KR102308102B1 - Ccr2를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CCR2(C-C chemokine receptor type 2) 단백질 또는 CCR2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 골관절염과 같은 골질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

CCR2를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating bone diseases comprising CCR2}

본 발명은 CCR2를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

골관절염(Osteoarthritis, OA)은 연골에서 흔히 발생하는 퇴행성 관절질환이며, 인구 노령화 추세에 따라 임상에서 흔히 볼 수 있는 노인성 질환으로 관절연골의 퇴행성 변화를 기반으로 병변이 시작되어 운동 시 통증과 부종, 관절 강직감 및 점진적인 운동장애를 일으킨다.

골관절염의 치료에는 체중감량, 근육강화운동, 단순진통제, 비스테로이드 소염제, 관절내 스테로이드 주사 및 수술 등의 운동요법, 약물요법, 수술요법이 실시되고 있다. 하지만, 스테로이드 소염제는 위장관 장애 등의 합병증을 일으킬 수 있고, 그 외에 스테로이드제의 관절 내 주사요법은 전신부작용 및 스테로이드의 반복주사에 따른 연골의 파괴, 감염의 위험성이 따르게 되므로 적극적인 치료법이 될 수 없다. 또한, 본질적으로 퇴행성 질병의 진행을 억제시키거나 차단시켜 줄 수 있는 골관절염의 치료법이 미비한 실정이다.

한국등록특허 제10-1819827호

본 발명의 목적은 CCR2(C-C chemokine receptor type 2) 단백질 또는 CCR2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CCR2(C-C chemokine receptor type 2)가 포함된 재조합 벡터로 형질도입된 중간엽줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CCR2(C-C chemokine receptor type 2)의 E3 도메인과 Fc 절편(fragment)이 융합된 재조합 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CCR2(C-C chemokine receptor type 2) 단백질 또는 CCR2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 CCR2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 CCR2 단백질은 CCR2 단백질의 E3 도메인으로서 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 CCR2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 CCR2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 CCR2 단백질의 E3 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 발현 벡터 내에 포함된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 골질환은 골관절염(Osteoarthritis)인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 CCR2(C-C chemokine receptor type 2)가 포함된 재조합 벡터로 형질도입된 중간엽줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 CCR2는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 골관절염 환자의 말초혈액 또는 지방조직으로부터 분리된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 골질환은 골관절염(Osteoarthritis)인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 CCR2(C-C chemokine receptor type 2)의 E3 도메인과 Fc 절편(fragment)이 융합된 재조합 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 펩타이드는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질도입된 중간엽줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 CCR2(C-C chemokine receptor type 2) 단백질, CCR2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 CCR2가 형질도입된 중간엽줄기세포는 골관절염과 같은 골질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 건강한 사람(healthy) 또는 골관절염(Osteoarthritis, OA) 환자의 활막액에서의 human IL-1β, human IL-17, human VEGF, human MCP1 등을 포함하는 염증성 사이토카인의 분비량을 측정한 결과(왼쪽부터)를 나타낸 것이고, 그 중 MCP1에 대해서는 류마티스 관절염 환자 또는 골관절염 환자에서의 분비량을 비교한 결과(가장 오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 1b는 환자 유래의 연골세포에 MCP1를 처리한 후, 연골 세포의 분화와 관련되는 Collagen type 2a 및 SOX9의 mRNA 발현량, catalytic enzyme인 MMP1 및 MMP3의 발현량, 통증인자인 TRPV2의 발현량을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 골관절염 동물 모델의 연골 조직 내에서 MCP1의 발현 여부를 면역화학염색법을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 sCCR2 E3-Fc 과발현 재조합 벡터 지도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 sCCR2 과발현 재조합 벡터 지도를 나타낸 것이다.
도 5는 HEK293 세포에 sCCR2 재조합 벡터를 도입한 후 과발현되는지 여부를 확인한 결과이다.
도 6은 골관절염 동물 모델에서 sCCR2 재조합 벡터 주입 후, 발을 떼는데 걸리는 시간(Paw Withdrawal Latency, s, 초), 얼마만큼의 무게를 주었을 때 발을 떼는지(Paw Withdrawal Threshold, g) 및 우측 뒷다리 무게를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7는 골관절염 동물 모델의 관절 부위를 Safranin O 염색을 한 후 연골 손상 정도를 비교하였고, OARSI score 및 Mankin score 결과를 나타낸 것이다.
도 8는 골관절염 동물 모델에서 sCCR2 과발현시킨 후 micro CT 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 골관절염 동물 모델의 연골 조직 내에서 IL-1β, IL-6 및 MMP13의 발현여부를 면역화학염색법을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 sCCR2가 발현하는 중간엽줄기세포의 특성을 분석한 결과로서, 도 10a는 positive marker를 분석한 결과이고, 도 10b는 negative marker를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 골관절염 동물 모델에 sCCR2가 발현하는 중간엽줄기세포를 주입한 후, 발을 떼는데 걸리는 시간(Paw Withdrawal Latency, s, 초), 얼마만큼의 무게를 주었을 때 발을 떼는지(Paw Withdrawal Threshold, g) 및 우측 뒷다리 무게를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 pSecTag2-rat CCR2의 아미노산 서열(서열번호 7)을 나타낸 것이다.
도 13은 pSecTag2-rat CCR2E3-FC의 아미노산 서열(서열번호 8)을 나타낸 것이다.
도 14는 pSecTag2-rat CCR2의 염기 서열(서열번호 9)을 나타낸 것이다.
도 15는 pSecTag2-rat CCR2E3-FC의 염기 서열(서열번호 10)을 나타낸 것이다.

본 발명의 용어, "CCR2(C-C chemokine receptor type 2)"는 chemokine receptor로서, CCR2 유전자에 의해 인코딩되는 단백질로서, 단핵구를 유인하는 MCP1(monocyte chemoattractant protein-1 or CCL2)의 receptor이다.

본 발명은 CCR2 단백질 또는 CCR2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

바람직하게, 상기 CCR2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것이거나, CCR2 단백질의 E3 도메인으로서 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 CCR2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것이거나, CCR2 단백질의 E3 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 CCR2 단백질은 바람직하게 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드에 대해 기능적 동등물일 수 있다. 상기 "기능적 동등물"이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서, 본 발명의 CCR2와 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 말한다. 상기 "실질적으로 동질의 활성"이란 상기 CCR2의 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 본 발명에 따른 CCR2의 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함될 수 있다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환일 수 있으며, 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 CCR2의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치할 수 있다. 또한, 상기 기능적 동등물의 범위에는 CCR2의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩타이드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩타이드 유도체도 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 다른 단백질과 융합으로 만들어진 융합 단백질 등이 이에 포함될 수 있다.

또한, 상기 CCR2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터 내로 공지의 방법에 의해 도입시킨 후 상기 발현 벡터를 당업계에 공지된 다양한 방법으로 형질도입(transduction) 또는 형질주입(transfection)에 의해 발현형으로 표적 세포 내에 도입시킬 수 있다.

플라스미드 발현 벡터는 사람에게 사용할 수 있는 FDA의 승인된 유전자 전달방법으로 사람 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로서(Nabel, E G et al, Science, 249:1285-1288, 1990), 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 pSecTag2A 벡터를 사용하여 CCR2 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터인 pSecTag2A-CCR2, pSecTag2A-CCR2E3 벡터를 제조하였다.

본 발명에 따른 핵산을 포함하는 플라스미드 발현 벡터(plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 일시적 형질주입(transient transfection), 미세주사(microinjection), 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질주입(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질주입(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질주입(polybrene-mediated trans fection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 건(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 목적세포 내로 도입할 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니다(Wu et al, J Bio Chem, 267:963-967, 1992; Wu et al, Bio Chem, 263:14621-14624, 1988).

또한, 상기 CCR2를 발현시킬 수 있는 벡터는 공지의 방법에 의해 세포, 조직 또는 체내로 투여될 수 있는데, 예를 들면, 국소적으로, 비경구, 경구, 비강, 정맥, 근육 내, 피하 내 또는 다른 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 특히, 상기 벡터는 표적 조직 또는 표적 세포를 치료하기 위한 유효량으로 직접 주사할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 골질환, 바람직하게는 골관절염을 예방 및 치료할 수 있는 약학적 조성물로 사용될 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는, 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있고, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 "유효량" 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 0.1 ~ 1000 ㎎/체중kg/day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 골질환을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수도 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 골관절염 환자에서 MCP1의 발현 증가 및 병인 반응 상관성 규명

본 발명자들은 골관절염의 병인성을 규명하기 위하여, 건강한 사람(healthy) 또는 골관절염(Osteoarthritis, OA) 환자의 활막액에서 여러 종류의 염증성 사이토카인의 분비량을 비교하는 실험을 수행하였다. 상기 분비량의 측정은 공지된 방법인 ELIZA를 통해 진행하였다.

그 결과, human IL-1β, human IL-17, human VEGF(vascular endothelial growth factor), human MCP1(monocyte chemoattractant protein 1) 등은 건강한 사람에 비하여 골관절염 환자의 활막액에서 분비량이 현저히 증가됨을 확인하였다(도 1a). 특히, 본 발명자들은 류마티스 관절염 환자와 골관절염 환자에서의 MCP1 분비량을 확인하였고, 그 결과, 류마티스 관절염 환자에 비해 골관절염 환자의 활막액에서는 MCP1 분비량이 현저히 증가되어 있음을 확인하였다(도 1a 오른쪽 그래프).

이후, 본 발명자들은 환자 유래의 연골세포에 MCP1을 처리한 후 유전자의 발현량에 변화가 있는지 확인하는 실험을 수행하였다. 상기 실험을 공지된 방법의 RT-PCR로 수행되었고, 이에 대한 프라이머 서열은 하기와 같다.

유전자	방향	서열
collagen 2a	forward	5'-TCT ACC CCA ATC CAG CAA AC-3'
	reverse	5'-GTT GGG AGC CAG ATT GTC AT-3'
SOX9	forward	5'-ACT TGC ACA ACG CCG AG-3'
	reverse	5'-CTG GTA CTT GTA ATC CGG GTG-3'
MMP1	forward	5'-AGT CCA AGA GAA TGG CCG AG-3'
	reverse	5'-GCA GCG TCA AGT TTA ACT GGA A-3'
MMP3	forward	5'-CTC ACA GAC CTG ACT CGG TT-3'
	reverse	5'-CAC GCC TGA AGG AAG AGA TG-3'
TRPV2	forward	5'-AGT CAA CCT CAA CTA CCG AAA GG-3'
	reverse	5'-CCG CAT TGA AGA GCC GAT CT-3'

그 결과, 연골세포의 분화와 관련되는 Collagen type 2a 와 SOX9 유전자의 mRNA 발현량이 감소되었고, collagenase로 알려진 MMP1(matrix metalloproteinase 1) 및 MMP3(matrix metalloproteinase 3)의 mRNA 유전자의 발현량이 현저하게 증가됨을 확인하였다(도 1b). 또한, 통증활성인자로 알려진 TRPV2(transient receptor potential cation channel subfamily V member 2)의 mRNA 발현량 역시 증가되었음을 확인하였다(도 1b).

또한, 본 발명자들은 골관절염 동물 모델의 연골 조직을 분리한 후 MCP1이 발현되는지 여부를 확인하는 실험을 수행하였다. 상기 실험은 공지된 면역화학염색법을 통해 수행되었다. 그 결과, 정상 대조군에 비하여 골관절염 동물 모델에서는 MCP1의 발현이 현저하게 증가되었음을 확인하였다(도 2).

따라서, 본 발명자들은 MCP1의 발현량 또는 분비량이 증가되는 경우 골관절염을 야기시킬 수 있는 주요한 인자임을 확인하였다.

실시예 2. Rat sCCR2(soluble C-C chemokine receptor type 2) 과발현의 재조합 벡터 제작 및 sCCR2 과발현 확인

본 발명자들은 MCP1에 대한 receptor로 알려진 CCR2(C-C chemokine receptor type 2) 또는 CCR2의 서열 중 MCP1의 결합부위(binding site)로 알려진 E3 도메인(domain)과 Fc 절편(fragment)를 연결시킨 complex 서열을 PCR을 이용하여 합성하였다. 이후, 제한효소(restriction enzyme)를 이용하여 pSecTag2A 벡터에 상기 CCR2 또는 E3-Fc를 삽입하여 재조합 벡터를 제작하였다. CCR2 또는 E3-Fc 를 발현할 수 있는 재조합 벡터는 도 3 또는 도 4의 개열 지도를 갖고 있다. CCR2가 삽입된 재조합 벡터의 구체적인 서열 정보는 도 12 및 도 14에 나타내었고, E3-Fc가 삽입된 재조합 벡터의 구체적인 서열 정보는 도 13 및 도 15에 나타내었다.

이후, 본 발명자들은 제작된 재조합 벡터를 HEK293 세포에 도입하여 sCCR2 단백질이 발현되는지 여부를 확인하는 실험을 수행하였다. 상기 실험은 공지된 웨스턴 블럿팅을 통해 수행되었다. 그 결과, R-E3#1(pSecTag2A-rat CCR2E3 #1 construct) 에서 sCCR2의 발현이 확인되었다(도 5).

실시예 3. sCCR2 과발현에 의한 골관절염의 치료 효과

3.1. 골관절염 동물 모델

본 발명자들은 sCCR2를 과발현시킨 경우 골관절염의 치료에 효과가 있는지 확인하기 위하여 골관절염 동물 모델을 대상으로 골관절염 통증완화 효과를 실험하였다.

구체적으로, 골관절염 동물모델을 제작하기 위해 200~250g인 5주령 수컷 Wistar 랫(rat)를 21~22℃의 온도에서 명암주기(light-dark cycle)를 12시간 간격으로 사육하였고, 살균한 물과 사료를 공급하여 키웠다. 이후, 골관절염 유도를 위해 랫(rat)의 오른쪽 무릎에 3mg/50μl의 용량으로 생리식염수에 용해시킨 MIA(Monosodium iodoacetate, Sigma, ST. Louis, MO)를 투여하여 골관절염을 유도하였다.

3.2. 통증 분석

MIA 투여 후, 상기 실시예 2에서 제작된 재조합 벡터를 골관절염 동물 모델의 관절강내 주사를 통해 주입 후 세포막 투과성을 증가시켜 주기위해 electropotator를 사용하여 80mV로 관절강을 5회 자극하였다. MIA 투여 후 4일, 7일, 11일 및 13일이 경과한 후, 각각 골관절염 유발 동물의 행동력에 미치는 영향을 평가하는 지표인 통증정도를 측정하였다.

구체적으로, 통증은 Dynamic Plantat Aesthsiometer(Ugo Basile, Comerio, Italy)를 이용하여 측정하였고, 기계의 통증 측정 방법은 측정 기계 위에 그물로 된 판을 얹고 그 위에 아크릴로 된 동물고정틀 안에 랫(rat)을 넣은 후, 측정기계로 약물이 주입된 오른발을 찔러 주었다. 찌른 후에 발을 떼는데 걸리는 시간(Paw Withdrawal Latency, s, 초)과 얼마만큼의 무게를 주었을 때 발을 떼는지(Paw Withdrawal Threshold, g)를 측정하여 그때 나오는 시간과 무게를 기재하여 통증 측정 그래프를 그렸고, 우측 뒷다리 무게도 측정하였다.

그 결과, 골관절염 랫(rat)에 sCCR2 또는 E3-Fc 재조합 벡터를 주입한 경우 대조군(Mock)에 비해 통증반응정도가 정상 랫(rat)에 거의 근접한 것으로 확인되었다(도 6). 또한, 우측 뒷다리의 무게에서도 대조군(Mock)에서는 뒷다리의 무제가 현저히 감소되었으나, sCCR2 또는 E3-Fc 재조합 벡터를 처리한 군에서는 정상과 유사한 무게를 유지하고 있음을 확인하였다(도 6).

3.3. 연골 손상 정도 분석

본 발명자들은 랫(rat)의 대퇴골(Femur) 및 경골(Tibia)을 채취하여 Safronin O 염색법으로 연골의 손상 정도를 분석하였다. 또한, Safronin O 염색을 통한 연골의 손상 정도를 OARSI score 및 Mankin score로 비교하였다.

그 결과, sCCR2 또는 E3-Fc 재조합 벡터를 처리한 군에서는 대조군(Mock)에 비해 연골이 손상되지 않았고, OARSI score(연골 특화 분석) 및 Mankin score(연골 및 염증 침윤정도 종합 분석) 에서 낮은 점수로 확인되었다(도 7).

3.4. micro CT 분석

본 발명자들은 랫(rat)의 대퇴골(Femur)을 채취하여 micro CT를 통해 연골의 손상 정도를 분석하였다. 그 결과, 연골 손상 정도에 있어서 sCCR2 또는 E3-Fc 재조합 벡터를 처리한 군에서는 대조군(Mock)에 비해 정상 랫(rat)과 유사한 수준임을 확인하였다(도 8).

따라서, 상기 결과로부터 sCCR2가 과발현되는 경우 골관절염의 치료 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 4. sCCR2 조절에 의한 연골 내 염증성 사이토카인 발현 억제 효과

본 발명자들은 sCCR2가 과발현되는 경우 염증성 사이토카인의 발현에 영향을 주는지 확인하기 위하여 골관절염 동물 모델의 연골 내에서 IL-1β, IL-6 및 MMP13의 발현여부를 면역화학염색법을 통해 확인하는 실험을 수행하였다.

그 결과, sCCR2 또는 E3-Fc 재조합 벡터를 처리한 군에서는 대조군(Mock)에 비해 IL-1β+ 세포, IL-6+ 세포 및 MMP13+ 세포가 현저히 감소되었음을 확인하였다(도 9).

따라서, sCCR2는 연골 내에서 염증성 사이토카인의 발현을 억제하여 골관절염을 치료할 수 있음을 확인하였다.

실시예 5. sCCR2 발현의 중간엽줄기세포

5.1. 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)의 획득 및 배양

본 발명자들은 하기의 과정을 통하여 중간엽줄기세포를 획득하였다. 우선, 골관절염 환자에서 외과적 수술 후에 얻어진 지방 조직을 10％ 페니실린-스트렙토마이신을 포함한 PBS로 10회 이상 세척하여 혈액과 이물질을 제거한 후, 조직을 0.2~0.3g이 되도록 잘게 절단하였다. 0.1％ 콜라게나아제(Roche, Sandhofer Strasse, Mannheim, Germany) 용액에 넣어서 37℃, 100rpm에서 1시간 동안 반응시켰다. 100㎛ 메쉬를 이용하여 콜라게나아제에 의해서 분해된 용액층과 분해되지 않은 조각을 분리한 후, 분리된 콜라게나아제 용액에 동량의 PBS를 첨가하였다. 이어, 4℃, 1200rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액인 지질과 지방층을 제거하고, 콜라게나아제 상층액을 제거하였다. 얻어진 중간엽줄기세포는 배양접시에 접종하여 중간우태아혈청을 포함하는 MEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)으로 37℃, 5％ CO₂ 인큐베이터에서 3일에 한번 씩 배양액을 교체하면서 배양되었다.

5.2. sCCR2 발현의 중간엽줄기세포 제조 및 특성 분석

본 발명자들은 sCCR2가 발현되는 중간엽줄기세포를 제조하기 위하여 X-tremeGENE™ HP DNA Transfection Reagent(Roche)를 이용하였고, sCCR2 재조합 벡터를 리포좀으로 둘러 싼 후 생체막으로 들어가게 하는 원리로 중간엽줄기세포에 도입하였다.

sCCR2이 발현되는 중간엽줄기세포는 마커(CD29, CD44, CD105, CD31, CD34 및 HLA-DR(Human Leukocyte Antigen - antigen D Related))를 이용하여 세포의 특성을 분석하는 실험을 수행하였다.

그 결과, sCCR2이 발현되는 중간엽줄기세포의 경우 CD29, CD44 및 CD105는 양성이며, CD31, CD34 및 HLA-DR(Human Leukocyte Antigen - antigen D Related)은 음성의 면역학적 특징을 나타내었다.

실시예 6. sCCR 발현의 중간엽줄기세포에 의한 골관절염의 치료 효과

본 발명자들은 sCCR2가 발현되는 중간엽줄기세포가 골관절염의 치료에 효과가 있는지 확인하기 위하여 골관절염 동물 모델을 대상으로 골관절염 통증완화 효과를 실험하였다. 골관절염 동물 모델은 상기 실시예 3.1.과 같다.

sCCR2(E3)가 도입된 중간엽줄기세포(3x10⁵ cells)는 골관절염 동물 모델에 혈관내 주사(intravenous injection)로 주입되었고, 대조군으로서 sCCR2가 도입되지 않은 중간엽줄기세포가 주입된 군, Celecoxib(80 mg/kg)이 주입된 군 및 아무것도 주입되지 않은 군으로 나누어 상기 실시예 3.2. 에서와 같은 통증 분석을 수행하였다.

그 결과, sCCR2(E3)가 도입되어 발현되는 중간엽줄기세포를 주입한 군에서는 골관절염 유도 후 8일 이후부터 대조군에 비하여 통증반응정도가 골관절염을 유도하지 않은 상태와 거의 동일한 정도로 확인되었다(도 11). 즉, 골관절염 유도 후 8일 이후부터 정상과 거의 동일한 통증반응정도로 회복되었음을 확인하였다.

따라서, sCCR2가 발현되는 중간엽줄기세포를 주입할 경우 골관절염의 치료 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for preventing or treating bone diseases comprising CCR2 <130> PN1805-000 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 375 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rat CCR2 <400> 1 Met Glu Asp Ser Asn Met Leu Pro Gln Phe Ile His Gly Ile Leu Ser 1 5 10 15 Thr Ser His Ser Leu Phe Pro Arg Ser Ile Gln Glu Leu Asp Glu Gly 20 25 30 Ala Thr Thr Pro Tyr Asp Tyr Asp Asp Gly Glu Pro Cys His Lys Thr 35 40 45 Ser Val Lys Gln Ile Gly Ala Trp Ile Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu 50 55 60 Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn Met Leu Val Ile Ile Ile Leu 65 70 75 80 Ile Ser Cys Lys Lys Leu Lys Ser Met Thr Asp Ile Tyr Leu Phe Asn 85 90 95 Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Leu Leu Thr Leu Pro Phe Trp Ala 100 105 110 His Tyr Ala Ala Asn Glu Trp Val Phe Gly Asn Ile Met Cys Lys Leu 115 120 125 Phe Thr Gly Leu Tyr His Ile Gly Tyr Phe Gly Gly Ile Phe Phe Ile 130 135 140 Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile 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accctgtttc gctgtaggaa tgagaaaaag aggcataggg ctgtgaggct catctttgcc 780 atcatgattg tctactttct cttctggact ccatacaata ttgttctctt cctgaccacc 840 ttccaggaat tcttgggaat gagtaactgt gtggttgaca tgcacttaga ccaggccatg 900 caggtgacag agactcttgg aatgacacac tgctgcgtta atcctatcat ttatgccttt 960 gttggtgaga agttccgaag gtatctctcc atatttttca gaaagcacat tgccaaaaat 1020 ctctgcaaac aatgcccagt tttctatagg gagacagcag accgagtgag ctcaacattt 1080 accccttcta ctggggagca agaagtctca gttgggttgc tgcag 1125 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rat CCR2 E3 amino acid <400> 3 Thr Thr Phe Gln Glu Phe Leu Gly Met Ser Asn Cys Val Val Asp Met 1 5 10 15 His Leu Asp Gln Ala 20 <210> 4 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rat CCR2 E3 nucleic acid <400> 4 accaccttcc aggaattctt gggaatgagt aactgtgtgg ttgacatgca cttagaccag 60 gcc 63 <210> 5 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rat CCR2 E3-Fc amino acid <400> 5 Thr Thr Phe Gln Glu Phe Leu Gly Met Ser Asn Cys Val Val 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Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 225 230 235 240 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 245 250 255 <210> 6 <211> 765 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rat CCR2 E3-Fc nucleic acid <400> 6 accaccttcc aggaattctt gggaatgagt aactgtgtgg ttgacatgca cttagaccag 60 gccctgcagg aacccaagag ttgcgataaa acccatacat gccccccttg tcctgcccca 120 gaactcctgg ggggtccaag cgtgttcctc tttccaccca agcccaaaga cactctgatg 180 atctcacgga ctcccgaggt gacctgcgtg gtcgtggacg tgagccacga ggatcctgaa 240 gtgaagttca actggtacgt ggatggagtc gaggtgcata atgccaagac caaaccaaga 300 gaggaacagt acaacagtac ttatcgggtc gtgtcagtgc tcaccgtcct gcaccaggac 360 tggctgaacg gaaaggagta taagtgcaaa gtgtccaata aggcactgcc cgcccctatc 420 gagaaaacca tttctaaggc aaaagggcag cctagagaac cacaggtgta cacactccct 480 ccaagccggg acgagctgac caagaaccag gtgtccctca catgtctggt caaaggcttc 540 tatccttccg atatcgctgt ggagtgggaa tctaatggac agccagagaa caattacaag 600 actacccccc ctgtgctgga ctcagatggg agcttctttc tctattctaa gctgaccgtg 660 gacaaaagta gatggcagca gggtaacgtg ttcagctgct cagtcatgca tgaggccctg 720 cataatcact acacccagaa atcactgtca ctcagcccag gaaaa 765 <210> 7 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pSecTag2-rat CCR2 <400> 7 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Trp Val Pro Gly 1 5 10 15 Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr Lys 20 25 30 Leu Met Glu Asp Ser Asn Met Leu Pro Gln Phe Ile His Gly Ile Leu 35 40 45 Ser Thr Ser His Ser Leu Phe Pro Arg Ser Ile Gln Glu Leu Asp Glu 50 55 60 Gly Ala Thr Thr Pro Tyr Asp Tyr Asp Asp Gly Glu Pro Cys His Lys 65 70 75 80 Thr Ser Val Lys Gln Ile Gly Ala Trp Ile Leu Pro Pro Leu Tyr Ser 85 90 95 Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn Met Leu Val Ile Ile Ile 100 105 110 Leu Ile Ser Cys Lys Lys Leu Lys Ser Met Thr Asp Ile Tyr Leu Phe 115 120 125 Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Leu Leu Thr Leu Pro Phe Trp 130 135 140 Ala His Tyr Ala Ala Asn Glu Trp Val Phe Gly Asn Ile Met Cys Lys 145 150 155 160 Leu Phe Thr Gly Leu Tyr His Ile Gly Tyr Phe Gly Gly Ile Phe Phe 165 170 175 Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val 180 185 190 Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Ile Thr Ser Val 195 200 205 Val Thr Trp Val Val Ala Val Phe Ala Ser Leu Pro Gly Ile Ile Phe 210 215 220 Thr Lys Ser Glu Gln Glu Asp Asp Gln His Thr Cys Gly Pro Tyr Phe 225 230 235 240 Pro Thr Ile Trp Lys Asn Phe Gln Thr Ile Met Arg Asn Ile Leu Ser 245 250 255 Leu Ile Leu Pro Leu Leu Val Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Leu 260 265 270 His Thr Leu Phe Arg Cys Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala Val 275 280 285 Arg Leu Ile Phe Ala Ile Met Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp Thr Pro 290 295 300 Tyr Asn Ile Val Leu Phe Leu Thr Thr Phe Gln Glu Phe Leu Gly Met 305 310 315 320 Ser Asn Cys Val Val Asp Met His Leu Asp Gln Ala Met Gln Val Thr 325 330 335 Glu Thr Leu Gly Met Thr His Cys Cys Val Asn Pro Ile Ile Tyr Ala 340 345 350 Phe Val Gly Glu Lys Phe Arg Arg Tyr Leu Ser Ile Phe Phe Arg Lys 355 360 365 His Ile Ala Lys Asn Leu Cys Lys Gln Cys Pro Val Phe Tyr Arg Glu 370 375 380 Thr Ala Asp Arg Val Ser Ser Thr Phe Thr Pro Ser Thr Gly Glu Gln 385 390 395 400 Glu Val Ser Val Gly Leu Leu Gln Ile Ser Ser Thr Val Ala Ala Ala 405 410 415 Arg Gly Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser 420 425 430 Ala Val Asp His His His His His His 435 440 <210> 8 <211> 314 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pSecTag2-rat CCR2E3-FC <400> 8 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Val Arg Ser 20 25 30 Leu Thr Thr Phe Gln Glu Phe Leu Gly Met Ser Asn Cys Val Val Asp 35 40 45 Met His Leu Asp Gln Ala Leu Gln Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 50 55 60 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 65 70 75 80 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 85 90 95 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 100 105 110 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 115 120 125 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 130 135 140 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 145 150 155 160 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 165 170 175 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 180 185 190 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 195 200 205 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 210 215 220 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 225 230 235 240 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 245 250 255 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 260 265 270 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 275 280 285 Pro Arg Gly Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn 290 295 300 Ser Ala Val Asp His His His His His His 305 310 <210> 9 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSecTag2-rat CCR2 nucleic acid <400> 9 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctctggg ttccaggttc cactggtgac 60 gcggcccagc cggccaggcg cgcgcgccgt acgaagctta tggaagacag taatatgtta 120 cctcagttca tccatggcat actatcaaca tctcattctc tatttccaag aagtatccaa 180 gagcttgatg agggggccac cacaccgtat gactatgatg atggtgaacc ttgtcataaa 240 accagtgtga agcaaattgg agcttggatc ctgcccccac tctactccct ggtattcatc 300 tttggttttg tgggcaacat gttggtcatt ataattctga taagctgtaa aaagctgaag 360 agcatgactg atatctacct gttcaacctg gccatctctg acctgctctt cctgctcaca 420 ctcccattct gggctcacta tgctgcaaat gagtgggtct ttgggaatat aatgtgcaaa 480 ttattcacag ggctttatca cattgggtat tttggtggaa tcttcttcat tatcctcctg 540 acaattgata gatatttggc tattgtccat gctgtctttg ctttaaaagc caggacagtt 600 acctttgggg taataacaag tgtagtcact tgggtggtgg ctgtgtttgc ctctctacca 660 ggaatcatat ttactaaatc tgaacaagaa gatgatcagc atacttgtgg cccttatttt 720 ccaacaatct ggaagaattt ccaaacaata atgaggaata tcttgagttt gatcctgccc 780 ctacttgtca tggtcatctg ctactcagga atcctccaca ccctgtttcg ctgtaggaat 840 gagaaaaaga ggcatagggc tgtgaggctc atctttgcca tcatgattgt ctactttctc 900 ttctggactc catacaatat tgttctcttc ctgaccacct tccaggaatt cttgggaatg 960 agtaactgtg tggttgacat gcacttagac caggccatgc aggtgacaga gactcttgga 1020 atgacacact gctgcgttaa tcctatcatt tatgcctttg ttggtgagaa gttccgaagg 1080 tatctctcca tatttttcag aaagcacatt gccaaaaatc tctgcaaaca atgcccagtt 1140 ttctataggg agacagcaga ccgagtgagc tcaacattta ccccttctac tggggagcaa 1200 gaagtctcag ttgggttgct gcagatatcc agcacagtgg cggccgctcg aggagggccc 1260 gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg aatagcgccg tcgaccatca tcatcatcat 1320 cattga 1326 <210> 10 <211> 945 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSecTag2-rat CCR2E3-FC nucleic acid <400> 10 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacgcggccc agccggccag gcgcgccgta cgaagcttga ccaccttcca ggaattcttg 120 ggaatgagta actgtgtggt tgacatgcac ttagaccagg ccctgcagga acccaagagt 180 tgcgataaaa cccatacatg ccccccttgt cctgccccag aactcctggg gggtccaagc 240 gtgttcctct ttccacccaa gcccaaagac actctgatga tctcacggac tcccgaggtg 300 acctgcgtgg tcgtggacgt gagccacgag gatcctgaag tgaagttcaa ctggtacgtg 360 gatggagtcg aggtgcataa tgccaagacc aaaccaagag aggaacagta caacagtact 420 tatcgggtcg tgtcagtgct caccgtcctg caccaggact ggctgaacgg aaaggagtat 480 aagtgcaaag tgtccaataa ggcactgccc gcccctatcg agaaaaccat ttctaaggca 540 aaagggcagc ctagagaacc acaggtgtac acactccctc caagccggga cgagctgacc 600 aagaaccagg tgtccctcac atgtctggtc aaaggcttct atccttccga tatcgctgtg 660 gagtgggaat ctaatggaca gccagagaac aattacaaga ctaccccccc tgtgctggac 720 tcagatggga gcttctttct ctattctaag ctgaccgtgg acaaaagtag atggcagcag 780 ggtaacgtgt tcagctgctc agtcatgcat gaggccctgc ataatcacta cacccagaaa 840 tcactgtcac tcagcccagg aaaacctcga ggagggcccg aacaaaaact catctcagaa 900 gaggatctga atagcgccgt cgaccatcat catcatcatc attga 945

Claims (19)

1. CCR2(C-C chemokine receptor type 2)을 코딩하는 유전자가 포함된 재조합 벡터로 형질도입된 중간엽줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 골관절염(Osteoarthritis)의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물.
2. ◈청구항 2은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

   제 1 항에 있어서,
   상기 CCR2는 서열번호 1의 아미노산 또는 이를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 중간엽줄기세포는 골관절염 환자의 말초혈액 또는 지방조직으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 조성물.
4. CCR2의 E3 도메인 및 Fc 절편(fragment)을 코딩하는 유전자가 포함된 재조합 벡터로 형질도입된 중간엽줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 골관절염(Osteoarthritis)의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물.
5. ◈청구항 5은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

   제 4 항에 있어서,
   상기 CCR2의 E3 도메인은 서열번호 3의 아미노산 또는 이를 코딩하는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. ◈청구항 6은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

   제 4 항에 있어서,
   상기 CCR2의 E3 도메인 및 Fc 절편(fragment)은 서열번호 5의 아미노산 또는 이를 코딩하는 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제 4 항에 있어서,
   상기 중간엽줄기세포는 골관절염 환자의 말초혈액 또는 지방조직으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 조성물.
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