KR20030010189A - 연쇄체화에 의한 면역 글로블린 융합 단백질의 제조 방법및 이 방법에 의해 제조된 ＴＮＦＲ/Ｆｃ 융합 단백질,상기 단백질을 코딩하는 ＤＮＡ, 상기 ＤＮＡ를 포함하는벡터, 및 상기 벡터에 의한 형질전환체 - Google Patents

연쇄체화에 의한 면역 글로블린 융합 단백질의 제조 방법및 이 방법에 의해 제조된 ＴＮＦＲ/Ｆｃ 융합 단백질,상기 단백질을 코딩하는 ＤＮＡ, 상기 ＤＮＡ를 포함하는벡터, 및 상기 벡터에 의한 형질전환체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역 글로블린 융합 단백질에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 신규한 연쇄체 형태의 면역 글로블린 융합 단백질을 제조하는 방법, 상기 방법에 의해 생산된 면역 글로블린 융합 단백질 중 TNFR/Fc 융합 단백질의 전체 아미노산 서열, 상기 전체 아미노산 서열을 코딩하는 DNA의 염기서열, 상기 DNA를 포함하는 벡터 및 상기 DNA를 포함하는 벡터를 난소 세포에 도입하여 형질전환시킨 형질전환체를 제공하는 것을 그 특징으로 하는 것으로서, 본 발명을 이용하여 제조된 면역 글로블린 융합 단백질은 기존의 면역 글로블린 융합 단백질보다 현저하게 개선된 효능을 갖는데, 예를 들어 본 발명의 면역 글로블린 융합단백질 제조방법에 의해 제조된 TNFR/Fc 융합단백질을 이용하는 경우 TNF 알파 및 베타에 의해 유도되는 세포독성 억제제로써 기존의 단순 이량체와 비교하여 볼 때 현저하게 증강된 효과를 얻을 수 있다.

Description

연쇄체화에 의한 면역 글로블린 융합 단백질의 제조 방법 및 이 방법에 의해 제조된 ＴＮＦＲ/Ｆｃ 융합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 ＤＮＡ, 상기 ＤＮＡ를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터에 의한 형질전환체{METHOD OF MANUFACTURING Ig-FUSION PROTEINS BY CONCATAMERIZATION, TNFR/Fc FUSION PROTEINS MANUFACTURED BY THE METHOD, DNA CODING THE PROTEINS, VECTORS INCLUDING THE DNA, AND CELLS TRANSFORMED BY THE VECTOR}
본 발명은 면역 글로블린 융합 단백질에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 신규한 연쇄체 형태의 면역 글로블린 융합 단백질을 제조하는 방법, 상기 방법에 의해 생산된 면역 글로블린 융합 단백질 중 TNFR/Fc 융합 단백질의 전체 아미노산 서열, 상기 전체 아미노산 서열을 코딩하는 DNA의 염기서열, 상기 DNA를 포함하는 벡터 및 상기 DNA를 포함하는 벡터를 난소 세포에 도입하여 형질전환시킨 형질전환체에 관한 것이다.
사이토카인(cytokine)은 인간의 자가 항원(autoantigen)과 같이 부적절한 자극에 의해 병리학적으로 악화된 염증 반응이 유발될 때 작용하고, 사이토카인 작용 억제제인 가용성 물질들은 사이토카인을 인식할 수 있는 항체(antibody)와 가용성 수용체(soluble receptor)가 사용되고 있으며, 이 물질들에 대한 많은 특허가 나와있다 (WO93/016184, WO96/02576, WO1997/03682, US6,225,117, US5,656,272, WO96/023067, US6,210,661, US5,977,318, US5,789,192, US5,434,131). 상기한 물질들은 사이토카인과 미리 결합하여 세포막에 존재하는 수용체와 결합을 방해하거나수용체와 직접 결합함으로써 사이토카인에 의한 신호전달을 억제하는 공통적인 기작을 갖고 있다.
특히 사이토카인 작용 억제제로 사용되는 가용성 수용체의 경우 카폰등의 문헌(Nature 337:525, 1989)에서와 같이 인간 면역 글로블린(hIg, human immunoglobulin)의 중쇄부위(heavy chain)와 연결하여 사용하는 예가 많이 있다(US 5,844,095, US 6,225,448, US 6,090,914, US 6,100,383, US 6,046,310, US 5,521,288).
일반적으로 사이토카인의 가용성 수용체와 면역 글로블린(이하 'Ig'라 함)의 융합체는 원래 분자의 단일체(monomer) 또는 Ig와 융합되지 않은 분자에 비해 다음과 같은 장점을 갖고 있다(카폰 등의 상기 문헌).
1) 이량체(dimer) 형태에서 융합 단백질은 이가화(bivalency)가 되므로 리간드(ligand)에 대한 총 친화력(avidity)이 증가
2) 혈청내에서 파괴되지 않고 존재할 수 있는 기간의 증가, 즉 분자의 안정성 증가
3) 면역 글로블린 중쇄의 Fc(Fragment crystallizable)를 통한 효과세포(effector cell)의 활성화
4) 단백질 분리 정제의 편리성[예, 프로테인 A를 이용한 분리 정제]
대부분의 수용체 세포외역과 면역 글로블린 상쇄간의 융합체는 중쇄부위의 CH1 도메인을 제외한 형태로 제작되고 있는데 그 결과 면역 글로블린의 경쇄(light chain)와 결합하지 않은 이량체로 제조된다.
이와 같이, 면역반응을 매개하는데 관여하는 단백질 또는 상기 단백질의 수용체의 경우, 원래 분자의 단일체보다는 Ig 와 연결하여 사용하는 것이 바람직하다는 것이 알려져 있다.
보다 구체적으로 살펴보면, 사이토카인의 한 종류인 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor, 이하 'TNF'라 함)의 경우, TNF-의존성 염증 반응을 억제하기 위해 WO92/16221호 및 WO95/34326에서와 같이 종양 괴사 인자 수용체(tumor necrosis factor receptor, 이하 'TNFR'이라 함)를 사용하거나, US5,447,851, WO94/06476에서와 같이 종양 괴사 인자 수용체-면역 글로블린(Ig) 융합 단백질이 사용되고 있다. 많은 보고에 의하면 TNFR-Ig 융합 단백질은 원래 분자의 단일체(monomer) 또는 Ig와 융합되지 않은 분자보다 TNF에 대해 더 높은 친화력(affinity)을 갖는 것으로 보고되고 있다[레스라우어등의 문헌(Eur. J. Immunol. 21:2883, 1991), 아쉬케나지 등의 문헌(PNAS USA 88:10535, 1991), 페펠 등의 문헌(J. Exp. Med. 174:1483, 1991), 몰러 등의 문헌(J. Immunol. 151:1548, 1994)].
종양 괴사 인자-알파[TNF-α, 카케크틴(cachectin)으로도 알려져 있음]와 종양 괴사 인자-베타[TNF-β, 림포톡신(lymphotoxin)으로도 알려져 있음]는 다면적인 사이토카인으로 염증, 세포 면역 반응, 패혈증, 세포독성, 악액질, 류마티스성 관절염, 염증 관련 질환[타타글리아 등의 문헌(Immunol. Today 13:151, 1992)]과 항바이러스성 반응[뷰틀러의 문헌(Peptide Growth Factor Ⅱ, 1990, Springer -Verlag, Berlin, pp.39-70)]을 유발한다.
세포 독성을 포함한 대부분의 TNF-알파, TNF-베타의 작용들은, 이들 각각이삼중체 형태로 TNF 수용체에 결합함에 기인한다[맥 등의 문헌(J.Biol. Chem. 267:2119, 1992)].
TNF수용체에는 분자량 55 킬로달톤(KDa)인 타입 Ⅰ(TNFR1, p55)과 분자량 약 75 칼로달톤(KDa)인 타입 Ⅱ(TNFR2, p75)의 두 가지가 존재한다[스미스 등의 문헌(Science 248:1019, 1990), 로처 등의 문헌(Cell 61:351, 1990), 샬 등의 문헌(Cell 61:361, 1990)]. 이 두 수용체는 모두 TNF-알파와 TNF-베타에 대하여 거의 유사한 친화력을 나타내는 것으로 보고되었다(샬 등의 상기 문헌).
이들 가용성 수용체의 Ig 융합 단백질은 TNF-알파와 TNF-베타와 결합함으로써 세포막에 존재하는 수용체와의 결합을 방해하여 그 작용을 억제하는 효과를 나타내며, TNF-의존성 염증을 완화시킬 수 있는 효과적인 물질로 사용되고 있다.
이러한 종양괴사인자의 작용을 억제함에 있어서 유효작용부위인 종양괴사 인자 수용체의 세포외역부위를 다가화 혹은 다량체화하면 그 효능의 증가를 예상할 수 있다. 이러한 목적으로 종양괴사인자 수용체의 세포외역부위를 면역글로블린의 중쇄와 연결한 융합단백질과 이 부위를 다시 경쇄와 연결한 융합 단백질을 동시에 한 세포주내에서 발현시키면 중쇄와 경쇄간의 결합에 의하여 사량체 구조의 융합단백질을 제조할 수 있다. 이 때 사량체는 유효부위가 생체내에서와 동일하게 병렬 배열된 형태로 제조되고 그 효능은 종래의 이량체에 비하여 현저히 증가됨이 제시된 바 있다[스켈론 등의 문헌(Cytokine 7:759, 1995)].
그러나, 상기와 같은 Ig 융합 단백질의 제조 방법은 융합단백질을 제조할 때에 중쇄와 경쇄 각각에 융합시킨 두 개의 유전자를 동시에 생산세포주에 주입해야하고, 세포가 두 종류의 융합단백질을 생산할 때 두 단백질의 생산수율이 현저히 떨어지며, 생산된 중쇄융합단백질과 경쇄융합단백질들이 100% 결합되지 않아 이량체로부터 사량체를 순수 분리하는 공정 등의 기술적 곤란으로 인하여 실용화되기가 어려운 문제점이 있다. 이러한 이유 등으로 지금까지는 면역글로블린 융합단백질 제제는 두 개의 융합단백질이 서로 병렬 배열된 이량체 형태로 제조 사용되고 있었다.
따라서, 면역반응에 관여하는 단백질의 효과를 개선하기 위하여 단일 유전자를 발현시켜 단일분자의 형태의 효능이 개선된 다가화 혹은 다량체화 단백제제를 생산하는 방법에 대한 요구가 다수 존재하고 있었다.
본 발명자들은 상술한 바와 같은 요구에 따라 국내에서 최초로 면역반응에 관여하는 단백질의 효과를 개선하기 위하여 유효작용부위를 생체내에서 와는 달리 직렬 연결하여 다량체화시킨 연쇄체 형태의 Ig 융합 단백질을 제조하는 방법 및 상기 방법을 이용하여 제조된 종양괴사인자 수용체 세포외역부위 연쇄체(concatamer)와 면역글로블린 증쇄를 결합시킨 연쇄체 형태의 TNFR/Fc(종양괴사인자 면역글로블린)융합 단백질과 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 제조하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 연쇄체화에 의한 면역 글로불린 융합단백질의 효능을 개선하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 면역반응을 조절하고 매개하는 단백질의 유효작용부위를 다량체화시킨 연쇄체 형태의 Ig 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 TNFR1과 TNFR2의 세포외역 부위를 각각 서로 직렬 연결하거나 교차 직렬 연결한 연쇄체 형태의 아미노산 서열을 갖는 4종의 연쇄체 형태의 TNFR/Fc 융합 단백질의 전체 아미노산 서열을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 연쇄체 형태의 TNFR/Fc 융합 단백질의 전체 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 DNA를 포함하는 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 DNA를 포함하는 상기 벡터를 세포에 도입하여 형질전환시켜 제조되는 형질전환체를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 TNF-알파와 TNF-베타에 의한 세포 독성 작용을 효과적으로 억제하는 동시에 관절염을 치료하는데 유효한 연쇄체 형태의 TNFR/Fc 융합 단백질을 제공하는데 있다.
도 1은 중합효소 연쇄반응에 의한 기존 단순 이량체 형태의 TNFR-Ig(종양 괴사 인자 수용체-면역 글로블린 : tumor necrosis factor receptor-immunoglobulin) 다시 말해 TNFR/Fc 융합 유전자를 제조하는 과정을 도시한 개략도.
도 2는 중합효소 연쇄반응에 의한 연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 유전자를 제조하는 과정을 나타낸 개략도.
도 3은 단순 이량체 형태의 TNFR/Fc 융합 단백질 및 연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질의 구조를 도시한 구조도.
도 4는 4가지 타입의 연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질의 구조를 도시한 구조도.
도 5는 TNF 알파의 세포독성을 억제하는 기존 단순 및 연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질의 효과를 나타낸 그래프.
도 6은 TNF 베타의 세포독성을 억제하는 기존 단순 및 연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질의 효과를 나타낸 그래프
도 7은 단순 및 연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질에 의한 DBA/1생쥐에서 콜라겐 유도 관절염(CIA)억제 효과를 나타낸 그래프.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 면역반응에 관여하는 일정 단백질의 유효작용부위를 연쇄체화시켜 연쇄체 형태의 Ig 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 연쇄체 형태의 Ig 융합 단백질을 제조하는 방법은 Ig을 코딩하는 유전자와 면역반응에 관여하는 일정 단백질의 유효작용부위를 코딩하는 유전자로부터, 단순 이량체 형태의 Ig 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 제조하는 단계; 상기 제조된 단순 이량체 형태의 Ig 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 서열과 상기 면역반응에 관여하는 일정 단백질을 코딩하는 유전자의 유효작용부위의 서열에 동일한 제한효소 인식서열을 중합효소 연쇄반응을 이용하여 삽입하는 단계; 상기 제한효소 인식서열과 일치하는 제한효소를 사용하여 상기 단순 이량체 형태의 Ig 융합 유전자의 서열과 상기 일정 단백질을 코딩하는 유전자의 유효작용부위의 제한효소 인식서열 부위를 절단하는 단계; 및 상기 절단된 부분을 라이게이즈로 연결하여 연쇄체 형태의 이량체 Ig 융합 유전자를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 연쇄체 형태의 Ig 융합 단백질의 제조방법은 상기 연쇄체 형태의 이량체 Ig 융합 유전자를 벡터에 삽입하는 단계; 상기 연쇄체 형태의 Ig 융합 유전자를 포함하는 벡터를 난소 세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 상기 형질전환체로부터 상기 형질전환체가 생성한 연쇄체 형태의 Ig 융합 단백질을 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 연쇄체 형태의 Ig 융합 단백질의 제조방법에서 Ig을 코딩하는 유전자는 Ig G1의 Fc 부위를 코딩하는 DNA 단편이고, 상기 Ig에 융합하는 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 유전자는 TNFR의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA단편으로서, 상기 연쇄체 형태의 Ig 융합 단백질은 연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합단백질인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 상기 연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 유전자가 서열 5,7, 9, 및 11에 기재된 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 상기 연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 유전자를 삽입한 벡터가 플라스미드 pTR11-Top10'(기탁번호 : KCCM 10288), 플라스미드 pTR12- Top10'(기탁번호: KCCM 10289), 플라스미드 pTR21-Top10'(기탁번호: KCCM 10290), 플라스미드 pTR22-Top10'(기탁번호: KCCM 10291)인 것을 특징으로 하는 연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 상기 형질전환체가 TR11Ig-CHO (기탁번호: KCLRF-BP -00046), TR12Ig-CHO (기탁번호: KCLRF-BP-00047), TR21Ig-CHO (기탁번호: KCLRF-BP-00048), TR22Ig-CHO (기탁번호: KCLRF-BP-00049)이고, 상기 정제된 연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질은 서열 6, 8, 10, 및 12에 기재된 전체 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 TNFR1-TNFR1-Ig의 전체 아미노산 서열을 및 상기 전체 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 TNFR1-TNFR2-Ig의 전체 아미노산 서열 및 상기 전체 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 제공하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 TNFR2-TNFR1-Ig의 전체 아미노산 서열 및 상기 전체 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 TNFR2-TNFR2-Ig의 전체 아미노산 서열을 및 상기 전체 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 융합 단백질들의 전체 아미노산 서열을 코딩하는 DNA들을 각각 포함하는 플라스미드 pTR11-Top10', pTR12-Top10', pTR21-Top10', pTR22-Top10'을 제공하는 것을 다른 특징으로 한다.
본 발명은 상기 플라스미드 pTR11-Top10', pTR12-Top10', pTR21-Top10', pTR22-Top10'을 난소 세포에 도입하여 형질전환시켜 제조되는 형질전환체를 제공하는 것을 또 다른 특징으로 한다.
본 발명은 또한 TNFR1-Ig, TNFR2-Ig와 같은 단순 이량체 형태의 융합 단백질에 비해, TNFR1-TNFR1-Ig, TNFR1-TNFR2-Ig, TNFR2-TNFR1-Ig, TNFR2-TNFR2-Ig와 같은 연쇄체 형태의 TNFR/Fc 융합 단백질이 TNF-알파와 TNF-베타의 세포 독성 억제 효과가 현저히 증강될 뿐만 아니라 관절염의 치료에도 유효하게 작용함을 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다:
먼저, 본 발명에 따른 연쇄체 형태의 Ig 융합 단백질을 제조하는 방법을 살펴보면, 면역반응에 관여하는 단백질의 유효작용부위를 다가화 또는 다량체화하기 위해, 상기 단백질의 유효작용부위를 코딩하는 DNA 단편은 특정 제한효소의 인식서열과 리더 시퀀스의 코딩서열을 갖는 한 프라이머와 상기 유효작용부위의 3' 말단서열과 Ig의 특정 부위의 5'말단의 일부 서열을 코딩하는 안티센스 서열을 갖는 다른 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 생성시키고,
Ig의 특정 부위를 코딩하는 DNA 단편은 상기 단백질의 유효작용부위의 3'말단의 일부 서열을 포함하고, 상기 Ig의 특정 부위의 5'말단을 코딩하는 서열을 갖는 한 프라이머와 특정 제한효소의 인식서열과 Ig의 특정부위의 3'말단을 코딩하는 안티센스의 서열을 갖는 다른 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 이용하여 생성시킨다.
이와 같이 생성된 상기 단백질의 유효작용부위를 코딩하는 DNA단편과 Ig의 특정부위를 코딩하는 DNA단편을 한 시험관에서 혼합하고 DNA 가닥을 분리한 후, 공통되는 서열사이에서 상보적 결합이 일어나도록 유도한다. 이후 중합효소를 이용하여 각 DNA 가닥의 3' 말단으로부터 중합반응을 일으켜 완전한 두 가닥의 DNA 단편을 생성한다. 이를 주형으로 하여 상기 단백질의 유효작용부위를 코딩하는 서열을 갖는 프라이머와 상기 Ig의 특정부위의 3'말단을 코딩하는 프라이머를 사용한 중합효소연쇄반응을 일으켜, 상기 단백질의 유효작용부위의 DNA단편과 상기 Ig의 특정부위의 DNA단편의 서열을 포함하는 Ig 융합 유전자를 증폭시킨다.
이렇게 생성된 Ig 융합 유전자와 상기 단백질 유효작용부위의 서열을 갖는 DNA단편에 동일한 제한효소 인식서열을 중합효소 연쇄반응을 이용하여 삽입한 후, 제한효소를 사용하여 상기 제한효소 인식서열 부위를 절단하고, 절단된 부분을 라이게이즈로 연결하여 연쇄체 형태의 Ig 융합 유전자를 제조한다.
상기 제조된 Ig 융합 유전자를 삽입한 벡터를 제조한 후, 상기 벡터를 세포에 도입하여 형질감염시킴으로써 형질전환체를 제조하고, 상기 형질전환체를 증폭배양하여 생성된 연쇄체 형태의 Ig 융합 단백질을 정제함으로써 연쇄체 형태의 Ig융합 단백질을 얻을 수 있다.
여기서, 상기 면역 반응에 관여하는 단백질로는 사이토카인(IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, TNF, TGF, INF, GM-CSF, G-CSF 등)과 각 사이토카인에 대한 수용체(IL-1R, IL-2R, IL-4R, IL-6R, IL-7R, TNFR, TGFR, INFR, GM-CSFR, G-CSFR 등) 및 기타 세포표면수용체(CD2, CD4, CD40, CTLA-4, ICOS, ICAM-1 등)가 포함될 수 있으며, 상기 Ig의 특정부위는 IgM, IgD, IgG, IgA, IgE를 포함하는 면역 글로블린의 특정부위 일 수 있다.
이하에서는, 본 발명에 의한 연쇄체 형태의 Ig 융합 단백질의 제조방법을 보다 구체적으로 예시하기 위해 면역반응에 관여하는 특정 단백질의 유효작용부위를 코딩하는 DNA단편은 TNFR의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA단편으로 특정하고, Ig의 특정부위를 코딩하는 DNA단편은 Ig G1의 Fc 부위를 코딩하는 DNA 단편으로 특정한 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1
1. 단순 이량체 형태의 TNFR/Fc 융합 유전자의 제조
우선, 두 종류의 인체 TNF 수용체, TNFR1(타입 Ⅰ, p55), TNFR2(타입 Ⅱ, p75)의 세포외역 가용성 부위와 인체 면역글로블린 G1의 Fc부위가 연결된 융합 유전자를 제조하기 위해 문헌[홀튼 등의 Biotechniques 8:528, 1990)]에 상술되어 있는 방법과 동일한 방법으로 중합효소 연쇄반응 방법(PCR)을 수행하였다.
도 1을 통해 TNFR/Fc 융합 단백질의 제조하는 방법을 살펴보면,
먼저, TNF수용체(TNFR)의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편은, 제한효소 EcoR1의 인식서열과 리더 시퀀스[TNFR1(SEQ ID NO:2의 펩타이드 1-20), TNFR2(SEQ ID NO:4의 펩타이드 1-22)]의 코딩 서열[TNFR1(SEQ ID NO:13의 뉴클레오티드), TNFR2(SEQ ID NO:17의 뉴클레오티드)]을 갖는 한 프라이머와, 상기 세포외역 가용성 부위(TNFR-ED)의 3' 말단서열과 면역글로블린 G1(IgG1)의 상쇄부위(hinge region:H)의 5' 말단의 일부 서열을 코딩하는 안티센스 서열[TNFR1(SEQ ID NO:14의 뉴클레오티드), TNFR2(SEQ ID NO:18의 뉴클레오티드)]을 갖는 다른 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 생성시켰다. 이 반응을 위한 주형 cDNA는 건강한 성인의 단핵구 세포(T림파구)에서 추출한 mRNA를 역전사-중합효소 연쇄반응을 이용하여 제조하였다.
건강한 성인의 혈액을 채취하고 알피엠아이-1640[RPMI-1640(Gibco BRL, USA)] 배지와 1:1로 희석하여 이를 피콜-하이팩 [Ficoll-hypaque(Amersham, USA)]를 사용하여 밀도구분 원심분리(density-gradient centrifugation)하여 상부에 형성된 T 림프구 세포층을 얻었다. 그리고 알피엠아이-1640 배지로 3회 세척하고 여기에 10% 우태아혈청(FBS, Gibco BRL,5 USA) 함유 알피엠아이-1640 배지를 가하여 T 림프구 세포가 5×105cells/ml로 하고, 류코아굴루티닌 [leukoagglutinin(Pharmacia, USA)]을 3.5㎍/ml가 되도록 첨가한 후, 5% CO2배양기에, 37℃에서 2일간 배양하였다.
mRNA는 트리리젠트 [Tri-Reagent(MRC, USA)] mRNA 분리 키트를 이용하여 순수 분리하였다. 우선 인간 T 림프구 2×107개의 세포를 인산완충 생리식염수용액(phosphate buffered saline, PBS, pH7.2)으로 3회 세척한 후 1㎖ 트리리젠트로 수차례 섞어서 RNA를 용해시켰다. 이 튜브에 0.2㎖ 클로로포름(chloroform)을 첨가하여 강하게 흔들어준 후, 실온에서 15분간 방치한 다음, 4℃에서 15,000rpm으로 15분간 원심 분리하였다. 상층액을 1.5㎖ 튜브로 옮기고 0.5㎖ 이소프로판올(isopropanol)을 첨가한 후, 4℃에서 15,000rpm으로 15분간 원심 분리하였다. 상층액을 버린 후, 침전물에, 75% 에탄올(Ethanol)-25% 디이피씨[DEPC(Sigma, USA)]를 처리한 3차 증류수를 1㎖ 첨가하여 2∼3회 섞은 후 4℃에서 15,000rpm으로 15분간 원심 분리하였다. 상층액을 완전히 제거하고 공기 중에서 건조시켜 잔여 에탄올을 제거한 후 RNA를 디이피씨를 처리한 3차 증류수 50㎕로 녹였다.
cDNA 합성은 1.5㎖ 튜브에 정제된 2㎍ mRNA와 1㎕ 올리고 디티[oligo dT(dT30, Promega, USA)] 프라이머를 10μM의 농도로 혼합하고, 70℃에서 2분간 가열한 후, 얼음에 넣어 2분간 식혔다. 이 혼합물에 200U 엠-엠엘브이(M-MLV) 역전사 효소[reverse transcriptase(Promega, USA)], 10㎕ 5X 반응완충용액(reaction buffer) [250mM 트리스-에이치씨엘(Tris-HCl), pH 8.3, 375mM 염화칼륨(KCl), 15mM염화마그네슘(MgCl2), 50mM 디티티(DTT)], 1㎕ 디엔티피[dNTP(각각 10mM의 농도, Takara, Japan)]를 넣고 디이피씨를 처리한 3차 증류수로 50㎕가 되도록 첨가한 후, 42℃에서 1시간 반응시켜 1차 cDNA를 합성하였다.
또한, 면역글로블린 G1의 Fc 부위를 코딩하는 DNA 단편은, TNFR 세포외역 가용성부위의 3'말단의 일부 서열을 포함하고, IgG1의 상쇄부위의 5'말단을 코딩하는 서열을 갖는 한 프라이머[TNFR1(SEQ ID NO:15의 누클레오티드), TNFR2(SEQ ID NO:19의 누클레오티드)]와 Xba1의 인식서열과 IgG1 Fc의 3' 말단을 코딩하는 안티센스의 서열을 갖는 다른 프라이머(SEQ ID NO:16)를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 생성시켰다. 이 반응을 위한 주형 cDNA는 회복기에 있는 원인 불명의 열 환자의 말초 혈액 세포(B 림파구)에서 추출한 mRNA를 역전사-중합효소 연쇄반응을 이용하여 제조하였다.
이어서 상기 생성된 TNF수용체(TNFR)의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편과 면역글로블린 G1의 Fc 부위를 코딩하는 DNA 단편을 한 시험관에서 혼합한 후, 공통되는 서열(TNFR 세포외역 가용성 부위 3' 말단과 IgG1 상쇄부위의 5' 말단을 포함하는 서열)사이에서 상보적 결합이 일어나도록 유도한다. 이를 주형으로 하여 TNFR의 5' 말단을 코딩하는 서열을 갖는 프라이머[TNFR1(SEQ ID NO:13의 뉴클레오티드), TNFR2(SEQ ID NO:17의 뉴클레오티드)]와 IgG1 Fc의 3'말단을 코딩하는 프라이머(SEQ ID NO:16의 뉴클레오티드)를 사용한 중합효소 연쇄반응을 일으켜, 상기 TNFR 세포외역 가용성 부위의 DNA 단편과 IgG1 Fc 부위의 DNA 단편의 서열을 포함하는 TNFR/Fc 융합 유전자를 증폭시킨다. 여기서 CH1 및 CH2는 중쇄의 제 2, 제 3 불변 도메인을 나타내며, 제조된 유전자는 발현 후 단백질의 분비를 용이하게 하기 위한 리더 시퀀스를 포함한다.
상기 생성된 융합 유전자 단편을 제한효소 EcoR1과 Xba1으로 소화시키고, 시판되고 있는 클로닝 벡터(stratagene사 제품) 피블루스크립트 케이에스투 플러스[pBluescript KS Ⅱ(+)]의 EcoR1/ Xba1 부위에 삽입하여 클로닝하였다. 전체 코딩 영역 서열을 DNA 서열화에 의해 확인하였다 (SEQ ID NO:1, 3). 이때 생성된 융합 단백질을 각각 TNFR1-Ig, TNFR2-Ig라 명명하였고, 타원형 구조는 융합 유전자의 1 차 발현 산물 단백질의 구조를 나타낸다.
이러한 TNFR-Ig 융합 유전자의 예에는 국제 특허 출원 공개 제94/06476, WO97/41895, US5,477,851, US5,395,760, EP417,536, 스칼론 등의 문헌(Cytokine 7:759, 1995), 레스라우어 등의 문헌(Eur. J Immunol. 21:2883, 1991), 로처 등의 문헌(J. Biol. Chem. 266:18324, 1991), 아쉬케나지 등의 문헌[PNAS(USA) 88:10535, 1991]에 기술된 방법에 의해 제조될 수 있는 단백질이 포함된다.
2. 연쇄체 형태의 TNFR/Fc 융합 유전자의 제조
TNFR 세포외역 가용성 부위가 연쇄체(concatamer)의 형태를 갖는 융합 유전자를 만들기 위해, TNFR 세포외역 가용성 부위의 서열과 상술한 단순 이량체 형태의 융합 유전자의 서열에 동일한 제한효소(BamH1) 인식서열을 중합효소 연쇄반응을 이용하여 삽입한 후, BamH1으로 절단된 부분을 라이게이즈(ligase)로 연결하였다.
도 2를 통해 보다 구체적으로 연쇄체 형태의 TNFR/Fc 융합 유전자를 제조하는 과정을 살펴보면, 먼저, 3'말단에 BamH1 인식서열을 갖는 TNFR 세포외역 가용성부위의 단편은 TNFR1의 경우 SEQ ID NO:13의 뉴클레오티드와 SEQ ID NO:21의 뉴클레오티드에 해당하는 프라이머를 사용하여 증폭하였고, TNFR2의 경우 SEQ ID NO:17의 뉴클레오티드와 SEQ ID NO:23의 뉴클레오티드에 해당하는 프라이머를 사용하여 증폭하였으며, 단순 이량체 형태의 TNFR/Fc 융합 유전자의 5'말단은 BamH1 인식서열 외에도 예를 들어 글리코실레이션(glycosylation) 된 염기서열[TNFR1(SEQ ID NO:5의 뉴클레오티드 631-639), TNFR2(SEQ ID NO:7의 뉴클레오티드 628-646)]을 코딩하는 프라이머 [TNFR1 5'말단(SEQ ID NO:20의 뉴클레오티드), TNFR2 5'말단(SEQ ID NO:22의 뉴클레오티드)]를 사용하여 연쇄체 결합부위에 당측쇄 결합이 가능하도록 하였다. 연쇄체 형태의 TNFR/Fc 융합 유전자 제조시 특정부위 서열의 일부 삭제 및 첨가에 의한 효능 증가가 가능하며, 글리코실레이션 등의 변형을 통해 연쇄체 결합부위가 세포내 단백분해효소의 공격으로부터 보호되도록 하여 혈중에서의 반감기를 증가시켜 결국에는 효능이 증가하는 효과를 얻는 것이 가능하다.
중합효소 연쇄반응은 1㎕ 1차 cDNA, 2U 피에프유(pfu) DNA 중합효소 [polymerase (Stratagene, USA)], 10㎕ 10X 반응완충용액(reaction buffer) [200mM 트리스-에이치씨엘, pH 8.75, 100mM 황산암모늄[(NH4)2SO4], 100mM 염화칼륨(KCl), 20mM 염화마그네슘(MgCl2)], 1% 트리톤(등록상표 Triton) X-100, 1㎎/㎖ 우혈청알부민(BSA), 3㎕ 프라이머1(10μM), 3㎕ 프라이머2(10μM), 2㎕ 디엔티피(dNTP, 각각10mM)를 넣고 3차 증류수로 100㎕가 되도록 첨가한 후 실시하였다. 반응 조건은 94℃에서 5분동안 처리한 다음 95℃ 1분, 58℃ 1분30초, 72℃ 1분30초씩 31회 반응시키고, 72℃ 15분간 더 반응 시켜 중합효소 연쇄반응 산물이 완전한 평활 말단이 되도록 하였다.
중합효소 연쇄반응 산물을 0.8% 아가로즈 젤(agarose gel)에 전기영동한 후, 큐엑스 투 젤 추출 키트[Qiaex Ⅱ gel extraction kit(Qiagen, USA)]를 이용하여 순수 분리하였다. 순수분리된 중합효소 연쇄반응 산물을 제한효소 EcoR I(Takara, Japan)과 Xba I(Takara, Japan)으로 처리한후 페놀/클로로포름 추출 방법으로 순수분리하였다. 이 반응은 상기한 단순 이량체 융합 유전자(SEQ ID NO:1의 누클레오티드, SEQ ID NO:3의 누클레오티드)를 주형으로 사용하였다.
이와 같이 제조된 연쇄체 형태의 융합 유전자는 피블루스크립트 케이에스투 플러스 [pBluescript KS Ⅱ(+), Stratagene, USA)]의 EcoRI/ XbaI 부위에 삽입하여 클로닝하였다. 벡터로 사용할 10㎍ 피블루스크립트 케이에스투 플러스 [pBluescript KS Ⅱ(+), Stratagene, USA)]를 15U EcoRI과 15U XbaI, 5㎕ 10X 반응완충용액(reaction buffer) [100mM 트리스-에이치씨엘(Tris-HCl), pH 7.5, 100mM 염화마그네슘(MgCl2), 10mM 디티티(DTT), 500nM 염화나트륨(NaCl)], 5㎕ 0.1% 우혈청알부민[BSA(Takara, Japan)]을 섞은 후, 3차 증류수로 50㎕가 되도록 첨가한 후 37℃에서 2시간 반응시켜 DNA를 소화시켰다. 반응물을 0.8% 아가로즈 젤에 전기영동한 후, 큐엑스 투 젤 추출 키트[Qiaex Ⅱ gel extraction kit(Qiagen, USA)]로순수 분리하였다.
EcoRI과 XbaI으로 소화된 피블루스크립트 케이에스투 플러스 [pBluescript KS Ⅱ(+), Stratagene, USA] 100ng과 제한효소로 소화시킨 20ng의 중합효소 연쇄반응 산물을 혼합하고 0.5U 티포(T4) DNA 라이게이즈[ligase(Amersham, USA)], 1㎕ 10X 반응완충용액(reaction buffer) [300mM 트리스-에이치씨엘(Tris-HCl), pH 7.8, 100mM 염화마그네슘(MgCl2), 100mM 디티티(DTT), 10mM 에이티피(ATP)]를 넣은 후 3차 증류수로 10㎕가 되도록 첨가한 후 16℃ 수조(water bath)에서 16시간 동안 반응시켰다. 대장균[E. coli Top10(Novex, USA)]을 리비듐 클로라이드(RbCl, ribidium chloride, Sigma, USA)법으로 컴피턴트 세포(competent cell)를 만든 후 형질전환시켜 암피실린(ampicillin, Sigma, USA)을 50㎍/㎖ 함유한 엘비(LB) 고체배지에 도말하고 37℃에서 16시간 배양하였다. 생성된 콜로니들을 암피실린이 50㎍/㎖ 함유된 엘비(LB) 액체배지 4㎖에 접종한 후 37℃에서 16시간동안 진탕 배양하였다. 이 중 1.5㎖을 샘브룩 등의 문헌(Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p1.25-1.31, p1.63-1.69, p7.26-7.29, 1989)에 기술된 알칼리 분해(alkaline lysis)법으로 플라스미드를 소량 추출한 후, EcoRI과 XbaI으로 소화시켜 클로닝의 유무를 확인하였다.
전체 코딩영역 서열은 다이데옥시 체인 터미네이션 [Dideoxy chain termination(생어 등의 문헌, PNAS USA, 74:5483, 1977)법을 이용한 다음과 같은 DNA 서열화 방법에 의해 확인하였다. 상기의 알칼리 분해법으로 추출한 플라스미드와 시쿼네이즈(등록상표 Sequenase ver. 2.0, Amersham, USA) 및35S 디에이티피(dATP, Amersham, USA)를 사용하여 제품 사용법에 준하는 방법으로 DNA 서열화 반응을 진행시켰다. 6% 폴리아크릴아미드 젤(polyacrylamide gel)에 위의 시료를 로딩(loading)하고 전압을 1800∼2000V 사이로 유지하여 젤의 온도를 50℃로 유지하면서 2시간 전기영동한 후, 건조시킨 다음 엑스레이 필름(Kodak, USA)에 2일동안 노출시킨 후 DNA 염기 서열을 판독하였다.
이 연쇄체 형태의 TNFR/Fc 융합 유전자들을 TNFR 세포외역 부위의 종류에 따라 각각 TNFR1-TNFR1-Ig, TNFR1-TNFR2-Ig, TNFR2-TNFR1-Ig, 및 TNFR2-TNFR2-Ig라 명명하였고, 상기 연쇄체 형태의 TNFR/Fc 융합 유전자들의 서열은 첨부한 서열목록 5, 7, 9, 11에 기재된 바와 같다.
실시예 2
단순/연쇄 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질의 발현 및 정제
중국산 햄스터의 난소 케이원(CHO-K1, ATCC CCL-61, Ovary, Chinese hamster,Cricetulus griseus) 세포에서 융합 단백질을 발현시키기 위하여, TNFR/Fc 융합 유전자를 포함한 블루스크립트 케이에스투 플러스 플라스미드 DNA를 형질 전환된 대장균에서 추출한 후, 제한효소 EcoR1과 Xba1으로 소화시켜 얻은 TNFR/Fc 단편을 동물세포 발현 벡터인 피씨알쓰리(pCRTM3, Invitrogen, USA) 플라스미드의 EcoR1/ Xba1 부위에 삽입하여, 발현 벡터를 제조한 후 이를 각각 플라스미드 pTR11-Top10', 플라스미드 pTR12- Top10', 플라스미드 pTR21-Top10' 및 플라스미드 pTR22-Top10'로 명명하고, 2001년 7월 10일자로 한국미생물 보존센터(KCCM)에 각각 KCCM 10288, KCCM 10289, KCCM 10290 및 KCCM 10291의 수탁번호로 기탁하였다.
형질 감염은 상기 TNFR/Fc 융합 유전자를 포함한 플라스미드 pTR11-Top10', 플라스미드 pTR12- Top10', 플라스미드 pTR21-Top10' 및 플라스미드 pTR22-Top10' DNA 중 어느 하나를 지브코 비알엘(Gibco BRL, USA)사의 리포펙타민(LipofectamineTM) 시약과 혼합함으로써 수행하였다. 1~3 × 105cells/well의 농도의 중국산 햄스터의 난소(CHO-K1) 세포를 6구 조직 배양판(six-well tissue culture plate, Nunc, USA)에 접종하고 10% 우태아혈청(FBS)을 함유한 디엠이엠(DMEM) 배지에서 세포가 50 ~80%가 되도록 배양한 후, 혈청이 없는 디엠이엠(DMEM) 배지에서 상기 TNFR/Fc 융합 유전자를 포함한 플라스미드 pTR11-Top10', 플라스미드 pTR12- Top10', 플라스미드 pTR21-Top10' 및 플라스미드 pTR22-Top10' DNA 중 어느 하나를 1~ 2㎍ 취하고, 리포펙타민(Gibco BRL, USA)을 2~25㎕ 취하여 상온에서 15~45분간 반응시킨 DNA-리포좀 혼합체(Liposome complex)를 세포 배양판에 첨가시켰다. 5시간동안 배양한 후 혈청이 20%가 함유된 디엠이엠(DMEM) 배지를 첨가하여 18~24시간 배양하였다. 최초 형질 감염 후에 세포를 1.5 ㎎/㎖의 제네티신(Geneticin, G418, Gibco BRL, USA)이 첨가된 10% 우태아혈청 디엠이엠(DMEM) 배지에서 3주간 배양하고, 형성된 집락을 분리하여 증폭 배양하였다. 융합 유전자의 발현 여부는 퍼옥시데이즈가 표지된 염소 항 인간 면역 글로블린(Peroxidaselabeled goat anti-human IgG, KPL, USA)을 사용한 효소 면역 검사법(ELISA)을 통해 검사하였다.
효소 면역 검사법(ELISA)은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 먼저, 1㎎/㎖ 염소 항 인간 면역 글로블린(Peroxidase labeled goat anti-human IgG, KPL, USA)를 0.1M 중탄산나트륨(sodium bicarbonate)에 1:2000으로 희석한 후, 96구 효소 면역 검사판(96-well flexible plate, Falcon, USA)에 100㎕씩 분주하고 랩으로 봉한 후 4℃에서 16시간 이상 방치하여 항체가 검사판 표면에 코팅되게 하였다. 이를 세척완충용액(washing buffer) [0.1% 트윈-20(Tween-20) 함유 , 1X 인산완충 생리식염수(PBS, Phosphate buffered saline)로 3회 세척한 후 희석용액[diluent buffer(1X 인산완충 생리식염수 48.5㎖, 우태아 혈청 1.5㎖, 트윈-20 50㎕)을 100㎕씩 분주하였다. 첫 구(well)에 배양한 상층액 100㎕를 넣은 후 마이크로 피펫(micropipett)을 이용하여 연속적으로 희석하였고, 양성 대조군으로 0.01㎍/㎕ 인간 면역 글로블린(human IgG, Sigma, USA)를, 음성 대조군으로 형질감염되지 않은 중국산 햄스터의 난소 케이원(CHO-K1) 세포의 배양액을 사용하여 동일하게 희석하였다. 희석이 끝난 96구 효소 면역 검사판(Falcon, USA)를 호일로 싸서 37℃에서 1시간 30분간 반응시킨 후, 세척용액으로 3회 세척하였다. 퍼옥시데이즈가 표지된 염소 항 인간 면역 글로블린(Peroxidase labeled goat anti-human IgG, KPL, USA)를 희석용액으로 1:5000 희석한 다음 이를 100㎕씩 분주하고 호일로 싼 후 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 세척용액으로 3회 세척한 후 티엠비 퍼옥시데이즈 시스템(TMB microwell peroxidase substrate system, KPL, USA)을 이용하여발색시키고, 흡광기(microplate reader, Bio-RAD, Model 550, Japan)로 파장 695㎚에 대한 흡광도를 측정하여 발현 여부를 확인하였다.
이렇게 제조된 형질전환체(transfectant)를 각각 TR11Ig-CHO , TR12Ig-CHO , TR21Ig-CHO 및 TR22Ig-CHO로 명명하고, 2001년 7월 7일자로 한국세포주 연구재단 (KCLRF)에 각각 KCLRF-BP-00046, KCLRF-BP-00047, KCLRF-BP-00048 및 KCLRF-BP-00049의 수탁번호로 기탁하였으며, 상기 형질전환체가 생성한 융합 단백질을 정제할 목적으로 무혈청배지(serum free media) 중 CHO-S-SFM Ⅱ(Gibco BRL, USA)에 적응시키기 위하여 다음의 과정으로 진행하였다. 약 3× 105개의 세포를 6구판(6-well plate)에 접종한 후 16시간동안 5% CO237℃ 배양기에서 배양하여 정착시킨후 현미경 하에서 약 30~50%의 면적에 cell이 부착된 것을 확인하고 10% 우태아 혈청 함유 DMEM와 CHO-S-SFM Ⅱ의 비율을 8:2가 되도록 배지를 교체하여 배양하였다. 이 비율로 3회 계대 배양한 후, 각각 6:4의 비율로 3회, 4:6의 비율로 3회, 3:7의 비율로 3회, 2:8의 비율로 3회, 및 1:9의 비율로 3회 계대 배양한 후 최종적으로 100% CHO-S-SFM Ⅱ 배지에서 계대 배양하여, 이의 발현량을 효소 면역 검사법을 이용하여 측정하였다.
이 세포들을 우혈청배지가 없는 CHO-S-SFM Ⅱ(Gibco BRL, USA) 배지에서 대량 배양후 각각의 융합 단백질을 함유한 배양액을 200× g, 12분간 원심분리하여 세포 찌꺼기들을 완전히 제거하고 프로테인 에이 컬럼(HiTrap protein A column, Amersham, USA)을 이용한 다음의 방법으로 순수 분리하였다. 20mM 인산화나트륨(Sodium phosphate, pH 7.0, sigma, USA)을 1㎖/min의 속도로 2분간 통과시킨 후, 10㎖ 배양액을 동일한 속도로 컬럼을 통과시켜 프로테인 에이에 융합 단백질이 결합하도록 하였다. 20mM 인산화 나트륨(pH 7.0)을 2분간 동일 속도로 통과시켜 세척한 후, 0.1M 시트르산(C6H8O7. H2O. citric acid, pH 3.0, sigma, USA)을 3분간 동일 속도로 통과시키면서 500㎕씩 1.5㎖ 튜브에 순차적으로 추출물을 분주하였다. 이를 1M 트리스(Tris, pH 11.0, USB, Sigma)를 이용하여 pH 7.0으로 적정하였으며 각 튜브의 융합 단백질의 존재 유무는 상기에 기술한 효소면역 검사법(ELISA)을 통하여 확인하였다. 순수 분리한 융합 단백질은 센트리콘 30(Centricon 30, Amicon, USA)을 사용하여 4℃에서 2000×g, 30분간 원심분리하여 농축하였다.
도 3은 단순 이량체 형태의 TNFR/Fc 융합 단백질 및 연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질의 구조를 도시하고 있는데, 여기서 TNFR/Fc 융합 유전자를 코딩하는 플라스미드의 1차 번역 산물은 IgG1으로부터 유도된 Fc의 단일 사슬에 결합된 가용성 TNFR의 단일분자로서, 번역 후 및 분비 전에 상기 융합 단백질은 Fc영역에 있는 3개의 시스테인 잔기를 통해 이량체화 되어 이량체 형태의 TNFR/Fc 융합 단백질을 형성한다.
도 4는 이렇게 발현된 4가지 종류의 연쇄체 형태 TNFR/Fc 융합 단백질들의 구조를 도시하고 있는데, TNFR 세포외역 부위의 종류에 따라 각각 TNFR1-TNFR1-Ig, TNFR1-TNFR2-Ig, TNFR2-TNFR1-Ig, 및 TNFR2-TNFR2-Ig 융합 단백질이라 명명하였고, 상기 연쇄체 형태의 TNFR/Fc 융합 단백질들의 서열은 첨부한 서열목록 6, 8, 10,및 12에 기재된 바와 같다.
실시예 3
단순/연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질의 TNF 알파(α)와 TNF (β)의 세포독성 중화 효과 실험
TNFR/Fc 융합 단백질의 TNF 알파(α)와 TNF 베타(β)에 유도되는 세포독성을 억제하는 효과를 검사하기 위하여 L929 세포[ATCC, Mus musculus (mouse), NCTC clone 929(derivative of Strain L; L-929;L cell]를 이용하였다. 이 분석은 TNF에 의해 유도되는 세포독성을 억제하는 TNFR의 활성[스칼론(Scallon) 등, Cytokine 7:759, 1995)에 기초를 두고 있다.
L929 세포를 96구 판(96-well plate)에 3×104cells/well이 되게 접종하고,37℃, CO2배양기에서 24시간 배양한다. 이어서, 엑티노마이신 디(Actinomycin D, Sigma, USA)를 3㎍/㎖이 되게 첨가하고, 100% 세포독성을 나타내는 농도(0.5 ~ 2 ng/㎖)의 TNF 알파 및 베타(R&D, USA)와 10배씩 연속적으로 희석한 TNFR 표본과 함께 16~18시간 배양한다. 이어서 96구 판에 있는 세포를 염색시약인 크리스탈 바이올렛(crystal violet, Wako pure chemical industries, Japan)으로 염색하고 세포 활성도는 흡광도 595 nm에서 흡광기(spectrophotometer, Bio-RAD, Model-550, Japan)를 이용하여 측정하였다.
하기의 표 1은 각 TNFR/Fc 융합 단백질의 억제농도 중간값(IC50)으로서, 단순이량체 형태의 융합 단백질 (TNFR1-Ig, TNFR2-Ig)보다 연쇄체 형태의 융합 단백질(TNFR1-TNFR1-Ig, TNFR1-TNFR2-Ig, TNFR2-TNFR1-Ig, TNFR2-TNFR2-Ig)이 두 종류의 TNF에 대한 세포독성을 억제하는 효과가 모두 현저히 높은 것을 알 수 있다. 또한 기존의 단순 이량체 형태와 본 발명의 연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질이 TNF 알파(도 5)와 베타(도 6)의 세포독성을 억제하는 효과를 대비하면 본 발명의 연쇄체 형태의 TNFR/Fc 융합 단백질이 TNF 알파와 베타의 세포독성을 현저하게 억제하는 것이 더욱 명백하게 나타난다.
억제 농도 중간값
융합단백질
TNF 알파 처리구 TNF 베타 처리구
단순이량체형 TNFR1-IgTNFR2-Ig 63189 129469
연쇄이량체형 TNFR1-TNFR1-IgTNFR1-TNFR2-Ig TNFR2-TNFR1-IgTNFR2-TNFR2-Ig 9122415 20265915
실시예 4
DBA/1 생쥐의 콜라겐 유도 관절염에 대한 단순/연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc융합 단백질의 효과 실험
아스로젠 씨아이에이 보조제(Arthrogen-CIA ajuvant, Chondrex, USA) 중의 0.05M의 아세트산에 2㎎/㎖의 농도로 녹인, 타입 Ⅱ 콜라겐을 DBA/1 생쥐 한 마리당 꼬리에 100 ㎍씩 주입하여 콜라겐 유도 관절염(CIA; Collagen InducedArthritis)을 발병시켰다. 부스팅(Boosting)은 3주 후에 하였으며 불완전 프로인트 보조제(incomplete Freund's adjuvant, Difco, USA)를 이용하였다.
DBA/1 생쥐에 타입 Ⅱ 콜라겐 100㎍으로 면역화시킨 후에 3-4 주 후에 관절염 증상이 나타났다. 증상이 나타난 후 3-5일이 지나면 생쥐의 발이 빨갛게 부어오르며, 염증성 관절염(inflammatory arthritis)은 3-4주 이상 지속되었으며, 염증이 약화되어도 관절은 영구히 경직된다. 관절염 심도의 주관적 척도를 나타내는 표 2에 근거하여 1주일에 2-3회 측정하였다(각 실험군에서 5마리 생쥐에서의 평균값을 구함). 콜라겐 유도 관절염에 대한 단순 및 연쇄체 형태의 이량체의 TNFR/Fc 효과를 측정하기 위하여 생쥐에 TNFR/Fc 또는 인산완충 생리식염수(PBS)를 복강내로 주사하였다. TNFR/Fc는 실험군당 5마리의 생쥐에 제19일 내지 45일동안 2일에 한번씩 10 ㎍을 주사하였다(도 7의 화살표시). 5마리의 대조군 생쥐에는 PBS를 주사하였다. 상기 측정결과를 나타낸 도 7에서와 같이, 기존 단순 이량체 형태의 TNFR/Fc 융합단백질을 주입한 생쥐의 경우 대조군인 인산완충 생리식염수를 주사한 생쥐에 서 발병한 관절염 지표의 수치와 비교할 때 약 26~38% 감소된 효과를 보였으나 (제45일 측정치를 기준), 연쇄체 형태의 이량체인 TNFR1-TNFR1-Ig, TNFR2-TNFR2-Ig를 주입한 경우는 42~55% 감소된 효과를 나타냈다. 이와같이 단순 이량체 형태의 TNFR/Fc 융합 단백질에 비해 연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질이 생쥐의 관절염을 현저히 감소시키는 것을 알 수 있다.
관절염 지표
심도스코어(severity score) 병의 경과 상태
01234 홍진(erythema)과 종기(swelling)가 없음홍진과 작은 종기가 발목관절(ankle)이나 족근골(tarsal)에 한하여 나타난다.홍진과 작은 종기가 발목관절에서 족근골까지 번진다.홍진과 작은 종기가 발목관절에서 척골관절(metatarsal joint)까지 번진다.홍진과 심한 종기가 발목관절, 다리, 발가락까지 확장된다.
*생쥐의 각 다리의 심도스코어를 더하여 계산하며 한 마리당 16이 최고이다.
상기 결과들은 연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질이 생쥐의 CIA의 발병율을 저하시키는데 기존의 단순 이량체 형태의 융합 단백질에 비해 효과적이며, 따라서 관절염 치료에 사용함에 있어서 연쇄체 형태의 단백질제제가 기존의 단백질 제제에 비해 효과적인 치료제로 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 면역반응에 관여하는 일정 단백질의 유효작용부위를 연쇄체화시켜 면역 글로블린 융합 단백질의 효능을 개선시키는 방법 및 연쇄체 형태의 Ig 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 연쇄체 형태의 Ig 융합 단백질을 제조하는 방법에 의하면, 면역반응에 관여하는 단백질의 유효작용부위를 다가화 또는 다량체와 함으로써 상기 단백질의 작용효과를 현저하게 개선시킨 연쇄체 형태의 Ig 융합 단백질을 얻을 수 있다.
또한 본 발명은 보다 구체적으로 연쇄체 형태의 TNFR/Fc 융합 단백질의 전체 아미노산 서열 및 상기 연쇄체 형태의 TNFR/Fc 융합 단백질의 전체 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 제공하는데, 본 발명의 연쇄체 형태의 TNFR/Fc 융합 단백질은 최초로 발현된 것이고, 또한 그 게놈도 신규한 염기서열을 갖는 바, 이를이용하는 경우 TNF 알파 및 베타에 의해 유도되는 세포독성을 효과적으로 억제함으로써 TNF 알파 및 베타에 의한 세포독성으로 인해 발병하는 질병을 효과적으로 치료할 수 있다.
아울러, 본 발명의 연쇄체 형태의 TNFR/Fc 융합 단백질은 관절염 치료에 유효하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Claims (27)

  1. Ig 융합 단백질을 제조하는 데 있어서, 면역반응에 관여하는 일정 단백질의 유효작용부위를 연쇄체화시킴으로써 연쇄체 형태의 Ig 융합 단백질을 제조하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, Ig을 코딩하는 유전자와 면역반응에 관여하는 일정 단백질의 유효작용부위를 코딩하는 유전자로부터, 단순 이량체 형태의 Ig 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 제조하는 단계;
    상기 제조된 단순 이량체 형태의 Ig 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 서열과 상기 면역반응에 관여하는 일정 단백질을 코딩하는 유전자의 유효작용부위의 서열에 동일한 제한효소 인식서열을 중합효소 연쇄반응을 이용하여 삽입하는 단계;
    상기 제한효소 인식서열과 일치하는 제한효소를 사용하여 상기 단순 이량체 형태의 Ig 융합 유전자의 서열과 상기 일정 단백질을 코딩하는 유전자의 유효작용부위의 제한효소 인식서열 부위를 절단하는 단계; 및
    상기 절단된 부분을 라이게이즈로 연결하여 연쇄체 형태의 Ig 융합 유전자를 제조하는 단계를 포함하는 연쇄체 형태의 Ig 융합 단백질을 제조하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 연쇄체 형태의 Ig 융합 유전자를 벡터에 삽입하는 단계;
    상기 연쇄체 형태의 Ig 융합 유전자를 포함하는 벡터를 난소 세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;
    상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 상기 형질전환체로부터 상기 형질전환체가 생성한 연쇄체 형태의 Ig 융합 단백질을 정제하는 단계를 더 포함하는 연쇄체 형태의 Ig 융합 단백질을 제조하는 방법.
  4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 Ig을 코딩하는 유전자는 Ig G1의 Fc 부위를 코딩하는 DNA 단편이고, 상기 Ig에 융합하는 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 유전자는 TNFR의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA단편으로서, 상기 연쇄체 형태의 이량체 Ig 융합 단백질은 TNFR/Fc 융합단백질인 연쇄체 형태의 Ig 융합 단백질을 제조하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 연쇄체 형태의 이량체 Ig 융합 유전자는 서열 5, 7, 9, 및 11에 기재된 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 연쇄체 형태의 Ig 융합 단백질을 제조하는 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 유전자를 벡터에 삽입하는 벡터는 플라스미드 pTR11-Top10'(기탁번호: KCCM 10288), 플라스미드 pTR12-Top10'(기탁번호: KCCM 10289), 플라스미드 pTR21-Top10'(기탁번호: KCCM 10290), 플라스미드 pTR22-Top10'(기탁번호: KCCM 10291)인 것을 특징으로 하는 연쇄체 형태의 Ig 융합 단백질을 제조하는 방법.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 형질전환체는 TR11Ig-CHO (기탁번호: KCLRF-BP- 00046), TR12Ig-CHO (기탁번호: KCLRF-BP-00047), TR21Ig-CHO (기탁번호: KCLRF-BP-00048), TR22Ig-CHO (기탁번호: KCLRF-BP-00049)이고, 상기 정제된 연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질은 서열 6, 8, 10, 및 12에 기재된 전체 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 연쇄체 형태의 Ig 융합 단백질을 제조하는 방법.
  8. 서열 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질.
  9. 서열 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 DNA는 서열 5에 기재된 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA.
  11. 제 10항의 DNA 서열을 포함하는 플라스미드 pTR11-Top10'(기탁번호 : KCCM 10288).
  12. 제 11항의 플라스미드 pTR11-Top10'로 형질전환된 형질전환체 TR11Ig-CHO (기탁번호 : KCLRF-BP-00046).
  13. 서열 8에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질.
  14. 서열 8에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 DNA는 서열 7에 기재된 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA.
  16. 제 15항의 DNA 서열을 포함하는 플라스미드 pTR12-Top10'(기탁번호 : KCCM 10289).
  17. 제 16항의 플라스미드 pTR12-Top10'로 형질전환된 형질전환체 TR12Ig-CHO (기탁번호 : KCLRF-BP-00047).
  18. 서열 10에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질.
  19. 서열 10에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 DNA는 서열 9에 기재된 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA.
  21. 제 20항의 DNA 서열을 포함하는 플라스미드 pTR21-Top10'(기탁번호 : KCCM 10290).
  22. 제 21항의 플라스미드 pTR21-Top10'로 형질전환된 형질전환체 TR21Ig-CHO (기탁번호 : KCLRF-BP-00048).
  23. 서열 12에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질.
  24. 서열 12에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 DNA는 서열 11에 기재된 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA.
  26. 제 25항의 DNA 서열을 포함하는 플라스미드 pTR22-Top10'(기탁번호 : KCCM 10291).
  27. 제 26 항의 플라스미드 pTR22-Top10'로 형질전환된 형질전환체 TR22Ig-CHO (기탁번호 : KCLRF-BP-00049).
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