JP2021519824A

JP2021519824A - Ｈｂｖ感染の処置のための方法

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Publication number: JP2021519824A
Application number: JP2021502721A
Authority: JP
Inventors: ダウ−ツン・シン; チェン−ルン・ク; ペイ−ハン・チュン; フン−カイ・チェン
Original assignee: エリクシロンイミュノセラピューティクス（ホンコン）リミテッド
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2021-08-12
Also published as: CN112105373A; TWI823919B; EP3773659A1; TW202003012A; AU2019243303B2; EP3773659B1; CA3095585A1; AU2019243303A1; US20200289603A1; KR20200138167A; WO2019191483A1; CN112105373B; US10813974B2; CA3095585C; EP3773659A4

Abstract

本発明は、ヒトIFNγに特異的に結合する抗体を使用してB型肝炎ウイルス(HBV)感染を処置するための方法を提供する。

Description

本開示は、B型肝炎ウイルス感染を処置するための方法に一般に関し、特に、ヒトインターフェロン-ガンマ(IFNγ)に結合する抗体を使用する方法に関する。

配列表への言及
配列表の正式な写しは、EFS-Webを介してASCIIフォーマット済みのテキストファイルとして本明細書と同時に提出され、「09793.001WO1_SeqList_ST25.txt」のファイル名、2019年3月28日の作成日及び66,627バイトのサイズを有する。EFS-Webを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

慢性B型肝炎ウイルス(HBV)感染は、世界中で肝細胞癌(HCC)の主要原因であり、アジアではその最も重要な原因である。全ての慢性HBV感染の75パーセントはアジアで生じ、台湾での有病率は15〜20%であり、台湾では、成人集団の90%よりも多くが、過去にHBVに感染したことがある。例えば、Chenら、「Estimation of seroprevalence of hepatitis B virus and hepatitis C virus in Taiwan from a large-scale survey of free hepatitis screening participants」、J. Formos. Med. Assoc. (2007) 106(2):148〜55を参照のこと。

HBV関連HCCは、40歳以上で生じる場合が多く、このことは、HBVがHCCが実際に発症する前に、数十年間にわたってキャリア中で持続する可能性があることを示唆している。HBVの持続は、肝臓における慢性HBV感染への持続性の曝露に起因する、全身性の抗原特異的免疫寛容によって引き起こされ得る。即ち、HBV特異的免疫応答は、慢性感染の持続の間に減退され、これにより、HBVワクチン接種に対する応答は非常に低下し又は応答がなくなる。従って、慢性HBV感染を処置するための有効な戦略又は治療剤を開発することは困難であり、HBV感染の処置の方法がいまだ必要とされている。

インターフェロンガンマ(「IFNγ」)は、ヒト細胞培養物においてHBV遺伝子の発現及び複製を阻害することが示されている。例えば、Suri Dら、「Non-cytolytic inhibition of hepatitis B virus replication in human hepatocytes」、J Hepatol. 2001年12月; 35(6): 790〜7を参照のこと。IFNγは、HBVトランスジェニックマウスにおいてもHBV遺伝子の発現及び複製を阻害することが示されている。例えば、Yang PLら、「Immune effectors required for hepatitis B virus clearance」、Proc Natl Acad Sci. USA 2010年1月12日; 107(2): 798〜802を参照のこと。IFNγは、慢性HBVを処置するための治療薬として提唱されており、フェーズII臨床試験を受けている。例えば、clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00753467におけるNCT00753467、「A Phase II Study to Determine the Safety and Efficacy of Interferon-gamma in Patients with Chronic Hepatitis B」を参照のこと。

米国特許第7,335,743(B2)号米国特許第7,700,098(B2)号米国特許第6,329,511(B1)号 WO2005/012359 WO93/08829 米国特許第5,731,168号 WO2008/077546 米国特許出願公開第2003/0157108号米国特許出願公開第2004/0093621号米国特許出願公開第2003/0115614号米国特許出願公開第2002/0164328号米国特許出願公開第2004/0132140号米国特許出願公開第2004/0110704号米国特許出願公開第2004/0110282号米国特許出願公開第2004/0109865号 WO2000/61739 WO2001/29246 WO2003/085119 WO2003/084570 WO2005/035586 WO2005/035778 WO2005/053742 WO2002/031140 WO2004/056312 WO2003/085107 米国特許第6,737,056号米国特許第7,332,581号

Chen他、「Estimation of seroprevalence of hepatitis B virus and hepatitis C virus in Taiwan from a large-scale survey of free hepatitis screening participants」、J. Formos. Med. Assoc. (2007) 106(2):148〜55 Suri D他、「Non-cytolytic inhibition of hepatitis B virus replication in human hepatocytes」、J Hepatol. 2001年12月; 35(6): 790〜7 Yang PL他、「Immune effectors required for hepatitis B virus clearance」、Proc Natl Acad Sci. USA 2010年1月12日; 107(2): 798〜802 NCT00753467、「A Phase II Study to Determine the Safety and Efficacy of Interferon-gamma in Patients with Chronic Hepatitis B」 Sambrook他、Molecular Cloning-A Laboratory Manual (第2版)、第1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor社、N.Y.、1989 Current Protocols in Molecular Biology、F. M. Ausubel他編、Current Protocols、Greene Publishing Associates社とJohn Wiley & Sons社との合弁事業(2011年までの補遺) Antibody Engineering、第1巻及び第2巻、R. Kontermann及びS. Dubel編、Springer-Verlag社、Berlin及びHeidelberg (2010) Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols、V. Ossipow及びN. Fischer編、第2版、Humana Press (2014) Therapeutic Antibodies: From Bench to Clinic、Z. An編、J. Wiley & Sons社、Hoboken、N.J. (2009) Phage Display、Tim Clackson及びHenry B. Lowman編、Oxford University Press社、United Kingdom (2004) Kindt他、Kuby Immunology、第6版、W.H. Freeman社、91頁 Portolano他、J. Immunol. 150:880〜887 (1993) Clarkson他、Nature 352:624〜628 (1991) Chothia及びLesk、J. Mol. Biol. 196:901〜917 (1987) Kabat他、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD (1991) Milstein及びCuello、Nature 305: 537 (1983) Traunecker他、EMBOJ. 10: 3655 (1991) Wright他、TIBTECH 15:26〜32 (1997) Okazaki他、J. Mol. Biol. 336: 1239〜1249 (2004) Yamane-Ohnuki他、Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004) Ripka他、Arch. Biochem. Biophys. 249:533〜545 (1986) Kanda, Y.他、Biotechnol. Bioeng.、94(4):680〜688 (2006) Lin他、「Identification of a major epitope by anti-interferon-γ autoantibodies in patients with mycobacterial disease」、Nat. Med. (2016) 22(9):994〜1001 Wu, T. T.及びKabat, E. A.、1970 J. Exp. Med. 132: 211〜250 Lefranc M.-P.他、1999 Nucleic Acids Research、27、209〜212 Benci他、Cell. 2016年12月1日;167(6):1540〜1554 Munn他、J Clin Invest. 2007年5月1日; 117(5): 1147〜1154 Munn他、J Exp Med. 2013年7月1日;210(7):1389〜1402 Munn他、Cell Rep. 2015年12月22日;13(11):2470〜2479 Huang他、「An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection」、Proc Natl Acad Sci USA 2006年11月21日. 103(47); 17862〜17867

IFNγ及びHBV感染に関する分野における理解とは対照的に、本開示は、活性IFNγを遮断することが可能な抗体が、慢性HBV感染を含むHBV感染を処置する際に有用であるという驚くべき発見に基づく、処置のための方法及び組成物を提供する。理論に束縛されないが、持続性のIFNγシグナル伝達は、種々の経路を介して、免疫チェックポイント遮断、疲弊したT細胞、及びエフェクターT細胞の阻害をもたらし、それによって、免疫抑制効果を生じると提唱されている。HBV感染患者では、延長されたIFNγシグナル伝達が、免疫系の抑制をもたらし、これが、抗ウイルス薬物処置を使用するHBVの完全な根絶を妨げることが提唱されている。従って、本開示は、HBV感染患者にIFNγ抗体が投与され、この抗体が、延長されたIFNγシグナル伝達の影響を中和し、そうして、患者からHBV感染を有効に根絶することができる正常な免疫機能の回復を促進する、処置の方法を提供する。

一部の実施形態では、本開示は、その必要に迫られている対象に、治療有効量のIFNγ抗体及び薬学的に許容される担体を含む組成物を投与する工程を含む、B型肝炎ウイルス感染を処置するための方法を提供する。一部の実施形態では、IFNγ抗体は、IFNγの生物学的機能をモジュレートする。一部の実施形態では、IFNγ抗体は、IFNγを中和する。

この方法の一部の実施形態では、IFNγ抗体は、IFNγのシグナル伝達活性を阻害、減少及び/又は完全に遮断し;場合により、IFNγ抗体は、プロ-ヒトIFNγ、成熟-ヒトIFNγ又は短縮型-ヒトIFNγによるIFNγシグナル伝達活性を、阻害、減少及び/又は完全に遮断する。

この方法の一部の実施形態では、IFNγ抗体は、IFNγ依存的サイトカイン産生;IFNγ依存的T細胞機能不全、IFNγ依存的免疫寛容;及びIFNγ依存的炎症のうち1つ又は複数を低減させる。

この方法の一部の実施形態では、IFNγ抗体は、IFNγで刺激された単球におけるHLA-DR及び/又はPDL1の発現を低減させる。一部の実施形態では、IFNγ抗体は、IFNγで刺激された単球におけるインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)の発現を低減させる。

この方法の一部の実施形態では、IFNγ抗体は、
配列番号120又は123から選択されるCDR-H1アミノ酸配列、配列番号121又は124から選択されるCDR-H2アミノ酸配列及び配列番号122又は125から選択されるCDR-H3アミノ酸配列を有するVH領域;並びに
配列番号132又は135から選択されるCDR-L1アミノ酸配列、配列番号133又は136から選択されるCDR-L2アミノ酸配列及び配列番号134又は137から選択されるCDR-L3アミノ酸配列を含むVL領域
を含む。

この方法の一部の実施形態では、IFNγ抗体は、
(a)配列番号120のCDR-H1アミノ酸配列、配列番号121のCDR-H2アミノ酸配列及び配列番号122のCDR-H3アミノ酸配列を有するVH領域、並びに配列番号132のCDR-L1アミノ酸配列、配列番号133のCDR-L2アミノ酸配列及び配列番号134のCDR-L3アミノ酸配列を含むVL領域;
(b)配列番号123のCDR-H1アミノ酸配列、配列番号124のCDR-H2アミノ酸配列及び配列番号125のCDR-H3アミノ酸配列を有するVH領域、並びに配列番号135のCDR-L1アミノ酸配列、配列番号136のCDR-L2アミノ酸配列及び配列番号137のCDR-L3アミノ酸配列を含むVL領域;又は
(c)配列番号123のCDR-H1アミノ酸配列、配列番号124のCDR-H2アミノ酸配列及び配列番号125のCDR-H3アミノ酸配列を有するVH領域、並びに配列番号132のCDR-L1アミノ酸配列、配列番号133のCDR-L2アミノ酸配列及び配列番号134のCDR-L3アミノ酸配列を含むVL領域
を含む。

この方法の一部の実施形態では、IFNγ抗体は、
配列番号120又は123から選択されるCDR-H1アミノ酸配列、配列番号121又は124から選択されるCDR-H2アミノ酸配列及び配列番号122又は125から選択されるCDR-H3アミノ酸配列を有するVH領域;並びに配列番号132又は135から選択されるCDR-L1アミノ酸配列、配列番号133又は136から選択されるCDR-L2アミノ酸配列及び配列番号134又は137から選択されるCDR-L3アミノ酸配列を含むVL領域;並びに
配列番号109、110、164又は165に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVH領域;及び配列番号113又は114に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVL領域
を含む。

この方法の一部の実施形態では、IFNγ抗体は、
(a)配列番号109のVH領域アミノ酸配列及び配列番号113のVL領域アミノ酸配列;
(b)配列番号110のVH領域アミノ酸配列及び配列番号114のVL領域アミノ酸配列;
(c)配列番号109のVH領域アミノ酸配列及び配列番号114のVL領域アミノ酸配列;
(d)配列番号110のVH領域アミノ酸配列及び配列番号113のVL領域アミノ酸配列;
(e)配列番号164のVH領域アミノ酸配列及び配列番号113のVL領域アミノ酸配列;又は
(f)配列番号165のVH領域アミノ酸配列及び配列番号113のVL領域アミノ酸配列
を含む。

この方法の一部の実施形態では、IFNγ抗体は、
配列番号120又は123から選択されるCDR-H1アミノ酸配列、配列番号121又は124から選択されるCDR-H2アミノ酸配列及び配列番号122又は125から選択されるCDR-H3アミノ酸配列を有するVH領域;並びに配列番号132又は135から選択されるCDR-L1アミノ酸配列、配列番号133又は136から選択されるCDR-L2アミノ酸配列及び配列番号134又は137から選択されるCDR-L3アミノ酸配列を含むVL領域;並びに
配列番号183、185、187又は189に対して少なくとも90%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列;及び配列番号184又は186に対して少なくとも90%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列
を含む。

この方法の一部の実施形態では、IFNγ抗体は、
(a)配列番号183の重鎖アミノ酸配列及び配列番号184の軽鎖アミノ酸配列;
(b)配列番号185の重鎖アミノ酸配列及び配列番号186の軽鎖アミノ酸配列;
(c)配列番号183の重鎖アミノ酸配列及び配列番号186の軽鎖アミノ酸配列;
(d)配列番号185の重鎖アミノ酸配列及び配列番号184の軽鎖アミノ酸配列;
(e)配列番号187の重鎖アミノ酸配列及び配列番号184の軽鎖アミノ酸配列;又は
(f)配列番号189の重鎖アミノ酸配列及び配列番号184の軽鎖アミノ酸配列
を含む。

この方法の一部の実施形態では、IFNγ抗体のVH領域は、N76A及びN76Qから選択されるアミノ酸置換を更に含む。

この方法の一部の実施形態では、IFNγ抗体は、2A6、2B6、2A6A、2A6Q、AB、BA、AMG811、NI0105からなる群から選択される抗体である。

この方法の一部の実施形態では、IFNγ抗体は、免疫グロブリン分子、Fv、ジスルフィド連結されたFv、モノクローナル抗体、scFv、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、CDRグラフト抗体、ディアボディ(diabody)、ヒト抗体、ヒト化抗体、多特異性抗体、Fab、二重特異性抗体、Fab'断片、二特異性抗体、F(ab')₂断片、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価断片;V_Hドメイン及びCH1ドメインからなるFd断片;抗体の単一アームのV_Lドメイン及びV_HドメインからなるFv断片、dAb断片、単離された相補性決定領域(CDR)、又は単鎖抗体である。

この方法の一部の実施形態では、対象に投与する工程は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内(intraabdominal)、嚢内、軟骨内、腔内(intracavitary)、腔内(intracelial)、小脳内、脳室内、結腸内(intracolic)、子宮頸部内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内(intraosteal)、骨盤内、心膜内、腹腔内(intraperitoneal)、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻腔内及び経皮からなる群から選択される少なくとも1つの様式による。

この方法の一部の実施形態では、必要に迫られている対象は、HBVキャリア、慢性HBV感染を有する対象又はHBV持続を有する対象である。

一部の実施形態では、少なくとも1つの更なる治療剤を投与する工程を更に含む上記方法が実施され得る。一部の実施形態では、更なる治療剤は、HBVワクチンである。一部の実施形態では、更なる治療剤は、阻害性免疫チェックポイント分子を標的化する抗体であり;場合により、この阻害性免疫チェックポイント分子は、PD1、PD-L1及びCTLA-4から選択され;又は場合により、阻害性免疫チェックポイント分子を標的化する抗体は抗PD1、抗PD-L1及び抗CTLA-4から選択される。

一部の実施形態では、少なくとも1つの更なる治療剤を投与する工程を更に含む上記方法が実施され得、この更なる治療剤は、治療剤;画像化剤;細胞傷害性剤;血管新生阻害剤;キナーゼ阻害剤;共刺激分子ブロッカー;接着分子ブロッカー;抗サイトカイン抗体又はその機能的断片;メトトレキサート;シクロスポリン;ラパマイシン;FK506;検出可能な標識又はレポーター;TNFアンタゴニスト;抗リウマチ薬;筋弛緩薬;麻薬;非ステロイド性抗炎症薬物(NSAID);鎮痛薬;麻酔薬;鎮静薬;局所麻酔薬;神経筋ブロッカー;抗菌薬;抗乾癬薬;コルチコステロイド;タンパク質同化ステロイド;エリスロポエチン;免疫化;免疫グロブリン;免疫抑制薬;成長ホルモン;ホルモン補充薬物;放射性医薬品;抗うつ薬;抗精神病薬;刺激物質;喘息薬物療法;ベータアゴニスト;吸入ステロイド;エピネフリン又はそのアナログ;サイトカイン;サイトカインアンタゴニスト;及び免疫調節剤からなる群から選択される。

一部の実施形態では、更なる治療剤を投与する工程を含む上記方法が実施され、この更なる治療剤は、組成物と同時に、必要に迫られている対象に投与される。一部の実施形態では、更なる治療剤は、組成物の投与の前又はその後に、必要に迫られている対象に投与される。

この方法の一部の実施形態では、治療有効量の組成物を投与する工程は、必要に迫られている対象においてHBVに対する免疫応答を誘導若しくはブーストする、及び/又は必要に迫られている対象においてHBVに関するセロコンバージョンを誘導する。

この方法の一部の実施形態では、治療有効量の組成物を投与する工程は、免疫応答を誘導し、この免疫応答は、免疫系の活性をモジュレートする抗体の産生又はサイトカインの産生を含む。

この方法の一部の実施形態では、必要に迫られている対象に治療有効量の組成物を投与する工程の後に、対象におけるHBsAgが低減され;場合により、対象が、持続的なHBsAg喪失を示す。

この方法の一部の実施形態では、治療有効量の組成物を投与する工程の後に、対象におけるHBVのウイルス負荷が低減され;場合により、対象におけるHBVのウイルス負荷が検出不能である。

この方法の一部の実施形態では、IFNγ抗体は、1×10^-8M以下、1×10^-9M以下、1×10^-10M以下又は1×10^-11M以下の結合親和性でヒトIFNγに結合し;場合により、この結合親和性は、ヒトIFNγに対する平衡解離定数(K_D)によって測定される。一部の実施形態では、IFNγ抗体はまた、1×10^-8M以下、1×10^-9M以下、1×10^-10M以下又は1×10^-11M以下の結合親和性で、アカゲザル/カニクイザルIFNγに結合し;場合により、この結合親和性は、カニクイザルIFNγに対する平衡解離定数(K_D)によって測定される。

この方法の一部の実施形態では、IFNγ抗体は、SEB刺激されたヒトPBMCからのIL-2産生を、少なくとも1.2倍、少なくとも1.3倍、少なくとも1.4倍、少なくとも1.5倍、少なくとも1.6倍、少なくとも1.7倍、少なくとも1.8倍、少なくとも1.9倍、少なくとも2倍、少なくとも2.1倍又は少なくとも2.20倍増加させる。

IFNγ抗体2A6及び2ABの重鎖可変領域(V_H)及び軽鎖可変領域(V_L)のアミノ酸配列のアラインメントを示す図であり、フレームワーク領域(FR)及び相補性決定領域(CDR)も示される図である。組換えIFNγ抗体を調製する際に使用したヒトIgG₁λ発現ベクターを示す図である。図3は、示されたヒト及びアカゲザル/カニクイザルIFNγへのIFNγ抗体結合についてのELISAアッセイ結果を示し、図3Aは、ヒトIFNγへの結合についての結果を示す図である。図3は、示されたヒト及びアカゲザル/カニクイザルIFNγへのIFNγ抗体結合についてのELISAアッセイ結果を示し、図3Bは、アカゲザル/カニクイザルIFNγへの結合についての結果を示す図である。ルシフェラーゼレポーターHeLa安定細胞株におけるIFNγ抗体のIFNγ中和活性についてのアッセイ結果を示す図である。図5は、全血アッセイにおけるIFNγ抗体のIFNγ中和活性についてのアッセイ結果を示し、図5Aは、CXCL9の産生の阻害についての結果を示す図である。図5は、全血アッセイにおけるIFNγ抗体のIFNγ中和活性についてのアッセイ結果を示し、図5Bは、CXCL10の産生の阻害についての結果を示す図である。図6は、TCIRリガンドHLA-DR及びPD-L1の発現の阻害の細胞ベースの用量依存性研究におけるIFNγ抗体のIFNγ中和活性についてのアッセイ結果を示し、図6Aは、HLA-DR阻害についての結果を示す図である。図6は、TCIRリガンドHLA-DR及びPD-L1の発現の阻害の細胞ベースの用量依存性研究におけるIFNγ抗体のIFNγ中和活性についてのアッセイ結果を示し、図6Bは、PD-L1阻害についての結果を示す図である。 THP-1細胞におけるインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ (IDO)活性に対するIFNγ抗体のIFNγ中和活性についてのアッセイ結果を示す図である。 IFNγ活性化部位(GAS)ルシフェラーゼレポーターHeLa細胞アッセイにおけるIFNγ抗体のIFNγ遮断効果についての結果を示す図である。一方向性同種(one-way allogeneic)MLR培養物中の健康なドナー細胞に添加したIFNγ抗体の2つの代表的なアッセイについてのプロットを示す図である。図10は、PBMCにおけるSEB刺激された免疫応答に対するIFNγ抗体のIFNγ中和活性についての結果のプロットを示し、図10Aは、2日目におけるIL-2分泌の増強についての結果を示す図である。図10は、PBMCにおけるSEB刺激された免疫応答に対するIFNγ抗体のIFNγ中和活性についての結果のプロットを示し、図10Bは、7日目に測定された細胞増殖の増強についての結果を示す図である。 CFSE標識されたCD4⁺及びCD8⁺T細胞の増強された増殖の結果を示す、IFNγ抗体で処理したSEB刺激されたPBMCのフローサイトメトリーヒストグラムを示す図である。図12は、ヒトPBMC及びB細胞のPD-L1発現に対するIFNγ抗体のIFNγ中和効果についての結果を示し、図12Aは、PBMCについての結果を示す図である。図12は、ヒトPBMC及びB細胞のPD-L1発現に対するIFNγ抗体のIFNγ中和効果についての結果を示し、図12Bは、B細胞についての結果を示す図である。図13は、CTLA-4又はPD-1遮断抗体と組み合わせて使用したIFNγ抗体によって2つの異なる健康なドナーサンプルからのSEB刺激された細胞において惹起された、増強された免疫応答についての結果を示し、図13Aは、2A6Q、抗PD1又は抗CTLA4単独、抗PD1と組み合わせた2A6Q、及び抗CTLA4と組み合わせた2A6Qによって惹起された増強されたIL-2産生についての結果を示す図である。図13は、CTLA-4又はPD-1遮断抗体と組み合わせて使用したIFNγ抗体によって2つの異なる健康なドナーサンプルからのSEB刺激された細胞において惹起された、増強された免疫応答についての結果を示し、図13Bは、増強されたIL-2産生の惹起における、2A6Q、AMG811又は抗PD1抗体単独又は組み合わせについての結果を示す図である。図14は、CTLA-4又はPD-1遮断抗体と組み合わせて使用したIFNγ抗体によって惹起された、慢性HBV感染を有する患者からのSEB刺激されたPBMCにおける改善された免疫応答についての結果を示し、図14Aは、対照IgGと比較した場合の、IFNγ遮断抗体単独によって誘導された増強された細胞増殖についての結果を示す図である。図14は、CTLA-4又はPD-1遮断抗体と組み合わせて使用したIFNγ抗体によって惹起された、慢性HBV感染を有する患者からのSEB刺激されたPBMCにおける改善された免疫応答についての結果を示し、図14Bは、IFNγ遮断抗体2A6QとPD-1、PD-L1又はCTLA4の遮断抗体との組み合わせによって誘導された増強された免疫応答についての結果を示す図である。図14は、CTLA-4又はPD-1遮断抗体と組み合わせて使用したIFNγ抗体によって惹起された、慢性HBV感染を有する患者からのSEB刺激されたPBMCにおける改善された免疫応答についての結果を示し、図14Cは、IFNγ遮断抗体NI0501とPD-1、PD-L1又はCTLA4の遮断抗体との組み合わせによって誘導された増加したT細胞増殖についての結果を示す図である。

本開示は、IFNγのシグナル伝達活性を遮断することが可能な抗体が、HBV感染を処置する際に有用であるという驚くべき発見に基づく、処置の方法及び関連組成物を提供する。従って、本開示は、その必要に迫られている患者にIFNγ抗体が投与される、HBV感染の処置の方法を提供する。この方法及び組成物において有用なIFNγ抗体は、IFNγシグナル伝達活性を減少、阻害及び/又は遮断することが可能である。従って、以下により詳細に記載されるように、処置の方法及び関連組成物は、必要に迫られている対象からHBV感染を有効に根絶することができる正常な免疫機能を刺激すること及び/又は他の方法で回復させることが可能である。

用語法及び技術
本明細書の記載及び添付の特許請求の範囲について、単数形「1つの(a)」及び「1つの(an)」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数形の指示対象を含む。従って、例えば、「1つの(a)タンパク質」に対する言及は、1つよりも多くのタンパク質を含み、「1つの(a)化合物」に対する言及は、1つよりも多くの化合物を指す。「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含む(include)」、「含む(includes)」及び「含む(including)」の使用は、相互交換可能であり、限定を意図しない。種々の実施形態の記載が用語「含む(comprising)」を使用する場合、当業者は、一部の具体的な場合には、1つの実施形態が、「本質的に〜からなる」又は「〜からなる」という言葉を使用して代替的に記載されうることを理解することが、更に理解される。

文脈が明らかに他を示さない限り、値の範囲が提供される場合、文脈が明らかに他を示さない限り、その範囲の上限と下限との間の、その値の各介在する整数、及びその値の各介在する整数の各10分の1、並びに任意の他の述べられた値又はその述べられた範囲中の介在する値が、本発明の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、そのより小さい範囲内に独立して含まれ得、また、述べられた範囲内の任意の具体的に排除された限界に依存する本発明の範囲内に包含される。述べられた範囲が、これらの限界のうち一方又は両方を含む場合、含まれた限界の(i)いずれか又は(ii)両方を排除する範囲もまた、本発明に含まれる。例えば、「1〜50」には、「2〜25」、「5〜20」、「25〜50」、「1〜10」等が含まれる。

一般に、本明細書で使用される命名法並びに本明細書に記載される技術及び手順には、Sambrookら、Molecular Cloning-A Laboratory Manual (第2版)、第1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor社、N.Y.、1989 (本明細書で以下「Sambrook」);Current Protocols in Molecular Biology、F. M. Ausubel他編、Current Protocols、Greene Publishing Associates社とJohn Wiley & Sons社との合弁事業(2011年までの補遺)(本明細書で以下「Ausubel」);Antibody Engineering、第1巻及び第2巻、R. Kontermann及びS. Dubel編、Springer-Verlag社、Berlin及びHeidelberg (2010);Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols、V. Ossipow及びN. Fischer編、第2版、Humana Press (2014);Therapeutic Antibodies: From Bench to Clinic、Z. An編、J. Wiley & Sons社、Hoboken、N.J. (2009);並びにPhage Display、Tim Clackson及びHenry B. Lowman編、Oxford University Press社、United Kingdom (2004)に記載される一般的な技術及び方法論等の、当業者によって十分に理解され一般に使用されるものが含まれる。

本開示で言及される全ての刊行物、特許、特許出願及び他の文書は、各個々の刊行物、特許、特許出願又は他の文書が、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれると個々に示されるのと同程度まで、全ての目的のために、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態を記載するためだけのものであり、限定を意図しないことが理解される。本開示を解釈することを目的として、用語の以下の説明が適用され、適切な場合、単数形で使用される用語は、複数形もまた含み、その逆もまた同様である。

「IFNγ」、「IFNg」又は「インターフェロン-ガンマ」は、本明細書で使用する場合、霊長類(例えば、ヒト、アカゲザル及びカニクイザル)、げっ歯類由来の天然に存在するIFNγ、種々の翻訳前形態及び翻訳後形態のIFNγ(例えば、プロ-ヒトIFNγ、成熟-ヒトIFNγ又は短縮型-ヒトIFNγ)、並びに組換え形態のIFNγが含まれるがこれらに限定されない、タイプIIクラスのインターフェロンのメンバーである、二量体化した可溶性サイトカイン、インターフェロンガンマの種々の形態を指す。

「B型肝炎感染」又は「HBV感染」は、本明細書で使用する場合、生物におけるB型肝炎ウイルスの存在を指し、短期又は急性感染、長期又は慢性感染、及び潜伏(dormant)又は潜伏(latent)感染を含むことを意図する。

「抗体」は、本明細書で使用する場合、特定の抗原に特異的に結合する、又は特定の抗原と免疫学的に反応性である、1つ又は複数のポリペプチド鎖を含む分子を指す。本開示の例示的な抗体には、ネイティブ抗体、抗体全体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、多特異性(又はヘテロコンジュゲート)抗体(例えば、二特異性抗体)、一価抗体、多価抗体、抗原結合抗体断片(例えば、Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rIgG及びscFv断片)、抗体融合物及び合成抗体(又は抗体模倣物)が含まれる。

「IFNγ抗体」、「抗IFNγ抗体」又は「IFNγに結合する抗体」は、その抗体がIFNγを標的化する際に診断剤及び/又は治療剤として有用であるような十分な親和性でIFNγに結合する抗体を指す。一部の実施形態では、無関係の非IFNγ抗原へのIFNγ抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)によって測定した場合、IFNγへのその抗体の結合の約10%未満である。一部の実施形態では、IFNγに結合する抗体は、<1μΜ、<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM又は<0.01nM(例えば、10^-8M以下、例えば、10^-8M〜10^-13M、例えば、10^-9M〜10^-13M)の解離定数(Kd)を有する。

「全長抗体」、「インタクトな抗体」又は「抗体全体」は、ネイティブ抗体構造と実質的に類似した構造を有する抗体又は本明細書に定義されるFc領域を含む重鎖を有する抗体を指すために、本明細書で相互交換可能に使用される。

「抗体断片」又は「抗原結合断片」は、全長抗体と同じ抗原に結合することが可能な、全長抗体の一部分を指す。抗体断片の例には、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2;ディアボディ;直鎖抗体;単鎖抗体分子(例えば、scFv);及び抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれるがこれらに限定されない。

抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の型を指す。5つの主要なクラスの抗体:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMが存在し、これらのうちいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2へと更に分割される。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。

「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原への抗体の結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。ネイティブ抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン(それぞれ、VH及びVL)は、一般に、類似の構造を有し、各ドメインは、4つの保存されたフレームワーク領域(FR)及び3つの超可変領域(HVR)を含む(例えば、Kindt他、Kuby Immunology、第6版、W.H. Freeman社、91頁を参照のこと)。単一のVHドメイン又はVLドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、それぞれ、相補的なVLドメイン又はVHドメインのライブラリーをスクリーニングするために、この抗原に結合する抗体由来のVHドメイン又はVLドメインを使用して単離され得る(例えば、Portolano他、J. Immunol. 150:880〜887 (1993);Clarkson他、Nature 352:624〜628 (1991)を参照のこと)。

「超可変領域」又は「HVR」は、本明細書で使用する場合、配列が超可変性である及び/又は構造的に規定されたループ(「超可変ループ」)を形成する、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、ネイティブ抗体は、6つのHVRを有する4つの鎖を含む;3つのHVRは、重鎖可変ドメインVH中にあり(H1、H2、H3)、3つのHVRは、軽鎖可変ドメインVL中にある(L1、L2、L3)。HVRは、一般に、超可変ループ由来及び/又は「相補性決定領域」(CDR)由来のアミノ酸残基を含む。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、91〜96(L3)、26〜32(H1)、53〜55(H2)及び96〜101(H3)に存在する(Chothia及びLesk、J. Mol. Biol. 196:901〜917 (1987))。特に示さない限り、可変ドメイン中のHVR残基及び他の残基(例えば、FR残基)は、Kabat他、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD (1991)に従って、本明細書で番号付けされる。

「相補性決定領域」又は「CDR」は、本明細書で使用する場合、最も高い配列可変性を有する及び/又は抗原認識に関与する、可変ドメインの超可変領域内の領域を指す。一般に、ネイティブ抗体は、6つのCDRを有する4つの鎖を含む;3つのCDRは重鎖可変ドメインVH中にあり(H1、H2、H3)、3つのCDRは、軽鎖可変ドメインVL中にある(L1、L2、L3)。例示的なCDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及びCDR-H3)は、L1のアミノ酸残基24〜34、L2のアミノ酸残基50〜56、L3のアミノ酸残基89〜97、H1のアミノ酸残基31〜35、H2のアミノ酸残基50〜65、及びH3のアミノ酸残基95〜102に存在する(Kabat他、上記)。VH中のCDR-H1を除き、CDRは、一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。

「フレームワーク」又は「FR」は、超可変領域(HVR)残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのFRは、一般に、4つのFRドメイン:FR1、FR2、FR3及びFR4からなる。従って、HVR配列及びFR配列は、一般に、VH(又はVL)中に以下の順序で出現する:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

「ネイティブ抗体」は、天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、ネイティブIgG抗体は、ジスルフィド結合された2つの同一の軽鎖及び2つの同一の重鎖から構成される、約150ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質である。N末端からC末端へ、各重鎖は、3つの定常ドメイン(CH1、CH2及びCH3)が後に続く、可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VH)を有する。同様に、N末端からC末端へ、各軽鎖は、定常軽(CL)ドメインが後に続く、可変軽ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VL)を有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる2つの型のうち1つに割り当てられ得る。

「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用する場合、抗体の実質的に均一な集団から取得される抗体を指す、即ち、集団を構成する個々の抗体は、可能なバリアント抗体(例えば、バリアント抗体は、天然に存在する、又はモノクローナル抗体の産生の間に生じる変異を含み、一般に、微量で存在する)を除き、同一である、及び/又は同じエピトープに結合する。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、用語「モノクローナル」は、抗体の特徴を、抗体の実質的に均一な集団から取得されるものとして示しているのであって、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈すべきではない。例えば、使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法が含まれるがこれらに限定されない種々の技術によって作製され得、かかる方法及びモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法は、本明細書に記載される。

「キメラ抗体」は、重鎖及び/又は軽鎖の一部分が特定の供給源又は種に由来し、重鎖及び/又は軽鎖の残部が異なる供給源又は種に由来する、抗体を指す。

「ヒト化抗体」は、非ヒトHVR由来のアミノ酸配列及びヒトFR由来のアミノ酸配列を含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、FTVR(例えば、CDR)の全て又は実質的に全ては、非ヒト抗体のものに対応し、FRの全て又は実質的に全ては、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含み得る。「ヒト化形態」の抗体、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を受けた抗体を指す。

「単離された抗体」は、本明細書で使用する場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図する(例えば、IFNγに特異的に結合する単離された抗体は、IFNγ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。しかし、IFNγに特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原、例えば、他の種由来のIFNγ分子に対する交差反応性を有し得る。更に、単離された抗体は、他の細胞性材料及び/又は化学物質を実質的に含まなくてよい。

「ヒト抗体」は、本明細書で使用する場合、フレームワーク領域及びCDR領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図する。更に、抗体が定常領域を含む場合、この定常領域もまた、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってはコードされないアミノ酸残基(例えば、ランダム若しくは部位特異的変異誘発によってin vitroで、又は体細胞変異によってin vivoで導入された変異)を含み得る。しかし、用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用する場合、別の哺乳動物種、例えば、マウスの生殖系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列上にグラフトされた抗体を含むことは意図しない。

「ヒトモノクローナル抗体」は、フレームワーク領域及びCDR領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配に由来する可変領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合された、ヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから取得されたB細胞を含むハイブリドーマによって産生される。

「組換えヒト抗体」は、本明細書で使用する場合、組換え手段によって調製、発現、創出又は単離される全てのヒト抗体、例えば、(a)ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニック若しくは導入染色体性(transchromosomal)である動物(例えば、マウス)、又はそれから調製されたハイブリドーマ(以下に更に記載される)から単離された抗体、(b)ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマ(transfectoma)から単離された抗体、(c)組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、及び(d)他のDNA配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングが関与する任意の他の手段によって調製、発現、創出又は単離された抗体、を含む。かかる組換えヒト抗体は、フレームワーク領域及びCDR領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、ある特定の実施形態では、かかる組換えヒト抗体は、in vitro変異誘発(又は、ヒトIg配列についてトランスジェニックである動物が使用される場合には、in vivo体細胞変異誘発)に供され得、従って、組換え抗体のV_H領域及びV_L領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列V_H配列及びV_L配列に由来しそれらに関連するが、ヒト抗体生殖系列レパートリー内にin vivoでは天然に存在しない場合がある配列である。

「親和性」は、分子(例えば、抗体)の単一の結合部位とその結合パートナー(例えば、抗原)との間の非共有結合相互作用の総計の強さを指す。「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば、抗体及び抗原)間での1:1の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。そのパートナーYに対する分子Xの親和性は、一般に、平衡解離定数(KD)によって示すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当該分野で公知の一般的な方法によって測定され得る。結合親和性を測定するための具体的な実例及び例示的な実施形態は、以下に記載される。

「特異的に結合する」又は「特異的結合」は、約1×10^-7M以下の親和性値での、抗原への抗体の結合を指す。

「処置」、「処置する(treat)」又は「処置する(treating)」は、処置されている対象における障害の自然な過程を変更することを試みた臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理学の過程の間に、実施することができる。処置の所望の結果には、障害の発生又は再発の予防、症状の軽減、障害の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減退、転移の予防、進行の速度の減少、疾患状態の寛解又は緩和、及び軽快又は改善された予後が含まれ得るがこれらに限定されない。例えば、HBV感染の処置は、HBV感染を予防するため、HBV感染の発症を遅延させるため、HBV感染の進行を緩徐化するため、又はHBV感染を根絶するための、IFNγ抗体を含む医薬製剤の治療有効量の、対象への投与を含み得る。

「医薬組成物」又は「組成物」又は「製剤」は、活性成分の生物学的活性を有効にする形態にあり、製剤が投与される対象にとって毒性である更なる成分を含まない調製物を指す。

「薬学的に許容される担体」は、それが投与される対象にとって非毒性の、医薬製剤中の活性成分以外の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝剤、賦形剤、安定剤又は防腐剤が含まれるがこれらに限定されない。

「治療有効量」は、本明細書で使用する場合、所望の治療結果又は予防結果を達成するため、例えば、対象における疾患、障害又は状態を処置又は予防するための、活性成分又は薬剤(例えば、医薬組成物)の量を指す。HBV感染対象の場合、治療剤の治療有効量は、対象において検出可能なHBVのウイルス負荷及び/又はHBsAgの量を含む、HBV感染と関連する症状のうち1つ又は複数をある程度まで低減、予防、阻害及び/又は救済する量である。HBV感染の治療的処置について、in vivo有効性は、例えば、症状の持続時間、重症度及び/若しくは再発、奏効率(RR)、応答の持続時間、並びに/又は生活の質を評価することによって、測定することができる。

「対象」は、霊長類(例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えば、サル)、げっ歯類(例えば、マウス及びラット)、ウサギ、及び家畜化された動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ)が含まれるがこれらに限定されない哺乳動物を指す。

「必要に迫られている対象」は、本明細書で言及する場合、HBV感染を有する患者、例えば、HBVキャリア、慢性HBV感染を有する対象、HBV持続を有する対象、又はHBV感染のリスクがある対象を含む。

「HBVワクチン」は、本明細書で使用する場合、HBVに対する獲得免疫応答を惹起する調製物を指し、予防的ワクチン(即ち、予防のために、HBVに感染していない対象に投与されるワクチン)又は治療的ワクチン(例えば、感染の処置のために、HBVに既に感染した対象に投与されるワクチン)の両方を含み得る。例示的な治療的ワクチンには、DNAワクチン、ウイルスベクターワクチン、タンパク質ワクチン又はマルチペプチドワクチンが含まれ得る。

「免疫チェックポイント分子」は、本明細書で使用する場合、免疫系経路を調節し、それによって、免疫系経路が細胞を不必要に攻撃することを防止するように機能する、分子を指す。多くの免疫チェックポイント分子は、がん及びウイルス感染の処置における免疫療法(例えば、遮断抗体による)のための標的である。免疫療法のために現在標的にされている例示的な免疫チェックポイント分子には、PD1、PD-L1、CTLA-4、TIGIT、LAG3、PVRIG、KIR、TIM-3、CRTAM、BTLA、CD244、CD160、LIGHT、GITR、4-1BB、OX40、CD27、TMIGD2、ICOS、CD40、CD47、SIRPa、NKG2D、NKG2A、TNFRSF25、CD33、CEA、Epcam、GPC3、CD200、CD200R、CD73、CD83、CD39、TRAIL、CD226及びVISTAが含まれる。

IFNγ抗体を使用した、HBV感染の処置のための方法
本開示は、その必要に迫られている対象に、治療有効量のIFNγ抗体及び薬学的に許容される担体を含む組成物を投与する工程を含む、B型肝炎ウイルス感染を処置するための方法を提供する。処置の方法において有用な種々のIFNγ抗体組成物及び投与の様式は、以下により詳細に記載され、実施例において例示される。更に、更なる治療剤を投与する工程を更に含む処置の方法が、以下に更に記載され、実施例において例示される。

IFNγは、タイプIIクラスのインターフェロンのメンバーである、二量体化した可溶性サイトカインである。IFNγは、マクロファージの活性化因子及びクラスII主要組織適合複合体(MHC)分子発現の誘導因子として機能する、重要な免疫刺激性かつ免疫調節性の分子である。IFNγは、自然免疫応答の一部としてのナチュラルキラー(NK)細胞及びナチュラルキラーT(NKT)細胞によって、及び抗原特異的免疫が発達した後のCD4 Th1及びCD8細胞傷害性Tリンパ球(CTL)エフェクターT細胞によって、優勢に産生される。IFNγの異常な発現は、いくつかの自己炎症性疾患及び自己免疫疾患と関連付けられている。免疫系におけるIFNγの重要性は、ウイルス複製を阻害する能力から少なくとも一部生じると考えられる。ヒト、霊長類及び他の哺乳動物バージョンのIFNγのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列並びにアノテーションは、公に入手可能である。例えば、UniProtエントリー番号P01579におけるヒトIFNγの完全アミノ酸配列を参照のこと。ヒトIFNγのアミノ酸配列は、添付の配列表の配列番号166として開示される。

一般に、HBVの処置のための方法において有用なIFNγ抗体は、IFNγシグナル伝達活性を減少、阻害及び/又は(部分的若しくは完全に)遮断するという機能的特徴を有する。一部の実施形態では、本開示の方法において有用なIFNγ抗体は、IFNγの生物学的機能をモジュレートすること、IFNγを中和すること、又はその受容体へのIFNγ結合を低減させることが可能である。一部の実施形態では、IFNγ抗体は、プロ-ヒトIFNγ、成熟-ヒトIFNγ若しくは短縮型-ヒトIFNγのシグナル伝達活性、及び/又はプロ-ヒトIFNγ、成熟-ヒトIFNγ若しくは短縮型-ヒトIFNγがその受容体に結合する能力を、低減、阻害及び/又は遮断し得;それによって、IFNγ依存的サイトカイン産生、IFNγ依存的T細胞機能不全、IFNγ依存的免疫寛容及び/又はIFNγ依存的炎症のうち1つ又は複数を低減させる。

本開示の方法において有用な例示的なIFNγ抗体には、例えば、IFNγの少なくとも1つの生物学的機能又は活性をモジュレートするIFNγアンタゴニスト又は阻害剤が含まれ得る。IFNγの生物学的機能又は活性には、例えば、IFNγ受容体(IFNγ-R)への結合、細胞表面上での主要組織適合複合体(MHC)クラスII発現のモジュレーション(例えば、増強)、細胞増殖のモジュレーション(例えば、低減若しくは阻害)、及び/又は免疫応答のモジュレーションが含まれる。

一部の実施形態では、本開示の方法において有用なIFNγ抗体は、IFNγシグナル伝達活性を完全に又は部分的に阻害する。一部の実施形態では、IFNγ抗体は、IFNγ受容体へのIFNγの結合を部分的又は完全に遮断することによって、IFNγシグナル伝達活性を完全に又は部分的に阻害する。しかし、IFNγ抗体は、IFNγ受容体へのIFNγ結合の直接的阻害が関与しない機構によっても、IFNγシグナル伝達を完全に又は部分的に阻害することができることが企図される。

一部の実施形態では、本開示の方法及び組成物において有用なIFNγ抗体は、種々の周知の免疫グロブリン特色(例えば、CDR、HVR、FR、V_H及びV_Lドメイン)のアミノ酸配列及びコードするヌクレオチド配列の観点から記載することができる。以下のTable 1(表1)は、本明細書の他の箇所で「2A6」、「2B6」、「2A6_Q」(又は「2A6Q」)及び「2A6_A」(又は「2A6A」)と記載されるIFNγ抗体を含む、本開示の方法において有用な例示的なIFNγ抗体についての配列及び配列識別子の要約説明を提供する。これらの配列は、添付の配列表に含まれる。

本開示の方法及び組成物において有用な更なるIFNγ抗体には、IFNγに特異的に結合し、IFNγシグナル伝達活性を中和、阻害、減少、及び/又は他の方法で遮断することが当該分野で公知の任意の抗体が含まれる。当該分野で公知の例示的な抗体には、以下のIFNγ抗体が含まれる:AMG-811(例えば、米国特許第7,335,743(B2)号に記載される)、NI-0501(例えば、米国特許第7,700,098(B2)号に記載される)、HuZAF(例えば、米国特許第6,329,511(B1)号に記載される)。米国特許第7,335,743(B2)号、米国特許第7,700,098(B2)号及び米国特許第6,329,511(B1)号の各々の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

一般に、本開示の処置の方法において有用なIFNγ抗体は、IFNγへの高親和性での結合を示す。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗IFNγ抗体は、IFNγへの結合について、<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM又は<0.001nM(例えば、10^-8M以下、10^-8M〜10^-13M、例えば、10^-9M〜10^-13M)の平衡解離定数(K_D)を有する。

更に、本明細書に開示される方法において有用な抗IFNγ抗体には、ヒトIFNγ、カニクイザルIFNγへの高親和性での結合が可能な、一部の実施形態では、ヒトIFNγ及びカニクイザルIFNγの両方への高親和性での結合が可能な、抗体が含まれる。より具体的には、一部の実施形態では、本開示の方法において有用なIFNγ抗体は、1×10^-8M以下、1×10^-9M以下、1×10^-10M以下又は1×10^-11M以下の結合親和性でヒトIFNγに結合する。一部の実施形態では、本開示の抗IFNγ抗体は、1×10^-8M以下、1×10^-9M以下、1×10^-10M以下又は1×10^-11M以下の結合親和性でカニクイザルIFNγに結合する。一部の実施形態では、本開示の抗IFNγ抗体は、1×10^-8M以下、1×10^-9M以下、1×10^-10M以下又は1×10^-11M以下の結合親和性で、ヒトIFNγ及びカニクイザルIFNγの両方に結合する。

一般に、IFNγ抗体の結合親和性は、種々のアッセイのいずれかを使用して決定され得、種々の定量的値を用いて表され得る。抗体の親和性を決定する際に有用な具体的なIFNγ結合アッセイは、本明細書の実施例に開示されている。更に、抗原結合アッセイは、当該分野で公知であり、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、表面プラズモン共鳴ベースのアッセイ(例えば、WO2005/012359に記載されるBIAcoreアッセイ)、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ及びプロテインAイムノアッセイ等の技術を使用する任意の直接的又は競合的結合アッセイが含まれるがこれらに限定されない抗原結合アッセイが、本明細書で使用され得る。

一部の実施形態では、本開示の方法において有用な抗IFNγ抗体は、そのコグネート受容体、IFNγ-RへのIFNγ結合を減少、阻害、及び/又は完全に遮断し、それによって、IFNγによって媒介される免疫調節及び/又は免疫シグナル伝達をモジュレートする。IFNγ結合によって媒介されるこれらの免疫調節経路及び免疫シグナル伝達経路を阻害するIFNγ抗体の能力は、本開示の実施例に記載される種々の細胞ベースのアッセイを含む公知の細胞ベースのアッセイを使用して、in vitroでアッセイされ得る。

従って、一部の実施形態では、本開示の方法において有用なIFNγ抗体は、ブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)によって刺激されたヒトPBMCにおける測定可能な免疫応答を、少なくとも1.2倍、少なくとも1.3倍、少なくとも1.4倍、少なくとも1.5倍、少なくとも1.6倍、少なくとも1.7倍、少なくとも1.8倍、少なくとも1.9倍、少なくとも2倍、少なくとも2.1倍又は少なくとも2.20倍増強する能力を特徴とする。例えば、一部の実施形態では、IFNγ抗体は、SEB刺激されたヒトPBMCにおけるIL-2産生及び/又は細胞増殖を、少なくとも1.2倍、少なくとも1.3倍、少なくとも1.4倍、少なくとも1.5倍、少なくとも1.6倍、少なくとも1.7倍、少なくとも1.8倍、少なくとも1.9倍、少なくとも2倍、少なくとも2.1倍又は少なくとも2.20倍増加させる。本開示の方法において有用な例示的なIFNγ抗体の更なる機能的特徴は、以下及び実施例に更に記載される。

上記のように、本開示のHBV感染を処置するための方法において有用なIFNγ抗体には、IFNγに特異的に結合する又はIFNγと免疫学的に反応性である、1つ又は複数のポリペプチド鎖を含む任意の免疫グロブリンが含まれ得ることが企図される。従って、本開示の方法において有用なIFNγ抗体には、ネイティブ抗体、抗体全体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、多特異性(又はヘテロコンジュゲート)抗体(例えば、二特異性抗体)、一価抗体、多価抗体、抗原結合抗体断片(例えば、Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rIgG及びscFv断片)、抗体融合物及び合成抗体(又は抗体模倣物)が含まれる。

本開示の一部の実施形態では、IFNγ抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも2つの重(H)鎖及び2つの軽(L)鎖を含む糖タンパク質、又はその抗原結合部分である。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではV_Hと略す)及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、3つのドメインCH1、CH2及びCH3から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではV_Lと略す)及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメインC_Lから構成される。V_H領域及びV_L領域は、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域へと更に下位分割され得、相補性決定領域(CDR)の間には、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより保存された領域が散在する。各V_H及びV_Lは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置された、3つのCDR及び4つのFRから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)及び古典的補体系の第一成分(C1q)を含む宿主組織又は因子への、免疫グロブリンの結合を媒介し得る。

本開示に従う一部の実施形態では、IFNγ抗体は、免疫グロブリン分子、Fv、ジスルフィド連結されたFv、モノクローナル抗体、scFv、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、CDRグラフト抗体、ディアボディ、ヒト化抗体、多特異性抗体、Fab、二重特異性抗体、Fab'断片、二特異性抗体、F(ab')₂断片、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価断片;V_Hドメイン及びCH1ドメインからなるFd断片;抗体の単一アームのV_Lドメイン及びV_HドメインからなるFv断片、dAb断片、単離された相補性決定領域(CDR)、又は単鎖抗体であり得る。特に、IFNγ抗体は、ヒトタンパク質又はヒト化結合タンパク質であり得る。

本開示の一部の実施形態では、IFNγ抗体は、「抗原結合断片」、例えば、ディアボディ、Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv断片、ジスルフィド安定化Fv断片(dsFv)、(dsFv)₂、二特異性dsFv(dsFv-dsFv')、ジスルフィド安定化ディアボディ(dsディアボディ)、単鎖抗体分子(scFv)、scFvダイマー(二価ディアボディ)、1つ若しくは複数のCDRを含む抗体の一部分から形成される多特異性抗体、又は抗原に結合するが完全な抗体構造を含まない任意の他の抗体断片である。かかる実施形態では、抗原結合断片は、親抗体又は親抗体断片(例えば、親scFv)が結合するのと同じIFNγ抗原に結合することが可能である。ある特定の実施形態では、抗原結合断片は、1つ又は複数の異なるヒト抗体由来のフレームワーク領域にグラフトされた特定のヒト抗体由来の1つ又は複数のCDRを含み得る。

上記抗原結合断片のうち、軽鎖及び重鎖可変領域、軽鎖定常領域並びに重鎖の第1の定常領域(CH1)を有する構造であるFabは、1つの抗原結合部位を有する。Fab'は、Fab'が、重鎖CH1ドメインのC末端に、少なくとも1つのシステイン残基を含むヒンジ領域を有するという点で、Fabとは異なる。F(ab')₂は、Fab'のヒンジ領域におけるシステイン残基がジスルフィド結合によって結合される場合に産生される。

Fvは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のみを有する最小の抗体断片であり、Fv断片を産生するための組換え技術は、当該分野で周知である。「単鎖Fv抗体」又は「scFv」は、直接又はペプチドリンカー配列を介して互いに接続された軽鎖可変領域及び重鎖可変領域からなる操作された抗体を指す。二鎖Fvは、重鎖可変領域が非共有結合によって軽鎖可変領域に連結される構造を有し得、単鎖Fvは、一般に、二鎖Fvと同様にダイマー構造を形成し得るが、このとき、重鎖可変領域は、ペプチドリンカーを介して軽鎖可変領域に共有結合されるか、又は重鎖及び軽鎖可変領域は、そのC末端において互いに直接連結される。リンカーは、1〜100個又は2〜50個の任意のアミノ酸を含むペプチドリンカーであり得、その適切な配列は、当該分野で公知である。

抗原結合断片は、プロテアーゼを使用して取得され得(例えば、抗体全体は、Fab断片を得るためにパパインで消化され得、F(ab')₂断片を得るためにペプシンで消化され得る)、又は遺伝子組換え技術をによって調製され得る。

本開示の方法の一部の実施形態では、IFNγ抗体は、多特異性抗体、例えば、二特異性抗体であり得る。一部の実施形態では、多特異性抗体は、少なくとも2つの異なる結合部位を有するモノクローナル抗体であり、結合部位の各々は、異なる抗原に対する結合特異性を有し、そのうち少なくとも1つは、IFNγに特異的に結合する。一部の実施形態では、多特異性抗体は、IFNγに対する特異性並びに免疫調節及び/又は免疫シグナル伝達を媒介する別の抗原に対する特異性を含む二特異性抗体である。二特異性抗体の一部の実施形態では、他の特異性は、PD1、PD-L1、CTLA-4、TIGIT、LAG3、PVRIG、KIR、TIM-3、CRTAM、BTLA、CD244、CD160、LIGHT、GITR、4-1BB、OX40、CD27、TMIGD2、ICOS、CD40、CD47、SIRPa、NKG2D、NKG2A、TNFRSF25、CD33、CEA、Epcam、GPC3、CD200、CD200R、CD73、CD83、CD39、TRAIL、CD226及びVISTAから選択される免疫チェックポイント分子である抗原に対する特異性である。抗IFNγ二特異性抗体の一部の実施形態では、この抗体がそれに対する特異性を有する他の抗原は、PD1、PD-L1及びCTLA-4から選択される。

多特異性抗体を作製するための技術には、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組換え共発現が含まれるがこれに限定されない(例えば、Milstein及びCuello、Nature 305: 537 (1983)、WO93/08829並びにTraunecker他、EMBOJ. 10: 3655 (1991)を参照のこと)。「ノブインホール(Knob-in-hole)」操作もまた、本開示の抗IFNγ抗体で有用な二特異性抗体を生成するために使用され得る。ノブインホール操作のための技術は、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第5,731,168号に記載されている。

一部の実施形態では、本開示の方法において有用なIFNγ抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるために変更させることができる。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、1つ又は複数のグリコシル化部位が創出又は除去されるようにアミノ酸配列を変更することによって実施することができる。例えば、本開示は、V_H領域の76位においてN結合型グリコシル化部位を除去するように改変された配列を有する、例示的なIFNγ抗体2A6_A及び2A6_Qを提供する。

Fc領域に結合された炭水化物が変更され得ることもまた企図される。典型的には、哺乳動物細胞によって産生されるネイティブ抗体は、Fc領域のCH2ドメインの約297位におけるアスパラギン(「N297」)にN結合によって結合された分枝した二分岐オリゴ糖を含む(例えば、Wright他、TIBTECH 15:26〜32 (1997)を参照のこと)。オリゴ糖は、種々の炭水化物、例えば、マンノース、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ガラクトース及びシアル酸、並びに、二分岐オリゴ糖構造の「ステム」中のGlcNAcに結合したフコースを含み得る。一部の実施形態では、抗体のFc領域のオリゴ糖の改変は、特定の改善された特性を有するバリアントを創出し得る。一部の実施形態では、本開示のIFNγ抗体は、親抗体のバリアントであり得、このバリアントは、Fc領域に(直接的又は間接的に)結合されたフコースを欠く炭水化物構造を含む。例えば、かかる抗体中のフコースの量は、約1%〜約80%、約1%〜約65%、約5%〜約65%又は約20%〜約40%であり得る。フコースの量は、MALDI-TOF質量分析によって測定した場合、Asn 297に結合した全ての糖構造(例えば、複雑なハイブリッドの高マンノース構造)の合計に対する、N297における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって、決定することができる(例えば、WO2008/077546を参照のこと)。N297は、Fc領域中の約297位(Fc領域残基のEu番号付け)に位置するアスパラギン残基を指す;しかし、N297は、抗体における軽微な配列バリエーションに起因して、297位の上流又は下流約±3アミノ酸、即ち、294位と300位との間にも位置し得る。

一部の実施形態では、フコシル化バリアントは、改善されたADCC機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第2003/0157108号又は米国特許出願公開第2004/0093621号を参照のこと。「脱フコシル化(defucosylated)」又は「フコース欠損」抗体及びそれらを調製するための関連の方法の例は、例えば、米国特許出願公開第2003/0157108号;米国特許出願公開第2003/0115614号;米国特許出願公開第2002/0164328号;米国特許出願公開第2004/0093621号;米国特許出願公開第2004/0132140号;米国特許出願公開第2004/0110704号;米国特許出願公開第2004/0110282号;米国特許出願公開第2004/0109865号;WO2000/61739;WO2001/29246;WO2003/085119;WO2003/084570;WO2005/035586;WO2005/035778;WO2005/053742;WO2002/031140;Okazaki他、J. Mol. Biol. 336: 1239〜1249 (2004);Yamane-Ohnuki他、Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)に開示されている。

脱フコシル化抗体を産生するために有用な細胞株には、タンパク質フコシル化が欠損したLed 3 CHO細胞(例えば、Ripka他、Arch. Biochem. Biophys. 249:533〜545 (1986);米国特許出願公開第2003/0157108号及びWO2004/056312を参照のこと)、及びノックアウト細胞株、例えば、アルファ-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、FUT8、ノックアウトCHO細胞(例えば、Yamane-Ohnuki他、Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004);Kanda, Y.他、Biotechnol. Bioeng.、94(4):680〜688 (2006);及びWO2003/085107を参照のこと)が含まれる。

一部の実施形態では、本開示の方法において有用なIFNγ抗体は、Fc領域中に1つ又は複数のアミノ酸改変を含み得る(即ち、Fc領域バリアント)。Fc領域バリアントは、1つ又は複数のアミノ酸残基位置においてアミノ酸置換を含むヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のFc領域)を含み得る。本開示の抗IFNγ抗体で有用である、当該分野で公知の広範なFc領域バリアントが、以下に記載される。

一部の実施形態では、IFNγ抗体は、変更されたエフェクター機能を有するFc領域バリアントであることが企図される。一部の実施形態では、変更されたエフェクター機能を有する抗体は、親抗体のエフェクター機能の一部(全てではないが)を有する、減少したエフェクター機能を有する、又はエフェクター機能を有さない(例えば、エフェクターなし)。エフェクターなしのFc領域バリアントは、エフェクター機能(例えば、ADCC)が不必要若しくは有害である及び/又は抗体のin vivo半減期が重要である、特定の適用のためにより望ましい。低減されたエフェクター機能を有する又はエフェクターなしであるFc領域バリアント抗体は、以下のFc領域位置:238位、265位、269位、270位、297位、327位及び329位のうち1つ又は複数においてアミノ酸置換を含み得る (例えば、米国特許第6,737,056号を参照のこと)。かかるFc領域バリアントは、265位、269位、270位、297位及び327位のうち2つ以上においてアミノ酸置換を含み得る。かかるFc領域バリアントはまた、残基265及び297の両方の、アラニンへの置換を含み得る(例えば、米国特許第7,332,581号を参照のこと)。

従って、一実施形態では、本開示は、その必要に迫られている対象に、治療有効量のIFNγ抗体及び薬学的に許容される担体を含む組成物を投与する工程を含む、B型肝炎ウイルス(HBV)感染を処置するための方法を提供する。

従って、例示的な細胞ベースのモデル研究は、IFNγ抗体が慢性HBV感染の増加した割合と関連する細胞ベースの経路を中和できる機構を支持する。言い換えれば、本発明は、IFNγ抗体が、HBVの処置のための改善された方法を提供するために使用することができることを示唆する。

IFNγ抗体組成物を投与するための様式
処置の方法に従う、IFNγ抗体を含む組成物又は製剤を必要に迫られている対象への投与は、HBV感染から対象を保護する及び/又はHBV感染の進行を処置する治療効果を提供する。

本開示の処置の方法の一部の実施形態では、IFNγ抗体を含むIFNγ抗体組成物又は製剤は、薬剤を全身送達する又は所望の標的組織に送達する任意の様式の投与によって、対象に投与される。全身性投与は、一般に、抗体又はその製剤が、対象の循環系に進入し、従って、代謝及び他の同様のプロセスにさらされるような、所望の標的部位、組織並びに臓器中に直接的なもの以外の部位における、対象中への抗体の、任意の様式の投与を指す。

従って、本開示のHBV感染の処置の方法において有用な投与の様式には、注射、注入、滴下注入及び吸入が含まれ得るがこれらに限定されない。注射による投与には、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、心室内、嚢内、眼窩内、心臓内、真皮内、腹腔内(intraperitoneal)、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内(intracerebro spinal)並びに胸骨内の注射及び注入が含まれ得る。

本開示の方法に従う実施形態では、IFNγ抗体は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内(intraabdominal)、嚢内、軟骨内、腔内(intracavitary)、腔内(intracelial)、小脳内、脳室内、結腸内、子宮頸部内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内(intraperitoneal)、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻腔内及び経皮からなる群から選択される少なくとも1つの経路によって、その必要に迫られている対象に投与され得る。一実施形態では、IFNγ抗体は、必要に迫られている対象に静脈内に投与され得る。

一部の実施形態では、IFNγ抗体の製剤は、抗体が腸における不活性化から保護されるように製剤化される。従って、処置の方法は、製剤の経口投与を含み得る。

一部の実施形態では、本開示は、HBV感染の処置のための医薬としての、IFNγ抗体を含む組成物又は製剤の使用を提供する。更に、一部の実施形態では、本開示は、HBV感染の処置のための医薬の製造又は調製における、IFNγ抗体を含む組成物又は製剤の使用もまた提供する。更なる実施形態では、医薬は、その必要に迫られている対象に、有効量の医薬を投与する工程を含む、HBV感染を処置するための方法における使用のためのものである。ある特定の実施形態では、医薬は、有効量の少なくとも1つの更なる治療剤又は処置を更に含む。

更なる実施形態では、医薬は、HBV感染を処置するのに有効な量の医薬を対象に投与する工程を含む、対象におけるHBV感染を処置する際の使用のためのものである。

HBV感染の処置のために、本開示の組成物及び製剤中に含まれるIFNγ抗体の適切な投薬量(単独で、又は1つ若しくは複数の他の更なる治療剤と組み合わせて使用される場合)は、疾患の重症度及び過程、抗体が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか否か、患者に投与された以前の治療、患者の臨床履歴及び抗体に対する応答、並びに担当医の裁量が含まれる因子に左右される。

一般に、本開示の方法において有用な処置レジメンは、必要に迫られている対象の医療関係者によって決定され得る。本開示のIFNγ抗体は、本明細書に記載される組成物及び製剤中に含まれる場合、一度に、又は一連の処置にわたって、患者に適切に投与され得る。単回投与、又は種々の時点にわたる複数投与、ボーラス投与、及びパルス注入が含まれるがこれらに限定されない種々の投薬スケジュールが、本明細書で企図される。

これらの方法の一部の実施形態では、IFNγ抗体を含む組成物は、必要に迫られている対象に、1日に1回よりも多く、1日に少なくとも1回、1週間に少なくとも1回又は1ヶ月に少なくとも1回投与され得る。

HBV感染の型及び重症度により、本開示の製剤中の約1μg/kg〜15mg/kgのIFNγ抗体が、例えば、1回又は複数の別々の投与によるものであれ、連続的な注入によるものであれ、ヒト対象への投与のための最初の候補投薬量である。一般に、抗体の投与される投薬量は、約0.05mg/kg〜約10mg/kgの範囲である。一部の実施形態では、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg若しくは10mg/kg(又はそれらの任意の組み合わせ)の1つ又は複数の用量が、患者に投与され得る。

投薬量の投与は、対象の状態に左右され、数日間又はそれよりも長くにわたって持続され得、例えば、投与は、当該分野で公知の方法によって決定した場合、HBV感染が十分に処置されるまで、継続し得る。一部の実施形態では、最初のより高い負荷用量が投与され得、その後、1回又は複数のより低い用量が投与され得る。しかし、他の投薬レジメンが有用であり得る。投薬量の投与の治療効果の進行は、従来の技術及びアッセイによってモニタリングされ得る。

従って、本開示の方法の一部の実施形態では、IFNγ抗体の投与は、約1mg/kg〜約100mg/kgの1日投薬量を含む。一部の実施形態では、IFNγ抗体の投薬量は、少なくとも約1mg/kg、少なくとも約5mg/kg、少なくとも約10mg/kg、少なくとも約20mg/kg又は少なくとも約30mg/kgの1日投薬量を含む。

他の治療剤との併用処置方法
本発明に従う実施形態では、この方法は、少なくとも1つの更なる治療剤を投与する工程を更に含み得る。例えば、更なる治療剤は、その必要に迫られている対象に、IFNγ抗体組成物と組み合わせて投与され得 - 例えば、IFNγ抗体組成物と同時に;IFNγ抗体組成物の投与の前に;又はIFNγ抗体組成物の投与の後に、投与され得る。一部の実施形態では、更なる治療剤は、HBV感染のための更なる処置、又はHBV感染と関連する疾患若しくは状態のための処置を含み得る。この併用処置方法では、IFNγ抗体組成物を治療剤と組み合わせて投与することによって、治療剤の有効性が改善され得ることが企図される。理論に束縛されないが、治療有効量のIFNγ抗体組成物及び必要に応じた更なる治療剤を投与する工程の後に、HBVに対する免疫応答が、必要に迫られている対象において誘導若しくはブーストされ得る;HBVに関するセロコンバージョンが誘導され得る;又は必要に迫られている対象におけるHBVのウイルス負荷が、実に検出不能なレベルまで低減され得る、と考えられる。更に、ブーストされた免疫応答は、免疫系の活性を更にモジュレートする抗体又はサイトカインの産生を含み得る。

一実施形態では、更なる治療剤がHBVワクチンである、少なくとも1つの更なる治療剤を投与する工程を含む方法が実施される。本明細書の他の場所に記載されるように、併用処置方法において有用なHBVワクチンには、予防のためのHBVワクチン、並びにHBVに既に感染した対象の処置のための治療的ワクチンが含まれ得る。一部の実施形態では、治療的ワクチンは、DNAワクチン、ウイルスベクターワクチン、タンパク質ワクチン及びマルチペプチドワクチンから選択される。

本明細書の他の場所に記載されるように、阻害性免疫チェックポイント分子は、一部のウイルス感染並びにがんの処置のための標的である。従って、一実施形態では、更なる治療剤が阻害性免疫チェックポイント分子を標的化する抗体である、少なくとも1つの更なる治療剤を投与する工程を含む方法が実施される。一部の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子は、PD1、PD-L1及びCTLA-4から選択される。一部の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子を標的化する抗体は、抗PD1、抗PD-L1及び抗CTLA-4から選択される。

本発明に従う他の実施形態では、更なる治療剤は、治療剤;画像化剤;細胞傷害性剤;血管新生阻害剤;キナーゼ阻害剤;共刺激分子ブロッカー;接着分子ブロッカー;抗サイトカイン抗体又はその機能的断片;メトトレキサート;シクロスポリン;ラパマイシン;FK506;検出可能な標識又はレポーター;TNFアンタゴニスト;抗リウマチ薬;筋弛緩薬;麻薬;非ステロイド性抗炎症薬物(NSAID);鎮痛薬;麻酔薬;鎮静薬;局所麻酔薬;神経筋ブロッカー;抗菌薬;抗乾癬薬;コルチコステロイド;タンパク質同化ステロイド;エリスロポエチン;免疫化;免疫グロブリン;免疫抑制薬;成長ホルモン;ホルモン補充薬物;放射性医薬品;抗うつ薬;抗精神病薬;刺激物質;喘息薬物療法;ベータアゴニスト;吸入ステロイド;エピネフリン又はそのアナログ;サイトカイン;及びサイトカインアンタゴニスト;免疫調節剤からなる群から選択され得る。

一部の実施形態では、更なる治療剤は、HBV侵入阻害剤、ウイルスRNA阻害剤、遺伝子編集剤、HBsAg分泌阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、インターフェロン、ウイルス侵入阻害剤、ウイルス成熟化阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、カプシドアセンブリ阻害剤/モジュレーター、cccDNA阻害剤、FXRアゴニスト、microRNA、TLRアゴニスト及び免疫調節薬から選択される。

一部の実施形態では、更なる治療剤は、エンテカビル(Baraclude)、テノホビル(Viread)、ラミブジン(Epivir)、アデホビル(Hepsera)及びテルビブジン(Tyzeka)、インターフェロンアルファ-2b並びにペグインターフェロン(pegyinterferon)アルファ-2aから選択される。

本開示の種々の特色及び実施形態は、限定ではなく例示を意図する以下の代表的な実施例で説明される。当業者は、具体的な実施例が、その後に続く特許請求の範囲中に、より完全に記載される本発明の例示に過ぎないことを、容易に理解する。本出願に記載される全ての実施形態及び特色は、中に含まれる全ての実施形態と相互交換可能かつ組み合わせ可能であると理解すべきである。

(実施例1)
dNTM患者におけるHBV及びIFNγ自己抗体の分析
この実施例は、IFNγ自己抗体がHBVのより低い有病率と関連することを示す、播種性非結核性抗酸菌(dNTM)感染を有する患者の分析を示す。

研究方法論:血液サンプルを、dNTM感染を有する44人の患者から得た。患者は、約1921年と1981年との間に誕生し、58.7歳の平均年齢を有した。血液サンプルを、Lin他(「Identification of a major epitope by anti-interferon-γ autoantibodies in patients with mycobacterial disease」、Nat. Med. (2016) 22(9):994〜1001)によって記載されるように、全血IL-12p40発現を使用して、IFNγ自己抗体の存在について分析した。HBsAg、HBeAg、抗HBs Ab、抗HBc Abの血清レベルを決定した。

結果:Table 2(表2)に示されるように、IFNγ自己抗体を有する44人の患者のうち2人のみ(EIP31及びEIP44)が、HBsAgについて陽性と試験され、AASLD B型肝炎ガイダンスに基づいて、慢性HBV感染を有すると診断された。

Table 2(表2)の結果は、IFNγ自己抗体を有する44人の患者の集団における慢性HBVの有病率が、4.5%(2/44)に過ぎなかったことを示している。対照的に、公開された研究は、1920年〜1983年の間に誕生した台湾集団における慢性HBVの有病率が、およそ15〜20%であったことを示している(J Formos Med Assoc. 2007年2月;106(2):148〜55)。これらの結果の更なる比較分析を、フィッシャー直接検定を使用して実施したところ、P<0.5のP値で、0.0251の直接検定統計値が得られた。この統計分析は、慢性HBV感染もまた有する、IFNγ自己抗体を有するdNTM患者の割合が、一般的な集団における慢性HBV感染の割合よりも有意に低いことを示唆している。

理論に束縛されないが、上記結果は、対象におけるIFNγ自己抗体の存在が、慢性HBV感染の減少した割合と強く相関することを強く示唆している。従って、この結果は、患者へのIFNγ抗体の投与が、HBV感染の予防又は処置を促進し得ることを更に支持している。HBV感染を予防又は処置するためのIFNγ抗体の使用への更なる支持は、本明細書の更なる実施例に開示される細胞ベースの及び動物モデル研究によって提供される。

(実施例2)
HBV患者集団におけるIFNγシグナル伝達レベルの分析
この実施例は、HBV患者及び健康なドナー集団の肝臓におけるCXCL9、CXCL10、CXCL11及びSTAT1の遺伝子発現レベルの分析を示す。CXCL9、CXCL10、CXCL11及びSTAT1遺伝子の増加した発現は、増加したIFNγシグナル伝達と関連することが公知である。

材料及び方法:Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)を、GEOデータベースから取得した肝臓マイクロアレイデータを使用して実施した。データは、8つの健康な肝臓サンプル(チップID:GSM138595、GSM138596、GSM2291960、GSM2291961、GSM2291962、GSM2291963、GSM2291964、GSM2291965)及び7つのHBV感染肝臓サンプル(GSM1629354、GSM1629355、GSM1629356、GSM1629357、GSM1629358、GSM1629359、GSM1629360)を含んだ。全てのマイクロアレイデータを遺伝子レベル情報にまとめ、プローブ名を遺伝子記号に変換した。次いで、発現データをlog2変換し、log2変換した値を使用して、CXCL9、CXCL10、CXCL11及びSTAT1の発現レベルにおける変化倍率を計算した。

結果:CXCL9、CXCL10、CXCL11及びSTAT1は全て、慢性HBV患者の肝臓においてより高い発現(log変化倍率>1.5)を示し、これは、増加したIFNγシグナル伝達が慢性HBV感染と関連することを示している。

(実施例3)
HBV感染の処置のためのIFNγ抗体の調製
この実施例は、HBV感染を処置するための本開示の方法において有用な種々のIFNγ抗体の調製を示す。

A.蛍光活性化細胞選別による単一ヒトB細胞の単離
末梢静脈血サンプルを、治験審査委員会(IRB)が審査したプロトコールに従って、インフォームドコンセントにサインした後に、マイコバクテリア疾患を有するヒト患者から収集した。単核細胞は、製造業者の指示に従ってFicoll-Paque(GE Healthcare社)密度勾配遠心分離によって精製した後に、患者の末梢静脈血から単離された。精製された単核細胞を、1×10⁷細胞/mLの濃度で、FACS緩衝液(PBS中1%のFBS、2mMのEDTA、0.1%のNaN3)の5%正常マウス血清(Jackson ImmunoResearch社)中に再懸濁し、30分間氷上に置いた。その一方で、細胞に、20μg/mLの抗ヒトCD119抗体(BioLegend社)を添加した。次いで、細胞を、FACS緩衝液によって洗浄し、1×10⁶細胞以内で1μgの組換えIFNγタンパク質(R&D systems社)を添加し氷上で20分間置いた。選別プロセスの前に、細胞を、氷上で30分間、抗ヒトIgG PE(BD Bioscience社)、抗ヒトIgD APC(BD Bioscience社)、抗ヒトCD3 PE-Cyanine7(eBioscience社)、抗ヒトCD19 APC-eFluor 780(eBioscience社)、抗ヒトIFNγ FITC(BD Bioscience社)、及びDNAマーカーとしての7-アミノアクチノマイシンD(Sigma社)で染色した。IFNγへの、個々の単一のB細胞の結合を、CD19⁺IgG⁺CD3^-IgD^-FITC⁺でゲートし、次いで、細胞を各々、18μL/ウェルのRT-溶解緩衝液(これは、200ngのランダムヘキサマープライマー(Thermo Scientific社)、10mMの各ヌクレオチドdNTP-ミックス1μL(Thermo Scientific社)、0.5%v/vのIgepal CA-630(Sigma社)及び40UのRibolock(Fermentas社)を含む)を含む96ウェルプレートの個々のウェル中に選別し、それによって、単一のB細胞の総RNAを有する溶解物混合物を得た。96ウェルプレートを、アルミニウム密封テープ(Corning社)で密封し、-80℃で即座に貯蔵した。

B.単一細胞RT-PCR及びIg遺伝子増幅
RT-PCRプロトコールを手動で実施した。cDNAを、各ウェル中に、DEPC処理した水中に2μL(50U)のMaxima H minus逆転写酵素(Thermo Scientific社)を含む上記96ウェルプレート中、20μL/ウェルの総体積で合成した。各B細胞(「2A6」及び「2B6」B細胞と称する)の総RNAを、逆転写(RT)反応に供したが、この反応は、アニーリングステップにおいて42℃で10分間、事前プライマー伸長ステップにおいて25℃で10分間、重合ステップにおいて50℃で45分間、酵素不活性化ステップにおいて85℃で5分間実施した。こうして形成された第1鎖cDNAを、-20℃で貯蔵した。

各B細胞のIgH、Igλ、Igκ V遺伝子転写物を、ネステッドPCRによって増幅し、各ネステッドPCRには、鋳型として、上のように得た第1鎖cDNA 2.5μLから開始する第1ラウンドのPCR、次いで、鋳型として、第1ラウンドのPCRから得た未精製の第1ラウンドのPCR産物2.5μLを使用する第2ラウンドのPCRが関与した。全てのPCR反応を、0.5μMのプライマーミックスを含む、1反応当たり25μLの総体積で実施した。簡潔に述べると、200μMの各dNTP(Thermo Scientific社)及び約4.4×10^-7のエラー率を有するPhusion High-Fidelity DNAポリメラーゼ(Thermo Scientific社)0.5U。全てのPCR反応を、DEPC処理した水を用いて実施した。ネステッドPCR反応の第1ラウンド及び第2ラウンドの各々を、変性ステップにおいて98℃で10秒間、アニーリングステップにおいて65℃で15秒間、伸長ステップにおいて72℃で30秒間で、35サイクルにわたって実施した。特定の遺伝子のPCRに使用したフォワードプライマー及びリバースプライマーのミックスは、Table 3(表3)にまとめられる。

使用したフォワードプライマー及びリバースプライマーのヌクレオチド配列は、Table 4(表4)及び添付の配列表に記載される。

C.Ig V遺伝子配列分析
各B細胞のV_H、V_κ及びV_λ鎖PCR産物のアリコート(上述の第2ラウンドのPCRから得た)を、製造業者の指示に従ってQIAquick PCR精製キット(Qiagen社)を用いて精製し、それぞれ、配列番号64、66及び69によって同定されたプライマー(Table 4(表4)を参照のこと)を用いて配列決定した。取得された配列を、IMGT(登録商標)、国際ImMunoGeneTics情報システム(登録商標)(http://www.imgy.org)によって分析して、最も高い同一性を有する生殖系列V(D)J遺伝子セグメントを同定した。

取得されたIg V遺伝子配列によってエンコードされる抗体の重鎖可変領域(V_H)及び軽鎖可変領域(V_L)のアミノ酸配列のアラインメントは図1に示され、それらのフレームワーク領域(FR)及び相補性決定領域(CDR)もまた示される。以下に記載されるように、これら2つの抗体は、「2A6」及び「2B6」と命名した。アミノ酸配列もまた、添付の配列表に提供される。

D.発現ベクタークローニング
配列決定後、遺伝子特異的プライマーを、ネステッドPCRの反応条件と類似の反応条件下で更なるPCR反応を実施するために、最も高い同一性を有するV又はJセグメントに従い、Table 5(表5)から選択したが、この反応では、各B細胞のV_H、V_κ及びV_λ鎖PCR産物(上記第2ラウンドのPCRから得た)を、鋳型として使用した。

2A6抗体及び2B6抗体をエンコードするベクターを調製するために使用した、選択されたフォワードプライマー及びリバースプライマーは、Table 6(表6)に示される。

2A6-V_H、2A6-V_L、2B6-V_H及び2B6-V_Lの各々についてのPCR産物を、上記のように精製し、その後、図2に示されるヒトIgG₁λ発現ベクター(Academia Sinica、TaiwanのTse-Wen Chang博士からの厚意による提供)中に組み換えた。2つの発現ベクター「2A6」及び「2B6」に加えて、2B6-V_H及び2A6-V_Lを有する抗体の発現のための、「BA」と命名したベクターもまた構築した。

クローニングされた遺伝子の、ヒトIgG₁λ発現ベクター中への組換えを、GeneArt(登録商標)Seamless Cloning and Assembly Enzyme Mix(Invitrogen社)によって実施した。コンピテントな大腸菌(E. coli)を、5μLの組換え産物で42℃で形質転換した。形質転換された大腸菌のコロニーを、それぞれ、フォワードプライマーとして、Table 7(表7)に示されるpIgG1κ-screen+(配列番号117)又はpIgG1λ-screen+(配列番号118)を使用し、リバースプライマーとしてpIgG1-screen-(配列番号119)を使用するPCRによって、スクリーニングした。

予想されたサイズ(約1,800bp)のPCR産物を、元のPCR産物との同一性の確認のために配列決定した。プラスミドDNAを、100μg/mLのアンピシリンを含むLuria-Bertaniブロス中37℃で16時間成長させた形質転換された大腸菌の細菌培養物3mLから、QIAprep(登録商標)Spinカラム(Qiagen社)を使用して単離した。

E.グリコシル化変異体2A6_A及び2A6_qのクローニング
哺乳動物細胞における抗体2A6の発現は、ゲル電気泳動の際に2つの重鎖バンドの観察を生じることが見出された(データ示さず)。2A6は、76位において、その可変領域中にN結合型グリコシル化部位を有することが注目された。N結合型グリコシル化部位の存在を、PNGase F消化アッセイによって確認した。PNGase F消化後、2A6は、N結合型炭水化物が除去されたことを示す、低減されたサイズを示した(データ示さず)。この結果は、PNGase F処理前に観察された重鎖の2つのバンドのうちの下の方が、N結合型グリコシル化部位の部分的グリコシル化に起因したことを示唆した。このN結合型部分的グリコシル化部位は、2A6の大規模産生を、分子均一性の欠如に起因して、問題のあるものにする可能性がある。2A6の前述のN結合型グリコシル化部位を除去するための点変異を設計し、実施した。

部位特異的グリコシル化変異体プラスミドを生成するために、部位特異的変異誘発を、NEB社のQ5ポリメラーゼを使用して実施した。各構築物の変異誘発に使用したオリゴヌクレオチドは、以下の通りである(センス配列):c2A6_Q 5'-CGTTTCTAGAGACAACGCCCAGAATTCGGTATATCTCCACA-3'(配列番号169)及びc2A6_A 5'-CGTTTCTAGAGACAACGCCGCCAATTCGGTATATCTCCAC-3'(配列番号170)。

次いで、変異体配列を、各構築物のDNA配列決定によって検証した。前述の点変異後、抗体2A6の重鎖可変領域の76位におけるアスパラギンアミノ酸は、アスパラギン(N)からアラニン(A)又はグルタミン(Q)に変異した。これら2つのバリアント抗体を、「2A6_A」(N76A変異)及び「2A6_Q」(N76Q変異)と命名した。抗体2A6_A及び2A6_Qの重鎖V_H領域は、それぞれ、配列番号164及び配列番号165を含む。

SDS-PAGE分析は、2A6_A及び2A6_Qの両方の重鎖が、2A6について観察された2つのバンドとは異なり、より小さい分子質量のくっきりした単一のバンドのみを示したことを示し(データ示さず)、これは、N結合型グリコシル化部位が首尾よく破壊されたことを示唆している。質量分析により、それぞれ2A6_A及び2A6_Q中に導入されたN76A及びN76Q変異が、グリコシル化シグナルの喪失を生じたことが更に確認された。

F.組換えIFNγ抗体産生
FreeStyle(商標)293-F細胞(Thermo Scientific社、R79007)を、1×10⁶細胞の濃度で、標準的な条件下で、FreeStyle(商標)293発現培地(Gibco社、12338018)を含む250mLフラスコ中で培養した。指数関数的に増殖しているFreeStyle(商標)293-F細胞(1.5〜2×10⁶細胞)の一過的トランスフェクションを、トランスフェクション試薬として、25kDaの平均分子量を有する直鎖ポリエチレンイミン(PEI)(Polysciences社、Warrington、Pa)、及び合計88μgのプラスミドDNAによって実施した。トランスフェクション後、細胞を3日間培養し、培養培地を回収した。培養培地を3000rpmで10分間遠心分離して、FreeStyle(商標)293-F細胞デブリを除去し、その後、得られた上清を収集し、0.45μmフィルターを介して濾過した。

G.組換え抗体精製
上記のように取得して得られた上清を、Protein A Sepharose Fast Flowビーズ(GE Healthcare社、17-1279-01)を用いて引き続いて精製して、組換え抗体を得た。簡潔に述べると、80mLの上清に、80μLのProtein A Sepharose Fast Flowビーズを添加し、2つの50mlチューブ中に均等にアリコート化し、これを、回転下で4℃で24時間インキュベートした。次いで、これらのチューブを、3000rpmで10分間遠心分離し、その後、得られた上清を除去し、ビーズをPBSで平衡化した。平衡化されたビーズを、0.1Mのグリシン(pH3.0)で溶出させ、溶出液を、1MのTris(pH8.0)を含むチューブ中に収集し、PBS緩衝液に対して透析して、それぞれ、2A6、2B6、2A6_A、2A6_Q及びBA抗INF-γ mAbを含むモノクローナル抗体を採得た。

明確さのために、これらのモノクローナル抗体の各々のV_H鎖及びV_L鎖上のCDRを、それぞれTable 8(表8)及びTable 9(表9)にまとめる。CDRは、配列アノテーションによって、並びに、例えば、www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/index.html及びwww.ncbi.nlm.nih.gov/igblastに記載されるインターネットベースの配列分析によって、Kabatシステム(Wu, T. T.及びKabat, E. A.、1970 J. Exp. Med. 132: 211〜250)及びIMGTシステム(Lefranc M.-P.他、1999 Nucleic Acids Research、27、209〜212)に基づいて同定した。以下のTable 8(表8)では、「K:」の後ろのCDRは、Kabatシステムに基づき、「I:」の後ろのCDRは、IMGTシステムに基づく。

(実施例4)
IFNγに結合しそれを遮断する際のIFNγ抗体の特徴の決定
この実施例は、種々の標準的なアッセイにおける本開示のIFNγ抗体のIFNγ結合及び遮断の機能的特徴を示す。

A.Bio-layer Interferometry(BLI)分析。
材料及び方法:抗体結合動的速度定数(k_a及びk_d)を、Bio-Layer Interferometry(BLI、ForteBio社Octet RED96)によって測定した。AHC(Anti-hIgG Fc Capture)バイオセンサー(ForteBio社)を使用してBLIアッセイを実施して、各IFNγ抗体(750ng/mL)を捕捉して、0.5nmのシフトを獲得し、次いで、バイオセンサーを、無菌水中に0.1%のウシ血清アルブミン(BSA)、0.1%のTween-20、250mMのNaCl、2.7mMのKCl、10mMのNa₂HPO₄及び1.8mMのKH₂PO₄を含むランニング緩衝液中、変動する濃度(即ち、0、0.625、1.25、2.5、5、10、20及び40nM)の組換えヒトIFNγタンパク質(R&D systems社、285-IF-100)中に浸した。速度定数を、5分間の会合及び15分間の解離の相互作用時間で、結合応答の曲線あてはめ分析(1:1 Langmuirモデル)によって計算した。

結果:典型的な結合曲線が、AHCバイオセンサー上に固定化したIFNγ抗体上に、異なる濃度の組換えヒトIFNγ(0、0.625、1.25、2.5、5、10nM)を通過させることによって得た。観察されたIFNγ抗体結合動的速度定数(K_a及びK_d)、並びに平衡解離定数(K_D=K_d/K_a)は、Table 9(表9)に示される。IFNγ抗体2A6及び2B6は各々、K_D値<10^-10Mを有し、これは、ヒトIFN-γに対する高い親和性を示す。

別の実施形態では、IFNγ抗体AMG811(米国特許第7,335,743号に記載され、そこに記載の通り調製した)、2A6、2B6、2A6_A、2A6_Q、AB及びBAを、上記のように、IFNγ結合についてアッセイした。Table10(表10)に示されるように、これらのIFNγ抗体は全て、K_D値<10^-10Mで、匹敵するIFN-γ結合機能を示す。

B.HLA-DR発現。
材料及び方法:2×10⁵のTHP-1細胞(BCRC社60430)を、10%のFBS及び1%のペニシリン/ストレプトマイシンを補充したRoswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640培地(Gibco社、11875-093)100μL中で培養し、次いで、異なる濃度(即ち、0.017、0.05、0.15、0.45、1.37、4.11、12.34、37.03、111.1、333.3、1000、3000、5000及び10000ng/mL)のIFNγ抗体2A6及び2B6で30分間処理した。処理されたTHP-1細胞を、2ng/mLの組換えヒトIFN-γタンパク質で刺激し、インキュベーター(37℃、5%CO₂)中で24時間カルチベートした。未刺激のTHP-1細胞を対照として使用した。その後、刺激したTHP-1細胞及び未刺激のTHP-1細胞を、HLA-DR-PE抗体(BD Pharmigen(商標)社)で染色し、次いで、暗中で氷上に30分間置いた。染色した細胞を、2mLのPBSで洗浄し、500μLのPBS中に再懸濁した。染色された細胞の蛍光強度を、FACSVerseフローサイトメーターで獲得し、FACSuiteソフトウェアで分析した。各抗体についてのHLA-DR発現の阻害パーセンテージは、以下の式によって得られる:
A=(B/C)×100
式中、A=HLA-DR発現の阻害パーセンテージ;B=刺激した細胞についての蛍光強度の中央値;C=未刺激の細胞についての蛍光強度の中央値。

結果:試験したIFN-γ抗体2A6及び2B6は、HLA-DR発現の用量依存的阻害を示した。2A6及び2B6について決定されたIC₅₀(ng/mL)値は、それぞれ、3.4及び3.5であった。上記結果は、本開示の抗体が、IFN-γ媒介性活性を有効に阻害することができ、IFN-γ媒介性症候群の処置において使用され得ることを示した。

C.IFNγ抗体のELISAアッセイ。
材料及び方法:透明ポリスチレン96ウェル平底プレート(Nunc)を、1ウェル当たり重炭酸緩衝液(pH9.6)中100μLの組換えヒトIFN-γタンパク質(2μg/mL)又はBSA(2μg/mL)でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートを、0.05%のTween 20を含むリン酸緩衝食塩水(PBS)を使用して3回洗浄し、次いで、PBS中5%のヒト正常血清アルブミン(Aventis社)で25℃で2時間ブロッキングした。プレートを、0.05%のTween 20を含むPBSを使用して再度洗浄し、その後、IFNγ抗体1E8、2F2、2A6、2B6、AB及びBAの各々を、1μg/mL及び0.1μg/mLの2つの異なる濃度で、組換えヒトIFN-γタンパク質との結合のためにプレートのウェル中に添加し、その後、25℃で2時間反応させた。プレートを、0.05%のTween 20を含むPBSを使用して徹底的に洗浄し、次いで、Fc特異的アルカリホスファターゼコンジュゲートしたAffiniPureヤギ抗ヒトIgG(Cappel社)を、1:2500の希釈率で添加した。プレートを、37℃で90分間置き、次いで、0.05%のTween 20を含むPBSを使用して5回洗浄した。p-ニトロフェニルリン酸(pNPP)溶液(100μL/ウェル)を添加した後、プレートを、37℃で30分間置いた。VICTOR X3 Multilabel Plate Reader(PerkinElmer社)を用いて、吸光度をOD₄₀₅nmにおいて決定した。

結果:プレートウェルの405nmにおける吸光度(OD₄₀₅)は、試験したIFNγ抗体の全てが、より高い濃度(1μg/mL)で、より低い濃度(0.1μg/mL)よりも強い吸光度を示したことを示した。更に、IFNγ抗体は、BSAに結合せず、これは、IFNγ抗体がヒトIFNγに特異的に結合することを示している。

D.ビオチン化IFN-γを使用した、抗IFN-γ抗体のELISAアッセイ。
材料及び方法:組換えヒトIFNγ(R&D systems社285-IF-100)及びカニクイザルIFNγ(R&D systems社961-RM-025)を、キットマニュアル(EZ-Link NHS-LC-Biotin;Thermo社#21336)に従ってビオチン化し、それぞれ、ストレプトアビジンコーティングしたプレートに結合させた。室温で1〜2時間インキュベートした後、プレートを、300μLの洗浄緩衝液で3回洗浄した。IFNγ抗体AMG811、2A6、2A6A、2A6Q、2B6、AB及びBAの段階希釈を、ウェルに添加した。室温で1〜2時間のインキュベーション後、プレートを、300μLの洗浄緩衝液で3回洗浄した。HRP抗ヒトIgGを、室温で各ウェルに適用し1時間インキュベーションした。洗浄後、プレートを、TMB基質で発色させ、OD_450〜650下で分析した。

結果:図3Aに示されるように、試験したIFNγ抗体の全てが、ヒトIFNγに対する強い結合親和性を示した。図3Bに示されるように、IFNγ抗体2A6、2A6A、2A6Q、2B6、AB及びBAは、ヒトIFNγへのそれらの結合よりも低い親和性でではあるが、アカゲザル/カニクイザルIFNγとの交差反応性もまた示した。しかし、AMG811は、アカゲザル/カニクイザルIFNγとの交差反応性を示さなかった。

E.IFN-γ中和活性の細胞ベースのアッセイ。
材料及び方法:pGL4[luc2P/GAS-RE/Hygro(Promega社#CS179301)を発現するルシフェラーゼレポーターHeLa安定細胞株を使用して、IFNγ抗体AMG811、2A6、2A6A、2A6Q、2B6及びBAの中和活性を測定した。簡潔に述べると、HeLa細胞株を、8×10³細胞/ウェルで96ウェル白色プレート中にプレートした。細胞を、1ng/mlのIFNγ及び異なる濃度のIFNγ抗体で18時間処理した。ルシフェラーゼ活性を、ONE-Glo(商標)Luciferase Assay System(Promega社#E6110)を使用して分析した。

結果:図4に示されるように、試験したIFNγ抗体の全ては、IFNγの活性を中和することができ、産業又は医薬適用のために十分な中和活性を示している。

F.IFNγ抗体中和活性の全血アッセイ。
材料及び方法:カルメット・ゲラン桿菌(Bacillus Calmette-Guerin)(BCG)によるワクチン接種を受けたことがある健康なボランティアからの全血を、10mLのヘパリン化チューブ中に収集した。全血の20μLサンプルを、96ウェルマイクロタイタープレートの丸底ウェル中、BCG+IL12(20ng/ml)あり又はなしで、80μLのRPMI 1640培養培地に添加した。抗IFNγ抗体を、BCG+IL12の前に、1μg/mlで培養物に添加した。マイクロタイタープレートを、37℃、5% CO₂で48時間インキュベートした。インキュベーション後、CXCL9を、CXCL9 ELISAキット(R&D systems社DCX900)を使用して測定した。CXCL10を、CXCL10 ELISAキット(Biolegend社439905)を使用して測定した。希釈倍数による補正後のサイトカインレベルを示した。ヒトIgG1アイソタイプ対照を、この実験において陰性対照として使用した。予想通り、ヒト全血サンプルは、高レベルの、IFNγ、並びにその産生がIFNγによって調節されることが公知のCXCL9及びCXCL10を産生した。IFNγ抗体による内因性IFNγ活性の阻害は、CXCL9及びCXCL10の産生も遮断する。

結果:図5A及び図5Bに示される結果によって示されるように、IFNγ抗体AMG811、2A6、2A6A、2A6Q、2B6及びBAは、内因性IFN-γを中和することによって、CXCL9及びCXCL10の産生を有効に阻害した。

(実施例4)
TCIRの発現に対するIFNγ抗体の中和効果の、THP-1細胞ベースの研究
延長されたIFNγシグナル伝達は、PD-1のリガンド(PD-L1)、TIM3のリガンド(ガレクチン-9)及びLAG3のリガンド(MHCクラスII)を含む、T細胞阻害性受容体(TCIR)のリガンドの発現を誘導することが以前に示されている(例えば、Benci他、Cell. 2016年12月1日;167(6):1540〜1554を参照のこと)。この誘導は、免疫チェックポイント遮断及び疲弊したT細胞に対する抵抗性をもたらす。

この実施例は、TCIRリガンドHLA-DR及びPD-L1の発現に対するIFNγ抗体の中和効果を実証する、細胞ベースのモデル研究を示す。

材料及び方法:THP-1細胞を、ATCCの指示に従って培養した。中和アッセイのために、500μLのRPMI-1640中40ng/mlのIFNγを、異なる量(0、80、400、2000ng/ml)の6つの異なるIFNγ抗体(「AMG811」、「BA」、「2A6」、「2A6_A」、「2A6_Q」、「2B6」)と共に10分間インキュベートし、この混合物を、4×10⁵細胞(500ul)に添加した。37℃のインキュベーター中で72時間のインキュベーション後、細胞を、PE抗ヒトPD-L1抗体(Biolegend社329706)又はFITC抗ヒトHLA-DR抗体(Biolegend社327006)で染色し、暗中氷上で30分間インキュベートした。細胞を、2mlのFACS緩衝液で2回洗浄し、300μlのFACS緩衝液中に再懸濁した。データを、FACSCaliburフローサイトメーターで獲得した。

結果:図6A及び図6Bに示されるように、IFNγで刺激したTHP-1細胞は、TCIRリガンドHLA-DR及びPD-L1を発現する。しかし、6つの中和IFNγ抗体AMG811、BA、2A6、2A6_A、2A6_Q又は2B6のいずれかによるTHP-1細胞の処理の際に、THP-1細胞は、TCIRリガンドの発現における有意な低減を示した。更に、IFNγ抗体は、HLA-DR及びPD-L1発現の低減において、用量依存的応答を誘導した。

(実施例5)
IDO活性に対するIFNγ抗体の中和効果の、THP-1細胞ベースの研究
インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)は、活性化されたエフェクターT細胞によって生成される炎症シグナル、例えば、IFNγ誘導性T細胞疲弊に応答して上方調節されることが以前に示されている(例えば、Munn他、J Clin Invest. 2007年5月1日; 117(5): 1147〜1154;Munn他、J Exp Med. 2013年7月1日;210(7):1389〜1402;Munn他、Cell Rep. 2015年12月22日;13(11):2470〜2479を参照のこと)。IDOは、エフェクターT細胞を阻害し、免疫抑制性微小環境に更に寄与するようにTregを活性化する。T細胞を抑制し、局所Treg媒介性免疫抑制を増強することによって、増加したIDO発現は、免疫寛容原性環境を促進する。

この実施例は、THP-1細胞におけるIFNγ誘導されるインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)活性に対するIFNγ抗体の中和効果を実証する、細胞ベースのモデル研究を示す。

材料及び方法:THP-1細胞を、ATCCの指示に従って培養した。3×10⁶細胞を、10%のFBS及び1%のペニシリン/ストレプトマイシンを補充した培地4mL中に播種した。細胞を、0、10、20ng/mlのIFNγで48時間刺激した。中和アッセイのために、IFNγを、細胞に添加する前に、抗IFNγ mAb、2A6_Q又は2B6と共に最初にインキュベートした。培養物中の抗IFNγ mAbの最終濃度は、2μg/mLであった。37℃で48時間のインキュベーション後、細胞を回収し、IDO1 Activity Assay Kitのマニュアルに従って、150μlの溶解緩衝液中で溶解させた。溶解物のIDO活性を、IDO Activity Assay Kit(Biovision社K972)を使用して決定した。IDO活性のデータを、スチューデントt検定を用いて分析した。

結果:図7に示されるように、漸増量のIFNγ(0、10又は20ng/mL)によるTHP-1細胞の刺激により、漸増量のIDO比活性が生じた。しかし、中和IFNγ抗体2A6_Q又は2B6によるTHP-1細胞の更なる処理は、いずれのIFNγ刺激もなしに観察されたおよそのレベルまで、IDO比活性を有効に低減させた。

(実施例6)
HeLa-GAS細胞株アッセイにおけるIFNγ抗体のIFNγ遮断効果
この実施例は、IFNγ活性化部位(GAS)ルシフェラーゼレポーターHeLa細胞アッセイにおけるIFNγ抗体のIFNγ遮断効果を示す。HeLa-GASルシフェラーゼレポーター細胞アッセイは、IFNγ活性化部位の転写制御下でルシフェラーゼレポーターを発現する、安定にトランスフェクトされたHeLa細胞株を利用する。

材料及び方法:IFNγ抗体2A6、2B6、2A6Q及び2C10を、実施例3に記載されるように調製した。IFNγ抗体NI0501(米国特許第7700098号)、フォントリズマブ(米国特許第6329511号)及びAMG811(米国特許第7335743号)をエンコードする開示された遺伝子配列を合成し、ヒト発現ベクター中にクローニングした。pGL4[luc2P/GAS-RE/Hygro]ベクター(CS179301;Promega社、Madison、WI、USA)を発現した安定なHeLaレポーター細胞株(HeLa-GAS)を生成した。HeLa-GAS細胞をプレートし、96ウェル培養プレート中で8000細胞/ウェルで成長させた。6つの抗体の段階希釈を、IFNγの存在下で調製した。100μLのIFNγ抗体/IFNγ混合物を、事前プレートした細胞に添加したところ、1ng/mLのIFNγによるHeLa-Gas細胞の刺激が生じた。18時間のインキュベーション後、ONE-Glo(商標)試薬(Promega社、Madison、WI、USA)を各ウェルに添加し、もう3分間インキュベートした。次いで、発光を、ルミノメーター(Victor X3、PerkinElmer社)を使用して測定した。

結果:図8に示されるように、IFNγに特異的に結合しそれを中和することが公知の、6つ全ての試験したIFNγ抗体2A6、2B6、2A6Q、NI0501、フォントリズマブ及びAMG811は、相対ルミノメーター単位(RLU)を用量依存的様式で有意に減少させた。対照的に、dNTM患者から単一B細胞クローニングによっても得られるIFNγ抗体である(2A6、2B6及び2A6Qと同様)が、種々のアッセイにおいてIFNγ中和活性を示さない(データ示さず)2C10は、RLUに対して影響を示さないことが見出された。

(実施例7)
MLRアッセイにおけるIFNγ抗体のIFNγ遮断効果
この実施例は、一方向性同種混合リンパ球反応(MLR)培養物に添加した場合の、本開示のIFNγ抗体の効果を示す。

材料及び方法:種々の細胞ベースのアッセイにおいてIFNγシグナル伝達を遮断することが示された(上記実施例を参照のこと)選択されたIFNγ抗体2A6Q、AMG811及びNI0501を、一方向性同種MLRシステムに添加した。健康なボランティアドナーからのPBMCを、Ficoll-Hypaqueを使用する密度勾配遠心分離によって単離した。2×10⁵のヒトPBMCを、96ウェルプレート中に、1ウェル当たり等しい数のマイトマイシンC処理した(30μg/mL、30分間)刺激細胞と共にインキュベートした。試験したMLR培養物は、5μg/mLのIFNγ抗体AMG811、2A6_Q若しくはNI0501、又は5μg/mLのIgG1対照抗体(Bio X cell社:BE0297)を含んだ。レスポンダー細胞増殖を、CellTiter-Glo(登録商標)アッセイ(G7570;Promega社、Madison、WI、USA)によって、9日目に測定した。発光を、ルミノメーター(Victor X3、PerkinElmer社)によって測定した。

結果:図9に示される健康なドナー細胞の2つの代表的なアッセイについてのプロットによって示されるように、MLR培養物中のIFNγ抗体AMG811、2A6Q又はNI0501のいずれかの存在は、対照IgGと比較した場合、レスポンダー細胞の増殖を有意に増強させたが、これは、増加した免疫活性化を示している。

(実施例8)
SEB刺激されたヒトPBMCにおける免疫応答に対するIFNγ抗体のIFNγ遮断効果
この実施例は、ブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)によって刺激した場合の、ヒトPBMCの免疫応答に対する本開示のIFNγ抗体の効果を示す。

材料及び方法:健康な成人ドナーから得たPBMCを、IFNγを中和することが示されたIFNγ抗体AMG811、2A6Q、2B6若しくはNI0501、非中和抗体2C10、又は対照IgGのうち1つの存在下で、1ng/mLのSEBで刺激した。

PBMCを、Ficoll-Paque密度勾配遠心分離を使用して健康なボランティアから単離し、5%のFBSを含む10%のRPMI培地中で24時間休息させた。PBMC(2×10⁵細胞/ウェル)を、IFNγを中和することが示されたIFNγ抗体AMG811、2A6Q、2B6若しくはNI0501、非中和抗体2C10、又は対照IgGのうち1つの存在下で、1ng/mLのSEBを含む200μLのアッセイ培地(RPMI、5%ヒト血清)中に播種した。培養物上清中のIL-2レベルを、製造業者の指示に従って、IL-2 ELISAキット(Biolegend社、San Diego、CA、USA)によって2日目に測定した。細胞増殖を、CellTiter-Glo(登録商標)(Promega社)を使用して7日目に決定し、発光を、Victor(商標)1420マルチラベルカウンター(PerkinElmer社、US)によって測定した。データを、GraphPad Prism7ソフトウェアを使用して分析した。

結果:図10Aに示されるように、IFNγ中和IFNγ抗体AMG811、2B6、2A6Q及びNI0501は、2日目に、有意に増強されたIL-2分泌を惹起した。更に、図10Bに示されるように、IFNγ中和IFNγ抗体AMG811、2B6、2A6Q及びNI0501は、7日目に測定した場合、増加した細胞増殖を惹起した。対照的に、対照IgGは、2日目にも7日目にも、増強された免疫応答を惹起しなかった。非中和抗体2C10もまた、対照IgGと比較して、IL-2分泌を増強させなかった(データ示さず)。

(実施例9)
SEB刺激されたヒトPBMCにおけるT細胞増殖に対するIFNγ抗体の効果のフローサイトメトリーアッセイ
この実施例は、フローサイトメトリーを使用して測定した場合の、ヒトPBMCのSEB刺激の間のT細胞増殖に対する本開示のIFNγ抗体の効果を示す。

材料及び方法:CFSE標識されたPBMCを、実施例8に記載した方法に従って、IFNγ抗体2A6Q若しくはAMG811、抗PD-1抗体、又はIgG対照抗体の存在下で、SEB(1ng/mL)で刺激した。6日間の培養後、細胞を、CD4及びCD8について染色し、CFSE希釈されたCD4+又はCD8+T細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーによって決定した。

結果:図11は、CFSE標識されたCD4⁺及びCD8⁺T細胞の増強された増殖が示されたことを実証する、各々単一のドナーからの、代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを示す。これらの図は、3回の実験からの代表である。図11の図によって示されるように、増殖中の(CFSE希釈)細胞のパーセンテージは、対照IgGと比較して、IFNγ遮断抗体AMG811及び2A6Qの存在によって有意に増強された。T細胞増殖を増加させることが公知である、陽性対照として含めたPD-1遮断抗体もまた、対照と比較して、増殖中の細胞の有意な増強を生じた。CFSE希釈細胞の集団は、SEB刺激なしで実施した対照実験からのヒストグラムでは観察されなかった(データ示さず)。

(実施例10)
SEB刺激されたヒトPBMC及びB細胞におけるPD-L1発現に対するIFNγ抗体のIFNγ遮断効果
PD1のリガンドであるPD-L1は、自己免疫疾患及び他の疾患状態、例えば肝炎の間を含め、免疫系の適応アームを抑制する際に重要な主要な役割を有すると理解される。T細胞上でのPD-L1発現は、IFNγ刺激に応答して増加することが公知である。この実施例は、ヒトPBMC及びB細胞上のPD-L1発現を遮断する際の本開示のIFNγ抗体の効果を示す。

材料及び方法:PBMC及びB細胞を、健康なドナー(即ち、HBV感染なし)から単離した。PBMCは、PD-L1を発現することが可能な異なる免疫細胞を含む。単離されたPBMC及びB細胞を、IFNγ遮断抗体2A6Q、非IFNγ中和抗体2C10、及びIgG1対照抗体の存在下で、3日間にわたって1ng/mLのSEBで刺激した。細胞を回収し、PD-L1の細胞表面発現を、フローサイトメトリーを使用して測定した。結果を、幾何平均蛍光強度(GMFI)としてプロットした。

結果:図12A及び図12Bに示されるように、PBMC及びB細胞上のPD-L1の総発現は、SEB刺激に起因して上方調節された。しかし、IFNγ中和抗体2A6Qの存在は、PBMC及びB細胞の両方において、PD-L1発現を大きく阻害した。しかし、IFNγ非中和抗体2C10の存在は、IgG1対照と比較してPD-L1発現を有意には阻害しなかった。

(実施例11)
PD-1又はCTLA-4遮断と組み合わせたIFNγ遮断効果の、改善された免疫応答
この実施例は、改善された免疫応答が、CTLA-4又はPD-1遮断抗体と組み合わせて使用した本開示のIFNγ抗体によって、SEB刺激された細胞においてどのように惹起されるかを示す。

材料及び方法:健康な成人ドナーから得られたPBMCを、10μg/mLの以下の抗体又は抗体組み合わせ:IgG1対照抗体、2C10、2A6Q、AMG811、抗PD1、抗CTLA4、[2A6Q+抗PD1]、[2A6Q+抗CTLA4]、[AMG811+抗PD1]又は[AMG811+抗CTLA4]の存在下で、1ng/mLのSEBで刺激した。IL-2分泌を、IL-2 ELISAキット(Biolegend社431804)によって、2日目に決定した。抗PD-1(ペンブロリズマブ)、抗PD-L1(アテゾリズマブ)及び抗CTLA4(イピリムマブ)をエンコードする遺伝子(例えば、www.imgt.org/3Dstructure-DBにおいて入手可能)を、組換え抗体を生成するための標準的な技術を使用して、合成し、ヒトベクター中にクローニングし、発現させ、精製した。

結果:図13A及び図13Bに示されるように、2A6Q、AMG811又は抗PD1抗体単独(10μg/mL濃度)の存在は、IL-2濃度によって示されるように、T細胞応答を有意に増強させた。しかし、抗CTLA4抗体は、単独で使用した場合、T細胞応答を有効には増強させなかった。驚くべきことに、IFNγ遮断抗体AMG811又は2A6Qのうち1つと抗CTLA4抗体又は抗PD-1抗体との組み合わせは、単独の抗体による応答と比較した場合、健康なドナーからのPBMCにおいて免疫応答の増加した増強を生じた。

(実施例12)
慢性HBV感染を有する患者からのPBMCにおけるSEB誘導性免疫応答に対するIFNγ遮断効果
この実施例は、CTLA-4又はPD-1遮断抗体と組み合わせて使用したIFNγ抗体が、慢性HBV感染を有する患者からのSEB刺激されたPBMCにおいて改善された免疫応答をどのように惹起するかを示す。

材料及び方法:慢性HBV感染を有する患者から得られたPBMCを、10μg/mLの以下の抗体又は抗体組み合わせ:IgG1対照抗体、2C10、2A6Q、AMG811、NI0501、抗PD1、抗PDL1、抗CTLA4、[2A6Q+抗PD1]、[2A6Q+抗PDL1]、[2A6Q+抗CTLA4]、[NI0501+抗PD1]、[NI0501+抗PDL1]又は[NI0501+抗CTLA4]の存在下で、1ng/mLのSEBで刺激した。図14は、2人の異なる慢性HBV患者からの代表的な結果のプロットを示す。

結果:図14Aに示されるように、IFNγ遮断抗体AMG811、2A6Q又はNI0501単独の添加は、対照IgGと比較した場合、細胞増殖を有効に増強させた。図14B及び図14Cに示されるように、IFNγ遮断抗体2A6Q又はNI0501と、PD-1、PD-L1又はCTLA4の遮断抗体との組み合わせは、増加したIL2分泌(図14B)又は増加したT細胞増殖(図14C)によって示されるように、免疫応答の更なる増強を惹起した。

(実施例13)
IFNγ遮断効果は、ワクチン非応答性を打破する。
この実施例は、HBVワクチン接種後のIFNγ遮断抗体の投与が、マウスモデルにおいてワクチンに対する非応答性をどのように打破することができるかを示す。

材料及び方法:市販のマウス代替IFNγ抗体XMG1.2を使用して研究を実施した。XMG1.2は、マウスIFNγを中和し、多数の研究において記載されている。水力学的注射(HDI)ベースのHBVキャリアマウスモデルを、Huang他、「An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection」、Proc Natl Acad Sci USA 2006年11月21日. 103(47); 17862〜17867に記載されるように使用した。CBA雄性6週齢〜8週齢マウスに、10μgのpAAV/HBV1.2プラスミドを、水力学的に注射した(HDI)。HDIの4週間後に高レベルの血清HBsAgを示した安定に確立されたHBV持続を有するマウス(HBV-HDI)を、長期免疫化/処置実験に登録した。登録したHBV-HDIマウスを、0日目にHBsAgワクチン(ENGERIX-B)で筋肉内に免疫した。抗体処置のために、マウスに、300μgのマウスIFNγ抗体XMG1.2(BioXcell社クローンXMG1.2)又は対照IgG(BioXcell社クローンHRPN)を、ワクチン接種の3日後に腹腔内に注射し、次いで、ワクチン接種後7日間隔で引き続いて注射した。

HBsAgのマウス血清レベルを、Abbott社のArchitect I1000システム(Abbott Diagnostics社、Germany)によって決定した。検出限界は0.05IU/mLである。マウスのHBeAg及び抗HBsレベルを、Roche社のcobas e 411アナライザー(Roche Diagnostics社、GmbH、 Mannheim、Germany)によって決定した。HBeAg及び抗S Abの検出限界は、それぞれ、1COI及び10IU/lである。血清アラニンアミノトランスフェラーゼを、ALTGPT試薬(Denka Seiken社、Tokyo、Japan)を使用して、自動臨床化学アナライザーTBA-200FR(Toshiba社、Tokyo、Japan)で測定した。

結果:研究の最後、ワクチン接種の42日後に、抗HBs抗体を、XMG1.2抗体で処置したマウスの22%において検出することができた。対照的に、HBsAgワクチン接種は、対照IgGで処置したマウスにおいて抗HBs抗体の産生を誘導しなかった。処置期間にわたって、登録した全てのマウスにおいて、ALTにおける有意な増加は観察されず、これは、中和マウスIFNγ抗体の投与が、検出可能な肝臓傷害を誘導しなかったことを示している。

上記結果は、HBsAgワクチンによる免疫化後の抗IFNγ抗体の投与が、マウスにおいてワクチン非応答性を打破することができることを示している。従って、これらの結果は、ワクチン接種後のIFNγ中和抗体の投与が、ヒトにおいて慢性HBV感染の処置を増強できることを示唆している。

本発明の上述の開示は、明確さ及び理解の目的で、例及び例示としていくらか詳細に記載されてきたが、本明細書に記載される例、説明及び実施形態を含む本開示は、例示目的であり、例示的であることが意図され、本開示を限定すると解釈すべきではない。本明細書に記載される例、説明及び実施形態に対する種々の改変又は変化が行われ得、それらが本開示及び添付の特許請求の範囲の精神及び視野の範囲内に含まれることが、当業者に明らかである。更に、当業者は、本明細書に記載されるものと等価ないくつかの方法及び手順を認識する。全てのかかる均等物は、本開示の範囲内であると理解すべきであり、添付の特許請求の範囲によってカバーされる。本発明の更なる実施形態は、以下の特許請求の範囲に示される。

Claims

その必要に迫られている対象に、治療有効量のIFNγ抗体及び薬学的に許容される担体を含む組成物を投与する工程を含む、B型肝炎ウイルス感染を処置するための方法。
前記IFNγ抗体が、IFNγの生物学的機能をモジュレートする、請求項1に記載の方法。
前記IFNγ抗体が、IFNγを中和する、請求項1に記載の方法。
前記IFNγ抗体が、IFNγのシグナル伝達活性を阻害、減少及び/又は完全に遮断する、請求項1に記載の方法。
前記IFNγ抗体が、プロ-ヒトIFNγ、成熟-ヒトIFNγ又は短縮型-ヒトIFNγによるIFNγシグナル伝達活性を減少させる、請求項4に記載の方法。
前記IFNγ抗体が、IFNγ依存的サイトカイン産生;IFNγ依存的T細胞機能不全、IFNγ依存的免疫寛容及びIFNγ依存的炎症のうち1つ又は複数を低減させる、請求項1に記載の方法。
前記IFNγ抗体が、IFNγで刺激された単球におけるHLA-DR及び/又はPDL1の発現を低減させる、請求項1に記載の方法。
前記IFNγ抗体が、IFNγで刺激された単球におけるインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)の発現を低減させる、請求項1に記載の方法。
前記IFNγ抗体が、SEB刺激されたヒトPBMCのIL-2産生及び/又は細胞増殖を、少なくとも1.2倍、少なくとも1.3倍、少なくとも1.4倍、少なくとも1.5倍、少なくとも1.6倍、少なくとも1.7倍、少なくとも1.8倍、少なくとも1.9倍、少なくとも2倍、少なくとも2.1倍又は少なくとも2.20倍増加させる、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
前記IFNγ抗体が、
配列番号120又は123から選択されるCDR-H1アミノ酸配列、配列番号121又は124から選択されるCDR-H2アミノ酸配列及び配列番号122又は125から選択されるCDR-H3アミノ酸配列を有するVH領域;並びに
配列番号132又は135から選択されるCDR-L1アミノ酸配列、配列番号133又は136から選択されるCDR-L2アミノ酸配列及び配列番号134又は137から選択されるCDR-L3アミノ酸配列を含むVL領域
を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
前記IFNγ抗体が、
(a)配列番号120のCDR-H1アミノ酸配列、配列番号121のCDR-H2アミノ酸配列及び配列番号122のCDR-H3アミノ酸配列を有するVH領域、並びに配列番号132のCDR-L1アミノ酸配列、配列番号133のCDR-L2アミノ酸配列及び配列番号134のCDR-L3アミノ酸配列を含むVL領域;
(b)配列番号123のCDR-H1アミノ酸配列、配列番号124のCDR-H2アミノ酸配列及び配列番号125のCDR-H3アミノ酸配列を有するVH領域、並びに配列番号135のCDR-L1アミノ酸配列、配列番号136のCDR-L2アミノ酸配列及び配列番号137のCDR-L3アミノ酸配列を含むVL領域;又は
(c)配列番号123のCDR-H1アミノ酸配列、配列番号124のCDR-H2アミノ酸配列及び配列番号125のCDR-H3アミノ酸配列を有するVH領域、並びに配列番号132のCDR-L1アミノ酸配列、配列番号133のCDR-L2アミノ酸配列及び配列番号134のCDR-L3アミノ酸配列を含むVL領域
を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
前記IFNγ抗体が、
(a)配列番号109、110、164又は165に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVH領域;及び
(b)配列番号113又は114に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むVL領域
を含む、請求項10又は11に記載の方法。
前記IFNγ抗体が、
(a)配列番号109のVH領域アミノ酸配列及び配列番号113のVL領域アミノ酸配列;
(b)配列番号110のVH領域アミノ酸配列及び配列番号114のVL領域アミノ酸配列;
(c)配列番号109のVH領域アミノ酸配列及び配列番号114のVL領域アミノ酸配列;
(d)配列番号110のVH領域アミノ酸配列及び配列番号113のVL領域アミノ酸配列;
(e)配列番号164のVH領域アミノ酸配列及び配列番号113のVL領域アミノ酸配列;又は
(f)配列番号165のVH領域アミノ酸配列及び配列番号113のVL領域アミノ酸配列
を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
前記IFNγ抗体が、
(a)配列番号183、185、187又は189に対して少なくとも90%の同一性を有する重鎖アミノ酸配列;及び
(b)配列番号184又は186に対して少なくとも90%の同一性を有する軽鎖アミノ酸配列
を含む、請求項10から13のいずれか一項に記載の方法。
前記IFNγ抗体が、
(a)配列番号183の重鎖アミノ酸配列及び配列番号184の軽鎖アミノ酸配列;
(b)配列番号185の重鎖アミノ酸配列及び配列番号186の軽鎖アミノ酸配列;
(c)配列番号183の重鎖アミノ酸配列及び配列番号186の軽鎖アミノ酸配列;
(d)配列番号185の重鎖アミノ酸配列及び配列番号184の軽鎖アミノ酸配列;
(e)配列番号187の重鎖アミノ酸配列及び配列番号184の軽鎖アミノ酸配列;又は
(f)配列番号189の重鎖アミノ酸配列及び配列番号184の軽鎖アミノ酸配列
を含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
前記IFNγ抗体の前記VH領域が、N76A及びN76Qから選択されるアミノ酸置換を更に含む、請求項10から15のいずれか一項に記載の方法。
前記IFNγ抗体が、2A6、2B6、2A6A、2A6Q、AB、BA、AMG811、NI0105からなる群から選択される抗体である、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
前記IFNγ抗体が、免疫グロブリン分子、Fv、ジスルフィド連結されたFv、モノクローナル抗体、scFv、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、CDRグラフト抗体、ディアボディ、ヒト抗体、ヒト化抗体、多特異性抗体、Fab、二重特異性抗体、Fab'断片、二特異性抗体、F(ab')₂断片、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価断片;V_Hドメイン及びCH1ドメインからなるFd断片;抗体の単一アームのV_Lドメイン及びV_HドメインからなるFv断片、dAb断片、単離された相補性決定領域(CDR)、又は単鎖抗体である、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
前記対象に投与する工程が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内(intraabdominal)、嚢内、軟骨内、腔内(intracavitary)、腔内(intracelial)、小脳内、脳室内、結腸内、子宮頸部内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内(intraperitoneal)、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻腔内及び経皮からなる群から選択される少なくとも1つの様式による、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
必要に迫られている前記対象が、HBVキャリア、慢性HBV感染を有する対象又はHBV持続を有する対象である、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
前記組成物が、前記対象に、1日に1回よりも多く、1日に少なくとも1回、1週間に少なくとも1回又は1ヶ月に少なくとも1回投与される、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
少なくとも1つの更なる治療剤を投与する工程を更に含む、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
前記更なる治療剤がHBVワクチンである、請求項22に記載の方法。
前記更なる治療剤が、阻害性免疫チェックポイント分子を標的化する抗体である、請求項22に記載の方法。
前記阻害性免疫チェックポイント分子が、PD1、PD-L1及びCTLA-4から選択される、請求項24に記載の方法。
阻害性免疫チェックポイント分子を標的化する前記抗体が、抗PD1、抗PD-L1及び抗CTLA-4から選択される、請求項24に記載の方法。
前記更なる治療剤が、治療剤;画像化剤;細胞傷害性剤;血管新生阻害剤;キナーゼ阻害剤;共刺激分子ブロッカー;接着分子ブロッカー;抗サイトカイン抗体又はその機能的断片;メトトレキサート;シクロスポリン;ラパマイシン;FK506;検出可能な標識又はレポーター;TNFアンタゴニスト;抗リウマチ薬;筋弛緩薬;麻薬;非ステロイド性抗炎症薬物(NSAID);鎮痛薬;麻酔薬;鎮静薬;局所麻酔薬;神経筋ブロッカー;抗菌薬;抗乾癬薬;コルチコステロイド;タンパク質同化ステロイド;エリスロポエチン;免疫化;免疫グロブリン;免疫抑制薬;成長ホルモン;ホルモン補充薬物;放射性医薬品;抗うつ薬;抗精神病薬;刺激物質;喘息薬物療法;ベータアゴニスト;吸入ステロイド;エピネフリン又はそのアナログ;サイトカイン;サイトカインアンタゴニスト;免疫調節剤;HBV侵入阻害剤;ウイルスRNA阻害剤;遺伝子編集剤;HBsAg分泌阻害剤;ポリメラーゼ阻害剤;インターフェロン;ウイルス侵入阻害剤;ウイルス成熟化阻害剤;ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤;カプシドアセンブリ阻害剤/モジュレーター;cccDNA阻害剤;FXRアゴニスト;microRNA;及びTLRアゴニストからなる群から選択される、請求項22に記載の方法。
前記更なる治療剤が、エンテカビル(Baraclude)、テノホビル(Viread)、ラミブジン(Epivir)、アデホビル(Hepsera)及びテルビブジン(Tyzeka)、インターフェロンアルファ-2b並びにペグインターフェロンアルファ-2aからなる群から選択される、請求項22に記載の方法。
前記更なる治療剤が、前記組成物の投与の前、前記組成物の投与の後、及び/又は前記組成物と同時に、必要に迫られている前記対象に投与される、請求項22から28のいずれか一項に記載の方法。
治療有効量の前記組成物によって、HBVに対する免疫応答が、必要に迫られている前記対象において誘導若しくはブーストされる、又はHBVに関するセロコンバージョンが、必要に迫られている前記対象において誘導される、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法。
前記免疫応答が、免疫系の活性をモジュレートする抗体の産生又はサイトカインの産生を含む、請求項30に記載の方法。
必要に迫られている前記対象に前記組成物を投与する工程の後に、前記対象におけるHBsAgが低減され;場合により、前記対象が、持続的なHBsAg喪失を示す、請求項1から31のいずれか一項に記載の方法。
必要に迫られている前記対象に前記組成物を投与する工程の後に、前記対象におけるHBVのウイルス負荷が低減され;場合により、前記対象におけるHBVのウイルス負荷が検出不能である、請求項1から32のいずれか一項に記載の方法。
前記IFNγ抗体が、1×10^-8M以下、1×10^-9M以下、1×10^-10M以下又は1×10^-11M以下の結合親和性で、ヒトIFNγに結合する、請求項1から33のいずれか一項に記載の方法。
前記IFNγ抗体が、1×10^-8M以下、1×10^-9M以下、1×10^-10M以下又は1×10^-11M以下の結合親和性で、アカゲザルIFNγ又はカニクイザルIFNγに結合する、請求項1から34のいずれか一項に記載の方法。
前記IFNγ抗体が、1×10^-8M以下、1×10^-9M以下、1×10^-10M以下又は1×10^-11M以下の結合親和性で、ヒトIFNγ及びカニクイザルIFNγに結合する、請求項1から35のいずれか一項に記載の方法。