CN111929293A - 食药用真菌中总三萜含量的测定方法 - Google Patents

食药用真菌中总三萜含量的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明揭示了一种食药用真菌中总三萜含量的测定方法，包括，采用熊果酸标准品配置不同浓度的标准溶液；用可见分光光度计在设定波长下测定吸光度，以吸光度为纵坐标，以熊果酸含量为横坐标，绘制标准曲线；称取样品粉末0.10‑0.5g置于三角瓶中，向样品粉末中加入30‑80ml浸提剂，超声波提取30‑90min，得到浸提液；将所述浸提液的上清液移至100ml容量瓶中，定容，得到待测溶液；吸取所述待测溶液1.0ml于具塞比色管中，水浴蒸干溶剂；向所述比色管中加入0.10‑0.30mL香草醛‑冰乙酸溶液和0.70‑0.90mL高氯酸，摇匀，水浴加热后冷却，再调至室温，加入冰乙酸稀释，在20‑90min内用可见分光光度计在设定波长下测定吸光度。本发明的方法简单、便于操作，检测成本低。测定结果准确可靠。

Description

食药用真菌中总三萜含量的测定方法
技术领域
本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种食药用真菌中总三萜含量的测定方法。
背景技术
三萜类化合物是灵芝、桑黄、桦树茸等食、药用真菌主要活性成分，具有护肝排毒、抗氧化、抑制肿瘤、抗菌、抗炎、抗病毒等活性。总三萜含量的高低，是评价此类食、药用真菌质量的重要指标。大型真菌中的三萜类化合物，具有提高人体免疫力、抑制肿瘤的复发与转移、抗高血压、保肝等多种生物活性，没有精确的测定总三萜的标准方法，对含有三萜类成分的真菌的品质和功能进行评价，就缺少科学依据。而药用真菌中总三萜含量测定的简单、快捷和精准性，对于指导菌农和企业高质量生产、评价交易产品质量水平等具有十分重要的意义。
目前，总三萜的检测方法有分光光度法、高效液相色谱法、薄层色谱-液相色谱/质谱法等，但是现有的方法中，存在测定成本较高，测定结果误差较大，操作复杂的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种食药用真菌中总三萜含量的测定方法，以解决现有技术中测定测本较高，测定结果误差较大，操作复杂的问题。
为实现上述目的，本发明提出食药用真菌中总三萜含量的测定方法，包括：
标准溶液的制备：称取熊果酸标准品0.01g，用三氯甲烷溶解并定容至100mL，移取0.1mg/mL的熊果酸标准品液0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.20mL分别于25mL具塞比色管中，水浴蒸干溶剂，分别加入0.20mL香草醛-冰乙酸溶液和0.80mL高氯酸，摇匀，再分别向每一个个具塞比色管中加5.00mL冰乙酸稀释，摇匀，得到不同浓度的标准溶液；
标准曲线的绘制：分别取上述不同浓度的所述标准溶液于比色皿中，以0.00mL比色管做参比，20min-90min内用可见分光光度计在设定波长下测定吸光度，以吸光度为纵坐标，以熊果酸含量为横坐标，绘制标准曲线；
待测样品溶液的制备：称取样品粉末0.10-0.5g置于三角瓶中，向样品粉末中加入30-80ml浸提剂，超声波提取30-90min，得到浸提液；将所述浸提液的上清液移至100ml容量瓶中，定容，得到待测溶液；
待测溶液的测定：吸取所述待测溶液1.0ml于具塞比色管中，水浴蒸干溶剂；向所述比色管中加入0.10-0.30mL香草醛-冰乙酸溶液和0.70-0.90mL高氯酸，摇匀，水浴加热后冷却，再调至室温，加入冰乙酸稀释，在20-90min内用可见分光光度计在设定波长下测定吸光度。
优选地，所述标准曲线的绘制包括：分别取上述不同浓度的所述标准溶液于比色皿中，以0.00mL比色管做参比，30min内用可见分光光度计在设定波长下测定吸光度，以吸光度为纵坐标，以熊果酸含量为横坐标，绘制标准曲线。
优选地，所述待测样品溶液的制备包括：称取样品粉末0.25-0.40g置于三角瓶中，向样品粉末中加入50ml三氯甲烷，超声波提取60min，得到浸提液；将所述浸提液的上清液移至100ml容量瓶中，定容，得到待测溶液。
优选地，将所述浸提液的上清液移至100ml容量瓶中，定容，包括：将所述浸提液的上清液移至100ml容量瓶中后，再用少量浸提剂洗涤所述三角瓶，洗涤液一并转移到容量瓶中以浸提剂定容，摇匀。
优选地，所述待测溶液的测定包括：吸取所述待测溶液1.0ml于具塞比色管中，常压水浴蒸干溶剂，向所述比色管中加入0.20mL香草醛-冰乙酸溶液和0.80mL高氯酸，摇匀，70℃水浴加热15min后冷却5min，再调至室温，加入冰乙酸5.0ml稀释，在30分钟内用可见分光光度计在设定波长下下测定吸光度。
优选地，所述设定波长为548nm。
优选地，所述样品为食药用真菌。
优选地，所述食用真菌为桑黄、桦树茸或灵芝。
优选地，所述样品为桑黄或桦树茸时，称取样品粉末0.25g，当所述样品为灵芝时，称取样品0.40g。
本发明的有益效果是：
根据本发明实施例的食药用真菌中总三萜含量的测定方法，方法简单、便于操作，且采用的仪器价格合理，检测成本低。测定结果准确可靠，为对含有三萜类成分的真菌的品质和功能进行评价，提供了可靠的数据，对于指导菌农和企业高质量生产，具有显著的经济效益，具有广阔的市场前景。同时，准确测定药用真菌中总三萜的含量，科学的对含有三萜类成分的真菌进行评价，平衡交易产品质量水平，促进产业结构调整。
附图说明
图1是本发明的不同称样量对样品中总三萜含量的影响的柱形图；
图2是本发明的不同浸提剂体积对样品中总三萜含量的影响的柱形图；
图3是本发明的不同超声时间对样品中总三萜含量的影响的柱形图；
图4是本发明的不同显色剂组合对样品中总三萜含量的影响的柱形图；
图5是本发明的不同波长对样品中总三萜含量的影响的柱形图；
图6是本发明的不同水浴温度对样品中总三萜含量的影响的柱形图；
图7是本发明的不同水浴时间对样品中总三萜含量的影响的柱形图；
图8是本发明的不同比色时间对样品中总三萜的影响的柱形图；
图9是本发明的标准曲线图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明的仪器和设备：
紫外可见分光光度计：(中国北京普析通用仪器有限责任公司、T6新世纪)；
对照品熊果酸：纯度为98.10％，CAS NO：77-52-1。
原料为：桑黄粉、桦树茸粉、灵芝粉，由通化聚鑫经济开发区仙草堂药用菌种植基地提供。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明制备方法中未提及的方法均为常规的方法。
下面结合具体实施例描述本发明中关于参数及技术指标的选择以及各实验例的效果。
实施例1
称样量选择：准确称取样品0.05g、0.10g、0.15g、0.20g、0.25g、0.30g，通过测定总三萜含量，确定样品最适称样量。
试样混匀粉碎后，准确称取0.05g、0.10g、0.15g、0.20g、0.25g、0.30g样品，分别置于150mL具塞磨口三角瓶中，加入50mL浸提剂，超声提取仪中提取60min，将浸提上清液转移到100mL容量瓶中；再用少量浸提剂洗涤三角瓶，洗涤液一并转移到容量瓶中以浸提剂定容，摇匀。吸取待测液1.00mL于25mL具塞比色管中，常压水浴蒸干溶剂。加入0.20mL香草醛-冰乙酸溶液和0.80mL高氯酸，摇匀。置于70℃水浴加热15min，取出，立即置冰浴中冷却5min，再置水浴中调至室温。加冰乙酸5.00mL稀释，摇匀。同时做空白，在30min内用可见分光光度计在548nm波长下测定吸光度。9个称样量试样平行进行，重复3次，结果见表1和图1。
表1不同称样量对样品中总三萜提取效果的影响 单位：g/100g；n＝3
Figure BDA0002574828160000041
由表1和图1可知，随着称样量的增加，总三萜含量也随之增加，当桑黄粉和桦树茸粉称样量为0.25g，灵芝粉称样量为0.40g时，对样品中总三萜的提取效果最好。
实施例2
浸提剂体积的选择：准确称取桑黄粉和桦树茸粉0.25g，灵芝粉0.40g时，置于150mL具塞磨口三角瓶中，分别加入30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL浸提剂，通过测定总三萜含量，确定最佳浸提剂的体积。
其余步骤与实施例1相同。6个不同浸提剂体积下试样平行进行，重复3次。结果见表2和图2。
表2不同浸提剂体积对样品总三萜提取效果的影响 单位：g/100g；n＝3
Figure BDA0002574828160000051
由表2和图2可知，随着浸提剂体积的增加，样品中总三萜含量先增加再趋于平缓，当浸提剂体积为50mL、60mL、70mL和80mL时，样品中总三萜含量提取效果差距很小，从经济角度考虑，浸提剂体积为50mL较适宜。
实施例3
超声时间选择：浸提时间1：30min；浸提时间2：60min；浸提时间3：90min。
准确称取桑黄粉和桦树茸粉0.25g，灵芝粉0.40g时，置于150mL具塞磨口三角瓶中，分别加入50mL浸提剂，其余步骤与实施例2相同。3组不同超声时间下试样平行进行，重复3次。结果见表3和图3。
表3不同超声时间对样品中总三萜提取效果的影响 单位：g/100g；n＝3
Figure BDA0002574828160000052
从表3和图3中可以看出当超声时间为60min时，样品中总三萜浸提效果较好。
实施例4
显色剂体积选择：
显色剂组合1：0.1mL香草醛+0.8mL高氯酸。
显色剂组合2：0.2mL香草醛+0.8mL高氯酸。
显色剂组合3：0.3mL香草醛+0.8mL高氯酸。
显色剂组合4：0.2mL香草醛+0.9mL高氯酸。
显色剂组合5：0.2mL香草醛+0.7mL高氯酸。
准确称取桑黄粉和桦树茸粉0.25g，灵芝粉0.40g时，置于150mL具塞磨口三角瓶中，分别加入50mL浸提剂，在超声提取仪中提取60min，将浸提上清液转移到100mL容量瓶中，再用少量浸提剂洗涤瓶，洗涤液一并转移到容量瓶中以浸提剂定容，摇匀。吸取待测液1.00mL于25mL具塞比色三角管中，常压水浴蒸干溶剂。加入上述不同配比的显色剂，通过测定总三萜含量，确定最适显色剂组合。5组不同显色剂组合试样平行进行，重复3次。结果见表4和图4。
表4不同显色剂组合对样品总三萜提取效果的影响 单位：g/100g；n＝3
Figure BDA0002574828160000061
从表4和图4可知，当显色剂组合为0.2mL香草醛+0.8mL高氯酸时，样品中总三萜含量测定效果较好。
实施例5
标准品对照选择：分光光度法测定一般以齐墩果酸和熊果酸为对照品，分别以齐墩果酸和熊果酸为对照样品绘制标准曲线。
准确称取灵芝粉0.40g时，置于150mL具塞磨口三角瓶中，分别加入50mL浸提剂，在超声提取仪中提取60min，将浸提上清液转移到100mL容量瓶中，再用少量浸提剂洗涤瓶，洗涤液一并转移到容量瓶中以浸提剂定容，摇匀。吸取待测液1.00mL于25mL具塞比色三角管中，常压水浴蒸干溶剂。加入0.2mL香草醛+0.8mL高氯酸，通过测定总三萜含量，重复3次。结果见表5。
表5不同标准品对样品总三萜提取效果的影响 单位：g/100g；n＝3
Figure BDA0002574828160000071
由于表5可以看出，齐墩果酸与灵芝中三萜成分结构差异较大，测定结果误差大，采用熊果酸能够明显提高总三萜提取含量。故选择以熊果酸为对照品。
实施例6
波长的选择：三萜类物质在高氯酸的作用下与香草醛反应产生有色物质，通过在490nm、500nm、548nm、550nm处测定同一样品最大吸收峰选择适宜波长。其他步骤与实施例5相同。
表6样品中总三萜含量最大吸收波长的选择 单位：g/100g；n＝3
Figure BDA0002574828160000072
从表6和图5中可以看出，当波长为548nm和550nm时，吸收峰最大且两者相差不大，可以选择测定波长为548nm或550nm。
实施例7
水浴温度的选择：准确称取桑黄粉和桦树茸粉0.25g，灵芝粉0.40g时，置于150mL具塞磨口三角瓶中，分别加入50mL浸提剂，超声提取仪中提取60min，将浸提上清液转移到100mL容量瓶中，再用少量浸提剂洗涤三角瓶，洗涤液一并转移到容量瓶中以浸提剂定容，摇匀。吸取待测液1.00mL于25mL具塞比色管中，常压水浴蒸干溶剂。加入0.20mL香草醛-冰乙酸溶液和0.80mL高氯酸，摇匀。分别置于60℃、65℃、70℃、75℃、80℃水浴取出，立即置冰浴中冷却5min，再置水浴中调至室温。加冰乙酸5.00mL稀释，摇匀。同时做空白，在30min内用可见分光光度计在548nm波长下测定吸光度。通过测定样品中总三萜含量，确定适宜水浴温度。5个不同水浴温度试样平行进行，重复3次。结果见表7和图6。
表7不同水浴温度对样品总三萜提取效果的影响 单位：g/100g；n＝3
Figure BDA0002574828160000081
从表7和图6可以看出，水浴温度为70℃、75℃和80℃时对样品中总三萜含量提取效果均比较好，从经济角度考虑，选择水浴温度为70℃。
实施例8
水浴时间的选择：准确称取桑黄粉和桦树茸粉0.25g，灵芝粉0.40g时，置于150mL具塞磨口三角瓶中，分别加入50mL浸提剂，超声提取仪中提取60min，将浸提上清液转移到100mL容量瓶中，再用少量浸提剂洗涤三角瓶，洗涤液一并转移到容量瓶中以浸提剂定容，摇匀。吸取待测液1.00mL于25mL具塞比色管中，常压水浴蒸干溶剂。加入0.20mL香草醛-冰乙酸溶液和0.80mL高氯酸，摇匀。置于70℃水浴分别加热10min、15min、20min、25min、30min取出，立即置冰浴中冷却5min，再置水浴中调至室温。加冰乙酸5.00mL稀释，摇匀。同时做空白，在30min内用可见分光光度计在548nm波长下测定吸光度。通过测定样品中总三萜含量，确定适宜水浴时间。5个不同水浴时间试样平行进行，重复3次。详见表8和图7所示。
表8不同水浴时间对样品总三萜提取效果的影响 单位：g/100g；n＝3
Figure BDA0002574828160000091
从表8和图7可以看出，水浴时间为15min时对样品中总三萜含量提取效果较好。
实施例9
比色稳定时间选择：选定总三萜含量高的样品，分别在20min、30min、50min、60min、90min时测定溶液的吸光度，由图8知，溶液在30min内稳定。
实施例10
线性范围选择：
标准液(0.1mg/mL):称取熊果酸标准品0.01g，用三氯甲烷溶解并定容至100mL。
分别移取0.1mg/mL的熊果酸标准液0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.20mL于25mL具塞比色管中，常压水浴蒸干溶剂。加入0.20mL香草醛-冰乙酸溶液和0.80mL高氯酸，摇匀。再加5.00mL冰乙酸稀释，摇匀。
取系列标准溶液于比色皿中，以0.00mL比色管做参比，30min内用可见分光光度计在548nm波长下测定吸光度。以吸光度为纵坐标，以熊果酸含量为横坐标，绘制标准曲线。见图9。
表9熊果酸标准系列溶液测定结果
Figure BDA0002574828160000092
Figure BDA0002574828160000101
检出限测定
依据《HJ 168-2010环境监测分析标准技术导则》中附录A的A.1.1方法检出限的一般确定方法—空白试验中检测出目标物质。按照样品分析的全部步骤，重复10次空白试验，按照公式计算方法检出限。
其计算公式为：MDL＝t(n-1,0.99)×S，式中，MLD为检出限；S为10次平行测定的标准偏差。当重复测定10次时，t(n-1,0.99)为2.821，计算得到方法检出限为0.002322mg。结果见表10。
表10检出限测定结果 (n＝10)
Figure BDA0002574828160000102
精密度测定
准确称取赤灵芝孢子粉样品0.4000g，应本文确定的方法提取并测定。重复测定12次，结果见表11。数据表明，比色法测定总三萜RSD<1.00％。测定结果具有极强的重复性、良好的精密度和准确度。
表11精密度测定结果 (n＝12)
Figure BDA0002574828160000103
回收率测定
准确称取桑黄粉和桦树茸粉0.25g，灵芝粉0.40g，每个样品分别加入0.1mg/mL的熊果酸标准溶液0.80mL和1.20mL，相当于熊果酸含量为0.08mg和0.12mg。应本文确定的方法提取并测定，重复测定6次。回收率测定结果见表12。
表12回收率测定结果 (n＝6)
Figure BDA0002574828160000111
参考《GB27417-2017合格评定化学分析方法确认和验证指南》，加标回收率范围在90％-110％，RSD≤5.3％，经试验证明，达到验证要求。
根据本发明实施例的药用真菌中总三萜含量的测定方法，方法简单、便于操作，且采用的仪器价格合理，检测成本低。测定结果准确可靠，为对含有三萜类成分的真菌的品质和功能进行评价，提供了可靠的数据，对于指导菌农和企业高质量生产，具有显著的经济效益，具有广阔的市场前景。；同时，准确测定药用真菌中总三萜的含量，科学的对含有三萜类成分的真菌进行评价，平衡交易产品质量水平，促进产业结构调整。本发明的技术内容及技术特征已揭示如上，然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本发明的教示及揭示而作种种不背离本发明精神的替换及修饰，因此，本发明保护范围应不限于实施例所揭示的内容，而应包括各种不背离本发明的替换及修饰，并为本专利申请权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.一种食药用真菌中总三萜含量的测定方法，其特征在于，包括：
标准溶液的制备：称取熊果酸标准品0.01g，用三氯甲烷溶解并定容至100mL，移取0.1mg/mL的熊果酸标准品液0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.20mL分别于25mL具塞比色管中，水浴蒸干溶剂，分别加入0.20mL香草醛-冰乙酸溶液和0.80mL高氯酸，摇匀，再分别向每一个个具塞比色管中加5.00mL冰乙酸稀释，摇匀，得到不同浓度的标准溶液；
标准曲线的绘制：分别取上述不同浓度的所述标准溶液于比色皿中，以0.00mL比色管做参比，20min-90min内用可见分光光度计在设定波长下测定吸光度，以吸光度为纵坐标，以熊果酸含量为横坐标，绘制标准曲线；
待测样品溶液的制备：称取样品粉末0.10-0.5g置于三角瓶中，向样品粉末中加入30-80ml浸提剂，超声波提取30-90min，得到浸提液；将所述浸提液的上清液移至100ml容量瓶中，定容，得到待测溶液；
待测溶液的测定：吸取所述待测溶液1.0ml于具塞比色管中，水浴蒸干溶剂；向所述比色管中加入0.10-0.30mL香草醛-冰乙酸溶液和0.70-0.90mL高氯酸，摇匀，水浴加热后冷却，再调至室温，加入冰乙酸稀释，在20-90min内用可见分光光度计在设定波长下测定吸光度。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述标准曲线的绘制包括：分别取上述不同浓度的所述标准溶液于比色皿中，以0.00mL比色管做参比，30min内用可见分光光度计在设定波长下测定吸光度，以吸光度为纵坐标，以熊果酸含量为横坐标，绘制标准曲线。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述待测样品溶液的制备包括：称取样品粉末0.25-0.40g置于三角瓶中，向样品粉末中加入50ml三氯甲烷，超声波提取60min，得到浸提液；将所述浸提液的上清液移至100ml容量瓶中，定容，得到待测溶液。
4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，将所述浸提液的上清液移至100ml容量瓶中，定容，包括：将所述浸提液的上清液移至100ml容量瓶中后，再用少量浸提剂洗涤所述三角瓶，洗涤液一并转移到容量瓶中以浸提剂定容，摇匀。
5.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，所述待测溶液的测定包括：吸取所述待测溶液1.0ml于具塞比色管中，常压水浴蒸干溶剂，向所述比色管中加入0.20mL香草醛-冰乙酸溶液和0.80mL高氯酸，摇匀，70℃水浴加热15min后冷却5min，再调至室温，加入冰乙酸5.0ml稀释，在30分钟内用可见分光光度计在设定波长下下测定吸光度。
6.根据权利要求1-5任一项所述的测定方法，其特征在于，所述设定波长为548nm。
7.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述样品为食药用真菌。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述食药用真菌为桑黄、桦树茸或灵芝。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述样品为桑黄或桦树茸时，称取样品粉末0.25g，当所述样品为灵芝时，称取样品0.40g。
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