JPH0543598A - 免疫グロブリンの抗原認識領域を含むハイブリツド蛋白質受容体、その製造方法およびそれを用いる抗原測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】 免疫グロブリンの抗原認識領域と細胞膜表面
受容体の信号感領域とを含むハイブリッド蛋白質受容
体、これを含む抗原測定用バイオセンサーおよび抗原測
定方法に関する。抗原認識領域は、免疫グロブリンのＨ
鎖−Ｈ鎖間でのジスルフィド結合に関与するシステイン
残基を含まないものが好ましい。これによって、抗原結
合量依存的に信号が発生する。さらに、この発明は、該
受容体の製法にも関し、そのための発現系にも関する。 【効果】 免疫グロブリンの抗原認識領域と細胞膜表面
受容体の信号感領域とを含む本発明のハイブリッド蛋白
質受容体は、受容体の機能を有し抗原結合量依存的に信
号を発生するため病原性ウイルス、アレルゲン、腫瘍特
異抗原などの微量特定抗原を特異的かつ高感度に検出し
得る利点をもつ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫グロブリンの抗原
認識領域と細胞膜表面受容体の信号感応領域とを含むハ
イブリッド蛋白質受容体、該受容体の二量体、該受容体
をセンサーとして含む抗原測定用バイオセンサー、およ
び該バイオセンサーを用いる抗原測定方法に関する。

【０００２】本発明はまた、前記受容体をコードする塩
基配列を含むＤＮＡ、該ＤＮＡを含む発現ベクター、該
ベクターで形質転換された形質転換体、および該受容体
の製造方法にも関する。

【０００３】

【従来の技術】受容体（receptor）は、細胞内または細
胞表面に存在し、外因性若しくは内因性の物質または物
理的刺激を認識して細胞に応答を誘起するタンパク質構
造体の総称である。一般に、受容体は、リガンドとして
のアゴニストまたはアンタゴニストが特異的に結合する
ことが可能な立体構造を持ち、リガンドの結合によって
例えば受容体の高次構造の変化や膜電位の変化を介して
アデニル酸シクラーゼ、イオンチャンネル、チロシンキ
ナーゼ等の活性発現を誘導し、細胞内にその情報を伝達
する役割をもつ。

【０００４】受容体の中で、特に興味が持たれているも
のに細胞増殖因子受容体がある。1970年代半ばにラウス
肉腫ウイルスの癌遺伝子産物がチロシン特異的プロテイ
ンキナーゼ活性を持つとの画期的な発見が成されて以来
（Hunter,T. とSefton,B.M.,Proc.Natl.Acad.Sci. 77,1
311 （1980））、チロシンキナーゼが細胞の増殖制御や
癌化の一部に深く関わっていることが明らかとなってき
た。細胞増殖因子とその受容体が複合体を形成するとチ
ロシンキナーゼ活性をもつようになるが、この種の細胞
増殖因子および受容体には、上皮増殖因子（ＥＧＦ）と
ＥＧＥ受容体（Ushiro,H. とCohen,S.,J.Biol.Chem. 2
55, 8363(1980)）、インシュリンとインシュリン受容体
（Kasuga,M. ら,J.Biol.Chem. 257, 9891(1982)）等が
知られている。細胞増殖因子およびチロシンキナーゼ
は、動脈硬化、発癌、炎症等の疾患と何らかの関わりを
有していると考えられており、これらの疾患のメカニズ
ムを解明し有効な治療法を見出だすために細胞増殖因子
およびその受容体を含めた細胞内情報伝達系に関する知
識が集積されつつある。

【０００５】このような状況の中で人工受容体を開発
し、医薬としての新しいアゴニストまたはアンタゴニス
トのスクリーニング、ハイブリッド型酵素結合抗体の酵
素免疫結合法（ＥＬＩＳＡ）への利用等が試みられてい
る。

【０００６】例えば、ジェネンテック・インコーポレイ
テッドのグループは、細胞増殖因子受容体を模倣した人
工受容体を報告している（特開昭62-272990 号公報）。
この人工受容体は、受容体のリガンド結合領域と、受容
体と無関係なシグナル生成用リポーターポリペプチドと
からなり、遺伝子組換え技術を用いて作製される。ま
た、リポーターポリペプチドによって生成されるシグナ
ルとしては、上記チロシンキナーゼ活性のような酵素活
性等が利用され、また、リガンド結合領域としては、細
胞表面に存在する受容体の細胞外領域が使用されるが、
免疫グロブリンの抗原結合部位はリガンド結合領域とし
て使用されないことが明記されている。

【０００７】ヌーバーガーら（特表昭62-500352 号公
報）は、免疫グロブリンの抗原結合部位に酵素、蛋白質
毒素、異種のＩｇ分子蛋白質などの蛋白質を連結したキ
メラ抗体を開示している。特に、該キメラ抗体中に含ま
れる酵素蛋白質として、ＤＮＡポリメラーゼＩのKlenow
断片およびヌクレアーゼが挙げられおり、また、このキ
メラ抗体を構成するＩｇ分子部分は、抗原結合部位を有
する可変領域、ＣＨ１、ヒンジおよびＣＨ２領域からな
る。このような酵素結合キメラ抗体は、ＥＬＩＳＡにお
いて抗体と酵素を別々に使用する従来の方法の代替法と
して利用し得ることが提案されている。

【０００８】天然由来の受容体は大量取得や安定性の点
で問題があるが、人工受容体は、そのような欠点を克服
し得るだけでなく、リガンド結合領域と信号感応領域と
の多様な組み合わせが可能となるためその応用範囲も限
りなく拡がることが予想される。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】免疫グロブリンは，動
物体内に侵入する異物（抗原）に対して防御的に産生さ
れる抗体を指す。抗原と抗体との反応は特異的であり、
特に、モノクローナル抗体は単一のエピトープに対する
ものであり高度の特異性を有している。従って、免疫グ
ロブリンの特異的抗原認識領域と、上記公報中リポータ
ーポリペプチドと称する信号感応領域とを含む人工受容
体が得られるならば、病原ウイルス、アレルゲン、腫瘍
特異抗原などの微量特定抗原を特異的かつ高感度に検出
し得る新規のバイオセンサーを提供し得ると共に、その
応用範囲も格段に拡がる可能性を持つと言える。従来の
抗原の定性および定量法としては、免疫沈降法、ＥＬＩ
ＳＡ、ラジオイムノアッセイなどが知られているが、感
染若しくは発病初期の病原ウイルス抗原、腫瘍特異抗原
などの体液微量成分をこれらの従来法で検知しようとす
る場合、検出感度の点で少なからず限界があった。本発
明は、受容体の機能を利用する微量成分の高感度検出を
達成するものである。

【００１０】本発明は、免疫グロブリンの抗原認識領域
と細胞膜表面受容体の信号感応領域を含むハイブリッド
蛋白質受容体およびその二量体を提供することを目的と
する。

【００１１】本発明はまた、該受容体をセンサーとして
含む抗原測定用バイオセンサーおよびそれを用いる抗原
測定方法を提供することを目的とする。

【００１２】本発明は更に、該受容体をコードする塩基
配列を含むＤＮＡ、関連する発現ベクターおよび形質転
換体、並びに該受容体の製造方法を提供することを目的
とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明は、免疫グロブリ
ンの抗原認識領域と細胞膜表面受容体の信号感応領域と
を含む新規のハイブリッド蛋白質受容体を提供する。

【００１４】ヌーバーガーら（特表昭62-500352 号公
報）によって開示された酵素結合キメラ抗体は、抗原の
結合の有無に拘らずはじめから酵素活性を有するもので
あるのに対し、本発明の受容体は、抗原が結合すること
によってはじめて酵素活性の発現および／または細胞増
殖などの信号を発生する点で画期的である。

【００１５】本発明者らは、最初ヌーバーガーらによっ
て開示された方法に従い、酵素として上皮細胞増殖因子
受容体（ＥＧＦＲ）を用いてキメラ抗体を作製したとこ
ろこれはたしかにチロシンキナーゼ活性を有していた
が、その活性は抗原濃度に関係なく発現しバイオセンサ
ーとしての特性を有していなかった。チロシンキナーゼ
活性が免疫グロブリンに認識される抗原の量（濃度）に
比例して発現されるような方法を種々模索したところ、
上皮細胞増殖因子受容体とのキメラ抗体の場合は免疫グ
ロブリンの遺伝子領域の中から定常領域の一部ＣＨ２ド
メインを外して上皮細胞増殖因子受容体の遺伝子と結合
してキメラ抗体を発現させるとチロシンキナーゼ活性が
抗原濃度依存的に変化することを発見した（図５）。

【００１６】理論に拘束されるつもりはないが、この理
由は上皮細胞増殖因子受容体のチロシンキナーゼ発現の
機構が二量体形成によっているためと解釈される。つま
りＣＨ２ドメインを含むキメラ抗体ではＣＨ２ドメイン
に含まれるシステインのために二つのキメラ抗体がジス
ルフィド結合によって抗原濃度非依存的に二量体を形成
し（図４のＩｇＭ−ＥＧＦＲ）、よって上皮細胞増殖因
子受容体のチロシンキナーゼ活性が抗原認識とは無関係
に常に誘導されるためと考えられる。

【００１７】したがって、ほっておけば二量体を形成す
る免疫グロブリン分子に加工を加え、上皮細胞増殖因子
受容体とのキメラ抗体が抗原なしには二量体を形成しな
いようにもっていくことが必要である（図４のＩｇＭ−
ＥＧＦＲｄＣＨ２）。そのために、免疫グロブリンの抗
原認識領域が、Ｈ鎖−Ｈ鎖間のジスルフィド結合をもつ
ヒンジ領域および／またはＣＨ２ドメインを含まないよ
うにハイブリッド蛋白質受容体を形成することによっ
て、結合抗原濃度依存的に該受容体の信号感応領域が活
性化されるようになり、抗原の定性、定量分析への使用
が可能となった。

【００１８】本明細書中、「抗原認識領域」とは、免疫
グロブリンのＬ鎖およびＨ鎖によって構成される、可変
領域を含むポリペプチドを意味する。この中には、Ｈ鎖
とＬ鎖が１つのポリペプチドで構成されるものも含まれ
る。このポリペプチドは、Ｈ鎖上にＨ鎖−Ｈ鎖間でのジ
スルフィド結合形成に関与するシステイン残基を含まな
いものが特に好ましい。

【００１９】免疫グロブリンはＩｇＡ、ＩｇＤ、Ｉｇ
Ｅ、、ＩｇＧおよびＩｇＭの５つのクラスに分けられ
る。これらのクラスは、Ｌ鎖が同一であり、Ｈ鎖が互い
に異なる。また、免疫グロブリンは、通常、Ｈ鎖および
Ｌ鎖の２種のポリペプチド鎖がＨ₂ Ｌ₂ （ＩｇＧ、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、膜結合型ＩｇＭ）かあるいはＨ₂
Ｌ₂ のペンターマー（分泌型ＩｇＭ）を構成している。
Ｈ−Ｌ間は合計２個の、またＨ−Ｈ間は１個以上のジス
ルフィド結合で結合されている。

【００２０】本発明のハイブリッド蛋白質受容体中の抗
原認識領域は、上記５クラスのいずれのものであっても
よいが、好ましくはＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＥのクラ
ス並びにサブクラスから選択される。ＩｇＭ、ＩｇＧお
よびＩｇＥはそのＦｃ領域をそれぞれ、ある種のリンパ
球細胞、マクロファージおよび肥満細胞の細胞膜上の各
Ｆｃ受容体と結合して、Ｂ細胞増殖、ファゴサイトーシ
スおよびヒスタミン放出を誘導する抗原受容体として機
能することが知られている。

【００２１】また、「信号感応領域」とは、抗原認識領
域即ち免疫グロブリン部分とは由来の異なる、細胞膜表
面受容体中のポリペプチドであって、抗原が認識領域に
結合した際に信号感応領域の性質を変化させ得るもので
あればいかなるものであっても良い。一般に、このよう
な性質の変化は、ハイブリッド蛋白質受容体の二量化、
コンホメーション変化等の構造変化によって酵素活性お
よび／または細胞増殖が発現され得るものが好ましい。
該信号感応領域は、自己リン酸化活性能を有する細胞増
殖因子受容体のものが好適であり、例えば上皮増殖因子
受容体、インシュリン受容体、血小板由来増殖因子受容
体、ｅｒｂＢのような遺伝子産物などの信号感応領域が
挙げられる。これらの受容体は何れもチロシンキナーゼ
活性を持つことが知られている。実際の細胞膜表面受容
体中の信号感応領域は、細胞内領域に存在しているが、
ハイブリッド化に際しては、該受容体の細胞内領域の全
体を必ずしも含有させる必要はなく、酵素活性発現およ
び／または細胞増殖が得られるならば所望の機能を示す
部分のみを含有すればよい。このような信号感応領域
は、受容体の二量化、コンホメーション変化等の構造変
化を介して活性を発現する酵素部分であってもよく、例
示した受容体の性質上特にホスホキナーゼが好ましい。

【００２２】本発明のハイブリッド蛋白質受容体をin v
ivo で使用することも可能である。例えば、該受容体を
コードする遺伝子を含む線状化発現ベクターを動物細胞
内で相同的組換えを可能とする受容体関連遺伝子に相同
的組換えを起こすことによって、細胞膜表面に該受容体
を発現させ、この細胞上に抗原が結合したときに信号感
応領域が活性化され細胞増殖を誘導する。このような例
としては、リンパ球細胞を用いるＢ細胞増殖がある。

【００２３】本発明の好適実施態様により、受容体は、
膜結合型ＩｇＭの抗原認識領域を含有する細胞外領域
と、細胞膜表面受容体の信号感応領域を含有する細胞内
領域とから構成される。このとき、該細胞外領域と該細
胞内領域との間に、該細胞膜表面受容体由来のまたはＩ
ｇＭ由来の膜貫通（トランスメンブラン）領域を含有さ
せることも可能である。

【００２４】本発明はまた、上記ハイブリッド蛋白質受
容体の二量体も提供する。このような二量体は、免疫グ
ロブリンのＨ鎖−Ｈ鎖間でのジスルフィド結合形成に関
与するシステイン残基をもつ抗原認識領域を含有するハ
イブリッド蛋白質受容体の二量体（例えば、二量化Ｉｇ
Ｍ−ＥＧＦＲ）、および該システイン残基をもたない抗
原認識領域を含有するハイブリッド蛋白質受容体の二量
体（例えば、ＩｇＭ−ＥＧＦＲｄＣＨ２の二量体）の両
方を包含するものとする。但し、後者の二量体はその抗
原認識領域に抗原が結合することによって生成されるも
のを指す。

【００２５】本発明はさらに、上記ハイブリッド蛋白質
受容体をコードする塩基配列を含むＤＮＡを提供する。

【００２６】異なる蛋白質同士のハイブリッド化は、化
学合成法よりはむしろ伝統的な遺伝子組換え技術を用い
て実施し得る。以下にその基本操作を示す。

【００２７】 （Ａ）受容体細胞内領域をコードするＤＮＡ断片の調製 １）一次構造既知の細胞受容体に特徴的なアミノ酸配列
部分をコードする核酸プローブを合成し、 ２）受容体を取得した生物の組織または細胞から該受容
体ｍＲＮＡを取得し、このｍＲＮＡから受容体ｃＤＮＡ
ライブラリーを調製し、 ３）コロニーハイブリダイゼーション法により、所望の
受容体をコードするｃＤＮＡを含有しているファージを
保有するコロニーをスクリーニングし、 ４）受容体ｃＤＮＡの塩基配列および推定アミノ酸配列
を決定して所望の受容体をコードするものであることを
確認し、並びに、 ５）受容体をコードするＤＮＡを含有するファージを特
定の制限酵素で消化し、精製し、該細胞内領域をコード
するＤＮＡ断片を得る。

【００２８】（Ｂ）特定抗原に特異的な免疫グロブリン
Ｈ又はＬ鎖発現ベクターの構築 １）適切な動物細胞培養物から所望の免疫グロブリンの
Ｈ又はＬ鎖ｍＲＮＡを取得し、このｍＲＮＡからｃＤＮ
Ａライブラリーを調製し、 ２）合成プローブを用いるコロニーハイブリダイゼーシ
ョン法により、所望のＨ又はＬ鎖をコードするｃＤＮＡ
を含有しているファージを保有するコロニーをスクリー
ニングし、 ３）Ｈ又はＬ鎖をコードするＤＮＡを含有するファージ
を特定の制限酵素で消化し、精製し、Ｈ又はＬ鎖をコー
ドするＤＮＡを得、 ４）Ｈ又はＬ鎖をコードするＤＮＡを適切な制限酵素で
消化して、所望の抗原認識領域を構成するＨ又はＬ鎖ポ
リペプチドをコードするＤＮＡ断片を調製し、 ５）Ｈ及び／又はＬ鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡ
断片を適切なベクター内のプロモーター下流部位に組み
込み、免疫グロブリンＨ及び／又はＬ鎖発現ベクターを
作製する。このとき、免疫グロブリンＨ及びＬ鎖連結遺
伝子は、Ｌ鎖遺伝子の下流の部位に、抗原結合可能な高
次構造形成を妨げない任意ポリペプチドをコードする遺
伝子を介して、Ｈ鎖遺伝子を配置するのが好ましい。

【００２９】（Ｃ）免疫グロブリンＨ及び／又はＬ鎖−
受容体ハイブリッド蛋白質発現ベクターの構築 １）段階（Ｂ）で得た免疫グロブリンＨ及び／又はＬ鎖
発現ベクターを特定の制限酵素で消化し、 ２）このベクター断片中の抗原認識領域コード配列に任
意の方向で、好ましくはその下流側に段階（Ａ）で得た
受容体細胞内領域をコードするＤＮＡ断片を連結し、お
よび、 ３）所望の方向性で含まれるクローンをコロニーハイブ
リダイゼーション法によりスクリーニングして、免疫グ
ロブリンＨ及び／又はＬ鎖−受容体ハイブリッド蛋白質
発現ベクターを得る。

【００３０】（Ｄ）免疫グロブリン−受容体ハイブリッ
ド蛋白質の産生 １）段階（Ｃ）で得た免疫グロブリンＨ及びＬ鎖−受容
体ハイブリッド蛋白質発現ベクター単独か又は、免疫グ
ロブリンＨ又はＬ鎖−受容体ハイブリッド蛋白質発現ベ
クター及び段階（Ｂ）で得た免疫グロブリンＬ又はＨ鎖
発現ベクターの両方を真核宿主細胞内に導入して宿主を
形質転換し、 ２）得られた形質転換体を適切な培地中で培養してハイ
ブリッド蛋白質を発現、分泌させ、および、 ３）ハイブリッド蛋白質を回収する。

【００３１】従って、上記のハイブリッド蛋白質受容体
をコードするＤＮＡを含む複製可能な発現ベクター、該
ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体、お
よびハイブリッド蛋白質受容体の製造方法も本発明の範
囲に含まれる。

【００３２】発現ベクターは、ハイブリッド蛋白質受容
体をコードしているＤＮＡが発現および複製可能なよう
に、該ＤＮＡの上流にプロモーター配列を含み、必要に
応じてリボソーム結合部位、複製起点、転写終結部位な
どの配列を含む。また、所望のＤＮＡを発現するコロニ
ーのスクリーニングが容易となるように選択マーカー配
列を含み得る。

【００３３】プロモーターとしては、酵母のような真核
宿主細胞の場合、例えば例えば３−ホスホグリセレート
キナーゼ（Hitzenman ら,J.Biol.Chem.,255:2073(198
0)）、他の解糖系酵素（Hessら,J.Adv.Enzyme Reg.,7:1
49(1968);Hollandら,Biochemistry,17:4900(1978) ）等
が使用され、また哺乳動物細胞のような宿主細胞の場
合、例えば常用のプロモーターはポリオーマウイルス、
アデノウイルス２から誘導される、更に一般的にはサル
ウイルス４０（SV40）から誘導される、特にＳＶ４０ウ
イルスの初期プロモーターまたは後期プロモーターある
いは免疫グロブリンプロモーターが好適に使用され得
る。

【００３４】宿主としては、酵母、動物細胞等の真核細
胞が使用される。受容体はしばしば、多数のＳ−Ｓ結合
を介してサブユニット構造を形成しており、またグリコ
シル化等の翻訳後修飾を受けているため、このように複
雑な構造をもつハイブリッド蛋白質受容体の発現におい
ては真核細胞を使用するのが好都合である。

【００３５】ある種のミエローマ細胞系、特にマウスミ
エローマJ558L 細胞は、免疫グロブリンＬ鎖の一種であ
るλ１鎖を分泌するため、この細胞にＨ鎖の遺伝子を導
入することにより完全な免疫グロブリンを分泌する細胞
を得ることができる（Oiら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
80,825-826(1983)）。それ故、J558L 細胞を、Ｈ鎖ポリ
ペプチドをコードする遺伝子と受容体細胞内領域をコー
ドする遺伝子との連結遺伝子を含有する発現プラスミド
で形質転換することにより、所定の位置にＬ鎖の結合し
たハイブリッド蛋白質受容体を容易に得ることができる
だろう。従って、宿主としてこのようなミエローマ細胞
系を使用するのがさらに好都合である。ハイブリッド蛋
白質受容体をコードする遺伝子を含む発現ベクターで宿
主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、ハ
イブリッド蛋白質を発現、分泌させ、次いで該受容体を
回収することによって、ハイブリッド蛋白質受容体を製
造し得る。このような該受容体の製造方法も本発明の範
囲に含まれる。

【００３６】本発明はまた、上記ハイブリッド蛋白質受
容体をセンサーとして含む抗原測定用バイオセンサーを
提供する。

【００３７】このバイオセンサーは、該受容体上の抗原
認識領域に特定抗原が特異的に結合すると、受容体蛋白
質が二量化、コンホメーション変化等の構造変化を起こ
すことにより該受容体上の信号感応領域を活性化し、こ
れによって発生した信号を検出することにより、抗原の
定性および定量分析を可能にする。信号の検出は、invi
troでは好ましくは酵素活性の発現で捕えるのがよく、
より好ましくはホスホキナーゼ活性を測定するのがよ
い。ホスホキナーゼ活性は、受容体自体または外部添加
基質中に取込まれた放射性リン（³²Ｐ）の量を測定する
ことにより求められる。あるいは、in vivo では細胞増
殖量を検出する方法でも可能である。従って、このよう
な検出方法は、複数の情報伝達段階を経て信号が増幅さ
れるため、ナノモル以下のレベルの抗原を高感度に検出
し得る利点をもつ。

【００３８】本発明のバイオセンサーは、例えば緩衝液
に溶解された該受容体の溶液形態であってもよいし、ま
たは膜などの担体上に活性発現可能なように吸着若しく
は固定化された形態であってもよい。バイオセンサー
は、通常、該受容体を安定に維持し得る緩衝液中で使用
され、必要によりグリセロール等の蛋白質安定化剤を含
み得る。

【００３９】本発明はさらに、上記バイオセンサーを使
用する抗原測定方法も提供する。

【００４０】即ち、この方法は、バイオセンサーに抗原
を接触させて該バイオセンサーのハイブリッド蛋白質受
容体上の抗原認識領域に抗原を結合させる段階、抗原結
合を介して該ハイブリッド蛋白質受容体上の信号感応領
域を活性化する段階、及び発生した信号を検出する段階
を包含する。信号をホスホキナーゼ活性として検出する
場合、リン酸化を受けるペプチドもしくはタンパク質基
質のような外部添加基質の放射能を測定するか、または
受容体の自己リン酸化による放射能を測定することによ
って行なわれる。

【００４１】

【実施例】以下の実施例により本発明をさらに説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されない。

【００４２】実施例 １ ハプテンＮＰ特異的免疫グロブリンＩｇＭ−上皮増殖因
子受容体融合蛋白質発現プラスミドの構築 該発現プラスミドの構築のためにマウスＩｇＭプラスミ
ドｐＳＶ−Ｖμ１（Neuberger, EMBO J. 2, 1373−1378
(1983)）を使用した。このプラスミドは、ミエローマＢ
１−８由来の抗原ＮＰ（４−ヒドロキシ−３−ニトロフ
ェニル酢酸）特異的可変領域と、ＩｇＭの定常領域と、
選択マーカーとしての大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子
及びキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ（ｇｐｔ）とをコードするプラスミドである。ま
た、ヒトEGFRcDNAは、ヒト胎盤由来ライブラリーからク
ローニングされたEGFRcDNA（受容体蛋白質カルボキシル
末端部分）及び遺伝子バンク（ＪＣＲＢ−ＤＮＡ）より
供給を受けたプローブｃＤＮＡであるｐＥ７（受容体蛋
白質膜貫通領域〜キナーゼドメイン部分）を使用した。

【００４３】ハプテンＮＰ特異的マウス免疫グロブリン
ＩｇＭ発現プラスミドであるｐＳＶ−Ｖμ１から得たゲ
ル精製ＫpnＩフラグメント（３．２ｋｂ）を、クローニ
ングベクターｐＵＣ119 をＫpnＩで切断したものにサブ
クローニングした。このベクターをＰstＩで消化した
後、ウシ小腸ホスファターゼで末端のリン酸を除き、Ｉ
ｇＭのＭ１エクソンとｐＵＣ119 の複製起点を含むベク
ター断片５．６ｋｂをゲルで精製した。これにEGFRcDNA
をコードするベクターをＰstＩで消化、ゲル精製して得
たＥＧＦＲの細胞質領域をコードする１．３ｋｂの断片
を挿入した。そして所望の方向性で含まれるクローンを
スクリーニングした。このベクターで大腸菌ｄａｍ^- 株
ＧＭ３３を形質転換し、プラスミドＤＮＡを調製した。
このプラスミドをＢclＩ（この酵素はｄａｍ^- 株から得
たＤＮＡしか切断し得ない）とＣlaＩで消化し、Ｍ１ド
メインとEGFRcDNA配列を含む断片１．５ｋｂをゲル精製
した。更にEGFRcDNAをコードするベクターをＣlaＩとｃ
ＤＮＡの３′側に位置するポリリンカー配列中のＳalＩ
で消化してEGFRcDNA断片１．０ｋｂをゲル精製した。こ
れらの断片をＧＭ３３株より調製したｐＳＶ−Ｖμｌを
ＢclＩとＸhoＩで消化した後ゲル精製した１５ｋｂのベ
クター断片に挿入した。このようにして得られた発現プ
ラスミドをｐＳＶ−ＶμＭＥＲと命名した（図１参
照）。ｐＳＶ−ＶμＭＥＲは、ＩｇＭの膜結合配列をコ
ードするＭ１ドメインからスプライシングを介してＥＧ
ＦＲの６６１番目の残基（ＥＧＦＲの細胞質側に位置し
てキナーゼドメインの上流にある）に相当する塩基配列
を結合させたｍＲＮＡを転写させることにより、目的の
融合蛋白ＩｇＭ−ＥＧＦＲを発現する。

【００４４】実施例 ２ Ｈ鎖間のＳ−Ｓ結合を欠いたＩｇＭ−ＥＧＦＲｄＣＨ２
発現プラスミドの構築 ＩｇＭ−ＥＧＦＲ発現プラスミドであるｐＳＶ−ＶμＭ
ＥＲから得たゲル精製ＳamＩ−ＣlaＩ断片３ｋｂ（Ｉｇ
ＭのＣＨ１ドメイン中よりＥＧＦＲキナーゼドメイン中
までをコードする）を、クローニングベクターｐＵＣ11
9 のＨinｃII（＝ＳalＩ）サイトにＣlaＩリンカーを組
み込んで作製したベクターｐＵＣ119 ＣのＳmaＩ−Ｃla
Ｉ消化物にサブクローニングした。

【００４５】このベクターを唯一の切断部位がＩｇＭＣ
Ｈ２ドメインの３′側に存在するＡflIIで完全消化した
後、ＳacＩで部分消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで末
端を平滑化し、セルフライゲーションさせた。得られた
コロニーを培養し、目的のＣＨ２ドメイン部分のＤＮＡ
断片のみを欠いたクローンをスクリーニングした。この
ベクターをＳmaＩ，ＣlaＩおよびＤraＩで消化し、Ｓma
Ｉ−ＣlaＩ 2.4ｋｂ断片をゲル精製した。これとｐＳＶ
−ＶμｌのＳmaＩ，ＸhoＩ消化物のゲル断片（１３ｋ
ｂ）とEGFRcDNAをコードするベクターのＣlaＩ，ＳalＩ
消化物のゲル断片（１．０ｋｂ）をライゲーションさせ
て、発現プラスミドを作製した。スクリーニングの結果
目的のプラスミドを得てｐＳＶ−ＶμＭＥＲ△ＣＨ２と
命名した（図２参照）。

【００４６】実施例 ３ ＩｇＭ−ＥＧＦＲ又はＩｇＭ−ＥＧＦＲｄＣＨ２融合蛋
白質の発現 融合蛋白質を発現させるために、発現プラスミドをマウ
スミエローマＪ５５８Ｌ細胞（Ｏｉら、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. U.S.A. 80, 825-829 (1983)）に導入した。Ｊ
５５８Ｌ細胞は免疫グロブリンＬ鎖の一種であるλ１鎖
を分泌するので、ここにＨ鎖の遺伝子を導入することに
より完全な免疫グロブリンを分泌する細胞を得ることが
できる。特にプラスミドｐＳＶ−Ｖμｌを導入した場
合、分泌されたＩｇＭ抗体は抗原ＮＰに対する結合性を
持つことが知られている（Neuberger ら、 Nature 31
2, 604-607 (1984)）。Ｊ５５８Ｌ細胞へのＤＮＡ導入
法としては電気穿孔法を用いた。ゲル濾過法で精製して
エタノール沈殿させたｐＳＶ−ＶμＭＥＲあるいはｐＳ
Ｖ−ＶμＭＥＲ△ＣＨ２プラスミドのペレット２０μｇ
を、２５０μｌのハンクス緩衝液に溶解し、２５０μｌ
のハンクス緩衝液に懸濁させた１×１０⁷ のＪ５５８Ｌ
細胞と混合させた。混合液を４mm幅のアルミニウム電極
入りチェンバーに入れて１kV／cm、０．２ミリ秒の矩型
波を２秒間隔で１２回かけた。室温で１０分間置いたあ
と、２０mlの１０％ウシ胎児血清入りＤＭＥ（ダルベッ
コ改良イーグル）培地に細胞を移した。遺伝子導入され
たＪ５５８Ｌ細胞は、３７℃５％ＣＯ₂ 存在下で培養
し、翌日２０mlの選択培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ、
６μｇ／mlミコフェノール酸、２５０μｇ／mlキサンチ
ン）を加え２日間培養した。その後２日毎に２回、２０
mlの上清を除き２０mlの新鮮な選択培地を加えた。

【００４７】導入後１０日〜１４日で遺伝子導入細胞の
みが選択的に増殖してきたので、ある程度継代して死細
胞の割合が少なくなった所でＮＰ−ＢＳＡを抗原として
用いたＥＬＩＳＡ間接法により細胞内のＩｇＭ−ＥＧＦ
Ｒ蛋白発現量を定量した。すなわちあらかじめＮＰ−Ｂ
ＳＡを吸着させておいてマイクロタイタープレートに、
一定数の細胞（例えば１０⁶ ）を 100μｌの界面活性剤
Triton X-100 を１％含むＰＢＳ緩衝液で可溶化したラ
イセートを加えて室温で１時間置いた。そののち界面活
性剤 Tween 20 を０．１％含むＰＢＳ緩衝液で洗浄して
余分のライセートを除き、適度に希釈したペルオキシダ
ーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体を加え、室温で１時間置
く。その後洗浄して余分の抗体を除き、基質二塩酸オル
トフェニレンジアミンを含む反応液を加えて反応させて
マイクロプレートリーダーで４９２nmの吸光度を測定し
た。

【００４８】この結果、遺伝子導入細胞では導入されて
いないＪ５５８Ｌ細胞に比べて吸光度が増大しているこ
とが判明した。そこでＩｇＭ−ＥＧＦＲ蛋白が発現され
ていると判断し、遺伝子導入細胞を限界希釈法によりク
ローニングを行なった。増殖してきたクローンについ
て、同様のＥＬＩＳＡ間接法による蛋白発現量の定量を
行ない、発現量の多いクローンを以下の実験に使用し
た。

【００４９】まず免疫沈降法によりＩｇＭ−ＥＧＦＲ蛋
白の核サブユニットの分子量を確認した。対数増殖期の
細胞５×１０⁷ をメチオニンフリーのＭＥＭ＋１％ＦＣ
Ｓ培地で洗浄した後、３．７ＭＢｑ（１００μＣｉ）の
［³⁵Ｓ］メチオニンを含む４mlメチオニンフリーＭＥＭ
＋１％ＦＣＳで３７℃，３時間培養した。ＰＢＳで２回
洗浄し、０．５mlの可溶化緩衝液（20mM Hepes, 150mM
NaCl, 10% glycerol,1% Triton X-100, 1.5mM MgCl₂ ,
1.0mM EGTA, 1% 1mg/ml アプロチニン，1%1 mg/ml ロ
イペプチン，1mM PMSF, pH7.5 ）で細胞膜を溶かし０℃
で１０分間おいた後、１５ krpm で１０分間遠心して核
を除いた。上清を２分し、予め３０分間、４℃でプロテ
インＡセファロースビーズ（Sigma ）に結合させておい
たウサギ抗マウスＩｇＭ（Zymed ：コスモバイオ）ある
いはウサギ抗ヒトＥＧＦＲと混合し、４℃、６０分間回
転混合させた。ビーズを洗浄緩衝液１（50mM Hepes, 50
0mM NaCl, 0.1% SDS, 0.2% Triton X-100, 5mM EGTA, p
H 8.0)で４回、洗浄緩衝液２（50mM Hepes, 150mM NaC
l, 0.1% SDS, 0.2% Triton X-100, 5mM EGTA, pH8.0)で
１回洗浄し、５０μｌの２×泳動用緩衝液（0.125M Tri
s-HCl, 4% SDS,10% 2-メルカプトエタノール，pH 6.8）
で９５℃で３分間処理してＳＤＳ／９％ポリアクリルア
ミド電気泳動を行った（Laemmli 、Nature， 277，680-
685 (1970)）。泳動終了後３０％メタノール−１０％酢
酸で３０分処理したのち増感液（EN³ HANCE, Du Pont）
で２０分処理し、乾燥して−８０℃，２日間オートラジ
オグラフィーを行なった。この結果、発現ベクターを導
入した細胞では抗ＩｇＭと抗ＥＧＦＲの両方の抗体によ
って認識される分子量１２０−１４０キロダルトンのＨ
鎖のバンドと３０キロダルトンのＬ鎖のバンドの両方が
確認された（図３）。

【００５０】次に融合蛋白質の蛋白質チロシンキナーゼ
活性を測定した。１０⁷ の細胞を５００μｌの可溶化緩
衝液で可溶化して３mgのＮＰカプロン酸アフィニティー
カラムと４℃６０分間回転混合させた。ＮＰカプロン酸
アフィニティーカラムは３０mgのＮＰカプロン酸（Camb
ridge Research Biochemicals ：コスモバイオ）、３０
mgの水溶性カルボジイミド（和光純薬）１mlのＥＡＨ−
セファロース４Ｂ（ファルマシア）をまぜてｐＨを５〜
６に保ちながら一晩室温で回転混合したのち蒸留水でよ
く洗う事により作製した。回転させた細胞ライセートと
カラムは１５ krpm で１分間遠心して上清を除き、ペレ
ットを５００μｌの HNTG500緩衝液（20mM Hepes, 500m
M NaCl, 0.1% Triton X-100, 10% glycerol,pH 7.5 ）
で４回洗浄しＨＮＴＧ緩衝液（20mM Hepes, 150mM NaC
l, 0.1% Triton X-100, 10%glycerol, pH 7.5）で１回
洗浄した。ペレットに２５μｌの１ mM ＮＰカプロン酸
を含むＨＮＴＧ緩衝液を加えてよくまぜ、氷上で５分置
き１５ krpm で１分間遠心して上清２０μｌを回収し
た。これにγ位を［³²Ｐ］でラベルしたＡＴＰ111 kBq
（３μＣｉ）， 15mM MnCl₂ , 100μM Na₃ VO₄ を含む
ＨＮＴＧ緩衝液１０μｌを加えて３７℃で５分反応さ
せ、蛋白質に取り込まれた［³²Ｐ］をＳＤＳ／６％ポリ
アクリルアミド電気泳動後のオートラジオグラフィーで
検出した。このときサンプルは二分し、一方（１５μ
ｌ）には２−メルカプトエタノールを含まない４×泳動
用緩衝液５μｌを加えて９５℃３分間処理して同時に泳
動した（図４）。

【００５１】実施例 ４ ＩｇＭ−ＥＧＦＲ又はＩｇＭ−ＥＧＦＲｄＣＨ２発現蛋
白質のタンパク質キナーゼ活性および抗ＩｇＭ抗体また
は抗原（ＮＰ−ＢＳＡ）によるキナーゼ活性の変化の測
定 実施例３に示した方法で得たＩｇＭ−ＥＧＦＲあるいは
ＣＨ２ドメインを欠いたＩｇＭ−ＥＧＦＲ蛋白（ＩｇＭ
−ＥＧＦＲｄＣＨ２と呼ぶ）を発現する細胞株につい
て、その発現する蛋白のライセート中でのキナーゼ活性
を以下の方法で測定した。

【００５２】得られた細胞を１％ Triton X-100, 150mM
NaCl，10％グリセリン， 1.5mMMgCl₂ ，1.0mM EGTA,
1mM PMSF（フェニルメタンスルホニルフルオリド），１
０μｇ／mlアプロチニン，１０μｇ／mlロイペプチンを
含むＨＥＰＥＳ緩衝液（pH7.5）で濃度を１０⁸ 細胞／m
lとなる様に可溶化して氷上に５分間置いた後１５Krpm
で５分間遠心し核を除いた。そして上清を２０μｌづつ
に小分けして１μｌの抗ＩｇＭ抗体あるいは抗原ＮＰカ
プロン酸ＢＳＡと氷上でプレインキュベーションをおこ
なった。その後１０μｌの３μＣｉの［γ³²Ｐ］ＡＴＰ
を含む反応液を加え、３７℃１０分間反応をおこないそ
のうち１５μｌを抗ＩｇＭ抗体を用いた免疫沈降に供し
た。そして免疫沈降させた融合蛋白に含まれるラベルさ
れたリン酸基の量をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動とオートラジオグラフィーで測定した（図５）。
Ｊ５５８Ｌでは融合蛋白のバンドが認められず、他のバ
ンドの濃度にも変化が認められないのに対し、ＩｇＭ−
ＥＧＦＲｄＣＨ２蛋白発現細胞では融合蛋白に相当する
分子量のバンドの濃度が、抗ＩｇＭ抗体あるいは抗原の
濃度に依存して変化することが確認された。すなわち抗
ＩｇＭ抗体あるいは抗原の濃度に依存して融合蛋白の自
己リン酸化活性が変化する（融合蛋白がセンサー活性を
持つ）ことが確認された。ＣＨ２ドメインを持ったＩｇ
Ｍ−ＥＧＦＲ蛋白発現細胞では融合蛋白のバンドは見ら
れたがこの様な変化は見られなかった。すなわちＣＨ２
ドメインの有無がセンサー活性の有無に密接に関与する
ことが分かった。

【００５３】

【発明の効果】免疫グロブリンの抗原認識領域と細胞膜
表面受容体の信号感応領域とを含む本発明のハイブリッ
ド蛋白質受容体は、受容体の機能を有し抗原結合量依存
的に信号を発生するため病原性ウイルス、アレルゲン、
腫瘍特異抗原などの微量特定抗原を特異的かつ高感度に
検出し得る利点をもつ。

【図面の簡単な説明】

【図１】この図は、発現プラスミドｐＳＶ−ＶμＭＥＲ
の構築方法を示す。

【図２】この図は、発現プラスミドｐＳＶ−ＶμＭＥＲ
△ＣＨ２の構築方法を示す。

【図３】この図は、ＩｇＭ−ＥＧＦＲｄＣＨ２およびＩ
ｇＭ−ＥＧＦＲ発現蛋白質のＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動の結果を示す写真である。但し、バンデ
ィングは抗ＩｇＭ抗体（Ｍ）又は抗ＥＧＦＲ抗体（Ｅ）
との免疫沈降反応による。

【図４】この図は、ＩｇＭ−ＥＧＦＲｄＣＨ２およびＩ
ｇＭ−ＥＧＦＲ発現蛋白質の蛋白質チロシンキナーゼ活
性を示す還元条件又は非還元条件下でのＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。

【図５】この図は、ＩｇＭ−ＥＧＦＲｄＣＨ２発現蛋白
質の、抗ＩｇＭ抗体又はＮＰ抗原濃度依存的自己リン酸
化活性を、リン酸化、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動後オートラジオグラフィーで測定した結果を示
す写真（上）である。また、下の写真は、リン酸化活性
の抗原濃度依存性をより明瞭にするためのものであり、
リン酸化反応液を抗ＩｇＭ抗体を結合したプロテインＡ
−セファロースカラムで処理して発現ハイブリッド受容
体蛋白質を精製した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかけ、次いでオートラジオグラフィーで測
定した結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/13 15/62 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 8214−4Ｂ 21/08 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 27/327 27/416 33/566 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 7236−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 8828−4Ｂ 15/00 Ａ

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 免疫グロブリンの抗原認識領域と細胞膜
   表面受容体の信号感応領域とを含むハイブリッド蛋白質
   受容体。
2. 【請求項２】 前記抗原認識領域が、Ｈ鎖−Ｈ鎖間での
   ジスルフィド結合形成に関与するシステイン残基を含ま
   ない請求項１記載の受容体。
3. 【請求項３】 前記免疫グロブリンがＩｇＭ、ＩｇＧま
   たはＩｇＥである請求項１又は２記載の受容体。
4. 【請求項４】 前記細胞膜表面受容体が細胞増殖因子受
   容体である請求項１又は２記載の受容体。
5. 【請求項５】 前記細胞増殖因子が自己リン酸化活性を
   有するものである請求項４記載の受容体。
6. 【請求項６】 前記細胞増殖因子受容体が上皮増殖因子
   受容体、インシュリン受容体、血小板由来増殖因子受容
   体またはｅｒｂＢ遺伝子産物である請求項５記載の受容
   体。
7. 【請求項７】 前記信号感応領域が、受容体の構造変化
   を介して活性を発現する酵素である請求項１又は２記載
   の受容体。
8. 【請求項８】 前記酵素がホスホキナーゼである請求項
   ７記載の受容体。
9. 【請求項９】 前記受容体が、ＩｇＭの抗原認識領域含
   有細胞外領域と、細胞膜表面受容体の信号感応領域含有
   細胞内領域とからなる請求項１、２または４〜８の何れ
   か一項に記載の受容体。
10. 【請求項１０】 前記受容体が、前記細胞外領域と前記
    細胞内領域との間に膜貫通領域を更に有する請求項９記
    載の受容体。
11. 【請求項１１】 前記膜貫通領域が前記細胞膜表面受容
    体由来のものである請求項１０記載の受容体。
12. 【請求項１２】 前記膜貫通領域がＩｇＭ由来のもので
    ある請求項１０記載の受容体。
13. 【請求項１３】 請求項１〜１２の何れか一項に記載の
    ハイブリッド蛋白質受容体の二量体。
14. 【請求項１４】 請求項１〜１２の何れか一項に記載の
    ハイブリッド蛋白質受容体をセンサーとして含む抗原測
    定用バイオセンサー。
15. 【請求項１５】 請求項１４記載のバイオセンサーに抗
    原を接触させてバイオセンサーのハイブリッド蛋白質受
    容体上の抗原認識領域に抗原を結合させる段階、 前記抗原結合を介して前記受容体上の信号感応領域を活
    性化する段階、および、 発生した信号を検出する段階、を含む抗原測定方法。
16. 【請求項１６】 前記信号を、前記ハイブリッド蛋白質
    受容体上の自己リン酸化部位のリン酸化またはリン酸化
    を受ける外部添加基質のリン酸化で検出する請求項１５
    記載の方法。
17. 【請求項１７】 請求項１〜１２の何れか一項に記載の
    ハイブッリド蛋白質受容体をコードする塩基配列を含む
    ＤＮＡ。
18. 【請求項１８】 請求項１７記載のＤＮＡを含む複製可
    能な発現ベクター。
19. 【請求項１９】 請求項１８記載の発現ベククターで宿
    主を形質転換して得られる形質転換体。
20. 【請求項２０】 前記宿主が真核細胞である請求項１９
    記載の形質転換体。
21. 【請求項２１】 前記真核細胞がミエローマ細胞系であ
    る請求項２０記載の形質転換体。
22. 【請求項２２】 請求項１〜１２の何れか一項に記載の
    ハイブリッド蛋白質受容体の製造方法であって、 請求項１８記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換す
    る工程、 前記宿主細胞を、ハイブリッド蛋白質受容体をコードす
    るＤＮＡを発現させ得る条件下で培養する工程、および
    前記ハイブリッド蛋白質受容体を発現させ、これを回収
    する工程、を含む方法。