CN108623688B - 一种中和贝伐珠单抗的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种中和贝伐珠单抗的单克隆抗体及其应用，所述单克隆抗体的轻链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.3，轻链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.4，轻链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.5；所述单克隆抗体的重链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.6，重链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.7，重链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.8；本发明通过大量复杂实验筛选并验证了所述单克隆抗体能特异性结合贝伐珠单抗，并能够阻断贝伐珠单抗与VEGF结合，该抗体能够研究贝伐珠单抗在临床前和临床试验中的免疫原性，监测评估免疫原性试验的敏感性和特异性，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

Description

一种中和贝伐珠单抗的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种中和贝伐珠单抗的单克隆抗体及其应用。
背景技术
近年来，抗体药物以其安全有效、特异性高等优点被广泛应用于肿瘤、移植排异、感染性疾病、自身免疫疾病等多种疾病的临床治疗。但选用抗体药物进行治疗会出现一个不容忽视的问题，即抗体药物免疫原性对治疗的影响，这些免疫原性不但会引起机体的急性过敏反应，同时对药物本身也具有竞争抑制作用。对抗体药物免疫原性的检测是生物技术药物申请临床试验和注册的重要内容。尽管在动物模型中显示免疫原性并不一定预期在人体也会出现免疫反应，但评价药物引起的免疫反应仍显得十分重要。
贝伐珠单抗是一种以VEGF为特异性靶点的重组人源化IgG1型单克隆抗体，它能竞争性抑制VEGF与VEGF受体的结合，抑制下游信号通路的激活，促进肿瘤细胞凋亡，可用于治疗转移型结肠直肠癌、非小细胞肺癌和乳腺癌等。目前，评估抗体药物的免疫原性主要从两个方面进行，一方面是检测病人有没有产生抗药抗体，另一方面检测病人产生的抗药抗体有无阻断药物与靶位点结合的能力，即抗体的中和性能。在各种评估免疫原性的检测方法中，都需要有阳性对照，用于监测方法的敏感性和特异性。美国FDA推荐使用能识别抗体药物可变区的抗体作为免疫原性检测的阳性对照抗体，用于评估ADA分析方法的灵敏度。
目前常用的阳性抗体包括亲和纯化的多克隆抗体(一般来源于兔或羊)，尽管这类抗体能在某种程度上代表体内抗药抗体的多样性，但由于抗原亲和纯化收率低，每批产量有限，且不同批次间活性差异大，可能影响从临床前到临床试验中免疫原性评价的连贯性。而单克隆抗体的生产过程经济且灵活，易于纯化，收益高，且不同批次拥有稳定的结合活性，易于商业化生产，是良好的评估抗体药物免疫原性的阳性参照，但现今市场上缺乏特异抗贝伐珠可变区的单抗。
因此，研发一种特异性抗贝伐珠可变区的单抗，分析贝伐珠单抗的临床前和临床试验中的免疫原性，作为监测评估免疫原性试验的敏感性和特异性的阳性对照，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种中和贝伐珠单抗的单克隆抗体及其应用，所述单克隆抗体能特异性结合贝伐珠单抗，并能够阻断贝伐珠单抗与VEGF结合，能够作为阳性对照抗体，研究贝伐珠单抗在临床前和临床试验中的免疫原性，监测评估免疫原性试验的敏感性和特异性，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种中和贝伐珠单抗的单克隆抗体，所述单克隆抗体的轻链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.3，轻链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.4，轻链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.5；
所述单克隆抗体的重链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.6，重链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.7，重链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.8。
所述单克隆抗体Fab段的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述单克隆抗体Fab段的重链氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
所述SEQ ID NO.1如下所示：
DIVLTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQSILHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKVEVKRADAAPTFQSSPTWRFY.
所述SEQ ID NO.2如下所示：
EVQLQQSGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCTRGLCEYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYNRRP.
所述SEQ ID NO.3如下所示：
SILHSNGNTYLE.
所述SEQ ID NO.4如下所示：
YKVSNRFS.
所述SEQ ID NO.5如下所示：
GVYYCFQGSHVPW.
所述SEQ ID NO.6如下所示：
FTFSSYTMSWVRQTPEKR.
所述SEQ ID NO.7如下所示：
ATISSGGSYTYYPDSVKG.
所述SEQ ID NO.8如下所示：
SSLKSEDTAMYYCTRGLCE.
本发明中，发明人通过深入研究现有技术中对于贝伐珠单抗的免疫原性检测的优缺点，通过设计大量复杂实验，反复筛选并最终发现了上述单克隆抗体，验证了该抗体具有特异性结合贝伐珠单抗并能够阻断贝伐珠单抗与VEGF结合的特殊功能，所述单克隆抗体的序列跟已有序列均不同，具有新颖性和创造性。
本发明提供的单克隆抗体命名为4H7，是以贝伐珠单抗作为免疫原，利用单克隆抗体技术制备获得的特异性抗贝伐珠单抗的单克隆抗体。
所述贝伐珠单抗包括安维汀(Avastin)及其生物类似药。
第二方面，本发明提供一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞分泌第一方面所述的单克隆抗体。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的单克隆抗体或第二方面所述的杂交瘤细胞用于制备评估贝伐珠单抗的免疫原性的药物和/或试剂盒的用途。
本发明提供了分离的抗贝伐珠单抗的抗体，该抗体还能够阻断贝伐珠与其靶点血管内皮生长因子(VEGF)的结合，在贝伐珠单抗的临床前和临床试验中对免疫原性的分析可以发挥重要作用，可以作为阳性对照，监测评估免疫原性试验的敏感性和特异性，能够用于抗药抗体中和活性的检测，用于在动物实验研究贝伐珠单抗的药理，并用于研究在动物体内是否存在抗贝伐珠的单抗。
第四方面，本发明提供一种制备如第一方面所述单克隆抗体的方法，包括如下步骤：
(1)动物免疫；
(2)细胞融合；
(3)杂交瘤细胞的筛选；
(4)杂交瘤细胞的克隆化；
(5)单克隆抗体的制备。
作为优选技术方案，一种制备如第一方面所述单克隆抗体的方法，具体包括如下步骤：
(1)动物免疫：采用6周龄BALB/C雌鼠，抗原为商品化的贝伐珠单抗Avastin，免疫途径为皮下注射；
(2)细胞融合：制备脾细胞悬液、骨髓瘤细胞悬液和饲养层细胞，采用PEG介导融合法进行融合；
(3)杂交瘤细胞的筛选：常规间接ELISA方法筛选步骤(2)得到的融合细胞的阳性孔；
(4)杂交瘤细胞的克隆化：将步骤(3)筛选出的阳性孔用常规的有限稀释法克隆，获得单抗细胞株4H7细胞；
(5)单克隆抗体的制备：将步骤(4)得到的4H7细胞扩大培养，注射小鼠腹腔，收集腹水离心取上清，纯化得到所述单克隆抗体。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供的单克隆抗体能够特异性的跟贝伐珠单抗特异性结合，而跟其他抗体交叉反应极小，能中和贝伐珠单抗，阻断其与靶位点VEGF的结合，IC50约为479ng/mL，用于监测评估免疫原性试验的敏感性和特异性；
(2)本发明提供的制备方法简洁高效，便于推广应用。
附图说明
图1为本发明的单克隆抗体与商品化贝伐珠单抗Avastin结合特异性结果图；
图2为本发明的4H7对Avastin的中和活性结果图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1制备单克隆抗体
本实施例的制备方法的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选、杂交瘤细胞的克隆化和单抗的制备；
(1)动物免疫：采用6周龄BALB/C雌鼠，抗原为商品化的贝伐珠单抗Avastin，免疫方法为常规免疫法，免疫途径为皮下注射，用50μg Avastin与福氏完全佐剂等体积混合，于小鼠背部皮下分3到4点注射；经两周后进行二次相同剂量免疫，用福氏不完全佐剂；两周后进行三次免疫，用福氏不完全佐剂；两周后加强免疫，用福氏不完全佐剂，3天后取脾细胞进行融合；
(2)细胞融合：最后一次免疫后第三天制备；
脾细胞悬液的制备：于细胞融合当天制备，取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清，同时颈脱位致死小鼠，取其脾脏，制备脾细胞悬浮液；
骨髓瘤细胞悬液的制备：提前两周复苏细胞，保证使用时细胞处于对数生长期；
饲养层细胞的制备：提前两天获得小鼠腹腔巨噬细胞，加入96孔板培养；
细胞融合采用PEG介导融合方法，取脾细胞与骨髓瘤细胞按照5:1的比例，在无血清的DMEM培养基中混匀，1500rpm离心5分钟，去掉上清，用力振动离心管，振散细胞，在1分钟内加入1mL 50％PEG(pH8.0，40℃)融合细胞，边加边摇动，加完后静置90s，加入无血清的DMEM培养基终止融合，1500rpm离心5分钟，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养；
(3)杂交瘤细胞筛选
细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10％-50％时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔,用Avastin包板，检测杂交瘤细胞培养上清，二抗为酶标记羊抗鼠抗体，小鼠抗血清作为阳性对照，筛选出抗体表达量高的杂交瘤细胞；
(4)杂交瘤细胞克隆化
筛选出的特异性强阳性孔用常规的有限稀释法克隆，获得单抗细胞株4H7细胞；从原始孔中得到的阳性杂交瘤细胞，可能来源于二个或者多个杂交瘤细胞，他们分泌的抗体是不同质的，为了得到完全同质的单克隆抗体，必须对杂交瘤细胞进行克隆化；
制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20％血清的HT培养基稀释至每毫升含8个细胞，同时在杂交瘤细胞悬液中加入小鼠腹腔细胞，每毫升加入5E4个细胞，按每孔接种0.1mL细胞悬液，即每孔含0.8个杂交瘤细胞；37℃、5％CO2湿润培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测；
取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存，同时再进一步对阳性孔的细胞进行克隆化，用ELISA的方法对克隆化的单抗进行鉴别，筛选出阳性克隆细胞株4H7细胞。
(5)制备抗体
将筛选出的杂交瘤细胞进行扩大培养，取6周龄左右的小鼠，腹腔注射0.5mL石蜡油，一周后腹腔注射2E6个杂交瘤细胞，注射后7天可见小鼠腹部明显变大，收集腹水，离心取上清，获得单克隆抗体腹水，用Protein A的吸附柱纯化抗体，最终获得纯化后的单克隆抗体4H7。
以下为单克隆抗体4H7轻链与重链可变区的序列，其轻链可变区的序列与已知序列如下，重链可变区的序列，序列比对结果显示如下，跟已有序列都有不同，具有特异性。
Fab轻链氨基酸序列：129个氨基酸
SEQ ID NO.1：
DIVLTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQSILHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKVEVKRADAAPTFQSSPTWRFY.
轻链CDR区信息如下：
CDR1 28-39，序列为SEQ ID NO.3：SILHSNGNTYLE.
CDR2 54-61，序列为SEQ ID NO.4：YKVSNRFS.
CDR3 89-101，序列为SEQ ID NO.5：GVYYCFQGSHVPW.
Fab重链氨基酸序列：127个氨基酸
序列为SEQ ID NO.2：
EVQLQQSGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCTRGLCEYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYNRRP.
重链CDR区信息如下：
CDR1 27-44，序列为SEQ ID NO.6：FTFSSYTMSWVRQTPEKR.
CDR2 49-66，序列为SEQ ID NO.7：ATISSGGSYTYYPDSVKG.
CDR3 84-102，序列为SEQ ID NO.8：SSLKSEDTAMYYCTRGLCE.
实施例2单克隆抗体4H7与贝伐珠单抗结合的特异性实验
试验步骤：
(1)包被：用包被缓冲液分别稀释Avastin，及对照抗体Erbitux至5μg/mL，分别加入到不同的96孔上，100μL/孔，2-8℃过夜；
(2)洗板：用洗液洗板3次，300μL/孔；
(3)封闭：200μL/孔3BSA溶液，室温2.5小时；
(4)洗板：用洗液洗板3次，300μL/孔；
(5)稀释样品：用缓冲液稀释抗体4H7，然后连续2倍稀释得到12个浓度样品，依次为:5000ng/mL，2500ng/mL，1250ng/mL，625ng/mL，312.5ng/mL，156.25ng/mL，78.12ng/mL，39.06ng/mL，19.63ng/mL，9.76ng/mL，4.88ng/mL，2.44ng/mL；
(6)将稀释好的样品转移到96孔板，100μL/孔；
(7)孵育：2-8℃过夜孵育；
(8)洗板：用洗液洗板3次，300μL/孔；
(9)酶结合物：羊抗鼠IgG Fc片段酶结合物IgG-HRP，用缓冲液稀释1:10000，100μL/孔，37℃孵育30分钟；
(10)洗板：用洗液洗板3次，300μL/孔；
(11)底物：加新鲜配制的底物，100μL/孔，37℃孵育6分钟；
(12)终止：2M H2SO4，50μL/孔；
(13)测定：酶标仪读数，波长450nm；
(14)结果：用SoftMaxPro软件进行数据处理，采用4-参数方程，结果见图1；
由图1可知，采用两种IgG1型的治疗性单克隆抗体(Avastin和Erbitux)进行ELISA包板，检测4H7单抗识别Avastin的特异性，结果表明，4H7单抗仅能与Avastin结合，不识别Erbitux，说明4H7能特异性识别Avastin，与其他IgG1型抗体无交叉反应。
实施例3单克隆抗体4H7的中和活性实验
试验步骤：
(1)包被：用包被缓冲液稀释VEGF至50ng/mL，加入到96孔上，100μL/孔，2-8℃过夜；
(2)洗板：用洗液洗板3次，300μL/孔；
(3)封闭：200μL/孔3％BSA溶液，室温2.5小时；
(4)洗板：用洗液洗板3次，300μL/孔；
(5)稀释Avastin样品：用缓冲液稀释抗体Avastin至6μg/mL，然后连续2倍稀释得到12个浓度样品，依次为：3μg/mL，1.5μg/mL，750ng/mL，375ng/mL，187.5ng/mL，93.8ng/mL，46.88ng/mL，23.4ng/mL，11.72ng/mL，5.86ng/mL，2.93ng/mL和1.96ng/mL；
(6)稀释4H7样品：用缓冲液稀释抗体4H7至20μg/mL，然后连续2倍稀释得到12个浓度样品，依次为：20μg/mL，10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，625ng/mL，312.5ng/mL，156.25ng/mL，78.12ng/mL，39.06ng/mL，19.63ng/mL和9.76ng/mL，将各稀释梯度的4H7与6μg/mL的Avastin等体积混合，室温孵育2h；
(7)去掉封闭液，立即加入孵育好的样品，100μL/孔，室温孵育1.5h；
(8)洗板：用洗液洗板3次，300μL/孔；
(9)酶结合物：羊抗人IgG Fc片段酶结合物IgG-HRP，用缓冲液稀释1:10000，100μL/孔，37℃孵育1h；
(10)洗板：用洗液洗板3次，300μL/孔；
(11)底物：加新鲜配制的底物，100μL/孔，37℃孵育6分钟；
(12)终止：2M H2SO4，50μL/孔；
(13)测定：酶标仪读数，波长450nm；
(14)结果：用SoftMaxPro软件进行数据处理，采用4-参数方程，结果见图2；
由图2可知，采用VEGF进行ELISA包板，反映Avastin与VEGF的结合的OD450值随Avastin浓度的增加而升高；在固定浓度的Avastin中投入梯度增加的4H7单抗，可以浓度依赖地抑制Avastin与VEGF结合，IC50约为479ng/mL，结果表明，4H7单抗对Avastin有较好的中和活性。
综上所述，本发明提供了一种中和贝伐珠单抗的单克隆抗体，通过大量复杂实验筛选并验证了所述单克隆抗体能特异性结合贝伐珠单抗，并能够阻断贝伐珠单抗与VEGF结合，该抗体可以作为阳性对照抗体，研究贝伐珠单抗在临床前和临床试验中的免疫原性，监测评估免疫原性试验的敏感性和特异性，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 宝船生物医药科技（上海）有限公司 白帆生物科技(上海)有限公司
<120> 一种中和贝伐珠单抗的单克隆抗体及其应用
<130> 2018年
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<213> 人工合成
<400> 4
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 5
Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp
1 5 10
<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 6
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu
1 5 10 15
Lys Arg
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 7
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 8
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 8
Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly
1 5 10 15
Leu Cys Glu

Claims (2)

1.一种中和贝伐珠单抗的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的轻链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.3，轻链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.4，轻链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.5；
所述单克隆抗体的重链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.6，重链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.7，重链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.8；
其中，所述单克隆抗体Fab段的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述单克隆抗体Fab段的重链氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
2.一种如权利要求1所述的单克隆抗体用于制备评估贝伐珠单抗的免疫原性的药物和/或试剂盒的用途。
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