DE68923990T2 - Zellen mit ausgestattener Antikörperspezifität. - Google Patents

Zellen mit ausgestattener Antikörperspezifität.

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von Lymphocyten, die mit einem oder zwei Expressionsvektoren transfiziert sind, die ein chimäres T-Zell-Rezeptorgen (TcR- Gen) enthalten. Wie nachfolgend dargestellt wird, wurde ein Modellsystem konstruiert, das Expressionsvektoren umfaßt, mit denen T-Killerzellen transfiziert wurden, und die in T- Killerzellen funktionell exprimiert wurden.
  • Wegen der durch das gleichzeitige Erkennen des Eigen- MHC plus Antigen auferlegten Restriktionen ist der Erwerb einer neuen Spezifität durch Verpflanzen von TcR-Genen auf entweder in vitro-oder in vivo-Experimente in Inzuchtkombinationen (inbred combinations) begrenzt. Solche Manipulationen sind in einer Auskreuzungspopulation (outbred population) praktisch unmöglich.
  • Im Unterschied zu Antikörpern erkennen T-Zellen Antigene nur in Verbindung mit Produkten des Haupt-Histokompatibilitätskomplexes (MHC). Solch eine duale Erkennung wird durch Kombination der variablen Bereiche sowohl der α- als auch der β-Ketten vermittelt, die den TcR umfassen. Kürzlich wurde es mögliche, T-Zellen durch DNA-vermittelten Transfer clonierter, die α- und β-TcR-Ketten codierender Gene mit einer vorgegebenen Spezifität auszustatten (Dembic et al., Nature 320 (1986), 232-238). Im allgemeinen war zur Entfaltung einer definierten Spezifität die Expression sowohl der α- als auch der β-Ketten eines gegebenen TcRs als Dimer nötig, obwohl angenommen wird, daß das Vβ für die MHC-Spezifität verantwortlich ist (Saito et al., Nature 329 (1987), 256-259).
  • Zur Überwindung der vorstehend genannten Beschränkungen und um nach Belieben T-Zellen konstruieren zu können, die eine gewünschte vorbestimmte Spezifität aufweisen, wurden T-Zellen mit einer Antikörpertyp-Spezifität konstruiert. Wie hier dargestellt wird, läßt sich die Erfindung auf eine große Zahl von Zellen anwenden.
  • Aufgrund der starken Ähnlichkeit zwischen Antikörper- und TcR-Molekülen bezüglich ihrer Struktur und Organisation wurde angenommen, daß es möglich sein müßte, den V- Bereich des TcRs durch den eines Antikörpers in einer Weise zu ersetzen, die zu einem funktionsfähigen chimären TcR führt. Erfindungsgemäß ist es möglich, einen chimären TcR zu konstruieren und in funktionsfähiger Form zu exprimieren, der das Antigen in einer nicht MHC-beschränkten Weise erkennt, und der transmembrane Signale zur T-Zellaktivierung wirksam übermittelt. Erfindungsgemäß wurden chimäre T-Zell- Rezeptorgene durch Rekombination der VH- und VL-Genabschnitte eines anti-TNP-Antikörpers mit den Exons des konstanten Bereichs der α- und β-Kette des T-Zellrezeptors (TcR) konstruiert. Nach Tranfektion von cytotoxischen Hybridomen wurde die Expression eines neuen funktionsfähigen T- Zellrezeptors nachgewiesen. Der chimäre Rezeptor offenbarte den Idiotyp des Antikörpers und stattete die T-Zellen mit einer nicht MHC-beschränkten anti-TNP-Reaktivität aus. Dieses Modellsystem beweist, daß sich ein chimärer TcR mit einer antikörperartigen Bindungsstelle konstruieren und in einer Reihe von T-Zellen funktionell exprimieren läßt. Diese Manipulation eröffnet einen neuen Zugang zum beliebigen Engineering von T-Zellen jeder gewünschten Spezifität, mit der Maßgabe, daß sich solche Spezifität vorweg durch monoclonale Antikörper definieren läßt. Die verschiedenen Gesichtspunkte der Erfindung betreffen geeignete Paare von Genen zur Einführung und zur Expression in speziellen Vektoren, die Verwendung solcher Vektoren zur Transfektion von Zellen (T-Zellen und anderen, wie definiert), um sie mit einer vorbestimmten antigenen Spezifität auszustatten. Die Erfindung betrifft ferner Arzneimittel zur Vorbeugung und Heilung spezieller Krankheiten. Weitere Gesichtspunkte werden nachstehend deutlich.
  • Wie vorstehend festgestellt wurde, betrifft die Erfindung Lymphocyten, umfassend Populationen von T-Killerzellen, T-Helferzellen, T-Supressorzellen, lymphokinaktivierten Zellen, natürlichen Killerzellen u.ä. Wie vorstehend festgestellt wurde, verwendet die Erfindung ein rekombinantes Genpaar, das so adaptiert wurde, daß es mononucleäre Zellen mit einer Spezifität vom Antikörpertyp ausstattet, wobei es sich um die folgenden Gene handelt:
  • a. Exons enthaltende Genabschnitte, die den konstanten Bereich des T-Zellrezeptors (α-, β- γ-, δ-Ketten) codieren.
  • b. Genabschnitte, die die Leadersequenz und die rearrangierten variablen und verbindenden (joining) Exons enthalten, die spezifische schwere und leichte Antikörperketten codieren, wobei die mononucleären Zellen Lymphocyten sind, die Populationen von T-Killerzellen, T- Helferzellen, T-Suppressorzellen, lymphokinaktivierten Zellen, natürlichen Killerzellen u.ä. umfassen.
  • Die vorstehend genannten Genabschnitte können genomische oder cDNA-Abschnitte sein. Einem bevorzugten Aspekt gemäß verwendet die Erfindung ein Genpaar mit Abschnitten, die den konstanten Bereich von α- und β-Ketten codieren, wobei jeder Abschnitt entweder mit dem rearrangierten variablen Genabschnitt der schweren oder der leichten Antikörperkette ligiert ist, und umgekehrt, wobei der T-Zellrezeptor selbstverständlich entweder von der gleichen Spezies wie der Antikörper oder einer anderen Spezies stammen kann. Bevorzugt codieren die rearrangierten Genabschnitte eine Bindungsstelle eines Antikörpermoleküls, das entweder von dergleichen Spezies wie das T-Zellrezeptor-Gen oder von einer anderen Spezies stammt, wobei die rearrangierten Genabschnitte Antikörper codieren, die spezifisch gegen tumorspezifische Antigene, tumorassoziierte Antigene, virale Antigene, modifizierte Eigen-Antigene, Parasitenantigene, bakterielle Antigene, Pilzantigene, Antigene vom Autoimmuntyp oder andere fremde Antigene gerichtet sind. In einer anderen Ausführungsform codieren die rearrangierten Genabschnitte monoclonale Antikörper, die mit einem definierten Typ von Tumorzellen reagieren. Die Erfindung betrifft ferner zur wirksamen Transfektion geeignete Expressionsvektoren, die ein rekombinantes Genpaar (wie oben definiert) umfassen. Solch ein Vektor kann ein einen Promotor, eine Polyadenylierunsstelle und Wirkstoff-Selektionsmarker enthaltendes Plasmidgerüst sein. Erfindungsgemäß bevorzugte Vektoren sind die Plasmide pRSV2 und pRSV3. Bevorzugt verwendet man ein Paar von Expressionsvektoren, bei dem ein Vektor ein Plasmid mit einem Selektionsmarker (z.B. neo ) umfaßt, in das ein rearrangierter, den variablen Bereich der leichten Kette des Antikörpers codierender Genabschnitt zusammen mit dem Genabschnitt cloniert ist, der den konstanten Bereich der α- oder β-Kette des T-Zellrezeptors codiert, und bei dem in den zweiten einen anderen Selektionsmarker (z.B gpt) umfassenden Vektor ein rearrangierter den variablen Bereich der schweren Kette des Antikörpers codierender Genabschnitt zusammen mit dem Genabschnitt des konstanten Bereichs der komplementären, im ersten Vektor verwendeten (β- oder α-) Kette des T-Zellrezeptors cloniert ist.
  • Die Erfindung betrifft ferner mononucleäre Zellen, die ein wie oben definiertes Genpaar enthalten.
  • Ferner betrifft die Erfindung ein Arzneimittel zur Behandlung von Patienten, das als aktiven Bestandteil Lymphocyten enthält, die dem Patienten entnommen, in vitro vermehrt und mit einem wie vorstehend beschriebenen Genpaar oder einem wie vorstehend definierten Vector transfiziert worden sind.
  • Zur Herstellung der in der Erfindung verwendeten Expressionsvektoren und zur Konstruktion eines Genpaares wurde ein einen monoclonalen Antikörper gegen das gewünschte Antigen produzierendes Hybridom ausgewählt, eine Genombank aus den restringierten, die rearrangierten VL- und VH-Exons enthaltenden DNA-Fragmenten konstruiert, die Clone isoliert, die die rearrangierten VL- und VH-Exons in voller Länge enthielten, und aus ihnen die DNA-Abschnitte isoliert, die das Leaderexon und die rearrangierten VDJH- und VJL-Exons enthielten, und jeder der DNA-Abschnitte wurde in einen Expressionsvektor subcloniert, der entweder den neo - oder den gpt-Selektionsmarker enthielt, und anschließend wurde in jeden dieser Vektoren 3' zum VDJH oder VJL eines der genomischen, alle Exons des konstanten Bereichs enthaltenden Fragmente und 5' flankierende nicht-translatierte Bereiche der aus einer Embryo-DNA-Bank isolierten α- und β-Ketten des T- Zellrezeptors eingesetzt, wodurch sich ein Satz chimärer VHCα-, VLCβ-, VLCα- und VHCβ-Gene ergab, von denen jedes in einen der entweder neo oder gpt als Selektionsmarker enthaltenden Expressionsvektoren cloniert wurde. Ein Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren, in dem zur Transfektion der T-Zelle eine Kombination zweier Plasmide verwandt wird, von denen eines den variablen Bereich der leichten Kette und den konstanten Bereich entweder der α- oder der β-Kette, und das andere den variablen Bereich der schweren Kette mit dem konstanten Bereich der α- oder der β-Kette umfaßte.
  • Das nachfolgende Beispiel stellt ein Modellexperiment dar, das die Durchführbarkeit der vorstehend aufgeführten allgemeinen Prinzipien und deren weiten Anwendungsumfang demonstriert. Die Erfindung ist nicht auf diese spezifische Ausführungsform beschränkt.
    • Beispiel
  • Zur Konstruktion der chimären TcR-Gene wurden die genomischen Abschnitte, die jeweils die rearrangierten VJ- und die Leaderexons der schweren oder der leichten Kette des Sp6 anti-TNP-Igm-Antikörpers (Ochi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 6351-6355) enthielten, mit den Exons des konstanten Bereichs entweder der α- oder der β-Kette des TcR ligiert. Die chimären Gene wurden in einen pRSV-Expressionsvektor eingesetzt, der den Rous sarcom-Promotor und entweder die Neo - oder die gpt-Wirkstoff-Resistenzgene enthielt. MD.45 - ein CTL-Hybridom mit BALB/c-Ursprung, das durch H-2Db-Zellen sowohl zur IL-2-Produktion als auch zur spezifischen Abtötung von Zielzellen stimuliert werden kann (Kaufmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2502-2507), wurde mit jedem der Vektoren mittels Protoplastenfusion transfiziert. Unter den wirkstoffresistenten transfizierten Zellen wurden die Hybridome ausgewählt, die die chimären Gene exprimierten (unter Verwendung von VH- und VL-Sonden). Der die größten Mengen einer Kette produzierende Clon wurde mit der Konstruktion, die die komplementäre Kette und den anderen Wirkstoff-Marker enthielt, erneut transfiziert. Doppelt transfizierte, sowohl in Anwesenheit von Mycophenolsäure als auch von G.418 wachsende Zellen wurden durch Northern-Analyse auf die Transkription beider chimärer Gene hin und durch Immunblot und Immunpräzipitation auf die Expression des Sp6-Idiotyps (unter Verwendung von 20.5 mAb) hin überprüft. Die Expression des funktionsfähigen chimären Rezeptors wurde über die Fähigkeit der Zellen bewertet, mit einer produktion von IL-2 auf TNPylierte Zellen unterschiedlichen Ursprungs und auf TNP-Protein-Antigene - entweder als solche oder durch unterschiedliche Zellen dargeboten - zu reagieren.
  • Nach DNA-Transfer der chimären Gene mit einer Kombination von entweder VLCα + VHCβ oder VLCβ + VHCα in das MD.45-CTL-Hybridom exprimierten beinahe alle transfizierten Zellen die beiden komplementäre Ketten mit 1,8 kb für die VLCα- oder VLCβ- und mit 1,9 kb für VHCα- oder VHCβ- Ketten (Gross et al., Transp. Proc. 21 (1989), 127-130). Die Expression des chimären Polypeptids wurde mittels eines Immunblots von Zellysaten unter Verwendung des anti-Sp6-Idiotyps mAb 20.5 oder durch Immunpräzipitation unter Verwendung des 20.5 mAbs und der anti-TcR-β-8.3-Untergruppe F23.1 mAb analysiert (Fig. 1). Unter nicht-reduzierenden Bedingungen ergab die Reaktion mit anti-id- und anti-β-TcR eine breite Bande mit einem relativen Molekulargewicht von 80 kD, die sich aus zwei Banden mit 83 kD und 77 kD zusammensetzte. Bei einigen transformierten Hybridomen gab es ebenfalls eine Bande mit 42-45 kD. Nach Reduktion wurde die im Immunblot von 20.5 mAb erkannte idiotypische Determinante jedoch zerstört, und der Komplex mit 80 kD dissoziierte in das Polypeptid mit 42 kD. Interessanterweise exprimierten die Hybridome, die entweder allein mit VHCα oder mit VHCβ transfiziert worden waren, ebenfalls sowohl den Komplex mit 83 kD als auch die den 20.5-Idiotyp tragende Kette mit 42 kD. Unter Berücksichtigung der Tatsache, daß das MD.45-Hybridom sein αβ-Dimer (Becker at al., Nature 316 (1985), 606-619) und nur die β-Kette des BW 5147-Fusionspartners (Lustgarten and Eshhar, unveröffentlichte Ergebnisse) exprimiert, in Verbindung mit der Tatsache, daß der 20.5-Idiotyp (genau wie die anti-TNP-Bindungsstelle) allein auf VH-Sp6 exprimiert wird und empfindlich gegen eine Denaturierung unter reduzierenden Bedingungen ist, kann man schlußfolgern, daß in transfizierten Zellen, die das VHCα- oder das VHCβ-Gen erhalten hatten, eine chimäre Kette exprimiert wird, die funktionsfähige Dimere mit den autologen komplementären α- oder β-Ketten des TcRs bildet. Bei einem Teil der Dimeren sind die Ketten nicht durch Disulfidbindungen verknüpft und wandern daher in der SDS-PAGE als Einzelbande. Die doppelt transfizierten Zellen exprimieren sehr wahrscheinlich auf ihrer Oberfläche zusätzlich zu den chimären VLCα-VHCβ- (oder VLCβ-VHCα-) Dimeren des chimären Rezeptors ebenfalls die Heterodimeren, die sich aus den verschiedenen Paarungskombinationen der chimären Kette mit den komplementären autologen α- und β-Ketten ergeben. Dies führt zu der breiten Bande, die in der Immunpräzipitation von oberflächeniodiertem TcR durch entweder anti-id- oder anti-TcR- beobachtet wurde (Fig.1).
  • Um zu untersuchen, ob der chimäre Rezeptor die anti- TNP-Spezifität des Antikörpers und die Fähigkeit bewahrt hatte, ein transmembranes Signal zur Aktivierung von T-Zellen auszusenden, wurden die transfizierten Zellen zusammen mit unterschiedlichen Stimulatorzellen entweder TPNyliert oder in Gegenwart verschiedener TNP-Protein-Antigene inkubiert. Fig. 2 zeigt das Ausmaß der IL-2-Produktion durch G.2 - eines der transfizierten Hybridome, die chimäre VLCβ + VHCα-Ketten erhalten hatten. G.2 exprimierte auf seiner Oberfläche beide autologen TcRs, wie seine Reaktivität (wie das Elternhybridom MD.45) mit EL-4-Stimulatorzellen beweist. Im Gegensatz zu MD.45 wurde G.2 aber durch TNP, das kovalent an A.20 (BALB/cB-Lymphom) oder an UC.29 (menschliches B-Lymphoblastoid) gekoppelt war, stimuliert. Ferner konnten TNPylierte Proteine (z.B. TNP-BSA, TNP-KLH u.a.) die IL-2-Produktion durch G.2 in löslicher Form und noch besser in Gegenwart von BALB/c-Milz- oder A.20-Zellen stimulieren, von denen bekannt ist, daß sie Antigene gut darbieten. Interessanterweise konnten die transfizierten Zellen, die nur das chimäre VHCα- oder VHCβ-Gen erhalten hatten und den Sp6-Idiotyp exprimierten, ebenfalls auf TNP reagieren, was darauf hindeutet, daß das VH von Sp6 die gesamte Information enthält, die zur Konstruktion der TNP-Bindungsstelle benötigt wird.
  • Alles in allem beweisen die vorliegenden Ergebnisse klar, daß es möglich ist, chimäre, eine Antikörperspezifität aufweisende T-Zellgene zu konstruieren, mit ihnen Zellen zu transfizieren und sie funktionell zu exprimieren. Diese neue Vorgehensweise sollte zur Ermöglichung eines gewünschten Engineerings der Spezifität von T-Zellen in einer nicht MHCbeschränkten Weise so erweiterbar sein, daß ein gegebener Satz von Genen in T-Zellen beliebigen Ursprungs übertragen werden kann. Solche T-Zellen können dann zurück in ihre Spender übertragen werden und dort die erworbene Spezifität offenbaren. Durch solch eine Manipulation erwerben die Zellen eine neue, durch die chimären Gene codierte Spezifität vom Antikörpertyp, die somit nicht durch Eigen-MHC-Moleküle beschränkt ist.
  • Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß man auf ähnliche Weise eine große Zahl von Paaren solcher chimärer Gene präparieren kann, die chimäre Rezeptoren codieren, die gegen verschiedene, durch spezifische monoclonale Antikörper definierte Zielantigene gerichtet sind. Zu diesen Antigenen können solche Antigene gehören, die man in Tumorzellen einiger Krebserkrankungen findet, ferner virale Antigene, modifizierte Eigenantigene, Bakterienantigene, Parasitenantigene, Pilzantigene, Antigene von Autoimmunkrankheiten und beliebige andere Antigene, deren Steuerung der zellulären Immunantworten dem Patienten zugute kommen kann.
  • Einer der Vorteile der Erfindung ist es, daß sie es ermöglicht, patienteneigene Zellen zu nehmen, diese in vitro zu vermehren, falls nötig, eine bestimmte Effektor-Untergruppe (Killer-, Helfer- oder Suppressorzellen) zu selektionieren und die gewünschte Spezifität solcher Zellen durch Einführen eines Paares gentechnologisch manipulierter chimärer Gene in diese Zellen zu steuern. Solche Zellen üben nach Reimplantation in den Patienten ihre Funktion gegen die Zielantigene so aus, wie es die chimären Gene diktieren.

Claims (9)

1. Mononucleäre T-Killerzelle oder natürliche Killerzelle, die einen chimären Rezeptor exprimiert, der es der Zelle erlaubt, Zielzellen, die ein vorbestimmtes Ziel-Antigen tragen, in einer nicht MHCbeschränkten Weise selektiv abzutöten, wobei die Zelle ein rekombinantes, den chimären Rezeptor codierendes Gen umfaßt, wobei das Gen
(a) Genabschnitte, enthaltend codierende Sequenzen, die den konstanten Bereich des T-Zellrezeptors (TCR) (α-, β-, γ- und δ-Ketten) codieren, und
(b) Genabschnitte, enthaltend codierende Sequenzen, die die Leadersequenz, die variablen und verbindenden (joining) Unterbereiche des rearrangierten variablen Bereichs der schweren oder leichten Kette eines spezifischen Antikörpers codleren, umfaßt.
2. T-Killerzelle nach Anspruch 1, wobei das Gen ein Paar rekombinanter Gene umfaßt, wobei der erste Satz von Genabschnitten, die den konstanten Bereich der α- oder β-Kette des T-Zellrezeptors codieren, entweder mit den Genabschnitten des rearrangierten variablen Bereichs der schweren oder der leichten Kette des Antikörpers rekombiniert ist, und wobei der zweite Satz von Genabschnitten, die den konstanten Bereich der β- oder α-Kette des T- Zellrezeptors codieren, mit den Genabschnitten des rearrangierten variablen Bereichs der anderen Kette des Antikörpers rekombiniert ist.
3. T-Killerzelle nach Anspruch 1 oder 2, wobei der TCR und der Antikörper, von denen man das rekcmbinante Gen oder Genpaar erhält, von der gleichen Spezies stammen.
4. T-Killerzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der TCR und der Antikörper, von denen man das rekombinante Gen oder Genpaar erhält, von einer unterschiedlichen Spezies stammen.
5. T-Killerzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Gen ein rekombinantes Gen oder ein Genpaar umfaßt, wobei die Genabschnitte der rearrangierten variablen Bereiche die Bindungsstelle eines Antikörpermoleküls codieren, das entweder von der gleichen Spezies wie der T-Zellrezeptor oder von einer anderen Spezies stammt.
6. T-Killerzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Gen ein rekombinantes Gen oder ein Genpaar umfaßt, wobei die Genabschnitte der rearrangierten variablen Bereiche einen Antikörper codieren, der eine Spezifität für tumorspezifische Antigene, tumorassoziierte Antigene, virale Antigene, modifizierte Eigen-Antigene, Parasitenantigene, Bakterienantigene, Pilzantigene, für Autoimmunerkrankungen typische Antigene oder andere fremde Antigene aufweist.
7. T-Killerzelle nach Anspruch 6, wobei das Gen ein rekombinantes Gen oder ein Genpaar umfaßt, wobei die Genabschnitte der rearrangierten variablen Bereiche monoclonale Antikörper codieren, die mit einem definierten Typ von Tumorzellen reagieren.
8. Arzneimittel, das als Wirkstoff eine wirksame Menge von T-Killerzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfaßt.
9. Arzneimittel nach Anspruch 8, wobei die T-Killerzellen einem Patienten entnommen wurden, der mit den modifizierten T-Killerzellen mittels Re-Implantation behandelt werden soll.
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