JP2010099049A - 実験動物とそれを用いた骨疾患改善能の評価方法 - Google Patents
実験動物とそれを用いた骨疾患改善能の評価方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010099049A JP2010099049A JP2008275776A JP2008275776A JP2010099049A JP 2010099049 A JP2010099049 A JP 2010099049A JP 2008275776 A JP2008275776 A JP 2008275776A JP 2008275776 A JP2008275776 A JP 2008275776A JP 2010099049 A JP2010099049 A JP 2010099049A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ifitm5
- gene
- experimental animal
- bone
- animal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000010171 animal model Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 title claims abstract description 30
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 title 1
- 102100039731 Interferon-induced transmembrane protein 5 Human genes 0.000 claims abstract description 65
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 35
- 230000011164 ossification Effects 0.000 claims abstract description 30
- 101710087402 Interferon-induced transmembrane protein 5 Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 101001034831 Homo sapiens Interferon-induced transmembrane protein 5 Proteins 0.000 claims description 63
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 52
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 36
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 31
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 23
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims description 13
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 claims description 13
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 claims description 13
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 8
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 12
- 101100340601 Homo sapiens IFITM5 gene Proteins 0.000 description 82
- 101150052656 IFITM5 gene Proteins 0.000 description 82
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 52
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 42
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 35
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 208000004434 Calcinosis Diseases 0.000 description 21
- 230000002308 calcification Effects 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 16
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 14
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 12
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 10
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 9
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 8
- 108090000573 Osteocalcin Proteins 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 102100022584 3-keto-steroid reductase/17-beta-hydroxysteroid dehydrogenase 7 Human genes 0.000 description 5
- 101001045215 Homo sapiens 3-keto-steroid reductase/17-beta-hydroxysteroid dehydrogenase 7 Proteins 0.000 description 5
- 101000806266 Homo sapiens Very-long-chain 3-oxoacyl-CoA reductase Proteins 0.000 description 5
- 102000004067 Osteocalcin Human genes 0.000 description 5
- 102100037438 Very-long-chain 3-oxoacyl-CoA reductase Human genes 0.000 description 5
- 230000037182 bone density Effects 0.000 description 5
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 5
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 4
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 description 3
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 3
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 3
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 3
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004373 mandible Anatomy 0.000 description 3
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 3
- 210000002050 maxilla Anatomy 0.000 description 3
- 230000004072 osteoblast differentiation Effects 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 FBBP11 Proteins 0.000 description 2
- DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N Glycerol 2-phosphate Chemical compound OCC(CO)OP(O)(O)=O DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000891028 Homo sapiens Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP11 Proteins 0.000 description 2
- 102100040348 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP11 Human genes 0.000 description 2
- 101100028227 Rattus norvegicus Bglap gene Proteins 0.000 description 2
- 101150086605 Runx2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000007849 functional defect Effects 0.000 description 2
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000001001 laser micro-dissection Methods 0.000 description 2
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000623 ulna Anatomy 0.000 description 2
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000015775 Core Binding Factor Alpha 1 Subunit Human genes 0.000 description 1
- 108010024682 Core Binding Factor Alpha 1 Subunit Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 101710174204 Cyclic AMP-responsive element-binding protein 3-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101001034844 Homo sapiens Interferon-induced transmembrane protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001034842 Homo sapiens Interferon-induced transmembrane protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001034846 Homo sapiens Interferon-induced transmembrane protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000016921 Integrin-Binding Sialoprotein Human genes 0.000 description 1
- 108010028750 Integrin-Binding Sialoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102100040021 Interferon-induced transmembrane protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100040020 Interferon-induced transmembrane protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100040035 Interferon-induced transmembrane protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 208000029725 Metabolic bone disease Diseases 0.000 description 1
- 101100340602 Mus musculus Ifitm5 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010031243 Osteogenesis imperfecta Diseases 0.000 description 1
- 206010049088 Osteopenia Diseases 0.000 description 1
- 102000004264 Osteopontin Human genes 0.000 description 1
- 108010081689 Osteopontin Proteins 0.000 description 1
- 201000000023 Osteosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 208000006735 Periostitis Diseases 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 235000013290 Sagittaria latifolia Nutrition 0.000 description 1
- 102000002624 Sp7 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010043267 Sp7 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 1
- 239000002313 adhesive film Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000018678 bone mineralization Effects 0.000 description 1
- 230000037118 bone strength Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000003109 clavicle Anatomy 0.000 description 1
- 235000015246 common arrowhead Nutrition 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 231100001129 embryonic lethality Toxicity 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002082 fibula Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 210000001847 jaw Anatomy 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004705 lumbosacral region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000004579 marble Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001785 maturational effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000009245 menopause Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 1
- 210000000537 nasal bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000024121 nodulation Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 208000005368 osteomalacia Diseases 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000003254 palate Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 210000003460 periosteum Anatomy 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 208000007442 rickets Diseases 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Abstract
【課題】長期間の飼育が可能でかつ、他の組織に影響を与えない骨疾患モデル動物と、これを用いた骨疾患改善能の評価方法を提供する。
【解決手段】骨形成能が欠損した実験動物であって、自然体で有されるべきInterferon induced transmembrane protein5(IFITM5)遺伝子領域の一部又は全部、あるいはこの遺伝子の上流プロモーター領域が改変されている、骨形成能が欠損した実験動物。
【選択図】図5
【解決手段】骨形成能が欠損した実験動物であって、自然体で有されるべきInterferon induced transmembrane protein5(IFITM5)遺伝子領域の一部又は全部、あるいはこの遺伝子の上流プロモーター領域が改変されている、骨形成能が欠損した実験動物。
【選択図】図5
Description
本発明は、骨形成能が欠損した実験動物とそれを用いた骨疾患改善能の評価方法に関する。
これまで、骨形成不全症、骨軟化症、くる病、骨減少症、骨粗鬆症、骨硬化症、大理石病、鎖骨頭蓋異形成症、等の骨疾患に関する基礎的研究、骨疾患の治療薬の開発等に使用するための適当なモデル動物は存在しなかった。そのため、たとえば骨粗鬆症に関しては、卵巣摘出動物が主に使用されている。また、骨粗鬆症モデル動物として小胞体ストレスセンサーOASIS遺伝子欠損マウス(特許文献1)が存在するが、この遺伝子は骨芽細胞以外の細胞でも発現しているため、骨組織以外への影響が考えられ骨組織のみの正確な解析は困難であった。
骨芽細胞の分化に重要な役割を果たす転写因子Cbfa1/Runx2のノックアウトマウスは、軟骨形成および骨形成に重大な影響を及ぼすが、胎生致死(非特許文献1)のためモデル動物として使用することはできない。また、骨芽細胞特異的で骨芽細胞の分化に重要なもう一つの転写因子Ostrixのノックアウトマウスは骨量が少なく、特に鎖骨が未発達であるが、誕生後数十分内に呼吸障害で死に至るため(非特許文献2)モデル動物として使用できない。
また、骨芽細胞特異的で、かつ骨芽細胞の分化成熟の後期過程である石灰化期で発現量が増加するタンパク質としてオステオカルシンが知られている。しかしながら、オステオカルシン遺伝子ノックアウトマウスは骨量が増加することから、オステオカルシンは過剰な骨形成を抑制する機能を有することが報告されている(非特許文献3)。これまで骨芽細胞に特異的でかつ骨形成の促進に関与する遺伝子またはタンパク質は見出されていなかった。したがって、骨芽細胞に特異的でかつ骨形成を促進する遺伝子を改変した骨疾患モデル動物は存在しない。
PCT/JP2006/319628
Komori, T. et al. Target disruption of Cbfa1 results in a complete lack of bone formation owing to maturational arrest of osteoblasts. Cell 89: 755-764 (1997)
Nakashima, K. e al., The novel zinc finger-containing transcription factor Osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell 108: 17-29 (2002)
Ducy, P. et al., Increased bone formation in osteocalcin-deficient mice. Nature 382: 448-452 (1996)
Hanagata, N. et al., Phenotype and expression pattern of osteoblast-like cells cultured on polystyrene and hydroxyapatite with pre-adsorbed type-I collagen. Journal of Biomedical Materials Research Part A 83(2): 362-371 (2007)
本発明は、このような背景から、長期間の飼育が可能でかつ、他の組織に影響を与えない骨疾患モデル動物とこれを用いた骨疾患改善能の評価方法を提供することを目的とした。
発明1の実験動物は、 骨形成能が欠損した実験動物であって、自然体で有されるべきInterferon induced transmembrane protein5 (以下IFITM5と記す。)遺伝子領域の一部又は全部あるいはこの遺伝子の上流プロモーター領域が改変されていることを特徴とする。
発明2は、発明1の実験動物において、前記遺伝子改変は対立遺伝子の片方のみが改変されたヘテロ接合体であることを特徴とする。
発明2は、発明1の実験動物において、前記遺伝子改変は対立遺伝子の片方のみが改変されたヘテロ接合体であることを特徴とする。
発明3は、発明1の実験動物において、前記遺伝子改変は対立遺伝子の両方が改変されたホモ接合体であることを特徴とする。
発明4は、発明1から3のいずれかの実験動物において、前記遺伝子改変を全身に及ぼさせてあることを特徴とする。
発明5は、発明1から3のいずれかの実験動物において、前記遺伝子改変を特定の部位のみに生じさせてあることを特徴とする。
発明6は、骨形成能が欠損した実験動物であって、発明1から5のいずれかの実験動物の子孫であることを特徴とする。
発明7は、発明6の実験動物において、発明1から5のいずれかの実験動物同士の交配によるものであることを特徴とする。
発明8は、発明6の実験動物において、発明1から5のいずれかの実験動物と前記遺伝子改変が存在しない実験動物との交配によるものであることを特徴とする。
発明9の骨疾患改善能の評価方法は、発明1から8のいずれかの実験動物と前記遺伝子改変が存在しない実験動物とに被験物質を投与し、両実験動物の表現型あるいは骨形成関連マーカー物質の生成量をそれぞれ測定して、両者を比較することを特徴とする。
発明10の骨疾患改善能の評価方法は、発明1から8のいずれかの実験動物に被験物質を投与したものと投与しないものとを作り、両実験動物の表現型あるいは骨形成関連マーカー物質の生成量をそれぞれ測定して、両者を比較することを特徴とする。
発明者は、IFITM5が骨形成に関与することをin vitroで見出し(非特許文献4、Table 1)、さらにこの遺伝子の機能について調べ、以下に記載する事実を得た。
図1aに示すようにマウス骨芽細胞を適当な培地で培養すると骨芽細胞が成熟し石灰化により骨結節を形成する。骨芽細胞が石灰化する時期にはオステオカルシン遺伝子(Bglap1/2)の発現が誘導されることが知られているが、IFITM5遺伝子の発現はBglap2と同様に石灰化期に発現が誘導された。IFITM5遺伝子の発現誘導とともにタンパク質レベルでも発現量が増加していることを確認した。
また、骨形成促進因子であるBMP−2を添加すると骨結節の増加に伴いIFITM5遺伝子の発現量も増加し、一方、骨形成抑制因子であるインターロイキン1(IL−1)を添加すると骨結節の減少に伴いIFITM5遺伝子の発現量も減少した(図1b, c)。
これらのことから、IFITM5は骨形成に関与することが示唆された。
図1aに示すようにマウス骨芽細胞を適当な培地で培養すると骨芽細胞が成熟し石灰化により骨結節を形成する。骨芽細胞が石灰化する時期にはオステオカルシン遺伝子(Bglap1/2)の発現が誘導されることが知られているが、IFITM5遺伝子の発現はBglap2と同様に石灰化期に発現が誘導された。IFITM5遺伝子の発現誘導とともにタンパク質レベルでも発現量が増加していることを確認した。
また、骨形成促進因子であるBMP−2を添加すると骨結節の増加に伴いIFITM5遺伝子の発現量も増加し、一方、骨形成抑制因子であるインターロイキン1(IL−1)を添加すると骨結節の減少に伴いIFITM5遺伝子の発現量も減少した(図1b, c)。
これらのことから、IFITM5は骨形成に関与することが示唆された。
IFITM5遺伝子はIFITMファミリーのメンバーとして知られている。IFITMファミリーはマウスでは少なくとも5つの機能的なメンバー(IFITM1, IFITM2, IFITM3, IFITM5, IFITM6)が知られているが、骨結節の増減と正の相関があるのはIFITM5だけである(図1d)。
16.5日目のマウス胚のin situハイブリダイゼーションによりIFITM5遺伝子の発現組織を調べたところ、図2に示すように腰椎、胸椎、口蓋骨、蝶骨、下顎骨、頭蓋骨、上顎骨、鼻骨、大腿骨、脛骨、指骨など軟骨内骨化および膜性骨化の両骨組織で発現が認められ、他の組織での発現は認められなかった。また、骨組織においては、軟骨細胞では発現せず、特に骨膜の周囲に位置する骨芽細胞、海綿骨周囲に位置する骨芽細胞において顕著に発現していた。これらのことから、IFITM5遺伝子は骨芽細胞でのみ発現する骨芽細胞特異的遺伝子であるといえる。
以上の事実からIFITM5は骨形成に関与し、かつ骨芽細胞に特異的であることが示唆されたため、これを利用して新たな実験動物のこの遺伝子改変動物の作製に至った。
以上の事実からIFITM5は骨形成に関与し、かつ骨芽細胞に特異的であることが示唆されたため、これを利用して新たな実験動物のこの遺伝子改変動物の作製に至った。
本発明のIFITM5遺伝子改変非ヒト動物およびその一部により、これまで不明であった骨形成の分子機構解明のための有用なモデルとして、また、IFITM5が様々な骨疾患にどのように関与するかを調べる有用なモデルとして役立つ。
本発明の骨疾患改善評価方法によると、骨芽細胞に作用して骨疾患を治療しうる薬剤の開発、および骨疾患の診断方法の開発に貢献することができる。
また、動脈硬化や乳癌でも骨形成に類似した石灰化現象が認められ、骨芽細胞あるいは骨芽細胞に類似した細胞の関与が報告されている。IFITM5遺伝子改変非ヒト動物あるいはIFITM5遺伝子改変非ヒト動物の一部は、これらの疾患による石灰化機序、治療薬、診断薬および診断方法の開発への利用も期待できる。
さらに、IFITM5の一塩基多型(SNP)や変異を有する動物の表現型の解析により骨疾患の診断が可能となる。
本発明の骨疾患改善評価方法によると、骨芽細胞に作用して骨疾患を治療しうる薬剤の開発、および骨疾患の診断方法の開発に貢献することができる。
また、動脈硬化や乳癌でも骨形成に類似した石灰化現象が認められ、骨芽細胞あるいは骨芽細胞に類似した細胞の関与が報告されている。IFITM5遺伝子改変非ヒト動物あるいはIFITM5遺伝子改変非ヒト動物の一部は、これらの疾患による石灰化機序、治療薬、診断薬および診断方法の開発への利用も期待できる。
さらに、IFITM5の一塩基多型(SNP)や変異を有する動物の表現型の解析により骨疾患の診断が可能となる。
IFITM5遺伝子を欠損したノックアウトマウスの作製
本発明における遺伝子改変とは、内因性のIFITM5遺伝子の塩基配列のうち、1塩基以上に置換、欠失、挿入の操作を行うこと(ノックアウト)、あるいは外因性のIFITM5遺伝子を染色体上に導入する操作を行うこと(トランスジェニック)である。前者では、IFITM5遺伝子の機能的欠損を引き起こし、後者ではIFITM5遺伝子の機能的亢進を引き起こす。
本発明における遺伝子改変とは、内因性のIFITM5遺伝子の塩基配列のうち、1塩基以上に置換、欠失、挿入の操作を行うこと(ノックアウト)、あるいは外因性のIFITM5遺伝子を染色体上に導入する操作を行うこと(トランスジェニック)である。前者では、IFITM5遺伝子の機能的欠損を引き起こし、後者ではIFITM5遺伝子の機能的亢進を引き起こす。
これらの操作が加えられた改変動物は、IFITM5遺伝子の対立遺伝子の片方のみに操作が加えられたヘテロ接合体、および両方に操作が加えられたホモ接合体、およびそれらの出生前の胎仔も含まれる。
前記遺伝子の改変は、ノックアウトの場合、内因性のIFITM5遺伝子の少なくとも一部を欠損させる変異を導入し、機能的欠損を有するように操作する。マウスIFITM5のゲノムDNAはBac cloneなどから単離することができる。トランスジェニックの場合は、外因性のIFITM5遺伝子を用いるが、ヒトの疾患モデルのためにはヒトのIFITM5遺伝子を使用することが望ましい。ヒトIFITM5遺伝子の塩基配列はGenbank アクセッション番号NM_001025295、BC150562、BC150563などで公表されており、公知の手法により単離可能である。
現在まで、マウス、ラット、ウシ、イヌ、ニワトリでIFITM5の存在が知られているが、ハムスター、ウサギ、モルモット、ネコ、サル等の実験動物、およびヒツジ、ウマ、ブタ等の家畜などでも同様にIFITM5類似遺伝子の存在が確認されているのでこれらを利用することも可能である。
本発明のノックアウト動物は公知の方法で作製することができる。
ノックアウト動物を作製するためにはIFITM5のターゲティングベクターを設計し構築する。IFITM5遺伝子のターゲティングベクターは当該遺伝子の全部あるいは一部を喪失あるいは破壊させ、機能を失わせるか、あるいは機能を低下させるものである。ここで機能とは、骨形成あるいは石灰化に関する機能のことを言う。
ターゲティングベクターとしては、IFITM5遺伝子を含むゲノムDNAに対して相同組換えを起こすように設計されたIFITM5遺伝子に相同な2つのポリヌクレオチド、および選択マーカーを含むことが好ましい。IFITM5遺伝子に相同な2本のポリヌクレオチドは相同領域が長いほど良く、また長さは0.5〜20Kb、好ましくは1〜10Kbである。
ノックアウト動物を作製するためにはIFITM5のターゲティングベクターを設計し構築する。IFITM5遺伝子のターゲティングベクターは当該遺伝子の全部あるいは一部を喪失あるいは破壊させ、機能を失わせるか、あるいは機能を低下させるものである。ここで機能とは、骨形成あるいは石灰化に関する機能のことを言う。
ターゲティングベクターとしては、IFITM5遺伝子を含むゲノムDNAに対して相同組換えを起こすように設計されたIFITM5遺伝子に相同な2つのポリヌクレオチド、および選択マーカーを含むことが好ましい。IFITM5遺伝子に相同な2本のポリヌクレオチドは相同領域が長いほど良く、また長さは0.5〜20Kb、好ましくは1〜10Kbである。
本発明で用いられるターゲティングベクターの選択マーカーはポジティブ選択マーカー、ネガティブ選択マーカーあるいは両方を含むことができる。ポジティブ選択マーカーとしては例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などがあり、ネガティブ選択マーカーとしては例えば、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素A遺伝子などを使用することができる。
ターゲティングベクターの基本骨格となるベクターは特に限定されず、大腸菌などの形質転換を行う細胞中で自己複製できるものであれば良い。たとえば、pGEM−1(Promega社)等が使用できる。
ターゲティングベクターの基本骨格となるベクターは特に限定されず、大腸菌などの形質転換を行う細胞中で自己複製できるものであれば良い。たとえば、pGEM−1(Promega社)等が使用できる。
本発明のターゲティングベクターは公知の方法により構築できる。すなわち、IFITM5に相同な2本のポリヌクレオチドおよび選択マーカーをベクターに挿入することにより構築できる。
構築したターゲティングベクターを用いて相同組換えを行う。相同組換えはES細胞を用いることが望ましい。ES細胞はTT2細胞が多く使用されるが、AB−1細胞、J1細胞、R1細胞などを使用しても良い。
ターゲティングベクターをES細胞に導入する方法としては、エレクロポレーション法、DEAE−デキストラン法、リポソーム法などがあり、いずれの方法でも良い。
IFITM5遺伝子がターゲティングされているかどうかは、たとえばターゲティングベクターの外側のゲノムDNA領域上、およびターゲティングベクター配列のうち薬剤耐性遺伝子上などから設計したプライマーを用いてPCRを行うことにより確認できる。また、ターゲティングベクターに含まれないゲノム領域を認識するプローブを設計し、IFITM5遺伝子を含むゲノムを適当な制限酵素で処理することにより得られるゲノム断片と、上記のプローブをハイブリダイズするサザンブロットによっても確認できる。
構築したターゲティングベクターを用いて相同組換えを行う。相同組換えはES細胞を用いることが望ましい。ES細胞はTT2細胞が多く使用されるが、AB−1細胞、J1細胞、R1細胞などを使用しても良い。
ターゲティングベクターをES細胞に導入する方法としては、エレクロポレーション法、DEAE−デキストラン法、リポソーム法などがあり、いずれの方法でも良い。
IFITM5遺伝子がターゲティングされているかどうかは、たとえばターゲティングベクターの外側のゲノムDNA領域上、およびターゲティングベクター配列のうち薬剤耐性遺伝子上などから設計したプライマーを用いてPCRを行うことにより確認できる。また、ターゲティングベクターに含まれないゲノム領域を認識するプローブを設計し、IFITM5遺伝子を含むゲノムを適当な制限酵素で処理することにより得られるゲノム断片と、上記のプローブをハイブリダイズするサザンブロットによっても確認できる。
相同組換えされたES細胞は、8細胞期胚あるいは胚盤胞の胚内にマイクロマニピュレーション法、凝集法などの方法により移植する。8細胞期胚あるいは胚盤胞の胚は、FSH様作用を有するPMSGおよびLH作用を有するhCGなどのホルモン剤により過排卵処理した雌動物と雄動物を交配させることにより得ることが出来る。
ES細胞を移植されたキメラ胚は動物、好ましくは偽妊娠動物(去勢した雄動物と交配した雌動物)の子宮に移入する。キメラ胚を移入された動物はキメラ動物を出産する。キメラ動物は体色や被毛色など公知の方法により確認できる。
キメラ動物を成熟するまで飼育し、雄のキメラ動物と野生型の雌動物と交配させる。誕生した動物の体色、被毛色などによりES細胞がキメラ動物の生殖系列に導入されたことを確認することができる。胚内に移植された相同組換えES細胞が生殖系列に導入されたIFITM5遺伝子欠損動物はヘテロ接合体動物である。
このヘテロ接合体の雄動物とヘテロ接合体の雌動物を交配させることによりIFITM5遺伝子欠損ホモ接合体動物を得ることができる。ホモ接合体動物の確認は、たとえば尻尾などから染色体DNAを抽出しPCR等により行うことができる。
本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、IFITM5タンパク質の発現が調節されている。
マウスの場合、IFITM5遺伝子欠損マウスはIFITM5タンパク質の発現が抑制され、骨量が野生型に比べて減少しているが、野生型マウスと同じ飼育条件下でも発生、繁殖、寿命には欠陥が生じない。
ES細胞を移植されたキメラ胚は動物、好ましくは偽妊娠動物(去勢した雄動物と交配した雌動物)の子宮に移入する。キメラ胚を移入された動物はキメラ動物を出産する。キメラ動物は体色や被毛色など公知の方法により確認できる。
キメラ動物を成熟するまで飼育し、雄のキメラ動物と野生型の雌動物と交配させる。誕生した動物の体色、被毛色などによりES細胞がキメラ動物の生殖系列に導入されたことを確認することができる。胚内に移植された相同組換えES細胞が生殖系列に導入されたIFITM5遺伝子欠損動物はヘテロ接合体動物である。
このヘテロ接合体の雄動物とヘテロ接合体の雌動物を交配させることによりIFITM5遺伝子欠損ホモ接合体動物を得ることができる。ホモ接合体動物の確認は、たとえば尻尾などから染色体DNAを抽出しPCR等により行うことができる。
本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、IFITM5タンパク質の発現が調節されている。
マウスの場合、IFITM5遺伝子欠損マウスはIFITM5タンパク質の発現が抑制され、骨量が野生型に比べて減少しているが、野生型マウスと同じ飼育条件下でも発生、繁殖、寿命には欠陥が生じない。
IFITM5遺伝子改変非ヒト動物あるいはその一部による骨疾患改善物質の探索方法
骨疾患改善物質の評価方法であって、(a)本発明の非ヒト動物あるいはその一部に被験物質を投与あるいは接触させ、(b)前記被験物質を投与あるいは接触させた非ヒト動物あるいはその一部における表現型あるいは骨形成関連マーカー物質の生成量を調べ、被験物質を投与あるいは接触させていない対照の非ヒト動物あるいはその一部における表現型あるいは骨形成関連マーカー物質の生成量と比較し、(c)(b)の結果に基づいて被験物質を選択する骨疾患の改善物質を評価することを特徴とする骨疾患改善物質の探索方法を提供する。
骨疾患改善物質の評価方法であって、(a)本発明の非ヒト動物あるいはその一部に被験物質を投与あるいは接触させ、(b)前記被験物質を投与あるいは接触させた非ヒト動物あるいはその一部における表現型あるいは骨形成関連マーカー物質の生成量を調べ、被験物質を投与あるいは接触させていない対照の非ヒト動物あるいはその一部における表現型あるいは骨形成関連マーカー物質の生成量と比較し、(c)(b)の結果に基づいて被験物質を選択する骨疾患の改善物質を評価することを特徴とする骨疾患改善物質の探索方法を提供する。
ここで、非ヒト動物の一部とは、組織または細胞などである。また、投与は経口投与と非経口投与であり、非経口投与としては、例えば静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、気道内等の全身投与、あるいは骨、骨髄への局所投与等が挙げられる。表現型とは、体長、体重等、および骨量、骨密度、骨強度など、骨組織形態計測に利用されている指標である。骨形成関連マーカー物質とはアルカリフォスファターゼ、I型コラーゲン、オステオポンチン、オステオカルシン、骨シアロタンパク質など、骨形成に関連して生成される物質である。
本発明の探索方法の対象となる被験物質は特に限定されるものではない。たとえば、アミノ酸、タンパク質、核酸、多糖、合成物質、天然物質などを挙げることができる。これらの被験物質は単独でも組み合わせても良い。
このようにして選択された被験物質はIFITM5遺伝子あるいはIFITM5タンパク質に障害のある骨疾患の改善薬として有効である。
このようにして選択された被験物質はIFITM5遺伝子あるいはIFITM5タンパク質に障害のある骨疾患の改善薬として有効である。
IFITM5遺伝子あるいはIFITM5タンパク質を測定することによる骨疾患改善物質の探索方法
骨疾患改善物質の評価方法であって、(a)非ヒト動物あるいはその一部に被験物質を投与あるいは接触させ、(b)非験物質を投与あるいは接触させた非ヒト動物あるいはその一部のIFITM5遺伝子あるいはIFITM5タンパク質の発現量を調べ、非験物質を投与あるいは接触させていない非ヒト動物あるいはその一部のIFITM5遺伝子あるいはIFITM5タンパク質の発現量と比較し、(c)(b)の結果に基づいて被験物質の骨疾患改善能を評価することを特徴とする骨疾患改善物質を探索する方法を提供する。
IFITM5遺伝子の発現量を調べる方法は、特に限定されるものではく、例えばRT−PCR、リアルタイム定量PCR、ノーザンハイブリダイゼーションなどが挙げられる。
骨疾患改善物質の評価方法であって、(a)非ヒト動物あるいはその一部に被験物質を投与あるいは接触させ、(b)非験物質を投与あるいは接触させた非ヒト動物あるいはその一部のIFITM5遺伝子あるいはIFITM5タンパク質の発現量を調べ、非験物質を投与あるいは接触させていない非ヒト動物あるいはその一部のIFITM5遺伝子あるいはIFITM5タンパク質の発現量と比較し、(c)(b)の結果に基づいて被験物質の骨疾患改善能を評価することを特徴とする骨疾患改善物質を探索する方法を提供する。
IFITM5遺伝子の発現量を調べる方法は、特に限定されるものではく、例えばRT−PCR、リアルタイム定量PCR、ノーザンハイブリダイゼーションなどが挙げられる。
IFITM5タンパク質の発現量を調べる方法は、特に限定されるものではなく、例えばウエスタンブロッティング法などが挙げられる。
IFITM5遺伝子あるいはIFITM5タンパク質を測定することによる骨疾患の診断方法
被験者あるいは被験動物から組織を採取し、IFITM5遺伝子あるいはIFITM5タンパク質の発現量を測定することにより骨形成能あるいは骨疾患の診断を行う方法を提供する。
IFITM5遺伝子およびIFITM5タンパク質の測定方法は特に限定されるものではなく、前記の例と同様な方法で測定することができる。
被験者あるいは被験動物から組織を採取し、IFITM5遺伝子あるいはIFITM5タンパク質の発現量を測定することにより骨形成能あるいは骨疾患の診断を行う方法を提供する。
IFITM5遺伝子およびIFITM5タンパク質の測定方法は特に限定されるものではなく、前記の例と同様な方法で測定することができる。
IFITM5遺伝子ノックアウトES細胞の作製
IFITM5遺伝子のゲノムDNAのクローンは、市販のBac clon (ID: RP23−388N13)から得た。ターゲティングベクターはNeoカセットを含むベクターの両側にBac cloneから切り出したゲノムをShort arm、Long armとしてクローニングした。さらにネガティブセレクションマーカーとしてDTA(ジフテリア毒素)を挿入し、コンストラクトとして(short−Neo−long−DTA)を作製した(図3)。
次に、ターゲティングベクターより直鎖状にしたDNAをエレクトロポレーションにより4−7x107個のES細胞に導入した。G418により1週間選択をおこなった後、生き残ったコロニーを数百個ピックアップした。ピックアップしたES細胞はさらに1週間培養した後、ゲノムDNAを抽出し、PCR法を用いて相同組換えクローンをスクリーニングした。ここで得た陽性クローンをさらに5‘側、3’側に設計した2組のプローブを用いてサザンブロットを行い、ターゲティングベクターの相同組換え体を確認した(図4)。
IFITM5遺伝子のゲノムDNAのクローンは、市販のBac clon (ID: RP23−388N13)から得た。ターゲティングベクターはNeoカセットを含むベクターの両側にBac cloneから切り出したゲノムをShort arm、Long armとしてクローニングした。さらにネガティブセレクションマーカーとしてDTA(ジフテリア毒素)を挿入し、コンストラクトとして(short−Neo−long−DTA)を作製した(図3)。
次に、ターゲティングベクターより直鎖状にしたDNAをエレクトロポレーションにより4−7x107個のES細胞に導入した。G418により1週間選択をおこなった後、生き残ったコロニーを数百個ピックアップした。ピックアップしたES細胞はさらに1週間培養した後、ゲノムDNAを抽出し、PCR法を用いて相同組換えクローンをスクリーニングした。ここで得た陽性クローンをさらに5‘側、3’側に設計した2組のプローブを用いてサザンブロットを行い、ターゲティングベクターの相同組換え体を確認した(図4)。
IFITM5遺伝子ノックアウトマウスの作製
実施例1で作製されたIFITM5遺伝子が破壊されたES細胞をマイクロインジェクションにより交配後3.5日目のC57BL6の胚盤胞に移入し、偽妊娠マウスの子宮に移した。得られたキメラマウスをC57BL6マウスと交配し、生殖系列にIFITM5遺伝子の破壊が導入されたヘテロ接合マウスを得た。さらに、これらのヘテロ接合マウス同士を交配させることにより本発明のIFITM5遺伝子がノックアウトされた遺伝子改変動物を得た。
本発明におけるIFITM5遺伝子欠損マウスは野生型マウスと同じ飼育条件で生育できた。
実施例1で作製されたIFITM5遺伝子が破壊されたES細胞をマイクロインジェクションにより交配後3.5日目のC57BL6の胚盤胞に移入し、偽妊娠マウスの子宮に移した。得られたキメラマウスをC57BL6マウスと交配し、生殖系列にIFITM5遺伝子の破壊が導入されたヘテロ接合マウスを得た。さらに、これらのヘテロ接合マウス同士を交配させることにより本発明のIFITM5遺伝子がノックアウトされた遺伝子改変動物を得た。
本発明におけるIFITM5遺伝子欠損マウスは野生型マウスと同じ飼育条件で生育できた。
実施例2で得たマウスの表現型
実施例2で得たIFITM5遺伝子欠損マウスは、野生型マウスに比べ体長が小さく、かつ前肢および後肢とも発達不全であった(図5a)。また、本発明におけるIFITM5遺伝子欠損マウスは、軟骨形成には異常は認められなかったが、脛骨および尺骨が湾曲していた(図5b, c)。さらに、IFITM5遺伝子欠損マウスでは、上顎骨および下顎骨の骨化が認められず、頭蓋骨も野生型に比べ薄かった(図5d)。
実施例2で得たIFITM5遺伝子欠損マウスは、野生型マウスに比べ体長が小さく、かつ前肢および後肢とも発達不全であった(図5a)。また、本発明におけるIFITM5遺伝子欠損マウスは、軟骨形成には異常は認められなかったが、脛骨および尺骨が湾曲していた(図5b, c)。さらに、IFITM5遺伝子欠損マウスでは、上顎骨および下顎骨の骨化が認められず、頭蓋骨も野生型に比べ薄かった(図5d)。
実施例2で得た本発明マウスの骨構造
野生型マウスおよび実施例2で得たIFITM5遺伝子欠損マウスから脛骨を摘出し、μ−CTにより二次海綿骨部位の立体構造を調べた(図6a)。さらにこの画像から骨形態計測のパラメーターをTRI/3D−BON(ラトックシステムエンジニアリング)により求めた(図6b,c)。二次海綿骨の骨組織に対する割合(BV/TV)および二次海綿骨の骨密度(Tr.BMD)はIFITM5遺伝子欠損マウスで低かった。
これは、IFITM5遺伝子欠損マウスでは骨量が野生型に比べて低下していることを示している。IFITM5遺伝子欠損マウスでは海綿骨数(Tb.N)は野生型と変わらないが、海綿骨幅(Tb.Th)が低いことから、IFITM5遺伝子欠損マウスでは野生型マウスに比べ海綿骨が薄いことがわかる。また、皮質骨の骨密度(Cor.BMD)および皮質骨量(Cor.BMC)はIFITM5遺伝子欠損マウスが野生型マウスに比べ顕著に低く、IFITM5遺伝子欠損マウスは皮質骨量の重大な低下を引き起こすことがわかる。
さらに、図7に示すようにIFITM遺伝子欠損マウスの二次海綿骨では、骨粗鬆症の指標であるV*m.spac(大きい値ほど骨粗鬆症の度合いが大きい)は野生型に比べ大きく、V*tr.(小さい値ほど骨粗鬆症の度合いが大きい)は野生型に比べて小さいことから、IFITM5遺伝子欠損マウスでは骨粗鬆症の度合いが大きいことを示していた。
野生型マウスおよび実施例2で得たIFITM5遺伝子欠損マウスから脛骨を摘出し、μ−CTにより二次海綿骨部位の立体構造を調べた(図6a)。さらにこの画像から骨形態計測のパラメーターをTRI/3D−BON(ラトックシステムエンジニアリング)により求めた(図6b,c)。二次海綿骨の骨組織に対する割合(BV/TV)および二次海綿骨の骨密度(Tr.BMD)はIFITM5遺伝子欠損マウスで低かった。
これは、IFITM5遺伝子欠損マウスでは骨量が野生型に比べて低下していることを示している。IFITM5遺伝子欠損マウスでは海綿骨数(Tb.N)は野生型と変わらないが、海綿骨幅(Tb.Th)が低いことから、IFITM5遺伝子欠損マウスでは野生型マウスに比べ海綿骨が薄いことがわかる。また、皮質骨の骨密度(Cor.BMD)および皮質骨量(Cor.BMC)はIFITM5遺伝子欠損マウスが野生型マウスに比べ顕著に低く、IFITM5遺伝子欠損マウスは皮質骨量の重大な低下を引き起こすことがわかる。
さらに、図7に示すようにIFITM遺伝子欠損マウスの二次海綿骨では、骨粗鬆症の指標であるV*m.spac(大きい値ほど骨粗鬆症の度合いが大きい)は野生型に比べ大きく、V*tr.(小さい値ほど骨粗鬆症の度合いが大きい)は野生型に比べて小さいことから、IFITM5遺伝子欠損マウスでは骨粗鬆症の度合いが大きいことを示していた。
実施例2で得た誕生後2日目のIFITM5遺伝子欠損マウスおよび野生型マウスの頭蓋骨から骨芽細胞を単離し、5600細胞/cm2の濃度でカルチャーディッシュに播種し、10%FBS, 100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、50μg/mlのアスコルビン酸、2mmol/lのβーグリセロリン酸を含む培地で培養した。培養後40日目以降で野生型マウスから単離した骨芽細胞は石灰化による骨結節が認められたが、IFITM5遺伝子欠損マウスでは石灰化はわずかしか起こらなかった(図8a)。さらに、細胞からRNAを抽出後、逆転写によりcDNAを合成し、5’−cagctcctgggagttacagc−3’および5’−aagtggggaaagggacaaa−3’のプライマーを用いてPCRによってIFITM5遺伝子の発現量を求めた。その結果、野生型マウスでは培養後期にIFITM5遺伝子の顕著な発現増加が認められたのに対し、IFITM5遺伝子欠損マウスでは発現が認められなかった(図8b)。
これにより、野生型マウス骨芽細胞に被験物質を接触させ、接触させない対照の野生型マウス骨芽細胞とのIFITM5遺伝子の発現量を比較することにより、被験物質の骨形成能あるいは骨疾患改善能を評価することができる。
これにより、野生型マウス骨芽細胞に被験物質を接触させ、接触させない対照の野生型マウス骨芽細胞とのIFITM5遺伝子の発現量を比較することにより、被験物質の骨形成能あるいは骨疾患改善能を評価することができる。
実施例2で得た誕生後2日目のIFITM5遺伝子欠損マウスおよび野生型マウスの頭蓋骨から骨芽細胞を単離し、前記した培地にて50日間培養した。培養後40日目以降で野生型マウスから単離した骨芽細胞は石灰化による骨結節が認められたが、IFITM5遺伝子欠損マウスでは石灰化がわずかしか観察されなかった。培養40日目の培養細胞からtotal protein extraction kit (CHEMICON)を用いて抽出したタンパク質をSDS−PAGEにて電気泳動を行った後に、Immobilon−PSQメンブレン(Millipore)にタンパク質を転写した。メンブレンは3%Immunoblot Blocking Reagent(Millipore)(0.05Teen−20を含むPBSに溶解)を用いて、室温で1hrブロッキングを行い、メンブレンを一次抗体としてIFITM5タンパク質のN末端に対するポリクロナル抗体(N末端側peptide 配列:TSYPREDPRAPSSRC)を4℃で一晩インキュベートした。その後、0.05% Teen−20を含むPBSでメンブンレンを3回洗浄後、2次抗体としてHRP−F(ab’)2 of Goat Anti−rabbit IgG(H+L) (ZYMED)を加え、室温で1時間あるいは4℃で一晩インキュベートした。このメンブレンをImmobilon Western Chmilimunescent HRP Substrate( Millipore)を用いて反応させ、IFITM5タンパク質を検出した。その結果、IFITM5遺伝子欠損マウスではIFITM5タンパク質の発現が認められず、野生型マウスでは顕著に発現していた(図8c)。
これにより、野生型マウス骨芽細胞に被験物質を接触させ、接触させない対照の野生型マウス骨芽細胞とのIFITM5タンパク質の発現量を比較することにより、被験物質の骨形成能あるいは骨疾患改善能を評価することができる。
これにより、野生型マウス骨芽細胞に被験物質を接触させ、接触させない対照の野生型マウス骨芽細胞とのIFITM5タンパク質の発現量を比較することにより、被験物質の骨形成能あるいは骨疾患改善能を評価することができる。
実施例2で得た誕生後7日目のマウスの大腿部からKawamoto法(詳しくは下記参考文献参照)によりクライオセクションを調整した。このクライオセクションをメタノールで固定後、ヘマトキシリンとエオシンで染色し(HE染色)、エタノールで脱水処理を行った。この大腿部切片からレーザーマイクロダイセクションで骨芽細胞を切り出し、RNAを回収、cDNAを合成後、前記のプライマーセットでPCRを行いIFITM5遺伝子の発現量を調べた。IFITM5遺伝子欠損マウスでは遺伝子の発現は認められないが、野生型マウスではIFITM5遺伝子が発現していた(図9)。
このような方法により、回収した組織からIFITM5遺伝子の発現量を計測することができ、組織の骨形成能および骨疾患の診断を行うことができる。また、非ヒト動物に被験物質を投与し、投与してない対照の非ヒト動物とIFITM5遺伝子の発現量を測定することにより骨疾患改善物質の探索を行うことができる。これらの診断および探索は、実施例6によるIFITM5タンパク質の測定によって行ってもよい。
参考文献:Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol. Cytol. 66(2): 123-143 (2003)
このような方法により、回収した組織からIFITM5遺伝子の発現量を計測することができ、組織の骨形成能および骨疾患の診断を行うことができる。また、非ヒト動物に被験物質を投与し、投与してない対照の非ヒト動物とIFITM5遺伝子の発現量を測定することにより骨疾患改善物質の探索を行うことができる。これらの診断および探索は、実施例6によるIFITM5タンパク質の測定によって行ってもよい。
参考文献:Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol. Cytol. 66(2): 123-143 (2003)
IFITM5と相互作用するタンパク質群をプルダウン法で得た後、質量分析計により同定した結果、女性ホルモンであるエストラジオールの合成に関与する酵素HSD17B12およびHSD17B7、さらに免疫抑制剤FK506と結合するFKBP11が得られた(図10)。骨粗鬆症の主要な原因として、閉経後に卵巣等から骨組織に供給されるエストラジオール濃度の低下が報告されている。IFITM5はエストラジオール合成に関与する酵素と結合していることから骨粗鬆症との関連が示唆され、IFITM5遺伝子改変動物は骨粗鬆症の発症機序および治療薬の開発に寄与することが期待できる。
Claims (10)
- 骨形成能が欠損した実験動物であって、自然体では有されるべきInterferon induced transmembrane protein5 (以下IFITM5と記す。)遺伝子領域の一部又は全部あるいはこの遺伝子の上流プロモーター領域が改変されていることを特徴とする実験動物。
- 請求項1に記載の実験動物において、前記遺伝子改変は対立遺伝子の片方のみが改変されたヘテロ接合体であることを特徴とする実験動物。
- 請求項1に記載の実験動物において、前記遺伝子改変は対立遺伝子の両方が改変されたホモ接合体であることを特徴とする実験動物。
- 請求項1から3のいずれかに記載の実験動物において、前記遺伝子改変を全身に及ぼさせてあることを特徴とする実験動物。
- 請求項1から3のいずれかに記載の実験動物において、前記遺伝子改変を特定の部位のみに生じさせてあることを特徴とする実験動物。
- 骨形成能が欠損した実験動物であって、請求項1から5のいずれかに記載の実験動物の子孫であることを特徴とする実験動物。
- 請求項6に記載の実験動物において、請求項1から5のいずれかに記載の実験動物同士の交配によるものであることを特徴とする実験動物。
- 請求項6に記載の実験動物において、請求項1から5のいずれかに記載の実験動物と同士と前記遺伝子改変が存在しない実験動物との交配によるものであることを特徴とする実験動物。
- 物質の骨疾患改善能を評価する方法であって、請求項1から8のいずれかに記載の実験動物と前記遺伝子改変が存在しない実験動物とに被験物質を投与し、
両実験動物の表現型あるいは骨形成関連マーカー物質の生成量をそれぞれ測定して、両者を比較することを特徴とする骨疾患改善能の評価方法。 - 物質の骨疾患改善能を評価する方法であって、請求項1から8のいずれかに記載の実験動物に被験物質を投与したものと投与しないものとを作り、両実験動物の表現型あるいは骨形成関連マーカー物質の生成量をそれぞれ測定して、両者を比較することを特徴とする骨疾患改善能の評価方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008275776A JP2010099049A (ja) | 2008-10-27 | 2008-10-27 | 実験動物とそれを用いた骨疾患改善能の評価方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008275776A JP2010099049A (ja) | 2008-10-27 | 2008-10-27 | 実験動物とそれを用いた骨疾患改善能の評価方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010099049A true JP2010099049A (ja) | 2010-05-06 |
Family
ID=42290248
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008275776A Pending JP2010099049A (ja) | 2008-10-27 | 2008-10-27 | 実験動物とそれを用いた骨疾患改善能の評価方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2010099049A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101303958B1 (ko) | 2011-03-30 | 2013-09-06 | 원광대학교산학협력단 | 골아세포 분화 마커 |
WO2015069877A1 (en) * | 2013-11-06 | 2015-05-14 | Shriners Hospitals For Children | Method for treating osteogenesis imperfecta type v |
RU2615902C1 (ru) * | 2016-03-21 | 2017-04-11 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО "СамГМУ" Минздрава России) | Способ моделирования локального снижения минеральной плотности костной ткани у кроликов |
-
2008
- 2008-10-27 JP JP2008275776A patent/JP2010099049A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101303958B1 (ko) | 2011-03-30 | 2013-09-06 | 원광대학교산학협력단 | 골아세포 분화 마커 |
WO2015069877A1 (en) * | 2013-11-06 | 2015-05-14 | Shriners Hospitals For Children | Method for treating osteogenesis imperfecta type v |
RU2615902C1 (ru) * | 2016-03-21 | 2017-04-11 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО "СамГМУ" Минздрава России) | Способ моделирования локального снижения минеральной плотности костной ткани у кроликов |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kuang et al. | Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. | |
Gagliardi et al. | Human stanniocalcin-2 exhibits potent growth-suppressive properties in transgenic mice independently of growth hormone and IGFs | |
RU2654565C2 (ru) | Грызуны с гуманизированным il-7 | |
Lee et al. | Generation and validation of mice carrying a conditional allele of the epidermal growth factor receptor | |
US7858843B2 (en) | Gene disruptions, compositions and methods relating thereto | |
CA2446859A1 (en) | Transgenic animal model of bone mass modulation | |
JP2008517625A (ja) | 分泌されたタンパク質をコードする遺伝子の破壊、それに関連する組成物および方法 | |
JP2008541781A5 (ja) | ||
EP2002714A1 (en) | Novel gene disruptions, compositions and methods relating thereto | |
Jin et al. | Generation of a Mig‐6 conditional null allele | |
JP2010099049A (ja) | 実験動物とそれを用いた骨疾患改善能の評価方法 | |
JP2006506968A (ja) | アグーチ関連蛋白質欠損細胞、非ヒトトランスジェニック動物及びエネルギー代謝を調節する化合物の選択方法 | |
US6642433B1 (en) | Fgl-2 knockout mice | |
JP5888693B2 (ja) | 間質性肺炎モデル及びその用途 | |
US20110173706A1 (en) | Novel gpr101 transgenic mice and methods of use thereof | |
WO2006085673A1 (ja) | 無毛トランスジェニック動物 | |
JPWO2005041648A1 (ja) | 高脂血症・高アルブミン血症モデル動物 | |
JP4696316B2 (ja) | Cd9/cd81二重欠損非ヒト動物 | |
JP2006141329A (ja) | Polθノックアウト動物、並びに免疫機能調節用組成物及びそのスクリーニング方法 | |
CN114466858A (zh) | 一种鉴别能够影响衰老的物质的方法 | |
JP2006325452A (ja) | Tzf/tzf−l遺伝子ノックアウト非ヒト哺乳動物、その作製方法、およびその利用方法 | |
WO2005092090A1 (ja) | 肥満モデル動物及びそれを用いた薬剤評価方法 | |
JP2006025647A (ja) | Fsp27ノックアウト動物 | |
JP2006141283A (ja) | 3−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼの発現が低下したノックアウト非ヒト哺乳動物 | |
JP2010276505A (ja) | 新規癌転移抑制剤の探索法 |