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Gebiet der
Erfindung
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Die
Erfindung befindet auf dem Gebiet des Nachweises von Mikroorganismen
und der Qualitätsüberprüfung von
filtrierbaren und/oder nichtfiltrierbaren Produkten sowie zur Beurteilung
des Hygienezustandes von Produktionsanlagen.
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Stand der
Technik
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Die
Identifizierung von Mikroorganismen in Produkten konnte lange Zeit
nur durch zeitaufwendige Kultivierung und einhergehender Amplifizierung erfolgen,
wobei die geforderten Ergebnisse erst nach 1 bis 2 Wochen vorlagen.
Die Kultivierung erfolgte beispielsweise für Bakterien, Pilze und einzellige
Algen in den jeweils günstigsten
Nährmedien.
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Bei
dieser Kontrolle wird überprüft, wie
viele und welche Mikroorganismen pro Volumeneinheit im Endprodukt
vorhanden sind. Hierbei sind vor allem die vermehrungsfähigen lebenden
Mirkoorganismen von Interesse, die eine unerwünschte Kontamination des Zwischen-
oder Endproduktes hervorrufen können.
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Eine
klassische Methode ist beispielsweise die Membranfiltration, bei
der die Proben kultiviert und filtriert werden und die Mikroorganismen
auf der Membran verbleiben. Auf dieser Membran werden die Mikroorganismen
vermehrt und identifiziert. Weitere Verfahren sind die Standprobe
und teilweise auch die PCR (polymerase chain reaction). Da die PCR
jedoch auch bei „nackter"DNA positiv ausfällt, kommt
es hier häufig
zu falsch positiv Ergebnissen.
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All
diese Verfahren haben jedoch den Nachteil, dass die Behandlung der
Proben sehr aufwendig ist und erst frühestens nach mehreren Tagen
bis Wochen das Ergebnis bekannt ist.
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Weiterentwicklungen
der bekannten Verfahren haben z.B. zu Methoden geführt, die
es ermöglichen,
in filtrierbaren Produkten wie Getränken über die sogenannten „Direct
Epifluorescent Filter Technique (DEFT)" lebende Zellen direkt zu identifizieren, indem
Fluoreszensfarbstoffe, welche an DNA binden und so die Synthese
der RNA blockieren, in die Zellen gebracht werden und die Zellen
durch Epifluoreszenzmikroskopie detektiert werden (Kroll, R.; Methods
in Molecular Biology; 1995; 46; S 113–121). In der
EP 386051 thods in Molecular Biology;
1995; 46; S 113–121).
In der
EP 386051 oder
in
DE 19841588 wird
beispielsweise beschrieben, wie die DEFT-Methode durch Verwendung
von Induktoren zur Bildung bestimmter Enzyme in lebenden Mikroorganismen und
anschließende
Gabe eines Fluoreszenzreagenz, welches durch Reaktion mit dem gebildeten
Enzym fluoresziert und dann detektiert werden kann, abgewandelt
werden kann. Diese Methode wird jedoch nur für den Nachweis von coliformen
Bakterien oder von Laktobazillen beschrieben. Des weiteren kann die
DEFT-Methode in allen bekannten Abwandlungen nur für filtrierbare
Produkte angewendet werden, was einen großen Nachteil darstellt. Bei
dieser Methode ergibt sich zusätzlich
das Problem der Nachweisgrenze. Es müssen mindestens zwischen 10 und
1000 Keime pro Fläche,
die ausgezählt
wird, vorhanden sein. Diese hohe Zahl an Mikroorganismen in einer
Probe entspricht jedoch nicht den heutigen Hygieneanforderungen,
so dass Systeme notwendig werden, die eine geringere Anzahl von
Mikroorganismen in einer Probe schnell und ohne viel Aufwand detektierbar
machen.
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Für nichtfiltrierbare
Produkte findet sich im Stand der Technik eine Methode, die durch
in-situ Hybridisierung
mit fluoreszierenden Nucleinsäuresonden
zum Nachweis von spezifischen Mikroorganismen führt. Dieses als „FISH – Floureszens
in-situ Hybridisierung" bezeichnete
Verfahren dient zum Nachweis und zur Lokalisierung jeder Art von
Nucleinsäuren
in Zellen. Dabei wird mit Hilfe einer markierten RNA- oder DNA-Sonde
eine molekulare Hybridisierung mit der in den Chromosomen befindlichen DNA/RNA
durchgeführt.
(FISH; Amann, R.L, W. Ludwig und K.-H. Schleifer, 1995. Phylogenetic
identification and in situ detection of individual microbial cells
without cultivation. Microbial. Rev. 59, S. 143–169; siehe auch
DE 10160666 ). Die spezifische Hybridisierung
der Sonde wird durch fluoreszensmikroskopische Techniken nachgewiesen
wie beispielsweise in
DE 19936875 beschrieben.
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Die
FISH-Technik basiert auf der Tatsache, dass es in Bakterienzellen
bestimmte Moleküle
gibt, die aufgrund ihrer lebenswichtigen Funktion im Laufe der Evolution
nur wenig mutiert wurden: Die 16S und die 23S ribosomale Ribonukleinsäure (rRNS).
Beide sind Bestandteile der Ribosomen, den Orten der Proteinbiosynthese,
und können
aufgrund ihrer ubiquitären
Verbreitung, ihrer Größe, und
ihrer strukturellen und funktionellen Konstanz als spezifische Marker dienen.
Die rRNA Datenbanken können
dazu verwendet werden, art- und gattungs- spezifische Gensonden zu konstruieren.
Hierbei werden alle verfügbaren
rRNA Sequenzen miteinander verglichen und für bestimmte Sequenzstellen
Sonden entworfen, die spezifisch eine Bakterienart, -gattung oder
-gruppe erfassen.
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Bei
der FISH -Technik werden diese Gensonden, die zu einer bestimmten
Region auf der ribosomalen Zielsequenz komplementär sind,
in die Zelle geschleust. Die Gensonden sind in der Regel kleine, 16–20 Basen
lange, einzelsträngige
Desoxyribonukleinsäurestücke und
rich ten sich gegen eine Zielregion, welche typisch für eine Bakterienart
oder eine Bakteriengruppe ist. Findet die fluoreszenzmarkierte Gensonde
in einer Bakterienzelle ihre Zielsequenz, so bindet sie daran und
die Zellen können
aufgrund ihrer Fluoreszenz im Fluoreszenzmikroskop detektiert werden.
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Untersuchungen
belegen jedoch, dass durch große
Populationsschwankungen statistische Probleme bei der Probenahme
bei diesen Methoden auftreten. Auch hier ergibt sich die Schwierigkeit
der Nachweisgrenze, denn auch hier sind mindestens zwischen 10 und
1000 Keime pro Fläche,
die ausgezählt
wird, notwendig um aussagekräftige
Ergebnisse zu erhalten. Diese hohe Zahl an Mikroorganismen in einer
Probe entspricht nicht den heutigen Hygienestandards.
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Obwohl
laut internationalem Arzneimittelgesetzbuch (Ph. Eur.) eine Nachweisgrenze
von < 100 CFU/g
noch akzeptabel und hinreichend ist für den Vertrieb von Produkten,
erwartet die Industrie und der Verbraucher heute eine weit geringere
Nachweisgrenze bzw. sind die Hygieneanforderungen an Produkte heute
so hoch, dass eine Nachweisgrenze < 10 CFU/g
unausweichlich ist und eine Nachweisgrenze < 1 CFU/g angestrebt werden sollte.
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Die
Methoden zum Nachweis und zur Quantifizierung von Mikroorganismen
müssen
immer sensitiver und bedienungsfreundlicher werden, um den Anforderungen
an schnellen Nachweismethoden mit hoher Effizienz, niedrigen Nachweisgrenzen
und geringem Aufwand für
möglichst
viele unterschiedliche Mikroorganismen gerecht zu werden. Dabei
ist es oftmals ausreichend, wenn zunächst nur ein „Abwesenheitstest" durchgeführt wird
(Ja/Nein-Test) und getestet wird, ob überhaupt Mikroorganismen in
der Probe enthalten sind, bevor diese taxonomisch bestimmt werden.
Es ist zu zeitaufwendig und fordert zuviel Laborkapazität, wenn
für die
unterschiedlichsten Mikroorganismen viele Nachweismethoden angewendet werden
müssen
oder aus dem Angebot der unterschiedlichsten Methoden auf dem Markt
die jeweils effektivste gewählt
werden muss.
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Der
Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein System zur Verfügung zu
stellen, mit dem sowohl filtrierbare als auch nicht filtrierbare
Proben und Produkte untersucht werden und durch ein schnelles Verfahren
der quantitative Nachweis verschiedenster Mikroorganismen sowohl
lebend als auch tot möglich
wird. Das System sollte es ermöglichen,
Mikroorganismen mit einer Nachweisgrenze von < 10 CFU/g in der gewählten Probenmenge nachzuweisen.
Das System sollte nicht nur speziell für einen Organismus anwendbar
sein, sondern einen generellen Nachweis für Mikroorganismen in Proben
und Produkten zur Verfügung
stellen. Mit dem System sollte es auch möglich sein, den Hygienezustand
von Produktionsanlagen zu überprüfen.
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Beschreibung der Erfindung
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Gegenstand
der Erfindung ist ein Qualitätssicherungssystem
zum Nachweis von vermehrungsfähigen
Mikroorganismen enthaltend,
- a) ein System zur
Anreicherung von Mikroorganismen in einer Probe in einer "Übernachtkultur" entsprechend 8 bis
24 Stunden Kultivierung unter Standardbedingungen gemäß internationalen Arzneimittelgesetzbüchern, Lebensmittelgesetzgebungen
und Kosmetikverordnungen (beispielsweise Ph.Eur.),
- b) ein Kit (aus dem englischen = Baukasten, Bausatz) zum Nachweis
lebender, geschädigter
oder toter Mikroorganismen in filtrierbaren und/oder nichtfiltrierbaren
Produkten, enthaltend
i) mindestens ein Reagenz enthaltend
einen Induktor und ein Fluoreszenzreagenz das bei lebenden Zellen
zur Bildung eines bestimmten Enzyms führt, welches durch Reaktion
mit einem spezifischen Fluoreszenzreagenz einen Fluoreszenzfarbstoff
freisetzt, der detektierbar wird,
ii) mindestens eine Nucleinsäuresonde
zum Nachweis von Mikroorganismen über in-situ Hybridisierung wobei die Nucleinsäuresonde
an einem Fluoreszensmarker gebunden ist,
bei dem eine
Nachweisgrenze für
vermehrungsfähige
Mikroorganismen von < 10
CFU/g erreicht wird.
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Bei
den herkömmlichen
Testmethoden werden in der Regel nur 0,1 g und max. 1 g der Probe entnommen
und die Tests durchgeführt.
Hier ergibt sich ein extremes statistisches Problem und Idealerweise
sollte ein möglichst
großes
Probenvolumen untersucht werden. Die herkömmlichen Testmethoden lassen
jedoch nur eine Probenmenge in der genannten Größenordnung zu.
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Die
Kultivierung in „Übernachtkulturen" entspricht den Standardmethoden,
welche in dem internationalem Arzneimittelgesetz vorgeschrieben
sind. Eine Übernachtkultur
bedeutet dabei speziell, dass die Proben zwischen 8 und 24 Stunden,
bevorzugt zwischen 10 und 20 Stunden und insbesondere zwischen 12
und 15 Stunden kultiviert werden. Die Standardbedingungen der Kultivierung
sind dem Gesetzestext zu entnehmen. Geringfügige Abweichungen beispielsweise
in den Konzentrationen der Nährmedienbestandteile,
der Temperatur oder sonstiger Parameter der Standardmethoden für die Kultivierung sollen
jedoch vom erfindungsgemä ßen Qualitätssicherungssystem
eingeschlossen sein. Ebenso sind eventuelle Änderungen im Gesetzestext für das erfindungsgemäße System
anwendbar. Die Bedingungen müssen
jedoch jeweils dokumentiert werden damit eine Nachweisgrenze für vermehrungsfähige Mikroorganismen
bestimmbar wird. So ist es von großer Bedeutung, welche Probenmenge
eingesetzt wird.
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Erfindungsgemäß werden
5 bis 10 g, bevorzugt 5 g der zu untersuchenden Probe bzw. des zu untersuchenden
Produktes in 100 bis 1000 ml Standardlösung suspendiert und in der Übernachtkultur angereichert.
Diese Behandlung ist oftmals notwendig, da die Proben teilweise
selbst hemmende Wirkung auf Mikroorganismen besitzen können. Um dennoch
eine sehr geringe Keimpopulation nachweisen zu können, die die gewünschte Qualität des Produktes
bei längerer
Lagerung in Bezug auf Hygieneanforderungen zerstören könnte, bedarf es einer Methode,
die nach Verdünnung
der Probe diese Keime noch nachweisen kann. Hierbei ergibt sich
jedoch das Problem der Nachweisgrenze, denn nach Verdünnung ist
die Gesamtzahl der Mikroorganismen für die sofortige Anwendung der
Testmethoden DEFT oder FISH zu gering, um eine Abwesenheitsprüfung durchführen zu
können.
Die erste Anforderung an das Qualitätssicherungssystem, eine Abwesenheitsprüfung für vermehrungsfähige Mikroorganismen oder
anders gesagt eine Ja/Nein-Bestimmung für vermehrungsfähige Mikroorganismen
bereitzustellen, wird dadurch gegeben, dass durch die Übernachtkultur
eine Nachweisgrenze von < 10
CFU/g erreicht wird. Insbesondere wird durch die angewendete Probenvorbereitung
aus 5 bis 10 g Probe in 100 bis 1000 ml Standardlösung eine
Nachweisgrenze von < 1
CFU/g erreicht, bzw. < 1
CFU/5g erreicht. Die von dem internationalem Arzneimittelgesetz
geforderte Mindestnachweisgrenze von < 100 CFU/g wird damit deutlich unterschritten.
Damit kann der heutige Hygienestandard, der für viele Produkte vom Verbraucher und
von der Industrie gefordert wird, eingehalten werden, weil ein Qualitätssicherungssystem
entwickelt wurde, was den schnellen Nachweis von geringsten Populationen
vermehrungsfähiger
Mikroorganismen möglich
macht.
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Durch
die Kombination von zwei Nachweismethoden in einem Kit wird es dem
Anwender möglich,
direkt und parallel unterschiedliche Proben, Zwischenprodukte und
Endprodukte zu testen. So kann während
eines Herstellungsprozesses in jeder Phase jedes Zwischenprodukt
unabhängig
von der Konsistenz auf das Vorhandensein von Mikroorganismen untersucht
werden.
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Der
Nachweis von Mikroorganismen im Sinne der Erfindung bedeutet zum
einen eine „Ja – Nein"-Bestimmung zur Beantwortung
der Frage, ob sich unerwünschte
Mikroorganismen in den zu untersuchenden Proben oder Produkten befinden
und zum anderen anschließend
je nach untersuchter Probe oder Produkt die genaue Identifizierung
des detektierten Mikroorga nismus. Welcher Nachweis erbracht wird,
ist abhängig
von der Konsistenz der Probe oder des Produktes und damit von dem
zu verwendenden Reagenz und der zu verwendenden Nucleinsäuresonde.
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Unter
den Begriffen Proben und Produkte werden erfindungsgemäß sowohl
Zwischenprodukte als auch Endprodukte verstanden. Unter dem Begriff „Proben" kann des weiteren
auch ein Anteil oder Teil eines Zwischenproduktes oder Endproduktes
verstanden werden, beispielsweise der flüssige oder feste Anteil eines
heterogenen Produktes oder Zwischenproduktes bevorzugt nach jeweils
definierten Reaktionszeiten insbesondere zur Kontrolle eines gesamten
Herstellungsprozesses. Erfindungsgemäß werden unter „Proben" ebenfalls beispielsweise Rückstände von
Reinigungsprozessen an Produktionsanlagen verstanden. Unter Endprodukte
wird erfindungsgemäß sowohl
das Endprodukt für
den Verbraucher als auch das Rohprodukt verstanden, welches zum
Verkauf steht und für
die Herstellung von Endprodukten für den Verbraucher verwendet
wird.
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Im
Sinne der Erfindung bedeutet „filtrierbare" Probe oder Produkt,
dass diese durch Filter mit 0,45 μm
Porendurchmesser durchgängig
sind. Sie sollten also keine Öltröpfchen oder
Feststoffpartikel oder ähnliches
enthalten.
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In
einer besonderen Ausführungsform
der Erfindung wird aus dem erfindungsgemäßen Kit das Reagenz aus b i)
für filtrierbare
flüssige
Proben und Produkte oder für
filtrierbare flüssige
Anteile der zu untersuchenden Proben und Produkte zum Nachweis von
lebenden Mikroorganismen eingesetzt. Indirekt können so auch tote Mikroorganismen
nachgewiesen werden.
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Bei
dieser Nachweismethode wird der Stoffwechselweg von der Induktion
zur Bildung eines Enzyms durch die Aufnahme einer spezifischen Substanz
untersucht. Die Induktion geschieht durch ein Reagenz enthaltend
einen Induktor und ein Fluoreszenzreagenz, welches die Zellmembran
passieren kann woraufhin intrazellulär die induzierten Enzyme die
hochfluoreszierende Verbindung entstehen lassen. Zellen ohne intakter
Zellmembran oder aktiven Stoffwechsel können das fluoreszierende Reaktionsprodukt
nicht bilden und zeigen keine Fluoreszenz. Durch die Verwendung
eines weiteren farbigen Reagenzes, welches sich in den toten Zellen
anreichert da eine Reaktion durch das induzierte Enzym nicht stattfinden
kann, ist eine Unterscheidung zwischen toten und lebenden Zellen
möglich.
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Erst
wenn der Nachweis des Enzyms durch die Bildung des fluoreszierenden
Reaktionsproduktes gelingt, ist sichergestellt, dass dieser Stoffwechselweg
funktioniert und damit kann diesen Zellen ein funktionsfähiger Stoffwechsel
und eine Vermehrungsfähigkeit
zugeschrieben werden. Ein Ergebnis liegt bereits nach ca. einer
Stunde vor. Zur Trennung der Zellen von den filtrierbaren Proben
oder Produkten werden bevorzugt Membranfilter, insbesondere Polycarbonatfilter
einer Porengröße von 0,2
bis 1,20 μm,
bevorzugt 0,45 μm
genutzt. Wenn es möglich
ist, können
die zu untersuchenden Proben und Produkte auch in geeigneter Weise
verflüssigt
werden. Zu dieser Probe wird ein Induktor des gesuchten Enzyms zugesetzt
und anschließend
ein Fluoreszenzreagenz, welches erst nach Reaktion mit dem gesuchten und
induzierten Enzym seine Fluoreszenz entwickelt.
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Zu
diesen spezifischen Fluoreszenzreagenzien zählt beispielsweise Fluorescindigalactosid
zum Nachweis von Galactosidase welches durch Galactose als Induktor
induziert wurde. Mit diesen Induktor und Fluoreszensreagenz können Lactobazillen
und coliforme Bakterien wie Escherichia coli, Aeromonas, Citrobacter,
Enterobacter, Klebsiella, Pseudomonaden und weitere Prozesswasser-relevante
Keime nachgewiesen werden.
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Zu
den Fluoreszensreagenzien zählen
erfindungsgemäß 4-Methylumbelliferon-Derivate,
die speziell für
bestimmte Enzyme derivatisiert werden. Beispielsweise findet 4-Methylumbelliferonheptanoat für den Nachweis
von Lipase oder Esterase Anwendung. Für den Nachweis von Galactosidase
kann auch 4-Methylumbelliferon-β-D-galactosid
angewendet werden. Die Lösung
wird dann durch die beschriebenen Mikrofilter filtriert und fluoreszensoptisch
mit Hilfe eines Epifluoreszenzmikroskops untersucht.
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In
einer weiteren Anwendungsform werden die Indikatoren und Fluoreszensreagenzien
zu den Rückständen auf
dem Filter gegeben.
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In
einer weiteren Ausführungsform
wird aus dem Kit die Nucleinsäuresonde
aus b ii) sowohl für
filtrierbare flüssige
Proben und Produkte als auch für nichtfiltrierbare
Proben und Produkte als auch für
Gemische aus filtrierbaren und nichtfiltrierbaren Proben und Produkten
zum Nachweis von lebenden Mikroorganismen eingesetzt.
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Bei
der Nukleinsäuresonde
im Sinne der Erfindung kann es sich um eine DNA- oder RNA-Sonde handeln, die
in der Regel zwischen 12 und 1000 Nukleotide, bevorzugt zwischen
12 und 500, bevorzugter zwischen 12 und 200, besonders bevorzugt
zwischen 12 und 50 und zwischen 15 und 40, und am meisten bevorzugt
zwischen 17 und 25 Nukleotide umfassen wird. Die Auswahl der Nukleinsäuresonden
geschieht nach den Gesichtspunkten, ob eine komplementäre Sequenz
in dein nachzuweisenden Mikroorganismus vorliegt. Durch diese Auswahl
einer definierten Sequenz, kann dadurch eine Bakterienart, eine
Bakteriengattung oder eine ganze Bakteriengruppe erfasst werden.
Komplementarität
sollte bei einer Sonde von 15 Nukleotiden über 100% der Sequenz gegeben
sein. Bei Oligonukleotiden mit mehr als 15 Nukleotiden sind ein
bis mehrere Fehlpaarungsstellen erlaubt.
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Die
Nucleinsäuresonden
aus dem erfindungsgemäßen Kit
sind in der Lage, durch unspezifische Nucleinsäuresonden unspezifisch Mikroorganismen
nachzuweisen. Damit kann die oft gestellte Frage geklärt werden,
ob sich unerwünschte
Mikroorganismen in Proben oder Produkten befinden, ohne den Mikroorganismus
genau zu charakterisieren.
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Die
Hybridisierungsbedingungen und die Dauer der Hybridisierung werden
je nach Produkt und zu untersuchender Probe in Abhängigkeit
von der Nucleinsäuresonde
angepasst.
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Als
detektierbare Marker für
die Nucleinsäuresonden
werden z. B. fluoreszierende Gruppen wie z. B. CY2 (erhältlich von
Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, USA), CY3 (ebenfalls
erhältlich
von Amersham Life Sciences), CY5 (ebenfalls zu beziehen von Amersham
Life Sciences), FITC (Molecular Probes Inc., Eugene, USA), FLUOS
(erhältlich von
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland), TRITC (erhältlich von
Molecular Probes Inc. Eugene, USA), 6-FAM oder FLUOS-PRIME verwendet.
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Das
erfindungsgemäße Qualitätssicherungssystem
kann zum Nachweis von gram pos. und/oder gram neg. Bakterien und/oder
Hefen und/oder Schimmelpilzen und/oder Algen verwendet werden.
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Zu
den gram-pos. Bakterien zählen
neben den umweltrelevanten auch medizinisch relevante Keime wie
beispielsweise Staphylokokken, Streptokokken, Milzbrand-, Starrkrampf-,
Milchsäure-,
Diphtherie-, Schweinerotlauf- oder Heubakterien. Zu den gram-neg.
Bakterien zählen
ebenfalls neben den umweltrelevanten auch medizinisch relevante
Keime wie Gonokokken, Meningokokken, Legionellen, Coli-, Typhus-,
Rur- und Pestbakterien. Zu den umweltrelevanten und Mensch-assoziierten
Keimen gehören unter
anderem prozesswasserspezifische Keime wie Pseudomonaden, Burkholderien,
Raoultellen, Klebsiellen, Corynebakterien und Bazillus-Arten.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Qualitätssicherungssystems
zum Nachweis von Mikroorganismen und zur Qualitätsüberprüfung von filtrierbaren und/oder
nichtfiltrierbaren Proben oder Produkten sowie zur Beurteilung des
Hygienezustandes von Produktionsanlagen. Die zu untersuchenden filtrierbaren
und/oder nichtfiltrierbaren Proben oder Produkte sind ausgewählt aus
der Gruppe, die gebildet wird aus Rohprodukten, Kosmetikprodukten,
pharmazeutischen Zubereitungen, Nahrungsmitteln, Nahrungsergänzungsmitteln,
Textilhilfsmitteln, Wasch- und Reinigungsmitteln sowie Farben und
Lacke.
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Unter
Rohprodukte werden im Sinne der Erfindung Produkte verstanden, die
zur Herstellung von Endprodukte für den Verbraucher verwendet
werden. Hierbei kann es sich um Tenside, Ölkörper, Emulgatoren, Perlglanzwachse,
Konsistenzgeber, Verdickungsmittel, Überfettungsmittel, Stabilisatoren,
Polymere, Siliconverbindungen, Fette, Wachse, Lecithine, Phospholipide,
UV-Lichtschutzfaktoren, Antioxidantien, Deodorantien, Antitranspirantien,
Antischuppenmittel, Filmbildner, Quellmittel, Insektenrepellentien,
Selbstbräuner,
Tyrosinaseinhibitoren (Depigmentierungsmittel), Hydrotrope, Solubilisatoren, Konservierungsmittel,
Parfümöle, nichtfiltrierbare O/W-
und W/O-Emulsionen handeln. Prozesswasser ist ebenfalls als Rohstoff
zu sehen.
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Bei
den Kosmetikprodukten kann es sich beispielsweise um Salben, Cremes,
Lotionen, Shampoo, Conditioner, Duschgels, Badezusätze, dekorative
Kosmetik wie Make up, Lidschatten, Lippenstift, Nagellack oder ähnliches
handeln. Die pharmazeutischen Zubereitungen können in Form von Säften, Cremes,
Salben, Lotionen, Suspensionen, Tinkturen, Tropfen oder ähnliches
vorliegen.
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Die
Nahrungsmittel sind bevorzugt Milch oder Milchprodukte, Back- oder
Fleischwaren, Getränke
wie Mineralwasser, Bier, Limonade oder Fruchtsaft. Als Nahrungsergänzungsmittel
werden bevorzugt Vitaminlösungen,
ungesättigte
Fettsäuren insbesondere
konjugierte Linolsäuren,
Konservierungsmittel oder Antioxidantien genannt.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis
von Mikroorganismen in filtrierbaren und/oder nichtfiltrierbaren
Produkten bei dem das erfindungsgemäße Qualitätssicherungssystem angewendet
wird, indem man die Proben
- a) zur Anreicherung
von Mikroorganismen in einer "Übernachtkultur" entsprechend 8 bis
24 Stunden kultiviert unter Standardbedingungen gemäß internationalen
Arzneimittelgesetzbüchern,
Lebensmittelgesetzgebungen und Kosmetikverordnungen und
- b) ein Kit zum Nachweis lebender, geschädigter oder toter Mikroorganismen
in filtrierbaren und/oder nichtfiltrierbaren Proben oder Produkten anwendet,
indem man die angereicherte Probe
i) mit einem Reagenz enthaltend
einen Induktor und ein Fluoreszenzreagenz inkubiert, welches in den
Zellen die Bildung eines speziellen Enzyms induziert und dabei aus
einem Fluoreszenzreagenz eine fluoreszierende Verbindung entstehen lässt, und/oder
ii)
nach Fixieren der Bakterien diese mit einer Nucleinsäuresonde
inkubiert, welche mit einem Fluoreszensmarker versehen ist um eine
Hybridisierung herbeizuführen
und
- c) die Fluoreszens der Proben detektiert und mit der Anzahl
der Zellen korreliert wobei die Anzahl der Zellen bestimmbar wird
und beim Einsatz von b) i) zwischen toten und lebenden Zellen unterschieden
werden kann.
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Im
Sinne der vorliegenden Erfindung wird unter "Fixieren" der Bakterien eine Behandlung verstanden,
mit der die Bakterienhülle
für Nukleinsäuresonden
durchlässig
gemacht wird. Zur Fixierung wird üblicherweise Ethanol verwendet.
Es kann jedoch auch Methanol, Mischungen von Alkoholen, eine niederprozentige
Paraformaldehydlösung
oder eine verdünnte
Formaldehydlösung,
enzymatische Behandlungen oder ähnliches
verwendet werden.
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Für die "Hybridisierung" werden im Sinne
der Erfindung die fixierten Bakterien mit fluoreszenzmarkierten
Nukleinsäuresonden
inkubiert. Diese Nukleinsäuresonden,
die aus einem Oligonukleotid und einem daran gebundenen Marker bestehen,
können dann
die Zellhülle
penetrieren und sich an die der Nukleinsäuresonde entsprechenden Zielsequenz
im Zellinneren binden. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresonden
können
mit verschiedenen Hybridisierungslösungen eingesetzt werden. Verschiedene
organische Lösungsmittel
können
hierbei in Konzentrationen von 0–80% eingesetzt werden. Durch
das Einhalten von stringenten Hybridisierungsbedingungen wird gewährleistet,
dass die Nukleinsäuresonde
auch tatsächlich
mit der Zielsequenz hybridisiert. Moderate Bedingungen im Sinne
der Erfindung sind z. B. 0% Formamid in einem Hybridisierungspuffer
wie er nachfolgend beschrieben ist. Stringente Bedingungen im Sinne
der Erfindung sind beispielsweise 20–80% Formamid im Hybridisierungspuffer.
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Eine
typische Hybridisierungslösung
enthält 0%–80% Formamid,
bevorzugt 20%–60%
Formamid, besonders bevorzugt 35% Formamid. Sie hat außerdem eine
Salzkonzentration von 0,1 mol/l–1,5
mol/l, bevorzugt von 0,5 mol/l–1,0
mol/l, bevorzugter von 0,7 mol/l–0,9 mol/l, besonders bevorzugt
von 0,9 mol/l, wobei es sich bei dem Salz vorzugsweise um Natriumchlorid
handelt. Weiter umfasst die Hybridisierungslösung üblicherweise ein Detergens,
wie z. B. Natriumdodecylsulfat (SDS), in einer Konzentration von
0,001%–0,2%,
vorzugsweise in einer Konzentration von 0,005–0,05%, bevorzugter von 0,01–0,03%,
besonders bevorzugt in einer Konzentration von 0,01%. Zum Puffern
der Hybridisierungslösung
können
verschiedene Verbindungen wie Tris-HCl, Natrium-Citrat, PIPES oder
HEPES verwendet werden, die üblicherweise
Konzentrationen von 0,01–0,1
mol/l eingesetzt werden, bevorzugt von 0,01 bis 0,08 mol/l, in einem
pH- Wert-Bereich von 6,0–9,0,
bevorzugt 7,0 bis 8,0. Die besonders be vorzugte erfindungsgemäße Ausführung der
Hybridisierungslösung
beinhaltet 0,02 mol/l Tris-HCl,
pH 8,0.
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Die
Konzentration der Sonde kann je nach Markierung und Anzahl der zu
erwartenden Zielstruktur stark schwanken. Um eine schnelle und effiziente Hybridisierung
zu ermöglichen,
sollte die Sondenmenge die Anzahl der Zielstrukturen um mehrere Größenordnungen überschreiten.
Allerdings ist bei der Fluoreszenz in situ-Hybridisierung (FISH)
darauf zu achten, dass eine zu hohe Menge an fluoreszenzmarkierter
Hybridisierungssonde zu erhöhter
Hintergrundfluoreszenz führt.
Die Menge an Sonde sollte deshalb in einem Bereich zwischen 0,5
ng/l und 500 ng/l, bevorzugt zwischen 1,0 ng/l und 100 ng/l und besonders
bevorzugt bei 1, 0–50
ng/l liegen.
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Die
Dauer der Hybridisierung beträgt üblicherweise
zwischen 10 Minuten und 12 Stunden; bevorzugt erfolgt die Hybridisierung
für etwa
1,5 Stunden. Die Hybridisierungstemperatur beträgt bevorzugt zwischen 44°C und 48°C, besonders
bevorzugt 46°C,
wobei der Parameter der Hybridisierungstemperatur, wie auch die
Konzentration an Salzen und Detergenzien in der Hybridisierungslösung in
Abhängigkeit
von den Nukleinsäuresonden,
insbesondere deren Längen
und dem Grad der Komplementarität zur
Zielsequenz in der nachzuweisenden Zelle optimiert werden kann.
Nach erfolgter Hybridisierung werden die nicht hybridisierten und überschüssigen Nukleinsäuresondenmoleküle mittels
einer herkömmlichen
Waschlösung
entfernt bzw. abgewaschen. Diese Waschlösung kann, falls gewünscht, 0,001–0,1 % eines
Detergens wie SDS, wobei eine Konzentration von 0,01 % bevorzugt
wird, sowie Tris- HCl in einer Konzentration von 0,001–0,1 mol/l,
bevorzugt 0,01–0,05
mol/l, besonders bevorzugt 0,02 mol/l, enthalten. Weiter enthält die Waschlösung üblicherweise
NaCl, wobei die Konzentration je nach benötigter Stringenz von 0,003
mol/l bis 0,9 mol/l, bevorzugt von 0,01 mol/l bis 0,9 mol/l, beträgt. Des
Weiteren kann die Waschlösung
EDTA in einer Konzentration bis zu 0,01 mol/l enthalten, wobei die
Konzentration vorzugsweise 0,005 mol/l beträgt. Des weiteren werden zur
Waschlösung
noch Pufferlösungen eingesetzt,
die den Hybridisierungspuffer in einer geringeren Salzkonzentration
entsprechen.
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Das "Abwaschen" der nicht gebundenen
Nukleinsäuresondenmoleküle erfolgt üblicherweise
bei einer Temperatur im Bereich von 30°C bis 50°C, bevorzugt von 44°C bis 50°C und besonders
bevorzugt bei 46°C
für eine
Dauer von 10–40
Minuten, vorzugsweise für
15 Minuten. Das Ergebnis bei Verwendung des erfindungsgemäßen Kits
liegt nach 24 bis 48 Stunden vor. Die jeweiligen mit Fluoreszensreagenz oder
Fluoreszenzmarker behandelte Proben oder Produkte werden anschließend mit
Hilfe eines Mikroskops, bevorzugt eines Epifluoreszensmikroskops optisch
detektiert.