CN102370981B - 防治神经退行性疾病的试剂和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及防治神经退行性疾病的试剂和方法。本发明首次揭示趋化因子MCP-1与小胶质细胞的聚集和/或激活以及神经元的损伤密切相关，从而可以作为药物靶点开发预防或治疗神经退行性疾病的药物。

Description

防治神经退行性疾病的试剂和方法

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及防治神经退行性疾病的试剂和方法。

背景技术

神经元死亡是神经退行性疾病的中心事件，如在阿尔茨海默症(Alzheimer’sdisease，AD)，帕金森氏病(Parkinson’s disease，PD)，亨庭顿氏病(Huntington’s disease，HD)等。这些不同种疾病有一些相同的特点，如选择性的神经元进行性退行，不断严重的神经炎症反应，损伤的氧化代谢，以及未折叠蛋白/错误折叠蛋白的积累等。氧化应激和炎症反应，是这些神经退行性疾病都共有的过程，并认为是在这些疾病中神经元损伤直至死亡的重要原因。

小胶质细胞，广泛分布于中枢神经系统，约占脑内细胞总数的20％，有类似于巨噬细胞的功能——吞噬功能，能清除有害物质及坏死组织，是中枢神经系统内主要的免疫/炎症细胞，与在脑内稳态的维持和修复功能中起重要作用。小胶质细胞在脑内的聚集和激活，是神经退行性疾病中选择性神经元死亡的重要标志之一，同时也被认为是氧化应激引起神经元死亡的一个重要原因。小胶质细胞的聚集和激活，在阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease，AD)，帕金森氏病(Parkinson’s disease，PD)，自闭症(Autism)，视网膜脱离(retina detachment，RD)中都有发生。在这些神经退行性疾病中，激活的小胶质细胞都会聚集在神经元受损伤区域。众所周知，激活的小胶质细胞能分泌各种有细胞毒性作用的成分，包括细胞因子、兴奋性氨基酸、喹啉酸、补体蛋白、活性氧、一氧化氮等。这些物质对邻近的神经元非常有害，能导致临近神经元的进行性死亡。与此相应的，抗炎症药物治疗能有效的延迟或减缓神经退行性疾病的进展。氧化应激是神经退行性疾病的重要共同特点，其常发生在大量活性氧和活性硝基自由基产生，超出了细胞抗氧化系统抵抗能力的时候。氧化应激和小胶质细胞的激活密切相关，慢性小胶质细胞激活会加重氧化应激状态；然而他们之间的因果关系尚不清楚。另外，在神经退行性疾病中，氧化应激在神经元/小胶质细胞的相互作用中的作用也有待研究揭示。

维生素B1(thiamine)，也叫硫胺素，是人体必需的维生素类营养素。其在体内主要以焦磷酸维生素B1(thiamine pyrophosphate，TPP)形式存在。TPP是丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvate dehydrogenase complex，PDHC)，α-酮戊二酸脱氢酶复合体(α-ketoglutarate dehydrogenase complex，KGDHC)以及磷酸戊糖途径中的转酮醇(transketolase，TK)的辅酶。前两个酶复合体是细胞线粒体三羧酸循环至关重要，是利用葡萄糖产生ATP途径的重要组成部分；而转酮酶参与了核糖分子的合成。作为糖代谢中两种关键性催化酶类的辅酶，维生素B1对能量产生具有重要的作用。此外，体内氧化还原反应的主要成分，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamideadenine dinucleotide，NADH)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamideadenine dinucleotide phosphate，NADPH)和谷胱甘肽多是在以TPP为辅助因子的酶促反应过程中产生的。维生素B1在维持脑内氧化代谢平衡方面，如脂质过氧化产物水平和谷胱甘肽还原酶活性方面也发挥了重要作用。这三种依赖维生素B1为辅酶的酶，在维生素B1缺乏影响下，其酶活性显著降低，这会导致线粒体功能异常，能量短缺，慢性氧化应激。以前的研究证实，这种慢性温和的氧化应激能引起一系列的炎症反应，包括小胶质细胞在维生素B1缺乏敏感区域的聚集。然而，为什么小胶质细胞会聚集和激活，而氧化应激在此过程中又扮演何种重要角色，这些还都有待于深入研究来阐明揭示。

维生素B1缺乏(thiamine deficiency，TD)会导致脚气病(beriberi)，心血管系统和神经系统是该病的主要受损的器官系统。维生素B1缺乏引起的中枢神经病理表现被称之为干性脚气病(dry beriberi)，严重的干性脚气病病人记忆力减退，最终发展为痴呆，这种严重的神经退行性疾病被称为韦尼克-科尔萨科夫综合症(Wernicke-Korsakoff’s Syndrome，WKS)。研究显示WKS病人脑内的KGDHC活性明显降低，并伴随有炎症反应，胶质细胞激活，氧化损伤，神经元死亡等一系列神经退行性疾病共同的特征。

近年来许多研究提示了亚临床维生素B1缺乏的普遍性。譬如，在正常的老年人(大于65岁)中，维生素B1水平显著低于中年人(40-50岁)，这种亚临床维生素B1缺乏在老年人中很普遍，但其生理、病理的影响尚未得到明确阐释；大约1/3的充血性心力衰竭病人被检测出维生素B1缺乏；I型和II型糖尿病人血浆中维生素B1降低了75％左右，补充维生素B1实验表明补充维生素B1对糖尿病有一定的保护作用。在AD病人脑组织中，正电子成像技术显示AD病人许多脑区内的葡萄糖代谢明显降低，与此对应的是有报道称葡萄糖代谢直接相关的TPP含量以及TPP依赖性酶类的活性显著下降。本发明人之前的研究显示，维生素B1缺乏能通过增加β分泌酶的活性来增加APP的加工，来产生更多的Aβ，这也在另外一项维生素B1缺乏的AD小鼠模型研究中得到证实。因此，维生素B1缺乏很有可能是AD病人脑组织葡萄糖代谢明显降低的原因之一。

维生素B1缺乏的小鼠模型是经典的由代谢性氧化损伤导致神经系统损伤的动物模型(Ke ZJ，Gibson GE.Selective response of various brain cell types duringneurodegeneration induced by mild impairment of oxidative metabolism.Neurochem Int.2004；45：361-369)。维生素B1缺乏在体内和体外都可引起氧化应激。有研究报道，在体外实验中，正常情况下，活性氧可以在KGDHC的酶促反应中生成；而维生素B1依赖的KGDHC，在维生素B1缺乏的状态下，酶促反应不能正常进行，会产生大量的活性氧。更重要的是，有研究证实，在维生素B1缺乏小鼠脑内，氧化应激标志物血红素氧合酶-1(Heme oxygenase-1，HO-1)表达增加，脂类过氧化产物4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal，HNE)积累。这些标志物的出现表明了维生素B1缺乏小鼠脑组织内存在氧化应激。并且小鼠脑内丘脑腹内侧核团伴随有炎症反应，胶质细胞激活，氧化损伤，神经元死亡等一系列神经退行性疾病共同的特征。

趋化因子是一个具有趋化免疫细胞活性的细胞因子超家族，依据其结构特性，趋化因子可以分为CXC，CC，C和CX3C四个类型，也被称为α，β，γ和δ趋化因子。其保守的氨基酸序列对于他们形成相似的三维结构很重要，四个半胱氨酸相互配对链接可以构成希腊锁链式结构，这个结构是趋化因子共有的。在脑内，趋化因子表达于内皮细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元中。且其和多种神经退行性疾病相关，阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease，AD)，多发性硬化(multiple sclerosis，MS)，帕金森氏病(Parkinson’s disease，PD)和脑缺血(ischemia)。在神经系统中，小胶质细胞/巨噬细胞上表达有多种趋化因子的受体；而在多种神经退行性疾病中，损伤的神经元会分泌趋化因子，招募和激活小胶质细胞到其神经退行性疾病特异的受损脑区，产生神经炎症反应。

发明内容

本发明的目的在于提供一种神经退行性疾病的药物靶点。及防治神经退行性疾病的试剂和方法。

本发明的另一目的在于提供一种防治神经退行性疾病的试剂和方法。。

在本发明的第一方面，提供一种趋化因子MCP-1(也称为CCL2)的抑制剂在制备预防或治疗神经退行性疾病的药物中的用途。

在另一优选例中，所述的趋化因子MCP-1的抑制剂是：

特异性与趋化因子MCP-1结合的抗体或配体；或

特异性干扰趋化因子MCP-1基因表达的小干扰RNA分子或反义核苷酸。

在另一优选例中，所述的特异性与趋化因子MCP-1结合的抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的神经退行性疾病是代谢障碍相关的神经退行性疾病。

在另一优选例中，所述的神经退行性疾病是神经元损伤或死亡相关的神经退行性疾病。

在另一优选例中，所述的代谢障碍导致神经元中趋化因子MCP-1上调，从而介导小胶质细胞的聚集和/或激活，进而加速神经元损伤或死亡。

在另一优选例中，所述的药物还用于：保护神经元。

在另一优选例中，所述的药物还用于：下调小胶质细胞中TNF-α和IL-1β的表达水平。

在另一优选例中，所述的药物还用于：抑制小胶质细胞的聚集和/或激活。

在本发明的另一方面，提供一种筛选预防或治疗神经退行性疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)用候选物质处理表达趋化因子MCP-1的体系；和

(2)检测所述体系中趋化因子MCP-1的表达或活性；

其中，若所述候选物质可降低趋化因子MCP-1的表达或活性，则表明该候选物质是预防或治疗神经退行性疾病的潜在物质。

在另一优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达趋化因子MCP-1的体系中；和/或

步骤(2)包括：检测测试组的体系中趋化因子MCP-1的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达趋化因子MCP-1的体系；

如果测试组中趋化因子MCP-1的表达或活性在统计学上低于(优选显著低于，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)对照组，就表明该候选物是预防或治疗神经退行性疾病的潜在物质。

在另一优选例中，所述的表达趋化因子MCP-1的体系：选自：细胞体系(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在另一优选例中，所述的表达趋化因子MCP-1的体系是神经元。

在本发明的另一方面，提供一种筛选预防或治疗神经退行性疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：

(s1)用MCP-1激活小胶质细胞，使得小胶质细胞的形态变为突起回缩、细胞胞体变圆；

(s2)用候选物质处理(s1)获得的小胶质细胞；

(s3)检测候选物质对于小胶质细胞形态的影响，若所述候选物质使得小胶质细胞由突起回缩、细胞胞体变圆的形态转变为具有枝蔓型凸起、伸长的胞体，则表明该候选物质是预防或治疗神经退行性疾病的潜在物质。

在本发明的另一方面，提供一种筛选预防或治疗神经退行性疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：

(i)用MCP-1激活小胶质细胞，检测小胶质细胞中TNF-α或IL-1β的表达水平；

(ii)用候选物质处理(i)获得的小胶质细胞，再次检测小胶质细胞中TNF-α或IL-1β的表达水平；若是表达水平比MCP-1处理后候选物质加入前的表达水平下降(优选显著下降，如下降20％以上，较佳的下降50％以上；更佳的下降80％以上)，就表明该候选物质是防治哺乳动物神经退行性疾病的潜在物质。

在本发明的另一方面，提供一种细胞共培养系统，包括：

第一培养容器，其中包含神经元细胞培养物(包括神经元细胞及其培养基)；

第二培养容器，其底面或侧面为培养膜，所述培养膜可以透过大分子或小分子，但不能透过细胞，其中包含小胶质细胞培养物(包括小胶质细胞及其培养基)；

其中，所述的第二培养容器置于所述的第一培养容器中，且所述的第二培养容器的底面或侧面与神经元细胞培养物接触。

在另一优选例中，所述培养膜中有孔径为0.4μm的孔。

在本发明的另一方面，提供所述的细胞共培养系统的用途，用于筛选防治哺乳动物神经退行性疾病的物质。

在本发明的另一方面，提供一种筛选预防或治疗神经退行性疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：

(a)提供所述的细胞共培养系统；

(b)将候选物质加入到(a)的细胞共培养系统中；

(c)观察其中神经元细胞的变化，如果神经元细胞死亡在统计学上减少(优选显著减少，如减少20％以上，较佳的减少50％以上；更佳的减少80％以上)，就表明该候选物质是防治哺乳动物神经退行性疾病的潜在物质。

在另一优选例中，(b)中，所述的候选物质是经测定抑制小胶质细胞激活的物质。

在另一优选例中，(b)中，所述的候选物质是经测定抑制MCP-1活性或表达的物质。

在另一优选例中，以上所述的任一筛选方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于预防或治疗神经退行性疾病有用的物质。

另一方面，提供一种预防或治疗神经退行性疾病的方法，所述方法包括：下调所述哺乳动物神经元内趋化因子MCP-1的表达或活性。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1.支架培养膜(culture plate inserts，PICM ORG 50)的示意图。

图2.维生素B1缺乏在丘脑中诱导趋化因子MCP-1的表达。

A：对维生素B1缺乏不同天数的小鼠丘脑和皮层两部分分别进行实时定量PCR检测分析其中MCP-1信使核糖核酸的表达水平。

B：应用免疫印迹测定MCP-1在维生素B1缺乏不同天数的小鼠丘脑中的变化。MCP-1的相对表达量以GAPDH为内参进行定量。

C：其他CC型趋化因子和细胞因子在丘脑和皮层中分别进行实时定量PCR检测分析。

所有数据用平均值±标准偏差显示(n＝5每组)；与对照组比较P＜0.05，为*，即在统计学上有差异。

图3.在丘脑中神经元表达MCP-1。

维生素B1缺乏8天后，应用免疫荧光标记的方法检测MCP-1的表达和定位。这些图片显示的是在丘脑腹内侧核团中的MCP-1阳性细胞(红色)。这些在丘脑腹内侧核团的细胞与神经元的标志物(NeuN)、星形胶质细胞的标志物(GFAP)、小胶质细胞的标志物(CD68)以及内皮细胞的标志物(PECAM1)进行共标记。在丘脑腹内侧核团，MCP-1表达于NeuN阳性的细胞内。标尺为50μm。

图4.维生素B1缺乏在神经元中诱导MCP-1表达上调。

A：在原代培养神经元中诱导维生素B1缺乏的方法参见材料方法。应用实时定量PCR检测原代培养的神经元在维生素B1缺乏条件(TD)下，MCP-1信使核糖核酸的表达水平变化。Ct表示对照组。

B：应用免疫印迹的方法检测原代培养的神经元在维生素B1缺乏条件下，MCP-1蛋白的表达水平变化。MCP-1的相对表达量以GAPDH为内参进行定量。

C：应用免疫细胞荧光染色检测原代培养的神经元在维生素B1缺乏7天后，MCP-1蛋白的表达水平和细胞内定位变化。应用DAPI染神经元的核。

D：在SHSY5Y神经母细胞瘤细胞系中诱导维生素B1缺乏的方法参见材料和方法。应用实时定量PCR检测培养的SHSY5Y细胞在维生素B1缺乏条件下，MCP-1信使核糖核酸的表达水平变化。

E：应用实时定量PCR检测原代培养的星形胶质细胞、小胶质细胞、神经元和脑内皮细胞b.End3细胞系在维生素B1缺乏条件下，MCP-1信使核糖核酸的表达水平变化。

所有数据用平均值±标准偏差显示(n＝3每组)；与对照组比较P＜0.05，为*，即有差异。

图5.维生素B1缺乏后丘脑腹内侧核团小胶质细胞和神经元的变化。

A，B：对照组和维生素B1缺乏10天组老鼠，在丘脑腹内侧核团小胶质细胞标志物(IBA1)和神经元标志物(NeuN)免疫组化染色状况。丘脑腹内侧核团(SmTN)在丘脑乳头体束(mammillothalamic tract，mt)旁。标尺为100μm。

C，D：体视学定量丘脑腹内侧核团IBA1阳性小胶质细胞和NeuN阳性神经元的的数目。

所有数据用平均值±标准偏差显示(n＝5每组)；与对照组比较P＜0.05，为*，即在统计学上有差异。

图6.维生素B1缺乏在神经元/小胶质细胞共培养体系中引起更多神经元死亡。

10⁶原代培养的神经元单独培养或和10⁶小胶质细胞共培养的方法参见材料方法，维生素B1缺乏通过处理1mM Amprolium(AMP)实现。

A：图片显示的单独培养或共培养的神经元的对照组或维生素B1缺乏组。维生素B1缺乏7天能在共培养小胶质细胞(M)的体系里引起更多的神经元死亡。

B：不同组神经元应用Annexin V-PI染色法检测细胞凋亡，参见材料方法。

C：显示不同组神经元Annexin V-PI染色凋亡细胞的百分比。

所有数据用平均值±标准偏差显示(n＝3每组)；与对照组比较P＜0.05，为*，即印迹有差异。

图7.MCP-1对共培养小胶质细胞的神经元存活的影响。

神经元/小胶质细胞共培养体系处理1、10ngMCP-1或50ng脂多糖LPS两天。

A：不同处理组神经元的凋亡细胞应用Annexin V-PI染色法检测。

B：显示不同组神经元Annexin V-PI染色凋亡细胞的百分比。

C：应用实时定量PCR检测不同处理共培养小胶质细胞内TNF-α和IL-1β信使核糖核酸的表达水平变化。

所有数据用平均值±标准偏差显示(n＝3每组)；与对照组比较P＜0.05，为*，即在统计学上有差异。

图8.MCP-1抗体中和对维生素B1缺乏和MCP-1诱导的神经元死亡的作用。

A：维生素B1缺乏的神经元/小胶质细胞共培养体系中，添加0或10μg抗MCP-1抗体(αMCP-1)处理7天。左为应用Annexin V-PI染色法通过流式细胞仪检测细胞凋亡；右为显示不同组神经元Annexin V-PI染色凋亡细胞的百分比。所有数据用平均值±标准偏差显示(n＝3每组)；与维生素B1缺乏组比较P＜0.05，为*，即在统计学上有差异。

B：神经元/小胶质细胞共培养体系处理10ngMCP-1，并同时添加0或10μg抗MCP-1抗体2天。左为细胞凋亡应用Annexin V-PI染色法检测；右为显示不同组神经元Annexin V-PI染色凋亡细胞的百分比。所有数据用平均值±标准偏差显示(n＝3每组)；与单添加MCP-1组比较P＜0.05，为*，即在统计学上有差异。

C，D：应用实时定量PCR检测MCP-1抗体中和对维生素B1缺乏和MCP-1对共培养小胶质细胞内IL-1β和TNF-α信使核糖核酸的表达水平影响。所有数据用平均值±标准偏差显示(n＝3每组)；与对照组比较P＜0.05，为*，即在统计学上有差异；与维生素B1缺乏组或单添加MCP-1组比较P＜0.05，为#，即在统计学上有差异。

图9.MCP-1诱导激活小胶质细胞。

A：原代培养的小胶质细胞，应用0，1，10，ng/毫升MCP-1和50ng/毫升LPS处理3小时。图片显示为不同处理后小胶质细胞形态。MCP-1和LPS诱导小胶质细胞胞体呈现大而圆的激活形态，不同于长的胞体和分支的突起的静息状态。标尺为50μm。

B：激活小胶质细胞百分比评价标准参见材料方法。所有数据用平均值±标准偏差显示(n＝3每组)；与未处理组比较P＜0.05，为*，即在统计学上有差异。

C：小胶质细胞应用0，10ng/mLMCP-1或50ng/mL LPS处理24小时。应用实时定量PCR检测不同处理组小胶质细胞内TNF-α和IL-1βmRNA的表达水平。所有数据用平均值±标准偏差显示(n＝3每组)；与未处理组比较P＜0.05，为*，即在统计学上有差异。

D：小胶质细胞应用对照组和维生素B1缺乏组条件下神经元的培养液以及添加了中和MCP-1抗体(10μg/mL)的维生素B1缺乏组培养神经元的条件培养液处理4小时。图片显示为不同处理后小胶质细胞形态。NT为未处理组。标尺为50μm。

E：激活小胶质细胞百分比评估。所有数据用平均值±标准偏差显示(n＝3每组)；与未处理组比较P＜0.05，为*，即在统计学上有差异；与维生素B1缺乏组比较为p＜0.05，为#，即在统计学上有差异。

F：小胶质细胞处理对照组和维生素B1缺乏组培养神经元条件培养液以及添加了中和MCP-1抗体(0，10μg/mL)的维生素B1缺乏组培养神经元的条件培养液处理42小时。应用实时定量PCR检测不同处理组小胶质细胞内TNF-α和IL-1β信使核糖核酸的表达水平影响。所有数据用平均值±标准偏差显示(n＝3每组)；与未处理组比较P＜0.05，为*，即在统计学上有差异；与维生素B1缺乏组比较为p＜0.05，为#，即在统计学上有差异。

图10.活性氧在维生素B1缺乏的神经元诱导表达MCP-1中的作用。

原代神经元和SHSY5Y中诱导维生素B1缺乏的方法参见材料方法。

A和B：在原代神经元(A)和SHSY5Y(B)上，应用DCF-DA染色检测不同时间点维生素B1缺乏条件下细胞内活性氧产物水平。

C：在不同神经细胞中检测维生素B1缺乏7天后，细胞内活性氧产物水平。所有数据用平均值±标准偏差显示(n＝3每组)；与对照组比较P＜0.05，为*，即在统计学上有差异。

D和E：原代神经元和SHSY5Y在维生素B1缺乏过程中添加200μM Trolox(TR)或PB(磷酸缓冲盐)，应用DCF-DA染色检测维生素B1缺乏7天后细胞内活性氧产物水平。所有数据用平均值±标准偏差显示(n＝3每组)；与对照组比较P＜0.05，为*，即在统计学上有差异；与维生素B1缺乏组比较为p＜0.05，为#，即在统计学上有差异。

F和G：原代神经元和SHSY5Y在维生素B1缺乏过程中添加200μM Trolox或PB，应用实时定量PCR检测维生素B1缺乏7天后MCP-1信使核团核酸表达水平。所有数据用平均值±标准偏差显示(n＝3每组)；与对照组比较P＜0.05，为*，即有差异；与维生素B1缺乏组比较为p＜0.05，为#，即在统计学上在统计学上有差异。

图11.活性氧和小胶质细胞在维生素B1缺乏诱导神经元死亡中的作用。

在神经元/小胶质细胞共培养体系中，维生素B1缺乏7天共孵育(0，200μM)。

A：不同组神经元应用Annexin V-PI染色法检测细胞凋亡，参见材料方法。M存在小胶质细胞。

B：显示不同组神经元Annexin V-PI染色凋亡细胞的百分比。

所有数据用平均值±标准偏差显示(n＝3每组)；与对照组比较P＜0.05，为*，即在统计学上有差异；与维生素B1缺乏组比较为p＜0.05，为#，即在统计学上有差异。

C：应用实时定量PCR检测不同处理共培养小胶质细胞内TNF-α和IL-1β信使核糖核酸的表达水平变化。

所有数据用平均值±标准偏差显示(n＝3每组)；与对照组比较P＜0.05，为*，即有在统计学上差异；与维生素B1缺乏组比较为p＜0.05，为#，即在统计学上有差异。组比较为p＜0.05，为#，即在统计学上有差异。

图12.抗氧化剂减弱维生素B1缺乏在小鼠中丘脑腹内侧核团神经元的死亡，小胶质细胞的激活。

A和B：PB或Trolox(TR；50mg/kg/d)在维生素B1缺乏过程中给小鼠皮下注射。维生素B1缺乏9天后，在丘脑腹内侧核团小胶质细胞标志物(IBA1)和神经元标志物(NeuN)免疫组化染色状况。丘脑腹内侧核团(SmTN)在丘脑乳头体束(mammillothalamic tract，mt)旁。标尺为100μm。

C和D：体视学定量丘脑腹内侧核团IBA1阳性小胶质细胞和NeuN阳性神经元的的数目。

所有数据用平均值±标准偏差显示(n＝5每组)；与PB加维生素B1组比较P＜0.05，为*，即在统计学上有差异。

图13.MCP-1中和抗体对维生素B1缺乏诱导的丘脑腹内侧核团小胶质细胞激活和神经元死亡的影响。

在小鼠中维生素B1缺乏的诱导参见材料方法。

A和B：在维生素B1缺乏7天后给小鼠左侧丘脑定位注射PBS或中和抗体(α-MCP-1；4μg溶于PBS)。维生素B1缺乏9天后，在丘脑腹内侧核团小胶质细胞标志物(IBA1)和神经元标志物(NeuN)免疫组化染色。丘脑腹内侧核团(SmTN)在丘脑乳头体束(mammillothalamic tract，mt)旁。标尺为100μm。

C和D：体视学定量丘脑腹内侧核团IBA1阳性小胶质细胞和NeuN阳性神经元的的数目，图中显示为左侧/右侧比值。

所有数据用平均值±标准偏差显示(n＝7每组)；与注射PBS的维生素B1缺乏组比较P＜0.05，为*，即在统计学上有差异。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次揭示趋化因子MCP-1与小胶质细胞的聚集和/或激活以及神经元的损伤密切相关，从而可以作为药物靶点开发预防或治疗神经退行性疾病的药物。

趋化因子MCP-1及其作用

趋化因子(趋化活性细胞因子)是一个小分子蛋白超家族，参与炎症反应过程中自细胞迁移。然而，趋化因子在神经退行性疾病中的具体作用仍不清楚。维生素B1缺乏(Thiamine Deficiency，TD，也叫硫胺素缺乏)会在脑内引起不正常的氧化代谢，并进一步引起区域特异的神经退行和神经炎症这两种神经退行性疾病共有的特征。维生素B1缺乏的小鼠模型中，也会导致相似脑区(丘脑腹内侧核团，submedial thalamusnucleus，SmTN)的小胶质细胞的神经炎症和神经退行。应用维生素B1缺乏模型，本发明人研究了趋化因子在神经退行性疾病中的作用和潜在机制。在检测的趋化因子中，维生素B1缺乏选择性的引起MCP-1在丘脑腹内侧核团表达的上调，而这早于小胶质细胞的激活和神经退行的发生。而且，维生素B1缺乏引起的MCP-1表达的上调，无论在体内还是体外都是源于神经元，而不是小胶质细胞，星形胶质细胞或脑内血管内皮细胞。来源于维生素B1缺乏下神经元的培养液能激活小胶质细胞。在本发明人建立的神经元/小胶质细胞共培养体系里，发现MCP-1对神经元的细胞毒性作用依赖于小胶质细胞。外源的MCP-1能激活小胶质细胞并促进小胶质细胞产生趋化因子。一个MCP-1的抗体中和实验无论在培养的细胞上还是在动物的丘脑区域，能有效的抑制MCP-1引起的小胶质细胞的激活和神经元死亡。这种抗体也能抑制来源于维生素B1缺乏条件下神经元的培养液引起的小胶质细胞的激活。另外，维生素B1缺乏能特异的引起神经元细胞内活性氧的积累(reactive oxygen species，ROS)，但在小胶质细胞，星形胶质细胞或脑内血管内皮细胞都不增加。抗氧化剂能有效的抑制维生素B1缺乏引起的神经元内MCP-1的上调和小胶质细胞激活。综上，本发明人的结果说明，氧化代谢损伤中的神经元分泌MCP-1能引起小胶质细胞的聚集和激活，而这将加剧神经退行性疾病的进程。

本研究中，本发明人应用维生素B1缺乏的小鼠模型和细胞模型，来研究应对氧化应激时，趋化因子在神经元/小胶质细胞之间的相互作用中的作用。维生素B1缺乏引起慢性温和的氧化代谢损伤，并引起特异脑区产生氧化应激和神经炎症，这会导致这些特异脑区的神经元的死亡。其中氧化应激、神经炎症和特异神经元死亡是神经退行性疾病的共同特点。和人类的AD一样，实验的TD模型能降低多个脑区维生素B1酶的活性，其中最敏感的脑区是丘脑腹内侧核团(submedial thalamic nucleus，SmTN)。而且在丘脑腹内侧核团聚集激活的小胶质细胞也是维生素B1缺乏引起神经元死亡的一个重要特征。维生素B1缺乏能在这一特异脑区引起氧化应激、小胶质细胞和星形胶质细胞的激活、多种细胞因子上调，如TNF-α，IL-1β和IL-6。同时，也能引起这一特异脑区神经元死亡。维生素B1缺乏动物模型中的这种时空特异的病理学变化已经有了比较充分的阐述。应用这样的动物模型，本发明人研究了氧化应激发生时，趋化因子在神经元/小胶质细胞相互作用中的功能。本发明人发现TD能特异的引起趋化因子MCP-1在SmTN区域的神经元的特异上调，这先于小胶质细胞的激活和神经退行性病变的发生。而对维生素B1缺乏小鼠丘脑腹内侧核团给予MCP-1的抗体能有效的抑制维生素B1缺乏引起的小胶质细胞激活和神经元退行性病变。在一个神经元/小胶质细胞的共培养体系中，本发明人确证，维生素B1缺乏和MCP-1的神经毒性作用依赖于小胶质细胞，并且外源的MCP-1也能激活小胶质细胞。抗氧化剂能削弱维生素B1缺乏引起的神经元MCP-1的表达上调，以及小胶质细胞的激活。总而言之，本发明人的结果显示，慢性氧化代谢损伤能使神经元产生MCP-1，这将导致小胶质细胞的聚集和激活，而小胶质细胞的聚集和激活会加速神经退行性病变进程。

任何适合的MCP-1蛋白均包括在本发明中。所述的MCP-1蛋白可以来源于鼠或其它哺乳动物或人。所述的MCP-1蛋白包括全长的MCP-1蛋白或其生物活性片段。优选的，所述的MCP-1蛋白的氨基酸序列可以与GenBank登录号：NP_002973.1(人)，NP_035463.1(小鼠)所示的序列基本上相同。编码所述的MCP-1蛋白的核苷酸序列可以与GenBank登录号：NM_002982.3(人)，NM_011333.3(小鼠)所示的序列或该序列的简并的序列基本上相同。

通过上述的研究工作可知，MCP-1是一个新的、与神经退行性疾病密切相关的药物靶点。针对MCP-1的各种治疗手段可以作为治疗神经退行性疾病的新颖和有效的手段。

MCP-1的抑制剂及其用途

基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种MCP-1的抑制剂的用途，用于制备预防或治疗神经退行性疾病的组合物。所述的神经退行性疾病优选地是神经元损伤或死亡相关的神经退行性疾病。所述的神经元损伤或死亡优选地是维生素B1缺乏引起的。

此外，所述的MCP-1的抑制剂还用于保护神经元；下调小胶质细胞中TNF-α和IL-1β的表达水平；或抑制小胶质细胞的聚集和/或激活。

如本文所用，所述的MCP-1基因或蛋白的抑制剂包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。

所述的MCP-1基因或蛋白的抑制剂是指任何可降低MCP-1蛋白的活性、降低MCP-1基因或蛋白的稳定性、下调MCP-1蛋白的表达、减少MCP-1蛋白有效作用时间、或抑制MCP-1基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调MCP-1有用的物质，从而可用于预防或治疗神经退行性疾病。例如，所述的抑制剂是：特异性干扰MCP-1基因表达的小干扰RNA分子或反义核苷酸；或特异性与MCP-1结合的抗体或配体。

作为本发明的一种优选方式，所述的MCP-1的抑制剂是一种特异性与MCP-1结合的抗体。所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。可用MCP-1蛋白免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等来生产多克隆抗体；多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。与之相似的，表达MCP-1或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。所述的抗体也可以是单克隆抗体，此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。

作为本发明的一种优选方式，所述的MCP-1的抑制剂是一种MCP-1特异性的小干扰RNA分子(siRNA)。如本文所用，所述的“小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。

小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。本发明对小干扰RNA的制备方法没有特别的限制，包括但不限于：化学合成法，体外转录法等。应理解，本领域技术人员在得知了MCP-1与神经退行性疾病的相关性以后，可以以各种途径方便地制备出所述的小干扰RNA，从而用于抑制神经退行性疾病。所述的小干扰RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到体内(如神经元聚集区)，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到体内。此外，小干扰RNA包含的正义链和反义链可通过一个或多个编码正义链和反义链的表达盒来制备。当正义链和反义链由一个单独的表达盒编码时，它们可以从生成的转录物中断裂形成分离的正义链和反义链，其后杂交生成双链小干扰RNA。所述的小干扰RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的MCP-1的抑制剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于防治神经退行性疾病。任何前述的MCP-1的抑制剂均可用于组合物的制备。

如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。

在得知了所述MCP-1基因或蛋白的抑制剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的抑制剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。

优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将MCP-1的抑制剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带MCP-1的抑制剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或siRNA)递送到靶点(如神经元细胞)上，并使之表达活性的MCP-1抑制剂，具体情况需视所述的抑制剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

本发明所述的MCP-1的抑制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的MCP-1基因或蛋白的抑制剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的MCP-1的抑制剂每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

药物筛选

在得知了MCP-1与神经退行性疾病的密切相关性后，可以基于该特征来筛选抑制MCP-1的表达或活性的物质。可从所述的物质中找到对于预防或治疗神经退行性疾病真正有用的药物。

因此，本发明提供一种筛选预防或治疗神经退行性疾病的潜在物质的方法，所述的方法包括：用候选物质处理表达MCP-1的体系；和检测所述体系中MCP-1的表达或活性；若所述候选物质可抑制MCP-1的表达或活性，则表明该候选物质是预防或治疗神经退行性疾病的潜在物质。所述的表达MCP-1的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达MCP-1的细胞；或可以是重组表达MCP-1的细胞。所述的表达MCP-1的体系还可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到MCP-1的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达MCP-1的体系。

本发明对于MCP-1蛋白的表达、活性、存在量或分泌情况的检测方法没有特别的限制。可以采用常规的蛋白定量或半定量检测技术，例如(但不限于)：SDS-PAGE法，Western-Blot法等。

此外，在得知了所述MCP-1可激活小胶质细胞后，可通过小胶质细胞的形态变化来筛选药物。因此，本发明提供了一种筛选预防或治疗神经退行性疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：(s1)用MCP-1激活小胶质细胞，使得小胶质细胞的形态变为突起回缩、细胞胞体变圆；(s2)用候选物质处理(s1)获得的小胶质细胞；以及(s3)检测候选物质对于小胶质细胞形态的影响，若所述候选物质使得小胶质细胞由突起回缩、细胞胞体变圆的形态转变为具有枝蔓型凸起、伸长的胞体，则表明该候选物质是预防或治疗神经退行性疾病的潜在物质。

此外，在得知了所述MCP-1可激活小胶质细胞后，以及激活后小胶质细胞内TNF-α或IL-1β的表达水平上升的特点，可基于此筛选药物。因此，本发明还提供了一种筛选预防或治疗神经退行性疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：(i)用MCP-1激活小胶质细胞，检测小胶质细胞中TNF-α或IL-1β的表达水平；(ii)用候选物质处理(i)获得的小胶质细胞，再次检测小胶质细胞中TNF-α或IL-1β的表达水平；若是表达水平比MCP-1处理后候选物质加入前的表达水平下降，就表明该候选物质是防治哺乳动物神经退行性疾病的潜在物质。

共培养体系及药物筛选

在得知了所述小胶质细胞对于神经元细胞的影响后，可基于建立小胶质细胞与神经元细胞的共培养体系，并基于此筛选药物。

本发明还提供了一种细胞共培养系统，包括：

第一培养容器，其中包含神经元细胞培养物(包括神经元细胞及其培养基)；

第二培养容器，其底面或侧面为培养膜，所述培养膜可以透过大分子或小分子，但不能透过细胞，其中包含小胶质细胞培养物(包括小胶质细胞及其培养基)；

其中，所述的第二培养容器置于所述的第一培养容器中，且所述的第二培养容器的底面或侧面与神经元细胞培养物接触。

所述的共培养体系中，小胶质细胞与神经元细胞不直接接触，但其细胞间的小分子和大分子物质可以交换。所述的共培养体系可以提供更接近于体内环境的环境，从而有利于筛选获得有用的药物。

因此，本发明还提供了一种筛选预防或治疗神经退行性疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：(a)提供所述的细胞共培养系统；(b)将候选物质加入到(a)的细胞共培养系统中；(c)观察其中神经元细胞的变化，如果神经元细胞死亡减少，就表明该候选物质是防治哺乳动物神经退行性疾病的潜在物质。

作为本发明的优选方式，(b)中，所述的候选物质是经测定抑制小胶质细胞激活的物质；或所述的候选物质是经测定抑制MCP-1活性或表达的物质。

较佳地，为了排除所述的候选物质通过直接作用于神经元细胞而减少其死亡，还设置对照组，所述对照组为第一培养容器，其中包含神经元细胞培养物。在该对照组中加入候选物质，若候选物质能够在所述的共培养体系中减少神经元细胞的死亡，而在该对照组中不减少神经元细胞的死亡，则说明该候选物质通过抑制MCP-1表达或活性或抑制小胶质细胞的激活而发挥减少神经元死亡的作用。

另一方面，作为本发明的优选方式，以上任一筛选方法进一步还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于预防或治疗神经退行性疾病真正有用的物质。

本发明还提供了采用所述筛选方法获得的预防或治疗神经退行性疾病的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制MCP-1的表达和活性，进而预防或治疗神经退行性疾病有用的物质。

本发明的主要优点在于：

(1)首次揭示MCP-1与神经退行性疾病的发生或发展密切相关，从而可以作为药物靶点开发预防或治疗神经退行性疾病的药物。

(2)首次描绘了TD病理引起的神经退行性病变时序：神经元是TD最初的目标细胞；在TD过程中，胞内活性氧积累，产生氧化应激。氧化应激对神经元有害，而且能促进神经元产生分泌MCP-1。MCP-1招募聚集并激活小胶质细胞。而激活的小胶质细胞进一步损伤神经元。因此，神经元分泌的MCP-1在神经退行性病变中的神经元/小胶质细胞相互作用中发挥重要作用，而且这和氧化应激密切有关。

(3)基于本发明人的新发现找到了可抑制MCP-1的抑制剂，其可非常有效地抑制MCP-1的表达，从而预防或治疗神经退行性疾病的发生。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

材料和方法

1、试验所用试剂及抗体

试剂

三羟甲基氨基甲烷(Tris)、牛血清白蛋白(BSA)、蛋白酶抑制剂、NP-40、Tween-20、TritonX-100、Pyrithiamine、Amprolium等购自Sigma公司(St.Louis，MO，USA)；水溶性维生素E(Trolox)、十二烷基磺酸钠(SDS)购自Calbiochem公司(La Jolla，CA，USA)；氧自由基检测染料6-carboxy-2’，7’-dichlorodihydrofiuoresceindiacetate(Carboxy-H₂DCFDA)购自Molecular Probes公司(Eugene，OR，USA)；维生素B1缺乏的DMEM培养液(Thiamine deficiency medium，TDM)是向JRH公司(Lenexa，KA，USA)特殊定制的；DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)培养液、Neurobasal培养液、青霉素、链霉素、0.25％胰蛋白酶购自GIBCO公司(Carlsbad，CA，USA)；胎牛血清购自Hyclone公司(Logan，UT，USA)；MCP-1购自AbD Serotec公司(Raleigh，NC，USA)；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自Biovision公司(Mountain View，CA，USA)；Avidin-biotin-peroxidase complex和3，3’-diaminobenzidine(DAB)购自VectorLaboratories公司(Burlingame，CA，USA)。

抗体

兔抗MCP-1、大鼠CD68抗体购自AbD Serotec公司(Raleigh，NC，USA)；小鼠抗NeuN抗体、生物素标记二抗Chemicon International公司(Temecula，CA，USA)；小鼠抗GFAP抗体购自Sigma公司(St.Louis，MO，USA)；大鼠抗PECAM1抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司(Santa Cruz，CA，USA)；兔抗IBA1抗体购自Wako公司(Osaka，Japan)；小鼠抗GAPDH抗体购自康盛生物科技公司(Shanghai，China)。Alexa标记二抗购自Molecular Probes公司(Eugene，OR，USA)；HRP标记二抗购自Jackson immunology公司(Portland，OR，USA)。

2、细胞培养及体外维生素B1缺乏模型

(1)SHSY5Y的培养

SHSY5Y神经母细胞瘤细胞培养在添加10％胎牛血清，100U/mL青霉素100μg/mL链霉素的DMEM中。维生素B1缺乏的DMEM培养液(Thiamine deficiencymedium，TDM)是向JRH公司特殊定制的，其组成成分除没有维生素B1外，与普通的DMEM培养液完全相同。此外，实验中本发明人还向新鲜配制的培养液加入了维生素B1的拮抗剂Pyrithiamine(购自Sigma)。将Pyrithiamine的终浓度设定为300nM。细胞传代24小时后，吸弃培养液，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗2遍后加入含有Pyrithiamine的TDM培养液，即为开始维生素B1缺乏处理。此后每隔一天更换一次细胞培养液。

(2)原代小鼠大脑皮层神经元的培养

原代小鼠大脑皮层神经元的培养方法如下：取孕14天小鼠胚胎大脑皮层，悬于4～5mL 0.025％的胰酶溶液37℃消化15-20分钟后中和胰酶，离心；用含130kU/mL脱氧核糖核酸酶的缓冲液重悬，轻轻吹散成单细胞悬液，离心；Neurobasal培养液添加2％B27(Invitrogen公司；Carlsbad，CA，USA)，1mM谷氨酸(Invitrogen公司；Carlsbad，CA，USA)，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Gibco公司；Los Angeles，CA，USA)(NB/B27培养液)重悬，计数。每个35mM培养盘或6孔板接种250～300万个细胞。培养盘或孔板需用多聚赖氨酸(50μg/mL)包被过夜。培养条件是37℃，5％CO₂的培养箱。培养7天后，换液，在处理组中添加1mM Amprolium(AMP)处理不同时间。Amprolium是维生素B1转运体的强抑制剂，能有效的减少细胞内维生素B1水平。

(3)原代小鼠小胶质细胞和星形胶质细胞的培养

原代小鼠小胶质细胞和星形胶质细胞的培养方法如下：取出生1～3天的小鼠大脑皮层，悬于10mL0.025％的胰酶溶液37℃消化15-20分钟，后中和胰酶，离心；含130kU/mL脱氧核糖核酸酶I的缓冲液重悬，轻轻吹打散，离心；DMEM培养基添加10％胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素重悬，计数。接种到75mM培养瓶内，培养条件是37℃，5％CO₂的培养箱。培养14天后，200转/分摇1～2小时，培养液内悬浮细胞离心即为小胶质细胞。贴壁细胞消化，用培养基重悬，接种到10厘米培养盘，培养箱内孵育1小时，悬浮细胞离心即为星形胶质细胞。原代的小鼠小胶质细胞和星形胶质细胞不传代，以增加一致性，减少可能的酶活减少和氧化损伤。细胞纯度约为98％。维生素B1缺乏处理如SHSY5Y，即TDM添加300nM Pyrithiamine，10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。

(4)原代小鼠小胶质细胞和神经元的共培养

原代小鼠小胶质细胞和神经元的共培养中，原代培养的神经元以1×10⁶个细胞/35mM盘的密度，或1×10⁶个细胞/孔(6孔板)的密度接种，在NB/B27培养液中培养7天。1×10⁶个小胶质细胞培养在支架培养膜(Culture plate inserts，见图1)上贴壁24小时后，放入培养神经元的盘或孔板里共培养。在此系统中，神经元和小胶质细胞不通过直接接触相互作用，而且神经元和小胶质细胞可以用于进一步的生化分析。维生素B1缺乏的诱导和原代培养的神经元相同，1mM Amprolium处理7天。在抗体中和实验中，抗MCP-1的抗体工作浓度是1μg/mL，在维生素B1缺乏的4天和6天分别添加。抗氧化实验中，抗氧化剂Trolox的工作浓度是200μM，和Amprolium同时添加。LPS和MCP-1共培养实验中，细胞用培养液为NB/B27(无抗氧化剂型)，LPS的工作浓度是50ng/mL，MCP-1的工作浓度有1ng/mL和10ng/mL，分别处理2天。不同处理结束后，下层神经元用于细胞凋亡检测(Annexin V和PI染色)，上层小胶质细胞抽提RNA用于实时定量PCR。

3、动物维生素B1缺乏模型

通过对小鼠喂食维生素B1缺乏粮食(购自ICN Nutrition Biomedicals)，同时每日对其腹腔注射(0.5mg/kg)维生素B1拮抗剂Pyrithiamine来构建维生素B1缺乏小鼠模型。通常处理11天后，小鼠开始出现死亡。维生素B1缺乏期间，为小鼠提供充足饲料和水，任其自由取食；对照组喂食维生素B1对照粮食，每天腹腔注射生理盐水。维生素B1缺乏的组别设置了6天到11天的时间点；为了检测抗氧化剂对维生素B1缺乏影响，另设置了补充Trolox组别，此组小鼠在维生素B1缺乏处理过程中，同时给予50mg/kg/d的Trolox，并在维生素B1缺乏9天收集样本。为了检测抗体中和对维生素B1缺乏影响，还设置了补充丘脑内注射抗体的组别，此组小鼠在维生素B1缺乏7天时，立体定位注射4μg抗体MCP-1，并在维生素B1缺乏9天收集样本。实验过程中，记录每日小鼠的体重变化，以开始维生素B1缺乏当天的体重平均值作为基准，得到小鼠体重变化曲线。通常在处理9天后，小鼠体重开始下降；处理11天后，开始出现个别小鼠死亡现象。

4、样品收集和免疫印迹实验

免疫印迹实验：对于维生素B1缺乏处理不同时间的细胞或小鼠脑组织，用RIPA缓冲液(150mM NaCl，50mM Tris(PH8.0)，1％NP-40，0.1％SDS，0.5％Deoxycholic acidsodium，蛋白酶抑制剂试剂盒(1∶100))提取总蛋白，冰上裂解细胞10分钟，14000g，4℃离心60分钟，收集上清，-80℃保存。小鼠脑组织，匀浆后，冰上放置10-20分钟，期间数次混匀样品。14000g，4℃离心60分钟，收集上清，-80℃保存。按BCA试剂盒(购自Pierce)的方法测定每个样品的总蛋白浓度，调平各个样品的蛋白浓度，取等体积的样品加入上样缓冲液(loading buffer，6×)，煮沸10分钟后，冷却至室温。样品采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE)分离，凝胶的浓度是15％。采用半干法转膜，硝酸纤维素膜(购自Schleicher & Schuell公司)的孔径为0.2μm。转膜后用PBS-T(PBS-Tween20，0.02％)充分洗涤，5％脱脂奶粉(溶于PBS-T)室温下封闭1小时，转入一抗(primary antibody)溶液，用含5％牛血清白蛋白的PBS-T溶液稀释看体，MCP-1的多克隆抗体按1∶1000稀，GADPH的单克隆抗体按1∶20000稀释。4℃孵育过夜后，PBS-T充分洗涤，转入辣根过氧化物耦连的相应二抗溶液，室温孵育1小时，PBS-T充分洗涤。加入ECL溶液(购自GE health care公司)显色，暗室中X光胶片显色印迹。利用Quantity One软件(购自Bio-Rad公司)对胶片条带的密度进行定量测定。

5、RNA抽提和实时定量PCR实验

(1)细胞和组织RNA的抽提

细胞样品，磷酸盐缓冲液洗两遍后，加入1ml Trizol裂解细胞，按Trizol法(Trizol购自Invitrogen公司)的说明抽取总RNA；组织样本在Trizol内匀浆，按Trizol法的说明抽取总RNA。测定RNA浓度后，将所有样品的浓度统一调整为2μg/mL。按Promaga公司试剂盒的说明进行RNA的反转录实验。

(2)实时定量PCR实验

本实验采用了荧光染料(SYBR green)掺入法来检测目的基因的表达变化。其原理是在PCR反应体系中，加入过量的SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入脱氧核糖核酸双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加同步。通过对反应体系内荧光信号的实时检测，计算出目的基因的mRNA含量。SYBR染料和PCR仪器均为ABI公司产品。利用其随机附送的引物设计软件得到如下引物：

mMCP1正向，5’-TCTCTCTTCCTCCACCACCATG-3’(SEQ ID NO：1)；

mMCP1反向，5’-GCGTTAACTGCATCTGGCTGA-3’(SEQ ID NO：2)；

hMCP1正向，5’-TCTCGCCTCCAGCATGAAAGT-3’(SEQ ID NO：3)；

hMCP1反向，5’-GCATTGATTGCATCTGGCTGA-3’(SEQ ID NO：4)；

Actin正向，5’-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3’(SEQ ID NO：5)；

Actin反向，5’-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3’(SEQ ID NO：6)；

mVEGF正向，5’-ACCGATTAACCATGTCACCACC-3’(SEQ ID NO：7)；

mVEGF反向，5’-CCAAAGTGCTCCTCGAAGAGTC-3’(SEQ ID NO：8)；

mEPO正向，5’-CACCAGAGACCCTTCAGCTTCA-3’(SEQ ID NO：9)；

mEPO反向，5’-GCGACATCAATTCCTTCTGAGC-3’(SEQ ID NO：10)；

mTNF-α正向，5’-AGCCGATGGGTTGTACCTTGTCTA-3’(SEQ ID NO：11)；

mTNF-α反向，5’-TGAGATAGCAAATCGGCTGACGGT-3’(SEQ ID NO：12)；

mIL-1β正向，5’-ACAGAATATCAACCAACAAGTGATATTCTC-3’(SEQ ID NO：13)；

mIL-1β反向，5’-GATTCTTTCCTTTGAGGCCCA-3’(SEQ ID NO：14)。

以cDNA作为模板，混入2×Real time PCR缓冲液，加入相应的引物后，进行实时定量PCR，温度设定如下：94℃变性10秒，60℃退火，延伸60秒。数据由随机附送的分析软件导出。

6、立体定位注射

维生素B1缺乏处理7天的小鼠，腹腔注射水合氯醛溶液(400mg/kg)对小鼠进行麻醉，待小鼠深度麻醉后，固定在立体注射定位仪上，在左侧丘脑近丘脑腹内侧核团：前囟(Bregma)后1.45mm，中线侧0.5mm，软脑膜下4mm，注射4μg(溶于4μL磷酸盐缓冲液)抗MCP-1抗体或4μL磷酸盐缓冲液。所有注射都使用10μL Hamilton注射器，以0.1uL/min度进行。注射后，注射器在注射点停留5分钟后拔出45。

7、免疫荧光组织和细胞化学

(1)小鼠脑组织的固定、切片

维生素B1缺乏处理不同时间后，腹腔注射水合氯醛溶液(500mg/kg)对小鼠进行麻醉，待小鼠深度麻醉后，迅速打开胸腔，暴露心脏，心脏灌流50mL 0.9％氯化钠水溶液后继续灌注100mL固定液(4％多聚甲醛溶液)，剥离脑组织，放入固定液继续固定24小时。脑组织转入30％蔗糖溶液，待脑组织沉降后，在滑动切片机(Lecia公司)上进行冰冻切片。本发明人主要研究了丘脑区域(从bregma-0.7到-2.06)，片厚40μm，隔5取1放置于同一孔内(24孔板)，得到5套脑组织的切片。一套用于神经元特异性核蛋白(Neuronal Nuclei，NeuN)的免疫组织化学染色，一套用于小胶质细胞特异蛋白(Ionized calcium binding adaptor molecule-1，IBA1)的免疫组织化学染色。用于体视学细胞计数。

(2)免疫组织化学ABC法染色方法

3％过氧化氢溶液，室温处理30分钟。磷酸盐缓冲液洗3次，每次20分钟；

0.1％Triton-X 100，室温处理10分钟。磷酸盐缓冲液洗3次，每次20分钟；

抗体封闭液(10％羊血清，1％牛血清白蛋白，0.1％TritonX-100)封闭，室温1小时；

切片转入一抗(1％羊血清，1％牛血清白蛋白，0.1％TritonX-100)溶液，一抗为NeuN的鼠源单克隆抗体，按1∶1000稀释；一抗为IBA1的兔源多克隆抗体，按1∶1000稀释；4℃孵育过夜。第二天磷酸盐缓冲液洗3次，每次20分钟；

切片转入二抗溶液(羊抗小鼠，羊抗兔，1∶200)室温孵育2小时。磷酸盐缓冲液洗3次，每次20分钟；

切片转入辣根过氧化物酶标记的链亲和素(1∶1000)溶液，室温孵育2小时。磷酸盐缓冲液洗3次，每次20分钟；

0.03％的DAB(3，3’-Diaminobenzidine，3，3’-二氨基联苯胺)磷酸盐缓冲液，加入终浓度为0.01％的过氧化氢，显色适当时间。磷酸盐缓冲液洗3次，每次20分钟；

贴片，晾干后，脱水透明处理，中性树胶封片，显微镜下观察，拍照。所得图片经DP maneger软件(Olympus公司)处理后保存。经Photoshop 9.0软件编辑得到实验结果图片。

(3)免疫荧光细胞和免疫荧光组织化学染色方法

免疫荧光组织化学染色方法

脑片在0.1％Triton-X 100中室温处理10分钟后，磷酸盐缓冲液洗3次，每次20分钟；

抗体封闭液(10％羊血清，1％牛血清白蛋白，0.1％TritonX-100)封闭，室温1小时；

切片转入一抗(1％羊血清，1％牛血清白蛋白，0.1％TritonX-100)溶液，一抗MCP-1兔源多克隆抗体，按1∶1000稀释；4℃孵育过夜。第二天磷酸盐缓冲液洗3次，每次20分钟；

切片转入二抗溶液(羊抗兔Alexa555，1∶1000)室温孵育2小时。磷酸盐缓冲液洗3次，每次20分钟；

切片转入抗为NeuN、GFAP的鼠源单克隆抗体，CD68、PECAM1的大鼠源单克隆抗体，按1∶1000稀释；4℃孵育过夜。磷酸盐缓冲液洗3次，每次20分钟；

切片转入二抗溶液(羊抗鼠或大鼠Alexa488，1∶1000)室温孵育2小时。磷酸盐缓冲液洗3次，每次20分钟；

贴片，晾干后，抗淬灭封片剂封片，双光子共聚焦激光显微镜下观察，拍照。经Photoshop 9.0软件编辑得到实验结果图片。

培养神经元4％多聚甲醛固定15分钟后0.1％Triton-X 100中室温处理10分钟后，磷酸盐缓冲液洗3次，每次20分钟；

抗体封闭液(10％羊血清，1％牛血清白蛋白，0.1％TritonX-100)封闭，室温1小时；

切片转入一抗(1％羊血清，1％牛血清白蛋白，0.1％TritonX-100)溶液，一抗MCP-1兔源多克隆抗体，按1∶1000稀释；4℃孵育过夜。第二天磷酸盐缓冲液洗3次，每次20分钟；

切片转入二抗溶液(羊抗兔Alexa555，1∶1000)室温孵育2小时。DAPI染核10分钟，磷酸盐缓冲液洗3次，每次20分钟。

取出含细胞玻片晾干后，抗淬灭封片剂封片，双光子共聚焦激光显微镜下观察，拍照。经Photoshop 9.0软件编辑得到实验结果图片。

8、活性氧的检测

荧光素法检测活性氧的原理：2’，7’-二氯二氢荧光素二乙酯(2’，7’-Dichlorofluorescin diacetate，CM-H₂DCFDA)在还原状态下没有荧光，当这种染料进入细胞后，在乙酰基转移酶的作用下，乙酰基被移走，还原状态的二氯荧光素可以被细胞内的自由基分子氧化，氧化状态的二氯荧光素就会发出荧光，通过流式细胞仪检测细胞内的荧光强度，从而反映细胞内的活性氧水平。

本实验利用荧光素法检测维生素B1缺乏不同时间点(1天、3天、5天、7天)对细胞内氧化还原状态的影响。此外本发明人还检测了抗氧化剂Trolox的抗氧化作用。组别设置如下：对照组、对照状况添加200μM终浓度的Trolox组、维生素B1缺乏组(添加300μM Pyrithiamine缺乏维生素B1的DMEM或添加1mM Amprolium的Neurobasal)、和维生素B1缺乏条件添加200μM的Trolox，细胞处理7天后检测。

实验方法：避光条件下，用DMSO完全溶解染料，配制成10mM的母液，分装为20μL/管，避光、隔绝空气，保存在-20℃。使用时，用磷酸盐缓冲液稀释1500倍(终浓度为10μM)。待检测不同组细胞，吸弃培养液后，磷酸盐缓冲液洗2遍，再加入稀释好的染料。避光，在37℃培养箱孵育30分钟，0.05％的胰酶消化后重悬。用磷酸盐缓冲液洗去残存的培养液，用300-500μL磷酸盐缓冲液重悬细胞，在流式细胞仪(BD公司)检测细胞内荧光强度，激发光波长：488nm；发射光波长：520nm。数据的获取、分析均采用BD公司的Cellquest program软件来完成。

9、AnnexinV+Propidium iodide(PI)检测细胞凋亡

AnnexinV检测凋亡的原理是：在细胞凋亡早期，位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸迁移至细胞膜外侧。磷脂结合蛋白V(AnnexinV)是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它与磷脂酰丝氨酸具有高度的结合力。因此，AnnexinV可以作为探针检测暴露在细胞外侧的磷脂酰丝氨酸。将AnnexinV标记上荧光素(如异硫氰酸荧光素Fluoresceinisothiocyanate，FITC)，同时结合使用PI染色(因坏死细胞磷脂酰丝氨酸亦暴露于细胞膜外侧，但对PI高染)进行凋亡细胞双染色法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。结果判断：正常活细胞AnnexinV和PI均低染；早期凋亡细胞AnnexinV高染、PI低染；坏死和凋亡晚期的细胞AnnexinV和PI均高染。细胞发生凋亡时，膜上的磷脂酰丝氨酸外露早于DNA断裂发生，因此AnnexinV联合PI染色法可以很好检测早期细胞凋亡和晚期凋亡、死亡的细胞。

需检测细胞，经过0.25％胰蛋白酶酶消化、2次磷酸盐缓冲液清洗、离心后，得到细胞沉淀。加入300μL结合缓冲液重悬细胞，依次加入FITC标记的AnnexinV 3μL和PI 3μL，室温避光10分钟，在流式细胞仪(购自BD公司)上进行定量检测，以不加AnnexinV-FITC及PI的1管细胞作为空白对照。按照AnnexinV和PI的阳性与否，细胞计数结果分布在四个象限：Ⅰ象限为AnnexinV染色阴性，PI染色阳性；Ⅱ象限为AnnexinV、PI染色双阳性；Ⅲ象限为AnnexinV、PI染色双阴性；Ⅳ象限为AnnexinV染色阳性，PI染色阴性。统计ⅠⅡⅣ象限的凋亡细胞数目占细胞总数的百分比。

10、体视学定量分析小胶质细胞和神经元数量

本实验采用连接于Olympus BX61显微镜上的StereoInvestigator软件(version 8，MicroBrightField，San Diego，CA，USA)控制x-y-z轴，按软件手册操作。丘脑腹内侧核团界定标准依据维生素B1缺乏研究的标准(Zhang Q，Yang G，Li W，et al.Thiamine deficiency increases beta-secretase activity and accumulation of beta-amyloidpeptides.Neurobiol Aging.2009)。前文所述的一套脑片中的5张跨丘脑腹内侧核团用于计数。在四倍物镜下选择画定丘脑腹内侧核团区域，在四十倍物镜下，计数框内计数IBA1阳性的小胶质细胞和NeuN阳性的神经元。经过免疫组化染色过程和脱水过程后，切片厚度从40μm变成14.8μm。实际厚度由在计数前测量丘脑腹内侧核团区域不同位置得出。在上下两侧留足够安全区后，有10.8μm为计数区域。遵循立体计数法则计数每个计数区域内的IBA1阳性的小胶质细胞和NeuN阳性的神经元，它们的总数由下面公式计算得出：

$N=\mathrm{\Σ}{Q}^{-}\frac{t}{h}\frac{1}{\mathrm{asf}}\frac{1}{\mathrm{ssf}}$

其中，∑Q-是计数IBA1阳性的小胶质细胞和NeuN阳性的神经元的总数，t是平均切片厚度，h是计数位置高度，asf是计数取样面积分数，ssf是切片取样分数。每个切片计数区域的变异系数都小于0.1。

11、统计分析

本实验采用Graphpad Prism 4.0软件分析实验实验数据，除体视学细胞计数和动物组织MCP-1mRNA水平使用t test比较外，其他的关于蛋白质印迹定量，AV-PI检测定量，小胶质细胞形态定量，活性氧定量和实时定量PCR都是对三次独立实验的数据进行one-way ANOVA分析中的Newman-Keuls Multiple Comparison Test实现，P＜0.05时表明统计学上，有显著性差异。

II.实施例

实施例1、维生素B1缺乏导致趋化因子MCP-1/CCL2早期特异性上调

由于维生素B1缺乏会导致激活的小胶质细胞聚集在丘脑腹内侧核团区域，提示调节小胶质细胞激活迁移的趋化因子可能在维生素B1缺乏模型中被诱导表达。因此，本发明人检测了维生素B1缺乏后，小鼠丘脑和皮层内四种CC型趋化因子的表达水平，分别是单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1，也称为CCL2)，巨噬细胞炎症蛋白1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α，也称为CCL3)，巨噬细胞炎症蛋白1β(macrophage inflammatory protein-1β，MIP1-β，也称为CCL4)，和在激活或正常T细胞表达分泌上调节首字母缩写(an acronym for Regulatedon Activation，Normal T Expressed and Secreted，RANTES，也称为CCL5)。在中枢神经系统中，这四种CC型趋化因子关于其趋化小胶质细胞的研究较多。

本发明人发现，MCP-1mRNA水平在维生素B1缺乏8天的丘脑区上升，在维生素B1缺乏10天达到峰值(高达400倍)(图2A)。而在皮层区域则几乎没有变化。

免疫印迹实验表明，MCP-1蛋白质水平也在维生素B1缺乏8天的丘脑中开始增加，在维生素B1缺乏10天达到峰值(高达6倍)(图2B)。

同时，MIP-1α，MIP-1β和RANTES的mRNA水平在丘脑和皮层中都没有明显变化。本发明人还检测了其他一些在炎症过程中重要的细胞因子的mRNA表达水平，如肿瘤坏死因子α，白介素1β，这些细胞因子在维生素B1缺乏9天的丘脑中开始增加(图2C)。

实施例2、维生素B1缺乏特异致神经元MCP-1/CCL2上调

本发明人应用免疫组化的方法检测发现，在丘脑腹内侧核团区域，组成性表达的MCP-1很少，信号很微弱，这与之前的报道是一致的。丘脑腹内侧核团的MCP-1表达水平从维生素B1缺乏8天开始显著上调，这比小胶质细胞的激活和聚集早一天(如图3)。免疫荧光共标记实验显示，MCP-1主要表达在神经元里(NeuN阳性细胞)，而不是在星形胶质细胞(GFAP阳性细胞)、小胶质细胞(CD68阳性细胞)、或内皮细胞内(PECAM1阳性细胞)(图3)。

为了进一步验证，本发明人用原代培养的皮层神经元、神经母细胞瘤SHSY5Y细胞系、小胶质细胞、星形胶质细胞、和脑内皮细胞系，在体外检测了维生素B1缺乏条件下，这些细胞类型中MCP-1的表达水平。在原代培养的皮层神经元中，无论是mRNA还是蛋白水平，维生素B1缺乏都能引起MCP-1的表达上升(如图4A，B，C)。并且在原代培养的皮层神经元中，维生素B1缺乏诱导的MCP-1主要分布在细胞质内(如图4D)。另外，在SHSY5Y神经母细胞瘤细胞系中，维生素B1缺乏也能引起MCP-1的mRNA水平的上升。但是，维生素B1缺乏不能在小胶质细胞、星形胶质细胞和脑内皮细胞(b.End3)中引起MCP-1的表达上升(如图4E)。

实施例3、小胶质细胞促进维生素B1缺乏导致的神经元死亡

维生素B1缺乏诱导的脑损伤中，激活的小胶质细胞和神经退行同时存在(如图5)。然而，它们之间的关系仍不十分清楚。本发明人设想激活的小胶质细胞可能导致了神经退行。为了验证这个假设，本发明人建立了一个神经元/小胶质细胞共培养系统，来研究它们之间的相互联系。在这个系统里，神经元和小胶质细胞进行相互联系但不能直接接触。在图6A中，实验结果显示，共培养体系中的神经元比单独培养的神经元对维生素B1缺乏更敏感，且细胞状态明显变差很多。维生素B1缺乏后，相较于单独培养的神经元，共培养的神经元中能引起更多的细胞凋亡(如图6B、C)。因此，小胶质细胞加速了维生素B1缺乏引起的神经元凋亡。

实施例4、MCP-1/CCL2促进小胶质细胞杀伤神经元

维生素B1缺乏在神经元中引起MCP-1表达上升。本发明人推测MCP-1的积累可能是导致神经元死亡的重要原因之一。因此，本发明人进行了MCP-1对于原代培养神经元影响的探索。以细菌内毒素，脂多糖(LPS)作阳性对照。令人吃惊的是，在体外实验中，无论是MCP-1，还是LPS，都不能导致单独培养的原代神经元死亡(如图7A，B)。由于在维生素B1缺乏条件下，激活的小胶质细胞能促进神经元死亡，且有报道称MCP-1受体在小胶质细胞中表达(Viola A，Luster AD.Chemokines and theirreceptors：drug targets in immunity and inflammation.Annu Rev Pharmacol Toxicol.2008；48：171-197)。因此，本发明人推测MCP-1对神经元的细胞毒作用需要小胶质细胞的存在。图7A，B结果显示，在有小胶质细胞存在的情况下，MCP-1有更显著的细胞毒作用，能引起更显著的神经元死亡。在用10ng/mLMCP-1的处理组中，非共培养体系的神经元，凋亡细胞占近30％，而共培养体系的神经元，凋亡细胞占59％。激活的小胶质细胞会产生分泌TNF-α和IL-1β，这对神经元有毒性作用。本发明人进一步检测小胶质细胞内TNF-α和IL-1β的水平，观察MCP-1是否调节共培养体系中小胶质细胞内TNF-α和IL-1β的表达。如图7C结果显示，MCP-1增加了小胶质细胞内TNF-α和IL-1β的mRNA的表达水平。

接着，本发明人应用了一种MCP-1中和抗体来研究MCP-1的作用，以便进一步阐明MCP-1在维生素B1缺乏引起神经元死亡中的作用。如图8A，C结果显示，添加该抗体能显著减少维生素B1缺乏引起的共培养体系中神经元的死亡。同时能减少共培养体系中小胶质细胞内TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平。另外，该抗体也能部分拮抗由MCP-1诱导的共培养体系中神经元的死亡，保护原代培养的神经元。抑制MCP-1引起的TNF-α和IL-1βmRNA水平在小胶质细胞中的上调(如图8B，D)。总之，上述结果显示，MCP-1促进小胶质细胞杀伤神经元，阻断MCP-1的效应在维生素B1缺乏中能保护神经元，减少神经元死亡。

实施例5、MCP-1/CCL2介导小胶质细胞激活

进一步，本发明人想确定MCP-1能否激活小胶质细胞。当小胶质细胞培养于无血清培养基中后，大多数小胶质细胞表现出更多的枝蔓型突起，伸长的胞体等静息状态小胶质细胞的特性。MCP-1处理能引起小胶质细胞突起回缩，更圆的细胞胞体等激活小胶质细胞的形态。LPS也可以产生相似的形态学改变(如图9A，B)。同时，MCP-1会引起小胶质细胞内一定程度TNF-αmRNA的表达上升(如图9C)。特别是，维生素B1缺乏神经元的条件培养液也能让小胶质细胞产生激活的细胞形态，而这种激活能被MCP-1的中和抗体部分的挽回(如图9D，E)。另外，这个抗体也能明显的抑制维生素B1缺乏神经元的条件培养液引起的小胶质细胞内TNF-α和IL-1βmRNA水平的上升(如图9F)。上述结果显示，MCP-1能激活小胶质细胞，神经元分泌的MCP-1能导致小胶质细胞的激活，进而对神经元产生细胞毒作用。

实施例6、氧化应激是维生素B1缺乏特异致神经元MCP-1/CCL2上调的可能机制

活性氧在维生素B1缺乏引起的神经退行性疾病中有广泛的研究。本发明人设想活性氧可能在维生素B1缺乏引起的MCP-1上调。如图10A-C显示，维生素B1缺乏在原代培养的神经元中和SHSY5Y神经母细胞瘤细胞系中都能显著的增加其细胞内活性氧水平，而在小胶质细胞、星形胶质细胞、脑内皮细胞b.End3细胞系中则没有变化。一种抗氧化剂，Trolox能显著的减少维生素B1缺乏引起的细胞内活性氧和MCP-1表达的增加，无论是原代培养的神经元(如图10D，E)还是SHSY5Y神经母细胞瘤(如图10F，G)。

Trolox也能减弱维生素B1缺乏引起的神经元死亡(如图11A，B)以及在小胶质细胞内TNF-α和IL-1β的mRNA水平的上升(如图11C)。

本发明人体内实验结果也证实，Trolox能在丘脑内保护维生素B1缺乏引起的神经元死亡(如图12)。

上述结果显示，活性氧在维生素B1缺乏引起的MCP-1表达和后续的神经元死亡过程中扮演重要角色。

实施例7、MCP-1/CCL2介导小胶质细胞促进维生素B1缺乏导致的神经元死亡

本发明人通过向维生素B1缺乏7天的小鼠丘脑腹内侧核团立体定位注射抗MCP-1的抗体，来确定MCP-1在维生素B1缺乏引起小胶质细胞激活和神经元退行中的作用。本发明人利用立体计数的方法统计维生素B1缺乏9天后，丘脑腹内侧核团NeuN阳性神经元和IBA1阳性小胶质细胞的数目。如图13显示，丘脑腹内侧核团IBA1阳性小胶质细胞的数目右侧和左侧的比值，注射抗体组比注射生理盐水组少25％。相反的，丘脑腹内侧核团NeuN阳性神经元的数目右侧和左侧的比值，注射抗体组比注射PBS组多32％。

上述结果显示，MCP-1在维生素B1缺乏引起的小胶质细胞的激活和神经元退行中有重要作用。

实施例8、防治神经退行性疾病的潜在药物的筛选

取原代小鼠大脑皮层神经元，其可内源性表达MCP-1蛋白。所述神经元的培养方法同上。将该神经元作为用于筛选防治哺乳动物神经退行性疾病的药物的细胞模型。

测试组：用候选物质处理的上述神经元的培养物；

对照组：不用候选物质处理的上述神经元的培养物。

在处理后适当时间，采用常规方法测定所述神经元的MCP-1蛋白的表达、活性、存在量或分泌情况。如果与对照组相比，测试组中的MCP-1蛋白的表达、活性、存在量或分泌显著下降30％以上，则说明该候选物质是潜在的防治哺乳动物神经退行性疾病的物质。

验证：采用特异性抗MCP-1蛋白的抗体(兔抗MCP-1)作为候选物质进行了测试，结果显示MCP-1蛋白的活性被抑制，从而该抗体是潜在的防治哺乳动物神经退行性疾病的物质。

实施例9、利用小胶质细胞的形态变化筛药

如前所述，MCP-1能激活小胶质细胞。基于该发现，本实施例利用小胶质细胞在静息和激活状态下的形态变化筛药。

将小胶质细胞培养于无血清培养基中，大多数小胶质细胞表现出更多的枝蔓型突起，伸长的胞体等静息状态小胶质细胞的特性。接着，用MCP-1(浓度5ng/mL)处理小胶质细胞，观察到MCP-1能引起小胶质细胞突起回缩，更圆的细胞胞体等激活小胶质细胞的形态。

之后，在培养基中加入候选物质，继续观察小胶质细胞(激活状态)的变化。若是小胶质细胞由较圆的胞体变为具有枝蔓型凸起、伸长的胞体，则说明小胶质细胞由激活状态回复为静息状态，也即所述侯选物质能够抑制小胶质细胞的激活，从而潜在的是防治哺乳动物神经退行性疾病的物质。

实施例10、利用小胶质细胞内TNF-αmRNA的表达程度来筛药

可通过检测小胶质细胞内TNF-α或IL-1βmRNA的表达程度来筛药。具体是：将小胶质细胞培养于无血清培养基中，用MCP-1(浓度5ng/mL)处理小胶质细胞，检测MCP-1处理后小胶质细胞中mRNA的表达水平。

之后，在培养基中加入候选物质，培养一段时间后，检测小胶质细胞中TNF-α或IL-1βmRNA的表达水平，若是表达水平比MCP-1处理后候选物质加入前的表达水平下降30％以上，则表明该候选物质能够抑制小胶质细胞的激活，从而潜在的是防治哺乳动物神经退行性疾病的物质。

实施例11、利用共培养体系筛药

基于实施例10的方法，进一步对候选药物进行筛选和鉴定。

根据前述方法建立小胶质细胞和神经元的共培养体系。经实施例10鉴定的潜在药物进行进一步鉴定。

在共培养体系中加入上述潜在药物，观察其通过抑制小胶质细胞激活后是否也能减少神经元的死亡。若是可以减少神经元的死亡(减少30％以上)，则该物质是防治哺乳动物神经退行性疾病有用的物质。

讨论

慢性温和的氧化代谢受损的动物模型(维生素B1缺乏)因其有序的发生氧化应激、小胶质细胞聚集和神经退行性病变，而被用于神经退行性疾病的机理研究中。在这个模型系统中，本发明人发现神经元分泌的MCP-1是一个在调节神经元/小胶质细胞相互作用中起着至关重要作用的媒介，在神经退行性病变中发挥重要作用。

(a)MCP-1的诱导

MCP-1是一种在脑内以相对低水平组成性的表达于小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元内的趋化因子。研究显示，损伤神经元响应刺激能分泌趋化因子，如干扰素诱导蛋白(interferon-inducible protein，IP-10)、Fractlkine和MIP-1α；这些趋化因子可能是小胶质细胞聚集的原因。本发明人的研究发现，TD能诱导表达趋化因子，并有一点的特异性。在本发明人检测的趋化因子中，MCP-1是仅有的被TD诱导上调的。TD引起的MCP-1的上调发生在维生素B1缺乏敏感脑区丘脑区，而在皮层区域没有。丘脑区比皮层区域更对TD引起的损伤敏感。然而，目前还不清楚，丘脑和皮层对TD的不同敏感性是否和MCP-1在这两个脑区不同的诱导有关联。不过，TD在培养的皮质神经元中能诱导MCP-1的表达上调。这可能是由于微环境的不同造成的，如抗氧化剂系统和氧化还原状态等，这些在体外和体内是完全不同的。MCP-1在动物模型中在TD8天后开始，而小胶质细胞的大量聚集和神经元退行性病变的发生在TD9天后，这相差一天。重要的是，MCP-1无论在体内还是体外TD引起的上调，都发生在神经元上。这种神经元特异的诱导可能是因为TD引起的活性氧的积累只发生在神经元内，而非小胶质细胞和星形胶质细胞。维生素B1缺乏会引起的神经元特异的MCP-1表达上调，这为研究神经元中MCP-1的作用提供了一个很好的模型系统。

(b)神经元中MCP-1的作用和功能

聚集的小胶质细胞是维生素B1缺乏模型中脑内病理变化的一个重要特征。维生素B1缺乏在培养的神经元中引起神经退行；而氧化应激和内质网应激都是可能的机制。不过，在体外共培养体系中，小胶质细胞的存在能显著的加重维生素B1缺乏引起的神经元死亡。这验证了小胶质细胞参与维生素B1缺乏引起的神经退行性病变。然而，小胶质细胞被招募到维生素B1缺乏敏感部位的具体机制目前尚不清楚。以前的报道显示，MCP-1是一个能作用于小胶质细胞的趋化因子，也能调节巨噬细胞/小胶质细胞的激活。本发明人的结果显示，神经元分泌的MCP-1调节小胶质细胞的聚集和激活。注射一种MCP-1的中和抗体于维生素B1缺乏动物，能有效减少丘脑腹内侧核团区域小胶质细胞的聚集。另外，MCP-1处理的小胶质细胞呈现一种激活细胞形态，并能分泌白介素IL-1β和肿瘤坏死因子TNF-α。这些细胞因子在维生素B1缺乏引起的小胶质细胞介导的炎症反应中发挥重要作用。而且应用MCP-1抗体，能抑制MCP-1引起的小胶质细胞的这些改变。总之，以上实验结果说明，在维生素B1缺乏引起的小胶质细胞的聚集和激活，MCP-1在其中发挥重要作用。

尽管，MCP-1在维生素B1缺乏的神经元中产生，但MCP-1似乎不会直接损伤神经元，因为单独的MCP-1不影响神经元的存活。然而，MCP-1在神经元/小胶质细胞的共培养体系中表现出神经细胞毒性作用，这显示MCP-1的毒性效应是通过小胶质细胞来介导的。MCP-1刺激小胶质细胞分泌白介素IL-1β和肿瘤坏死因子TNF-α。而小胶质细胞分泌白介素IL-1β和肿瘤坏死因子TNF-α在多种神经退行性疾病中有发现，并且认为是维生素B1缺乏引起的小鼠丘脑腹内侧核团神经元死亡的原因之一。神经元分泌的MCP-1也能激活小胶质细胞，因为从维生素B1缺乏的神经元获得条件培养液能激活小胶质细胞，并诱导小胶质细胞表达白介素IL-1β和肿瘤坏死因子TNF-α；而添加MCP-1的抗体，能抑制神经元条件培养液的这种效应。

(c)氧化应激和MCP-1

有研究证实，活性氧ROS与神经元损伤时的趋化因子产生密切相关^14，45，82。维生素B1缺乏能诱导神经元能活性氧ROS的积累和神经元死亡，而在其他神经细胞中不会，如小胶质细胞、星形胶质细胞和脑血管内皮细胞。同时，TD引起的MCP-1上升也只发生在神经元中，而在小胶质细胞、星形胶质细胞和脑内皮细胞中不发生。抗氧化剂能有效抑制维生素B1缺乏引起的神经元内MCP-1的表达上调。也能在神经元/小胶质细胞共培养体系中，抑制维生素B1缺乏引起的神经元死亡。在神经元/小胶质细胞共培养体系中，抗氧化剂也能有效的减少维生素B1缺乏诱导的小胶质细胞内，白介素IL-1β和肿瘤坏死因子TNF-α的表达上调。另外，维生素B1缺乏的动物注射抗氧化剂能减少小胶质细胞的聚集和减弱神经退行性病变。

总结

本发明人在体外培养细胞和活体动物两个水平检测了维生素B1缺乏趋化因子的变化，本发明人发现维生素B1缺乏促进丘脑腹内侧核团神经元产生分泌趋化因子大量MCP-1，而MCP-1能招募和激活小胶质细胞，从而导致MCP-1上调区域的神经元的大量死亡。进一步，应用MCP-1的抗体中和MCP-1的作用，能明显的减弱小胶质细胞的激活和神经元的死亡。本发明人还发现，维生素B1导致的氧化应激可能会促使神经元产生大量MCP-1。因此，本发明人的结果提示氧化应激和MCP-1的上调之间存在着潜在联系。即氧化应激促进了MCP-1的上调；MCP-1的上调又作用于小胶质细胞，促使其激活并杀伤神经元。这种效应很可能参与了维生素B1病理的发生和发展。

本发明人的结果表明：

1、维生素B1缺乏导致趋化因子MCP-1/CCL2早期特异性上调；

2、维生素B1缺乏导致神经元MCP-1/CCL2上调；

3、小胶质细胞促进维生素B1缺乏导致的神经元死亡；

4、MCP-1/CCL2促进小胶质细胞杀伤神经元；

5、MCP-1/CCL2介导小胶质细胞激活；

6、氧化应激是维生素B1缺乏导致神经元MCP-1/CCL2上调的可能机制；

7、MCP-1/CCL2介导小胶质细胞促进维生素B1缺乏导致的神经元死亡。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (5)

1.一种趋化因子MCP-1的抑制剂在制备预防或治疗神经退行性疾病的药物中的用途，所述的趋化因子MCP-1的抑制剂是特异性与趋化因子MCP-1结合的抗体；所述的神经退行性疾病是维生素B1缺乏引起的神经元损伤或死亡相关的神经退行性疾病。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物还用于：

下调小胶质细胞中TNF-α和IL-1β的表达水平；或

抑制小胶质细胞的聚集和/或激活。

3.一种筛选预防或治疗神经退行性疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)用候选物质处理表达趋化因子MCP-1的细胞培养物体系；和

(2)检测所述细胞培养物体系中趋化因子MCP-1的表达或活性；

其中，若所述候选物质可降低趋化因子MCP-1的表达或活性，则表明该候选物质是预防或治疗神经退行性疾病的潜在物质；

所述的神经退行性疾病是维生素B1缺乏引起的神经元损伤或死亡相关的神经退行性疾病。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达趋化因子MCP-1的细胞培养物体系中；和/或

步骤(2)包括：检测测试组的细胞培养物体系中趋化因子MCP-1的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达趋化因子MCP-1的细胞培养物体系；

如果测试组中趋化因子MCP-1的表达或活性在统计学上低于对照组，就表明该候选物是预防或治疗神经退行性疾病的潜在物质。

5.一种筛选预防或治疗神经退行性疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：

(s1)用MCP-1激活小胶质细胞培养物，使得小胶质细胞的形态变为突起回缩、细胞胞体变圆；

(s2)用候选物质处理(s1)获得的小胶质细胞培养物；

(s3)检测候选物质对于小胶质细胞形态的影响，若所述候选物质使得小胶质细胞由突起回缩、细胞胞体变圆的形态转变为具有枝蔓型凸起、伸长的胞体，则表明该候选物质是预防或治疗神经退行性疾病的潜在物质；

所述的神经退行性疾病是维生素B1缺乏引起的神经元损伤或死亡相关的神经退行性疾病。