ES2333358T3 - Moleculas y metodos de uso de las mismas para el tratamiento de enfermedades asociadas con mcp-1/ccr2. - Google Patents

Abstract

Una molécula que comprende una secuencia de inmunoglobulina conjugada con una secuencia de aminoácido de CCR2 que es capaz de unirse a MCP-1, dicha secuencia de aminoácido de CCR2 se describe en la SEQ ID NO: 2 y en donde la molécula es no-inmunógena y esta desprovista de un dominio N-terminal de CCR

Description

Moléculas y métodos de uso de las mismas para el tratamiento de enfermedades asociadas con MCP-1/CCR2.

La presente invención se refiere a una molécula que comprende una secuencia de inmunoglobulina conjugada con una secuencia de aminoácidos de CCR2, de acuerdo con la reivindicación 1, una molécula de acuerdo con la reivindicación 3, una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4, el uso de la molécula de la reivindicación 1, de acuerdo con la reivindicación 5, un método de aislamiento de MCP-1 a partir de una muestra biológica de acuerdo con la reivindicación 6.

La presente invención se relaciona con moléculas novedosas y, más particularmente, con métodos para tratar enfermedades asociadas con MCP-1/CCR2, tales como enfermedades inflamatorias y cáncer.

En los últimos años, un número creciente de factores de activación/quimioatrayente del leucocito (quimioquinas) se describen [Oppenheim, J. J. et al., Annu. Rev. Immunol., 9:617-648 (1991); Schall and Bacon, Curr. Opin. Immunol., 6:865-873 (1994); Baggiolini, M., et al., Adv. Imunol., 55:97-1-79 (1994)]. Las quimioquinas se producen y secretan por una gran variedad de tipos de células en respuesta a mediadores inflamatorios primarios tales como IL-1\beta o TNF-\alpha.

La superfamilia de quimioquinas comprende dos ramas principales: las \alpha-quimioquinas (también conocidas como las quimioquinas CXC) y las \beta-quimioquinas (también conocidas como las quimioquinas CC). Esta clasificación se basa en, sí las primeras dos cisteinas en la secuencia de aminoácidos se separan por un sólo aminoácido (CXC) o son adyacentes (CC), La rama de la \alpha-quimioquina incluye las proteínas tales como IL-8, neutrófilo que activa el péptido-2 (NAP-2), actividad estimulatoria del crecimiento del melanoma (MGSA/gro o GRO \alpha), y ENA-78, cada una de los cuales tiene ambos efectos de atracción y activación predominantemente sobre los neutrófilos y linfocitos T. Los miembros de la rama \beta-quimioquina, afecta otros tipos de células de sangre tales como monocito, linfocitos, basófilos, y eosinófilos [Oppenheim, J. J. et al., Annu. Rev. Immunol., 9:617-648 (1991); Baggiolini, M., et al., Adv. Imunol., 55:97-179 (1994); Miller and Krangel, Crit. Rev. Immunol., 12:17-46 (1992); Jose, P. J., et al., J. Exp. Med., 179:881-118 (1994); Ponath, P. D., et al., J. Clin. Invest., 97:604-612 (1996)], e incluyen proteínas tales como proteínas quimioatrayentes de los monocitos 1-4 (MCP-1, MCP-2, MCP-3, y MCP-4), RANTES, y proteínas inflamatorias de macrófagos (MIP-1\alpha y MIP-1\beta).

Una tercera rama más pequeña de la superfamilia de la quimioquina comprende las quimioquinas unidas a la membrana. Los miembros de esta clase se denominan quimioquinas CX3C [Bazan, J. F., et al., Nature 385:640-644 (1997)].

Las quimioquinas pueden mediar un rango de efectos pro-inflamatorios en leucocitos, tales como estimulación de la quimiotaxia, degranulación, síntesis de mediadores de lípidos, y activación de la integrina [Oppenheim, J. J. et al., Annu. Rev. Inmunol., 9:617-648 (1991); Baggiolini, M., et al., Adv. Imunol., 55:97-179 (1994); Miller, M. D. and Krangel, M. S., Crit. Rev. Immunol., 12:17-46 (1992)].

Las quimioquinas se unen a receptores de la superficie celular específicos que pertenecen a la familia de proteínas de siete dominios transmembrana acoplados a la proteína G [Murphy, P. M., Annu. Rev. Immunol., 12:593-633 (1994)] que se denominan "receptores de quimioquinas". En unión de sus ligandos cognados, los receptores de quimioquinas transducen una señal intracelular aunque las proteínas G triméricas asociadas, dando lugar a, entre otras respuestas, un aumento rápido en la concentración de calcio intracelular, cambios en la forma de la célula, aumento de la expresión de moléculas de adhesión celular, degranulación, y promoción de la migración celular.

Las quimioquinas se han implicado como mediadores importantes de trastornos alérgicos, inflamatorios y autoinmunes y enfermedades, tales como asma, aterosclerosis, glomerulonefritis, pancreatitis, restenosis, artritis reumatoide, nefropatía diabética, fibrosis pulmonar, y el rechazo de trasplantes.

En particular, proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1), que actúa sobre su receptor del Receptor de la Quimioquina CC 2 (CCR-2), juega un papel en una gran variedad de indicaciones. Al unirse con su receptor, MCP-1 induce un aumento rápido en la concentración de calcio intracelular, lo que conduce a un aumento de la expresión de moléculas de adhesión celular y, eventualmente, a la degranulación celular y la promoción de la migración del leucocito.

La demostración de la importancia de la interacción MCP-1/CCR-2 ha sido suministrada por experimentos con ratones modificados genéticamente. Los ratones-/-MCP-1 tienen números normales de leucocitos y macrófagos, pero fueron incapaces de reclutar monocitos en sitios de inflamación, después de varios tipos diferentes de desafíos inmunes [Bao Lu, et al., J. Exp. Med. 1998, 187, 601]. De igual modo, los ratones-/-CCR-2 fueron incapaces de reclutar monocitos o producir el interferon \gamma cuando se desafían con diversos agentes exógenos; por otra parte, los leucocitos de ratones mutantes CCR-2, no migraron en respuesta a MCP-1 [Landin Boring, et al., J. Clin. Invest. 1997, 100, 2552], lo que demuestra la especificidad de la interacción MCP-1/CCR-2. Otros dos grupos han reportado independientemente resultados equivalentes con cepas diferentes de ratones-/-CCR-2 [William A. Kuziel, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 12053, and Takao Kurihara, et al., J. Exp. Med. 1997, 186, 1757]. La viabilidad y por lo general la salud normal de los animales-/MCP-1 y -/-CCR-2 es notable, en aquella alteración de la interacción MCP-1/CCR-2 no se induce la crisis fisiológica. En conjunto, estos datos sugieren que las moléculas que bloquean las acciones de MCP-1 serían útiles en el tratamiento de un rango de trastornos inflamatorios y autoinmunes.

Se sabe que la MCP-1 se aumenta en pacientes con artritis reumatoide [Alisa Koch, et al., J. Clin. Invest. 1992, 90, 772-779]. Por otra parte, varios estudios han demostrado el valor terapéutico potencial de antagonismo de la interacción MCP-1/CCR2 en el tratamiento de la artritis reumatoide. Una vacuna de ADN que codifica MCP-1 se mostró recientemente para mejorar la artritis crónica inducida por poliadyuvante en ratas [Sawsan Youssef, et al., J. Clin. Invest. 2000, 106, 361]. De igual modo, los síntomas de enfermedad inflamatoria podrían ser controlados vía administración directa de anticuerpos para MCP-1 a ratas con artritis inducida por colágeno [Hiroomi Ogata, et al., J. Pathol. 1997, 182, 106], o artritis inducida por pared celular de estreptococo [Ralph C. Schimmer, et al., J. Immunol. 1998, 160, 1466]. Quizás lo más importante, un antagonista de péptido de MCP-1, MCP-1 (9-76), se mostró tanto para prevenir la aparición de la enfermedad como para reducir los síntomas de la enfermedad (dependiendo del tiempo de administración) en el modelo de ratón MRL-1pr de la artritis [Jiang-Hong Gong, et al., J. Exp. Med. 1997, 186, 131].

MCP-1 también se aumenta en lesiones ateroscleróticas, y se ha demostrado que los niveles circulantes de MCP-1, juegan un papel en progreso de la enfermedad [Abdolreza Rezaie-Majd, et al, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2002, 22, 1194-1199]. MCP-1 es responsable del reclutamiento de monocitos en áreas ateroscleróticas, como se muestra por inmunohistoquímica de pared arterial rica en macrófagos [Yla-Herttuala et al., Proc Natl Acad Sci USA 88:5252-5256 (1991); Nelken et al., J Clin Invest 88:1121-1127 (1991)] y la detección del anticuerpo anti-MCP-1 [Takeya et al., Human Pathol 24:534-539 (1993)]. Ratones del receptor LDL/MCP-1-deficiente y apoB-transgénico/MCP-1-deficiente muestran deposición de lípidos significantemente menor y acumulación de macrófago a lo largo de sus aortas en comparación con cepas MCP-1 de tipo salvaje [Alcami et al., J Immunol 160: 624-633 (1998); Gosling et al., J Clin Invest 103:773-778 (1999); Gu et al., Mol. Cell. 2:275-281 (1998); Boring et al., Nature 394:894-897 (1998)].

Se sabe que MCP-1 se aumenta en la esclerosis múltiple humana, y se ha demostrado que la terapia eficaz con el interferon\beta-1\beta reduce la expresión de MCP-1 en las células mononucleares de la sangre periférica, lo que sugiere que MCP-1 juega un papel en el progreso de la enfermedad [Carla Iarlori, et al., J. Neuroimmunol. 2002, 123, 170-179]. Otros estudios han demostrado el valor terapéutico potencial de antagonismo de la interacción MCP-1/CCR-2 en el tratamiento de esclerosis múltiple; todos estos estudios se han demostrado en encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), el modelo animal convencional para la esclerosis múltiple. La administración de anticuerpos para MCP-1 a animales con EAE disminuye significantemente la recurrencia de la enfermedad [K. J. Kennedy, et al., J. Neuroimmunol. 1998, 92, 98]. Adicionalmente, dos informes más recientes han demostrado que CCR-2-/-ratones son resistentes a EAE [Brian T. Fife, et al., J. Exp. Med. 2000, 192, 899; Leonid Izikson, et al., J. Exp. Med. 2000, 192, 1075].

Se sabe que MCP-1 se aumenta en pacientes, que desarrollan síndrome de bronquiolitis obliterante, después de un trasplante de pulmón [Martine Reynaud-Gaubert, et al., J. de Heart and Lung Transplant., 2002, 21, 721-730; John Belperio, et al., J. Clin. Invest. 2001, 108, 547-556]. En un modelo murino de síndrome de bronquiolitis obliterante, la administración de un anticuerpo con MCP-1 dio lugar a la atenuación de obliteración de las vías respiratorias; del mismo modo, los CCR2-/- ratones fueron resistentes a la obliteración de las vías respiratorias, en este mismo modelo [John Belperio, et al., J. Clin. Invest. 2001, 108, 547-556]. Estos datos sugieren que el antagonismo de MCP-1/CCR2 puede ser beneficioso en el tratamiento de rechazo de órganos después del trasplante.

Otros estudios han demostrado el valor terapéutico potencial de antagonismo de la interacción MCP-1/CCR2 en el tratamiento de asma. El secuestro de MCP-1 con un anticuerpo de neutralización en ratones desafiados con ovoalbúmina causó una disminución marcada en la hiperreactividad e inflamación bronquial [Jose-Angel Gonzalo, et al., J. Exp. Med. 1998, 188, 157]. Se considera factible para reducir la inflamación alérgica de las vías respiratorias en ratones desafiados con huevos de Schistosoma mansoni a través de la administración de anticuerpos para MCP-1 [Nicholas W. Lukacs, et al., J. Immunol. 1997, 158, 4398]. En consistencia con esto, MCP-1-/-ratones mostraron una respuesta reducida al desafío con huevos de Schistosoma mansoni [Bao Lu, et al., J. Exp. Med. 1998, 187, 601].

Otros estudios han demostrado el valor terapéutico potencial de antagonismo de la interacción MCP-1/CCR2 en el tratamiento de enfermedad de riñón. La administración de anticuerpos para MCP-1 en un modelo murino de glomerularnefritis causó una disminución marcada en la formación creciente glomerular y deposición de colágeno tipo I [Clare M. Lloyd, et al., J. Exp. Med. 1997, 185, 1371]. Además, MCP-1-/-ratones con nefritis de suero nefrotóxico inducido, mostraron daño tubular significantemente menor que sus MCP-1+/+ equivalentes [Gregory H. Tesch, et al., J. Clin. Invest. 1999, 103, 73].

Un estudio ha demostrado el valor terapéutico potencial de antagonismo de la interacción MCP-1/CCR2 en el tratamiento del lupus eritematoso sistémico. El cruce de MCP-1-/-ratones con MRL-FAS-1pr ratones -el último teniendo una enfermedad autoinmune fatal que es análoga al lupus eritematoso sistémico humano- da lugar a ratones con un enfermedad menor y supervivencia mayor de los MRL-FAS-1pr ratones del tipo salvaje [Gregory H. Tesch, et al., J. Exp. Med. 1999, 190, 1813].

La interacción MCP-1/CCR2 también es pertinente en la patología de la colitis como CCR-2-/-ratones fueron protegidos de los efectos de colitis inducida por dextran sulfato de sodio [Pietro G. Andres, et al., J. Immunol. 2000, 164, 6303].

Un estudio ha demostrado el valor terapéutico potencial de antagonismo de la interacción MCP-1/CCR2 en el tratamiento de la alveolitis. Cuando ratas con una lesión pulmonar del complejo inmune IgA se trataron vía intravenosa con anticuerpos construidos contra MCP-1 de rata (JE), los síntomas de la alveolitis se aliviaron parcialmente [Michael L. Jones, et al., J. Immunol. 1992, 149, 2147].

La interacción MCP-1/CCR2 también es relevante en el cáncer. Cuando los ratones inmunodeficientes que llevan células de carcinoma de mama humana, se trataron con un anticuerpo anti-MCP-1, se observaron inhibición de micrometástasis pulmonar y aumento de supervivencia [Rosalba Salcedo, et al., Blood 2000, 96, 34-40]. En particular MCP-1 se indica en cáncer de próstata como se describe con detalle en PCT WO 2004/080273 a los actuales inventores.

La restinosis es otro indicio en el cual se involucra MCP-1. Los ratones deficientes en CCR2 mostraron reducciones en el área interna y en la relación interna/media (en relación con crías de la misma camada de tipo salvaje), después de la lesión de la arteria femoral [Merce Roque, et al. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2002, 22, 554-559).

Otros estudios han proporcionado pruebas de que MCP-1 se sobreexpresa en diversos estados de enfermedad no mencionados anteriormente. Estos reportes proporcionan evidencia de la correlación de que los antagonistas de MCP-1 podrían ser terapéuticos útiles para dichas enfermedades. Se ha demostrado que MCP-1 se sobreexpresa en las células epiteliales intestinales y la mucosa intestinal de pacientes con enfermedad intestinal inflamatoria [H. C. Reinecker, et al., Gastroenterology 1995, 108, 40; Michael C. Grimm, et al., J. Leukoc. Biol. 1996, 59, 804]. Dos informes describen la sobreexpresión de MCP-1 ratas con trauma cerebral inducido [J. S. King, et al., J. Neuroimmunol. 1994, 56, 127; Joan W. Berman, et al., J. Immunol. 1996, 156, 3017]. También se ha demostrado que MCP-1 se sobreexpresa en aloinjertos cardiacos de roedor, que sugieren un papel para MCP-1 en la patogénessis de arteriosclerosis de trasplantes [Mary E. Russell, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 6086]. La sobreexpresión de MCP-1 se ha observado en las células endoteliales del pulmón de pacientes con fibrosis pulmonar idiopática [Harry N. Antoniades, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 5371]. Del mismo modo, la sobreexpresión de MCP-1 se ha observado en la piel de pacientes con psoriasis [M. Deleuran, et al., J. Dermatol. Sci. 1996, 13, 228, and R. Gillitzer, et al., J. Invest. Dermatol. 1993, 101, 127]. Por último, un informe reciente ha demostrado que MCP-1 se sobreexpresa en el cerebro y en fluido cerebroespinal de pacientes con demencia asociada con HIV-1 [Alfredo Garzino-Demo, WO 99/46991].

La mayoría de los antagonistas de la quimioquina presentados hasta la fecha son ya sea los anticuerpos de neutralización a las quimioquinas específicas o antagonistas de moléculas pequeñas [Howard et al., Trend Biotechnol 14:46-51 (1996)].

Los anticuerpos anti-MCP-1 se han utilizado efectivamente en un número de modelos de enfermedades de ratones como se describe anteriormente. Sin embargo, un principal problema asociado con el uso de anticuerpos para antagonizar la función de la quimioquina es que deben ser humanizados antes de utilizar en enfermedades humanas crónicas. Adicionalmente, la capacidad de múltiples quimioquinas para unir y activar un receptor único obliga al desarrollo de una estrategia de anticuerpo múltiple o el uso de anticuerpos de reacción en cruz con el fin de bloquear o prevenir completamente las condiciones patológicas.

Varios antagonistas de moléculas pequeñas de la función del receptor de la quimioquina han sido reportados en la literatura científica y de patentes [White, J Biol Chem 273:10095-10098 (1998); Hesselgesser, J Biol Chem 273:15687-15692 (1998); Bright et al., BioorgMed Chem Lett 8:771-774 (1998); Lapierre, 26th Natl Med Chem Symposium, June 14-18, Richmond (Va.), USA (1998); Forbes et al., Bioorg Med Chem Lett 10:1803-18064 (2000); Kato et al., WO 97/24325; Shiota et al., WO 97/44329; Naya et al., WO 98/04554; Takeda Industries, JP 09-55572 (1998); Schwender et al., WO 98/02151; Hagmann et al., WO 98/27815; Connor et al., WO 98/06703; Wellington et al., U.S. Pat. No. 6,288,103]. La especificidad de los antagonistas del receptor de la quimioquina, sin embargo, sugiere que los trastornos inflamatorios caracterizados por perfiles de expresión de la quimioquina múltiples o redundantes serán relativamente más refractarios al tratamiento por estos agentes.

Existe de esta manera una necesidad ampliamente reconocida para, y sería altamente ventajosa tener, composiciones y métodos que las utilizan para tratar enfermedades asociadas con CCR-2 que se han eliminado de las limitaciones anteriores.

La molécula que comprende una secuencia de inmunoglobulina conjugada con una secuencia de aminoácidos de CCR2 de la presente invención se define en la reivindicación 1, la molécula se define en la reivindicación 3 de la presente invención, la composición farmacéutica se define en la reivindicación 4, el uso de la molécula de la reivindicación 1, se define en la reivindicación 5, el método de aislamiento de MCP-1 a partir de una muestra biológica se define en la reivindicación 6 de la presente invención.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos heteróloga conjugada con una secuencia de aminoácidos de CCR2 carente de un dominio N-terminal de CCR2, la secuencia de aminoácidos de CCR2 que es capaz de unir MCP-1, y en donde la molécula es no-inmunógena.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos de CCR2 unida a una fracción no-proteinácea, en donde la secuencia de aminoácidos de CCR2 sea capaz de unir MCP-1 y dado que la molécula es no-inmunógena en un sujeto.

De acuerdo con aún otro aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula que comprende al menos dos secuencias de aminoácidos de CCR2 siendo cada uno capaz de unirse a MCP-1.

De acuerdo con incluso otro aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula que comprende una etiqueta unida a una secuencia de aminoácidos de CCR2 carente de un dominio N-terminal de CCR2, la secuencia de aminoácidos de CCR2 que es capaz de unir MCP-1.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una molécula según se describe en SEQ ID NO: 14 o 15.

De acuerdo con incluso un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona la composición farmacéutica que comprende la molécula y un portador farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con incluso un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos de CCR2 carente de un dominio N-terminal de CCR2 y que es capaz de unir un MCP-1 y un portador farmacéuticamente aceptable, siendo la composición farmacéutica no-inmunógena.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para tratar una enfermedad asociada con MCP-1/CCR2 en un sujeto con necesidad de este, que comprende la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de la molécula, por consiguiente tratar la enfermedad asociada con MCP-1/CCR2 en el sujeto.

De acuerdo con incluso otro aspecto de la presente invención, se proporciona uso de la molécula para la fabricación de un medicamento identificado para tratar enfermedades asociadas con MCP-1/CCR2.

De acuerdo con incluso otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método de aislamiento MCP-1 a partir de una muestra biológica, el método que comprende: (a) poner en contacto la muestra biológica con la molécula de la reivindicación 4 de tal manera que MCP-1 y la molécula de la reivindicación 4 formen un complejo; y (b) aislamiento del complejo para por consiguiente aislar MCP-1 a partir de la muestra biológica.

De acuerdo con incluso otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para tratar una enfermedad asociada con MCP-1/CCR2 en un sujeto con necesidad de este, que comprende la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos de CCR2 carente de un dominio N-terminal de CCR2 y que es capaz de unir una MCP-1, por consiguiente tratar la enfermedad asociada con MCP-1/CCR2 en el sujeto.

De acuerdo con incluso otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos de CCR2 carente de un dominio N-terminal de CCR2 y que es capaz de unir una MCP-1, para la fabricación de un medicamento identificado para tratar unas enfermedades asociadas con MCP-1/CCR2.

De acuerdo con otras características en modalidades preferidas de la invención descritas a continuación, la secuencia heteróloga de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina.

De acuerdo con incluso otras características en las modalidades preferidas descritas, la secuencia de aminoácidos de CCR2 carente de un dominio N-terminal de CCR2 es como se describe en SEQ ID NO:2.

De acuerdo con incluso otras características, en las modalidades preferidas descritas, la enfermedad asociada con MCP-1/CCR2 se selecciona del grupo que consiste de enfermedades inflamatorias, necrosis, aterosclerosis, cáncer, esclerosis múltiple, ateroma, leucemia monocítica, enfermedades de riñón (por ejemplo, glomerularnefritis), síndrome de hamman-rich, endometriosis, artritis reumatoide, bronquiolitis, asma, lupus eritematoso sistémico, enfermedades inflamatorias intestinales (por ejemplo, colitis), alveolitis, restinosis, trauma cerebral, psoriasis, fibrosis pulmonar idiopática y arteriosclerosis de trasplantes.

De acuerdo con incluso otras características en las modalidades preferidas descritas la etiqueta es una etiqueta de epitope.

De acuerdo con incluso otras características en las modalidades preferidas descritas la molécula se une a un soporte sólido.

De acuerdo con incluso otras características en las modalidades preferidas descritas, la molécula se une a una fracción no-proteinácea.

De acuerdo con incluso otras características en las modalidades preferidas descritas la fracción no-proteinácea, se selecciona del grupo que consiste de polietilenglicol (PEG), polivinil pirrolidona (PVP), poli(estireno co-maleico anhídrido) (SMA), y divinil éter y maleico anhídrido copolímero (DIVEMA).

De acuerdo con incluso otras características en las modalidades preferidas descritas, el portador farmacéuticamente aceptable se formula para administración parenteral.

De acuerdo con incluso otras características en las modalidades preferidas descritas, el portador farmacéuticamente aceptable es sustancialmente no-inmunógeno.

De acuerdo con incluso otras características en las modalidades preferidas descritas, el portador farmacéuticamente aceptable comprende un ácido lipoamina.

De acuerdo con incluso otras características en las modalidades preferidas descritas, el portador farmacéuticamente aceptable comprende un carbohidrato.

De acuerdo con incluso otras características en las modalidades preferidas descritas, el portador farmacéuticamente aceptable comprende una microesfera.

De acuerdo con incluso otras características en las modalidades preferidas descritas, el portador farmacéuticamente aceptable comprende un liposoma.

De acuerdo con incluso otras características en las modalidades preferidas descritas, el portador farmacéuticamente aceptable comprende una microesfera de polímero.

La presente invención aborda con éxito las deficiencias de las configuraciones conocidas en la actualidad, proporcionando las moléculas novedosas y los métodos que las utilizan para tratar enfermedades asociadas con MCP-1/CCR2.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien de habilidad en el oficio al cual esta invención pertenece. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en este documento se pueden utilizar en la práctica o la prueba de la presente invención, los métodos y materiales apropiados se describen a continuación. En caso de conflicto, la especificación de la patente, incluyendo las definiciones, serán controladas. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son solamente ilustrativos y no tienen la intención de ser limitantes.

Breve descripción de los dibujos

La invención se describe en este documento, a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos acompañantes. Con especial referencia ahora a los dibujos en detalle, se destaca que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y con fines ilustrativos de la discusión de las modalidades preferidas de la presente invención solamente, y se presentan con el fin de proporcionar lo que se considera que es la descripción más útil y fácil de entender de los principios y aspectos conceptuales de la invención. En este sentido, no se intenta mostrar los detalles estructurales de la invención con más detalle del necesario para un entendimiento fundamental de la invención, la descripción tomada con los dibujos se hace aparente para aquellos de habilidad en el oficio, como las diversas formas de la invención pueden ser incluidas en la práctica.

Figs. 1a-b son gráficas que muestran que los pacientes con cáncer de próstata desarrollan selectivamente un título de autoanticuerpos altamente significante contra MCP-1. Figura 1a - Suero humano de 23 pacientes con cáncer de próstata, 21 pacientes con Hiperplasia Prostática Benigna (BPH) y 10 sujetos control, todos de la misma edad, se monitorearon para la posible aparición de autoanticuerpos de las siguientes 13 quimioquinas: SDF-1 (CXCL12, GenBank No. de Acceso NM199168), MIF (Gen-Bank No. de Acceso L19686), MIP-1\alpha (CCL3, GenBank No. de Acceso NM002983), MIP-1\beta (CCL4, GenBank No. de Acceso NM002984), IL-8 (CXCL8, GenBank No. de Acceso M2813), IP-10 (CXCL10, GenBank No. de Acceso NM001565), MIP-3\alpha (CCL20, GenBank No. de Acceso BC020698), MIP-3\beta (CCL-19, GenBank No. de Acceso BC027968), Linfotactina (XCL1, GenBank No. de Acceso NM002995), MIG (CXCL9, GenBank No. de Acceso NM002416), RANTES (CCL5, GenBank No. de Acceso NM002985), MCP-3 (CCL7, GenBank No. de Acceso NM006273) y MCP-1 (CCL2, GenBank No. de Acceso NM002982). Un titulo de anticuerpo significante (p<0.01) se observó en una vasta mayoría de pacientes con cáncer de próstata para solo una de las quimioquinas anteriores, MCP-1. Figura 1b -Log2Ab título para MCP-1 en cada una de las muestras clínicas descritas en la Figura 1a, arriba. Aproximadamente el 82% de pacientes con cáncer de próstata (19/23) y solamente cerca del 4.7% (1/21) de aquellos con BPH mostraron una respuesta significante (log2Ab título >10) a MCP-1 (p<0.01).

Fig. 2 es una ilustración esquemática que representa la generación de la construcción de la expresión que codifica el péptido de Ig-CCR2 humano de la presente invención (Ig-E3).

Fig. 3 es una gráfica de barras que representa el enlace específico del dominio E3 de CCR2 con MCP-1.

Fig. 4 es una gráfica de barras que representa la capacidad de CCR2(E3)-IgG humana para inhibir MCP-1 inducida por la migración de las células THP-1 (ATCC No. de Acceso TIB-202). Un ensayo de migración transwell in vitro se realizó. En resumen, las células THP-1 (10^{6}/pozo) se adicionaron a la cámara superior de la placa transwell y CCL2 (MCP-1 humana recombinante, RHMCP-1; (20 ng/ml) se adicionó al pozo inferior, que también se suplementó con diferentes concentraciones de CCR2(E3)-IgG como se muestra en la Figura. Después de 2 horas de incubación a 37ºC las células THP-1 que migraron, se contaron por un FACS. Los resultados se mostraron como medias de los triplicados \pm SE.

Figs. 5a-d son gráficas que representan el desarrollo de un tumor primario y su propagación metastásica como comparación entre las células administradas con CCR2(E3)-IgG y las células control (administradas con IgG o tratadas con PBS). Figuras 5a-b son las gráficas que representan la capacidad de CCR2(E3)-IgG para reducir el crecimiento del tumor a través del tiempo, ya sea cuando la administración de CCR2(E3)-IgG inicia junto con (Figura 5a), o 18 días después de la administración de células PC-3 (Figura 5b). El volumen del tumor (mm^{3}) de tumores de ratones administrados con CCR2(E3)-IgG (representado en azul), control correspondientes al isotipo administrado con IgG (representado en verde), o administrado con PBS (representado en marrón o amarillo), se midió repetidas veces, en diversos tiempos como se indica. Figura 5c es una gráfica que muestra la actividad anti-tumor de CCR2 (E3)-IgG inyectada 8 días después de la administración de células PC3. El volumen (mm^{3}) de tumores de ratones administrados con células PC-3 junto con CCR2(E3)-IgG (representados en azul), control correspondiente al isotipo administrado con IgG (representados en verde), o PBS (representados en rosado) se midió repetidas veces en diversos tiempos como se indica. Estos resultados apoyan la actividad preventiva y terapéutica de CCR2(E3)-IgG mostrados en las Figuras 5a-b.

Figura 5d es una gráfica de barras que representa la inhibición de la metástasis de hueso y pulmonar de luciferasa que expresa las células PC-3 por CCR2(E3)-Ig como se indica, en comparación a las células control.

Figs. 6a-f son fotografías que muestran que el bloqueo de CCL-2 con CCR2(E3)-Ig suprime por completo la producción de VEGF en el sitio del tumor. El tratamiento con cualquiera de CCR2(E3)-Ig (Figuras 6a,d), control correspondiente al isotipo IgG (Figuras 6b,e) o PBS (células control; Figuras 6c,f), se muestra. Los animales se sacrificaron y se retiró el tejido/tumor. Los tejidos se lavaron, fijaron, y permeabilizaron, y VEGF se detecto por inmunotinción empleando microscopia confocal. Las micrografías se mostraron tanto en X 10 (Figuras 6a-c) como en X 40 (Figuras 6d-f) de aumento.

Fig. 7 es una gráfica de barras que representa la migración celular de las células PC3 tratadas con CCL2, según se determina por densidad óptica. Las células PC3 se trataron con CCL2 (MCP-1), CCL2 junto con un anticuerpo contra CCL2 (MCP-1 + anti MCP-1), CCL2 junto con CCR2(E3)-IgG (MCP-1 + CCR2(E3)-IgG) y las células control que fueron no tratadas con el ligando.

Descripción de las modalidades preferidas

La presente invención es de moléculas, composiciones incluyendo las mismas y los métodos del uso de estas para tratar enfermedades asociadas con MCP-1/CCR2, tales como cáncer.

Los principios y operación de la presente invención se pueden entender mejor con referencia a los dibujos y las descripciones acompañantes.

Antes de explicar, al menos, una modalidad de la invención en detalle, se debe entender que la invención no se limita en su aplicación a los detalles publicados en la siguiente descripción o ejemplificada por los Ejemplos. La invención es apta de otras modalidades o de ser practicada o llevada a cabo de diversas maneras. También, es de entenderse que la fraseología y terminología empleada en este documento tiene el propósito de descripción y no debería considerarse como una limitante.

La proteína quimioatrayente del monocito (mcp)-1, también denominada CCL2, específicamente atrae monocitos y células T de memoria. Esta expresión se produce en una variedad de enfermedades caracterizadas por la migración celular, y existe evidencia genética y biológica sustancial por su papel esencial en el cáncer, enfermedades cardiovasculares y enfermedades inflamatorias. A pesar del análisis intensivo, no existen, hasta ahora, antagonistas del receptor de MCP-1/CCL2, CCR2.

Reduciendo la presente invención a la práctica, los actuales inventores descubrieron que el enlace de MCP-1 con CCR2 exclusivamente se media por la tercera región extracelular (E3) de CCR2 (aminoácido coordinados 273-292 de GenBank No. de Acceso NP000639.1). Esto es en contraste marcado con el informe previo por Datta Mannan and Stone [Datta-Mannan And Stone (2004) Biochemistry 43:14602-11] quienes demostraron que el enlace de MCP-1 con CCR2 es dependiente de ambos la región N-terminal (N-ter) y bucle extracelular tercero (E3) de CCR2. Estos resultados sugieren que los péptidos que comprenden la región E3 de CCR2 se pueden utilizar como agentes inhibidores, por esencialmente, el secuestro de MCP-1.

De tal manera, la presente invención concibe el uso de cualquier secuencia de aminoácidos de CCR2 que comprende el dominio E3 de CCR2 y preferiblemente carente de un dominio N-terminal de CCR2, y/o composiciones que comprenden el mismo para el tratamiento de enfermedades asociadas con MCP-1/CCR2, tales como cáncer. Apreciablemente, las composiciones de la presente invención son no-inmunógenas para lograr la máxima eficacia terapéutica. De tal manera, la presente invención prevé por ejemplo, la inclusión de la secuencia de CCR2 en un complejo donde se une a una fracción proteinácea (por ejemplo, secuencia heteróloga de aminoácidos) o no-proteinácea (por ejemplo, PEG), cada una de las cuales que es capaz de prolongar la vida media de la composición en la circulación.

De tal manera, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula no-inmunógena que comprende al menos una secuencia heteróloga de aminoácidos conjugada con una secuencia de aminoácidos de CCR2 preferiblemente carente de un dominio N-terminal de CCR2 (por ejemplo, aminoácido coordinado 1-41 de traducido GenBank No. de Acceso NM 000647/NP000638 o aminoácidos coordinados correspondientes de GenBank No. de Acceso NM000648/ NP000639), siendo la secuencia de aminoácidos de CCR2 capaz de unir MCP-1.

Como se muestra en la sección de Ejemplos que sigue, las moléculas quiméricas de este aspecto de la presente invención, que comprenden el recientemente descubierto dominio de enlace de MCP-1 (E3-IgG), inhibe el desarrollo del tumor, incluso hasta 18 días después de la administración de las células tumorales. Sorprendentemente, las mismas moléculas quiméricas incluso inhiben drásticamente la metástasis de tumores de hueso y tejidos pulmonares. En conjunto, los actuales hallazgos apoyan el uso de las moléculas de la presente invención en el tratamiento de enfermedades asociadas con MCP-1/CCR2, tales como cáncer.

Cabe señalar que, las moléculas quiméricas de este aspecto de la presente invención son notablemente diferentes de aquellas descritas en WO 97/31949 que explica el uso de péptidos quiméricos-E3 (i.e., KLH-E3) para la producción de anticuerpos dirigidos en la región E3 de CCR2, por consiguiente inhibiendo el receptor CCR2 del enlace del ligando. Los péptidos no-inmunógenos de la presente invención se utilizan para dirigir el ligando de CCR2, MCP-1, para inhibir de este modo el ligando del enlace receptor. De tal manera, las moléculas de la presente invención permiten el control terapéutico delicado y especificidad, se pueden sintetizar y administrar fácilmente y se caracterizan por una alta biodisponibilidad.

Como se utiliza en este documento MCP-1 se refiere indistintamente a CCL2, referida como una proteína MCP-1 de mamíferos (por ejemplo, humana) tal como se describe en GenBank Nos. de Acceso NM002982 o NP002973.

Como se utiliza en este documento el término "no-inmunógena" se refiere a una sustancia que es sustancialmente incapaz de producir una respuesta inmune en un sujeto administrado con esta. Por ejemplo, no-inmunógeno en un humano significa que, al contacto de la molécula quimérica de este aspecto de la presente invención con el tejido apropiado de un ser humano, ningún estado de sensibilidad o resistencia a la molécula quimérica es demostrable en la segunda administración de la molécula quimérica después de un periodo latente apropiado (por ejemplo, 8 a 14 días).

Como se utiliza en este documento "secuencia de aminoácidos de CCR2" se refiere a una porción de péptidos de una proteína del receptor 2 de la quimioquina C-C de mamífero (por ejemplo, humano), que tiene afinidad de enlace por MCP-1. Cabe señalar que una secuencia única de aminoácidos de CCR2 puede ser incluida en las moléculas de la presente invención, pero puede ser preferido la inclusión de al menos dos secuencias de aminoácidos de CCR2, siendo cada una capaz de unirse a CCR2 (preferiblemente con alta afinidad, por ejemplo, SEQ ID NO: 9). Debido al aumento de avidez, estos polipéptidos se pueden utilizar como potentes inhibidores de la actividad de MCP-1 y dosificaciones inferiores se pueden administrar.

Como se utiliza en este documento "afinidad de enlace" se refiere a un valor KD mínimo de al menos 10-6 M.

Ejemplos de proteínas de CCR2 se proporcionan en GenBank Nos. de Acceso NM000647 y NP000639.1. Como se menciona el CCR2 de este aspecto de la presente invención es preferiblemente carente de un dominio N-terminal, pero retiene un dominio E3 (i.e., aminoácidos coordinados 273-292 de GenBank No. de Acceso NM000647, SEQ ID NO: 2) o miméticos de estos.

Como se utiliza en este documento el término "miméticos" cuando se hace en referencia a los péptidos se refiere a estructuras moleculares, que sirven como sustituyentes para los péptidos de la presente invención en interacción con MCP-1 [Morgan et al. (1989) Ann. Reports Med. Chem. 24:243-252 para una revisión de miméticos de péptidos].

Los miméticos de péptidos, como se utiliza en este documento, incluyen estructuras sintéticas (conocidas e incluso desconocidas), que pueden o no contener aminoácidos y/o enlaces de péptidos, pero retienen las características estructurales y funcionales de un ligando de péptido. Los tipos de aminoácidos que pueden ser utilizados para generar miméticos se describen además en este documento abajo. El término, "miméticos de péptidos" también incluye peptoides y oligopeptoides, que son péptidos u oligómeros de aminoácidos N-sustituidos [Simon et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371]. Además se incluyen como miméticos de péptidos son las bibliotecas de péptidos, que son colecciones de péptidos diseñados para ser de una longitud de aminoácido determinada y que representan todas las secuencias de aminoácidos concebibles correspondientes a esta. Los métodos para la producción de miméticos de péptidos se describen en este documento a continuación.

De acuerdo con una modalidad preferida de este aspecto de la presente invención, la secuencia de aminoácidos de CCR2 incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y puede ser codificada por un secuencia de ácido nucleico publicada por SEQ ID NO: 1.

De acuerdo con otra modalidad preferida de este aspecto de la presente invención, la molécula de este aspecto de la presente invención es según se describe en SEQ ID NO: 14 o 15.

El término "péptido" como se utiliza en este documento abarca los péptidos nativos (ya sea productos de degradación, péptidos sintetizados sintéticamente o péptidos recombinantes) y como se menciona anteriormente, peptidomiméticos (por lo general, péptidos sintetizados sintéticamente), así como peptoides y semipeptoides que son análogos de péptidos, que pueden tener, por ejemplo, modificaciones que convierten los péptidos más estables aunque en un cuerpo o más capaces de penetrar en las células. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a la modificación N-terminal, la modificación C-terminal, modificación de enlace peptídico, incluyendo, pero no limitando a, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH o CF=CH, modificaciones de esqueleto, y modificación de residuos. Los métodos para preparar compuestos peptidomimeticos son bien conocidos en el oficio y se especifican, por ejemplo, en Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992), que se incorpora por referencia como si completamente se publica en este documento. Otros detalles en este respecto se exponen a continuación.

Los enlaces de péptidos (-CO-NH-) dentro del péptido pueden ser sustituidos, por ejemplo, por enlaces N-metilados (-N(CH3)-CO-), enlaces éster (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-), enlaces cetometileno (-CO-CH2-), enlaces \alpha-aza (-NH-N(R)-CO-), en donde R es cualquier alquilo, por ejemplo, metil, enlaces carba (-CH2-NH-), enlaces hidroxietileno (-CH(OH)-CH2-), enlaces tioamida (-CS-NH-), enlaces dobles olefínicos (-CH=CH-), enlaces retro amida (-NH-CO-), derivados peptídicos (-N(R)-CH2-CO-), en donde R es la cadena lateral "normal", naturalmente presente en el átomo de carbono.

Estas modificaciones pueden ocurrir en cualquiera de los enlaces a lo largo de la cadena peptídica e incluso en varios (2-3), al mismo tiempo.

Los aminoácidos aromáticos naturales, Trp, Tyr y Phe, pueden ser sustituidos por ácido no-natural sintético tales como Fenilglicina, TIC, naftilalanina (Nol), derivados de anillo-metilado de Phe, derivados halogenados de Phe o o-metil-Tyr.

Además de lo anterior, los péptidos de la presente invención también pueden incluir uno o más aminoácidos modificados o uno o más no-aminoácidos monómeros (por ejemplo ácidos grasos, carbohidratos complejos etc).

Como se utiliza en este documento en la especificación y en la sección de las reivindicaciones abajo el término "aminoácido" o "aminoácidos" se entiende que incluye los 20 aminoácidos que ocurren naturalmente; aquellos aminoácidos a menudo modificados pos-translacionalmente in vivo, incluyendo, por ejemplo, hidroxiprolina, fosfoserina y fosfotreonina; y otros aminoácidos inusuales incluyendo, pero no limitando a, ácido 2-aminoadípico, hidroxilisina, isodesmosina, nor-valina, nor-leucina y ornitina. Adicionalmente, el término "aminoácido" incluye ambos D- y L-aminoácidos.

Las tablas 1 y 2 a continuación enumeran los aminoácidos que ocurren naturalmente (Tabla 1) y aminoácidos no-convencionales o modificados (Tabla 2) que se puede utilizar con la presente invención.

TABLA 1

1

2

TABLA 2

3

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

Dado que los péptidos presentes preferiblemente se utilizan en terapéuticos o diagnósticos, que necesitan que los péptidos estén en la forma soluble, los péptidos de la presente invención preferiblemente incluyen uno o más aminoácidos polares no-naturales o naturales, incluyendo pero no limitando a serina y treonina que son capaces de aumentar la solubilidad del péptido debido a su cadena lateral que contiene el hidroxilo.

Los péptidos de la presente invención preferiblemente se utilizan en una forma lineal, aunque será apreciado que en casos donde la ciclización no interfiera severamente con las características de los péptidos, las formas cíclicas del péptido también se pueden utilizar.

La generación de miméticos de péptidos, como se describe anteriormente, se puede llevar a cabo empleando diversas metodologías, incluyendo, por ejemplo, técnicas de expresión.

De tal manera, la presente invención contempla una biblioteca de expresión que comprende una pluralidad de vehículos de expresión (tales como fagos, virus o bacterias) cada uno exhibiendo al menos 2, al menos 3, al menos 5, al menos 7, al menos 11, al menos 15 aminoácidos consecutivos derivados de las secuencias de polipéptidos del E3 de CCR2 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2).

Los métodos de construcción de tales bibliotecas de expresión son bien conocidos en el oficio. Dichos métodos se describen en, por ejemplo, Young AC, et al., "The three-dimensional structures of a polysaccharide binding antibody to Cryptococcus neoformans and its complex with a peptide from a phage display library: implications for the identification of peptide mimotopes" J Mol Biol 1997 Dec 12;274(4):622-34; Giebel LB et al. "Screening of cyclic peptide phage libraries identifies ligands that bind streptavidin with high affinities" Biochemistry 1995 Nov 28;34(47):15430-5; Davies EL et al., "Selection of specific phage-display antibodies using libraries derived from chicken immunoglobulin genes" J Immunol Methods 1995 Oct 12;186(1):125-35; Jones C RT al. "Current trends in molecular recognition and bioseparation" J Chromatogr A 1995 Jul 14;707(1):3-22; Deng SJ et al. "Basis for selection of improved carbohydrate-binding single-chain antibodies from synthetic gene libraries" Proc Natl Acad Sci U S A 1995 May 23;92(11):4992-6; y Deng SJ et al. "Selection of antibody single-chain variable fragments with improved carbohydrate binding by phage display" J Biol Chem 1994 Apr 1;269(13):9533-8, que se incorporan aquí por referencia.

Los miméticos de péptidos también se pueden descubrir utilizando la biología computacional. Los programas de software útiles para exhibir modelos de estructuras de tres dimensiones, tales como RIBBONS (Carson, M., 1997. Methods in Enzymology 277, 25), O (Jones, TA. et al., 1991. Acta Crystallogr. A47, 110), DINO (DINO: Visualizing Structural Biology (2001) http://www.dino3d.org); y QUANTA, INSIGHT, SYBYL, MACROMODE, ICM, MOLMOL, RASMOL and GRASP (revisado en Kraulis, J., 1991. Appl Crystallogr. 24, 946) se puede utilizar para interacciones de modelo entre MCP-1 y miméticos de péptidos prospectivos para identificar por consiguiente los péptidos que muestran la probabilidad más alta de unirse a una región MCP-1 específica. El moldeado computacional de interacciones proteína-péptido se han utilizado con éxito en el diseño de fármacos racional, para otros detalles, ver Lam et al., 1994. Science 263, 380; Wlodawer et al., 1993. Ann Rev Biochem. 62, 543; Appelt, 1993. Perspectives in Drug Discovery and Design 1, 23; Erickson, 1993. Perspectives in Drug Discovery and Design 1, 109, y Mauro MJ. et al., 2002. J Clin Oncol. 20, 325-34.

Como se menciona la molécula quimérica de este aspecto de la presente invención incluye una secuencia heteróloga de aminoácidos.

Como se utiliza en este documento la frase "secuencia heteróloga de aminoácidos" se refiere a una secuencia de aminoácidos no-inmunógena, que no forma una parte de la secuencia de aminoácidos de CCR2. Esta secuencia preferiblemente confiere solubilidad a la molécula de este aspecto de la presente invención, preferiblemente aumenta la vida media de la molécula quimérica en el suero.

La secuencia heteróloga de aminoácidos por lo general se localiza en el terminal amino- o carboxilo- del péptido de CCR2 de la presente invención.

Como se menciona, al menos una secuencia heteróloga de aminoácidos se puede conjugar con la secuencia de aminoácidos de CCR2 de la presente invención. Por ejemplo, al menos una secuencia de aminoácidos de CCR2 se puede incrustar entre dos secuencias heterólogas, tal como se describe Hoogenboom (1991) Mol. Immunol. 28:1027-1037. La secuencia heteróloga de aminoácidos se puede unir a la secuencia de aminoácidos de CCR2 por cualquier enlace de péptido o no-péptido. Adjunto de la secuencia de aminoácidos de CCR2 con la secuencia heteróloga de aminoácidos se puede llevar a cabo por enlace covalente directo (enlace peptídico o un enlace peptídico sustituido) o enlace indirecto, tal como por el uso de un ligador que tiene grupos funcionales. Los grupos funcionales incluyen, sin limitación, un ácido carboxílico libre (C(=O)OH), un grupo amino libre (NH_{2}), un grupo éster (C(=O)OR, donde R es un alquilo, cicloalquilo o aril), un grupo acil haluro (C(=O)A, donde A es flúor, cloro, bromo o yodo), un haluro (flúor, cloro, bromo o yodo), un grupo hidroxilo (OH), un grupo tiol (SH), un grupo nitrilo (C\equivN), un libre grupo C-carbámico (NR''-C(=O)-OR', donde cada uno de R' y R'' es independientemente hidrógeno, alquilo, cicloalquilo o aril).

Un ejemplo de una secuencia heteróloga de aminoácidos que se puede utilizar de acuerdo con este aspecto de la presente invención es una secuencia de inmunoglobulina, tal como las regiones bisagra y Fc de un dominio pesado de inmunoglobulina (ver U.S. Pat. No. 6,777,196). La fracción de inmunoglobulina en las quimeras de este aspecto de la presente invención se puede obtener de los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, IgA, IgE, IgD o IgM, como se explica aquí abajo.

Las quimeras construidas a partir de una secuencia receptor unida a una apropiada secuencia de dominio constante de inmunoglobulina (inmunoadhesinas) se conocen en el oficio. Las inmunoadhesinas reportadas en la literatura incluyen fusiones del receptor de la célula T [Gascoigne et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 84: 2936-2940 (1987)]; CD4 [Capon et al., Nature 337: 525-531 (1989); Traunecker et al., Nature, 339: 68-70 (1989); Zettmeissl et al., ADN Cell Biol. USA, 9: 347-353 (1990); Byrn et al., Nature, 344: 667-670 (1990)]; L-selectina (homing receptor) [(Watson et al., J. Cell. Biol., 110:2221-2229 (1990); Watson et al., Nature, 349: 164-167 (1991)]; CD44 [Aruffo et al., Cell, 61: 1303-1313 (1990)]; CD28 y B7 (Linsley et al., J. Exp. Med., 173: 721-730(1991)]; CTLA-4 [Lisley et al., J. Exp. Med. 174: 561-569 (1991)]; CD22 [Stamenkovic et al., Cell, 66:1133-1144 (1991)]; receptor TNF [Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-10539 (1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol., 27: 2883-2886 (1991); Peppel et al., J. Exp. Med., 174:1483-1489 (1991)]; receptores NP [Bennett et al., J. Biol. Chem. 266:23060-23067 (1991)]; y receptor \alpha IgE [Ridgway et al., J. Cell. Biol., 1 15:abstr. 1448 (1991)].

Por lo general, en tales fusiones la molécula quimérica retendrá al menos los dominios bisagra y CH2 y CH3 funcionalmente activos de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. Las fusiones también pueden ser generadas con el C-terminal de la porción Fc de un dominio constante, o N-terminal inmediatamente con el CH1 de la cadena pesada o la región correspondiente de la cadena ligera.

El sitio exacto en el que la fusión (conjugación) entre la secuencia heteróloga y la secuencia de aminoácidos de CCR2 no es crítica. Los sitios particulares son bien conocidos en el oficio y se pueden seleccionar con el fin de optimizar la actividad biológica, secreción o características de enlace de las moléculas quiméricas de este aspecto de la presente invención (ver el Ejemplo 3 de la sección de Ejemplos a continuación).

Aunque puede ser posible conjugar la región constante de cadena pesada total con la secuencia de aminoácidos de CCR2 de la presente invención, es preferible fusionar secuencias más pequeñas. Por ejemplo, una secuencia que inicia en la región bisagra antes de la secuencia arriba del sitio de corte de la papaína, que define IgG Fc químicamente; residuo 216, tomando el primer residuo de la región constante de cadena pesada que es 114, o sitios análogos de otras inmunoglobulinas, se utiliza en la fusión. En una modalidad particularmente preferida, la secuencia de aminoácidos de CCR2 se fusiona a la región bisagra y CH2 y CH3, o a los dominios CH1, bisagra, CH2 y CH3 de una cadena pesada de IgG1, IgG2, o IgG3 (ver U.S. Pat. No. 6,777,196). El sitio preciso en el que la fusión se hace no es crítica, y el sitio óptimo se puede determinar por experimentación rutinaria.

Como se menciona, las secuencias de inmunoglobulina utilizadas en la construcción de las moléculas quiméricas de este aspecto de la presente invención pueden ser de un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina IgG. Se prefiere el uso de IgG1 humana y secuencias de inmunoglobulina IgG3. Una ventaja principal de emplear IgG1 es que la IgG1 se puede purificar eficientemente sobre la proteína A inmovilizada. En contraste, la purificación de IgG3 requiere la proteína G, un medio conveniente significantemente menor. Sin embargo, otras propiedades estructurales y funcionales de inmunoglobulinas se deberían considerar cuando se selecciona el socio de fusión de Ig para una construcción de quimera particular. Por ejemplo, la bisagra del IgG3 es más larga y más flexible, de modo que pueda acomodar secuencias de aminoácidos de CCR2 más grandes que no pueden doblarse o funcionar correctamente cuando se fusiona a IgG1. Otra consideración puede ser de valencia; IgG son homodímeros bivalentes, dado que los subtipos Ig como IgA e IgM pueden dar lugar a estructuras diméricas o pentaméricas, respectivamente, de la unidad de homodímero Ig básico. Otras consideraciones en la selección de la porción de inmunoglobulina de las moléculas quiméricas de este aspecto de la presente invención se describen en U.S. Pat. No. 6, 77,196.

Así, las moléculas de este aspecto de la presente invención pueden comprender una secuencia heteróloga de aminoácidos, como se describe arriba.

Adicional o alternativamente como se menciona anteriormente, las secuencias de aminoácidos de CCR2 (capaces de unir MCP-1) de la presente invención se pueden unir a una fracción no-proteinácea, dichas moléculas se seleccionan no-inmunógenas en un sujeto. Dicha molécula es altamente estable (resistente a la actividad proteolítica in-vivo, probablemente debido al impedimento estérico conferido por la fracción no-proteinácea) y se puede producir utilizando métodos de síntesis comunes de fase sólida que son de bajo costo y altamente eficientes, tal como se describe en este documento a continuación. Sin embargo, será apreciado que las técnicas recombinantes se pueden seguir utilizando, por lo cual el producto de péptido recombinante se somete a modificación in-vitro (por ejemplo, PEGilación tal como se describe en este documento a continuación).

Como se menciona, la secuencia de aminoácidos de CCR2 se une a una fracción no-proteinácea. La frase "fracción no-proteinácea" como se utiliza en este documento se refiere a una molécula que no incluye aminoácidos (péptido unido) que se une a la secuencia de aminoácidos de CCR2 descrita anteriormente. De acuerdo con las modalidades preferidas en la actualidad, la fracción no-proteinácea de este aspecto de la presente invención es un polímero o un co-polímero (sintético o natural). Ejemplos no-limitantes de la fracción no-proteinácea de la presente invención incluyen polietilenglicol (PEG), polivinil pirrolidona (PVP), divinil éter y copolímero anhídrido maleico (DIVEMA; ver por ejemplo, Kaneda Y, et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 239: 160-5) y poli(estireno co-maleico anhídrido) (SMA; ver por ejemplo, Mu Y, et al., 1999, Biochem Biophys Res Commun. 255: 75-9).

Bioconjugación de dicha fracción no-proteinácea confiere a la secuencia de aminoácidos de CCR2 con estabilidad (por ejemplo, contra actividades de la proteasa) y/o solubilidad (por ejemplo, dentro de un fluido biológico tales como sangre, fluido digestivo) mientras que la preservación de su actividad biológica y la prolongación de su vida media. La bioconjugación es particularmente ventajosa en casos de proteínas terapéuticas que muestran corta vida media y rápido despeje de la sangre. La prolongación de vidas-medias de proteínas bioconjugadas en el plasma resulta del aumento tamaño de conjugados de proteínas (que limita su filtración glomerular) y la proteólisis disminuye debido un polímero impedimento estérico. En general, más cadenas de polímero unidas por péptido, mayor es la extensión de la vida media. Sin embargo, no se toman medidas para reducir la actividad específica de la secuencia de aminoácidos de CCR2 de la presente invención (i.e., enlace MCP-1).

La bioconjugación de la secuencia de aminoácidos de CCR2 con PEG (i.e., PEGilación) se puede llevar a cabo utilizando derivados de PEG tales como N-hidroxisuccinimida (NHS) ésteres de ácidos de carboxílicos PEG, monometoxi PEG2-NHS, succinimidil éster de carboximetilado PEG (SCM-PEG), derivados de benzotriazol carbonato de PEG, glicidil éteres de PEG, PEG p-nitrofenil carbonatos (PEG-NPC, tal como metoxi PEG-NPC), aldehídos PEG, PEG-ortopiridil-disulfuro, PEGs carbonildimidazol-activado, PEG-tiol, PEG-maleimida. Tales derivados PEG son disponibles comercialmente en diversos pesos moleculares [Ver, por ejemplo, Catalog, Polietileno Glicol and Derivatives, 2000 (Shearwater Polymers, Inc., Huntsvlle, Ala.)]. Si se desea, muchos de los derivados anteriores son disponibles en un forma monofuncional monometoxiPEG (mPEG). En general, el PEG adicionado a la secuencia de aminoácidos de CCR2 de la presente invención deberán oscilar entre un peso molecular (MW) de varios cientos de Daltons a aproximadamente 100 kDa (por ejemplo, entre 3-30 kDa). Se puede utilizar un MW grande de PEG, pero puede resultar en alguna pérdida de producción de péptidos PEGilados. La pureza de las moléculas de PEG grandes también se debería observar, ya que puede ser difícil obtener MW de PEG grandes, de pureza tan alta como aquella obtenible para PEG de MW menor. Es preferible utilizar un PEG de al menos 85% de pureza, y más preferiblemente de al menos 90% de pureza, 95% de pureza, o más. La PEGilación de moléculas además se discute en, por ejemplo, Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press San Diego, Calif. (1996), at Chapter 15 y en Zalipsky et al., "Succinimidyl Carbonates of Polyetilene Glycol", en Dunn and Ottenbrite, eds., Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, American Chemical Society, Washington, D.C. (1991).

Convencionalmente, PEG puede estar unido a una posición seleccionada en la secuencia de aminoácidos de CCR2 por mutagénesis de sitio específico siempre y cuando la actividad del conjugado se conserve (i.e., enlace MCP-1). Por ejemplo, el residuo de Cisteina en la posición 5 de la secuencia de aminoácidos de CCR2 según se describe en SEQ ID NO:1 puede ser un blanco para la PEGilación. Adicional o alternativamente, otros residuos de Cisteina pueden ser adicionados a la secuencia de aminoácidos de CCR2 (por ejemplo, en el N-terminal o el C-terminal) para servir por consiguiente como un blanco para la PEGilación. El análisis computacional se puede llevar a cabo para seleccionar una posición preferida para la mutagénesis sin comprometer la actividad.

La química de conjugación de varios de PEG activados tales como PEG-maleimida, PEG-vinilsulfona (VS), PEG-acrilato (AC), PEG-ortopiridil disulfuro se puede emplear. Los métodos de preparación de moléculas de PEG activado se conocen en el oficio. Por ejemplo, PEG-VS se puede preparar bajo argón mediante la reacción de una solución de diclorometano (DCM) del PEGOH con NaH y a continuación con di-vinilsulfona (relaciones molares: OH 1: NaH 5: divinil sulfona 50, a 0.2 gramos de PEG/mL de DCM). PEG-AC se hace bajo argón, mediante la reacción de una solución de DCM del PEG-OH con cloruro de acriloil y trietilamina (relaciones molares: OH 1: cloruro de acriloil 1.5: trietilamina 2, a 0.2 gramos de PEG/mL de DCM). Dichos grupos químicos pueden estar unidos a moléculas linealizadas de PEG, 2-ramas, 4-ramas, o 8-ramas.

Mientras que la conjugación con los residuos de cisteina es un método conveniente por el cual el aminoácido de CCR2 de la presente invención puede ser PEGilado, si se desea, otros residuos también se pueden utilizar. Por ejemplo, se puede utilizar anhídrido acético para reaccionar con grupos NH_{2} y SH, pero no con los grupos COOH, S- -S, o - -SCH_{3}, mientras que el peróxido de hidrógeno se puede utilizar para reaccionar con los grupos - -SH y - -SCH_{3}, pero no con NH_{2}. Las reacciones se pueden conducir en condiciones apropiadas para la conjugación con un residuo deseado en el péptido que emplea químicas que sacan provecho de reactividades bien establecidas.

Para la bioconjugación de la secuencia de aminoácidos de CCR2 de la presente invención con PVP, el terminal COOH que lleva PVP se sintetiza a partir del N-vinil-2-pirrolidona por polimerización del radical en dimetil formamida con la ayuda de 4,4'-azobis-(ácido 4-cianovalérico) como un radical iniciador, y como un agente de transferencia de cadena el ácido 3-mercaptopropionico. Los PVPs resultantes con un peso molecular promedio de Mr 6,000 se pueden separar y purificar por cromatografía líquida de alta resolución y el grupo terminal COOH de PVP sintético se activa por el método N-hidroxisuccinimida/diciclohexil carbodiimida. La secuencia de aminoácidos de CCR2 se hace reaccionar con un exceso molar de 60-veces de PVP activado y la reacción se detiene con ácido amino caploico (exceso molar de 5-veces contra PVP activado), esencialmente como se describe en Haruhiko Kamada, et al., 2000, Cancer Research 60: 6416-6420, que se incorpora en su totalidad aquí por referencia.

La moléculas de CCR2 conjugadas resultantes (por ejemplo, PEGilados o CCR2 de PVP-conjugado) se separan, purifican y cualifican utilizando por ejemplo, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Además, las moléculas conjugadas purificadas de este aspecto de la presente invención además pueden ser cualificadas utilizando por ejemplo, ensayos in vitro en los cuales la especificidad de enlace de MCP-1 con su receptor (por ejemplo, CCR2) se prueba en la presencia o ausencia de los CCR2 conjugados de la presente invención, esencialmente como se describe por otras quimioquinas [por ejemplo, MIP-1\alpha, ver por ejemplo, Hesselgesser J, 1998 (Supra), que se incorpora en su totalidad aquí por referencia].

Las moléculas de este aspecto de la presente invención pueden ser sintetizadas bioquímicamente tal como utilizando técnicas estándar de fase sólida. Estos métodos incluyen síntesis de fase sólida exclusiva, métodos de síntesis de fase sólida parcial, condensación de fragmentos y síntesis de solución clásica. Estos métodos preferiblemente se utilizan cuando el péptido es relativamente corto (i.e., 10 kDa) y/o cuando no puede ser producido por técnicas recombinantes (i.e., no codificado por una secuencia de ácido nucleico, tal como una "Etiqueta" además descrita en este documento a continuación) y por consiguiente, involucrar una química diferente.

Los procedimientos de síntesis de péptidos de fase sólida, son bien conocidos en el oficio y además se describen por John Morrow Stewart and Janis Dillaha Young, Solid Phase Peptide Syntheses (2nd Ed., Pierce Chemical Company, 1984).

Los péptidos sintéticos se pueden purificar por cromatografía de alta resolución preparativa [Creighton T. (1983) Proteins, structures and molecular principles. WH Freeman and Co. N.Y.] y la composición de la cual se puede confirmar vía secuenciación de aminoácidos.

En casos donde grandes cantidades de los péptidos de la presente invención se desean, los péptidos de la presente invención se pueden generar utilizando técnicas recombinantes tales como se describen por Bitter et al., (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544, Studier et al. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89, Brisson et al. (1984) Nature 310:511-514, Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6:307-311, Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680 and Brogli et al., (1984) Science 224: 838-843, Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565 and Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463.

En pocas palabras, una construcción de la expresión (i.e., vector de expresión), que incluye un polinucleótido aislado (i.e., aislado de una fuente de estos que ocurre naturalmente, por ejemplo, SEQ ID NO: 10) que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de CCR2 (opcionalmente se fusiona en marco a una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia heteróloga de aminoácidos) de la presente invención colocada bajo el control transcripcional de un elemento regulador, tal como un promotor, se introduce en células huésped.

Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de CCR2 de la presente invención (por ejemplo, SEQ ID NO:1) se liga en marco a una secuencia de cADN de inmunoglobulina (por ejemplo, SEQ ID NOs: 3 y 5). Se puede apreciar que, la unión de fragmentos de inmunoglobulina genómicos también se pueden utilizar. En este caso, la fusión requiere de la presencia de secuencias reguladoras de la inmunoglobulina para la expresión. Los cADNs que codifican regiones constantes de cadena-pesada de IgG se pueden aislar basándose en la secuencia publicada de bibliotecas de cADN derivadas de linfocitos de sangre periférica o del bazo, por hibridación o por técnicas de reacción de cadena de la polimerasa (PCR). La secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos de CCR2 y la inmunoglobulina puede ser ligada en tándem en una construcción de la expresión (vector) que dirige la expresión eficiente en las células huésped seleccionadas, descritas a continuación. Para la expresión en células de mamíferos, vectores basados en pRK5 [Schall et al., Cell, 61:361-370 (1990)]; y vectores basados en CDM8 [Seed, Nature, 329:840 (1989)] se pueden utilizar. La unión exacta se puede crear eliminando las secuencias extra entre los codones de unión diseñados utilizando mutagénesis delecional de oligonucleótidos-dirigidos [Zoller et al, Nucleic Acids Res., 10:6487 (1982); Capon et al., Nature, 337:525-531 (1989)]. Se pueden utilizar oligonucleótidos sintéticos, en los cuales cada mitad es complementaria a la secuencia en ambos lados de la unión deseada; idealmente, estos son 11 a 48-meros. Como alternativa, se pueden utilizar técnicas de PCR para unir las dos partes de la molécula en-marco con un vector apropiado.

Los métodos para introducir la construcción de la expresión en una célula huésped son bien conocidos en el oficio e incluyen, electroporación, lipofección y transformación química (por ejemplo, fosfato de calcio). Ver también el Ejemplo 2 de la sección de Ejemplos a continuación.

Las células "transformadas" se cultivan bajo condiciones apropiadas, que permiten la expresión de la molécula quimérica codificada por la secuencia de ácido nucleico.

Después de un periodo de tiempo predeterminado, la molécula quimérica expresada se recupera a partir de la célula o cultivo celular, y la purificación se realiza de acuerdo con el uso final del polipéptido recombinante.

Dependiendo del sistema huésped/vector utilizado, cualquiera de un número de elementos de transcripción y traducción apropiados incluyendo promotores constitutivos e inducibles, elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, y similares, se pueden utilizar en el vector de expresión [ver, por ejemplo, Bitter et al., (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544].

A parte de contener los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada (que codifica la quimera), la construcción de la expresión de la presente invención también puede incluir secuencias diseñadas para optimizar la estabilidad, producción, purificación, producción o toxicidad de la proteína de fusión expresada.

Una variedad de células procariotas o eucariotas, se puede utilizar como sistemas huésped-expresión para expresar la secuencia codificante de proteína de fusión. Estas incluyen, pero no se limitan a; microorganismos, tales como bacterias transformadas con un vector de expresión de ADN bacteriófago recombinante, ADN del plásmido o ADN del cósmido que contiene la secuencia que codifica la quimera; levadura transformada con vectores de expresión de levadura recombinante que contiene la secuencia que codifica la quimera; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión del plásmido recombinante, tales como plásmido Ti, que contiene la secuencia que codifica la quimera. Preferiblemente se utilizan sistemas de expresión de mamífero para expresar la quimera de la presente invención.

La elección de la línea celular huésped para la expresión de las moléculas depende principalmente del vector de expresión. Se prefieren los sistemas de expresión eucariota (por ejemplo, mamíferos e insectos) dado que permiten modificaciones pos-translacionales (por ejemplo, glicosilación). Otra consideración es la cantidad de proteína que se necesita. Las cantidades de miligramos a menudo pueden ser producidos por transfecciones transitorias. Por ejemplo, línea celular de riñón de embrión humano 293 transformada de EIA de adenovirus, puede ser transfectada transitoriamente con vectores basados en pRK5 por una modificación del método fosfato de calcio para permitir una expresión eficiente. Los vectores basados en CDM8 se pueden utilizar para transfectar las células COS por el método DEAE-dextran (Aruffo et al., Cell, 61:1303-1313 (1990); Zettmeissl et al., ADN Cell Biol. US, 9:347-353 (1990)]. Sí grandes cantidades de proteína se desean, las moléculas pueden ser expresada después de la transfección estable de una línea celular huésped (ver el Ejemplo 2 de la sección de Ejemplos). Se puede apreciar que la presencia de una secuencia líder hidrófoba en el N-terminal de la molécula asegurará la transformación y secreción de la molécula mediante las células transfectadas.

Se puede apreciar que el uso de sistemas de bacterias o levaduras huésped puede ser preferible para reducir el costo de producción. Sin embargo dado que los sistemas huésped de bacterias son carentes de mecanismos de glicosilación de proteínas, se puede necesitar una glicosilación de pos-producción.

En cualquier caso, las células transformadas se cultivan bajo condiciones eficaces, que permiten la expresión de altas cantidades de polipéptido recombinante. Las condiciones de cultivo eficaces incluyen, pero no se limitan a, condiciones de medio efectivo, bioreactor, temperatura, pH y oxígeno que permitan la producción de la proteína. Un medio eficaz se refiere a cualquier medio en el cual una célula se cultiva para producir la molécula quimera recombinante de la presente invención. Dicho medio por lo general incluye una solución acuosa que tiene fuentes de carbón asimilable, nitrógeno y fosfato, y sales apropiadas, minerales, metales y otros nutrientes, tales como vitaminas. Las células de la presente invención pueden ser cultivadas en bioreactores de fermentación convencional, matraces de agitación, tubos de prueba, platos de microtitulación, y placas de petri. El cultivo se puede llevar a cabo a una temperatura, pH y contenido de oxígeno apropiado para una célula recombinante. Tales condiciones de cultivo están dentro de la experiencia de alguien de ordinaria habilidad en el oficio.

Dependiendo del sistema vector y huésped, utilizado para la producción, las proteínas resultantes de la presente invención pueden ya sea permanecer dentro de la célula recombinante, secretadas en el medio de fermentación, secretadas en un espacio entre dos membranas celulares, tales como el espacio periplasmico en E. coli; o retenidas en la superficie exterior de una membrana celular o viral.

Después de un tiempo predeterminado en el cultivo, la recuperación de la proteína recombinante se realiza. La frase "recuperación de la proteína recombinante" se refiere a la recolección del medio de fermentación completo que contiene la proteína y no necesita implicar etapas adicionales de separación o purificación. Las proteínas de la presente invención se pueden purificar utilizando una variedad de técnicas estándar de purificación de proteínas, tales como, pero no limitando a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio aniónico, filtración, electroforesis, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de fase reversa, cromatografía de concanavalina A, cromatoenfoque y solubilización diferencial.

Las moléculas de la presente invención preferiblemente se recuperan en forma "sustancialmente pura". Como se utiliza en este documento, "sustancialmente pura" se refiere a una pureza que permite el uso eficaz de la proteína en las diversas aplicaciones, descritas a continuación.

Las moléculas quiméricas que comprenden la secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina se pueden purificar convenientemente por cromatografía de afinidad. La aptitud de la proteína A como un ligando de afinidad depende de la especie e isotipo del dominio Fc de la inmunoglobulina que se utiliza en la quimera. La proteína A se puede utilizar para purificar moléculas quiméricas que se basan en cadenas pesadas \gamma1, \gamma2, o \gamma4 humanas [Lindmark et al., J. Immunol. Meth., 62:1-13 (1983)]. La proteína G preferiblemente se utiliza para todos los isotipos de ratón y para \gamma3 humana [Guss et al., EMBO J., 5:1567-1575 (1986)]. El soporte sólido al cual el ligando de afinidad se une es con frecuencia agarosa, pero otros soportes sólidos también están disponibles. Los soportes sólidos estables mecánicamente tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenodividil)benceno permiten las velocidades de flujo rápidas y tiempos de transformación más cortos que se pueden lograr con agarosa. Las condiciones para el enlace de las moléculas quiméricas con la columna de afinidad de proteína A o G se estipulan completamente por las características del dominio Fc; es decir, su especie e isotipo. Generalmente, cuando el ligando apropiado se selecciona, se produce un enlace eficiente, directamente a partir del fluido de cultivo incondicionado. Una característica distintiva de las moléculas quiméricas de este aspecto de la presente invención es que, para las moléculas gamma.1 humana, la capacidad de enlace para la proteína A se disminuye algo en relación con un anticuerpo del mismo tipo Fc. Las moléculas quiméricas unidas de este aspecto de la presente invención se puede eluir eficientemente ya sea a pH ácido (a o por encima 3.0), o en una solución reguladora de pH neutro que contiene una sal suavemente caotrópica. Esta etapa de cromatografía de afinidad puede resultar en una preparación de molécula quimérica que es >95% de pureza. La pureza de grado médico es esencial para aplicaciones terapéuticas.

Otros métodos conocidos en el oficio se pueden utilizar en lugar de, o en adición a, cromatografía de afinidad en proteína A o G para purificar las moléculas quiméricas que incluyen una porción de inmunoglobulina. Tales moléculas quiméricas se comportan de manera similar con anticuerpos en cromatografía en gel tiofílico [Hutchens et al., Anal. Biochem., 159:217-226 (1986)] y cromatografía de metal quelato inmovilizado [Al-Mashikhi et al., J. Dairy Sci., 71:1756-1763 (1988)]. En contraste a los anticuerpos, sin embargo, su comportamiento sobre columnas de intercambio iónico se estipula no solamente por sus puntos isoelectricos, sino también por una carga dipolo que puede existir en las moléculas debido a su naturaleza quimérica.

Se puede apreciar que las moléculas de la presente invención, se pueden utilizar para unir cualquier ligando que une CCR2 tal como a través del dominio E3 de este. Estos pueden incluir CCL7, CCL8 y CCL13 [D'Ambrosio (2003) J. Immunol. Methods 273:3-13].

Las moléculas de este aspecto de la presente invención se pueden utilizar para tratar enfermedades asociadas con MCP-1/CCR2.

De tal manera, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para tratar una enfermedad asociada con MCP-1/CCR2, en un sujeto con necesidad de este. El método que comprende la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de las moléculas de la presente invención, para así, tratar la enfermedad asociada con MCP-1/CCR2 en el sujeto.

Como se utiliza en este documento el término "sujeto" se refiere a un mamífero, preferiblemente un sujeto huma-
no.

Como se utiliza en este documento el término "tratar" se refiere a la prevención, curación, revocación, atenuación, alivio, minimización, supresión o detención de los efectos perjudiciales de una enfermedad asociada con MCP-1/CCR2.

Como se utiliza en este documento la frase "enfermedad asociada con MCP-1/CCR2" se refiere a una enfermedad que depende de la interacción entre MCP-1 y su receptor, CCR2, para la aparición o progresión.

Ejemplos de enfermedades asociadas con MCP-1/CCR2 incluyen, pero no se limitan a, enfermedades inflamatorias, necrosis, aterosclerosis, cáncer (por ejemplo, cáncer de próstata, carcinoma mamario, cáncer de pecho, glioblastoma, cáncer del esófago, neuroblastoma), esclerosis múltiple, ateroma, leucemia monocítica, enfermedades de riñón (por ejemplo, glomerularnefritis), síndrome de hamman-rich, endometriosis, artritis reumatoide, bronquiolitis, asma, lupus eritematoso sistémico, enfermedades inflamatorias intestinales (por ejemplo, colitis), alveolitis, restinosis, trauma cerebral, psoriasis, fibrosis pulmonar idiopática y arteriosclerosis de trasplantes.

La molécula de la presente invención puede ser administrada al sujeto per se, o en una composición farmacéutica, donde se mezcla con portadores o excipientes apropiados.

Como se utiliza en este documento, una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de uno o más de los ingredientes activos descritos en este documento con otros componentes químicos tales como portadores o excipientes fisiológicamente apropiados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto con un organismo. Preferiblemente, la composición farmacéutica no es inmunógena.

Como se utiliza en este documento, el término "ingrediente activo" se refiere a la molécula de la presente invención responsable del efecto biológico pretendido.

A partir de ahora, las frases "portador fisiológicamente aceptable" y "portador farmacéuticamente aceptable", que se pueden utilizar de forma intercambiable, se refieren a un portador o un diluente que no causa irritación significante con un organismo y no invalida la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Un adyuvante se incluye bajo estas frases.

De tal manera por ejemplo, el portador farmacéuticamente aceptable de la presente invención puede comprender un ácido lipoamina.

Como alternativa, el portador farmacéuticamente aceptable utilizado por la presente invención puede comprender un material que incrusta tal como un poliol (i.e., un carbohidrato). Ejemplos no-limitantes de carbohidratos que son apropiados para el uso como excipientes incluyen maltodextrina (por ejemplo, Glucidex Roquette), trehalosa (por ejemplo, Trehalosa Merck), celobiosa, glucosa, fructosa, maltulosa, iso-maltulosa, lactulosa, maltosa, gentobiosa, lactosa, isomaltosa, maltitol (por ejemplo, Maltisorb Roquette), lactitol, eritritol, palatinitol, xilitol, manitol, sorbitol, dulcitol y ribitol, sacarosa, rafinosa, gentianosa, planteosa, verbascosa, estaquiosa, melezitosa, dextran e inositol.

Incluso de manera alterna, el portador farmacéuticamente aceptable utilizado por la presente, es una microesfera apropiada para la administración oral. Por ejemplo, la microesfera puede incluir una matriz insoluble en agua de un material orgánico que es resistente a la disolución o degradación ácida a niveles de pH encontrados en el estómago (por ejemplo, un nivel de pH inferior de 4) esencialmente como se describe en U.S. Pat. No. 6,849,271 para Vaghefi, et al., que se incorpora en su totalidad aquí por referencia. Dicho material de matriz orgánica puede ser, por ejemplo, triglicérido, aceite vegetal hidrogenado, una cera o una mezcla de ceras, polialcoxialquileter, polialcoxialquilester y proteínas degradadas, parcialmente insolubles en agua.

Se puede apreciar que el polímero bioconjugado (por ejemplo, el péptido de CCR2 PEGilado de la presente invención) se puede utilizar en, y como una parte de, el portador farmacéuticamente aceptable, y de esta manera sirve como un molécula portador para la entrega de la secuencia de aminoácidos de CCR2, mientras al mismo tiempo sirve como un componente del vehículo de entrega. Una modalidad preferida de este uso doble es un vehículo liposomal, por ejemplo, liposomas PEG-conjugados, como se describe por ejemplo, en U.S. Pat. Appl. No. 20030186869 para Poiani, George et al., que se incorpora en su totalidad aquí por referencia.

En este documento, el término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte adicionada a una composición farmacéutica para facilitar además la administración de un ingrediente activo. Ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales, y glicoles de polietileno.

Las técnicas para la formulación y administración de fármacos se pueden encontrar en la última edición de "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, la cual se incorpora en este documento en su totalidad por referencia.

Las rutas apropiadas de administración pueden, por ejemplo, incluir entrega oral, rectal, transmucosal, especialmente transnasal, intestinal, o parenteral, incluyendo inyecciones vía intramuscular, subcutánea, e intramedular, así como intratecal, intraventricular directa, inyecciones intravenosas, inrtaperitoneales, intranasales, o intraoculares.

De manera alterna, alguien puede administrar la composición farmacéutica de una manera local, mejor que de una manera sistémica, por ejemplo, vía inyección de la composición farmacéutica directamente en una región de tejido de un paciente.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden fabricar por procesos bien conocidos en el oficio, por ejemplo, por medios de procesos convencionales de mezclado, disolución, granulación, fabricación de grajeas, levigación, emulsificación, encapsulación, atrapamiento, o liofilización.

Las composiciones farmacéuticas, para utilizar de acuerdo con la presente invención de esta manera, pueden ser formuladas de manera convencional utilizando uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan la transformación de los ingredientes activos en preparaciones que se pueden utilizar farmacéuticamente. La formulación apropiada es dependiente de la ruta de administración seleccionada.

Para la inyección, los ingredientes activos de la composición farmacéutica pueden ser formulados en soluciones acuosas, preferiblemente en soluciones reguladoras fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer, o solución reguladora de sal fisiológica. Para la administración transmucosal, se utilizan en la formulación, penetrantes apropiados a la barrera que son permeables. Tales penetrantes, por lo general se conocen en el oficio.

Para la administración oral, la composición farmacéutica se puede formular fácilmente por combinación de los compuestos activos con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en el oficio. Dichos portadores facilitan que la composición farmacéutica sea formulada como comprimidos, pildoras, tabletas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas suspensiones, y similares, para la ingestión oral por un paciente. Las preparaciones farmacológicas para uso oral, se pueden fabricar empleando un excipiente sólido, opcionalmente moliendo la mezcla resultante, y la transformación de la mezcla de gránulos, después de adicionar auxiliares apropiados según se desee, para obtener comprimidos o núcleos de tabletas. Los excipientes apropiados son, en particular, rellenos tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metil celulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, y sodio carbometilcelulosa; y/o polímeros fisiológicamente aceptables tales como polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, agentes desintegrantes, tales como polivinil pirrolidona reticulada, agar, o ácido algínico o una sal de estos, tales como alginto de sodio, se pueden adicionar.

Los núcleos de las tabletas se proporcionan con cubiertas apropiadas. Para este propósito, se pueden emplear soluciones de azúcar concentradas que pueden opcionalmente contener goma arábiga, talco, polivinil pirrolidona, carbopol gel, polietilenglicol, dióxido de titanio, soluciones de laca, y solventes orgánicos apropiados o mezclas de solventes. Materias colorantes o pigmentos se pueden adicionar con los comprimidos o cubiertas de tabletas para la identificación o caracterización de diferentes combinaciones de dosis del compuesto activo.

Las composiciones farmacéuticas que se pueden utilizar vía oral incluyen cápsulas duras fabricadas de gelatina, así como cápsulas selladas, suaves fabricadas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los ingredientes activos en mezcla con rellenos tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones, lubricantes tales como talco o estearato de magnesio, y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas suaves, los ingredientes activos se pueden disolver o suspender en líquidos apropiados, tales como aceites grasos, parafina líquida, o glicoles de polietileno líquidos. Además, se pueden adicionar estabilizantes. Todas las formulaciones para la administración oral deberían estar en dosificaciones apropiadas para la ruta de administración seleccionada.

Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas para chupar formuladas de manera convencional.

Para la administración por inhalación nasal, los ingredientes activos para emplear de acuerdo con la presente invención se entregan convenientemente en la forma de una presentación de atomizador en aerosol a partir de un envase presurizado o un nebulizador con el uso de un apropiado propelente, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, o dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para entregar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para utilizar en un dispensador pueden ser formuladas conteniendo una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo apropiada, tal como lactosa o almidón.

La composición farmacéutica descrita en este documento puede ser formulada por administración parenteral, por ejemplo, por inyección de bolo o infusión continúa. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosificación por unidad, por ejemplo, en ampollas o en contenedores multidosis con, opcionalmente, un conservante adicionado. Las composiciones pueden ser suspensiones, soluciones, o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes, y/o dispersantes.

Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de la preparación activa en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de los ingredientes activos se pueden preparar como apropiadas suspensiones de inyección basadas en agua o aceitosa. Los solventes o vehículos lipofílicos apropiados incluyen aceites grasos tales como aceite de ajonjolí, o ésteres de ácidos grasos sintéticos tales como oleato de etilo, triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones de inyección acuosa pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como sodio carboximetil celulosa, sorbitol, o dextran. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes apropiados o agentes que aumentan la solubilidad de los ingredientes activos, para permitir la preparación de soluciones altamente concentrados.

Como alternativa, el ingrediente activo puede ser en forma de polvo para constitución con un vehículo apropiado, por ejemplo, una solución basada en agua, esteril, libre de pirógeno, antes de su uso.

La composición farmacéutica de la presente invención también se puede formular en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, el uso, por ejemplo, bases de supositorios convencionales tales como mantequilla de cacao u otros glicéridos.

Las composiciones farmacéuticas apropiadas para utilizar en el contexto de la presente invención incluyen composiciones en donde los ingredientes activos se contienen en una cantidad efectiva para lograr el propósito pretendido. Más específicamente, una "cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad de ingredientes activos (por ejemplo, una construcción de ácido nucleico) efectiva para prevenir, aliviar, o mejorar los síntomas de un trastorno (por ejemplo, isquemia) o prolongar la supervivencia del sujeto que se trata.

La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva es adecuada dentro de la capacidad de aquellos de habilidad en el oficio, especialmente a la luz de la revelación detallada proporcionada en este documento.

Para cualquier preparación utilizada en los métodos de la invención, la dosificación o la cantidad terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de ensayos in vitro y cultivo celular. Por ejemplo, una dosis se puede formular en modelos de animales para lograr una concentración o título deseado. Dicha información se puede utilizar para determinar más exactamente la dosis útil en humanos.

La toxicidad y eficacia terapéutica de los ingredientes activos descritos en este documento se puede determinar por procedimientos farmacéuticos estándar in vitro, en cultivos celulares o animales experimentales. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos in vitro y cultivo celular y estudios de animales se pueden utilizar para formular un rango de dosificación para utilizar en humanos. La dosificación puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada. La formulación exacta, la ruta de administración, y dosificación puede ser seleccionada por el médico particular en vista de la condición del paciente. (Ver, por ejemplo, Fingl, E. et al. (1975), "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1, p.1.).

La cantidad de dosificación e intervalos de administración se puede ajustar individualmente para proporcionar suficientes niveles cerebrales o en plasma del ingrediente activo para inducir o suprimir el efecto biológico (i.e., la concentración mínima efectiva, CME). La CME variará para cada preparación, pero se puede estimar a partir de los datos in vitro. Las dosificaciones necesarias para lograr la CME dependerán de las características individuales y la ruta de administración. Los ensayos de detección se pueden utilizar para determinar las concentraciones en plasma.

Dependiendo de la severidad y sensibilidad de la condición a ser tratada, la dosificación puede ser de una sola o una pluralidad de administraciones, con el transcurso del tratamiento dura entre varios días a varias semanas, o hasta que se consigue la cura o la disminución del estado de enfermedad se logra.

La cantidad de una composición que será administrada, por supuesto, dependerá del sujeto que se trata, la severidad de la aflicción, el modo de administración, el juicio del médico que prescribe, etc.

Las composiciones de la presente invención, si se desea, pueden presentarse en un empaque o dispositivo dispensador, tal como un kit aprobado por la FDA, que puede contener una o más formas de dosificación por unidad que contienen el ingrediente activo. El empaque, por ejemplo, puede comprender una lámina de metal o plástico, tal como un empaque de blíster. El empaque o dispensador dispositivo se puede acompañar por la instrucciones de administración. El empaque o dispositivo dispensador también se puede acompañar por una información en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso, o venta de productos farmacéuticos, cuya información es el reflejo de la aprobación por la agencia de la forma de las composiciones para administración humana o veterinaria. Dicha información, por ejemplo, puede incluir el etiquetado aprobado por The U.S. Food and Drug Administration para la prescripción de fármacos o de un inserto del producto aprobado. Las composiciones que comprenden una preparación de la invención formulada en un portador farmacéuticamente aceptable también se pueden preparar, colocar en un contenedor apropiado, y etiquetar para el tratamiento de una condición indicada, como se detalla anteriormente.

Se puede apreciar que la molécula (por ejemplo, quimérica proteinácea) de este aspecto de la presente invención se puede suministrar al sujeto por medio de terapia génica. Por consiguiente la construcción de la expresión de mamíferos descritos anteriormente se puede administrar al sujeto empleando cualquier modo de apropiado de administración, descrito anteriormente (i.e., terapia génica in-vivo). Como alternativa, la construcción de ácidos nucleicos se introduce en una célula apropiada vía un apropiado método/vehículo de entrega del gen (transfección, transducción, recombinación homóloga, etc.) y un sistema de expresión como se necesita y luego las células modificadas se expanden en el cultivo y regresan al sujeto (i.e., terapia génica ex-vivo).

Las técnicas de transferencia de ácido nucleico preferidas actualmente in vivo incluyen la transfección con construcciones virales o no-virales, tales como adenovirus, lentivirus, virus del Herpes simple I, o sistemas asociados con adeno-virus (AAV) y basados en lípidos. Los lípidos útiles para la transferencia del gen mediada por lípidos son, por ejemplo, DOTMA, DOPE, y DC-Chol [Tonkinson et al., Cancer Investigation, 14(1): 54-65 (1996)]. Las construcciones más preferidas para utilizar en terapia génica son virus, más preferiblemente adenovirus, AAV, lentivirus, o retrovirus. Una construcción viral tal como una construcción retroviral incluye al menos un promotor/potenciador transcripcional o elemento(s) que define(n) el locus, u otros elementos que controlan la expresión génica por otros medios tales como empalme alterno, exportación nuclear de ARN, o modificación post-translacional del mensajero. Tales construcciones de vectores también incluyen una señal de empaquetamiento, repeticiones terminales largas (LTRs) o porciones de estos, y sitios de enlace del cebador de hebra positivo y negativo, apropiados al virus utilizado, a menos que estén presentes ya en la construcción viral. Además, dicha construcción por lo general incluye una secuencia señal para la secreción del péptido a partir de una célula huésped en la cual se coloca. Preferiblemente la secuencia señal para este propósito es una secuencia señal de mamíferos tal como la secuencia líder Ig\kappa (por ejemplo, SEQ ID Nos. 7 y 8). Opcionalmente, la construcción también puede incluir una señal que dirige la poliadenilación, así como uno o más sitios de restricción y una secuencia de terminación de la traducción. A modo de ejemplo, tales construcciones por lo general incluyen un 5' LTR, un sitio de enlace de tARN, una señal de empaquetamiento, un origen de síntesis de ADN bicatenario, y una 3' LTR o una porción de estos. Otros vectores se pueden utilizar que son no-virales, tales como lípidos catiónicos, polilisina, y dendrímeros.

La afinidad del péptido de CCR2 de la presente invención con MCP-1 permite el uso de estos en la purificación y detección de MCP-1.

De tal manera, de acuerdo con aún otro aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula que comprende una etiqueta y el péptido de CCR2 de la presente invención.

Como se utiliza en este documento el término "etiqueta" se refiere a una fracción que específicamente se reconoce por un socio de enlace tal como un anticuerpo, un quelante o una molécula de avidina (biotina). La etiqueta se puede colocar vía C-terminal o N-terminal del péptido de CCR2, siempre y cuando no interfiera con una actividad biológica de estos (por ejemplo, enlace de MCP-1).

Por ejemplo, una etiqueta del polipéptido tiene suficientes residuos para proporcionar un epitope (i.e., etiqueta de epitope) contra la cual un anticuerpo en contra de este se puede hacer, incluso es suficientemente corto de tal manera que no interfiera con la actividad biológica del péptido de CCR2. La etiqueta de epitope preferiblemente también es imparcialmente única así que el anticuerpo en contra de esta no reacciona en cruz sustancialmente con otros epitopes. Los polipéptidos de etiqueta apropiados por lo general tienen al menos seis residuos de aminoácido y usualmente entre aproximadamente 8-50 residuos de aminoácido (preferiblemente entre aproximadamente 9-30 residuos). Se prefieren las secuencias poli-histidina, que unen el níquel, permitiendo el aislamiento de la proteína etiquetada por cromatografía Ni-NTA como se describe (Lindsay et al. Neuron 17:571-574 (1996)], por ejemplo.

Tales formas etiquetadas-epitope de la CCR2 son deseables, ya que la presencia de estas puede ser detectada utilizando un anticuerpo marcado contra la etiqueta polipéptido. Además, la prestación de la etiqueta de epitope facilita que el péptido de CCR2 de la presente invención que se purifica fácilmente por purificación de afinidad utilizando el anticuerpo anti-etiqueta. Las técnicas de purificación y ensayos de diagnóstico que involucran los anticuerpos se describen más adelante en este documento.

Los polipéptidos etiqueta y sus anticuerpos respectivos son bien conocidos en el oficio. Ejemplos incluyen el polipéptido etiqueta flu HA y su anticuerpo 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 de esta (Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; y la etiqueta (gD) de la glicoproteína D del virus del Herpes Simple y su anticuerpo. Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990). Otros polipéptidos etiqueta han sido revelados. Ejemplos incluyen el péptido-Etiqueta [Hopp et al., BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)]; el péptido epitope KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; un péptido epitope de \alpha-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; y la etiqueta del péptido de la proteína del gen 10 T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]. Una vez el polipéptido etiqueta ha sido seleccionado, un anticuerpo para este se puede generar, utilizando métodos que son bien conocidos en el oficio. Tales anticuerpos están disponibles comercialmente tales como a partir de Sigma, St. Louis. USA.

Las moléculas de este aspecto de la presente invención se pueden utilizar para aislar MCP-1 a partir de muestras biológicas o detectar la presencia de MCP-1 en esta.

Como se utiliza en este documento la frase "muestra biológica" se refiere a un fluido biológico tal como sangre, suero, plasma, linfa, fluido bilis, orina, saliva, esputo, fluido sinovial, semen, lágrimas, fluido cerebroespinal, fluido vasto broncoalveolar, fluido ascitis, pus, medio acondicionado y similares en el cual MCP-1 está presente.

El aislamiento de MCP-1 de acuerdo con este aspecto de la presente invención se realiza poniendo en contacto la muestra biológica con la molécula de este aspecto de la presente invención, de tal manera que MCP-1 y la molécula formen un complejo (empleando solución reguladora, condiciones de temperatura que permitan el enlace de la molécula con MCP-1, ver por Ejemplo Datta-Mannan and Stone 2004, supra); y el aislamiento del complejo para por consiguiente aislar MCP-1 a partir de la muestra biológica.

Con el fin de aislar el complejo, la molécula preferiblemente se inmoviliza sobre un soporte sólido. Como se utiliza en este documento la frase "soporte sólido" se refiere a una matriz no-acuosa a la cual un reactivo de interés (por ejemplo, la molécula de este aspecto de la presente invención) se puede adherir. Ejemplos de soportes sólidos, incluyen, pero no se limitan a, soportes sólidos formados parcialmente o completamente de vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, polivinil alcohol y siliconas. En ciertas modalidades, dependiendo del contexto, el soporte sólido puede comprender el pozo de una placa de ensayo; en otras el soporte, es una columna de purificación (por ejemplo, una cromatografía de columna de afinidad). Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tales como aquellas descritas en U.S. Pat. No. 4,275,149.

Como alternativa, tales moléculas se pueden utilizar para detectar los niveles de MCP-1 en muestras biológicas. Para aplicaciones de diagnóstico, las moléculas por lo general serán marcadas con una fracción detectable. La fracción detectable puede ser cualquiera que sea capaz de producir, ya sea directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la fracción detectable puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, o una etiqueta (tal como se describe anteriormente y al cual un anticuerpo marcado se puede unir). Las moléculas de la presente invención pueden ser empleadas en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de enlace competitivos, ensayos sandwich directo e indirecto, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of, Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

Las moléculas de este aspecto de la presente invención pueden ser incluidas en un kit de diagnóstico, en la cual la molécula y opcionalmente el soporte sólido y reactivos de tratamiento de imágenes (por ejemplo, anticuerpos, sustrato cromogénico etc.) puede ser empacado en envases apropiados con soluciones reguladoras y conservantes apropiados y utilizados para el diagnóstico.

Los objetos adicionales, ventajas, y características novedosas de la presente invención serán aparentes para alguien de ordinaria habilidad en el oficio en el examen de los siguientes ejemplos, que no tienen la intención de ser limitantes. Adicionalmente, cada una de las diversas modalidades y aspectos de la presente invención, como se delinea anteriormente y como se reivindica en la sección de las reivindicaciones abajo encuentra soporte experimental en los siguientes ejemplos.

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Ejemplos

La referencia ahora se hace de los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones arriba, ilustra la invención de una manera no limitante.

Generalmente, la nomenclatura utilizada en este documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, micriobiológicas y ADN recombinante. Tales técnicas se explican ampliamente en la literatura. Ver, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratorio Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Mariland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant ADN", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); las metodologías según se describen en U.S. Pat. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen extensamente en las patentes y la literatura científica, ver, por ejemplo, U.S. Pat. Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todos de los cuales se incorporan por referencia como cuando se publican en su totalidad en este documento. Otras referencias generales se proporcionan a lo largo de este documento. Los procedimientos en esta se consideran que son bien conocidas en el oficio y se proporcionan para la conveniencia del lector. Toda la información contenida en esta se incorpora aquí por referencia.

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Ejemplo 1 Los pacientes con cáncer de próstata muestran una respuesta de anticuerpo selectivo específico a MCP-1

La conexión entre CCL2 y cáncer de próstata se estableció utilizando una prueba de ELISA para la presencia de autoanticuerpos para diversas quimioquinas, incluyendo MCP-1 (CCL2), en pacientes con cáncer de próstata.

Materiales y Procedimientos Experimentales

Muestras de pacientes - El trabajo experimental humano se condujo en colaboración con los Departments of Urology of CARMEL and RAMBAM medical centers en Haifa, Israel. Todas las muestras de suero y tejido se obtuvieron de pacientes de RAMBAM hospital bajo Aprobación del Comité de Helsinki No. 1822 fechado Noviembre 11, 2003. El análisis patológico se condujo por Prof. Avi Stein of Department of Urology, CARMEL medical center. Los datos clínicos de los pacientes se resumen en la Tabla 1, abajo.

Determinación de títulos de anticuerpo (Ab) - título Ab contra cada quimioquina examinada se detecto empleando una prueba de ELISA como se describe previamente en detalle (Wildbaum, G., M. Nahir, and N. Karin. 2003. Beneficial autoimmunity to proinflammatory mediators restrains the consequences of self-destructive immunity. Immunity 19:679). Las quimioquinas humanas recombinantes: SDF-1 (CXCL12), MIP-1\alpha(CCL3), MIP-1\beta(CCL4), IL-8 (CXCL8), IP-10 (CXCL10), MIP-3\alpha(CCL20), MIP-3\beta(CCL-19), Linfotactina (XCL1), MIG (CXCL9), RANTES (CCL5), MCP-3 (CCL7) y MCP-1 (CCL2) todos se adquirieron de PeproTech, Rocky Hill, NJ. Human MIF se adquirió de R&D Systems (Minneapolis, NM).

Resultados Pacientes con Cáncer de Próstata muestran un significante título de autoanticuerpos para MCP-1

Los sueros de 23 pacientes con cáncer de próstata, 21 individuos con hipertorfia de próstata benigna (BPH), y 11 sujetos control (Tabla 3, abajo) se examinaron para la presencia de autoanticuerpos con diversas quimioquinas, particularmente aquellos que se han implicado con el cáncer, incluyendo SDF-1 (CXCL12), MIF, MIP-1\alpha (CCL3), MIP-1\beta (CCL4), IL-8 (CXCL8), IP- 10 (CXCL10), MIP-3\alpha (MCP-10), MIP-3\beta (CCL-19), Linfotactina (XCL1), MIG (CXCL9), RANTES (CCL5), MCP-3 (CCL7) y MCP-1 (MCP-1).

6

De todas las quimioquinas examinadas, los pacientes con cáncer de próstata subieron un titulo de anticuerpos altamente significante exclusivamente con MCP-1 (Figura 1a, log_{2} título Ab de 11.85\pm0.8). El título de referencia de anticuerpos anti MCP-1 (log_{2}) en individuos saludables y pacientes con BPH fue 5-6, y no difieren del observado en la respuesta a cualquiera de las otras quimioquinas. De tal manera, los pacientes con cáncer de próstata muestran una respuesta de anticuerpos altamente específica y selectiva con MCP-1 (Figura 1a , p<0.01). El análisis estadístico reveló que aproximadamente el 82% de pacientes con cáncer de próstata (19/23), y solamente el 4.7% (1/21) de pacientes con BPH no-maligno, mostraron una respuesta significante (log_{2} título Ab >10, p<0.01) con MCP-1 (Figura 1b).

Estos resultados sugieren que la inhibición de la interacción MCP-1 CCR2 se puede utilizar para suprimir el cáncer y otras enfermedades que se regulan por MCP-1/CCR2.

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Ejemplo 2 La generación del péptido quimérico CCR2 (E3-Ig) y la Expresión Estable en las Líneas Celulares Materiales y Procedimientos Experimentales Generación de la construcción CCR2(E3)-IgG

La Figura 2 muestra una ilustración de la construcción que expresa la quimera CCR2(E3)-IgG. La construcción IgG1 se produjo de acuerdo con el protocolo básico que se utilizó previamente para la generación de CTLA4-Ig (Van Oosterhout, A. J., C. L. Hofstra, R. Shields, B. Chan, I. Van Ark, P. M. Jardieu, and F. P. Nijkamp. 1997. El tratamiento CTLA4-IgG murina inhibe las eosinofilia y la hiperreactividad de las vías respiratorias y atenúa la sobreregulación de IgE en un modelo murino de asma alérgica. Am J Respir Cell Mol Biol 17:386) con modificaciones: cADN que codifica la región constante (Etiqueta-CH2-CH3) de cadena pesada de IgG1 humana ha sido clonada a partir de células mononucleares activadas de LPS y IL-4 de la sangre periférica (PBMC) sobre pSecTag2/Hygro B (Invitrogen, San Diego, CA). CCR2-E3 humano se subclonó a partir de PBMC humana activada LPS, empleando cebadores que codifican parte del dominio 6 de CCR2 (E3, SEQ ID Nos: 1 y 2, respectivamente) de la siguiente manera: sentido: cccaagcttggcctgagtaactgtgaaag (SEQ ID NO: 12), antisentido: ccgctcgagagtctctgtcacctgcgtgg (SEQ ID NO: 13). Después de la verificación de la secuencia, el producto PCR amplificado se clonó en un vector pSec-Tag2 (Invitrogen, San Diego, CA). Etiqueta-CH2-CH3 de la IgG humana Fc\gamma se ligó con el plásmido (pSec-CCR2) secuencia abajo de la CCR2 (E3) para crear una proteína fusión CCR2-IgG.

Generación de Líneas Celulares que expresan pSec-C CR2(E3)-IgG- Estables

El plásmido pSec-CCR2(E3)-IgG se co-transfectó en las células CHO DG44 (DHFR^{-/-}) (suministradas por Dr. Lawrence Chasin of Columbia university, USA), con el vector minigen CHO DHFR utilizando jet PEI (Polypluse transfección- Illkirch Cedex, France) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células transfectadas estables se seleccionaron en medio que contiene higromicina (200 \mug/ml). La proteína fusión CCR2(E3)-IgG se purificó a partir de los sobrenadantes por una columna de proteína G-Sefarosa obtenida de Amersham Biosciences (Uppsia, Sweden) y se verifico por análisis western blot utilizando el IgG -HRP anti humana de cabra (Sigma, St. Louis, MO).

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Ejemplo 3 CCR2(E3)-IgG se une específicamente con MCP-1

La capacidad del dominio E3 de CCR2 para unirse con MCP-1 se demostró por un ensayo de ELISA.

Materiales y Procedimientos Experimentales

ELISA - La especificidad del enlace de CCR2(E3)-IgG con diversas quimioquinas humanas comercialmente disponibles (Pepro-Tech, Rocky Hill, NJ) se determinó por ELISA directo de la siguiente manera: placas de ELISA de 96-pozos (Nunc, Roskilde, Denemark) se cubrieron con 100 ng/ml de cada quimioquina, se lavaron y bloquearon con 1% de BSA/PBS. CCR2(E3)-IgG a una concentración de 5 \mug/ml luego se adicionó. Se adicionó Ig anti humana de ratón marcada HRP (Jackson, Pennsylvania), como un segundo Anticuerpo. Los resultados se mostraron como lectura O.D. a 450 nm. El anticuerpo monoclonal Anti CCL2 (MAB679; R&D Systems, Minneapolis, NM) se utilizó como un control positivo (1 \mug/ml).

Resultados

El enlace de CCR2(E3)-IgG con diversas citoquinas se determinó por un ELISA. Como se muestra en la Figura 3, el dominio E3 de CCR2 fue suficiente para unir MCP-1, mostrando un enlace casi cuatro veces más alto con esta quimioquina en comparación con otros factores probados.

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Ejemplo 4 CCR2(E3)-IgG inhibe la migración celular inducida por MCP-1 Materiales y Procedimientos Experimentales Líneas Celulares

Las células THP-1 se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD con ATCC No. de Acceso TIB-202) y se cosecharon de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Ensayo de migración celular - La capacidad de CCR2(E3)-IgG para inhibir MCP-1 inducida por la migración de las células THP-1 se probó. Los ensayos de quimiotaxis se llevaron a cabo utilizando una cámara TransWell (Corning Costar, Cambridge, MA). Las células THP-1 con medio (1x10^{6} células/pozo) se adicionaron a la cámara superior del Transwell, después del equilibrio de las cámaras inferiores con medio, MCP-1 recombinante humana (R&D Systems, Minneapolis, NM), que fueron, o no, suplementadas con la CCR2(E3)-IgG soluble. Transwells luego se incubaron por 3 horas a 37ºC en aire humidificado que contiene 7.5% de CO_{2}. Los monocitos que migraron se recolectaron a partir de la cámara inferior y se contaron.

Resultados

La Figura 4 muestra que la CCR2(E3)-IgG soluble de manera significativa y notablemente (90%) de MCP-1 bloqueada, indujo la migración de las células THP-1 de una manera dependiente de la dosis.

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Ejemplo 4 CCR2(E3)-IgG radicalmente degrada el crecimiento del tumor PC-3, y reduce la expresión de VEGF Materiales y Procedimientos Experimentales

Tratamiento de ratones con CCR2(E3)-IgG -Tres grupos de seis ratones SCID/Bg se administraron vía subcutánea con 5x10^{6} células PC-3 Luc/ratón (El Hilali et al. Clin Cancer Res. 2005 Feb 1;11(3):1253-8.)

El primer grupo se sometió a administraciones repetidas de CCR2(E3)-IgG (200ug/ratón, i.v., en intervalos de cuatro días). El segundo grupo se administró con una cantidad concordante de PBS, y el tercero con IgG control correspondiente del isotipo. Para la última terapia (i.e., tratamiento de un tumor establecido), la administración se inició 18 días después de la administración con células PC-3.

Detección de VEGF- Ver de Wet, J. R., K. V. Wood, M. DeLuca, D. R. Helinski, and S. Subramani. 1987. gen de la luciferasa de Firefly: la estructura y expresión en células de mamíferos. Mol Cell Biol 7:725; Rubio, N., M. M. Villacampa, and J. Blanco. 1998. El tráfico a nódulos linfáticos de células tumorales de próstata PC-3 en ratones inmunológicamente deficientes visualizados utilizando el gen luciferasa como un marcador de célula tumoral. Lab Invest 78:1315; Rubio, N., M.. Lorgans se determina empleando células tumorales de próstata PC-3 que expresan el gen luciferasa como un cuantificable del marcador célula tumoral. Prostate 44:133; Harlow, E., and D. Lane. 1988. Antibodies, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Los animales se sacrificaron el día 30 y los tumores se recuperaron y seccionaron. VEGF se detectó utilizando anti VEGF de conejo de Santa Cruz.

Actividad de Luciferasa - Como se describe previamente ver Hilali Clin Cancer Res. 2005 Feb 1;11(3):1253-8. En pocas palabras, los animales se sacrificaron el día 30 utilizando CO_{2}. Los pulmones y hueso se recuperaron y se congelaron en nitrógeno líquido. El tejido congelado luego se molió en polvo y se adicionó solución reguladora de lisis (Promega). Las muestras se colocaron en un vortex por unos pocos segundos y la mezcla se centrifugó por 20 minutos (13000 rpm). Luego se adicionó el sustrato de Luciferasa.

Resultados

El tratamiento con CCR2(E3)-Ig radicalmente degrada el crecimiento del tumor PC-3 - como se muestra en la Figura 5a, la administración repetida de CCR2(E3)-IgG inhibe completamente el crecimiento del tumor PC-3, en comparación con los tumores desarrollados en ratones administrados con PBS o con IgG control.

Final de la Terapia (día 18) con CCR2-Ig bloquea el desarrollo del pretumor establecido primario y su capacidad para formar metástasis- La Figura 5b muestra claramente que incluso cuando CCR2(E3)-IgG se administró después del desarrollo del tumor (día 18 de la inyección de la célula), el bloqueo de CCL2 redujo drásticamente el desarrollo del tumor primario y su capacidad para formar metástasis. Incluso después del tiempo intermedio, después de la administración de las células tumorales (8 días) CCR2 (E3)-IgG fue capaz de inhibir el desarrollo del tumor.

El tratamiento con CCR2(E3)-Ig reduce la metástasis del tumor - Como se muestra en la Figura 5c, el tratamiento de ratones con CCR2(E3)-IgG inhibe significantemente la metástasis del tumor en tejido pulmonar y de hueso como se indica por la reducción de la actividad de luciferasa. La actividad de la luciferasa en ambos tejidos se redujo por 4-10 veces en comparación con animales sin tratar y el conjunto alcanzó el mismo nivel mínimo (i.e., aproximadamente 0.5).

El tratamiento con CCR2(E3)-IgG reduce radicalmente la expresión de VEGF - Como se muestra en las Figuras 6a-f, la administración de CCR2(E3)-IgG (Figuras 6a, d) redujo drásticamente la expresión de VEGF en el sitio del tumor, en comparación con IgG control del correspondiente isotipo (Figuras 6b, e) y PBS (Figuras 6c, f). Esto sugiere que el bloqueo de la ruta CCR2 inhibe la actividad de VEGF que induce el tumor.

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Ejemplo 5 CCL2 inducida por la migración de células PC-3 se inhibe por CCR2(E3)-IgG Materiales y Procedimientos Experimentales

Ensayo de migración celular- la migración celular se determinó utilizando el kit CytoSelect de Cell Biolabs, San Diego, CA. Anti CCL2 se obtuvo de Dr. Martinez and Dr. Melado - Department of Immunology and Oncology, Centro Nacional de Biotecnologia, UAM Campus de Cantoblanco, Madrid, España. En pocas palabras, las células PC-3 (10^{6}/pozo) se adicionaron a la cámara superior de la placa transwell y CCL2 (MCP-1 humana recombinante, RHMCP-1; 20 ng/ml) se adicionó al pozo inferior, que también se suplementó con anti CCL2 (50 \mug) y/o CCR2(E3)-IgG (200 \mug) como se muestra en la Figura 7. Después de 2 horas de incubación a 37ºC, las células PC-3 que migraron se contaron por un FACS. Los resultados se mostraron como medias de triplicados \pm SE.

Resultados

Entre los potenciales mecanismos de acción de CCL2 en células de cáncer de próstata, está el que atrae las células tumorales. Como puede verse en la Figura 7, CCL2 con CCR2-Ig inhibe mejor la migración de células PC3 que el anti CCL2 mAb.

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Ejemplo 6 La PEGilación de una secuencia de aminoácidos de CCR2

Para estabilizar la secuencia de aminoácidos de CCR2 de la presente invención y con el fin de hacerla apta para la administración oral y/o parenteral, un péptido que tiene la siguiente secuencia: Lys Gly Leu Ser Asn Cys Glu Ser Thr Ser Gln Leu Asp Gln Ala Thr Gln Val Thr Glu Thr (SBQ ID NO: 11), que es idéntico a SEQ ID NO:1 excepto que un residuo de Lisina se adiciona en su N-terminal, puede ser PEGilizado utilizando métodos conocidos en el oficio (por ejemplo, Croyle, M.A., et al., 2000, Hum. Gene Ther. 11: 1721-1730; Croyle, M.A., et al., 2004, J. Virol. 78: 912-921). Por ejemplo, monometoxipoli (etileno) el glicol puede ser activado por succinimidil succinato (que puede ser obtenido a partir de Sigma Chemicals, St. Louis, Mo.). Una vez activado, el polímero puede ser adicionado al péptido de CCR2 en una relación en peso de aproximadamente 10:1 (polímero:péptido) y la reacción de PEGilación además se lleva a cabo a 25ºC con agitación suave. Las reacciones se pueden detener por la adición de exceso de lisina (por ejemplo, de 10 veces) (Sigma Chemicals) con respecto a la cantidad de PEG adicionado. El PEG sin reaccionar, exceso de lisina, y sub-productos de reacción se eliminan por intercambio de solución reguladora sobre una columna de cromatografía Micro-Bio Spin P-30 (Bio-Rad) equilibrada con solución salina reguladora de potasio fosfato 100 mM (pH 7.4).

Se aprecia que ciertas características de la invención, que son, para mayor claridad, descritas en el contexto de modalidades separadas, también pueden ser suministradas en combinación en una sola modalidad. Por el contrario, diversas características de la invención, que, por brevedad, se describen en el contexto de una sola modalidad, también pueden presentarse por separado o en cualquier subcombinación apropiada.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citada por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patentes citadas en la descripción

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<212> ADN

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<223> secuencia codificante del dominio CCR2 E3 de Homo sapiens

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggcctgagta actgtgaaag caccagtcaa ctggaccaag ccacgcaggt gacagagact

\hfill

60

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<220>

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8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 227

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

9

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 705

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> miscfeature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (650)..(650)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> miscfeature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (689)..(689)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 234

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia codificante líder Ig kappa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de aminoácido líder Ig kappa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Un polipéptido que contiene Dos dominios CCR2 E3 en tándem

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Un polinucleótido que expresa dos dominios CCR2 E3 en tándem

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Un péptido que contiene el dominio CCR2 E3 adicionado con un residuo N' Lys para PEGilación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido de ADN monocatenario

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccaagcttg gcctgagtaa ctgtgaaag

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido de ADN monocatenario

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgctcgaga gtctctgtca cctgcgtgg

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 311

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Un polipéptido compuesto de Ig kappa líder, dominio CCR2 E3, región constante de cadena Pesada de Inmunoglobulina y una etiqueta 6XHis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 305

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Un polipéptido compuesto de Ig kappa líder, dominio CCR2 E3 y una región constante de cadena Pesada

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

de Inmunoglobulina

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

20

21

Claims (16)

1. Una molécula que comprende una secuencia de inmunoglobulina conjugada con una secuencia de aminoácido de CCR2 que es capaz de unirse a MCP-1, dicha secuencia de aminoácido de CCR2 se describe en la SEQ ID NO: 2 y en donde la molécula es no-inmunógena y esta desprovista de un dominio N-terminal de CCR2.

2. La molécula de la reivindicación 1, que además comprende una etiqueta unida a esta.

3. Una molécula según se describe en la SEQ ID NO: 14 o 15.

4. Una composición farmacéutica que comprende la molécula de la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.

5. Uso de la molécula de la reivindicación 1, para la fabricación de un medicamento identificado para tratar una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de enfermedades inflamatorias, necrosis, aterosclerosis, cáncer, esclerosis múltiple, ateroma, leucemia monocítica, enfermedades de riñón (por ejemplo, glomerulonefritis), síndrome de hamman-rich, endometriosis, artritis reumatoide, bronquiolitis, asma, lupus eritematoso sistémico, enfermedades inflamatorias intestinales (por ejemplo, colitis), alveolitis, restinosis, trauma cerebral, psoriasis, fibrosis pulmonar idiopática y arteriosclerosis de trasplantes.

\vskip1.000000\baselineskip

6. Un método de aislamiento de MCP-1 de una muestra biológica, método que comprende;

(a) poner en contacto la muestra biológica con la molécula de la reivindicación 2, de tal manera que MCP-1 y la molécula de la reivindicación 2 formen un complejo; y

(b) aislamiento de dicho complejo, para así aislar MCP-1, a partir de la muestra biológica.

\vskip1.000000\baselineskip

7. La molécula de la reivindicación 2, en donde dicha etiqueta es una etiqueta de epitope.

8. La molécula de la reivindicación 2, que además se une a un soporte sólido.

9. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en donde dicho portador farmacéuticamente aceptable se formula para administración parenteral.

10. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en donde dicho portador farmacéuticamente aceptable es sustancialmente no-inmunógeno.

11. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en donde dicho portador farmacéuticamente aceptable comprende un ácido lipoamina.

12. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en donde dicho portador farmacéuticamente aceptable comprende un carbohidrato.

13. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en donde dicho portador farmacéuticamente aceptable comprende una microesfera.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en donde dicho portador farmacéuticamente aceptable comprende un liposoma.

15. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en donde dicho portador farmacéuticamente aceptable comprende una microesfera de polímero.

16. El uso de la reivindicación 5, en donde dicha molécula es como se describe en la SEQ ID NO: 14 o 15.