFisher) diluído em 1% de leite desnatado-1X PBS para 1 h. Anticorpo anti-humano ou anti-coelho conjugado com Alex Fluor 488 (Invitrogen) diluído em 1% de leite desnatado-1X PBS a 1:1.000 foram usados como anticorpos secundários. As células coradas foram visualizadas usando um citômetro de imagem Celigo. As células Vero foram infectadas com o vírus da Zika PRVABC59 a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,5. Após 24 horas após a infecção, a monocamada de células Vero foi fixada com 0,5% PFA-1X PBS. As células foram bloqueadas com 5% de leite desnatado por 30 minutos em temperatura ambiente. O tampão de bloqueio foi então descartado e os soros foram adicionados a uma diluição de 1:100 em leite desnatado por 2h em temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com PBS entre cada etapa. Depois que as células foram lavadas, um anticorpo secundário IgG anti-rato conjugado com Alexa Fluor 488 (ThermoFisher) diluído 1:500 em leite desnatado foi adicionado à monocamada, e as placas foram incubadas no escuro por 1h em temperatura ambiente. As células foram lavadas com PBS e a monocamada foi visualizada usando um microscópio Evos do Grupo de Microscopia Avançada (AMG) (ThermoFisher).
[00485] Funções efetoras anticorpo-dependentes. Para experimentos envolvendo células infectadas, as células Vero foram semeadas em placas planas de fundo branco de 96 poços (Corning) e infectadas após 24h com o vírus da Zika PRVABC59 a um MOI de 0,01.
Para experiências envolvendo células transfectadas, células HEK 293T foram semeadas em placas de fundo branco planas revestidas com poli-D-lisina de 96 poços (Corning). Após 24 h, as células foram transfectadas com 100 ng por poço de pCAGGS-NS1 sem o marcador hexahistidina. Às 16h pós-transfecção ou 40h pós- infecção, o meio foi removido e 25 µl de tampão de ensaio (RPMI 1640 com 4% de FBS de IgG baixo) foram adicionados a cada poço. Em seguida, os soros foram adicionados em um volume de 25 µl a uma diluição inicial de 1:75 e diluídos em série 3 vezes em tampão de ensaio em duplicata. Os soros foram então incubados com as células transfectadas ou infectadas durante 30 minutos a 37°C. Células Jurkat geneticamente modificadas que expressam FcyR IV de rato ou FcyR IIIa humano com um gene repórter de luciferase sob o controle da transcrição do promotor de células T ativadas por fator nuclear (NFAT) foram adicionadas a 7,5 X 104 células em 25 µl por poço, que é aproximadamente uma proporção de 1:2 de células alvo para células efetoras (Promega). As células foram então incubadas por mais 6 h a 37°C. O reagente de ensaio Bio-Glo Luciferase foi adicionado, e a luminescência foi quantificada usando um leitor de microplaca. A indução dobrada foi medida em unidades de luz relativa e calculada subtraindo o sinal de fundo dos poços sem células efetoras e, em seguida, dividindo os valores para os poços com anticorpo por valores para aqueles sem anticorpo adicionado.
Especificamente, a indução de dobra foi calculada da seguinte forma: (RLUinduzido-RLUbackground)/(RLUnão induzido-RLUbackground). Os valores médios e os erros padrão das médias (SEM) foram relatados, e uma curva de regressão não linear foi gerada usando GraphPad Prism 6.
[00486] Vacinação de ratos. Todos os experimentos com animais foram realizados em uma instalação de nível de biossegurança animal 2 plus, de acordo com a Icahn School of Medicine no Mount Sinai Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Grupos de 10 ratos STAT2-/- fêmeas foram vacinados com 80 µg de pCAGGS NS1-His, pCAGGS-NS1 ou um vetor vazio em 40 µl de H2O bidestilada. As vacinas de DNA foram administradas por eletroporação intramuscular nos músculos posteriores da coxa esquerda por meio de um dispositivo de eletroporação TriGrid (Ichor Medical Systems).
Vacinas baseadas em proteínas (proteína NS1 recombinante de PRVABC59 ou BSA) foram administradas a uma dose de 5 µg /Rato com adjuvante com AddaVax (InvivoGen) por via intramuscular nos dias 21 e 42 ou adjuvante completo de Freund por via subcutânea no dia 21 (Sigma-Aldrich) e Adjuvante incompleto de Freund por via subcutânea no dia 42 (Sigma-Aldrich). Seis semanas após a última vacinação (dia 84), os animais foram anestesiados com um coquetel de cetamina-xilazina (0,15 mg de cetaminA/ kg de peso corporal e 0,03 mg de xilazinA/ kg por rato), e o soro foi obtido por punção de veia cardíaca.
[00487] Estudos de transferência passiva. Grupos de 4 a 5 ratos B6.129-STAT2-/- machos e fêmeas (gentilmente cedidos por Christian Schindler; Columbia University) foram transferidos passivamente por via intraperitoneal com 200 µl de soros agrupados de ratos vacinados. Os ratinhos de controle receberam 200 µl de soros agrupados de ratinhos vacinados com ADN com um vector vazio e BSA.
Os ratos foram desafiados intradermicamente com 1.000 PFU de vírus da Zika PRVABC59 ou 10 LD50s Zika (158 PFU) vírus MR766 e avaliados por 14 dias. Os ratos foram monitorados diariamente para peso e sinais clínicos. A pontuação clínica foi conduzida usando os critérios pré-definidos, com uma pontuação máxima possível de 7: impacto na caminhada, falta de resposta, perna traseira esquerda paralisada, perna traseira direita paralisada, perna dianteira esquerda paralisada e perna dianteira direita paralisada. Os animais mortos receberam uma pontuação de 7. Os animais que apresentaram mais de 25% de perda de peso ou paralisia total foram sacrificados humanamente. Os experimentos foram conduzidos com uma quantidade equilibrada de ratos machos e fêmeas e com uma distribuição uniforme de ratos de ninhadas diferentes, sempre que possível. Para determinar a significância estatística, os testes de Mantel-Cox e Gehan-Breslow-Wilcoxon foram usados para curvas de sobrevivência, e um teste t múltiplo e o método de Holm-Sidak foram utilizados para analisar a curva de peso e os escores clínicos.
Asteriscos em um gráfico indica a significância estatística (*, P <0,05) de um grupo de tratamento em comparação com o grupo de controle.
[00488] Amostras de doadores. Amostras de soro de doadores vacinados contra TBEV não identificados foram fornecidas pelo Centro de Sangue de Viena, na Áustria, conforme descrito anteriormente (49). Amostras de plasma de doador de sangue infectado com vírus da Zika identificado foram obtidas por meio do Global Virus Network Zika Serum Bank ou do repositório de recursos de pesquisa de infecções emergentes e da Biodefense (BEI Resources).
[00489] Aprovação do estudo. Todos os estudos conduzidos foram considerados pela Escola de Medicina Icahn no Comitê de Revisão Institucional do Monte Sinai como não pesquisa em seres humanos (NHSR).
[00490] Análise estatística. Os resultados de vários experimentos são apresentados como médias ± SEM. Vários testes t foram usados para testar as diferenças estatísticas entre os valores médios. Os dados foram analisados com o software GraphPad Prism 6, e valores de P <0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
6.2.3 Resultados
[00491] A vacinação com um plasmídeo de DNA e proteína NS1 induz altos títulos de IgG anti-NS1 em ratos. Duas construções de vacina de ZIKV foram geradas pela introdução de sequências otimizadas de códons humanos que codificam a proteína NS1 de comprimento completo da cepa ZIKV PRVABC59 de linhagem asiática em um vetor de expressão de mamífero pCAGGS. O primeiro construto, pCAGGS NS1, codifica os últimos 24 aminoácidos da proteína de envelope do ZIKV no terminal amino, permitindo o dobramento e ancoragem adequados da proteína NS1 à bicamada lipídica (43) seguida pela região codificadora completa da proteína NS1 de ZIKV PRVABC59 (um ácido aspártico marca o primeiro resíduo do NS1) (Fig. 12A). Também projetamos um plasmídeo de expressão projetado para produzir a proteína NS1 solúvel. O plasmídeo de expressão pCAGGS NS1 foi modificado pela adição de um local de clivagem de protease de pré-sucessão e um motivo hexahistidina no terminal carboxi, e o plasmídeo resultante foi denominado pCAGGS NS1-His (Fig. 12B). Para determinar se estes plasmídeos geraram proteína ZIKV NS1 devidamente dobrada, transfectamos células HEK 293T com pCAGGS NS1 ou pCAGGS NS1-His. Células transfectadas simuladas serviram como um controle negativo. Em 24h pós-transfecção, a expressão de ZIKV NS1 em células HEK 293T foi confirmada usando imunofluorescência por um anticorpo monoclonal humano, AA12, ou um anticorpo policlonal anti-histidina (32) (Fig. 12C). Como esperado, um anticorpo anti-histidina detectou apenas pCAGGS NS1-His. Células transfectadas simulado não foram detectadas por AA12 ou anticorpo anti-histidina policlonal. Usando o plasmídeo pCAGGS NS1-His, expressamos a proteína NS1 em células Expi293 de rim embrionário humano (HEK) e purificamos a proteína usando uma resina de ácido nitrilotriacético de níquel (Ni- NTA). A proteína NS1 solúvel purificada foi resolvida por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PIDADE) em condições de desnaturação e redução. A análise de Western blot usando um anticorpo policlonal anti-His demonstrou que as proteínas NS1 marcadas com His solúveis purificadas do sobrenadante da cultura de células e lisados resolveram em aproximadamente 50 kDa como monômeros (Fig. 12D).
Uma hemaglutinina solúvel marcada com histidina da cepa A/Perth/16/09 do vírus da gripe A (H3N2) foi usada como controle positivo, enquanto a albumina sérica bovina (BSA) serviu como controle negativo. Em seguida, vacinamos grupos de 10 ratos, conforme descrito pela estratégia de vacinação nas figuras 13A e 13B. No dia 0, ratos C57BL/6 do tipo selvagem foram iniciados com 80 µg de pCAGGS NS1-His ou pCAGGS NS1 via eletroporação intramuscular. Em seguida, os ratos foram imunizados intramuscularmente com 5 µg de proteína NS1 com adjuvante nos dias 21 e 42. Os ratos que receberam a proteína NS1 solúvel com o adjuvante de Freund receberam o adjuvante completo no dia 21 e o adjuvante incompleto no dia 42. Os ratos que receberam a proteína NS1 solúvel com AddaVax receberam a mesmo proteína com adjuvante em ambos os dias 21 e 42. Como controle, os ratos foram vacinados com um plasmídeo pCAGGS vazio e reforçados duas vezes com BSA suplementado com adjuvante de Freund ou AddaVax.
Antes da administração de cada componente da vacina, as amostras de soro foram obtidas por punção da veia facial. No dia 84, os ratos foram anestesiados e sangrados terminalmente por punção cardíaca, e os soros foram coletados para análise posterior e estudos de transferência passiva.
[00492] Um ensaio de imunoabsorção enzimática específico para NS1 (ELISA) foi realizado, e todos os ratos vacinados com NS1 demonstraram uma resposta robusta de anticorpos reativos após a imunização primária de DNA seguida por dois reforços de proteína (Figuras 13C a 13E). Diferenças significativas do grupo ingênuo foram observadas em todos os grupos de vacina no dia 42 e no dia
84. No dia 21, não houve diferença significativa entre o grupo NS1-His AddaVax e o grupo ingênuo. No entanto, este grupo tinha títulos suficientemente altos nos dias 42 e 84. Nenhuma diferença foi observada entre o grupo ingênuo e qualquer um dos dois grupos de controle. Além disso, não foram observadas diferenças dentro de cada grupo de vacinação. Foi observada uma tendência para títulos mais elevados nos grupos vacinados com a construção marcada com
His no dia 84. Isto ocorreu provavelmente devido aos anticorpos anti-His desencadeados que reconhecem as proteínas NS1 marcadas com His utilizadas nos nossos ELISAs.
[00493] Estudos de imunofluorescência demonstraram reatividade a células Vero infectadas com a linhagem asiática ZIKV PRVABC59 em todos os grupos de tratamento (ver Fig. 18). Como a proteína NS1 não está presente no próprio vírion do Zika, mas é expressa nas superfícies das células infectadas, é improvável que a imunidade mediada por NS1 seja esterilizante. Em vez disso, é provável que os anticorpos específicos para NS1 protejam por meio de funções efetoras mediadas por células dependentes de anticorpos. Para determinar se os soros de ratos vacinados são funcionalmente ativos contra células infectadas, foi testada a capacidade dos soros de ratos vacinados com NS1 para envolver FcyRs. Um ensaio in vitro bem estabelecido anteriormente usado para avaliar as atividades funcionais de anticorpos monoclonais direcionados à hemaglutinina do vírus da gripe e à proteína NS1 do vírus da Zika (32, 44) foi usado. Neste ensaio, o envolvimento do FcyR IV murino expresso em células efetoras geneticamente modificadas (Jurkat) resulta em um sinal luminescente quantificável. As células Vero foram infectadas com a cepa ZIKV PRVABC59 e foram adicionados soros reunidos (n = 10) de ratos vacinados. Consistentemente com os resultados de ELISA, os soros de todos os grupos vacinados com NS1 induziram funções efetoras em células infectadas com ZIKV PRVABC59 (Fig.
13F), enquanto os soros do grupo de controle foram incapazes de envolver FcyRs. Para confirmar que as funções efetoras mediadas por Fc são específicas para NS1, células 293T foram transfectadas com o plasmídeo pCAGGS NS1. Tal como acontece com as células infectadas, todos os grupos vacinados com NS1 induziram funções efetoras, mas os grupos de controle não (Fig. 13G), indicando que a atividade mediada por Fc era de fato específica para NS1.
[00494] A transferência passiva de soros imunes protege os ratos STAT2-/- do desafio letal. Para determinar se os anticorpos produzidos pelo nosso regime de vacina são protetores contra o ZIKV, 200 µl de soros agrupados foram transferidos passivamente por via intraperitoneal para ratos STAT2-/-, que são permissivos à infecção pelo ZIKV e podem exibir sinais clínicos da doença (45).
Duas horas após a administração de soros, os ratos foram desafiados intradermicamente com 10 doses letais a 50% (LD50) da cepa ZIKV MR766 de linhagem africana. Os ratos foram monitorados diariamente para perda de peso e pontuados para sinais de doença, incluindo dificuldade para andar, paralisia dos membros e falta de resposta.
Os animais que exibiram uma pontuação clínica de 5 ou superior foram sacrificados e classificados como sucumbindo à doença. Os soros de ratos que receberam um reforço NS1 e adjuvante de Freund forneceram o maior grau de proteção, com 80% dos ratos sobrevivendo ao desafio, em comparação com 60% no grupo AddaVax e 0% no grupo de controle BSA (Fig. 14A a 14C). Em seguida, a proteção contra a cepa homóloga de linhagem asiática PRVABC59, que está mais intimamente relacionada às cepas contemporâneas de ZIKV, foi testada. Foram administrados 1.000 PFU do vírus PRVABC59, uma vez que um LD50 adequado não pôde ser administrado devido à falta de virulência nas doses mais altas testadas. 100% dos ratos que receberam soros de ratos vacinados com NS1 sobreviveram ao desafio com PRVABC59, em comparação com 50% dos ratos tratados com soros de controle (Figuras 14D a 14F). Tal como acontece com os resultados do estudo de desafio MR766, todos os ratos exibiram sinais clínicos de infecção. Nenhuma diferença na letalidade entre ratos machos ou fêmeas foi observada. Embora esteja bem estabelecido que ZIKV PRVABC59 exibe menos patogenicidade do que MR766 em ratos, diferenças significativas na perda de peso entre os ratos vacinados com NS1 e os de controle ainda puderam ser detectadas (45).
[00495] A imunidade mediada por NS1 é de longa duração em humanos e medeia as funções efetoras de Fc. A atividade neutralizante de anticorpos específicos do envelope eliciados durante a infecção pelo ZIKV está bem documentada e caracterizada (19, 46, 47). No entanto, há poucos dados sobre a duração e os mecanismos de ação de anticorpos específicos para NS1 em humanos infectados por ZIKV ou outros flavivírus. Para determinar se a imunidade mediada por NS1 é relevante e de longa duração em humanos, as amostras de soro foram obtidas de pacientes infectados por ZIKV. Essas amostras foram retiradas de pacientes com doenças agudas a totalmente recuperados, de 3 a 267 dias após o início dos sintomas (Tabelas
11 e 12). A reatividade dessas amostras de soro à proteína NS1 foi determinada por ELISA.
Os anticorpos específicos para NS1 tornaram-se detectáveis aproximadamente no dia 10 após o início dos sintomas e permaneceram elevados ao longo do dia 267, com diminuição mínima ao longo do tempo (Fig. 15A). Amostras de soro dos mesmos indivíduos foram obtidas em vários momentos para representar uma resposta longitudinal.
Nessas amostras combinadas,
a resposta NS1 diminuiu ligeiramente ao longo do tempo, mas não voltou aos níveis basais (Figura 15B). Em seguida, foi avaliada a capacidade das amostras de soro desses indivíduos de induzir funções efetoras mediadas por Fc-FcyR.
Os ensaios in vitro mostraram correlações mensuráveis entre a reatividade a NS1 e a capacidade de envolver FcyR (Figura 15C a 15F). Por exemplo, o paciente UTMB-2 tinha um baixo título de anticorpo para NS1 no dia
3 pós-infecção e da mesma forma não mostrou atividade de função efetora em células infectadas com ZIKV PRVABC59 naquele ponto de tempo.
No entanto, nos dias 14 e 45 pós-infecção, ambos os soros do paciente eram reativos a NS1 por ELISA e funcionalmente ativos,
conforme medido pelo ensaio repórter ADCC.
Além disso, duas amostras colhidas depois do dia 200 pós-infecção foram testadas e mostraram que esses soros ainda eram capazes de induzir funções efetoras.
Em seguida, as questões sobre se os anticorpos para NS1 contribuíram especificamente para a imunidade mediada por Fc-FcyR por meio da transfecção de células HEK 293T com um plasmídeo que expressa NS1 e usando o mesmo ensaio repórter ADCC foram abordadas.
Os indivíduos que tiveram uma resposta positiva do anticorpo às células Vero infectadas também reagiram com as células HEK 293T transfectadas (Figuras 16A a 16D). Esses dados mostram que a resposta NS1 provocada pela infecção natural pelo ZIKV é de longa duração e contribui para a imunidade mediada por Fc em humanos.
[00496] Anticorpos com reatividade cruzada contra a proteína de envelope não induzem funções efetoras FcyR em humanos. Embora um número significativo de anticorpos seja gerado contra a proteína NS1, uma porção maior da resposta do anticorpo é direcionada contra a proteína de envelope do ZIKV. Os anticorpos específicos do envelope contribuem predominantemente para uma resposta neutralizante potente e fornecem imunidade esterilizante.
Anticorpos específicos do envelope com reatividade cruzada, entretanto, também são conhecidos por serem mediadores potentes do realce dependente de anticorpos (ADE) da doença (15). Esses anticorpos são conhecidos por se ligarem a epítopos conservados próximos à alça de fusão da glicoproteína de envelope e podem ligar flavivírus divergentes (48). Notavelmente, em Duehr et al., 28 das 50 amostras de soro de indivíduos vacinados com o vírus da encefalite transmitida por carrapatos (TBEV) se ligaram à proteína de envelope do ZIKV recombinante por ELISA, enquanto 36 das 50 amostras de soro aumentaram a infectividade do ZIKV in vitro (49).
Uma vez que o ADE da infecção é mediado por Fc, foi determinado se esses mesmos anticorpos de reação cruzada são capazes de induzir funções efetoras mediadas por Fc potencialmente benéficas in vitro em células infectadas. Um conjunto de amostras de soro de indivíduos vacinados contra TBEV, um membro da família dos avivírus (49), foi analisado. Embora as sequências de aminoácidos do TBEV e as proteínas do envelope do ZIKV sejam divergentes, exibindo aproximadamente 40% de identidade no nível de aminoácidos (49), os anticorpos de reação cruzada contra epítopos conservados perto da alça de fusão do domínio II da proteína de envelope são frequentemente gerado (15). Dezesseis das maiores amostras de soro reativas a ELISA e ADE do trabalho de Duehr et al. foram analisadas quanto à ligação à proteína E do ZIKV recombinante por ELISA, e todos mostraram uma resposta positiva (Figura 17A). Como um controle, foram usados soros de uma infecção aguda por ZIKV, conhecida por ter uma forte resposta específica para NS1, com baixa reatividade ao ZIKV E recombinante (32). Em seguida, foi confirmado que as amostras vacinadas não possuíam anticorpos direcionados à proteína ZIKV NS1. A vacina TBEV, que foi usada para vacinar os seres humanos, usa o vírus TBEV inativado. Como esta vacina não contém NS1, as amostras de soro de pacientes com TBEV não reagiram com ZIKV NS1, enquanto o controle positivo, soro de um indivíduo com infecção aguda, reagiu (Figura 17B). Foi então testado se essas amostras de soro podem desencadear funções efetoras mediadas por Fc em células Vero infectadas com ZIKV PRVABC59. Das 16 amostras de soro vacinadas com TBEV testadas, nenhuma foi capaz de induzir atividade efetora mediada por Fc em células infectadas com ZIKV, mas o soro de um indivíduo com infecção aguda pelo ZIKV induziu (Figura 17C). Esses dados sugerem que, embora os anticorpos específicos do envelope com reatividade cruzada eliciados pela vacinação contra TBEV possam causar a ocorrência de ADE da infecção in vitro, eles não induzem funções efetoras mediadas por Fc nas células infectadas. Uma possível explicação é que uma resposta forte do anticorpo NS1 é importante para a eliminação das células infectadas com ZIKV por meio da atividade mediada por células dependente de Fc. Por outro lado, devido aos baixos níveis da glicoproteína de envelope expressa nas superfícies das células infectadas, os anticorpos E de reação cruzada são incapazes de direcionar essas células para depuração mediada por Fc.
6.2.4 Discussão
[00497] Várias vacinas contra o ZIKV estão atualmente em várias fases de desenvolvimento (10–14, 50–52). O objetivo da maioria dessas vacinas candidatas é eliciar respostas potentes de anticorpos naturalizantes usando a glicoproteína E do envelope como o principal antígeno alvo. Os anticorpos específicos para ZIKV E podem fornecer imunidade esterilizante, e a caracterização de uma série de anticorpos monoclonais neutralizantes direcionados à proteína E revelou alta atividade neutralizante com concentrações inibitórias pela metade do máximo no nível de nanograma por mililitro (19, 46, 47, 53, 54). No entanto, a proteína ZIKV NS1 é um alvo igualmente viável para uma vacina.
Estudos anteriores demonstraram que anticorpos contra outras proteínas NS1 do flavivírus do vírus da febre amarela (YFV), vírus do Nilo Ocidental (WNV) ou DENV podem limitar ou prevenir a doença do flavivírus (26-28, 33-35). Além disso, as vacinas que produzem anticorpos específicos para NS1 não causam aumento da doença dependente de anticorpos, pois esses anticorpos não se ligam ao próprio vírion. Isso é pertinente, uma vez que a vacina Dengvaxia contra o vírus da dengue intimamente relacionado mostrou aumentar a frequência da doença grave em crianças que não tiveram dengue (55, 56). Assim, NS1 pode ser um componente esquecido de uma vacina contra ZIKV segura e eficaz.
[00498] Recentemente, vários grupos relataram a eficácia das vacinas baseadas em NS1 contra a infecção pelo ZIKV. Em um artigo de Brault et al., uma vacina NS1 incorporada em um vetor de vírus da vacina modificado Ankara (MVA) mostrou proteger os ratos do tipo selvagem contra o desafio intracerebral (40). Como os mesmos ratos foram vacinados e subsequentemente desafiados, não está claro se a imunidade mediada por células ou humoral ou ambas contribuíram para a proteção. Estudos de Liu et al. e Li et al.
incorporou NS1 além de PrM/M e E em uma vacina baseada em adenovírus 2 (Ad2) e vírus de estomatite vesicular recombinante (rVSV), respectivamente (41, 42). Ambos os estudos mostraram que a inclusão de NS1 na construção da vacina fornece proteção adicional em comparação com PrM/M e E sozinho. Embora a contribuição dos anticorpos NS1 para a proteção seja claramente mostrada, uma construção Ad2-NS1 sozinha não foi testada. No entanto, uma construção de rVSV-NS1 sem quaisquer componentes de proteína estrutural mostrou reduzir os títulos virais em comparação com aqueles nos ratos de controle não vacinados.
[00499] Este estudo demonstra que uma estratégia de vacinação baseada apenas na proteína ZIKV NS1 pode eliciar uma forte resposta de anticorpos que protege significativamente os ratos contra o desafio letal (Figuras 13A a 13G e 14A a 14F). Esta estratégia envolveu o priming de ratos vacinados com um plasmídeo de DNA, seguido por dois reforços de proteína com o adjuvante de Freund ou Add-aVax, que é uma emulsão óleo-em-água semelhante ao MF59 encontrado em uma vacina humana contra o vírus da gripe sazonal (57).
[00500] Este estudo usou um modelo de transferência passiva no qual os soros de ratos vacinados foram transferidos passivamente para ratos STAT2-/-. Os ratos foram então submetidos a um desafio letal via infecção intradérmica de duas cepas de ZIKV de linhagens diferentes (Figura 14A a 14F). Embora as sequências do ZIKV sejam altamente conservadas, as duas cepas diferentes foram isoladas com
68 anos de intervalo e exibem diferentes fenótipos de doença em ratos STAT2-/-(45). A eficácia de nossa estratégia de vacinação NS1 contra a cepa ZIKV MR766, que devido à sua alta letalidade em ratos representa um desafio rigoroso, foi testada.
A alta letalidade do
MR766 foi provavelmente devido à extensa passagem no cérebro dos ratos.
Neste caso, quatro dos cinco ratos que receberam soro do grupo de adjuvante NS1 Freund e três dos cinco ratos do grupo NS1
AddaVax sobreviveram.
Em contraste, nenhum dos ratos que receberam soro de ratos vacinados de controle sobreviveu à infecção.
A cepa
ZIKV PRVABC59 isolada em 2015 representa a cepa circulante moderna,
não foi adaptada para ratos e é menos patogênica em ratos.
Neste modelo de desafio, todos os ratos que receberam soro de ratos vacinados com NS1 sobreviveram, enquanto dois de quatro ratos que receberam soro de ratos vacinados de controle sucumbiram à infecção.
Notavelmente, nenhum dos ratos vacinados estava completamente protegido da doença de ZIKV, conforme medido pela perda de peso ou pontuação clínica, sugerindo que a imunidade esterilizante não foi alcançada.
No entanto, esta é a primeira demonstração de antissoros NS1 fornecendo proteção contra o desafio letal do ZIKV em um modelo de transferência passiva,
ressaltando a importância dos anticorpos específicos para NS1 na mediação da imunidade ao ZIKV.
Embora o mecanismo exato da imunidade específica a NS1 precise ser mais estudado, especulamos que a depuração viral mediada por Fc desempenha um papel importante na prevenção da progressão da doença ao limpar as células infectadas por vírus. Além disso, os grupos de tratamento adjuvante de AddaVax e Freund induzem altos títulos de anticorpos e proteção em estudos de transferência passiva que não diferem significativamente entre si. Portanto, um título específico de NS1 minimamente protetor não pôde ser quantificado. Estudos futuros podem realizar titulações de dose da vacina para determinar o título mínimo de anticorpos específicos para NS1 necessário para proteção.
[00501] Para determinar se a imunidade mediada por NS1 é relevante e de longa duração em humanos, foram obtidas 31 amostras de soro de 16 pacientes diferentes que foram infectados pelo ZIKV.
Essas amostras variaram do dia 3 ao dia 267 após o início dos sintomas e representam a fase aguda e a fase de convalescença da doença. A ligação a NS1 recombinante foi testada por ELISA e mostrou que os anticorpos se tornam detectáveis no dia 10 e duram além do dia 267 (Figuras 15A a 15F). Com base nesses resultados, a proteína NS1 do ZIKV é potentemente imunogênica. Esses resultados são esperados, uma vez que a resposta NS1 em outros flavivírus foi bem estudada. Para determinar se os anticorpos produzidos pela infecção natural eram funcionalmente ativos, foi realizado um ensaio para medir as funções efetoras mediadas por Fc. Todas as amostras de soro que foram positivas por ELISA também foram positivas no ensaio repórter. Em contraste, os soros de controle negativo e os soros do dia 3 após o início dos sintomas foram incapazes de induzir funções efetoras mediadas por Fc nas células infectadas. Além disso, todas as amostras de soro que eram ativas contra células Vero infectadas também foram ativas contra células 293T transfectadas com NS1 (Figuras 16A a 16D). Isso sugere que a resposta de anticorpos mediada por Fc predominante contra o vírus da Zika tem como alvo a proteína NS1. Além disso, a proteína NS1 mostrou ser suficiente para ativar as funções efetoras mediadas por Fc em células infectadas por soro humano. Os monoclonais humanos que têm como alvo o ZIKV NS1 são protetores. No entanto, estudos futuros exame de policlonais NS1 purificados de soros humanos para determinar se a transferência de passiva para os ratos contra o desafio letal.
[00502] As respostas dependentes de Fc mediadas por vírus podem geralmente ser divididas em duas categorias: respostas que visam partículas virais e respostas que medeiam a morte de células infectadas por vírus. No primeiro cenário, anticorpos podem facilitar a internalização de vírions via endocitose mediada por Fc em células imunes inatas, onde uma degradação ou replicação podem ocorrer (58, 59). No contexto do vírus da Zika e de outros flavivírus, a captação do vírus mediada por aumento os locais de replicação do vírus e pode potencialmente aumentar a doença (18).
Alternativamente, anticorpos podem direcionar a morte de células infectadas por vírus, ativando células imunes inatas, como células assassinas naturais, macrófagos e neutrófilos, por meio de interações Fc-FcyR (60).
[00503] Em contraste com a proteína NS1, a proteína de envelope do ZIKV não é expressa na superfície celular (15). Partículas avivirais nascentes brotam internamente do aparelho de Golgi e as proteínas introduzem não são facilmente direcionadas na superfície das células infectadas. É possível que, embora os anticorpos específicos de envelope possam se ligar ao vírion intacto para eliciar ADE, estes anticorpos são incapazes de se ligar às células infectadas e, portanto, não podem evocar funções efetoras mediadas por Fc protetores, conforme medido por nosso ensaio repórter in vitro. Os dados de dados neste exemplo demonstram que vacinados com TBEV podem induzir a reatividade cruzada contra a proteína do vírus da Zika. A reatividade cruzada de entre vacinados contra TBEV e ZIKV não é surpreendente, dado que muitos flavivírus têm epítopos comuns na superfície da proteína E. A preparação da vacina TBEV usa o vírus TBEV inativado. Portanto, o componente NS1 não faz parte da vacina TBEV e não há resposta mensurável de anticorpos à proteína NS1 do ZIKV. Estes envelopes de reação cruzada não puderam envolver FcyRs no ensaio repórter quando testados em células infectadas por vírus (Fig. 17). O ADE da infecção ocorre quando medido in vitro, no entanto, porque os vírions exibem de forma proeminente epítopos de alça de fusão conservados, contribuindo para a captação viral aumentada. É possível que,
embora os anticorpos específicos para E sejam superiores no total de imunidade esterilizante contra uma infecção pelo vírus da Zika, sua eficácia protetora pode ser limitada pela possibilidade de ADE. Além disso, anticorpos específico E não é eficiente na eliminação de células infectadas por vírus devido à falta de proteína de envelope exibida na superfície celular. Em contraste, os locais para NS1 podem direcionar a depuração de células infectadas por vírus, como anteriormente (32).
[00504] De modo geral, o trabalho aqui apresentado é a importância da NS1 como um componente de uma vacina segura e eficaz para o vírus da Zika. Esses dados podem explicar como uma incorporação de um componente NS1 pode aumentar a eficácia de uma vacina candidata contra ZIKV contendo apenas componentes apropriados (42). O projeto de uma vacina contra ZIKV segura e eficaz se beneficia a incorporação de um NS1 imunógeno para induzir uma imunidade mediada por Fc potente que elimina como células infectadas por vírus. Os recursos disponíveis por uma vacina baseada em NS1 podem proteger em um modelo de desafio letal e são funcionais ativos conforme medido por um ensaio ADCC substituto.
Além disso, os locais para NS1 são robustos e de longa duração em humanos e, com base em experimentos em ratos, podem fornecer proteção contra a doença ZIKV por meio de interações Fc-FcyR.
6.2.5 Referências Citadas no Exemplo 2
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TABELA 9
Anticorpo Cepa viral Kon1 (1/Ms) Kdis1 (1/s) KD1 (M) Kon2 (1/Ms) Kdis2 (1/s) KD2 (M) Χ2 R2
AA12 MR766 1,10x104 6,11x10-4 5,54x10-8 1,63x105 1,62x10-2 9.98x10-8 0,6389 0,9989
AA12 PRVABC59 6,03x103 4,59x10-4 7,61x10-8 1,45x105 2,13x10-2 1,47x10-7 0,2677 0,9986
Sem FC12 MR766 Sem ligação Sem ligação Sem ligação Sem ligação Sem ligação Sem ligação Sem ligação ligação
FC12 PRVABC59 7,98x103 5,70x10-4 5,33x10-8 3,18x105 1,70x10-2 7,15x10-8 0,0658 0,9977
EB9 MR766 2,24x104 6,52x10-4 2,92x10-8 1,15x105 9,45x10-3 8,22x10-8 1,7281 0,9992
EB9 PRVABC59 2,23x104 6,29x10-4 2,81x10-8 1.36x105 9.93x10-3 7.31x10-8 1,0758 0,9996
GB5 MR766 2,22x103 7,18x10-4 2,71x10-7 8.30x104 3.55x10-4 3.23x10-7 0,0267 0,9967
GB5 PRVABC59 9,69x103 7.45x10-4 7,69x10-8 1.73x105 1.84x10-2 1.06x10-7 0,0756 0,9985
TABELA 10
Reatividade Reatividade Atividade de V- J- V- J- a Anticorpo CDR3 Identidade % Isotipo CDR3 Identidade % Isotipo a MR766 Neutralização GENE GENE GENE GENE PRVABC59 NS1 (IC50) NS1 VH3- JH3- CARDRRGFDYW VK1- JK4- CQQTYSTPLTF Nenhum AA12 99% IgG1 98% kappa Sim Sim 53 02 (SEQ ID NO:155) 39 01 (SEQ ID NO:159) detectado VH3- JH3- CARGPVQLERRPLGAFDIW JL2- CQAWDSSTVVF Nenhum FC12 99% IgG1 VL3-1 100% lambda Sim No 53 02 (SEQ ID NO:156) 01 (SEQ ID NO:160) detectado VH3- JH3- CARWGGKRGGAFDIW VK1- JL2- CQQSYSTPYTF Nenhum EB9 100% IgG1 98% kappa Sim Sim 53 02 (SEQ ID NO:157) 39 01 (SEQ ID NO:161) detectado VH3- JH3- CARLIAAAGDYW VK1- JK1- CQQSYSTPWTF Nenhum GB5 99% IgG1 98% kappa Sim Sim 53 01 (SEQ ID NO:158) 39 01 (SEQ ID NO:162) detectado
Características do Anticorpo.
Atribuições de VJ, sequências de CDR3,% de identidade e isotipo para os clones de anticorpo.
O software IMGT/V-QUEST foi usado para atribuir a referência da linha germinativa para IGHV e IGLV e determinar a% de identidade para a linha germinativa.
ELISAs foram realizados para determinar a reatividade e ensaios de microneutralização foram realizados para determinar a Atividade de Neutralização em concentrações de até 100 µg/mL.
TABELA 11 Código do Dias após o Idade Sexo País de exposição paciente início da doença UTMB1 n/a F República Dominicana 22 UTMB1 n/a F República Dominicana 58 UTMB2 32 F Honduras 3 UTMB2 32 F Honduras 7 UTMB2 32 F Honduras 14 UTMB2 32 F Honduras 28 UTMB2 32 F Honduras 45 UTMB4 26 F Ilhas Caribenhas 18 UTMB5 28 F Jamaica 25 UTMB5 29 F Jamaica 32 UTMB7 15 F Colômbia 129 UTMB8 28 F Colômbia 113 UTMB9 43 M El Salvador, Guatemala 145 UTMB10 33 M Haiti 41 UTMB10 33 M Haiti 97 UTMB11 n/a n/a Haiti 56
[00505] Amostras de soro obtidas de pacientes infectados pelo vírus da Zika. Amostras de soro obtidas através da Global Virus Network. São mostrados o código do paciente, age, Sexo, País de exposição e a data de início da doença.
TABELA 12 Código do Dias após o início paciente da doença NR-50611 233 NR-50613 236 NR-50615 224 NR-50617 267 NR-50619 202 NR-50621 202 NR-51058 6 NR-51079 6 NR-51118 7 NR-50808 “Aguda” NR-50809 “Aguda” NR-50810 “Aguda” NR-50818 “Aguda” NR-50819 “Aguda” NR-50820 “Aguda”
[00506] Amostras de soro obtidas de pacientes infectados pelo vírus da Zika. Amostras de soro obtidas através de recursos BEI.
O código do paciente e a data de início da doença são exibidos.
7. EQUIVALENTE
[00507] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados nesta especificação são aqui incorporados por referência como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.
[00508] Embora a invenção anterior tenha sido descrita com algum pormenor a título ilustrativo e exemplificativo para fins de clareza de compreensão, será evidente para os peritos na técnica à luz dos ensinamentos da presente invenção que certas alterações e modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito ou âmbito das reivindicações anexas.
[00509] A presente invenção não deve ser limitada pelo escopo das modalidades específicas descritas aqui. De fato, várias modificações da invenção vão além das aqui descritas, tornando se evidentes para os versados na técnica, a partir da descrição anterior e das figuras anexas. Tais modificações se destinam a cair no âmbito das reivindicações anexas.

Claims (49)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo monoclonal recombinante que se liga especificamente a um vírus Zika NS1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende: (a) (1) uma região determinante da complementariedade (CDR)1 da região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos GFTVSSNY (SEQ ID NO: 143), (2) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos IYSGGST (SEQ ID NO: 144), (3) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARDRRGFDY (SEQ ID NO: 145), ARWGGKRGGAFDI (SEQ ID NO: 146), ARLIAAAGDY (SEQ ID NO: 147), ou ARGPVQLERRPLGAFDI (SEQ ID NO: 148), (4) uma região variável de cadeia leve (VL) CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSX, X é Y ou H (SEQ ID NO: 134), (5) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos X1X2S, X1 é A ou Q, X2 é A ou D (SEQ ID NO: 135), e (6) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQX1YSTPX2T, X1 é T ou S, X2 é L, Y ou W (SEQ ID NO: 136); ou (b) (1) uma região de ligação do anticorpo VH (ABR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos FTVSSNYMS (SEQ ID NO: 149), (2) uma VH ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos WVSVIYSGGSTYYA (SEQ ID NO: 150), (3) uma VH ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARDRRGFDY (SEQ ID NO: 151), ARWGGKRGGAFDI (SEQ ID NO: 152), ARLIAAAGDY (SEQ ID NO: 153) ou ARGPVQLERRPLGAFDI (SEQ ID NO: 154), (4) uma VL ABR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSX1LN, X1 é Y ou H (SEQ ID NO: 137), (5) uma VL ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos X1LIYAASSLQS, X1 é F ou L (SEQ ID NO: 138), e (6) uma VL ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQX1YSTPX2, X1 é T ou S, X2 é L, Y ou W (SEQ ID NO: 139).
2. Anticorpo monoclonal recombinante que se liga especificamente a um Zika vírus NS1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende: (a) (1) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos GFTVSSNY (SEQ ID NO: 17), (2) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos IYSGGST (SEQ ID NO: 18), (3) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARDRRGFDY (SEQ ID NO: 19), (4) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSY (SEQ ID NO: 20), (5) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos AAS (SEQ ID NO: 21), e (6) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQTYSTPLT (SEQ ID NO: 22); (b) (1) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos GFTVSSNY (SEQ ID NO: 45), (2) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos IYSGGST (SEQ ID NO: 46), (3) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARWGGKRGGAFDI (SEQ ID NO: 47), (4) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSH (SEQ ID NO: 48), (5) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos AAS (SEQ ID NO: 49), e (6) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQSYSTPYT (SEQ ID
NO: 50); (c) (1) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos GFTVSSNY (SEQ ID NO: 73), (2) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos IYSGGST (SEQ ID NO: 74), (3) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARLIAAAGDY (SEQ ID NO: 75), (4) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSY (SEQ ID NO: 76), (5) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos AAS (SEQ ID NO: 77), e (6) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQSYSTPWT (SEQ ID NO: 78); ou (d) (1) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos GFTVSSNY (SEQ ID NO: 101), (2) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos IYSGGST (SEQ ID NO: 102), (3) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARGPVQLERRPLGAFDI (SEQ ID NO: 103), (4) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos KLGDKY (SEQ ID NO: 104), (5) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos QDS (SEQ ID NO: 105), e (6) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QAWDSSTVV (SEQ ID NO: 106).
3. Anticorpo monoclonal recombinante que se liga especificamente a um Zika vírus NS1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende: (a) (1) uma região de ligação do anticorpo VH (ABR)1 compreendendo a sequência de aminoácidos FTVSSNYMS (SEQ ID NO: 31), (2) uma VH ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos WVSVIYSGGSTYYA (SEQ ID NO: 32), (3) uma VH ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARDRRGFDY (SEQ ID
NO: 33), (4) uma VL ABR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSYLN (SEQ ID NO: 34), (5) uma VL ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos LLIYAASSLQS (SEQ ID
NO: 35), e (6) uma VL ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQTYSTPL (SEQ ID NO: 36);
(b) (1) uma VH ABR1 compreendendo a sequência de aminoácidos FTVSSNYMS (SEQ ID NO: 59), (2) uma VH ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos WVSVIYSGGSTYYA (SEQ
ID NO: 60), (3) uma VH ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARWGGKRGGAFDI (SEQ ID NO: 61), (4) uma VL ABR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSHLN (SEQ ID
NO: 62), (5) uma VL ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos FLIYAASSLQS (SEQ ID NO: 63), e (6) uma VL ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQSYSTPY (SEQ ID
NO: 64);
(c) (1) uma VH ABR1 compreendendo a sequência de aminoácidos FTVSSNYMS (SEQ ID NO: 87), (2) uma VH ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos WVSVIYSGGSTYYA (SEQ
ID NO: 88), (3) uma VH ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARLIAAAGDY (SEQ ID NO: 89), (4) uma VL ABR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSYLN (SEQ ID
NO: 90), (5) uma VL ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos LLIYAASSLQS (SEQ ID NO: 91), e (6) uma VL ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQSYSTPW (SEQ ID
NO: 92); ou
(d) (1) uma VH ABR1 compreendendo a sequência de sequência de aminoácidos FTVSSNYMS (SEQ ID NO: 115), (2) uma VH ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos WVSVIYSGGSTYYA (SEQ ID NO: 116), (3) uma VH ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARGPVQLERRPLGAFDI (SEQ ID NO: 117), (4) uma VL ABR1 compreendendo a sequência de aminoácidos KLGDKYAC (SEQ ID NO: 118), (5) uma VL ABR2 compreendendo a sequência de aminoácidos LVIYQDSKRPS (SEQ ID NO: 119), e (6) uma VL ABR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QAWDSSTV (SEQ ID NO: 120).
4. Anticorpo monoclonal recombinante que se liga especificamente a um Zika vírus NS1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende: (a) uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10; (b) uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12; (c) uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14; ou (d) uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16.
5. Anticorpo monoclonal recombinante que se liga especificamente a um Zika vírus NS1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende: (a) uma VH que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 e uma VL que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10; (b) uma VH que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 e uma VL que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12; (c) uma VH que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 e uma VL que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14; ou (d) uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16.
6. Anticorpo monoclonal recombinante, de acordo com a reivindicação 5 (a), CARACTERIZADO pelo fato de que a VH compreende uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos GFTVSSNY (SEQ ID NO: 17), (2) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos IYSGGST (SEQ ID NO: 18), e (3) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARDRRGFDY (SEQ ID NO: 19); e a VL compreende (1) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSY (SEQ ID NO: 20), (2) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos AAS (SEQ ID NO: 21), e (3) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQTYSTPLT (SEQ ID NO: 22).
7. Anticorpo monoclonal recombinante, de acordo com a reivindicação 5 (b), CARACTERIZADO pelo fato de que a VH compreende (1) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos GFTVSSNY (SEQ ID NO: 45), (2) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos IYSGGST (SEQ ID NO: 46), e (3) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARWGGKRGGAFDI (SEQ ID NO: 47); e a VL compreende (1) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSH (SEQ ID NO: 48), (2) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos AAS (SEQ ID NO: 49), e (3) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQSYSTPYT (SEQ ID NO: 50).
8. Anticorpo monoclonal recombinante, de acordo com a reivindicação 5 (c), CARACTERIZADO pelo fato de que a VH compreende (1) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos GFTVSSNY (SEQ ID NO: 73), (2) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos IYSGGST (SEQ ID NO: 74), e (3) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARLIAAAGDY (SEQ ID NO: 75); e a VL compreende (1) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos QSISSY (SEQ ID NO: 76), (2) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos AAS (SEQ ID NO: 77), e (3) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QQSYSTPWT (SEQ ID NO: 78).
9. Anticorpo monoclonal recombinante, de acordo com a reivindicação 5 (d), CARACTERIZADO pelo fato de que a VH compreende (1) uma VH CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos GFTVSSNY (SEQ ID NO: 101), (2) uma VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos IYSGGST (SEQ ID NO: 102), e (3) uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos ARGPVQLERRPLGAFDI (SEQ ID NO: 103); e a VL compreende (1) uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos KLGDKY (SEQ ID NO: 104), (2) uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos QDS (SEQ ID NO: 105), e (3) uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos QAWDSSTVV (SEQ ID NO: 106).
10. Anticorpo monoclonal recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de cadeia única.
11. Anticorpo monoclonal recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um fragmento Fab ou F(ab')2.
12. Conjugado de anticorpo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende (a) uma porção de anticorpo que é o anticorpo monoclonal recombinante conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 11; (b) uma porção de fármaco ou porção detectável; e (c) opcionalmente, um ligante, em que a porção de fármaco ou porção detectável é conjugada à porção de anticorpo diretamente ou é conjugada à porção de anticorpo por meio de um ligante.
13. Conjugado de anticorpo, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de fármaco é citotóxica.
14. Conjugado de anticorpo, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção detectável é peroxidase de raiz-forte, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, acetilcolinesterase estreptavidina/biotina, avidina/biotina, um material fluorescente ou um metal emissor de pósitrons.
15. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz do anticorpo monoclonal recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, ou o conjugado de anticorpo, conforme definido na reivindicação 12 ou 13, em mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável.
16. Método para detectar uma infecção pelo vírus Zika em uma amostra biológica, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o contato do anticorpo monoclonal recombinante definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 ou o conjugado de anticorpo definido na reivindicação 12 ou 14 com a amostra biológica e a detecção da ligação do anticorpo ou conjugado de anticorpo a um vírus Zika NS1.
17. Método para diagnosticar uma infecção pelo vírus Zika em um indivíduo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o contato do anticorpo monoclonal recombinante definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 ou o conjugado de anticorpo definido na reivindicação 12 ou 14 com uma amostra biológica do indivíduo e a detecção da ligação do anticorpo ou conjugado de anticorpo a um vírus
Zika NS1, em que um aumento na detecção da ligação do anticorpo ou conjugado de anticorpo na amostra biológica em relação à detecção de ligação do anticorpo ou conjugado de anticorpo a uma amostra de controle negativo indica que o indivíduo tem uma infecção por vírus Zika.
18. Método para distinguir o vírus Zika do vírus da Dengue em uma amostra biológica, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o contato do anticorpo monoclonal recombinante, definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, ou o conjugado de anticorpo, definido na reivindicação 12 ou 14, com a amostra biológica e a detecção da ligação do anticorpo ou conjugado de anticorpo a um vírus Zika NS1, em que um aumento na detecção da ligação do anticorpo ou conjugado de anticorpo em relação à detecção de ligação do anticorpo ou conjugado de anticorpo a uma amostra contendo vírus da Dengue indica a presença de vírus Zika na amostra biológica.
19. Método, de acordo com a reivindicação 16 ou 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra biológica é de um indivíduo.
20. Método para prevenir uma infecção pelo vírus Zika em um indivíduo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica definida na reivindicação 15.
21. Método para tratar uma infecção por vírus Zika em um indivíduo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica definida na reivindicação 15.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 ou 19 a 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo é um indivíduo humano.
23. Sequência de ácido nucleico isolada, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo monoclonal recombinante definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 11.
24. Célula hospedeira, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (a) uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID No: 1 e uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID No: 2; (b) uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID No:3 e uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 4; (c) uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 5 e uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 6; ou (d) uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 7 e uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 8.
25. Polipeptídeo NS1 recombinante, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos de um vírus Zika NS1 e a sequência de aminoácidos de um fragmento de uma proteína de envelope do vírus Zika, em que a sequência de aminoácidos do fragmento da proteína de envelope do vírus Zika está no N-terminal da sequência de aminoácidos do vírus Zika NS1.
26. Polipeptídeo NS1 recombinante, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o fragmento da proteína de envelope do virus Zika compreende os últimos 20 a 50 resíduos de aminoácidos carbóxi-terminais da proteína de envelope do vírus Zika.
27. Polipeptídeo NS1 recombinante, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o fragmento da proteína de envelope do virus Zika compreende os últimos 24 resíduos de aminoácidos carbóxi-terminais da proteína de envelope do vírus Zika.
28. Polipeptídeo NS1 recombinante, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o fragmento compreende a sequência de aminoácidos NGSISLMCLALGGVLIFLSTAVSA (SEQ ID NO: 131).
29. Polipeptídeo NS1 recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 a 28, CARACTERIZADO pelo fato de que o vírus Zika NS1 compreende a sequência de aminoácidos NS1 do vírus Zika PRVABC59.
30. Polipeptídeo NS1 recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 a 29, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo NS1 compreende adicionalmente um sítio de clivagem e uma etiqueta.
31. Polipeptídeo NS1 recombinante, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que o sítio de clivagem é LEVLFNGPG (SEQ ID NO: 132).
32. Polipeptídeo NS1 recombinante, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, CARACTERIZADO pelo fato de que a etiqueta é um motivo hexahistidina.
33. Polipeptídeo NS1 recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 30 a 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o sítio de clivagem e a etiqueta estão no terminal carbóxi do polipeptídeo NS1.
34. Sequência de ácido nucleico isolada, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína NS1 recombinante, conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 25 a 33.
35. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADA pelo fato de que a sequência de nucleotídeo é otimizada para códons humanos.
36. Vetor de expressão, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a sequência de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 34 ou 35.
37. Vetor viral, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um genoma que compreende a sequência de ácido nucleico definida na reivindicação 34 ou 35.
38. Célula hospedeira, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a sequência de ácido nucleico definida na reivindicação 33 ou 34, ou o vetor definido nas reivindicações 36 ou 37.
39. Célula hospedeira CARACTERIZADA por ser projetada para expressar um polipeptídeo NS1 recombinante codificado pela sequência de ácido nucleico definida na reivindicação 34 ou 35.
40. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a sequência de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 34 ou 35, ou o vetor conforme definido na reivindicação 36 ou 37, em uma mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável.
41. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o polipeptídeo NS1 recombinante conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 25 a 33, em uma mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável.
42. Método para imunização contra o vírus Zika, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar a um indivíduo uma dose da composição farmacêutica definida na reivindicação 40 ou 41.
43. Método para prevenir uma doença mediada pelo vírus Zika, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar a um indivíduo uma dose da composição farmacêutica definida na reivindicação 40 ou 41.
44. Método para induzir uma resposta imune a um vírus Zika NS1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar a um indivíduo uma dose da composição farmacêutica definida na reivindicação 40 ou 41.
45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 42 a 44, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende adicionalmente a administração de uma ou mais doses de reforço da composição farmacêutica definida na reivindicação 39 ou 40.
46. Método para imunização contra o vírus Zika, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) administrar a um indivíduo uma dose de uma primeira composição farmacêutica que compreende a sequência de ácido nucleico definida na reivindicação 34 ou 35 ou o vetor definido na reivindicação 36 ou 37; e (b) após um primeiro determinado período de tempo administrar ao indivíduo uma dose de uma segunda composição farmacêutica compreendendo o polipeptídeo NS1 recombinante definido em qualquer uma das reivindicações de 25 a 33.
47. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende adicionalmente a administração de uma segunda dose da segunda composição farmacêutica após um segundo determinado período de tempo.
48. Método, de acordo com a reivindicação 46 ou 47, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro determinado período de tempo, o segundo determinado período de tempo ou ambos são 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 3 meses ou 6 meses.
49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 42 a 48, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo é humano.
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