JP5849275B2 - 抗ヒスチジンタグ抗体 - Google Patents
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抗原として、チオレドキシンのN末端にヒスチジンタグが融合したタンパク質(ヒスチジンタグ融合チオレドキシン)を作製した。すなわち、pET−32(a)ベクター(Novagen社製)を増幅した後、大腸菌(BL21株)へ導入し、その後選択薬剤であるアンピシリンを含むLB培地中に37℃で培養を行うことにより、形質転換した大腸菌を選択した。その後、最終濃度が4μMになるようにIPTGを加え、37℃で2時間培養を行うことにより、ヒスチジンタグ融合チオレドキシンの発現誘導を行った。ヒスチジンタグ融合チオレドキシンの発現は、SDS−PAGEを行った後、クマシー染色により確認した。
上記ヒスチジンタグ融合チオレドキシンを用いたC57Bl6マウスの抗原感作(6回実施)からハイブリドーマの樹立までの方法は、定法にしたがって行った。樹立したハイブリドーマがヒスチジンタグ融合チオレドキシンに対する抗体を産生しているか、スクリーニングをELISAにより行った。調べた42クローンのうち、32クローンが陽性を示し、そのうち1クローンはELISAにより高感度[OD450=1.035(基準値=0.2以上)]のヒスチジンタグ融合チオレドキシンに対する抗体を産生するハイブリドーマ(クローン名:HF16−1、アイソタイプ:IgG1κ)として単離された。
ハイブリドーマHF16−1が産生するモノクローナル抗体がチオレドキシンを認識していることをウェスタンブロッティング法で確認するため、チオレドキシン発現ベクター形質転換ヒト肝臓由来培養細胞(HepG2、Huh7)を用いて解析を行った。チオレドキシン発現ベクター形質転換ヒト肝臓由来培養細胞をタンパク質抽出バッファー(10mM Tris pH 6.8、1mM MgCl2、0.5mM EGTA、pH 8.0、0.1% NP−40、プロテアーゼインヒビター)で処理し、得られたタンパク質抽出液と上記抗体とをウエスタンブロッティング法により反応させたところ、上記抗体はチオレドキシンと結合しないという予想外の結果が得られた。このような結果を踏まえ、上記抗体がヒスチジンタグを認識する抗体であることを確認するため、実施例1に準じて作製した3種類のヒスチジンタグ融合タンパク質(EGFP[緑色蛍光タンパク質]、チオレドキシン、及びヒトスタスミン[Stathmin][以下、スタスミンと記載する])を発現させた大腸菌溶解液の段階希釈試料を調製し、SDS−PAGEでかかる試料に含まれるヒスチジンタグ融合タンパク質を分離し、PVDF膜に転写させた後、ハイブリドーマHF16−1産生モノクローナル抗体を一次抗体として、HRP標識マウスIgG抗体を二次抗体として用いてウェスタンブロッティングを行った。検出は化学発光検出(ECL plusTM)(Amersham社製)を用いて行った。その結果、ハイブリドーマHF16−1産生モノクローナル抗体は、ヒスチジンタグを認識する抗ヒスチジンタグ抗体であることがわかった。
ハイブリドーマHF16−1産生モノクローナル抗体が抗ヒスチジンタグ抗体であることがわかったので、かかる本発明の抗ヒスチジンタグ抗体の検出感度を調べた。ハイブリドーマHF16−1のRPMI1640培地(Sigma社製、R8758又は和光純薬社製、189-02025)、15%ウシ胎児血清、抗生物質:Penicillin Streptomycin 5ml[GIBCO社製15140-122])における培養上清(濃度約80μg/ml)と、その培養上清のアフィニティー精製による精製物(濃度15μg/ml)の他、対照として市販の抗ヒスチジンタグ抗体(シグマ社製、Cat.No.H1029)(濃度35μg/ml[35mg/mlの抗体を1000倍希釈して使用])を試験抗体として、実施例3記載と同様にヒスチジンタグ融合スタスミン発現大腸菌溶解タンパク質を試料としてウェスタンブロッティングを行った。結果を図1に示す。その結果、培養上清では上記試料の2000倍希釈まで、その精製物では上記試料の500倍希釈までそれぞれヒスチジンタグ融合スタスミンを検出することができた。一方、対照の市販抗体を用いた場合、100倍希釈までのヒスチジンタグ融合スタスミンの検出感度であった。この結果は、本発明の抗ヒスチジンタグ抗体は従来の市販抗体の5〜20倍以上の検出感度であることを示している。また、対照の市販抗体を用いた場合、化学発光の検出における露光時間を長くすると、目的のヒスチジンタグ融合スタスミンの分子量よりも大きいバンドが複数現れ、非特異的反応が見られるのに対し、本発明の抗ヒスチジンタグ抗体を用いた場合、露光時間を長くしても、目的のバンド以外には非特異的なバンドは検出されなかった。この結果は、本発明の抗ヒスチジンタグ抗体は、高い特異性を有していることを示している。また、対照の市販抗体としてRockland社の抗ヒスチジンタグ抗体(ウサギ)を用いてウェスタンブロッティングにより検証したところ、シグマ社製の抗体と同様の検出感度であった。
本発明の抗ヒスチジンタグ抗体が、免疫沈降法に使用できるかどうかを調べた。免疫沈降法に用いるヒスチジンタグ融合スタスミンの調製は、pET−14ベクター(Novagen社製)のヒスチジンタグ遺伝子の下流に、ヒトスタスミン遺伝子を挿入したベクターを構築した後、上記実施例1に記載の方法により行った。ヒスチジンタグ融合スタスミンと4種類の抗体(ハイブリドーマHF16−1培養上清と、その培養上清のアフィニティー精製による精製物の他、対照として市販の抗ヒスチジンタグ抗体[シグマ社製、Cat.No.H1029]及び抗ヒトアポE抗体[マウスモノクローナル抗体、Santa Cruz社製 sc-13521])を用いた免疫沈降法は、以下の方法1にしたがって行った。
1)1.5mlマイクロチューブに10mM Tris buffer 1 mlを加え、さらにヒスチジンタグ融合スタスミン0.5μgと上記4種類の抗体2μgをそれぞれ加えた後、4℃、1時間反応させた。ハイブリドーマHF16−1培養上清は、10mM Tris bufferで希釈せずに、直接ヒスチジンタグ融合スタスミン溶液へ加えた。
2)ProteinGアガロース(Santa Cruz社製、sc-2002)を20μlずつ加え、4℃、一晩インキュベートした。
3)1.5mlマイクロチューブを遠心(3,000rpm.x5min)した後、上清を除き、沈殿物に洗浄用バッファーA(25mM Tris,pH7.5,150mM NaCl,0.05% NP−40,0.02% SDS)を1ml加えた後、混和し、遠心処理(3,000rpm.x5min)を行った。
4)上清を除き、沈殿に洗浄用バッファーB(25mM Tris,pH7.5,1M NaCl,0.05% NP−40,0.02% SDS)を1ml加えた後、混和し、遠心処理(3,000rpm.x5min)を行った。
5)上清を除き、沈殿に洗浄用バッファーA(25mM Tris,pH7.5,150mM NaCl,0.05% NP−40,0.02% SDS)を1ml加えた後、混和し、遠心処理(3,000rpm.x5min)を行った。
6)5)の作業をもう1度繰り返した。
7)SDS−sample bufferを30μl加え、95℃、5分処理して得られた試料を、以下のSDS−PAGE及びウェスタンブロッティング法に用いた。
上記試料を、12.5%ポリアクリルアミドゲル(SuperSepTMエース、和光純薬社製)を用いたSDS−PAGEで展開した後、セミドライブロッティング法によりPVDF膜に転写した。試料中のタンパク質が転写されたPVDF膜を5%スキムミルク/TBSでブロッキング処理を行った(4℃、一晩)。5%ウシ血清アルブミン/0.01% Tween−20/TBS(Tris-buffered saline)で500倍に希釈した抗ヒトOp18/スタスミン抗体(ウサギポリクローナル抗体、シグマ社製、#O0138)を用いて一次抗体反応を室温で2時間行った後、0.01% Tween−20/TBSで洗浄(10分、3回)し、5%スキムミルク/TBSで10,000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG抗体(Jackson Laboratory社製)を用いて二次抗体反応を室温で1時間行った後、再度0.01% Tween−20/TBSで洗浄した(全て震盪して反応を行った)。化学発光試薬(ECL plus、GEヘルスケア社製)と化学発光用フィルム(Hyperfilm ECL、GEヘルスケア社製)を用いてヒスチジンタグ融合スタスミンの検出を行った。結果を図2に示す。その結果、培養上清では100%のヒスチジンタグ融合スタスミンを、その精製物では80%のヒスチジンタグ融合スタスミンをそれぞれ免疫沈降できた。一方、対照の市販抗体を用いた場合、免疫沈降されたスチジンタグ融合スタスミンは70%であった。なお、ヒスチジンタグを認識しない抗ヒトアポE抗体では、ヒスチジンタグ融合スタスミンは検出されなかった。この結果は、本発明の抗ヒスチジンタグ抗体は従来の市販抗体よりも高効率でヒスチジン融合タンパク質を免疫沈降できることを示している。
本発明の抗ヒスチジンタグ抗体遺伝子の同定は以下の方法にしたがって行った。すなわち、ハイブリドーマ(HF16−1)から、RNeasy Mini kit(Qiagen社製、Cat.No.74104)を用いてトータルRNAを抽出した後、GeneRacer TM Kit(Invitrogen社製 Cat. No.L1502-01[SuperScript TM III RTとTOTP TA CloningR Kit for Sequencingを含む])を用いた5’−RACE法により重鎖及び軽鎖可変領域を増幅した。なお、重鎖及び軽鎖可変領域の増幅に用いたプライマーを、以下に示す。
重鎖:ghg1 GSP(R1507-1484);5’-cctgtaggaccagagggctccaag-3’
軽鎖:Igk-C GSP(R350-328);5’-gtggtggcgtctcaggacctttg-3’
抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子は、Blend Taq(TOYOBO社製、Cat. No.BTQ-101)を用いたPCRにより単離し、pCR4−TOPO(Invitrogen社製)ベクターを用いてクローニングした。クローニングした各DNA断片の塩基配列は、BigDyeR Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems社製)を用い、DNAシークエンサーにて決定した。
重鎖可変領域遺伝子配列 :配列番号1
重鎖可変領域アミノ酸配列:配列番号2
軽鎖可変領域遺伝子配列 :配列番号3
軽鎖可変領域アミノ酸配列:配列番号4
重鎖遺伝子配列 :配列番号5
重鎖アミノ酸配列 :配列番号6
軽鎖遺伝子配列 :配列番号7
軽鎖アミノ酸配列 :配列番号8
Claims (9)
- 配列番号2に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号4に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を備えたことを特徴とする抗ヒスチジンタグ抗体。
- 配列番号6に示されるアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号8に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を備えたことを特徴とする抗ヒスチジンタグ抗体。
- 請求項1又は2記載の抗ヒスチジンタグ抗体をコードすることを特徴とする抗ヒスチジンタグ抗体遺伝子。
- 配列番号1に示される塩基配列を有する重鎖可変領域遺伝子、及び配列番号3に示される塩基配列を有する軽鎖可変領域遺伝子を備えたことを特徴とする請求項3記載の抗ヒスチジンタグ抗体遺伝子。
- 配列番号5に示される塩基配列を有する重鎖遺伝子、及び配列番号7に示される塩基配列を有する軽鎖遺伝子を備えたことを特徴とする請求項3記載の抗ヒスチジンタグ抗体遺伝子。
- 請求項1又は2記載の抗ヒスチジンタグ抗体を用いることを特徴とするヒスチジンタグ融合ポリペプチドの検出方法。
- 請求項1又は2記載の抗ヒスチジンタグ抗体を含むことを特徴とするヒスチジンタグ融合ポリペプチドの検出キット。
- 請求項1又は2記載の抗ヒスチジンタグ抗体を用いることを特徴とするヒスチジンタグ融合ポリペプチドの精製方法。
- 請求項1又は2記載の抗ヒスチジンタグ抗体を含むことを特徴とするヒスチジンタグ融合ポリペプチドの精製キット。
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