JPWO2011096302A1 - 薬剤耐性インフルエンザウイルス特異的抗体及びその用途 - Google Patents
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Abstract
迅速且つ簡便に薬剤耐性インフルエンザウイルスを検出するための手段を提供することを課題とする。アミノ酸配列EKGKVTKSIELNAPNFYYEE（配列番号１）からなるペプチドに対して特異的結合性を示す、薬剤耐性インフルエンザウイルス特異的抗体が提供される。また、当該抗体を用い、抗原抗体反応を利用して薬剤耐性インフルエンザウイルスを検出する検出法が提供される。
Description
本発明は薬剤耐性インフルエンザウイルスを特異的に認識する抗体及びその用途に関する。本出願は、２０１０年２月２日に出願された日本国特許出願第２０１０−０２０８１１号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
インフルエンザは毎年のように流行を繰り返す。また、数十年毎に世界的大流行（パンディック）を引き起こす。インフルエンザに対して様々な予防策が講じられているが、人類は依然としてインフルエンザの脅威に曝されている。一方、科学技術の進歩によってインフルエンザウイルスの特性や構造などが明らかになり、治療薬の開発が進められている。これまでにオセルタミビル（商品名タミフル、ロッシュ社）やザナビル（商品名リレンザ、グラクソ・スミスクライン社）などの分子標的薬が開発された。
インフルエンザウイルスの表層にはヘマグルチニン（HA）及びノイラミニダーゼ（NA）が存在する。出芽したウイルス表層のNAが周辺の細胞表面にあるシアル酸基を切断することにより、インフルエンザウイルスは効率よく細胞表層から遊離し次の細胞へと感染を広げる。オセルタミビルやザナビルはこの機序を抑制する。
オセルタミビルは第一選択薬として使用されることが多い。その一方で耐性ウイルスの出現が問題視されており、その使用に際しては耐性ウイルスでないことを見極めることが重要である。治療薬の選択を誤れば重症化することはもとより、感染の拡大にも繋がる。最近になって、NAの274番アミノ酸残基のヒスチジンからチロシンへの変異がインフルエンザウイルスのオセルタミビル耐性を引き起こすことが報告された（非特許文献１）。
Patrick J. Collins1 et al. Crystal structures of oseltamivir-resistant influenza virus neuraminidase mutants. Nature 453, 1258-1261, 2008.
重症化の予防や感染拡大を阻止するためには、インフルエンザ治療薬の選択は極めて重要である。特にオセルタミビル耐性であるか否かを迅速に判定することが切望される。現在の検査法では、耐性が疑われる症例について検体よりインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子配列を増幅し、その塩基配列の解析から耐性ウイルスであるか否かを判定している。このような遺伝子検査には時間がかかるため、検査結果を実際の治療に生かすことはできず、処方した治療薬が無効であった症例の理由付けに利用されているのが現状である。そこで本発明は、迅速且つ簡便に薬剤耐性インフルエンザウイルスを検出するための手段を提供することを課題とする。
本発明者らはオセルタミビル耐性に関与することが示唆されたアミノ酸変異に注目し、過去に報告された薬剤耐性インフルエンザウイルス数株についてノイラミニダーゼのアミノ酸配列を比較した。その結果に基づき、近年の耐性ウイルスにおいて保存性が高いアミノ酸配列を特定した。そして、当該アミノ酸配列を有するペプチドを抗原として免疫学的手法により抗体の取得を試みた。取得に成功した抗体の特性を検証した結果、オセルタミビル耐性に関与する変異箇所を特異的に認識することが示された。即ち、薬剤耐性インフルエンザウイルスの特異的検出に有用な抗体であることが判明した。以下に示す本発明は以上の成果に基づくものである。
［１］アミノ酸配列EKGKVTKSIELNAPNFYYEE（配列番号１）からなるペプチドに対して特異的結合性を示す、薬剤耐性インフルエンザウイルス特異的抗体。
［２］薬剤が、配列番号３のアミノ酸配列における１１８番アミノ酸残基、１５１番アミノ酸残基、２５２番アミノ酸残基、２７４番アミノ酸残基、２７６番アミノ酸残基、２９２番アミノ酸残基、２９４番アミノ酸残基、３４７番アミノ酸残基、３７１番アミノ酸残基によって形成される、ノイラミニダーゼのポケットを標的とした抗インフルエンザ薬であって、前記２７４番アミノ酸残基の変異によってそれへの耐性が現れることになる抗インフルエンザ薬である、［１］に記載の抗体。
［３］薬剤がオセルタミビルである、［１］に記載の抗体。
［４］配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識するが、配列番号４のアミノ酸からなるポリペプチドを認識しない、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の抗体。
［５］IgYクラスの抗体である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の抗体。
［６］ポリクローナル抗体である、［５］に記載の抗体。
［７］IgGクラスの抗体である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の抗体。
［８］マウスモノクローナル抗体である、［７］に記載の抗体。
［９］［１］〜［８］のいずれか一項に記載の抗体を用い、抗原抗体反応により検出することを特徴とする、薬剤耐性インフルエンザウイルスの検出法。
［１０］以下のステップ（１）及び（２）を含むことを特徴とする、［９］に記載の検出法：
（１）検体と、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の抗体とを接触させるステップ；及び
（２）生成する抗原抗体複合体を検出するステップ。
［１１］［１］〜［８］のいずれか一項に記載の抗体からなる、薬剤耐性インフルエンザウイルス検出用試薬。
［１２］［１１］に記載の試薬を含む、薬剤耐性インフルエンザウイルス検出用キット。
［１３］［１］〜［８］のいずれか一項に記載の抗体を検出用抗体又は捕捉用抗体に用いた薬剤耐性インフルエンザウイルス検出用テストストリップ。
［１］アミノ酸配列EKGKVTKSIELNAPNFYYEE（配列番号１）からなるペプチドに対して特異的結合性を示す、薬剤耐性インフルエンザウイルス特異的抗体。
［２］薬剤が、配列番号３のアミノ酸配列における１１８番アミノ酸残基、１５１番アミノ酸残基、２５２番アミノ酸残基、２７４番アミノ酸残基、２７６番アミノ酸残基、２９２番アミノ酸残基、２９４番アミノ酸残基、３４７番アミノ酸残基、３７１番アミノ酸残基によって形成される、ノイラミニダーゼのポケットを標的とした抗インフルエンザ薬であって、前記２７４番アミノ酸残基の変異によってそれへの耐性が現れることになる抗インフルエンザ薬である、［１］に記載の抗体。
［３］薬剤がオセルタミビルである、［１］に記載の抗体。
［４］配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識するが、配列番号４のアミノ酸からなるポリペプチドを認識しない、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の抗体。
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［１０］以下のステップ（１）及び（２）を含むことを特徴とする、［９］に記載の検出法：
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［１１］［１］〜［８］のいずれか一項に記載の抗体からなる、薬剤耐性インフルエンザウイルス検出用試薬。
［１２］［１１］に記載の試薬を含む、薬剤耐性インフルエンザウイルス検出用キット。
［１３］［１］〜［８］のいずれか一項に記載の抗体を検出用抗体又は捕捉用抗体に用いた薬剤耐性インフルエンザウイルス検出用テストストリップ。
１．薬剤耐性インフルエンザウイルス特異的抗体
本発明の第１の局面は、特定の薬剤に耐性を示すインフルエンザウイルスを特異的に認識する抗体に関する。本発明の抗体は、例えば、薬剤耐性インフルエンザウイルス特異的な検出を可能にする点において有用である。本発明において「特定の薬剤」とは、配列番号３のアミノ酸配列の１１８番アミノ酸残基（Arg118）、１５１番アミノ酸残基（Asp151）、２５２番アミノ酸残基（Tyr252）、２７４番アミノ酸残基（His274）、２７６番アミノ酸残基（Glu276）、２９２番アミノ酸残基（Arg292）、２９４番アミノ酸残基（Asn294）、３４７番アミノ酸残基（Tyr347）、３７１番アミノ酸残基（Arg371）によって形成される、ノイラミニダーゼのポケットを標的とした抗インフルエンザ薬であって、２７４番アミノ酸残基の変異（アミノ酸置換）によってそれへ耐性が現れることになる抗インフルエンザ薬である。当該薬剤の典型例はオセルタミビルである。本明細書では、説明の便宜上、「特定の薬剤」が、Patrick J. Collinsらの報告（Nature Vol. 453, p1258-1261 (2008)）で引用されたインフルエンザウイルス株（Influenza A virus (A/Tokyo/3/67(H2N2)）のノイラミニダーゼアミノ酸配列（配列番号３）を基準として定義されるが、他のインフルエンザウイルス株のアミノ酸配列を用いて定義することも可能である。基準とするウイルス株によって、ポケットを形成するアミノ酸残基や耐性の獲得に重要なアミノ酸残基の位置は変動し得る。しかしながら、本明細書において基準としたウイルス株における各アミノ酸残基に相当するアミノ酸残基は、アミノ酸配列のアライメント比較によって容易に特定することができる。Patrick J. Collinsらの報告に係る耐性インフルエンザウイルスでは、２７４番アミノ酸がヒスチジンからチロシンに置換されている（His274Tyr）。尚、本明細書では、特に言及しない限り、「薬剤耐性インフルエンザウイルス」とは、上記の通り定義された「特定の薬剤」に対して耐性を示すインフルエンザウイルスのことを指す。
本発明の第１の局面は、特定の薬剤に耐性を示すインフルエンザウイルスを特異的に認識する抗体に関する。本発明の抗体は、例えば、薬剤耐性インフルエンザウイルス特異的な検出を可能にする点において有用である。本発明において「特定の薬剤」とは、配列番号３のアミノ酸配列の１１８番アミノ酸残基（Arg118）、１５１番アミノ酸残基（Asp151）、２５２番アミノ酸残基（Tyr252）、２７４番アミノ酸残基（His274）、２７６番アミノ酸残基（Glu276）、２９２番アミノ酸残基（Arg292）、２９４番アミノ酸残基（Asn294）、３４７番アミノ酸残基（Tyr347）、３７１番アミノ酸残基（Arg371）によって形成される、ノイラミニダーゼのポケットを標的とした抗インフルエンザ薬であって、２７４番アミノ酸残基の変異（アミノ酸置換）によってそれへ耐性が現れることになる抗インフルエンザ薬である。当該薬剤の典型例はオセルタミビルである。本明細書では、説明の便宜上、「特定の薬剤」が、Patrick J. Collinsらの報告（Nature Vol. 453, p1258-1261 (2008)）で引用されたインフルエンザウイルス株（Influenza A virus (A/Tokyo/3/67(H2N2)）のノイラミニダーゼアミノ酸配列（配列番号３）を基準として定義されるが、他のインフルエンザウイルス株のアミノ酸配列を用いて定義することも可能である。基準とするウイルス株によって、ポケットを形成するアミノ酸残基や耐性の獲得に重要なアミノ酸残基の位置は変動し得る。しかしながら、本明細書において基準としたウイルス株における各アミノ酸残基に相当するアミノ酸残基は、アミノ酸配列のアライメント比較によって容易に特定することができる。Patrick J. Collinsらの報告に係る耐性インフルエンザウイルスでは、２７４番アミノ酸がヒスチジンからチロシンに置換されている（His274Tyr）。尚、本明細書では、特に言及しない限り、「薬剤耐性インフルエンザウイルス」とは、上記の通り定義された「特定の薬剤」に対して耐性を示すインフルエンザウイルスのことを指す。
本発明の抗体は、インフルエンザウイルス表層に存在するノイラミニダーゼを標的としたものであり、耐性の獲得に関与する特定の部位を認識し、結合する。ここでの「特定の部位」とは、オセルタミビル耐性との関連が報告された変異箇所（アミノ酸置換）及びその近傍からなる部位である。当該部位の具体的なアミノ酸配列はEKGKVTKSIELNAPNFYYEE（配列番号１）である。従って、本発明の抗体はこのアミノ酸配列からなるペプチドに対して特異的結合性を有する。
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体（数種〜数十種の抗体の混合物）、及びモノクローナル抗体のいずれでもよい。抗体のクラスも特に限定されない。抗体のクラスの例を示せばIgM、IgG、IgYである。好ましい一態様では本発明の抗体はIgYである。IgYのポリクローナル抗体又はオリゴクローナル抗体は、免疫後のニワトリから得た抗血清や卵黄から調製することができる。好ましい他の一態様では本発明の抗体はマウスモノクローナル抗体（IgGクラス）である。
本発明の抗体の調製法は特に限定されない。例えば、免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などを利用して本発明の抗体を調製することができる。以下、本発明の抗体の調製法の一例としてポリクローナルIgYの調製法を説明する。
免疫学的手法によるポリクローナル抗体の調製は常法で行えばよい（例えば、Losch, U. The chicken egg, an antibody source. J. Vet. Med. B 33:609-619 (1986).を参照）。まず、抗原（EKGKVTKSIELNAPNFYYEE（配列番号１））を調製し、これを用いてニワトリに免疫を施す。抗原は例えば化学合成によって調製することができる。組換え抗原を使用することにしてもよい。
免疫惹起作用を増強するために、キャリアタンパク質を結合させた抗原を用いるとよい。キャリアタンパク質としてはKLM（Keyhole Light Hemocyanin）、BSA（Bovine Serum Albumin）、OVA（Ovalbumin）などが使用される。キャリアタンパク質の結合にはカルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、ジアゾ縮合法、MBS（マレイミドベンゾイルオキシコハク酸イミド）法などを使用できる。一方、対象タンパク質（又はその一部）を、GST、βガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク、又はヒスチジン（His）タグ等との融合タンパク質として発現させた抗原を用いることもできる。このような融合タンパク質は、汎用的な方法により簡便に精製することができる。
必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で採血し、遠心処理などによって血清を得る。得られた抗血清を硫安沈澱及び／又はアフィニティー精製し、ポリクローナル抗体とする。また、卵黄からも同様にポリクローナル抗体を調製することができる。尚、卵黄からIgYを精製するためのキットが市販されており、これを利用することにしてもよい。
モノクローナルIgYの調製も常法で行うことができる（例えばNishinaka, S. et al. Int Arch Allergy Appl Immunol, 89, 416(1989); Nishinaka, S. et al. J Immunol Methods, 139, 217(1991); Nishinaka, S. et al. J Vet Med Sci, 58, 1053(1996）を参照）、モノクローナルIgYの調製法の一例を示す。まず、上記と同様の手順で免疫操作を実施する。必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で、免疫したニワトリから抗体産生細胞を摘出する。次に、得られた抗体産生細胞を用い、細胞融合法によってハイブリドーマを得る。続いて、このハイブリドーマをモノクローナル化した後、抗原に対して高い特異性を有する抗体を産生するクローンを選択する。選択されたクローンの培養液を精製することによって目的の抗体が得られる。一方、ハイブリドーマを所望数以上に増殖させた後、これを動物（例えばマウス）の腹腔内に移植し、腹水内で増殖させて腹水を精製することにより目的の抗体を取得することもできる。上記培養液の精製又は腹水の精製にはプロテインG、プロテインA等を用いたアフィニティークロマトグラフィーが好適に用いられる。また、抗原を固相化したアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。更には、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、硫安分画、及び遠心分離等の方法を用いることもできる。これらの方法は単独ないし任意に組み合わされて用いられる。
抗原への特異的結合性を保持することを条件として、得られた抗体に種々の改変を施すことができる。このような改変抗体も本発明の一つである。
低分子化合物、タンパク質、標識物質などを融合又は結合させた融合抗体又は標識化抗体を構成することができる。このような修飾抗体も本発明の一つである。標識物質としては例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、オレゴングリーン等の蛍光色素、西洋ワサビペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の酵素、ルミノール、アクリジン色素等の化学又は生物発光化合物、32P、131I、 125I等の放射性同位体、及びビオチンを挙げることができる。
後述の実施例に示す通り、本発明者らは、抗原ペプチド（配列番号１）を用いた免疫学的手法によって、薬剤耐性インフルエンザウイルスに対して特異的結合性を有するポリクローナルIgYを取得することに成功した。当該ポリクローナルIgYは、インフルエンザウイルス・プエルトリコ株（インフルエンザAウイルス、A/Puerto Rico/8/1934(Cambridge) (H1N1)）のノイラミニダーゼに対して薬剤耐性化するようにアミノ酸置換を施したポリペプチド（配列番号５）を認識する一方で当該ウイルス株の野生型（感受性型）ノイラミニダーゼ（配列番号４）及び市販の感受性型ノイラミニダーゼのいずれも認識せず、特異性に優れる。また、薬剤感受性インフルエンザウイルスに対しても結合性を示さない（後述の実施例を参照）。尚、本発明の抗体に関して使用する場合、「認識する」とは「特異的に結合する」と置換可能な用語であり、いわゆる抗原抗体反応が生ずることを意味する。
本発明者らは、薬剤耐性型ノイラミニダーゼに対して優れた特異性を示す、マウスモノクローナル抗体（IgGクラス）の取得にも成功した。（図４を参照）。
２．薬剤耐性インフルエンザウイルスの検出法
本発明の第２の局面は薬剤耐性インフルエンザウイルスの検出法に関する。本発明の検出法では、薬剤耐性因子であるノイラミニダーゼタンパク質の原因変異箇所に対する抗体によって薬剤耐性インフルエンザウイルスを検出する。この特徴により、インフルエンザ患者の咽頭ぬぐい液などの臨床検体から耐性インフルエンザウイルスを直接検出することも可能となる。本発明の検出法によれば薬剤耐性インフルエンザウイルスを特異的に検出できることから、インフルエンザの治療にあたって適切な薬剤の選択が可能になる。即ち、本発明の検出法による判定の結果、検体中のインフルエンザウイルスが薬剤耐性であることが明らかになれば、耐性が獲得された薬剤を処方することは適切でないと判断できる。このような判断に基づき薬剤の処方を行えば、より適切な治療が可能となり、インフルエンザウイルスによる重症化を防ぐことができる。このように本発明の検出法は、抗インフルエンザ薬の適切な選択を可能とする、有益な情報を与える。
本発明の第２の局面は薬剤耐性インフルエンザウイルスの検出法に関する。本発明の検出法では、薬剤耐性因子であるノイラミニダーゼタンパク質の原因変異箇所に対する抗体によって薬剤耐性インフルエンザウイルスを検出する。この特徴により、インフルエンザ患者の咽頭ぬぐい液などの臨床検体から耐性インフルエンザウイルスを直接検出することも可能となる。本発明の検出法によれば薬剤耐性インフルエンザウイルスを特異的に検出できることから、インフルエンザの治療にあたって適切な薬剤の選択が可能になる。即ち、本発明の検出法による判定の結果、検体中のインフルエンザウイルスが薬剤耐性であることが明らかになれば、耐性が獲得された薬剤を処方することは適切でないと判断できる。このような判断に基づき薬剤の処方を行えば、より適切な治療が可能となり、インフルエンザウイルスによる重症化を防ぐことができる。このように本発明の検出法は、抗インフルエンザ薬の適切な選択を可能とする、有益な情報を与える。
本発明の検出法では上記本発明の抗体を用い、当該抗体と薬剤耐性インフルエンザウイルスとの間の抗原抗体反応を利用する。採用する測定法によって具体的な操作手順は異なるが、本発明の測定法では大別して以下の２つのステップ（１）及び（２）が実施される。
（１）検体と本発明の抗体とを接触させるステップ
（２）生成する抗原抗体複合体を検出するステップ
（１）検体と本発明の抗体とを接触させるステップ
（２）生成する抗原抗体複合体を検出するステップ
ステップ（１）における検体は特に限定されない。検体の例として皮膚、咽頭、鼻腔等を擦過して得た試料、血液、血漿、血清、唾液、拭き取り試料、嘔吐物、糞便等を挙げることができる。これらの検体は必要に応じて前処理に供される。前処理として例えば検体の懸濁、フィルターろ過や遠心による夾雑物の除去、溶媒による希釈、変性処理などを行うことができる。
検体と本発明の抗体との接触は、検体に対して本発明の抗体を添加すること、或いは本発明の抗体が含浸又は固相化された部材に対して検体を添加又は展開させることなど（例えば、後述のイムノクロマトグラフィーを採用した場合）によって行われる。接触の具体的な態様や接触の条件などは、採用する測定法に応じて適宜設定できる。
ステップ（２）では、ステップ（１）によって生成する抗原抗体複合体を検出する。検出操作は測定法毎に異なり、例えば、FIA法を採用した場合には蛍光をシグナルとして抗原抗体複合体を検出する。後述の通り、テストストラップを用いたイムノクロマトグラフィーであれば判定部の呈色などによって検出できる。
本発明の検出法では、抗原抗体反応を利用した様々な測定法を採用することができる。測定法として、蛍光免疫測定法（FIA法）、酵素免疫測定法（EIA法）、イムノクロマトグラフィー、放射免疫測定法（RIA法）、ウエスタンブロット法を例示することができる。好ましい測定法としては、FIA法、EIA法及びイムノクロマトグラフィーを挙げることができる。これらの方法によれば高感度、迅速且つ簡便に検出可能である。FIA法では蛍光標識したIgYを用い、蛍光をシグナルとして抗原抗体複合体（免疫複合体）を検出する。一方、EIA法では酵素標識したIgYを用い、酵素反応に基づく発色ないし発光をシグナルとして免疫複合体を検出する。EIA法の中でもサンドイッチELISA法が特に好ましい。非競合法に限らず、競合法（検体とともに抗原を添加して競合させる方法）を用いることにしてもよい。
イムノクロマトグラフィーは簡便性の点で特に優れた手法といえる。イムノクロマトグラフィーを利用した検出には通常、テストストリップが用いられる。図３に示すように、典型的なテストストリップの構成では膜担体１の一端上に検出用抗体（標識抗体）が含浸した抗体含浸部材２を挟んで検体添加部（サンプルパッド）３が形成され、他端上には検体吸収部材（吸収パッド）４が形成される。検体添加部３と検体吸収部４の間には、捕捉用抗体を固相化した判定部（テストライン）５が設けられる。符号６は、検出用抗体の展開を確認するために設けられるコントロールラインであり、そこには検出用抗体を認識する抗体が固相化されている。
検出用抗体及び捕捉用抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。好ましくは少なくとも片方はモノクローナル抗体とする。検出用抗体は標識化されている。標識物質には呈色物質、酵素、放射線同位体などが用いられる。中でも、検出結果を肉眼で観察でき、迅速且つ簡便な判定が可能となることから、呈色物質を採用することが好ましい。呈色物質の例は金属コロイド（金コロイド、白金コロイド等）、顔料などで着色した合成ラテックス、天然ラテックスである。尚、本発明ではテストストリップの検出用抗体又は捕捉用抗体として上記本発明の抗体を用いる。
以上の構成のテストストリップを用いた場合、検体を検体添加部に添加すると、抗体含浸部材４内で検出用抗体との接触が生ずる。検体内に検出対象（即ち薬剤耐性インフルエンザウイルス）が存在していると、検出対象と検出用抗体の複合体が形成される。当該複合体は毛細管現象により展開し、判定部５において捕捉用抗体に捕捉される。その結果、検出用抗体の標識に呈色物質を用いておれば判定部５が発色する。一方、検体中の検出対象の有無にかかわらず、毛細管現象で移動した検出用抗体はコントロールライン６上で捕捉され、その結果、コントロールライン６が発色する。検体中に検出対象が存在しない場合には、コントロールライン６のみが発色することになる。このように判定部５とコントロールライン６の発色を調べることによって、検体中の検出対象の有無を判定できる。
３．薬剤耐性インフルエンザウイルス検出用試薬及びキット
本発明の第３の局面は本発明の検出法に用いられる試薬及びキットに関する。本発明の試薬の一態様は本発明の抗体である。本発明の試薬はその用途に適するように必要に応じて標識化されている。抗体の標識化に使用可能な標識物質の例は上記の通りである。本発明の試薬が固相化されていてもよい。固相化に用いる不溶性支持体は特に限定されない。例えばポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂等の樹脂や、ガラス等の水に不溶性の物質からなる不溶性支持体を用いることができる。不溶性支持体への抗体の担持は物理吸着又は化学吸着によって行うことができる。本発明の試薬の更なる一態様は、本発明の抗体を検出用抗体又は捕捉用抗体に用いたテストストラップである。
本発明の第３の局面は本発明の検出法に用いられる試薬及びキットに関する。本発明の試薬の一態様は本発明の抗体である。本発明の試薬はその用途に適するように必要に応じて標識化されている。抗体の標識化に使用可能な標識物質の例は上記の通りである。本発明の試薬が固相化されていてもよい。固相化に用いる不溶性支持体は特に限定されない。例えばポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂等の樹脂や、ガラス等の水に不溶性の物質からなる不溶性支持体を用いることができる。不溶性支持体への抗体の担持は物理吸着又は化学吸着によって行うことができる。本発明の試薬の更なる一態様は、本発明の抗体を検出用抗体又は捕捉用抗体に用いたテストストラップである。
本発明のキットは主要構成要素として本発明の試薬を含む。検出法を実施する際に使用するその他の試薬（展開用溶媒、緩衝液、ブロッキング用試薬、酵素の基質、発色試薬など）及び／又は装置ないし器具（容器、反応装置、蛍光リーダーなど）をキットに含めてもよい。また、抗原ペプチド（例えば、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド）をキットに含めてもよい。尚、通常、本発明のキットには取り扱い説明書が添付される。
４．薬剤耐性インフルエンザウイルス特異的抗体の他の用途
本発明の抗体の用途は上記検出法等に限られるものではない。例えば、薬剤耐性インフルエンザウイルス捕捉用の材料として、マスク（医療用マスク、家庭用マスクなど）や空気清浄機用フィルター、食品（飴、ガムなど）などに本発明の抗体を適用することも可能である。
本発明の抗体の用途は上記検出法等に限られるものではない。例えば、薬剤耐性インフルエンザウイルス捕捉用の材料として、マスク（医療用マスク、家庭用マスクなど）や空気清浄機用フィルター、食品（飴、ガムなど）などに本発明の抗体を適用することも可能である。
１．抗原ペプチドの設計
Patrick J. Collinsらの報告（Nature Vol. 453, p1258-1261 (2008)）より、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスにおけるノイラミニダーゼの２７４番目のヒスチジンからチロシンへの変異が薬剤との結合に重要であることが示唆された。そこで、これまで報告のある耐性インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼのアミノ酸配列を比較し、変異部位および周辺の保存性の高い配列を検索した（図１）。同時に実験株としてよく用いられるインフルエンザウイルス３種についてもアミノ酸配列を比較した。その結果から、EKGKVTKSIELNAPNFYYEE（配列番号１）の配列が近年の耐性ウイルスにおいて保存性が高いことが示唆された。
Patrick J. Collinsらの報告（Nature Vol. 453, p1258-1261 (2008)）より、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルスにおけるノイラミニダーゼの２７４番目のヒスチジンからチロシンへの変異が薬剤との結合に重要であることが示唆された。そこで、これまで報告のある耐性インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼのアミノ酸配列を比較し、変異部位および周辺の保存性の高い配列を検索した（図１）。同時に実験株としてよく用いられるインフルエンザウイルス３種についてもアミノ酸配列を比較した。その結果から、EKGKVTKSIELNAPNFYYEE（配列番号１）の配列が近年の耐性ウイルスにおいて保存性が高いことが示唆された。
２．抗体の調製
保存性が高いことが示唆された上記部位のペプチドにシステイン残基を加えたアミノ酸配列CEKGKVTKSIELNAPNFYYEE（配列番号２）からなるペプチドを合成した。付加したシステイン残基を利用してKLH（キャリアプロテイン）を結合し、抗原とした。当該抗原をアジュバントと懸濁し、ニワトリに免疫を行った。数回の免疫後、採血し、抗体価を調べた。十分な抗体価が得られていることを確認した後、再び採血し、血清を分離した（抗血清の取得）。尚、上述の手法によって、産卵した卵からも抗体が得られている。
保存性が高いことが示唆された上記部位のペプチドにシステイン残基を加えたアミノ酸配列CEKGKVTKSIELNAPNFYYEE（配列番号２）からなるペプチドを合成した。付加したシステイン残基を利用してKLH（キャリアプロテイン）を結合し、抗原とした。当該抗原をアジュバントと懸濁し、ニワトリに免疫を行った。数回の免疫後、採血し、抗体価を調べた。十分な抗体価が得られていることを確認した後、再び採血し、血清を分離した（抗血清の取得）。尚、上述の手法によって、産卵した卵からも抗体が得られている。
３．抗血清を用いたウエスタンブロット解析
得られた抗血清（ポリクローナル抗体）を用いたウエスタンブロッティングによりオセルタミビル耐性型のノイラミニダーゼ（R-NA）の検出を試みた。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ゲル内のタンパク質をPVDF膜へ転写し、抗血清を一次抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ヤギ由来抗ニワトリ抗体を二次抗体として用いて検出した。検出結果を図２に示す。抗原の標品（rNA標品）としては市販のインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（組換えノイラミニダーゼ、Spodoptera frugiperda Sf 21 (バキュロウイルス)由来、A/Brevig Mission/1/1918(H1N1)、'Spanish' インフルエンザウイルス遺伝子を使用）を用いた。感受性型組換えノイラミニダーゼ(rS-NA：ノイラミニダーゼのアミノ酸配列として配列番号４の配列を含む)はインフルエンザAウイルス(A/Puerto Rico/8/1934(Cambridge) (H1N1))のRNAを逆転写した鋳型DNAより増幅した全長遺伝子を発現ベクターpColdTFに組み込み、大腸菌において発現させニッケルカラムにより精製した。このpColdTFベクターは、目的タンパク質を可溶化しやすくするために大腸菌シャペロンの一種であるトリガーファクター（Trigger Factor；TF、分子量48 kDa）を可溶化タグとする融合型のコールドショック発現ベクターであるため、発現産物の分子量は標品より大きくなっている。耐性型組換えノイラミニダーゼ(rR-NA：ノイラミニダーゼのアミノ酸配列として配列番号５の配列を含む)は次の通り調製した。まず、インフルエンザAウイルス(A/Puerto Rico/8/1934(Cambridge) (H1N1))より得られた鋳型DNAを基にして、点変異導入プライマー（tgcacccaatttttattatgaggaatg：配列番号６）を用いてノイラミニダーゼの薬剤標的部位に関連するヒスチジンをチロシンに、さらにその直前のセリンをフェニルアラニンに変異させた変異型ノイラミニダーゼをコードする遺伝子（変異型ノイラミニダーゼ遺伝子）を作製した。この変異型ノイラミニダーゼ遺伝子を発現ベクターpColdTFに組み込み、大腸菌でタンパク質を発現させた。発現産物をニッケルカラムにより精製し、耐性型組換えノイラミニダーゼ（rR-NA）とした。尚、抗血清が薬剤感受性ウイルス（図２左、右側の二つのレーン）に対して反応性を示すか否かも確認した。
得られた抗血清（ポリクローナル抗体）を用いたウエスタンブロッティングによりオセルタミビル耐性型のノイラミニダーゼ（R-NA）の検出を試みた。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ゲル内のタンパク質をPVDF膜へ転写し、抗血清を一次抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ヤギ由来抗ニワトリ抗体を二次抗体として用いて検出した。検出結果を図２に示す。抗原の標品（rNA標品）としては市販のインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（組換えノイラミニダーゼ、Spodoptera frugiperda Sf 21 (バキュロウイルス)由来、A/Brevig Mission/1/1918(H1N1)、'Spanish' インフルエンザウイルス遺伝子を使用）を用いた。感受性型組換えノイラミニダーゼ(rS-NA：ノイラミニダーゼのアミノ酸配列として配列番号４の配列を含む)はインフルエンザAウイルス(A/Puerto Rico/8/1934(Cambridge) (H1N1))のRNAを逆転写した鋳型DNAより増幅した全長遺伝子を発現ベクターpColdTFに組み込み、大腸菌において発現させニッケルカラムにより精製した。このpColdTFベクターは、目的タンパク質を可溶化しやすくするために大腸菌シャペロンの一種であるトリガーファクター（Trigger Factor；TF、分子量48 kDa）を可溶化タグとする融合型のコールドショック発現ベクターであるため、発現産物の分子量は標品より大きくなっている。耐性型組換えノイラミニダーゼ(rR-NA：ノイラミニダーゼのアミノ酸配列として配列番号５の配列を含む)は次の通り調製した。まず、インフルエンザAウイルス(A/Puerto Rico/8/1934(Cambridge) (H1N1))より得られた鋳型DNAを基にして、点変異導入プライマー（tgcacccaatttttattatgaggaatg：配列番号６）を用いてノイラミニダーゼの薬剤標的部位に関連するヒスチジンをチロシンに、さらにその直前のセリンをフェニルアラニンに変異させた変異型ノイラミニダーゼをコードする遺伝子（変異型ノイラミニダーゼ遺伝子）を作製した。この変異型ノイラミニダーゼ遺伝子を発現ベクターpColdTFに組み込み、大腸菌でタンパク質を発現させた。発現産物をニッケルカラムにより精製し、耐性型組換えノイラミニダーゼ（rR-NA）とした。尚、抗血清が薬剤感受性ウイルス（図２左、右側の二つのレーン）に対して反応性を示すか否かも確認した。
図２左より、得られた抗体が感受性型ノイラミニダーゼとは反応せず、耐性型ノイラミニダーゼに対してのみ反応していることが分かる。比較対象として、市販の抗ノイラミニダーゼ抗体(ノイラミニダーゼ中央部分に存在する１６アミノ酸残基のペプチド（H5N1）を認識する抗体、Cat.No. 54530, AnaSpec社)を用いて検出すると（図２中央）、標品、感受性型及び耐性型の全てが検出された。これらの結果より、得られた抗体（抗血清）が耐性箇所を認識していることが示された。
４．マウスモノクローナル抗体での検出
上記２．と同様にKLH-CEKGKVTKSIELNAPNFYYEE（配列番号２）をマウスに免疫し、細胞融合を経てマウスのモノクローナル抗体産生細胞を樹立した。その培養上清中に耐性型組換えノイラミニダーゼrR-NA (pColdTF-NA(H274Y)に対する反応性の高い抗体が得られた。感受性型組換えノイラミニダーゼrS-NA (pColdTF-NA(野生型)）に対する反応性は低く変異箇所を認識している抗体と考えられる（図４）。
上記２．と同様にKLH-CEKGKVTKSIELNAPNFYYEE（配列番号２）をマウスに免疫し、細胞融合を経てマウスのモノクローナル抗体産生細胞を樹立した。その培養上清中に耐性型組換えノイラミニダーゼrR-NA (pColdTF-NA(H274Y)に対する反応性の高い抗体が得られた。感受性型組換えノイラミニダーゼrS-NA (pColdTF-NA(野生型)）に対する反応性は低く変異箇所を認識している抗体と考えられる（図４）。
本発明の抗体は薬剤耐性インフルエンザウイルスの検出に利用される。本発明の抗体を用いた検出法によれば迅速且つ簡便に薬剤耐性インフルエンザウイルスを検出できる。本発明の抗体を薬剤耐性インフルエンザウイルス捕捉用の材料として利用することもできる。
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
１ 膜担体
２ 抗体含浸部材
３ 検体添加部
４ 検体吸収部
５ 判定部
６ コントロールライン
２ 抗体含浸部材
３ 検体添加部
４ 検体吸収部
５ 判定部
６ コントロールライン
配列番号６：人工配列の説明：プライマー
Claims (13)
- アミノ酸配列EKGKVTKSIELNAPNFYYEE（配列番号１）からなるペプチドに対して特異的結合性を示す、薬剤耐性インフルエンザウイルス特異的抗体。
- 薬剤が、配列番号３のアミノ酸配列における１１８番アミノ酸残基、１５１番アミノ酸残基、２５２番アミノ酸残基、２７４番アミノ酸残基、２７６番アミノ酸残基、２９２番アミノ酸残基、２９４番アミノ酸残基、３４７番アミノ酸残基、３７１番アミノ酸残基によって形成される、ノイラミニダーゼのポケットを標的とした抗インフルエンザ薬であって、前記２７４番アミノ酸残基の変異によってそれへの耐性が現れることになる抗インフルエンザ薬である、請求項１に記載の抗体。
- 薬剤がオセルタミビルである、請求項１に記載の抗体。
- 配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識するが、配列番号４のアミノ酸からなるポリペプチドを認識しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
- IgYクラスの抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
- ポリクローナル抗体である、請求項５に記載の抗体。
- IgGクラスの抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
- マウスモノクローナル抗体である、請求項７に記載の抗体。
- 請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体を用い、抗原抗体反応により検出することを特徴とする、薬剤耐性インフルエンザウイルスの検出法。
- 以下のステップ（１）及び（２）を含むことを特徴とする、請求項９に記載の検出法：
（１）検体と、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体とを接触させるステップ；及び
（２）生成する抗原抗体複合体を検出するステップ。 - 請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体からなる、薬剤耐性インフルエンザウイルス検出用試薬。
- 請求項１１に記載の試薬を含む、薬剤耐性インフルエンザウイルス検出用キット。
- 請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体を検出用抗体又は捕捉用抗体に用いた薬剤耐性インフルエンザウイルス検出用テストストリップ。
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