CN115281152B - 一种小鼠狼疮脑病模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及狼疮脑病研究领域，具体而言，涉及一种小鼠狼疮脑病模型的构建方法。本发明所述方法是通过向小鼠脑内注射MRL/Lpr狼疮小鼠脾脏CD4+T细胞诱导正常小鼠狼疮脑病的发生，构建小鼠狼疮脑病模型。本发明提供了一种新的小鼠狼疮脑病模型的构建方法，采用脑内注射的方式，在短时间内单纯诱导狼疮脑病的发生，未发现其它伴随疾病的发生。较现有造模方法能够更加单纯的聚焦于狼疮脑病疾病本身，且造模成功率高，造模方法简单，造模周期短，造模存活率高。能够有效地诱导正常小鼠出现认知功能障碍、抑郁等狼疮脑病的相应症状。
Description
技术领域
本发明涉及狼疮脑病研究领域或小鼠模型构建领域，具体而言，涉及一种小鼠狼疮脑病模型的构建方法。
背景技术
系统性红斑狼疮会导致多种神经精神综合征的发生，包括抑郁、认知功能损害、癫痫、脑血管病等狼疮脑病相关症状。狼疮脑病是系统性红斑狼疮患者预后不良的重要原因，目前仍然缺乏有效防治狼疮脑病的药物和策略。因此，狼疮脑病的研究至关重要，而建立有效的狼疮脑病小鼠模型是研究狼疮脑病的基础和关键环节。
目前狼疮脑病动物模型主要分为两大类，一类是人工诱导型，一类是自发型。人工诱导型动物模型主要采用自身抗体、抗原或降植烷、咪喹莫特等生物试剂注射入小鼠体内进行诱导狼疮脑病的发生。自发型动物模型包括MRL/MpJ-Faslpr(MRL/Lpr)、BxSB、NZB×NZW F1(NZB/W F1)三种。
上述动物模型对狼疮脑病的研究做出了巨大的贡献，但仍存在一些缺陷：一、无论是人工诱导型还是自发型，均存在造模周期过长的情况，例如降植烷造模法，需要6个月左右的造模时长；MRL/Lpr小鼠至少也需要10周龄以上，才会出现神经精神症状；二、上述造模方法部分伴随着其它非狼疮脑病症状，例如降植烷造模法常常会伴随肠道炎症等；三、由于狼疮脑病往往是系统性红斑狼疮重症的并发症，狼疮症状也会逐渐加重，例如降植烷造模小鼠和MRL/Lpr小鼠的死亡率往往很高，导致实验开展困难。
因此，一种理想的狼疮脑病动物模型的构建方法对于狼疮脑病机制研究意义重大。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术问题，提供一种小鼠狼疮脑病模型的构建方法。本发明提供的狼疮脑病小鼠模型的构建方法，能够在短时间内完成狼疮脑病的诱导，操作方便，模型构建精准且存活率高。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种小鼠狼疮脑病模型的构建方法，所述方法是通过向小鼠脑内注射MRL/Lpr狼疮小鼠脾脏CD4+T细胞诱导正常小鼠狼疮脑病的发生，构建小鼠狼疮脑病模型。
本发明中所述正常小鼠为不具有狼疮脑病及其相关生理特征的小鼠。
优选的，所述正常小鼠为C57BL/6小鼠、MRL/MPJ小鼠或BALB/c nude小鼠，更优选为雌雄不限、6-8周龄的C57BL/6小鼠；更优选的所述的MRL/Lpr狼疮小鼠为雌性、不低于20周龄的小鼠。所述技术方案中的正常小鼠均能够通过本发明所述方法实现狼疮脑病小鼠模型的构建，且未发现其他不良反应。
优选的，所述的MRL/Lpr狼疮小鼠脾脏CD4+T细胞配置成浓度为50000cells/μl的细胞悬液进行注射，更优选的注射量为5μl，更优选溶剂为PBS。
更优选的，所述的MRL/Lpr狼疮小鼠脾脏CD4+T细胞采用磁珠分选技术得到；更优选的MRL/Lpr狼疮小鼠脾脏CD4+T细胞分选包括如下步骤：
(1)取材：MRL/Lpr(均为20周，雌性)狼疮小鼠麻醉后断颈处死，取出新鲜脾脏组织；更优选采用1％戊巴比妥钠麻醉；
(2)研磨：将脾脏至于70μm筛网中，加入2ml RPMI 1640培养液，研磨脾脏，收集所有脾脏细胞至15ml离心管中，2000rpm离心5min；
(3)裂红：加入2ml红细胞裂解液充分混匀裂红5min，加入2ml RPMI 1640培养液终止裂解；
(4)计数：用细胞计数仪进行细胞计数，2000rpm离心5min；
(5)分选：每107细胞加入40μl Running Buffer和10μl抗体生物素混合物，充分混匀后4℃孵育5min，每107细胞再次加入30μl Running Buffer和20μl抗生物素微珠，充分混匀4℃孵育10min，每108细胞加入500μl Running Buffer，细胞悬液离心10min，在磁珠分选器上经LS分选柱分选出目标的CD4+T细胞。
优选的，脑室内注射CD4+T细胞进行造模的具体操作为：腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉C57BL/6小鼠(雌雄不限，6-8周)，麻醉后根据C57BL/6小鼠脑图谱定位侧脑室，将前囟Bergma点定义为原点，坐标相对bregma：内外侧(X)＝+1/-1mm，前后端(Y)＝-0.5mm，背腹侧(Z)＝-2.30mm；CD4+T细胞以50000cells/μl重悬在PBS中，将5μl细胞悬液(2.5×105cells)在5min内以1μl/min的速度缓慢注射至小鼠大脑侧脑室，留针5min；注射完成后将小鼠置于恒温箱中直至复苏；注射次数为1次。
优选的，所述诱导为注射后小鼠于常规饲养环境下进行饲养，诱导时间更优选为7天；更优选的，所有动物饲养环境为SPF级，环境温度控制为22±1℃，环境湿度控制在50％-55％，12h明暗循环自动转换。动物随机分笼饲养，自由摄水摄食。所有的动物实验均遵照国家试验动物饲养和使用指南以及浙江中医药大学动物实验中心的动物伦理学条例，实验中尽可能地减少动物的使用数量和痛苦。
优选的，运用新位置识别和强迫游泳行为学作为判断造模成功与否的标准；更优选的，具体为：
(1)新位置识别：在40cm×40cm×40cm的开阔场地中圈出3个5cm×5cm的正方形区域(A、B和C)，在A和B区域放置2个相同物块，物块放置于同一水平线上，将小鼠放入场地中自主探索10min，后取出放回笼子，将场地中1个物块移动至斜对角(C区域)，30min后再次将小鼠放入，使用Any-Maze追踪记录3min内自发活动并导出小鼠探索A和C区域的时间数据进行统计分析；
(2)强迫游泳：使用圆形玻璃容器(直径19cm，高26cm)，水深15cm，水温维持在23-25℃，两个圆形玻璃容器之间用隔板隔开防止小鼠之间相互影响。将小鼠放入容器中使用Any-Maze记录6min；统计小鼠的不动总时间并进行分析。
一种上述小鼠模型的构建方法在动物模型构建领域中的应用。
一种上述小鼠模型的构建方法构建获得的小鼠模型在筛选预防或治疗狼疮脑病药物中的应用。
一种筛选预防或治疗狼疮脑病候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将测试候选药物施用于上述构建方法构建的小鼠模型中；
(2)体外无损动态监测小鼠模型颅内诱导的狼疮脑病；
(3)通过小鼠体内平均荧光强度或平均荧光密度的变化筛选候选药物。
本发明采用脑内注射的方式，单纯诱导狼疮脑病的发生，暂未发现其它伴随疾病的发生，能够更加单纯的对狼疮脑病进行研究。并且，本发明所提供的构建方法在短时间(一周)内即可诱导小鼠狼疮脑病的发生，周期短，且存活率高。同时仅需脑内注射一次狼疮小鼠脾脏CD4+T细胞即可成功诱发狼疮脑病的发生，成功率高。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种新的小鼠狼疮脑病模型的构建方法，较现有造模方法能够更加单纯的聚焦于狼疮脑病疾病本身，且造模成功率高，造模方法简单，造模周期短，造模存活率高。能够有效地诱导正常小鼠出现认知功能障碍、抑郁等狼疮脑病的相应症状。
附图说明
图1是本发明实施例中小鼠CD4+T细胞分选和脑内注射示意图；
图2是本发明实施例中小鼠脑内注射CD4+T细胞流程示意图；
图3是本发明实施例中小鼠新位置识别和强迫游泳行为学实验结果图；
图4是本发明实验例中小鼠脑内注射CD4+T细胞后伊文思蓝染色和平均光密度结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明实施例中，小鼠为C57BL/6小鼠(雌雄不限、6-8周龄)、MRL/Lpr小鼠(雌性、20周龄)和MRL/MPJ小鼠(雌性、20周龄)，均购于浙江中医药大学实验动物中心(实验动物使用许可证号：SYXK(浙)2013-0184)。
实施例：
1、CD4+T细胞分选：
(1)取材：MRL/MPJ和MRL/Lpr(均为20周，雌性)小鼠用1％戊巴比妥钠麻醉后断颈处死，取出新鲜脾脏组织；
(2)研磨：将脾脏至于70μm筛网中(Biosharp，中国)，加入2ml RPMI1640培养液(吉诺生物，中国)，研磨脾脏，收集所有脾脏细胞至15ml离心管中，2000rpm离心5min；
(3)裂红：加入2ml红细胞裂解液(Biosharp，中国)充分混匀裂红5min，加入2mlRPMI 1640培养液终止裂解；
(4)计数：用细胞计数仪(Bio-Rad，美国)进行细胞计数，2000rpm离心5min；
(5)分选：每107细胞加入40μl Running Buffer(Miltenyi Biotec，德国)和10μl抗体生物素混合物(Biotin-Antibody Cocktail，Miltenyi Biotec，德国)，充分混匀后4℃孵育5min，每107细胞再次加入30μl Running Buffer和20μl抗生物素微珠(Anti-BiotinMicroBeads，Miltenyi Biotec，德国)，充分混匀4℃孵育10min，每108细胞加入500μlRunning Buffer，细胞悬液400g离心10min，在磁珠分选器(Miltenyi Biotec，德国)上经LS分选柱(Miltenyi Biotec，德国)分选出CD4+T细胞；其中，MRL/MPJ正常小鼠获得正常CD4+T细胞，MRL/Lpr狼疮小鼠获得MRL/Lpr狼疮小鼠脾脏CD4+T细胞；
2、正常小鼠脑室内注射CD4+T细胞进行造模：
本实施例中以C57BL/6小鼠作为正常小鼠进行相关技术方案和技术效果的体现，但不对本发明的正常小鼠构成限制，本发明提到的正常小鼠品种及其他品种的正常小鼠均可以实现本发明所述技术方案和技术效果；
具体造模步骤为：腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉C57BL/6小鼠。麻醉后根据小鼠脑图谱定位侧脑室，将前囟Bergma点定义为原点，坐标相对bregma：内外侧(X)＝+1/-1mm，前后端(Y)＝-0.5mm，背腹侧(Z)＝-2.30mm。CD4+T细胞以50000cells/μl重悬在1X PBS中，将5μl细胞悬液(2.5×105 cells)在5min内以1μl/min的速度缓慢注射至小鼠大脑侧脑室，注射完成后停针5min，使细胞悬液被脑组织充分吸收。注射完成后将小鼠置于恒温箱中直至复苏。转至正常饲养进行诱导，7天后造模完成，行为学验证造模是否成功，并可以通过伊文思蓝染色进行辅助验证。
3、行为学和伊文思蓝染色验证：运用新位置识别和强迫游泳行为学实验进行认知功能障碍、抑郁等狼疮脑病症状的评估。
(1)新位置识别实验评估小鼠识别记忆能力(作为判断是否造模成功的指标之一)：在40cm×40cm×40cm的开阔场地中圈出3个5cm×5cm的正方形区域(A、B和C)，在A和B区域放置2个相同物块，物块放置于同一水平线上，将小鼠放入场地中自主探索10min，后取出放回笼子，将场地中1个物块移动至斜对角(C区域)，30min后再次将小鼠放入，使用Any-Maze追踪记录3min内自发活动并导出小鼠探索A和C区域的时间数据进行统计分析。
(2)强迫游泳实验评估小鼠抑郁程度(作为判断是否造模成功的指标之一)：使用圆形玻璃容器(直径19cm，高26cm)，水深15cm，水温维持在23-25℃，两个圆形玻璃容器之间用隔板隔开防止小鼠之间相互影响。将小鼠放入容器中使用Any-Maze记录6min。人工统计小鼠的不动总时间并进行分析。
正常小鼠(C57BL/6小鼠)脑内注射正常小鼠(MRL/MPJ小鼠)脾脏CD4+T细胞(对照组，MPJ to C57组)和脑内注射狼疮小鼠(MRL/Lpr小鼠)脾脏CD4+T细胞(模型组，Lpr toC57组)，进行行为学实验。
图3A以及表1结果显示，相比MPJ to C57组，Lpr to C57组小鼠新位置识别百分比明显低于MPJ to C57组，表明脑内注射狼疮小鼠CD4+T细胞小鼠的认知功能降低。图3B及表2结果显示，相比MPJ to C57组，Lpr to C57组小鼠强迫游泳不动总时间显著高于MPJ toC57组，表明脑内注射狼疮小鼠CD4+T细胞小鼠的抑郁程度加重，表明脑内注射狼疮小鼠CD4+T细胞能够诱发狼疮脑病症状的发生。成功构建小鼠狼疮脑病模型。
表1小鼠新位置识别行为学数据表
注：与MPJ to C57组比较，*P<0.05。
表2小鼠强迫游泳行为学数据表
注：与MPJ to C57组比较，*P<0.05。
运用伊文思蓝染色验证血脑屏障通透性是否增加，如图4结果显示，相比MPJ toC57组，Lpr to C57组小鼠伊文思蓝平均光密度显著增强，荧光强度显著高于MPJ to C57组，表明注射狼疮小鼠CD4+T细胞后小鼠血脑屏障通透性明显增加。图4结果显示，Lpr toC57组小鼠伊文思蓝荧光强度显著高于MPJ to C57组。
本发明的小鼠狼疮脑病模型的构建方法能够更加单纯的聚焦于狼疮脑病疾病本身，通过简单的造模方法及较短的诱导时间即可在一周内成功构建小鼠狼疮脑病模型，且构建的小鼠模型成功率高达100％，同时保证100％的存活率，造模成功率高，造模方法简单，造模周期短，造模存活率高。能够有效地诱导正常小鼠出现认知功能障碍、抑郁等狼疮脑病的相应症状，而不具有其他非狼疮脑病症状。并且成功构建的小鼠狼疮脑病模型能够良好用于筛选预防或治疗狼疮脑病药物，用于判断药物对于小鼠特定狼疮脑病症状的预防或治疗效果，避免其他因素的干扰，更优选的，筛选预防或治疗狼疮脑病候选药物的方法可以通过如下步骤进行：
(1)将测试候选药物施用于上述构建方法构建的小鼠模型中；
(2)体外无损动态监测小鼠模型颅内诱导的狼疮脑病；
(3)通过小鼠体内平均荧光强度或平均荧光密度的变化筛选候选药物。
以上所述的实施例只是本发明的较佳方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (8)
1. 一种小鼠狼疮脑病模型的构建方法，其特征在于，所述方法是通过向小鼠脑内注射MRL/Lpr狼疮小鼠脾脏CD4+ T细胞诱导正常小鼠狼疮脑病的发生，构建小鼠狼疮脑病模型；所述的MRL/Lpr狼疮小鼠脾脏CD4+ T细胞配置成浓度为50000 cells/µl的细胞悬液进行注射，注射量为5µl；所述正常小鼠为C57BL/6小鼠、MRL/MPJ小鼠，所述的MRL/Lpr狼疮小鼠为雌性、不低于20周龄的小鼠。
2. 根据权利要求1所述一种小鼠狼疮脑病模型的构建方法，其特征在于，所述的MRL/Lpr狼疮小鼠脾脏CD4+ T细胞采用磁珠分选技术得到。
3. 根据权利要求1所述一种小鼠狼疮脑病模型的构建方法，其特征在于，所述脑内注射的具体操作为：正常小鼠麻醉后根据小鼠脑图谱定位侧脑室，将前囟Bergma点定义为原点，坐标相对bregma：内外侧(X)=+1/-1 mm，前后端(Y)=-0.5 mm，背腹侧(Z)=-2.30 mm；MRL/Lpr狼疮小鼠脾脏CD4+ T细胞悬液缓慢注射至小鼠大脑侧脑室；注射完成后将小鼠置于恒温箱中直至复苏。
4.根据权利要求1所述一种小鼠狼疮脑病模型的构建方法，其特征在于，所述的诱导为注射后小鼠于常规饲养环境下进行饲养。
5.根据权利要求1所述一种小鼠狼疮脑病模型的构建方法，其特征在于，运用新位置识别和强迫游泳行为学作为判断造模成功与否的标准。
6.一种权利要求1-5所述任意一种小鼠狼疮脑病模型的构建方法在动物模型构建领域中的应用。
7.一种权利要求1-5所述任意一种小鼠狼疮脑病模型的构建方法构建获得的小鼠狼疮脑病模型在筛选预防或治疗狼疮脑病药物中的应用。
8.一种筛选预防或治疗狼疮脑病候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将测试候选药物施用于权利要求1-5所述任意一种小鼠狼疮脑病模型的构建方法构建的小鼠狼疮脑病模型中；
(2)体外无损动态监测小鼠狼疮脑病模型颅内诱导的狼疮脑病；
(3)通过小鼠体内平均荧光强度或平均荧光密度的变化筛选候选药物。
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