PT640622E - Derivados de polissacaridos e veiculos para farmacos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "DERIVADOS DE POLISSACÁRIDOS E VEÍCULOS PARA FÁRMACOS"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Área da Invenção A presente invenção relaciona-se com um veículo para um fármaco compreendendo um polissacárido inovador e um complexo com o fármaco. Mais particularmente, a presente invenção relaciona-se com um veículo para fármacos compreendendo um polissacárido combinado com um péptido, e um complexo com o fármaco compreendendo o veículo para fármacos e um fármaco introduzido no veículo para fármacos. Técnica Relacionada

Até agora foram feitas tentativas para utilizar um polímero solúvel em água como veículo para um fármaco especialmente no campo das preparações farmacêuticas, e na arte têm sido propostas muitas técnicas relacionadas com este objectivo. Em muitas destas propostas, utiliza-se derivados de celulose tais como carboximetil celulose, hidroxipropil celulose e hidroxipropil metilcelulose, e a dispersão e libertação controladas do fármaco são conseguidas por meio de propriedades físicas e químicas destas substâncias per se. Apesar de nestas tentativas o fármaco ser misturado homogeneamente com os derivados de celulose como veículo, o fármaco não está quimicamente ligado ao veículo.

Na chamada "técnica de administração controlada do fármaco" em que o fármaco é administrado numa quantidade 1 necessária numa altura desejada a um órgão alvo, guando se utiliza um polímero solúvel em água como veículo para o fármaco, o fármaco e o veículo devem estar quimicamente ligados um ao outro em vez de meramente misturados. Foram descritas essas tentativas para polissacáridos nas referências 1), 2) e 3) seguintes. A referência 1) descreve a técnica para ligar um dextrano carboxilado com mitomicina C. A referência 2) descreve a técnica para ligar manano com mitomicina C. Além disso, a referência 3) descreve a técnica de ligar manano com bleomicina. 1) Hitoshi Sezaki, Yakugaku Zasshi, 109, 611-621 (1989), 2) Proceeding of the 49th Japanese Câncer Association (1990) p. 425, Νδ 2155, 3) Proceeding of the 49th Japanese Câncer Association (1990) p. 425, N2 2154.

No entanto, a situação presente é que a técnica de libertação controlada de fármacos por meio de ligação química entre um fármaco e um veículo ainda não está suficientemente desenvolvida para ser aplicada.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os presente inventores examinaram a possibilidade de usar polissacáridos como veículos para fármacos. Como resultado, verificou-se que um derivado de polissacárido em que uma cadeia peptídica é introduzida num polissacárido apresenta excelentes propriedades como veículo para fármacos.

Consequentemente, um objecto da presente invenção é proporcionar um veículo para fármacos inovador em que um fármaco é conjugado através de ligação química e que é capaz de administração do fármaco, e um complexo farmacêutico do veículo para fármacos e um fármaco. 2

Γ

Assim, a presente invenção proporciona um derivado de polissacárido compreendendo um polissacárido com um grupo carboxilo no qual é introduzida uma cadeia peptidica em parte ou em todos os grupos carboxilo do polissacárido, compreendendo a cadeia peptidica desde 1-8 amino ácidos em que os amino ácidos podem ser iguais ou diferentes, em que uma parte ou todos os grupos amino na cadeia peptidica que não estão envolvidos na ligação com os grupos carboxilo do polissacárido ou uma parte ou todos os grupos carboxilo na cadeia peptidica podem formar uma ligação amida ácida ou uma ligação éster com um grupo carboxilo, um grupo amino ou um grupo hidroxilo de um terceiro composto tendo o grupo carboxilo, o grupo amino ou o grupo hidroxilo, e um seu sal. 0 derivado de polissacárido de acordo com a presente invenção tem uma propriedade de acumulação elevada num tumor. Portanto, o composto pode fornecer de forma eficaz a um tumor um fármaco com efeitos secundários ou com controlo limitado da sua eficácia contra o tumor.

Além disso, o derivado de polissacárido de acordo com a presente invenção tem a propriedade de distribuir gradualmente um fármaco num organismo, de modo que a concentração de fármaco é altamente retida no sangue durante um periodo prolongado.

Em conformidade, a presente invenção proporciona um veiculo para fármacos e um complexo com o fármaco compreendendo o derivado de polissacárido.

Na presente invenção, o termo "polissacárido contendo um grupo carboxilo" significa, um polissacárido que naturalmente contém um grupo carboxilo na sua estrutura tal como ácido hialurónico, ácido péctico, ácido alginico, condroitina ou heparina. Além disso, o termo também significa um polissacárido não contendo naturalmente nenhum grupo carboxilo tal como pululano, dextrano, manano, quitina, inulina, levano, xilano, 3 I' L—'—; \ arabina, manoglucano, ou quitosana, em que os átomos de hidrogénio numa parte ou em todos os grupos hidroxilo são substituídos por um grupo carboxi Ci_4 alquilo ou em que numa parte ou em todos os grupos hidroxilo é introduzido um ácido polibásico por uma ligação éster. 0 termo "derivado de polissacárido" significa aqui tanto um veículo para fármacos como um complexo com o fármaco em que o veiculo está ligado a um fármaco. Além disso, o termo "ligação amida ácida" significa aqui uma ligação uretano e inclusivé uma ligação ureia.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 ilustra um espectro de absorção η o ultravioleta-visível de carboximetilpululano-3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR de sódio (23) obtido no Exemplo 1 (concentração: 300 pg/mL, solvente: água); A Figura 2 ilustra um padrão de eluição por filtração por gel de carboximetilpululano-3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR de sódio (23) obtido no Exemplo 1 (detectado por absorção no visível a 478 nm); A Figura 3 ilustra um espectro de absorção η o ultravioleta-visível de carboximetilpululano-3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR de sódio (24) obtido no Exemplo 2 (concentração: 300 pg/mL, solvente: água); A Figura 4 ilustra um padrão de eluição por filtração por gel de carboximetilpululano-3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR de sódio (24) obtido no Exemplo 2 (detectado por absorção no visível a 478 nm); A Figura 5 ilustra um espectro de absorção η o ultravioleta-visível de carboximetilpululano-3'-N-Gly-DXR de 4 v.

t sódio (29) obtido no Exemplo 7 (concentração: 200 pg/mL, solvente: água); A Figura 6 ilustra um padrão de eluição por filtração por gel de carboximetilpululano-3'-N-Gly-DXR de sódio (29) obtido no Exemplo 7 (detectado por absorção no visivel a 478 nm); A Figura 7 ilustra um espectro de absorção η o ultravioleta-visivel de succinilpululano-3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR de sódio (42) obtido no Exemplo 15 (concentração: 300 pg/mL, solvente: água)? A Figura 8 ilustra um padrão de eluição por filtração por gel de succinilpululano-3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR de sódio (42) obtido no Exemplo 15 (detectado por absorção no visivel a 478 nm); A Figura 9 ilustra um espectro de absorção η o ultravioleta-visível de carboximetilquitina-3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR de sódio (44) obtido no Exemplo 16 (concentração: 1,1 mg/mL, solvente: água); A Figura 10 ilustra um padrão de eluição por filtração por gel de carboximetilquitina-3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR de sódio (44) obtido no Exemplo 16 (detectado por absorção no visível a 478 nm); A Figura 11 ilustra um espectro de absorção no ultravioleta-visível de carboximetildextrano-3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR de sódio (46) obtido no Exemplo 17 (concentração: 400 pg/mL, solvente: água); A Figura 12 ilustra um padrão de eluição por filtração por gel de carboximetildextrano-3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR de sódio (46) obtido no Exemplo 17 (detectado por absorção no visível a 478 nm); 5

V

A Figura 13 ilustra um espectro de absorção no ultravioleta-visível de carboximetilmanoglucano-3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR de sódio (48) obtido no Exemplo 18 (concentração: 1,12 mg/mL, solvente: água); A Figura 14 ilustra um padrão de eluição por filtração por gel de carboximetilmanoglucano-3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR de sódio (48) obtido no Exemplo 18 (detectado por absorção no visível a 478 nm); A Figura 15 ilustra um espectro de absorção no ultravioleta-visível de N-acetil-des-N-heparina sulfatada-3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR de sódio (50) obtida no Exemplo 19 (concentração: 257 pg/mL, solvente: água); A Figura 16 ilustra um padrão de eluição por filtração por gel de N-acetil-des-N-heparina sulfatada-3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR de sódio (50) obtida no Exemplo 19 (detectada por absorção no visível a 478 nm); A Figura 17 ilustra um espectro de absorção no ultravioleta-visível de hialuronato-3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR de sódio (53) obtido no Exemplo 20 (concentração: 181 pg/mL, solvente: água); A Figura 18 ilustra um padrão de eluição por filtração por gel de hialuronato-3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR de sódio (53) obtido no Exemplo 20 (detectado por absorção no visível a 478 nm); A Figura 19 é um gráfico que ilustra a relação entre as doses do complexo do fármaco de acordo com a presente invenção ou doxorubicina e os pesos de tumores; 6 ^ ί—1 ^ A Figura 20 é um gráfico que ilustra a alteração do peso corporal de ratos normais aos quais foi administrado o complexo do fármaco de acordo com a presente invenção ou doxorubicina.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Derivados de Polissacâridos O derivado de polissacárido de acordo com a presente invenção inclui primeiramente um polissacárido como esqueleto básico que contém naturalmente um grupo carboxilo. 0 derivado de polissacárido de acordo com a presente invenção também inclui um polissacárido como esqueleto básico que não contém naturalmente nenhum grupo carboxilo. Os derivados de polissacâridos compreendendo como esqueleto básico o polissacárido não contendo nenhum grupo carboxilo devem ter uma estrutura em que os átomos de hidrogénio numa parte ou em todos os grupos hidroxilo estão substituídos por um grupo carboxi Ci_4 alquilo ou em que numa parte ou em todos os grupos hidroxilo é introduzido um ácido polibásico por uma ligação éster. 0 derivado de polissacárido de acordo com a presente invenção compreende uma estrutura em que uma cadeia peptídica é introduzida no grupo carboxilo do polissacárido acima referido. A parte alquilo do grupo carboxi Ci_4 alquilo pelo qual o átomo de hidrogénio dos grupos hidroxilo do polissacárido é substituído pode ser de cadeia linear ou ramificada. O grupo carboxi Ci_4 alquilo inclui preferencialmente, por exemplo, carboximetilo, carboxietilo, carboxipropilo, carboxiisopropilo e carboxibutilo. O "ácido polibásico" que é introduzido no grupo hidroxilo do polissacárido por uma ligação éster significa um ácido com pelo menos dois protões que podem ser doados numa molécula, isto 7 é, um ácido com uma basicidade de dois ou mais. 0 ácido polibásico inclui preferencialmente, por exemplo, ácido malónico, ácido succinico, ácido glutárico, ácido adipico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido citracónico, ácido cis-aconítico, ácido L-aspártico, ácido L-glutâmico e ácido diglicólico.

Neste contexto, o grau de introdução do grupo carboxialquilo ou do ácido polibásico pode ser representado pelo "grau de substituição" que é definido como o número de grupos carboxialquilo ou de ácido polibásico por residuo de açúcar. 0 número inclui os grupos em que a cadeia peptldica é ainda introduzida no grupo carboxialquilo ou no ácido polibásico. Assim, o "grau de substituição" pode ser representado como se segue: Número total de grupos carboxialquilo ou de ácidos polibásicos na molécula

Grau de substituição = _

Numero total de resíduos de açúcar na molécula

Neste contexto, quando o grupo carboxialquilo é um grupo carboximetilo, o grau de substituição pode ser expresso como "o grau de carboximetilação", e quando o ácido polibásico é ácido succinico, este pode ser expresso como "o grau de succinilação".

Quando o polissacárido é pululano, em que os grupos hidroxilo são todos substituídos, o grau de substituição é 3. 0 grau é preferencialmente 0,1 ou mais.

Quando o polissacárido é quitina, em que os grupos hidroxilo são todos substituídos, o grau de substituição é 2. O grau é preferencialmente 0,1 ou mais.

Quando o polissacárido é dextrano, em que os grupos hidroxilo são todos substituídos, o grau de substituição é 3. O grau é preferencialmente 0,1 ou mais. 8 y

L·, K

Quando o polissacárido é manoglucano, em que os grupos hidroxilo são todos substituídos, o grau de substituição é 3. O grau é preferencialmente 0,1 ou mais. É necessário que a molécula do derivado de polissacárido tenha pelo menos um grupo carboxialquilo ou um ácido polibásico com a excepção do polissacárido que tem naturalmente um grupo carboxilo. Portanto, os compostos com um grau de substituição de 0 estão excluídos do derivado de polissacárido da presente invenção.

De acordo com a presente invenção, a cadeia peptídica introduzida no polissacárido compreende 1 até 8 amino ácidos que podem ser iguais ou diferentes. 0 número de amino ácidos é preferencialmente de dois ou mais tendo em conta a propriedade de libertação de fármaco do derivado de polissacárido. Além disso, o número é também preferencialmente seis ou menos, tendo em conta o processo sintético complexo da cadeia peptídica. O número é mais preferencialmente quatro ou menos.

Os amino ácidos não são especificamente limitados, mas são preferencialmente uma combinação de dois ou mais dos amino ácidos neutros que são diferentes uns dos outros de acordo com a forma de realização preferida da presente invenção. Essas cadeias de péptidos incluem, por exemplo, uma sequência de amino ácidos —Phe-Gly- e uma cadeia peptídica contendo esta sequência em que o lado do terminal-N está ligado ao grupo carboxilo do polissacárido.

Além disso, o termo "a cadeia peptídica compreendendo amino ácidos" significa aqui não apenas uma cadeia peptídica compreendendo amino ácidos só mas também uma cadeia peptídica incluindo um composto que não sejam os amino ácidos da cadeia. Por exemplo, um ácido carboxílico dibásico tal como o ácido succínico pode estar presente dentro ou no terminal da cadeia peptídica. Os aminos ácidos da cadeia peptídica também podem ser 9 Γ L· α-amino ácidos bem como compostos análogos de amino ácidos tais como ácido ε-aminocapróico ou ácido γ—aminobutlrico. A cadeia peptídica está geralmente ligada ao grupo carboxilo do poiissacárido na direcção do terminal-N. Alternativamente, a direcção da ligação da cadeia peptidica pode ser invertida ligando o amino ácido que não sejam os α-amino ácidos (por exemplo o grupo ε-amino de lisina, quando a cadeia peptidica contém lisina) ao grupo carboxilo do poiissacárido.

Embora a cadeia peptidica possa ser introduzida em todos os grupos carboxilo do poiissacárido, o grau de introdução é preferencialmente determinado dependendo das propriedades fisico-quimicas e farmacológicas de um fármaco introduzido na cadeia peptidica. A sequência de amino ácidos da cadeia peptidica deve ser seleccionada de modo a que o fármaco ou a sua molécula activa seja libertada rapidamente nos órgãos, ou nalguns casos gradualmente, por enzimas tais como proteases ou peptidases. Os amino ácidos tanto podem ser um amino ácido neutro, como um amino ácido básico ou um amino ácido ácido. 0 grupo amino ou o grupo carboxilo do péptido que não está envolvido na ligação com o grupo carboxilo do poiissacárido pode formar uma ligação amida ácida ou uma ligação éster com o grupo carboxilo, o grupo amino ou o grupo hidroxilo de um terceiro composto. O terceiro composto inclui, por exemplo, um composto que pode formar uma ligação com o grupo amino ou o grupo carboxilo no terminal do péptido para proteger o péptido. Neste tipo de composto, a porção para proteger grupos funcionais, isto é, o grupo protector, pode ser um grupo que é geralmente utilizado para a protecção de amino ácidos. Por exemplo, o grupo pode incluir grupos protectores de um grupo amino tal como um grupo terc-butoxicarbonilo e um grupo p-metoxibenziloxicarbonilo, e os 10 t Γ grupos protectores de um grupo carbonilo tal como um grupo alcoxi inferior (por exemplo ura grupo terc-butioxi), um grupo alquilimino inferior (por exemplo um grupo metilimino) e um grupo benziloxi.

Quando o terceiro composto é um fármaco com um grupo amino, um grupo carboxilo ou um grupo hidroxilo que é introduzido no derivado de polissacárido por uma ligação amida ácida ou uma ligação éster para formar um complexo com o fármaco, o complexo está incluído na presente invenção. 0 derivado de polissacárido de acordo com a presente invenção pode estar presente como um seu sal, que é preferencialmente um sal farmaceuticamente aceitável tendo em consideração as suas aplicações. Esses sais incluem sais de metais alcalinos ou de metais alcalino terrosos tais como um sal de sódio, um sal de potássio e um sal de cálcio e sais de amino ácido tais como um sal de arginina e um sal de lisina. 0 derivado de polissacárido de acordo com a presente invenção pode ser utilizado como um veículo para fármacos em que um fármaco é suportado para adminitração a, por exemplo, tecidos tumorais. 0 derivado de polissacárido de acordo com a presente invenção é preferido para libertação do fármaco num organismo e não para permanecer no organismo por um período longo. Fármacos tais como um agente anti-tumoral podem ser introduzidos na cadeia peptídica do derivado de polissacárido da presente invenção pelo utilização do grupo amino ou do grupo carboxilo de um terminal amino ácido da cadeia peptídica.

Por exemplo, o fármaco com um grupo amino pode formar uma ligação amida ácida com o grupo carboxilo do terminal amino ácido. 0 fármaco com um grupo hidroxilo alcoólico pode formar uma ligação éster com o grupo carboxilo do terminal amino ácido. 11

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O fármaco com um grupo carboxilo pode formar uma ligação com um grupo amino do terminal amino ácido.

Especificamente, estes tipos de fármacos incluem fármacos com um grupo amino tal como doxorubicina, daunorubicina, mitomicina C e bleomicina, e fármacos com um grupo hidroxilo alcoólico tal como ciclocitidina, vincristina, vinblastina e adrenalina. Os fármacos com um grupo carboxilo incluem metotrexato, bumetanida, furocemida e dinoprost.

Para além destes fármacos, também é possível utilizar um fármaco convertido num derivado que pode formar uma ligação amida ácida ou uma ligação éster com uma cadeia peptidica. 0 grau de introdução do fármaco no polissacárido ("teor de fármaco") é apropriadamente determinado dependendo dos fármacos e dos polissacáridos. As variações preferidas são como se segue:

Quando o polissacárido é pululano. o teor de fármaco é preferencialmente na gama desde 0,1 até 30% em peso, particularmente desde 1 até 10% em peso. Quando o polissacárido é quitina, o teor de fármaco é preferencialmente na gama desde 0,1 até 30% em peso, particularmente desde 1 até 10% em peso. Quando o polissacárido é dextrano, o teor de fármaco é preferencialmente na gama desde 0,1 até 30% em peso, particularmente desde 1 até 10% em peso. Quando o polissacárido é manoglucano , o teor de fármaco é preferencialmente na gama desde 0,1 até 30% em peso, particularmente desde 1 até 10% em peso. 12

Quando o polissacárido é N-acetil-des-N-heparina sulfatada, o teor de fármaco é preferencialmente na gama desde 0,1 até 30% em peso, particularmente desde 1 até 10% em peso.

Quando o polissacárido é ácido hialurónico, o teor de fármaco é preferencialmente na gama desde 0,1 até 30% em peso, particularmente desde 1 até 10% em peso. 0 complexo, isto é, o derivado de polissacárido em que o fármaco foi introduzido, pode também ser formado no seu sal. Exemplos do sal adequado incluem sais de metais alcalinos ou de metais alcalino terrosos tais como um sal de sódio, um sal de potássio e um sal de cálcio e sais de amino ácido tais como um sal de arginina e um sal de lisina. 0 derivado de polissacárido em que o polissacárido é pululano, quitina, dextrano, manoglucano, N-acetil-des-N-heparina sulfatada ou ácido hialurónico é agora explicado a seguir. 0 derivado de polissacárido em que o polissacárido é pululano (referido daqui em diante como "o derivado de pululano") compreende a unidade de repetição representada pela fórmula (I): CH2 ch2or4 ch2or7

(I) em que, 13

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1 9 R —R , que podem ser iguais ou diferentes, representam respectivamente um átomo de hidrogénio, um grupo — (CH2)m-CO-X, um grupo —C0-(CH2)n-c°—X, ou um grupo —CO—A—CO—X, em que —CO—A— CO— representa uma unidade ácida polibásica de um ácido polibásico do qual os grupos hidroxilo de dois grupos carboxilo foram removidos, X representa um átomo de hidrogénio ou uma cadeia peptidica compreendendo de 1-8 amino ácidos que podem ser iguais ou diferentes, em que uma parte ou todos os grupos amino da cadeia peptidica que não estão envolvidos nas ligações com os grupos carboxilo do polissacárido, ou os grupos carboxilo na cadeia peptidica podem formar uma ligação amida ácida ou uma ligação éster com um grupo carboxilo, um grupo amino ou um grupo hidroxilo de um terceiro composto tendo o grupo carboxilo, o grupo amino ou o grupo hidroxilo, m representa um número inteiro de 1—4, e n representa um número inteiro de 1—4. 0 derivado de pululano tem preferencialmente um peso 3 6 molecular da unidade de pululano na gama desde 2x10 até 1x10 , 4 5 mais preferencialmente desde 1x10 até 2x10 .

No derivado de pululano, a cadeia peptidica é preferencialmente introduzida numa proporção desde 0,01 até 3,0, mais preferencialmente desde 0,01 até 0,1 por residuo de açúcar. O derivado de polissacárido em que o polissacárido é quitina (referido daqui em diante como "o derivado de quitina”) compreende a unidade de repetição representada pela fórmula (II): 14

em que, R^·—R^, que podem ser iguais ou diferentes, representam respectivamente os grupos tais como definidos na fórmula (I). O derivado de quitina tem preferencialmente um peso 3 6 molecular da unidade de quitina na gama desde 2x10 até 1x10 , 4 5 mais preferencialmente desde 1x10 até 2x10 .

No derivado de quitina, a cadeia peptídica é preferencialmente introduzida numa proporção desde 0,001 até 2,0, mais preferencialmente desde 0,01 até 0,1 por resíduo de açúcar. O derivado de polissacárido em que o polissacárido é dextrano (referido daqui em diante como "o derivado de dextrano") compreende a unidade de repetição representada pela fórmula (III):

(III) 15 j f u ^—t- em que, R^—R^, que podem ser iguais ou diferentes, representam respectivamente os grupos tais como definidos na fórmula (I). O derivado de dextrano tem preferencialmente um peso molecular da unidade de dextrano na gama desde 2x10^ até 1x10^, . 4 5 mars preferencialmente desde 1x10 até 2x10 .

No derivado de dextrano, a cadeia peptidica é preferencialmente introduzida numa proporção desde 0,001 até 3,0, mais preferencialmente desde 0,01 até 0,1 por residuo de açúcar. O derivado de polissacárido em que o polissacárido é manoglucano (referido daqui em diante como "o derivado de manoglucano") compreende a unidade de repetição representada pela fórmula (IV):

(IV) 1 9 em que, R -R , que podem ser iguais ou diferentes, representam respectivamente os grupos tais como definidos na fórmula (I), e R*®— R^ que podem ser iguais ou diferentes representam 1 9 respectivamente os grupos tais como definidos nos grupos R —R . 16 f-' li tem 0 derivado de manoglucano acima referido preferencialmente um peso molecular da unidade de manoglucano na 3 6 . 4 gama desde 2x10 até 1x10 , mais preferencialmente desde 1x10 até 2x10^.

No derivado de manoglucano, a cadeia peptidica é preferencialmente introduzida numa proporção desde 0,004 até 12,0, mais preferencialmente desde 0,04 até 0,4 por unidade de repetição.

No derivado de polissacárido de acordo com a presente invenção, uma posição na qual o grupo carboxi alquilo ou o ácido polibásico é introduzido pode ser a mesma ou diferente das posições daquela das unidades de sacárido adjacentes, desde que cada uma das unidades de sacárido tenha uma estrutura definida por qualquer uma das fórmula (I)-(IV). O derivado de polissacárido em que o polissacárido é N-acetil-des-N-heparina sulfatada (referido daqui em diante como "o derivado de heparina") compreende a unidade de repetição representada pela fórmula (V):

em que X representa uma cadeia peptidica contendo de 1-8 amino ácidos, que podem ser iguais ou diferentes, e uma parte ou todos os grupos amino na cadeia peptidica que não estão envolvidos nas ligações com a N-acetil-des-N-heparina sulfatada ou os grupos carboxilo da cadeia peptidica podem formar uma ligação amida ácida ou uma ligação éster com um grupo carboxilo, um grupo 17 Γ y amino ou um grupo hidroxilo de um terceiro composto tendo o grupo carboxilo, o grupo amino ou o grupo hidroxilo. O derivado de heparina tem preferencialmente um peso 3 4 molecular da unidade de heparina na gama desde 2x10 até 6x10 , 4 4 mais preferencialmente de 1x10 até 6x10 .

No derivado de heparina, a cadeia peptidica é preferencialmente introduzida numa proporção desde 0,01 até 2,0, mais preferencialmente desde 0,01 até 0,1 por unidade de repetição. O derivado de polissacárido em que o polissacárido é ácido hialurónico (referido daqui em diante como "o derivado de ácido hialurónico") compreende a unidade de repetição representada pela fórmula (VI):

em que X representa uma cadeia peptidica tal como definido na fórmula (V). 0 derivado de ácido hialurónico tem preferencialmente um peso molecular da unidade de ácido hialurónico na gama desde 2x10^ até 6xl06, mais preferencialmente desde 1x10^ até 2xl05.

No derivado de ácido hialurónico, a cadeia peptidica é preferencialmente introduzida numa proporção desde 0,001 até 0,1, mais preferencialmente desde 0,01 até 0,1 por unidade de repetição. 18

Preparação dos Derivados de Polissacârido

Os polissacáridos modificados com um grupo carboxialquilo podem ser preparados substituindo o átomo de hidrogénio do grupo hidroxilo do polissacârido com um grupo carboxialquilo. Especificamente, este pode ser preparado dissolvendo um polissacârido num solvente inerte tal como H2O, N,N-dimetil-formamida ou sulfóxido de dimetilo na presença de um álcali tal como hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio, adicionando depois um ácido acético halogenado tal como ácido cloroacético, e submetendo a uma reacção a uma temperatura desde 4 até 100°C ao longo de um periodo de vários minutos até vários dias. Nesta reacção "o grau de substituição" pode ser controlado por variação da temperatura bem como da quantidade de ácido cloroacético e de álcali. 0 polissacârido modificado com um ácido polibásico pode ser preparado introduzindo o ácido polibásico num grupo hidroxilo do polissacârido. Especificamente, este pode ser preparado, por exemplo, submetendo o polissacârido a uma reacção num solvente inerte tal como H2O, Ν,Ν-dimetilformamida ou sulfóxido de dimetilo (na presença de uma base tal como hidrogeno carbonato de sódio, carbonato de potássio, carbonato de sódio ou amoníaco aquoso quando se utiliza água como solvente, ou na presença de piridina, trietilamina ou ácido aminoacético quando se utiliza Ν,Ν-dimetilformamida ou sulfóxido de dimetilo como solvente) a uma temperatura desde a temperatura de congelação até 80°C ao longo de um período de vários minutos até vários dias. Nesta reacção, "o grau de substituição" pode ser controlado variando a temperatura bem como a quantidade de álcali. 0 derivado de polissacârido de acordo com a presente invenção pode ser preparado introduzindo um péptido nos grupos carboxilo do polissacârido. Especificamente, quando o grupo carboxilo do polissacârido está ligado ao terminal-N de uma 19 f Γ I—^ cadeia peptidica por uma ligação amida ácida, o derivado de polissacárido de acordo com a presente invenção pode ser preparado fazendo reagir o polissacárido com a cadeia peptidica cujo terminal-C foi protegido num solvente inerte a uma temperatura desde — 20°C-4 0°C durante um período de vários minutos até vários dias. Nesta reacção, um agente de condensação apropriado tal como N,N'-diciclohexilcarbodiimida, cloridrato de 1- etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida ou 1-etoxicarbonil- 2- etoxi-l,2-dihidroquinolina é preferencialmente adicionado à mistura reaccional. Opcionalmente, a reacção também pode ser realizada convertendo o grupo carboxilo do polissacárido num éster activo tal como N-hidroxissuccinimida. O grau de introdução da cadeia peptidica no polissacárido pode ser ajustado controlando a quantidade de péptido a ser adicionada. Consequentemente, quando se pretende introduzir a cadeia peptidica em todos os grupos carboxilo, é preferível adicionar uma quantidade em excesso do péptido para reacção. 0 complexo com o fármaco pode ser preparado introduzindo um fármaco no péptido do derivado de polissacárido obtido tal como descrito acima através da ligação entre os grupos funcionais do péptido e do fármaco. O complexo com o fármaco também pode ser preparado introduzindo num polissacárido uma cadeia peptidica à qual o fármaco tenha sido previamente ligado. 0 fármaco pode ser introduzido na cadeia peptidica fazendo reagir o grupo carboxilo ou o grupo amino da cadeia peptidica com o grupo funcional ou com o substituinte activado do fármaco. Por exemplo, quando o fármaco se destina a ser introduzido no terminal-C do péptido, o fármaco contendo um grupo amino é introduzido no terminal-C por uma ligação amida ácida. Opcionalmente, a reacção pode ser realizada fazendo reagir o péptido que foi convertido num éster activo tal como N- 20 t hidroxissuccinimida com o fármaco em condições para formar a ligação amida ácida. 0 fármaco também pode ser introduzido no terminal-C formando uma ligação éster entre o terminal-C e um fármaco tendo um grupo hidroxilo alcoólico. Além disdo, quando o fármaco se destina a ser introduzido no terminal-N do péptido, o fármaco tendo um grupo carboxilo também pode ser introduzido no terminal-N por uma ligação amida ácida.

Além disso, o derivado de polissacárido de acordo com a presente invenção também pode ser preparado obtendo previamente um fármaco no qual foi introduzida uma cadeia peptídica e em seguida introduzindo o fármaco no polissacárido. 0 fármaco pode ser realizado apropriadamente dependendo das propriedades de grupos funcionais a serem utilizados para a reacção de forma semelhante à da introdução do fármaco no derivado de polissacárido acima referida. Quando se faz reagir o fármaco e a cadeia, o terminal-N ou o terminal-C da cadeia peptidica que não está envolvido na reacção está preferencialmente protegido com um grupo protector.

Na presente invenção, também é possível utilizar um polissacárido em que os grupos hidroxilo foram parcialmente eterados com polietileno glicol. Também é possível utilizar um produto tendo qualquer peso molecular que seja preparado pela decomposição enzimática do polissacárido.

Exemplos A presente invenção é agora explicada em pormenor com referência aos exemplos a seguir, mas não se deve considerar como estando limitada a estes.

Os números de compostos nos exemplos correspondem aos indicados nos esquemas ilustrando o processo sintético adiante. 21 Γ u t 0 grau de carboximetilação ou succinilação do derivado de polissacárido foi determinado pelo método de titulação com álcali. 0 teor de fármaco (% em peso) foi determinado com base na análise de absorção com utilização da absorção característica do fármaco (cerca de 478 nm). A filtração por gel foi realizada nas seguintes condições:

Coluna: Eluente: Caudal: Temperatura da coluna: TSK gel G4000 PWxl; NaCl 0,1 H; 0,8 mL/min.; 4 0°C;

Quantidade de amostra a ser injectada: ca. 50 pg,

Nas Preparações e Exemplos são utilizadas as seguintes abreviaturas: DXR: doxorubicina; DNR: daunorubicina; Trt: grupo trifenilmetilo (grupo tritilo).

Preparaçao 1

Carboximetilpululano de sódio (2)

Pululano (1) (10 g, peso do peso molecular médio: ca. 150.000 fabricado por K. K. Hayashibara-seibutsu-kagaku Kenkyujo) foi dissolvido numa solução de hidróxido de sódio 6 N (140 mL). Adicionou-se então ácido cloroacético (30 g). Depois da mistura ser agitada a 70°C durante 2 horas, foi adicionado metanol (1.000 mL). A mistura foi depois centrifugada para dar precipitados que foram então dissolvidos em água purificada (100 mL) para dialisar a solução através de uma membrana de diálise ("cut-off" molecular: 12.000—14.000, fabricada por SPECTRUM CO.) com água purificada como uma solução externa a 4°C durante 2 dias. A solução interna dialisada foi retirada e liofilizada para dar o composto em epígrafe (2) (8,7 g). 0 produto tinha um grau de carboximetilação de 0,6 por resíduo de açúcar. 22

Preparação 2

Carboximetilpululano de sódio (3)

Pululano (1) (5 g, peso do peso molecular médio: ca. 150.000 fabricado por K. K. Hayashibara-seibutsu-kagaku

Kenkyujo) foi dissolvido numa solução de hidróxido de sódio 1 N (250 mL). Ácido cloroacético (7,5 g) foi adicionado a seguir. Depois da mistura ser agitada a 70°C durante 2 horas, foi adicionado metanol (1.000 mL). A mistura foi centrifugada para dar precipitados que foram então dissolvidos em água purificada (100 mL) para dialisar a solução através de uma membrana de diálise ("cut-off" molecular: 12.000—14.000, fabricada por SPECTRUM CO.) com água purificada como uma solução externa a 4°C durante 2 dias. A solução interna dialisada foi retirada e liofilizada para dar o composto em epígrafe (3) (2,9 g). O produto tinha um grau de carboximetilação de 0,2 por resíduo de açúcar.

Preparação 3

Carboximetilpululano de sódio (4i

Pululano (1) (10 g, peso do peso molecular médio: ca. 150.000 fabricado por K. K. Hayashibara-seibutsu-kagaku

Kenkyujo) foi dissolvido numa solução de hidróxido de sódio 6 N (140 mL). Adicionou-se então ácido cloroacético (30 g). Depois de a mistura ser agitada a 70°C durante 2 horas, foi adicionado metanol (1.000 mL). A mistura foi centrifugada para dar precipitados que foram então secos a pressão reduzida. Operação semelhante foi realizada duas vezes. O produto foi dissolvido em água (100 mL) para dialisar a solução através de uma membrana de diálise ("cut-off” molecular: 12.000—14.000, fabricada por SPECTRUM CO.) com água purificada como uma solução externa a 4°C durante 2 dias. A solução interna dialisada foi retirada e liofilizada para dar o composto em epígrafe (4) (4,9 g). O produto tinha um grau de carboximetilação de 1,2 por resíduo de açúcar. 23

Preparação 4

Carboximetilpululano de sódio (6)

Pululano (5) (0,5 g, peso do peso molecular médio: ca. 400.000 fabricado por K. K. Hayashibara-seibutsu-kagaku Kenkyujo) foi dissolvido numa solução de hidróxido de sódio 1 N (25 mL). Adicionou-se então ácido cloroacético (0,75 g). Depois da mistura ser agitada a 70°C durante 2 horas, adicionou-se metanol (1.000 mL). A mistura foi centrifugada para dar precipitados que foram então dissolvidos em água purificada (10 mL) para dialisar a solução através de uma membrana de diálise ("cut-off" molecular: 12.000—14.000, fabricada por SPECTRUM CO.) com água purificada como uma solução externa a 4°C durante 2 dias. A solução interna dialisada foi retirada e liofilizada para dar o composto em epígrafe (6) (0,45 g). O produto tinha um grau de carboximetilação de 0,2 por resíduo de açúcar.

Preparação 5

Carboximetilpululano de sódio

Pululano (7) (0,5 g, peso do peso molecular médio: ca. 23.000 fabricado por K. K. Hayashibara-seibutsu-kagaku Kenkyujo) foi dissolvido numa solução de hidróxido de sódio 6 N (7 mL). Adicionou-se então ácido cloroacético (1,5 g). Depois de a mistura ser agitada a 70°C durante 2 horas, adicionou-se metanol (100 mL). A mistura foi centrifugada para dar precipitados que foram então secos a pressão reduzida. Operação semelhante foi realizada outra vez. 0 produto foi dissolvido em água purificada (10 mL) para dialisar a solução através de uma membrana de diálise ("cut-off" molecular: 1.000, fabricada por SPECTRUM CO.) contra água purificada como uma solução externa a 4eC durante 2 dias. A solução interna dialisada foi retirada e liofilizada para dar o composto em epígrafe (8) (0,4 g). O produto tinha um grau de carboximetilação de 1,0 por resíduo de açúcar. 24 t Γ

Preparação 6 3'-N-(Glv-Glv-Phe-Glv)-DXR.HC1 (10)

Uma solução de Na-Trt-Gly-Gly-Phe-Gly (9) (475 mg, 0,82 mmol) e N-hidroxissuccinimida (115 mg, 1,0 mmol) em N,N-dimetilformamida (4 mL) foi arrefecida até 4°C. Depois de se adicionar N, N'-diciclohexilcabodiimida (206 mg, 1,0 mmol), a mistura foi agitada a 4°C durante 2 horas. A esta solução foi adicionada uma solução de DXR (446 mg, 0,82 mmol) em N,N-dimetilformamida (3 mL). A mistura foi então agitada a 4°C durante 10 horas. Depois de água (30 mL) ter sido adicionada à reacção, a mistura foi extraída com clorofórmio (100 mL x 3). A camada orgânica foi seca com sulfato de sódio, concentrada e purificada por cromatografia em sílica gel (2,5 cm x 40 cm; clorofórmio:metanol = 20:1) para dar 3'-N-(Na-Trt-Gly-Gly-Phe-

Gly)-DXR (766 mg). 0 produto (750 mg) foi dissolvido em ácido acético 75% (3 mL). A solução foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. Depois de água (50 mL) ter sido adicionada à reacção e os precipitados terem sido removidos por filtração, a camada aquosa foi liofilizada. O produto liofilizado foi dissolvido em água purificada (10 mL) e passado por uma coluna de 5 mL de uma resina de permuta aniónica (AG1-X8 (tipo Cl”), BIO-RAD). A camada aquosa foi liofilizada para dar o composto em epígrafe (10) (462 mg). lH-r.m.n. (CD3OD): ô 7,91 (d, 1H, J=7,6 Hz, H-l), 7,80 (t, 1H, H-2), 7,54 (d, 1H, J=8,3 Hz, H-3), 7,16-7,26 (m, 5H, Phe- aromático), 5,43 (d, 1H, J=3,9 Hz, H-l'), 5,13 (s largo, 1H, H-7), 4,73 (s, 2H, H-14), 4,43 (dd, 1H, J=8,4, 6,6 Hz, Phe-a-CH), 4,30 (q, 1H, J=6,6 Hz, H-5'), 4,16 (ddd, 1H, H-3'), 4,03 (d, 1H, J=17,0 Hz, 1H, Gly-a-CHa), 4,02 (s, 3H, 4-OCH3), 3,86 (d, 1H, J=16,9 Hz, Gly-a-CHa), 3,83 (d, 1H, J=17,0 Hz, Gly-a-CHb), 3,77 (d, 1H, J=15,9 Hz, Gly-a-CHa), 3,73 (d, 1H, J=15,9 Hz, Gly-a- CHb), 3,62 (d, 1H, J=1,5 Hz, H-4'), 3,59 (d, 1H, J=16,9 Hz, Gly-a-CHb), 3,13 (dd, 1H, J=13,9, 6,6 Hz, Phe-p-CHa), 3,10 (d, 1H, J=18,6 Hz, H-lOa), 3,00 (d, 1H, J=18,6 Hz, HlOb), 2,94 (dd, 1H, 25 t r u ^ J=13,9, 8,4 Hz, Phe-p-CHb), 2,38 (d, 1H, J=14,7 Hz, H-8a), 2,19 (dd, 1H, J=14,7, 5,1 Hz, H-8b), 1,98 (ddd, 1H, J=12,7, 12,7, 3,9 Hz, Η-2'a), 1,71 (dd, 1H, J=12,7, 4,6 Hz, Η-2'b), 1,28 (d, 3H, J = 6,6 HZ, H-6').

Preparação 7 3'-N-(Glv-Phe-Glv-Glv)-DXR. HC1 (12 i

Da mesma maneira que na Preparação 6, a uma solução de N**-Trt-Gly-Phe-Gly-Gly ( 11 ) (579 mg, 1,0 mmol) e N- hidroxissuccinimida (127 mg, 1,1 mmol) em N,N-dimetilformamida (4 mL) foi adicionada N,N'-diciclohexilcarbodiimida (226 mg, 1,1 mmol) seguida por uma solução de DXR (544 mg, 1,0 mmol) em N,N-dimetilformamida (3 mL) para dar 3'-N-(Na-Trt-Gly-Phe-Gly-Gly)-DXR (670 mg). 0 composto (595 mg) foi tratado com ácido acético 75% (3 mL) para dar o produto des-N-tritilado, que foi adicionaliuente convertido no cloridrato como o composto em epígrafe (12) (316 mg). 1H-r.m.n. (CD3OD): ô 7,97 (d, 1H, J=7,3 Hz, H-l), 7,84 (t, 1H, H-2) , 7,57 (d, 1H, J=8, .3 Hz, r H-3) , 7,18-7 ,28 (m, 5H( , Phe- aromático) , 5,44 (d, 1H, J=3,4 HZ, H- -i'), 5,17 (s largo, 1H, H- 7), 4,75 (d, 1H , J=20,8 Hz, H- 14a), 4,70 (d, 1H, J=20 ,8 Hz, H- 14b) , 4,59 (dd, 1H, J=8,4 , 6,0 Hz, Phe-a-CH), 4,28 (q, 1H, r J= :6,6 Hz, H-5'), 4,14 (ddd, 1H, H-3 ' ), 4,03 (s, 3H, 4-OCH3), 3 , 85 (d, 1H, J=16,6 Hz, 1H, Gly-a -CHa) , 3,84 (d, 1H, J=16,1 Hz, Gly -a- CHa) , 3,79 (d, 1H, J=16, 6 Hz, Gly-a -CHb) , 3, 69 (d, 1H, J=16,1 Hz, Gly-a- CHb), 3,68 (d, 1H, J = 16, 1 Hz, Gly-a-CHa), 3, 62 (d, 1H, J=1,5 Hz, H -4'), 3,56 (d, 1H, J; =16,1 Hz, Gly-a-CHb) , 3 ,12 (dd, 1H, J· =14,0, , 6,0 Hz, Phe-β -CHa), 3,12 (d, 1H, J=18 ,5 HZ, H- 10a) , 3,04 (d, 1H, J=18,5 . Hz, H-lOb), , 2,94 (dd, 1H, J= 14, 0, 8,4 Hz, Phe-β- CHb) , 2,38 (d, 1H, J=14,7 Hz, H-8a), 2,19 (dd, 1H, J=14 , 7, 5, 1 Hz, H-8b) 2, 05 (ddd, 1H , J=12,7, 12,7, 3 / 4 Hz, H- 2'a) , 1,71 (dd, 1H, J=12, ,7, 4, 6 Hz, Η-2'b), ] L,28 (d, 3H, J= 6,6 Hz, H-6'). 26

Preparação 8 3'-N-ÍAla-Leu-Ala-Leu^-DXR.HCl (14 Ϊ

Da mesma maneira que na Preparação 6, a uma solução de Na-Trt-Ala-Leu-Ala-Leu (13) (314 mg, 0,50 mmol) e N- hidroxissuccinimida (71 mg, 0,62 mmol) em Ν,Ν-dimetilformamida (3 mL) foi adicionada N,N'-diciclohexilcarbodiimida (127 mg, 0,62 mmol) seguida por uma solução de DXR (272 mg, 0,50 mmol) em Ν,Ν-dimetilformamida (3 mL) para dar 3'-N-(Na-Trt-Ala-Leu-Ala-Leu)-DXR (324 mg). O composto (310 mg) foi tratado com ácido acético 75% (3 mL) para dar o produto des-N-tritilado, que foi adicionalmente convertido no cloridrato como o composto em epígrafe (14) (217 mg). iH-r.m.n. (CD3OD): δ 7,95 (d, 1H, J=7,3 Hz, H-l), 7,83 (t, 1H, H-2), 7,57 (d, 1H, J=8,3 Hz, H-3), 5,40 (d, 1H, J=3,2 Hz, H-l'), 5,13 (s largo, 1H, H-7), 4,75 (d, 1H, J=20,8 Hz, H-14a), 4,70 (d, 1H, J=20,8 Hz, H-14b), 4,37, (t, 1H, J=7,4 Hz, Leu-a-CH), 4,34, (t, 1H, J=7,3 Hz, Leu-a-CH), 4,28 (q, 1H, J=6,6 Hz, H-5'), 4,26 (q, 1H, J=7,2 Hz, Ala-a-CH), 4,14 (ddd, 1H, H-3'), 4,03 (s, 3H, 4-OCH3), 3,75 (q, 1H, J=7,1 Hz, Ala-a-CH), 3,57 (d, 1H, J=1,5 Hz, H-4'), 3,07 (d, 1H, J=18,0 Hz, H-10a), 2,93 (d, 1H, J=18,0 Hz, H-lOb), 2,38 (d, 1H, J=14,7 Hz, H-8a), 2,19 (dd, 1H, J=14,7, 5,1 Hz, H-8b), 2,05 (ddd, 1H, J=12,7, 12,7, 3,2 Hz, H-2'a), 1,71 (dd, 1H, J=12,7, 4,6 Hz, Η-2'b), 1,54-1,68 (m, 6H, Leu-P-CH2X2, Leu-v-CHx2), 1,40 (d, 3H, J=7,1 Hz, Ala-p-CH3), 1,28 (d, 3H, J=6,6 Hz, H-6'), 1,26 (d, 3H, 3=1,2 Hz, Ala-p-CH3), 0,87 - 0,93 (m, 12H, Leu-ô-CH3x4).

Preparação 9 3'-N-Glv-DXR.HC1 (16Ϊ

Da mesma maneira que na Preparação 6, a uma solução de Na-Trt-Gly (15) (127 mg, 0,40 mmol) e N-hidroxissuccinimida (51 mg, 0,44 mmol) em Ν,Ν-dimetilformamida (4 mL) foi adicionada N,N' -diciclohexilcarbodiimida (91 mg, 0,44 mmol) seguida por uma 27

V

solução de DXR (220 mg, 0,40 nutiol) em N,N-dimetilformamida (3 mL) para dar 3'-N-(Na-Trt-Gly)-DXR (233 mg), o composto (213 mg) foi tratado com ácido acético 75% (3 mL) para dar o produto des-N-tritilado, que foi adicionalmente convertido no cloridrato como o composto em epígrafe (16) (148 mg). iH-r.m.n. (CD3OD): δ 7,93 (d, 1H, J=6,8 Hz, H-l), 7,82 (t, 1H, H-2), 7,55 (d, 1H, J=8,6 Hz, H-3), 5,42 (d, 1H, J=3,4 Hz, H-l'), 5.17 (s largo, 1H, H-7), 4,77 (d, 1H, J=20,0 Hz, H-14a), 4,71 (d, 1H, J=20,0 Hz, H-14b), 4,28 (q, 1H, J=6,4 Hz, H-5'), 4,20 (ddd, 1H, H-3'), 4,03 (s, 3H, 4-OCH3), 3,63 (s, 2H, Gly-a-CH2), 3,61 (d, 1H, J=1,5 Hz, H-4' ), 3,08 (d, 1H, J=18,7 Hz, HlOa), 2,96 (d, 1H, J=18,7 Hz, H-lOb), 2,37 (d, 1H, J=14,4 Hz, H-8a), 2.17 (dd, 1H, J=14,4, 5,1 Hz, H-8b), 2,05 (d, 1H, J=12,7, 12,7, 3,4 Hz, H-2'a), 1,75 (dd, 1H, J=12,7, 4,7 Hz, Η-2'b), 1,28 (d, 3H, J=6,4 Hz, H-6').

Preparação 10 3'-N-(Glv-Phe)-DNR.HCl <18)

Da mesma maneira que na Preparação 6, a uma solução de N01-Trt-Gly-Phe (17) (140 mg, 0,30 mmol) e N-hidroxissuccinimida (38 mg, 0,33 mmol) em N,N-dimetilformamida (4 mL) foi adicionada N,N'-diciclohexilcarbodiimida (68 mg, 0,33 mmol) seguida por uma solução de DNR (159 mg, 0,30 mmol) em N,N-dimetilformamida (3 mL) para dar 3'-N-(Na-Trt-Gly-Phe)-DNR (174 mg). O composto (150 mg) foi tratado com ácido acético 75% (3 mL) para dar o produto des-N-tritilado, que foi adicionalmente convertido no cloridrato como o composto em epígrafe (18) (55 mg). 1H-r.m.n. (CD3OD): δ 7,97 (d, 1H, J=6,8 Hz, H-l), 7,82 (t, 1H, H-2), 7,56 (d, 1H, J=8,3 Hz, H-3), 7,18-7,28 (m, 5H, Phe-aromático), 5,40 (d, 1H, J=3,4 Hz, H-l'), 5,12 (s largo, 1H, H-7), 4,64 (dd, 1H, J=9,0, 5,6 Hz, Phe-ct-CH), 4,27 (q, 1H, J=6,6 Hz, H-5'), 4,13 (ddd, 1H, H-3'), 4,03 (S, 3H, 4-OCH3), 3,60 (d, 1H, J=15,9 Hz, Gly-a-CHa), 3,50 (d, 1H, J=15,9 Hz, Gly-a-CHb), 3,44 (d, 1H, J=1,5 Hz, H-4'), 3,10 (dd, 1H, J=13,9, 5,6 Hz, Phe- 28

V

y

β-CHa), 3,05 (d, 1H, J=18,5 Hz, H-lOa), 3,00 (d, 1H, J=18,5 Hz, H-lOb), 2,94 (dd, 1H, J=13,9, 9,0 Hz, Phe-p-CHb), 2,36 (s, 3H, H-14), 2,35 (d, 1H, J=14,4 Hz, H-8a), 2,18 (dd, 1H, J=14,4, 5,1 Hz, H-8b), 1,94 (ddd, 1H, J=13,0, 12,7, 3,4 Hz, H2'a), 1,69 (dd, 1H, J=13,0, 4,6 Hz, Η-2'b), 1,28 (d, 3H, J=6,6 Hz, H-6').

Preparação 11 3'-N-(Glv-Glv-Glv-Glv)-DXR.HC1 (20)

Da mesma maneira que na Preparação 6, a uma solução de Na-Trt-Gly-Gly-Gly-Gly ( 19 ) (488 mg, 1,0 mmol) e N- hidroxissuccinimida (127 mg, 1,1 mmol) em N,N-dimetilformamida (5 mL) foi adicionada N,N'-diciclohexilcarbodiimida (227 mg, 1,1 mmol) seguida por uma solução de DXR (544 mg, 1,0 mmol) em N,N-dimetilformamida (3 mL) para dar 3'-N-(Na-Trt-Gly-Gly-Gly-Gly)-DXR (759 mg). O composto (580 mg) foi tratado com ácido acético 75% (5 mL) para dar o produto des-N-tritilado, que foi adicionalmente convertido no cloridrato como o composto em epígrafe (20) (380 mg). í-H-r.m.n. (CD3OD-D2O): ô 7,87 (d, 1H, J=7,3 Hz, H-l), 7,83 (t, 1H, H-2), 7,55 (d, 1H, J=8,3 Hz, H-3), 5,43 (d, 1H, J=3,4 Hz, H- 1'), 5,09 (s largo, 1H, H-7), 4,79 (d, 1H, J=21,0 Hz, H-14a), 4,74 (d, 1H, 21,0 Hz, H-14b), 4,28 (q, 1H, J=6,4 Hz, H-5'), 4,16 (ddd, 1H, H-3'), 4,04 (s, 3H, 4-OCH3), 4,03 (d, 1H, J=16,6 Hz, Gly-a-CHa), 3,98 (d, 1H, J=16,6 Hz, Gly-a-CHb), 3,90 (s, 2H, Gly-a-CH2), 3,86 (s, 2H, Gly-a-CH2), 3,81 (s, 2H, Gly-a-CH2), 3,65 (d, 1H, J=1,5 Hz, H-4' ), 3,07 (d, 1, J=18,6 Hz, H-10a), 3,04 (d, 1H, J=18,6 Hz, H-lOb), 2,36 (d, 1H, J=14,7 Hz, H-8a), 2,18 (dd, 1H, J=14,7, 3,4 Hz, H-8b), 2,03 (ddd, 1H, J=12,7, 12,7, 3,4 Hz, Η-2'a), 1,75 (dd, 1H, J=12,7, 3,9 Hz, H-CHa'b), 1,29 (d, 3H, J=6,4 Hz, H-6') 29

Preparação 12 3 *-N-(Glv-Leu-Phe-Glv^-DXR.HCl (22)

Da mesma maneira que na Preparação 6, a uma solução de Na-Trt-Gly-Leu-Phe-Gly (21 ) (552 mg, 0,87 mmol) e N-hidroxissuccinimida (115 mg, 1,0 mmol) em N,N-dimetilformamida (5 mL) foi adicionada N,N'-diciclohexilcarbodiimida (206 mg, 1,0 mmol) seguida por uma solução de DXR (472 mg, 0,87 mmol) em N,N-dimetilformamida (3 mL) para dar 3'-N-(Na-Trt-Gly-Leu-Phe-Gly)-DXR (242 mg). O composto (169 mg) foi tratado com ácido acético 75% (3 mL) para dar o produto des-N-tritilado, que foi adicionalmente convertido no cloridrato como o composto em epígrafe (22) (79 mg). iH-r.m.n. (CD3OD): ô 7,95 (d, 1H, J=7,8 Hz, H-l), 7,82 (t, 1H, H-2), 7,56 (d, 1H, J=8,6 Hz, H-3), 7,15 - 7,25 (m, 5H, Phe-aromático), 5,43 (d, 1H, J=3,9 Hz, H-l'), 5,14 (s largo, 1H, H-7), 4,76 (d, 2H, J=20,0 Hz, H-14a), 4,71 (d, 1H, 20,0 Hz, H-14b), 4,44 (dd, 1H, J=9,0, 6,4 Hz, Phe-a-CH), 4,30 (q, 1H, J=6,6 Hz, H-5' ) , 4,30 (t, 1H, J=7,3 Hz, Leu-a-CH), 4,15 (ddd, 1H, H-3'), 4,03 (s, 3H, 4-OCH3), 3,90 (d, 1H, J=16,9 Hz, Gly-a-CHa), 3,74 (d, 1H, J=15,9 Hz, Gly-a-CHa), 3,70 (d, 1H, J=15,9 Hz, Gly-α-CHb), 3,62 (d, 1H, J=l,5 Hz, H-4'), 3,61 (d, 1H, J=16,9 Hz, Gly-a-CHb), 3,15 (dd, 1H, J=13,9, 6,4 Hz, Phe-p-CHa), 3,10 (d, 1H, J=18,7 Hz, H-lOa), 3,01 (d, 1H, J=18,7 Hz, H-lOb), 2,96 (dd, 1H, J=13,9, 9,0 Hz, Phe-p-CHb), 2,37 (d, 1H, J=14,7 Hz, H-8a), 2,19 (dd, 1H, J=14,7, 5,1 Hz, H-8b), 2,04 (ddd, 1H, J=12,7, 12,5, 3,9 Hz, H-2'a), 1,71 (dd, 1H, J=12,5, 4,2 Hz, Η-2'b), 1,55 (m, 1H, Leu-v-CH), 1,43 (m, 2H, Leu-P~CH2), 1,29 (d, 3H, J=6,6 Hz, H-6'), 0,89 (d, 3H, 3=6,6 Hz Leu-ô-CH3), 0,85 (d, 3H, J=6,6 Hz, Leu-Ô-CH3). 30 r L-Cj j^e*. t

Exemplo 1

Carboximetilpululano-3'-N-(Glv-Glv-Phe-Glvl-DXR de Sódio (231

Carboximetilpululano de sódio (2) (1.000 mg) foi dissolvido numa mistura de água:N/N-dimetilformamida (1:1) (30 mL). A esta solução foram adicionadas uma solução de 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR.HCl (10) (220 mg) numa mistura de água:N,N- dimetil-formamida (1:1) (6 mL) e l-etoxicarbonil-2-etoxi-l,2-dihidroquinolina (1.000 mg). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 2 horas e depois submetida a diálise através de uma membrana de diálise ("cut-off" molecular: 12.000—14.000; SPECTRUM CO.) com água purificada como uma solução externa a 4°C durante 2 dias, passada através de 50 mL de uma resina de permuta catiónica (AG 50W-X8 (tipo Na+); BIO-RAD), e ainda submetida a diálise contra água purificada a 4°C durante 2 dias. A solução interna dialisada foi retirada e liofilizada para dar 0 composto em epígrafe (23) (1.085 mg). O complexo tinha um teor de fármaco de 6,1% (% em peso) determinado por espectrofotometria de absorção no visível a 478 nm e o peso total do complexo. O espectro de absorção no ultravioleta-visível e o padrão de eluição da filtração por gel (detectado pela absorção no visível a 478 nm) estão ilustrados nas Figuras 1 e 2, respectivamente.

Exemplo 2

CarboximetilPululano-3,-N-fGly-Glv-Phe-Glv)-DXR de Sódio (24)

Da mesma maneira que no Exemplo 1, fez-se reagir uma solução de carboximetilpululano de sódio (3) (450 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (13,5 mL), uma solução de 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR.HCl (10) (100 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (4,5 mL) e 1-

etoxicarbonil-2-etoxi-l,2-dihidroquinolina (450 mg) para dar o composto em epígrafe (24) (420 mg). O complexo tinha um teor de fármaco de 5,8% (% em peso) determinado por espectrofotometria de absorção no visível a 478 nm e o peso total do complexo. O 31 Γ u espectro de absorção no ultravioleta-visivel e o padrão de eluição da filtração por gel (detectado pela absorção no visivel a 478 nm) estão ilustrados nas Figuras 3 e 4, respectivamente.

Exemplo 3

CarboximetilPululano-3'-N-(Gly-Glv-Phe-Glv^-DXR de Sódio (251

Da mesma maneira que no Exemplo 1, fez-se reagir uma solução de carboximetilpululano de sódio (4) (600 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (18 mL), uma solução de 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR.HCl (10) (270 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (6 mL) e l-etoxicarbonil-2- etoxi-1,2-dihidroquinolina (600 mg) para dar o composto em epigrafe (25) (705 mg). O complexo tinha um teor de fármaco de 12,4% (% em peso) determinado por espectrofotometria de absorção no visivel a 478 nm e o peso total do complexo.

Exemplo 4

Carboximetilpululano-3'-N-rGlv-Phe-GlY-GlY)-DXR de Sódio (26)

Da mesma maneira que no Exemplo 1, fez-se reagir uma solução de carboximetilpululano de sódio (2) (1.000 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (30 mL), uma solução de 3'-N-(Gly-Phe-Gly-Gly)-DXR.HCl (12) (220 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (10 mL) e l-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroquinolina (1.000 mg) para dar o composto em epigrafe (26) (1.070 mg). O complexo tinha um teor de fármaco de 6,1% (% em peso) determinado por espectrofotometria de absorção no visivel a 478 nm e o peso total do complexo.

Exemplo 5

Carboximetilpululano-3'-N-fAla-Leu-Ala-Leui-DXR de Sódio (Π\

Da mesma maneira que no Exemplo 1, fez-se reagir uma solução de carboximetilpululano de sódio (2) (750 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (22 mL), uma solução 32 de 3'-N-(Ala-Leu-Ala-Leu)-DXR.HCl (14) (180 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (8 mL) e l-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroquinolina (750 mg) para dar o composto em epígrafe (27) (856 mg). 0 complexo tinha um teor de fármaco de 6,7% (% em peso) determinado por espectrofotometria de absorção no visível a 478 nm e o peso total do complexo.

Exemplo 6

Carboximetilpululano-3'-N-Gly-DXR de Sódio (281

Da mesma maneira que no Exemplo 1, fez-se reagir uma solução de carboximetilpululano de sódio (6) (200 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (6 mL), uma solução de 3'-N-Gly-DXR.HCl (16) (15 mg) numa mistura de água:N,N- dimetilformamida (1:1) (2 mL) e l-etoxicarbonil-2-etoxi-l,2-dihidroquinolina (100 mg) para dar o composto em epígrafe (28) (155 mg). 0 complexo tinha um teor de fármaco de 3,1% (% em peso) determinado por espectrofotometria de absorção no visível a 478 nm e o peso total do complexo.

Exemplo 7

Carboximetilpululano-3'-N-Gly-DXR de Sódio f29)

Da mesma maneira que no Exemplo 1, exceptuando o facto de que foi utilizada uma membrana de diálise com um "cut-off” molecular de 1.000 como a membrana de diálise, fez-se reagir uma solução de carboximetilpululano de sódio (8) (100 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (3 mL), uma solução de 3'-N-Gly-DXR.HCl (16) (40 mg) numa mistura de água:N,N- dimetilformamida (1:1) (2 mL) e l-etoxicarbonil-2-etoxi-l,2- dihidroquinolina (100 mg) para dar o composto em epígrafe (29) (111 mg). O complexo tinha um teor de fármaco de 12,6% (% em peso) determinado por espectrofotometria de absorção no visível a 478 nm e o peso total do complexo. O espectro de absorção no ultravioleta-vislvel e o padrão de eluição na filtração por gel 33

(detectado pela absorção no visível a 478 nm) estão ilustrados nas Figuras 5 e 6, respectivamente.

Exemplo 8

CarboximetilPululano-3'-N-fGlv-Phei-DNR de Sódio (301

Da mesma maneira que no Exemplo 1, fez-se reagir uma solução de carboximetilpululano de sódio (2) (200 mg) numa mistura de águasN,N-dimetilformamida (1:1) (6 mL), uma solução de 3'-N-(Gly-Phe)-DNR.HCl (18) (32 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (2 mL) e l-etoxicarbonil-2-etoxi-l,2-dihidroquinolina (200 mg) para dar o composto em epígrafe (30) (185 mg). O complexo tinha um teor de fármaco de 5,6% (% em peso) determinado por espectrofotometria de absorção no visível a 478 nm e o peso total do complexo.

Exemplo 9

Carboximetilpululano-3'-N-íGlv-GlY-Gly-Glvl-DXR de Sódio f311

Da mesma maneira que no Exemplo 1, fez-se reagir uma solução de carboximetilpululano de sódio (2) (300 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (9 mL), uma solução de 3'-N-(Gly-Gly-Gly-Gly)-DXR.HCl (20) (63 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (3 mL) e l-etoxicarbonil-2- etoxi-1,2-dihidroquinolina (300 mg) para dar o composto em epígrafe (31) (330 mg). 0 complexo tinha um teor de fármaco de 6,9% (% em peso) determinado por espectrofotometria de absorção no visível a 478 nm e o peso total do complexo.

Exemplo 10

Carboximetilpululano-3f-N-(Glv-Leu-Phe-Glv)-DXR de Sódio (32)

Da mesma maneira que no Exemplo 1, fez-se reagir uma solução de carboximetilpululano de sódio (2) (200 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (6 mL), uma solução de 3'-N-(Gly-Leu-Phe-Gly)-DXR.HCl (22) (48 mg) numa mistura de 34

água:N,N-dimetilformamida (1:1) (2 mL) e l-etoxicarbonil-2- etoxi-1/2-dihidroquinolina (200 mg) para dar o composto em epígrafe (32) (183 mg). 0 complexo tinha um teor de fármaco de 6,2% (% em peso) determinado por espectrofotometria de absorção no visível a 478 nm e o peso total do complexo.

Exemplo 11

CarboximetilPululano-3'-N-(Gly-Glv-Phe-Gly\-DXR de Sódio (331

Da mesma maneira que no Exemplo 1, fez-se reagir uma solução de carboximetilpululano de sódio (4) (400 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (12 mL), uma solução de 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR.HC1 (10) (88 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (4 mL) e l-etoxicarbonil-2- etoxi-1,2-dihidroquinolina (400 mg) para dar o composto em epígrafe (33) (348 mg). 0 complexo tinha um teor de fármaco de 7,3% (% em peso) determinado por espectrofotometria de absorção no visível a 478 nm e o peso total do complexo.

Exemplo 12

Carboximetilpululano-3,-N-fGlY-GlY-Phe-Gly)-DXR de Sódio (34)

Da mesma maneira que no Exemplo 1, fez-se reagir uma solução de carboximetilpululano de sódio (2) (200 mg) numa mistura de ãgua:N,N-dimetilformamida (1:1) (6 mL), uma solução de 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR.HCl (10) (88 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (4 mL) e l-etoxicarbonil-2- etoxi-1,2-dihidroquinolina (200 mg) para dar o composto em epígrafe (34) (251 mg). O complexo tinha um teor de fármaco de 11,0% (% em peso) determinado por espectrofotometria de absorção no visível a 478 nm e o peso total do complexo. 35

Preparação 13 3'-N-(Gly Ϊ fi-DXR.HC1 (36i

Da mesma maneira que na Preparação 6, a uma solução de Na-Trt-(Gly)6-OH (35) (240 mg, 0,4 mmol) e N-hidroxissuccinimida (57 mg, 0,5 mmol) em N,N-dimetilformamida (4 mL) adicionou-se N, N'-diciclohexilcarbodiimida (103 mg, 0,5 mmol) seguida por uma solução de DXR (217 mg, 0,4 irmiol) em N,N-dimetilformamida (3 mL) para dar 3'-N-(Na-Trt-(Gly)6)-DXR (177 mg). 0 composto (167 mg) foi tratado com ácido acético 75% (3 mL) para dar o produto des-N-tritilado, que foi adicionalmente convertido no cloridrato como o composto em epígrafe (36) (98 mg). iH-r.m.n. (CD30D-D20); δ 7,73 (t, 1H, H-2), 7,69 (d, 1H, J=6,6 Hz, H-l), 7,42 (d, 1H, J=8,3 Hz, H-3), 5,41 (s largo, 1H, H-l'), 4,98 (s largo, 1H, H-7), 4,81 (d, 1H, J=20,3 Hz, H-14a), 4,70 (d, 1H, J=20,0 Hz, H-14b), 4,26 (q, 1H, J=6,6 Hz, H-5'), 4,16 (ddd, 1H, H-3'), 4,02 (s, 2H, Gly-a-CHa), 3,98 (s, 3H, 4-OCH3), 3,96 (s, 4H, Gly-a-CH2x2), 3,92 (s, 2H, Gly-a-C^), 3,91 (d, 1H, J=17,1 Hz, Gly-a-CH2), 3,87 (d, 1H, J=17,l Hz, Gly-a-CHb), 3,85 (s, 2H, Gly-a-CH2), 3,68 (d, 1H, J=l,5 Hz, H-4'), 2,98 (d, 1H, J=18,1 Hz, H-10a), 2,76 (d, 1H, J=18,l Hz, H-lOb), 2,34 (d, 1H, J=14,2 Hz, H-8a), 2,13 (dd, 1H, J=13,9, 3,7 Hz, H-8b), 2,03 (ddd, 1H, J=13,2, 13,2, 3,9 Hz, Η-2'a), 1,76 (dd, 1H, J=ll,9, 3,3 Hz, Η-2'b), 1,30 (d, 3H, 3=6,6 Hz, H-6').

Preparação 14 3'-N-1Phe-Glv^-DXR.HCl (38)

Da mesma maneira que na Preparação 6, a uma solução de Na-Trt-(Phe-Gly)-OH (37) (232 mg, 0,5 mmol) e N-hidroxissuccinimida (63 mg, 0,55 mmol) em N,N-dimetilformamida (4 mL) foi adicionada N,N'-diciclohexilcarbodiimida (113 mg, 0,55 mmol) seguida por uma solução de DXR (272 mg, 0,5 mmol) em N,N-dimetilformamida (3 mL) para dar 3'-N-(Na-Trt-Phe-Gly)-DXR (214 mg). O composto (200 mg) foi tratado com ácido acético 75% (3 mL) para dar o produto 36 Γ des-N-tritilado, que foi adicionalmente convertido no cloridrato como o composto em epígrafe (38) (98 mg). J-H-r.m.n. (CD3OD): ô 7,89 (d, 1H, J=7,3 Hz H-l), 7,79 (t, 1H, H-2), 7,52 (d, 1H, J=8,3 Hz, H-3), 7,21-7,30 (m, 5H, Phe- aromático), 5,41 (d, 1H, J=3,7 Hz, H-l'), 5,11 (s largo, 1H, H-7), 4,76 (d, 2H, J=19,9 Hz, H-14a), 4,71 (d, 1H, J=19,9 Hz, H-14b), 4,27 (q, 1H, J=6,4 Hz, H-5'), 4,16 (ddd, 1H, H-3'), 4,05 (dd, 1H, J=8,1, 6,4 Hz, Phe-a-CH), 4,02 (s, 3H, 4-OCH3), 3,92 (d, 1H, J=16,5 Hz, Gly-a-CHa), 3,75 (d, 1H, J=16,5 Hz, Gly-ct- CHb), 3,60 (d, 1H, J=1,5 Hz, H-4'), 3,18 (dd, 1H, J=14,0, 6,4 Hz, Phe-p-CHa), 3,05 (d, 1H, J=18,7 Hz, H-lOa), 2,98 (dd, 1H, J=14,0, 8,1 Hz, Phe-p-CHb), 2,92 (d, 1H, J=18,7 Hz, H-lOb), 2,36 (d, 1H, J=14,4 Hz, H-8a), 2,17 (dd, 1H, J=14,4, 4,6 Hz, H-8b), 1,97 (ddd, 1H, J=13,2, 13,2, 3,9 Hz, Η-2'a), 1,73 (dd, 1H, J=13,2 4,6 Hz, Η-2'b), 1,27 (d, 3H, J=6,4 Hz, H-6').

Exemplo 13

Carboximetilpululano-3'-N-fGlylfi-DXR de Sódio (39i

Da mesma maneira que no Exemplo 1, fez-se reagir uma solução de carboximetilpululano de sódio (2) (300 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (9 mL), uma solução de 3'-N-(Gly)6-DXR.HCl (36) (66 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (6 mL) e l-etoxicarbonil-2-etoxi-l,2-dihidroquinolina (300 mg) para dar o composto em epígrafe (39) (327 mg). 0 complexo tinha um teor de fármaco de 6,3% (% em peso) determinado por espectrofotometria de absorção no visível a 478 nm e o peso total do complexo.

Exemplo 14

Carboximetilpululano-3'-N-(Phe-Glvl-DXR de Sódio M0)

Da mesma maneira que no Exemplo 1, fez-se reagir uma solução de carboximetilpululano de sódio (2) (250 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (7,5 mL), uma solução de 3'-N-(Phe-Gly)-DXR.HCl (38) (45 mg) numa mistura de água:N,N- 37 u Γ t dimetilformamida (1:1) (2,5 mL) e l-etoxicarbonil-2-etoxi-l,2-dihidroquinolina (250 mg) para dar o composto em epígrafe (40) (223 mg). O complexo tinha um teor de fármaco de 6,5% (% em peso) determinado por espectrofotometria de absorção no visível a 478 nm e o peso total do complexo.

Preparação 15

Succinilpululano de sódio (41)

Pululano (1) (3,2 g, peso do peso molecular médio: ca. 150.000 fabricado por K. K. Hayashibara-seibutsu-kagaku Kenkyujo) e cloreto de lítio (2,5 g) foram dissolvidos em N,N-dimetilformamida (30 mL). Anidrido succínico (3,0 g) e N-metilmorfolina (3,03 g) foram então adicionados à solução. Depois de a mistura ter sido agitada à temperatura ambiente durante 1 hora, adicionou-se metanol (100 mL). A mistura foi centrifugada para dar precipitados que foram então dissolvidos em água (30 mL). Ά solução aquosa foi passada através de 50 mL de uma resina de permuta catiónica (AG 50W-X8 (tipo Na+); BIO-RAD), e adicionalmente submetida a diálise contra água purificada a 4°C durante 2 dias. A solução interna dialisada foi então retirada e liofilizada para dar o composto em epígrafe (41) (2,31 g). Este produto tinha um grau de succinilação de 0,7 (por resíduo de açúcar determinado por titulação com álcali).

Exemplo 15

SuccinilPululano-S^N-íGlv-Glv-Phe-Glvl-DXR de Sódio (421

Da mesma maneira que no Exemplo 1, fez-se reagir uma solução de succinilpululano de sódio (41) (300 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (9 mL), uma solução de 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR.HCl (10) (66 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (3 mL) e l-etoxicarbonil-2-etoxi-l,2-dihidroquinolina (300 mg) para dar o composto em epígrafe (42) (327 mg). 0 complexo tinha um teor de fármaco de 6,8% (% em peso) determinado por espectrofotometria de absorção no visível 38 r- L·, ^ a 478 nm e o peso total do complexo. O espectro de absorção no ultravioleta-visível e o padrão de eluição na filtração por gel (detectado pela absorção no visível a 478 nm) estão ilustrados nas Figuras 7 e 8, respectivamente.

Preparação 16

Carboximetilquitina de sódio de baixo peso molecular M31

Carboximetilquitina (grau de carboximetilação: 0,7; fabricada por Katakura Chikkarin Co.) (20,0 g) foi dissolvida numa solução de acetato de sódio 50 mM (pH 6,0) (2,0 litros) e aquecida até uma temperatura de 37°C. Uma solução de lisozima (derivada de clara de ovo, 51.500 Unidades/mg de sólido; fabricada por Seikagaku Co. ) (60 mg) dissolvida em água purificada foi adicionada a esta solução. A mistura foi agitada a 37°C durante 2,5 horas e adicionada a etanol 99,5% (1,2 litros). 0 precipitado assim obtido foi lavado com etanol 95%, acetona e éter, e seco a pressão reduzida para dar um produto branco amorfo de carboximetilquitina (17,6 g).

A carboximetilquitina (17,6 g) foi dissolvida em água purificada (1,2 litros). Adicionou-se à solução orohidreto de sódio (2,64 g) em três porções. A mistura foi agitada de um dia para o outro a 4°C. Depois adicionou-se ácido clorídrico à reacção para ajustar o pH para 4,0, adicionou-se uma solução de hidróxido de sódio e a mistura foi ajustada para pH 8,1. A solução foi filtrada por um filtro de membrana (0,3 pm), e o filtrado foi adicionado a etanol 99,5% (10 litros). O precipitado resultante foi lavado com etanol 95%, acetona e éter em sequência, e seco a pressão reduzida para dar carboximetilquitina de sódio (14,4 g) cujo terminal de redução foi reduzido.

Em seguida, a carboximetilquitina de sódio cujo terminal de redução tinha sido reduzido (4,0 g) foi dissolvida em solução de cloreto de sódio 0,2 M (400 mL). A solução foi adicionada a 39 η uma coluna de 240 mL de uma resina de permuta aniónica (AG1-X2 (tipo Cl); BIO-RAD) que tinha sido anteriormente equilibrada com uma solução de cloreto de sódio 0,2 Μ. A eluição foi então realizada por passos com várias concentrações de soluções aquosas de cloreto de sódio. O eluido com uma solução de cloreto de sódio 0,4 M foi adicionado a etanol 99,5% (3,5 litros). Os precipitados assim obtidos foram lavados com etanol 95%, acetona e éter em sequência e secos a pressão reduzida para dar uma carboximetilquitina de sódio com um peso molecular mais baixo (713 mg). A carboximetilquitina de sódio (600 mg) assim obtida foi dissolvida numa solução saturada de hidrogeno carbonato de sódio (60 mL). Adicionou-se anidrido acético (2,4 mL) em quatro porções, e a mistura foi agitada de um dia para o outro a 4eC. A mistura reaccional foi dialisada através de uma membrana de diálise ("cut-off" molecular: 12.000—14.000; SPECTRUM CO.) contra água purificada como uma solução externa a 4°C durante 3 dias. A solução reaccional foi filtrada por um filtro de membrana (0,22 μπι) e adicionada a etanol 99,5% (600 mL). O precipitado assim obtido foi lavado com etanol 95%, acetona e éter em sequência, seco a pressão reduzida para dar o composto em epígrafe (43) (550 mg), que tinha um peso molecular de cerca de 70.000 com base no método de filtração por gel com dextrano como o material padrão.

Exemplo 16

Carboxilmetilquitina-3'-N-(Glv-Gly-Phe-Gly)-DXR de Sódio (44¾

Da mesma maneira que no Exemplo 1, fez-se reagir uma solução de carboxilmetilquitosana de sódio (43) (100 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (3 mL), uma solução de 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR.HCl (10) (10,4 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (1 mL) e l-etoxicarbonil-2- etoxi-1,2-dihidroquinolina (100 mg) para dar o composto em epígrafe (44) (96 mg). O complexo tinha um teor de fármaco de 40 1 1 Γ u 2,7% (% em peso) determinado por espectrofotometria de absorção no visível a 478 nm e o peso total do complexo. O espectro de absorção no ultravioleta-visível e o padrão de eluição na filtração por gel (detectado pela absorção no visível a 478 nm) estão ilustrados nas Figuras 9 e 10, respectivaraente.

Preparação 17

Carboximetildextrano de sódio (45¾

Dextrano (peso molecular: ca. 70.000 fabricado por Pharmacia) (1,0 g) foi dissolvido numa solução de hidróxido de sódio 6 N (8,3 mL) e aquecido até 70°C. Ácido monocloroacético (2,0 g) foi adicionado à solução. A mistura resultante foi agitada a 70°C durante 20 minutos. Em seguida a solução reaccional foi arrefecida com gelo, e ajustada para pH 8,5 pela adição de ácido acético. A solução foi então adicionada a metanol (500 mL). O precipitado assim obtido foi dissolvido em água purificada (20 mL) e a solução foi dialisada através de uma membrana de diálise ("cut-off" molecular: 12.000—14.000; fabricada por SPECTRUM CO.) contra água purificada como uma solução externa a 4°C durante 2 dias. A solução interna dialisada foi retirada e liofilizada para dar o composto em epígrafe (45) (0,9 g). Este material tinha um grau de carboximetilação de 0,6 por resíduo de açúcar.

Exemplo 17

Carboxilmetildextrano-3'-N-(Gly-Glv-Phe-Gly)-DXR de Sódio (46)

Da mesma maneira que no Exemplo 1, fez-se reagir uma solução de carboxilmetildextrano de sódio (45) (300 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (9 mL), uma solução de 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR.HC1 (10) (66 mg) numa mistura de água:N,N<-dimetilformamida (1:1) (3 mL) e l-etoxicarbonil-2- etoxi-1,2-dihidroquinolina (300 mg) para dar o composto em epígrafe (46) (297 mg). 0 complexo tinha um teor de fármaco de 5,7% (% em peso) determinado por espectrofotometria de absorção 41 Γ u no visivel a 478 nm e o peso total do complexo. O espectro de absorção no ultravioleta-visível e o padrão de eluição na filtração por gel (detectado pela absorção no visível a 478 nm) estão ilustrados nas Figuras 11 e 12, respectivamente.

Preparação 18

Carboximetilmanoalucano de baixo peso molecular

Manoglucano (7,0) isolado de uma titulação de uma cultura de Actinomycete Microellobosporia grisea foi dissolvido em ácido clorídrico 0,1 N (280 mL). A solução foi aquecida até 80°C durante 7,5 horas. A mistura reaccional foi ajustada a pH 7,0 com arrefecimento com gelo com uma solução de hidróxido de sódio 5 N e adicionada a etanol 99,5% (900 mL). Os precipitados assim obtidos foram lavados com etanol 95% e depois dissolvidos em água purificada (450 mL). A solução foi passada por uma coluna de 60 mL de uma resina de permuta catiónica (AG50W-X2 (tipo H ); BIO-RAD. 0 eluído foi ainda passado por uma coluna de 60 mL de uma resina de permuta catiónica (AG1-X2 (tipo Cl”); BIO-RAD). O eluído final foi concentrado até um volume de 250 mL a pressão reduzida e adicionado a etanol 99,5% (800 mL). O precipitado assim obtido foi lavado com etanol 95%, acetona e éter em sequência e seco a pressão reduzida para dar um manoglucano de baixo peso molecular (6,02 g). 0 manoglucano de baixo peso molecular assim obtido (3,98 g) foi dissolvido numa solução de cloreto de sódio 1 M (400 mL). Metanol (533 mL) foi então adicionado à solução para dar o precipitado que foi depois dissolvido em água purificada (100 mL). A solução resultante foi adicionada a etanol 99,5% (400 mL). Os precipitados assim obtidos foram lavados com etanol 95%, acetona e éter em sequência e secos a pressão reduzida para dar um manoglucano de baixo peso molecular (2,0 g). Água (72 mL) e hidróxido de sódio (12,6 g) foram adicionados a este manoglucano de baixo peso molecular (1,80 g) 42

a fim de formar uma solução. Depois de se adicionar ácido cloroacético (18,0 g) a esta solução com arrefecimento com gelo, a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 20 horas. A mistura reaccional foi ajustada para pH 8,0 pela adição de ácido acético e depois adicionada a metanol (360 mL). Os precipitados assim obtidos foram lavados com metanol, acetona e éter em sequência e secos a pressão reduzida para dar um carboximetilmanoglucano de sódio de baixo peso molecular (2,23 g)· A carboximetilação acima foi repetida de novo para dar o composto em epígrafe (2,25 g), que tinha um peso molecular de cerca de 110.000 determinado pelo método de filtração por gel com dextrano como o material padrão. Este composto tem um grau de carboximetilação de 0,8 por resíduo de açúcar determinado por titulação com álcali.

Exemplo 18

Carboximetilmanoglucano-3'-N-íGly-Glv-Phe-Gly^-DXR de Sódio (481

Da mesma maneira que no Exemplo 1, fez-se reagir uma solução de carboxilmetilmanoglucano de sódio (47) (100 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (3 mL), uma solução de 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR.HCl (10) (11,9 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (1 mL) e l-etoxicarbonil-2- etoxi-1,2-dihidroquinolina (100 mg) para dar o composto em epígrafe (48) (99 mg). O complexo tinha um teor de fármaco de 4,5% (% em peso) determinado por espectrofotometria de absorção no visível a 478 nm e o peso total do complexo. O espectro de absorção no ultravioleta-visível e o padrão de eluição na filtração por gel (detectado pela absorção no visível a 478 nm) estão ilustrados nas Figuras 13 e 14, respectivamente. 43 Γ u

Preparação 19 N-acetil-des-N-heparina sulfatada (49)

Des-N-heparina sulfatada de sódio (1,0 g, derivada de mucosa porcina, fabricada por Sigma Co.) foi dissolvida numa solução saturada de hidrogeno carbonato de sódio (100 mL). Adicionou-se anidrido acético (4 mL) em quatro porções com um intervalo de 15 minutos. Em seguida a mistura foi agitada de um dia para o outro a 4°C, a mistura reaccional foi ajustada para pH 6,5 pela adição de ácido acético e depois adicionada a etanol 99,5% (700 mL). 0 precipitado assim obtido foi dissolvido em água destilada (50 mL) e filtrado através de um filtro de membrana (0,22 μπι). 0 eluido foi adicionado a etanol 99,5% (400 mL). Os precipitados resultantes foram lavados com etanol 95%, acetona e éter em sequência e secos a pressão reduzida para dar o composto em epígrafe (900 mg) como um produto branco amorfo, que tinha um peso molecular de cerca de 40.000 determinado pelo método de filtração por gel com dextrano como o material padrão.

Exemplo 19

Complexo de N-acetil-des-N-heparina sulfatada-/Glv-Gly-Phe-Glvi-DXR de Sódio (50i

Uma solução de N-acetil-des-N-heparina sulfatada de sódio (49) (340 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (20 mL), uma solução de 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR.HCl (10) (75 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (10 mL) e 1-etoxicarbonil-2-etoxi-l,2-dihidroquinolina (340 mg) foram agitadas à temperatura ambiente durante 3 horas. A mistura reaccional foi submetida a diálise através de uma membrana de diálise ("cut-off" molecular: 12.000—14.000; fabricada por SPECTRUM CO.) contra água purificada como uma solução externa a 4°C durante 3 dias. A solução interna dialisada foi passada através de uma coluna de 20 mL de uma resina de permuta catiónica (AG50W-X8 (tipo Na+); BIO-RAD) e ainda passada através de um filtro de membrana (0,45 μπι). O eluido foi adicionado a 44 t Γ etanol 99,5% (400 mL). O precipitado assim obtido foi lavado com etanol 95%, acetona e éter em sequência e seco a pressão reduzida. 0 resíduo assim obtido foi dissolvido em água purificada (20 mL), filtrado por um filtro de membrana (0,45 pm) e liofilizado para dar o composto em epígrafe (50) (328 mg). O complexo tinha um teor de fármaco de 4,2% (% em peso) determinado por espectrofotometria de absorção no visível a 478 nm e o peso total do complexo. O espectro de absorção no ultravioleta-vislvel e o padrão de eluição na filtração por gel (detectado por absorção no visível a 478 nm) estão ilustrados nas Figuras 15 e 16, respectivamente.

Preparação 20

Hialuronato de sódio de baixo peso molecular (51) (521 A 110 mL de uma injecção intra-articular de hialuronato de sódio (derivado de cristã de galo; peso do peso molecular médio: 600.000—1.200.000; fabricado por Seikagaku Co. Kaken Pharmaceutical Co.; solução de 25 mg/2,5 mL) foi adicionada uma solução de cloreto de sódio 1,5 M—acetato de sódio 1 M (pH 5,0) (11 mL). Depois de a mistura ter sido aquecida até 37°C, adicionou-se à solução Hialuronidase (2.200 U) (derivado de testículos de carneiro; 2,400 Unidades/mg de sólido; fabricado por Sigma Co.) dissolvida em água purificada arrefecida com gelo. A mistura foi então agitada a 37°C durante 2 horas. A mistura reaccional foi adicionada a etanol 99,5% (1,4 litros) para dar o precipitado, que foi então dissolvido em 20 mL de água destilada e filtrado por um filtro de membrana (0,45 pm). O eluido foi adicionado a etanol 99,5% (200 mL). O precipitado assim obtido foi lavado com etanol 95%, acetona e éter em sequência e seco a pressão reduzida para dar hialuronato de sódio como um produto branco amorfo (991 mg). 0 hialuronato de sódio (700 mg) foi então dissolvido numa solução de cloreto de sódio 0,1 M (70 mL) e passado por uma coluna de 70 mL de uma resina de permuta aniónica (AGMP-1 (tipo 45 r

Cl ); BIO-RAD) que tinha previamente sido equilibrada com uma solução de cloreto de sódio 0,1 Μ. A eluição com uma variedade de concentrações de sal resultou em quatro fracções que contêm um ácido hialurónico correspondente às concentrações de sal. Estes eluidos foram respectivamente adicionados a etanol 99,5% (1,5 litros). Os precipitados assim obtidos foram dissolvidos em água destilada (10 mL) e passados por um filtro de membrana (0,22 mL). O eluido foi adicionado a etanol 99,5% (100 mL). Os precipitados assim obtidos foram lavados com etanol 95%, acetona e éter em sequência, e secos a pressão reduzida para dar o hialuronato de sódio (51) 255 mg, (52) 173 mg, 109 mg e 84 mg. Estes hialuronatos tinham um peso molecular de cerca de 80.000, 170.000, 270.000 e 410.000, respectivamente, com base no método de filtração por gel com dextrano como o material padrão.

Exemplo 20

Hialuronato-^-N-fGly-Glv-Phe-GlYl-DXR de Sódio (53\

Da mesma maneira que no Exemplo 19, fez-se reagir uma solução de hialuronato de sódio (51) (150 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (12 mL), uma solução de 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR.HCl (10) (33 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (3 mL) e l-etoxicarbonil-2-etoxi-l,2-dihidroguinolina (150 mg) para dar o composto em epigrafe (53) (164 mg). O complexo tinha um teor de fármaco de 6,2% determinado por espectrofotometria de absorção no visivel a 478 nm e o peso total do complexo. O espectro de absorção no ultravioleta-visivel e o padrão de eluição na filtração por gel (detectado pela absorção no visivel a 478 nm) estão ilustrados nas Figuras 17 e 18, respectivamente.

Exemplo 21

Hialuronato-3'-N-fGly-Gly-Phe-Gly)-DXR de Sódio (541 A reacção foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 20, excepto que o hialuronato de sódio (51) foi substituído por 46

hialuronato de sódio (52) para dar o composto em epígrafe (54) (163 mg). O complexo tinha um teor de fármaco de 5,7% determinado por espectrofotometria de absorção no visível a 478 nm e o peso total do complexo.

Exemplo 22

Hialuronato-3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly>-DXR de Sódio (551

Da mesma maneira que no Exemplo 19, fez-se reagir uma solução de hialuronato de sódio (100 mg) (derivado de pele de porco; Pm=40.000—60.000; fabricado por Seikagaku Co.) dissolvido numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (12 mL), uma solução de 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR.HCl (10) (22 mg) numa mistura de água:N,N-dimetilformamida (1:1) (2 mL) e 1- etoxicarbonil-2-etoxi-l,2-dihidroquinolina (100 mg) para dar o composto em epígrafe (55) (87 mg). 0 complexo tinha um teor de fármaco de 5,4% determinado por espectrofotometria de absorção no visível a 478 nm e o peso total do complexo.

Alguns exemplos de referência estão ilustrados esquematicamente como se segue: 47 f—i!

Trt-Gly-Gly-Phe-Gly 9 1) DCC/HONSu 2) DXR_ 3) AcOH 75% 4) HC1

HO

10

Trt-Gly-Phe-Gly-Gly 11

1) DCC/HONSu 2) DXR 3) AcOH 75% 4) HCl

HCl.Gly-Gly-Phe-Gly- NH

HO

HCl.Gly-Phe-Gly-Gly- NH 12

Trt-Ala-Leu-Ala-Leu

1) DCC/HONSu 2) DXR 13 3) ACOH 75% 4) HCl

HCl.Ala-Leu-Ala-Leu- NH li 48 t 1) DCC/HONSU Trt-Gly 2 ) DXR_ 3) AcOH 75% 15 4) HC1

Trt-Gly-Phe 17 1) DCC/HONSu 2) DNR_ 3) AcOH 75% 4) HC1

HO HC1.Gly-Phe- NH

Trt-Gly-Leu-Phe-Gly 1) DCC/HONSu

2) DXR

Trt-Gly-Gly-Gly-Gly - 3) ACOH 75% 19 4) HC1 1) DCC/HONSu

2) DXR 3) ACOH 75% 4) HC1 18

HO HC1.Gly-Gly-Gly-Gly- NH 20

HC1.Gly-Leu-Phe-Gly- NH 49 22 21

V

Trt-(Gly)5 35

1) DCC/HONSu 2) DXR 3) AcOH 75% 4) HCl

Trt-Phe-Gly 37

1) DCC/HONSu 2) DXR 3) ACOH 75% 4) HCl

50

Exemplo Experimental 1 Actividade antitumoral 7 Células 256 do carcinossarcoma de Walker (1x10 ) foram transplantadas por via intramuscular para a região inguinal de fêmeas de ratos Wistar (6 semanas de idade, 110 ± 10 g). Após três dias, os compostos de teste, o composto (27) obtido no Exemplo 5, o composto (23) obtido no Exemplo 1 ou cloridrato de doxorubicina dissolvido em soro fisiológico, foram administrados através da veia da cauda de cinco ratos formando um grupo. Estes compostos foram administrados numa quantidade de 51,2, 128, 320 e 800 pg/kg que foram tornados equivalentes à doxorubicina.

Sete dias após o transplante das células tumorais, os ratos foram sacrificados por sangramento. 0 tumor foi extraído e pesado para avaliar a actividade antitumoral. A relação entre dose e peso do tumor está ilustrada na Figura 19. Como se torna evidente da Figura 19, os complexos de fármacos de acordo com a presente invenção exibiram excelente actividade antitumoral quando comparados com doxorubicina a qualquer das doses.

Exemplo Experimental 2 Variação do peso de ratos

Os compostos de teste, o composto (27) obtido no Exemplo 5, o composto (23) obtido no Exemplo 1 ou doxorubicina dissolvida em soro fisiológico, foram administrados através da veia da cauda de cinco ratos wistar fêmeas (6 semanas de idade, 110 ± 10 g) formando um grupo. A toxicidade e os efeitos secundários foram avaliados pela alteração no peso corporal e sobrevida dos ratos. A alteração do peso dos ratos foi expressa como uma percentagem com base nos pesos iniciais. 51 A alteração do peso dos ratos no grupo em que o composto foi administrado numa quantidade de 10 mg/kg está ilustrada na Figura 20. 0 peso corporal tendeu a diminuir no periodo inicial após a administração tanto da doxorubicina como dos complexos de fármaco de acordo com a presente invenção. No entanto, as alterações nos casos dos complexos de fármaco foram ligeiras quando comparadas com as da doxorubicina. Além disso, nos grupos em que os complexos de fármaco foram administrados, o peso aumentou de novo e foi recuperado até ao nivel inicial em cerca de 10 dias após a administração do complexo do fármaco. Por outro lado, no caso da doxorubicina o peso não foi recuperado até ao nivel inicial, com alguns ratos mortos.

Estes resultados sugerem que o complexo de acordo com a presente invenção apresenta actividade antitumoral acrescida e toxicidade e efeitos secundários reduzidos em comparação com a doxorubicina. Consequentemente, foi sugerido que o complexo do fármaco de acordo com a presente invenção pode ser um medicamento polimérico útil com um Índice terapêutico melhorado.

Lisboa, 29 de Agosto de 2000 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

\ 52

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Derivado de polissacárido compreendendo um polissacárido com um grupo carboxilo no qual é introduzida uma cadeia peptidica numa parte ou em todos os grupos carboxilo, compreendendo a cadeia peptidica de 1-8 amino ácidos em que os amino ácidos podem ser iguais ou diferentes, em que uma parte ou todos os grupos amino na cadeia peptidica que não estão envolvidos nas ligações com os grupos carboxilo do polissacárido ou uma parte ou todos os grupos carboxilo na cadeia peptidica podem formar uma ligação amida ácida ou uma ligação éster com um grupo carboxilo, um grupo amino ou um grupo hidroxilo de um terceiro composto tendo o grupo carboxilo, o grupo amino ou o grupo hidroxilo, e um seu sal.
2. 2. Derivado de polissacárido e um seu sal de acordo com a reivindicação 1, em que o polissacárido com um grupo carboxilo compreende um polissacárido em que o átomo de hidrogénio de uma parte ou de todos os grupo hidroxilo é substituído por um grupo carboxi Ci_4 alquilo, ou em que é introduzido um ácido polibásico em parte ou em todos os grupos hidroxilo através de uma ligação éster.
3. 3. Derivado de polissacárido e um seu sal de acordo com a reivindicação 2, em que o polissacárido em que o átomo de hidrogénio de uma parte ou todos os grupos hidroxilos é substituído por um grupo carboxi Ci_4 alquilo ou um ácido polibásico é introduzido numa parte ou em todos os grupos hidroxilo através de uma ligação éster é seleccionado do grupo que consiste em pululano, dextrano, manoglucano, manano, quitina, inulina, levano, xilano e arabinano. 1

   —sj t
4. 4. Derivado de polissacárido e um seu sal de acordo com a reivindicação 3, em que o grupo carboxi Ci_4 alquilo é um grupo carboximetilo.
5. 5. Derivado de polissacárido e um seu sal de acordo com a reivindicação 3, em que o ácido polibásico é seleccionado do grupo que consiste em ácido succinico, ácido maleico, ácido glutárico, ácido adipico, ácido citracónico, ácido cis-aconitico, ácido L-aspártico, ácido L-glutâmico, ácido malónico, ácido fumárico e ácido diglicólico.
6. 6. Derivado de polissacárido e um seu sal de acordo com qualquer das reivindicações 1-5, em que o referido polissacárido é puiulano, e a unidade de pululano tem um o 6 peso molecular desde 2x10 até 1x10 , compreendendo a unidade de repetição representada pela fórmula geral (I):

   em que 19 R —R , que podem ser iguais ou diferentes, representam respectivamente, um átomo de hidrogénio, um grupo — (CH2)m-CO—X, um grupo —C0-(CH2)n—CO—X/ ou um grupo -CO-A—CO-X, em que -CO-A-CO- representa uma unidade de ácido polibásico de um ácido polibásico do qual os grupos hidroxilo de dois grupos carboxilo foram removidos, x representa um átomo de hidrogénio ou uma cadeia peptidica compreendendo de 1 — 8 amino ácidos que podem ser iguais ou diferentes, uma parte ou todos os grupos amino da cadeia peptidica que não estão envolvidos nas ligações com os 2 V\l

   t grupos carboxilo do polissacárido ou os grupos carboxilo da cadeia peptidica podem formar uma ligação amida ácida ou uma ligação éster com um grupo carboxilo, um grupo amino ou um grupo hidroxilo de um terceiro composto tendo o grupo carboxilo, o grupo amino ou o grupo hidroxilo, m representa um número inteiro de 1-4, e n representa um número inteiro de 1-4.
7. 7. Derivado de polissacárido e um seu sal de acordo com qualquer das reivindicações 1-5, em que o referido polissacárido é quitina, e a porção de quitina tem um peso O g molecular desde 2x10 até 1x10 , compreendendo a unidade de repetição representada pela fórmula geral (II):

   1 4 em que R —R , que podem iguais ou diferentes, representam respectivamente os grupos tal como definidos na reivindicação 6.
8. 8. Derivado de polissacárido e um seu sal de acordo com qualquer das reivindicações 1-5, em que o referido polissacárido é dextrano, e a porção de dextrano tem um O g peso molecular desde 2x10 até 2x10 , compreendendo a unidade de repetição representada pela fórmula geral (III): 3 (III) r

   1 6 em que R —R , que podem ser iguais ou diferentes, representam respectivamente os grupos tal como definidos na reivindicação 6.
9. 9. Derivado de polissacárido e um seu sal de acordo com qualquer das reivindicações 1-5, em que o referido polissacárido é manoglucano, e a porção de manoglucano tem 3 6 um peso molecular desde 2x10 até 2x10 , compreendendo a unidade de repetição representada pela fórmula geral (IV):

   4 \i L—-«j 1 9 em que R —R , que podem ser iguais ou diferentes, representam respectivamente os grupos tal como definidos na reivindicação 3 e R*®—R12, que podem iguais ou diferentes, representam respectivamente os grupos tal como definido nos 1 9 grupos R —R . Derivado de polissacárido e um seu sal de acordo com a reivindicação 1, em que o polissacárido com um grupo carboxilo é seleccionado do grupo que consiste em ácido hialurónico, ácido péctico, ácido alginico, condroitina e N-acetil-des-N-heparina sulfatada, e um seu sal. Derivado de polissacárido e um seu sal de acordo com a reivindicação 1, em que o referido polissacárido é N- acetil-des-N-heparina sulfatada, e a porção de heparina tem 3 4 um peso molecular desde 2x10 até 6x10 , compreendendo a unidade de repetição representada pela fórmula geral (V):

   em que X representa uma cadeia peptidica contendo 1-8 amino ácidos, que podem ser iguais ou diferentes, e uma parte ou todos os grupos amino na cadeia peptidica que não estão envolvidos nas ligações com a N-acetil-des-N-heparina sulfatada, ou uma parte ou todos os grupos carboxilo na cadeia peptidica podem formar uma ligação amida ácida ou uma ligação éster com um grupo carboxilo, um grupo amino ou um grupo hidroxilo de um terceiro composto tendo o grupo carboxilo, o grupo amino ou o grupo hidroxilo. 5 Γ u
10. 12. Derivado de polissacárido e um seu sal de acordo com a reivindicação 1, em que o referido polissacárido é ácido hialurónico, e a unidade de ácido hialurónico tem um peso 3 4 molecular desde 2x10 até 6x10 , compreendendo a unidade de repetição representada pela fórmula geral (VI):

    (VI) em que X representa uma cadeia peptidica tal como definida na reivindicação 11.
11. 13. Derivado de polissacárido e um seu sal de acordo com qualquer das reivindicações 1-12, em que o referido péptido compreende de 2-4 amino ácidos.
12. 14. Derivado de polissacárido e um seu sal de acordo com qualquer das reivindicações 1-13, em que o terceiro composto tendo um grupo amino, um grupo carboxilo ou um grupo hidroxilo é um fármaco.
13. 15. Derivado de polissacárido e um seu sal de acordo com qualquer das reivindicações 1-14, em que o referido fármaco é um agente antitumoral. 6 16. Derivado de polissacárido e um seu sal de acordo com a reivindicação 15, em que o referido agente antitumoral é seleccionado de doxorubicina e daunorubicina. Lisboa, 29 de Agosto de 2000 0 AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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