JP7479367B2 - 代表的なＤＮＡシーケンシングによる個別化されたｃｔＤＮＡ疾患のモニタリング - Google Patents

Description

関連出願の相互参照

本出願は、２０１８年１１月２９日に出願された米国特許仮出願第６２／７７２，６５０号に対する優先権および利益を主張するものであり、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

ＤＮＡ塩基シーケンシング法を使用したヒトの遺伝的多様性の研究は、４０年以上前の導入から現在の技術まで、驚異的な発展を遂げた。これにより、ヒトゲノムのシーケンシングおよび分析を数日で行うことができる。２０００年代半ばに最初の「次世代シーケンシング」（ＮＧＳ）機器がリリースされたことで、疾患研究に革命が起こり、大幅に低コストで速度が大幅に向上し、ヒトゲノム配列全体を数週間で生成することが可能になった。価格とパフォーマンスとに加えて、新しいシーケンシング技術は、古いシーケンシング技術および遺伝子型同定技術の技術的な弱点のいくつかを補い、新しいものを含むバリアントのゲノムワイドな検出を低コストで可能にすることも証明した。ヒトゲノミクスにおけるＮＧＳのさらなるブレークスルーは、ターゲット濃縮法の導入によって実現し、関心領域の選択的シーケンシングを可能にし、それによって生成する必要のあるシーケンスの量を劇的に削減した。このアプローチは、ゲノム内の標的配列を表すＤＮＡまたはＲＮＡプローブの収集に基づいており、標的領域に由来するＤＮＡフラグメントに結合して抽出することができる。

ヒトゲノム（エクソーム）内のすべてのタンパク質コード領域のシーケンシングを可能にする全エクソームシーケンシング（ＷＥＳ）は、特に単一遺伝子（「メンデルの法則」）疾患で最も広く使用されるターゲット濃縮法になった。このアプローチにより、全ゲノムシーケンシングと比較して、シーケンシングの「負荷」の約２％しか必要とせずに、エキソン（コーディング）とスプライスサイトの両方のバリアントの検出が可能になった。すべての遺伝子の偏りのない分析により、シーケンシングの前に時間のかかる候補遺伝子を選択する必要がなくなった。エクソームは、疾患に関連する形質に大きな影響を与える突然変異の約８５％を抱えていると推定されている。さらに、エキソニック変異は単一遺伝子疾患の大部分を引き起こすことが示され、ミスセンス変異とナンセンス変異とだけで疾患変異の約６０％を占めている。

ゲノムシーケンシング技術の最近の進歩は、個々のゲノムランドスケープを特徴づけ、診断と治療とに関連する変異体を特定する前例のない機会を提供する。実際、近年、ＮＧＳは薬理ゲノミクス研究の質問に対処するためにもますます適用されている。一部の患者が特定の薬に反応しない理由を説明する遺伝的原因を検出するだけでなく、遺伝情報に基づいて薬の成功を予測しようとすることも可能である。特定の遺伝的バリアントは特定のタンパク質の活性に影響を与える可能性があり、これらを使用して、そのようなタンパク質を標的とする薬物の有効性と毒性との可能性を推定することができる。したがって、ＮＧＳには、疾患の原因となるバリアントを見つけることをはるかに超えた用途がある。

すべてのＤＮＡの約９９．５％がすべてのヒトで共有されている。すべての違いを生むのは０．５％である。遺伝的多様性、またはバリアントは、各人のゲノムをその人固有にする違いである。ＤＮＡシーケンシングは、個体のＤＮＡ配列を、ゲノム参照コンソーシアム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ：ＧＲＣ）によって維持されている参照ゲノムのＤＮＡ配列と比較することにより、個体のバリアントを識別する。平均的なヒトのゲノムには何百万ものバリアントがあると考えられている。いくつかのバリアントは遺伝子で発生するが、ほとんどは遺伝子外のＤＮＡ配列で発生する。少数のバリアントは、がんなどの疾患と関連している。

がんは、異常細胞の増殖が制御されないことを特徴とする疾患である。正常組織では、細胞は、周囲の細胞からのシグナルに応答して組織内で分けられ、組織化し、組織状況によって慎重に調整された正常な細胞挙動をもたらす。がん細胞は、周囲の組織からの成長を制限する状況の手がかりに応答せず、多くの場合、がん細胞を増殖させ、多くの器官において腫瘍を形成させる遺伝子変化を有する。腫瘍の成長が進行するにつれて、遺伝的および表現型の変化が蓄積し続け、がん細胞の集団が抗腫瘍免疫応答などの追加の「チェックポイント」を克服できるようになり、がん細胞が、より攻撃的な成長表現型として出現する。未処置のままである場合、リンパ系または血流による身体の遠隔領域へのがん細胞の転移、拡散が起こる可能性がある。転移は、複数の部位での二次性腫瘍の形成をもたらし、健康な組織を損傷する。ほとんどのがん死亡は、このような二次性腫瘍によって引き起こされる。

現在の診断腫瘍学は、腫瘍断片から得られた情報を利用しており、腫瘍がその組成において均一な細胞から構成されるという仮定に基づいて予測される。組成が均一であるというよりはむしろ、多くの腫瘍は不均一である。実際、いくつかの固形腫瘍は、均一であるというよりむしろ、複数の遺伝的に異なり、空間的に分離されたがん細胞集団から構成されることが報告されている。Ｇｅｒｌｉｎｇｅｒら、ＮＥＪＭ（２０１２）３６６：８８３－９２；およびＹａｃｈｉｄａら、Ｎａｔｕｒｅ（２０１０）４６７（７３１９）：１１１４－１１１７を参照されたい（これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。従来の組織学的方法は、例えば形態学および他の特徴に基づいて、分析のための複数の生検サンプルを選択することでこの不均一性に対処している。例えば、生検サンプルは腫瘍の複数の領域から採取され、採取された各サンプルは約０．１立方センチメートルの組織を含む。しかし、これらの方法は、より多くの腫瘍組織および腫瘍の異なる空間領域を検査する。しかし、そのような方法を使用してアッセイされた腫瘍の大部分は、サンプリングされないままである。同様に、従来の方法は、がん患者からのリンパ節のごく一部のみをサンプリングし、組織の大部分をサンプリングしない。これらのサンプルのサイズが小さいことは、シーケンシングのような、利用されるさらなる診断段階をも制限することになる場合がある。

本開示の一態様は、サンプル（例えば、ヒト患者に由来するサンプル）中の複数の遺伝的バリアントを特定する方法であって、１種以上の腫瘍サンプルを均質化して均質化されたサンプルを供給することと、シーケンシングのために、均質化されたサンプルから単離されたゲノム材料を調製することと、調製された前記ゲノム材料をシーケンシングした後に、得られたシーケンシングデータ内の前記複数の遺伝的バリアントを特定することとを含む、方法である。いくつかの実施形態では、本方法は、特定された複数の遺伝的バリアントがクローナルであるかサブクローナルであるかを判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、１種以上のネオ抗原が、判定されたサブクローナル変異に由来する。いくつかの実施形態では、複数の遺伝的バリアントが、全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）、全エクソームシーケンシング（ＷＥＳ）、一塩基多型（ＳＮＰ）分析、ディープシーケンシング、合成によるシーケンシング、標的遺伝子シーケンシング、またはそれらの任意の組み合わせを使用して特定される。

いくつかの実施形態では、前記方法は、特定された複数の遺伝的バリアントに基づいてｃｔＤＮＡ監視パネルを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、生成されたｃｔＤＮＡ監視パネルが、治療に対する応答を判定するために使用される。いくつかの実施形態では、生成されたｃｔＤＮＡ監視パネルが、がんの進化軌跡を判定する。いくつかの実施形態では、生成されたｃｔＤＮＡ監視パネルが、将来の治療戦略に対する応答を予測するために使用される。いくつかの実施形態では、生成されたｃｔＤＮＡ監視パネルが、治療中または治療後の患者におけるがんの有無を確認するために使用される。いくつかの実施形態では、生成されたｃｔＤＮＡ監視パネルを使用して、疾患寛解後、治療に対する完全奏効後、または検出不能な疾患の診断後の患者におけるがんの存在を確認する。いくつかの実施形態では、生成されたｃｔＤＮＡ監視パネルが、原発性腫瘍の外科的除去後の最小残存疾患を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、生成されたｃｔＤＮＡ監視パネルが、転移性腫瘍の外科的除去後の最小残存疾患を検出するために使用される。

いくつかの実施形態では、本方法は、特定された複数の遺伝的バリアントに基づいてクローナル構造をコンピュータで計算することをさらに含む。いくつかの実施形態では、クローナル構造を計算することが、（ｉ）特定された前記複数の遺伝的バリアントのそれぞれについてがん細胞画分推定値を計算すること、および（ｉｉ）計算された前記がん細胞画分推定値を突然変異クラスターに分類することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、個々の特定された遺伝的バリアントの分離を評価することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、本方法は、ゲノム材料の調製の前に、前記均質化されたサンプル内の細胞粒子を選別することをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞粒子の選別はサイズに基づく。いくつかの実施形態では、細胞粒子の選別は１種以上のバイオマーカーの存在に基づく。

いくつかの実施形態では、方法は、特定された前記複数の遺伝的バリアントの中で１種以上の特定のサブクローナルバリアントが特定された場合、ヒト対象が急速な疾患進行のリスクが高いかどうかを評価することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、複数の同定された遺伝的バリアント内の１種以上の特定のサブクローナルバリアントの特定に基づいて代替療法が必要かどうかを判定することをさらに含む。

本開示の別の態様は、サンプル（例えば、ヒト患者に由来するサンプル）中の複数の遺伝的バリアントを特定する方法であって、１種以上のインプットサンプルを均質化して均質化されたサンプルを提供することと、シーケンシングのために、均質化されたサンプルから単離されたゲノム材料を調製することと、調製された前記ゲノム材料をシーケンシングした後に、得られたシーケンシングデータ内の前記複数の遺伝的バリアントを特定することとを含む、方法である。いくつかの実施形態では、本方法は、特定された複数の遺伝的バリアントがクローナルであるかサブクローナルであるかを判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、１種以上のネオ抗原が、判定されたサブクローナル変異に由来する。いくつかの実施形態では、複数の遺伝的バリアントが、全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）、全エクソームシーケンシング（ＷＥＳ）、一塩基多型（ＳＮＰ）分析、ディープシーケンシング、標的遺伝子シーケンシング、またはそれらの任意の組み合わせを使用して特定される。

いくつかの実施形態では、１種以上のインプットサンプルは、腫瘍サンプル、リンパ節サンプル、血液サンプル、および／または他の組織サンプルの１種以上に由来する。いくつかの実施形態では、１種以上のインプットサンプルは、腫瘍サンプルおよび／または血液サンプルの１種以上に由来する。いくつかの実施形態では、１種以上のインプットサンプルは腫瘍サンプルに由来する。いくつかの実施形態では、インプットサンプルは、（ｉ）がんと診断され、（ｉｉ）がんを患っていることが疑われ、（ｉｉｉ）がんを発症するリスクがあり、（ｉｖ）がんの再発または回帰のリスクがあり；および／または（ｖ）がんの再発が疑われるヒト患者または哺乳動物対象に由来する。いくつかの実施形態では、インプットサンプルは健康なヒト患者または哺乳動物対象に由来する。

いくつかの実施形態では、インプットサンプルは、腫瘍サンプル、リンパ節サンプル、血液サンプル、またはそれらの任意の組み合わせに由来する細胞の代表的なサンプルを含む。いくつかの実施形態では、代表的なサンプルは、固形腫瘍からの無傷の腫瘍生検サンプルから生成したものであってもよい。いくつかの実施形態では、生検サンプルは少なくとも約１００個～約２００個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、生検サンプルは少なくとも約２００個～１，０００個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、生検サンプルは少なくとも約１，０００個～約５，０００個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、生検サンプルは少なくとも約１０，０００個～約１００，０００個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、生検サンプルは、少なくとも約１００，０００個～１，０００，０００個またはそれ以上の細胞を含む。

いくつかの実施形態では、方法は、同定された複数の遺伝的バリアントに基づいてｃｔＤＮＡ監視パネルを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、生成されたｃｔＤＮＡ監視パネルは、治療に対する応答を判定するために使用される。いくつかの実施形態では、生成されたｃｔＤＮＡ監視パネル、がんの進化軌跡を判定するために使用される。いくつかの実施形態では、生成されたｃｔＤＮＡ監視パネルが、将来の治療戦略に対する応答を予測するために使用される。いくつかの実施形態では、生成されたｃｔＤＮＡ監視パネルが、治療中または治療後の患者におけるがんの有無を確認するために使用される。いくつかの実施形態では、生成されたｃｔＤＮＡ監視パネルが、疾患寛解後、治療に対する完全奏効後、または検出不能な疾患の診断後の患者におけるがんの存在を確認するために使用される。いくつかの実施形態では、生成されたｃｔＤＮＡ監視パネルが、原発性腫瘍の外科的除去後の最小残存疾患を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、ｃｔＤＮＡ監視パネルが、転移性腫瘍の外科的除去後の最小残存疾患を検出するために使用される。

いくつかの実施形態では、本方法は、特定された複数の遺伝的バリアントに基づいてクローナル構造をコンピュータで計算することをさらに含む。いくつかの実施形態では、クローナル構造を計算することが、（ｉ）特定された前記複数の遺伝的バリアントのそれぞれについてがん細胞画分推定値を計算すること、および（ｉｉ）計算された前記がん細胞画分推定値を突然変異クラスターに分類することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、個々の特定された遺伝的バリアントの分離を評価することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、本方法は、ゲノム材料の調製の前に、均質化されたサンプル内の細胞粒子を選別することをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞粒子の選別はサイズに基づく。いくつかの実施形態では、細胞粒子の選別は、１種以上のバイオマーカーの存在に基づく。

いくつかの実施形態では、方法は、１種以上の特定のサブクローナルバリアントが特定された複数の遺伝的バリアントの中で特定された場合に、ヒト対象が急速な疾患進行の危険性が高いかどうかを評価することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、特定された複数の遺伝的バリアント内の１種以上の特定のサブクローナルバリアントの特定に基づいて代替療法が必要かどうかを判定することをさらに含む。

本開示の別の態様は、サンプル（例えば、ヒト患者に由来するサンプル）中の複数の遺伝的バリアントを特定する方法であって、代表的なサンプルを得ること；代表的なサンプルのシーケンシング後に得られたシーケンシングデータ内の複数の遺伝的バリアントを特定することを含む、方法である。いくつかの実施形態では、代表的なサンプルは、固形腫瘍からの無傷の腫瘍生検サンプルから生成され得る。いくつかの実施形態では、生検サンプルは少なくとも約１００個～約２００個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、生検サンプルは少なくとも約２００個～約１，０００個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、生検サンプルは少なくとも約１，０００個～約５，０００個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、生検サンプルは少なくとも約１０，０００個～約１００，０００個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、生検サンプルは、少なくとも約１００，０００個～１，０００，０００個またはそれ以上の細胞を含む。

いくつかの実施形態では、代表的なサンプルは、１種以上のインプットサンプルを均質化することによって得ることができる。いくつかの実施形態では、１種以上のインプットサンプルは、腫瘍サンプル、リンパ節サンプル、血液サンプル、および／または他の組織サンプルの１種以上に由来する。いくつかの実施形態では、１種以上のインプットサンプルは、腫瘍サンプルおよび／または血液サンプルの１種以上に由来する。いくつかの実施形態では、１種以上のインプットサンプルは腫瘍サンプルに由来する。いくつかの実施形態では、インプットサンプルは、（ｉ）がんと診断され、（ｉｉ）がんを患っていることが疑われ、（ｉｉｉ）がんを発症するリスクがあり、（ｉｖ）がんの再発または回帰のリスクがあり；および／または（ｖ）がんの再発が疑われるヒト患者または哺乳動物対象に由来する。いくつかの実施形態では、インプットサンプルは健康なヒト患者または哺乳動物対象に由来する。

いくつかの実施形態では、本方法は、特定された複数の遺伝的バリアントがクローナルであるかサブクローナルであるかを判定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、１種以上のネオ抗原は、判定されたサブクローナル変異に由来する。いくつかの実施形態では、複数の遺伝的バリアントが、全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）、全エクソームシーケンシング（ＷＥＳ）、一塩基多型（ＳＮＰ）分析、ディープシーケンシング、一塩基合成法（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、標的遺伝子シーケンシング、またはそれらの任意の組み合わせを使用して特定される。

いくつかの実施形態では、方法は、特定された複数の遺伝的バリアントに基づいてｃｔＤＮＡ監視パネルを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、生成されたｃｔＤＮＡ監視パネルは、治療に対する応答を判定するために使用される。いくつかの実施形態では、生成されたｃｔＤＮＡ監視パネル、がんの進化軌跡を判定するために使用される。いくつかの実施形態では、生成されたｃｔＤＮＡ監視パネルが、将来の治療戦略に対する応答を予測するために使用される。いくつかの実施形態では、生成されたｃｔＤＮＡ監視パネルが、治療中または治療後の患者におけるがんの有無を確認するために使用される。いくつかの実施形態では、生成されたｃｔＤＮＡ監視パネルが、疾患寛解後、治療に対する完全奏効後、または検出不能な疾患の診断後の患者におけるがんの存在を確認するために使用される。いくつかの実施形態では、生成されたｃｔＤＮＡ監視パネルが、原発性腫瘍の外科的除去後の最小残存疾患を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、ｃｔＤＮＡ監視パネルが、転移性腫瘍の外科的除去後の最小残存疾患を検出するために使用される。

いくつかの実施形態では、本方法は、特定された複数の遺伝的バリアントに基づいてクローナル構造をコンピュータで計算することをさらに含む。いくつかの実施形態では、クローナル構造を計算することが、（ｉ）特定された前記複数の遺伝的バリアントのそれぞれについてがん細胞画分推定値を計算すること、および（ｉｉ）計算された前記がん細胞画分推定値を突然変異クラスターに分類することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、個々の特定された遺伝的バリアントの分離を評価することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、本方法は、ゲノム材料の調製の前に、均質化されたサンプル内の細胞粒子を選別することをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞粒子の選別はサイズに基づく。いくつかの実施形態では、細胞粒子の選別は、１種以上のバイオマーカーの存在に基づく。

いくつかの実施形態では、前記方法は、１つまたは複数の特定のサブクローナルバリアントが特定された複数の遺伝的バリアントの中で特定された場合に、ヒト対象が急速な疾患進行の危険性が高いかどうかを評価することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、特定された複数の遺伝的バリアント内の１種以上の特定のサブクローナルバリアントの特定に基づいて代替療法が必要かどうかを判定することをさらに含む。

現在までに数十万の固形腫瘍がシーケンシングされているが、基本的に不十分なサンプリングの偏りが現在の方法には内在している。これは、一定の寸法の生検インプットサンプルによって引き起こされ、腫瘍容積スケールとしては著しく能力に不足している。実際、現在の臨床および研究実務の本発明者らの分析は、既存のプロトコルが総腫瘍質量の０．０００５％～２．０％しかサンプリングしていないことを示しており、かなりのサンプリング枠の偏りがある。ここで、本発明者らは、固形腫瘍組織のサンプリングに偏りがなくなるような新規方法として、代表的なシーケンシング「Ｒｅｐ－Ｓｅｑ」を実証する。Ｒｅｐ－Ｓｅｑプロトコルは、次世代シーケンシングと組み合わせて、病理学検査のために採取されなかったすべての残留腫瘍材料を十分に混合した溶液に均質化することを含む。１１種の腫瘍で概念実証に基づいてＲｅｐ－Ｓｅｑを実施し、一致したシーケンシング深度で、単一および複数領域のシーケンシングアプローチに対して評価した。Ｒｅｐ－Ｓｅｑは、より多くのバリアントを検出することができ、サブクローナル変異からクローナルを決定する際により高い精度を達成することができ、複製物にわたって優れたレベルの再現性をもたらすことができた。結論として、Ｒｅｐ－Ｓｅｑは、偏りのない腫瘍サンプリングアプローチを効果的に実施し、腫瘍塊全体の十分に混合された溶液からＤＮＡ分子を引き抜き、その結果、現在のアプローチに固有の空間的な偏りをなくす。

本開示の特徴の一般的な理解のために、図面を参照する。図面では、同一の要素を識別するために、全体を通して同様の参照番号が使用されている。

図１は、均質化された腫瘍サンプル内の遺伝的バリアントを特定する工程を説明するフローチャートを提供する。

図２は、均質化された腫瘍サンプルに由来するゲノムデータをシーケンシングする工程を説明するフローチャートを提供する。

図３は、均質化された腫瘍サンプル由来の複数のゲノムサンプルの特定後に起こり得るさらなる下流のプロセスを示す。

図４は、現在の腫瘍シーケンシング方法が不十分なサンプリングの原因になることを示しており、これはより広いサンプリング枠を介して解決することができる。

図４Ａ（上段）は、がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）由来の腫瘍容積の分布の密度プロットを示し、腫瘍容積（ｃｍ３）は、対数スケールでｘ軸上にプロットされている。図４Ａ（中段）は、ＴＣＧＡサンプルの同じコホートにおける、シーケンシングのためのインプット材料として使用された生検組織の容積の密度プロットを示す。図４Ａ（下段）は、腫瘍病期によって分けられた、サンプリングされた組織（すなわち、それぞれの場合について、中央パネルからの値を上部パネルで分けたものである。）の割合を示す。

図４Ｂ（左側）は、組織部位によって分けられた、局所臨床監査からの推定腫瘍容積（ｃｍ^３）を示す。図４Ｂ（右側）は、臨床監査における、組織部位によって分けられた、サンプリングされた組織の割合を示す。

図４Ｃは、プールされた「カクテル」サンプルのパイロット実験に使用された実験計画を示す。

図４Ｄ（左側）は、複数生検シーケンシング（ｙ軸）から推定した真のＶＡＦと比較した、カクテルシーケンシング（ｘ軸）間のバリアント対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）相関を示す。図４Ｄ（右側）は、複数生検シーケンシング（ｙ軸）から推定した真のＶＡＦと比較した、単一領域シーケンシング（ｘ軸）間のバリアント対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）相関を示す。

図４Ｅ（左側）は、非小細胞肺がんのパイロットデータセットにおいて各シーケンシング方法で発見されたバリアントの数を示す。図４Ｅ（右側）は、非小細胞肺がんの単一領域生検シーケンシングと比較して、「カクテル」シーケンシングを使用して発見された既知の真のバリアントの割合を示す。

図４Ｆ（左側）は、尿路上皮がん腫のパイロットデータセットにおいて各シーケンシング方法で発見されたバリアントの数を示す。図４Ｆ（右側）は、尿路上皮がん腫についての単一領域生検シーケンシングと比較して、「カクテル」シーケンシングを使用して発見された既知の真のバリアントの割合を示す。

図５は、本明細書に記載の代表的なサンプリングシーケンシング方法を示す。

図５Ａは、本明細書に記載されるいくつかの実施形態による新たな代表的シーケンシング（Ｒｅｐ－Ｓｅｑ）方法のための方法論的ワークフローを示す。

図５Ｂは、広範な生検サンプリングに対するＲｅｐ－Ｓｅｑ法の検証のためのサンプリング戦略を示す。

図５Ｃは、事例Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１でシーケンシングされた、すべての生検、ｃｔＤＮＡサンプルおよびＲｅｐ－Ｓｅｑ生物学的複製物にわたって発見された非同義バリアントのマップを示す。

図５Ｄは、再現性の尺度としての、単一生検シーケンシング対Ｒｅｐ－Ｓｅｑ（左）、およびｃｔＤＮＡシーケンシング対Ｒｅｐ－Ｓｅｑ（右）についてのジャッカード類似性指数の結果を示す。

図５Ｅは、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ（ＶＡＦ）サンプルおよび全腫瘍（ＶＡＦ）サンプルで検出されたバリアントに対するバリアント対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）のグラフを提供する。

図６は、Ｒｅｐ－ＳｅｑおよびｃｔＤＮＡによるクローナルトラッキングを示す。

図６Ａは、広範な複数生検シーケンシング（左側）および単一のＲｅｐ－Ｓｅｑサンプルを使用して導き出された場合の事例Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１の系統樹を示す。

図６Ｂは、原発性Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１腫瘍およびリンパ節転移の４つのスライス片にわたるクローナル分布を示す。

図６Ｃは、各生検サンプル（左側）およびＲｅｐ－Ｓｅｑサンプル（右側）における腫瘍クローンＡ、ＢおよびＣにおける変異についてのがん細胞画分（ＣＣＦ）推定値を示す。

図６Ｄは、クローン性シミュレーションデータの錯視を示し、シミュレートされた生検サンプルの数がｘ軸にプロットされ、ｙ軸にはクローナル（クローン性の幻影）と誤って表示されるバリアントのパーセンテージがプロットされている（１００のシミュレートされたサンプルの組み合わせから）。

図６Ｅは、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１のｃｔＤＮＡデータを示し、ＶＡＦは、クローンＡ、ＢおよびＣにおける突然変異についてプロットされている（ｙ軸）。

図６Ｆは、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ法を使用して構築された、事例Ｒｅｐ－Ｓｅｑ２およびＲｅｐ－Ｓｅｑ３の系統樹を示す。

図６Ｇは、事例Ｒｅｐ－Ｓｅｑ４～Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１１の非同義変異カウント（上段）を、変異シグネチャー分析の結果（下段）と共に示す。

図６Ｈは、大量混合細胞集団全体のＲｅｐ－Ｓｅｑ１１分布範囲データを、次いで推定腫瘍細胞の分布範囲データを純度推定値と共に示す（左側）。比較のために、標準Ｒｅｐ－Ｓｅｑを示し、次いで腫瘍純度を高めたＲｅｐ－Ｓｅｑのデータを示す。図６Ｈは、正常な濃縮Ｒｅｐ－Ｓｅｑサンプルおよび純度を高めたＲｅｐ－Ｓｅｑサンプル（右側）において検出された非同義バリアントの数を示す。バリアントカウントは、「共通」（すなわち、両方のサンプルに存在する）または「プライベート」（すなわち、バリアントはそのサンプルにのみ存在し、他方には存在しない）のいずれかに基づいて色分けされる。

図７は、事例Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１についての各生検サンプルおよびＲｅｐ－Ｓｅｑ生物学的複製からの予測されたネオ抗原を示す。腫瘍は数千の突然変異またはバリアントを含む可能性があるが、これらの突然変異の一部のみがネオ抗原（すなわち、免疫系に対して「異物」として感知される変化したタンパク質）として免疫系に提示される。突然変異が免疫系によって異物として効果的に認識されるかどうかを事前に知ることは不可能であるため、修飾（すなわち変異している）タンパク質の抗原性を予測するためにコンピュータアルゴリズムが使用される。ネオ抗原を使用して、個別化ワクチンを作製することによってがん患者の免疫応答を不正にすることができる。標的個別化ネオ抗原によるワクチン接種後の有効な免疫応答の重要な構成要素は、（１）ネオ抗原のクローン性の適切な検出（免疫応答を誘発するサブクローナルネオ抗原として、そのネオ抗原を有するがん細胞のみを排除する）、および（２）すべての患者から可能な限り多くのネオ抗原を発見すること（予測されたネオ抗原が免疫系の生産的刺激因子であるかどうかを知ることが不可能であるので、個別化がんワクチンの有用性は、標的化されたネオ抗原の数に依存する可能性が高い）である。したがって、Ｒｅｐ－Ｓｅｐは、図７に示すように、すべての場合において単一の生検よりも優れている。

図８Ａおよび図８Ｂは、疾患の２０の異なる解剖学的部位からの迅速剖検時に採取された転移生検領域（図８Ｂ）と共に、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１（図８Ａ））についてのすべての原発生検領域についてのコピー数ヒートマップを示す。生検は、染色体アーム１４ｑについての降順のｌｏｇ（Ｒ）値に基づいて順序付けられる。転移領域はすべて、原発生検領域（クローンＢ）の約半分と共に１４ｑの損失を含み、転移がクローンＢによって生じたことを示唆している。本発明者らは、転移における１４ｑの喪失が独立した並行事象であった可能性を排除することはできないが、ｃｔＤＮＡデータ、リンパ節代表的シーケンシングおよび剖検転移データを組み合わせると、すべてその仮説を支持することに注目する。

図９は、事例Ｒｅｐ－Ｓｅｑ４からＲｅｐ－Ｓｅｑ１０における全エクソームシーケンシングからのバリアント対立遺伝子頻度を、Ｒｅｆ＞代替塩基変化および頻度（５％ ＶＡＦより上または下）によって分割して提供する。ＦＦＰＥアーチファクト（例えば、Ｃ＞Ｔ、Ｇ＞Ａ）に関連する塩基変化は、低頻度突然変異の上昇ではない。これらのデータは、Ｒｅｐ－Ｓｅｑが標準的なシーケンシング方法と同等のシーケンシングデータを生成し、長期間のホルマリン固定が均質化された残留腫瘍組織からのＤＮＡのシーケンシングに悪影響を及ぼさないことを実証している。

反対に明確に示されない限り、複数の工程または行為を含む本明細書において特許請求の範囲に記載される任意の方法において、方法の工程または行為の順序は、必ずしも方法の工程または行為が記載される順序に限定されないことも理解されたい。

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「または」という単語は、文脈が明確に別のことを示さない限り、「および」を含むことを意図している。「含む」という用語は、「ＡまたはＢを含む」がＡ、Ｂ、またはＡおよびＢを含むことを意味するように、包括的に定義される。

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上記で定義された「および／または」と同じ意味を有することを理解されたい。例えば、リスト内の項目を区切る場合、「または」または「および／または」は、包括的であると解釈されるものとし、すなわち、要素の数またはリストの少なくとも１つを含むが、複数、および必要に応じて追加のリストに記載されていない項目を含むと解釈される。「のうちの１つのみ」または「のうちの正確に１つ」、または特許請求の範囲で使用される場合、「からなる」など、反対に明確に示される用語のみは、数または要素のリストのうちの正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」または「のうちの正確に１つ」など、排他性の用語が先行する場合にのみ、排他的な代替案（すなわち、「一方または他方であるが双方ではない」）を示すものとしてのみ解釈されるものとする。「から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。

「備える」、「含む」、「有する」などの用語は、交換可能に使用され、同じ意味を有する。同様に、「備える」、「含む」、「有する」などは、交換可能に使用され、同じ意味を有する。具体的には、各用語は、「を含み、」という共通の米国特許法の定義と一致して定義され、したがって、「少なくとも、」を意味するオープンタームであると解釈され、追加の特徴、制限、態様などを排除しないと解釈される。したがって、例えば、「構成要素ａ、ｂ、およびｃを有する装置」は、装置が少なくとも構成要素ａ、ｂおよびｃを有することを意味する。同様に、「工程ａ、ｂ、およびｃを含む方法」という語句は、方法が少なくとも工程ａ、ｂ、およびｃを含むことを意味する。さらに、工程およびプロセスは、本明細書において特定の順序で概説される可能性があるが、当業者は、順序付け工程およびプロセスが異なる可能性があることを認識するであろう。

本明細書の明細書および特許請求の範囲で使用される場合、１つ以上の要素のリストに関連する「少なくとも１つ」という句は、要素のリストの任意の１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、必ずしも要素のリスト内に具体的にリスト化されているありとあらゆる要素の少なくとも１つを含まなくてもなく、要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを除外するものではない。この定義はまた、「少なくとも１つ」という句が参照する要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の要素が、具体的に特定されるそれらの要素に関連するかどうかにかかわらず、必要に応じて存在し得ることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、少なくとも１つ、必要に応じて１つを超えるＡを含み、Ｂが存在しない（および必要に応じて、Ｂ以外の要素を含む）を指すことができ、別の実施形態では、少なくとも１つ、必要に応じて１つを超えるＢを含み、Ａが存在しない（および必要に応じて、Ａ以外の要素を含む）を指すことができ、さらに別の実施形態では、少なくとも１つ、必要に応じて１つを超えるＡを含み、少なくとも１つ、必要に応じて１つを超えるＢを含む（および必要に応じて、他の要素を含む）などを指すことができる。

本明細書で使用される場合、「生物学的サンプル」、「組織サンプル」、「標本」などの用語は、ウイルスを含む任意の生物から得られる生体分子（タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、炭水化物、またはそれらの組み合わせなど）を含む任意のサンプルを指す。生物の他の例は、哺乳類（ヒト、猫、犬、馬、牛、および豚などの獣医動物、ならびにマウス、ラット、霊長類などの実験動物など）、昆虫、環形動物、クモ形類動物、有袋類、爬虫類、両生類、細菌、および菌類などを含む。生物学的サンプルは、組織サンプル（組織切片や組織の針生検など）、細胞サンプル（Ｐａｐ塗抹標本もしくは血液塗抹標本などの細胞学的塗抹標本、またはマイクロダイセクションによって得られた細胞のサンプルなど）、または細胞分画、断片または細胞小器官（細胞を溶解し、遠心分離などによってそれらの成分を分離することによって得られる）を含む。生物学的サンプルの他の例は、血液、血清、尿、精液、糞便、脳脊髄液、間質液、粘膜、涙、汗、膿、生検組織（例えば、外科的生検または針生検によって得られる）、乳頭吸引物、耳垢、乳、膣液、唾液、ぬぐい液（頬スワブなど）、または最初の生物学的サンプルに由来する生体分子を含む任意の材料を含む。特定の実施形態では、本明細書で使用される「生物学的サンプル」という用語は、対象から取得された腫瘍またはその一部から調製されたサンプル（均質化または液化されたサンプルなど）を指す。

本明細書で使用される場合、「バイオマーカー」という用語は、正常もしくは異常な過程、または状態もしくは疾患（がんなど）の徴候である血液、他の体液、または組織に見られる生物学的分子を指す。バイオマーカーを使用して、身体が疾患もしくは状態の治療にどれだけ良好に応答するか、または対象が疾患もしくは状態にかかりやすいかを判定することができる。がんとの関連において、バイオマーカーは、体内にがんがあることを示す生体物質を指す。バイオマーカーは、腫瘍によって分泌される分子、またはがんの存在に対する身体の特異的応答である可能性がある。遺伝子バイオマーカー、エピジェネティックバイオマーカー、プロテオミクスバイオマーカー、グリコームバイオマーカーおよびイメージングバイオマーカーは、がんの診断、予後診断および疫学のために使用することができる。そのようなバイオマーカーは、血液または血清などの非侵襲的に収集された生体流体でアッセイすることができる。ＡＦＰ（肝臓がん）、ＢＣＲ－ＡＢＬ（慢性骨髄性白血病）、ＢＲＣＡ１／ＢＲＣＡ２（乳がん／卵巣がん）、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ（黒色腫／結腸直腸がん）、ＣＡ－１２５（卵巣がん）、ＣＡ１９．９（膵臓がん）、ＣＥＡ（結腸直腸がん）、ＥＧＦＲ（非小細胞肺がん）、ＨＥＲ－２（乳がん）、ＫＩＴ（消化管間質腫瘍）、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、Ｓ１００（黒色腫）などを含むがこれらに限定されないいくつかの遺伝子およびタンパク質ベースのバイオマーカーが既に患者の治療に使用されている。バイオマーカーは、診断薬（早期がんを特定するため）および／または予後診断薬（がんがどの程度侵攻性であるかを予測するため、および／または対象が特定の治療にどのように応答するか、および／またはがんがどの程度再発する可能性があるかを予測するため）として有用であり得る。

本明細書で使用される場合、「細胞粒子」という用語は、個々の細胞または細胞から放出された細胞小器官を指す。いくつかの実施形態では、細胞から放出される細胞小器官は、細胞核である。他の実施形態では、細胞から放出された細胞小器官は、核の起源細胞を特定するために使用され得る細胞質物質の残骸を含む細胞核である。例えば、サイトケラチンは、核に付着したままであってもよく、腫瘍細胞に由来する核のタンパク質マーカーとして使用することができる。

本明細書で使用される場合、「クローナル変異」という用語は、大部分の細胞に存在する突然変異を指す。

本明細書で使用される場合、「ｃｔＤＮＡ」という用語は、原発性腫瘍細胞、血液循環系の循環腫瘍細胞および壊死もしくはアポトーシス腫瘍細胞から末梢血に放出された遊離ＤＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを指す。

本明細書で使用される場合、「リスク上昇」という用語は、別の集団と比較して事象が起こる確率よりも高い確率に関する。本開示の文脈において、「急速な疾患進行のリスクが高い対象」は、そのような変異を有しない対象と比較して、サブクローナル変異を含む１種以上の突然変異の存在に起因して急速な疾患進行の確率が増加した対象（例えば、ヒト患者）を指す。

本明細書で使用される場合、「均質化すること」または「均質化」という用語は、生物学的サンプルが、サンプルのすべての画分の組成が等しくなるような状態にされるプロセス（機械的プロセスおよび／または生化学的プロセスなど）を指す。代表的なサンプル（上で定義した通り）は、均質化されたサンプルの一部を除去することによって調製することができる。均質化されたサンプル（「ホモジネート」）は、サンプルの一部（アリコート）を除去しても残留サンプルの全体的な構成が実質的に変化せず、除去されたアリコートの成分が残留サンプルの成分と実質的に同一であるように十分に混合される。本開示において、「均質化」は、一般に、サンプル中の大部分の細胞の完全性を保持し、例えば、サンプル中の少なくとも５０％の細胞は、均質化プロセスの結果として破裂または溶解されない。他の実施形態では、均質化は、サンプル中の少なくとも８０％の細胞の完全性を保持する。他の実施形態では、均質化は、サンプル中の少なくとも８５％の細胞の完全性を保持する。他の実施形態では、均質化は、サンプル中の少なくとも９０％の細胞の完全性を保持する。他の実施形態では、均質化は、サンプル中の少なくとも９５％の細胞の完全性を保持する。他の実施形態では、均質化は、サンプル中の少なくとも９６％の細胞の完全性を保持する。他の実施形態では、均質化は、サンプル中の少なくとも９７％の細胞の完全性を保持する。他の実施形態では、均質化は、サンプル中の少なくとも９８％の細胞の完全性を保持する。他の実施形態では、均質化は、サンプル中の少なくとも９９％の細胞の完全性を保持する。他の実施形態では、均質化は、その中の少なくとも９９．９％の細胞の完全性を保持する。ホモジネートは、個々の細胞（または細胞のクラスタ）に実質的に解離されてもよく、得られた１以上のホモジネートは、実質的に均質である（同様の要素からなるか、または構成されるか、または全体にわたって均一である）。

本明細書で使用される場合、「リンパ節」という用語は、脇の下および胃を含む身体全体にわたって広く存在し、リンパ管によって連結されたリンパ系の楕円形または腎臓形の器官を指す。リンパ節は、Ｂ細胞およびＴ細胞を含むがこれらに限定されない多様な数の免疫細胞を含む。いくつかの実施形態では、リンパ節は隠れた腫瘍細胞を含み得る。

本明細書で使用される場合、「ネオ抗原」という用語は、細胞のプロテオームに通常は存在しないペプチドによって形成される抗原である。「抗原」という用語は、本明細書では当該分野でそのまま使用され、抗体産生が可能な生物において抗体の産生を誘導する分子またはその一部を意味する。いくつかの実施形態では、「ネオ抗原」という用語は、発現タンパク質中の腫瘍特異的変異から生じる１種の腫瘍抗原を指す。いくつかの実施形態では、ネオ抗原は、任意のがん、腫瘍またはその細胞に由来し得る。いくつかの実施形態では、この用語は、ネオ抗原性ペプチドおよびネオ抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドの両方を包含する。すべての抗原が免疫応答を誘発できるわけではないので、「抗原性」という用語は「免疫原性」と同義ではない。同様に、「抗原」という用語は「免疫原」と同義ではない。本明細書で使用される場合、本開示の方法を使用して発見されるネオ抗原は、免疫原性であってもなくてもよい。いくつかの実施形態では、本開示の方法を使用して発見されるネオ抗原は免疫原性である。いくつかの実施形態では、本開示の方法を使用して発見されるネオ抗原は、１つの宿主、例えばヒト宿主に対して免疫原性ではないが、治療的にそれらを標的とする抗体を他の宿主で生成するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本開示のネオ抗原は、細胞の個々の集団ごとに特異的であってもよい。例えば、１つの対象から得られる細胞の集団は、異なる対象から得られる細胞の集団に含まれるネオ抗原とは異なる抗原を含んでいてもよい。したがって、細胞のＤＮＡは、異なる対象から採取された２つの細胞集団間で同一またはほぼ同一であることもあるが、細胞集団に含まれるネオ抗原は異なることもある。したがって、本開示は、個別化医療の方法に適用することができる。

本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「核酸」という用語は、遺伝情報を伝達するヌクレオチド鎖で構成される高分子量生化学高分子を指す。最も一般的な核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）である。核酸が構築されるモノマーはヌクレオチドと呼ばれる。各ヌクレオチドは、３つの成分：窒素複素環塩基、プリンまたはピリミジン（核酸塩基としても知られる）のいずれか；およびペントース糖からなる。異なる核酸タイプは、それらのヌクレオチドにおける糖の構造が異なる；ＤＮＡは２－デオキシリボースを含み、ＲＮＡはリボースを含む。

本明細書で使用される場合、「読み取り深度」または「シーケンシング深度」という用語は、配列がシーケンシングされた回数（シーケンシングの深さ）を指す。例として、読み取り深度は、複数のシーケンシング実行結果を整列させ、特定のサイズ（たとえば、１００ｂｐ）の重複しないウィンドウで読み取りの開始位置をカウントすることによって決定できる。コピー数多型は、当技術分野で知られている方法を使用して、読み取り深度に基づいて決定することができる。たとえば、Ｙｏｏｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；１９（９）：１５８６－１５９２；Ｘｉｅら，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００９ Ｍａｒ．６；１０：８０；またはＭｅｄｖｅｄｅｖら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００９ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；６（１１ Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ１３－２０に記載されている方法を使用する。

本明細書で使用される場合、「代表サンプル」および「代表的なサンプリング」という用語は、全体の成分を正確に反映するサンプル（またはサンプルのサブセット）を指し、したがって、サンプルは集団全体の偏りのない指標である。一般に、これは、代表的なサンプルまたはその一部内の異なるタイプの細胞およびそれらの相対的な割合またはパーセンテージが、組織標本全体、一般に固形腫瘍またはその一部内のこれらの細胞タイプの相対的な割合またはパーセンテージを本質的に正確に反映または模倣することを意味する。サンプリングは、その後の分析のために対象物の一部を確保する動作である。代表的なサンプルは、研究対象の目的に合理的に近い知識を得ることができるように生成される。対照的に、従来のランダムサンプリング法では、一般に「代表サンプル」を得られない。より大きなサンプルからのより小さな個々のサブサンプルの選択は、選択された領域に基づいて偏っている場合があるが、大きなサンプル、例えば腫瘍またはリンパ節全体を均質化すると、空間的に分離された要素がサンプル全体に均一に分散される。

本明細書で使用される場合、「シーケンシング」または「ＤＮＡシーケンシング」という用語は、ＤＮＡオリゴヌクレオチド中のヌクレオチド塩基、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンの順序を決定するための生化学的方法を指す。シーケンシングは、この用語が本明細書で使用される場合、並列シーケンシングまたは当業者に公知の任意の他のシーケンシング方法、例えば、鎖終結法、迅速ＤＮＡシーケンシング法、遊走スポット分析、Ｍａｘａｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔシーケンシング、色素ターミネーターシーケンシング、または任意の他の最新の自動ＤＮＡシーケンシング装置を使用することが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「配列データ」または「シーケンシングデータ」という用語は、当業者に知られている核酸分子に関する任意の配列情報を指す。配列データは、核酸配列に変換されることになるＤＮＡまたはＲＮＡ配列、修飾された核酸、一本鎖または二本鎖配列、あるいはアミノ酸配列に関する情報を含み得る。配列データは、シーケンシング装置、取得日、読み取り長、シーケンシングの方向、シーケンシングされた実体の起源、隣接する配列または読み取り、反復の存在、または当業者に知られている他の適切なパラメータに関する情報をさらに含み得る。配列データは、当業者に知られている任意の適切なフォーマット、アーカイブ、コーディング、または文書で提示することができる。

本明細書中で使用されるとき、用語「サブクローナル変異」とは、がん細胞の１００％未満、典型的には５０％未満に存在する変異のことを指す。サブクローナル変異は、腫瘍の大部分（すなわち、１００％未満であるが、５０％を超える）または腫瘍の少数（すなわち、５０％未満）に存在し得る。

本明細書で使用される場合、「腫瘍」という用語は、それ自体が、通常は正常な細胞よりも急速に増殖し、治療しなければ増殖し続ける細胞の異常な新たな増殖として定義され、隣接する構造に損傷をもたらすことがある塊または新生物を指す。腫瘍サイズは大きく異なり得る。腫瘍は、固体または流体充填であり得る。腫瘍は、良性（悪性ではなく、一般に無害である）または悪性（転移性）の増殖を指し得る。いくつかの腫瘍は、良性である新生物細胞（上皮内がんなど）を含有し、同時に悪性がん細胞（腺がんなど）を含有し得る。これは、身体全体の複数の場所に位置する新生物を含むと理解すべきである。したがって、本開示の目的のために、腫瘍には、原発性腫瘍、リンパ節、リンパ組織、および転移性腫瘍が含まれる。

本明細書で使用される場合、「腫瘍サンプル」という用語は、腫瘍から調製されたサンプル、またはがん細胞を潜在的に含み、もしくは含むと疑われるサンプル、またはがん細胞の潜在的存在について試験されるサンプルを包含する。いくつかの実施形態では、腫瘍サンプルは、例えばリンパ節に由来し得る。

本明細書で使用される場合、「バリアント」または「遺伝的バリアント」という用語は、遺伝子の代替形態、ゲノム配列、またはそれらの一部を指す。バリアントは、ゲノムの変化に対応して、タンパク質またはＲＮＡレベルで言及することもできる。いくつかの実施形態において、バリアントは、タンパク質配列中のアミノ酸の変化を引き起こすが、ＲＮＡスプライシング、翻訳、または他のレベルの転写または翻訳調節に関してなど、タンパク質または細胞の機能または活性に影響を及ぼす可能性もある。「バリアント」はまた、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない（すなわち、保存された変化）位置で、集団において最も一般的な配列と配列が異なるポリペプチドを指すことができる。遺伝的バリアントポリペプチドは、リスクハプロタイプによってコードされるか、保護ハプロタイプによってコードされるか、または中性ハプロタイプによってコードされることができる。遺伝的バリアントポリペプチドは、リスクに関連するか、保護に関連するか、または中性である可能性がある。遺伝的バリアントの非限定的な例には、フレームシフト、獲得停止、喪失開始、スプライスアクセプター、スプライスドナー、喪失停止、ミスセンス、スプライス領域、同義およびコピー数バリアントが含まれる。非限定的なタイプのコピー数多型には、欠失および重複が含まれる。

シーケンシングのための代表サンプルの生成

インプットサンプルおよび均質化

いくつかの実施形態では、腫瘍サンプル、リンパ節サンプル、血液サンプルおよび／または他の組織サンプル（ひとまとめにして「入力サンプル」）は、サンプルを機械的剪断装置、例えばブレンダーまたはウルトラソニケーターに入れることによって均質化される（工程１００）。

いくつかの実施形態では、インプットサンプルは、腫瘍サンプル、リンパ節サンプル、血液サンプル、またはそれらの任意の組み合わせに由来する細胞の代表的なサンプルを含む。いくつかの実施形態では、インプットサンプルは、（ｉ）がんと診断され、（ｉｉ）がんを患っていることが疑われ、（ｉｉｉ）がんを発症するリスクがあり、（ｉｖ）がんの再発または回帰のリスクがあり；および／または（ｖ）がんの再発が疑われるヒト患者または哺乳動物対象に由来する。いくつかの実施形態では、インプットサンプルは健康なヒト患者または哺乳動物対象に由来する。

いくつかの実施形態では、代表的なサンプルは、対象から得られた大量または多量の腫瘍サンプル（臨床腫瘍サンプルなど）またはリンパ節の均質化（工程１００）によって得られる。例えば、腫瘍全体またはそのかなりの部分が、代表的なサンプルが生成される入力材料として使用され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも４０％の腫瘍またはリンパ節（または、従来のＦＦＰＥサンプルの調製に使用可能な部分の除去など、他の診断試験に使用される部分の除去後に残る部分）が均質化のために利用される。他の実施形態では、少なくとも５０％の腫瘍またはリンパ節が均質化のために利用される。他の実施形態では、少なくとも６０％の腫瘍またはリンパが均質化のために利用される。他の実施形態では、少なくとも７０％の腫瘍またはリンパ節が均質化のために利用される。他の実施形態では、少なくとも８０％の腫瘍またはリンパ節％が均質化のために利用される。他の実施形態では、少なくとも９０％の腫瘍またはリンパ節が均質化のために利用される。他の実施形態では、少なくとも９１％の腫瘍またはリンパ節が均質化のために利用される。他の実施形態では、少なくとも９２％の腫瘍またはリンパ節が均質化のために利用される。他の実施形態では、少なくとも９３％の腫瘍またはリンパ節が均質化のために利用される。他の実施形態では、少なくとも９４％の腫瘍またはリンパ節が均質化のために利用される。他の実施形態では、少なくとも９５％の腫瘍またはリンパ節が均質化のために利用される。他の実施形態では、少なくとも９６％の腫瘍またはリンパ節が均質化のために利用される。他の実施形態では、少なくとも９７％の腫瘍またはリンパ節が均質化のために利用される。他の実施形態では、少なくとも９８％の腫瘍またはリンパ節が均質化のために利用される。他の実施形態では、少なくとも９９％の腫瘍またはリンパ節が均質化のために利用される。さらに他の実施形態では、腫瘍全体、リンパ節全体、またはリンパ節の集団全体（または、従来のＦＦＰＥサンプルの調製に使用可能な部分の除去など、他の診断試験に使用される部分の除去後に残るその部分）を均質化に使用する。

代表的なサンプルは、固形腫瘍からの無傷の腫瘍生検サンプルから生成することができる。いくつかの実施形態では、生検サンプルは少なくとも約１００個～約２００個の細胞を含む。他の実施形態では、生検サンプルは、少なくとも約２００個～約１，０００個の細胞を含む。さらに他の実施形態では、生検サンプルは、少なくとも約１，０００個～約５，０００個の細胞を含む。さらなる実施形態では、生検サンプルは少なくとも約１０，０００個～約１００，０００個の細胞を含む。なおさらなる実施形態では、生検サンプルは、少なくとも約１００，０００個～約１，０００，０００個またはそれ以上の細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞は腫瘍の空間的に異なる領域から得られる。別の実施形態では、本明細書に開示される代表的な例は、例えば、遺伝子変異または以前のがんのためにがんを発症するリスクがあるものを含む、がんを発症するリスクがある患者または哺乳動物対象に由来する１種以上の推定正常組織標本の均質化によって得られる。本明細書で使用される場合、「空間的に異なる」という用語は、空間の異なる領域に分布する要素を指す。一実施形態では、代表的なサンプルを生成するために使用される腫瘍生検サンプルは、腫瘍サンプルの異なる領域から採取される。例えば、腫瘍全体内の多様性を捕らえるために、腫瘍の近位領域と遠位領域、腫瘍の異なる面、腫瘍の異なる層などから採取される。

いくつかの実施形態において、腫瘍サンプル、リンパ節サンプルまたは他の組織サンプルは、サンプルを機械的剪断装置（例えば、ブレンダーまたは超音波処理器）に入れることによって均質化される。いくつかの実施形態では、均質化は、それぞれ数千～数百個にわたる細胞の組織断片を生成する。いくつかの実施形態では、組織断片サイズの中央値は、ブレンダー（または他の適切な装置）のエネルギーと逆相関する。そのため、高エネルギーでは、組織断片は非常に小さい。いくつかの実施形態では、ブレンダエネルギーに最も関連する組織の成分は、真皮が完全な解離のためにかなりのエネルギーを必要とするため、コラーゲン含有量である。いくつかの実施形態では、ブレンドの時間も重要であるが、最も効果的な臨床用途では、腫瘍全体を数分で解離させる必要がある。ブレンド時間が固定されると、所望の時間制限下で腫瘍解離に達するのに必要なエネルギーを容易に決定することができる。腫瘍サンプルまたはリンパ節サンプルを調製する他の方法は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０１７／０７９７６および米国特許出願公開第２０１８／０３２０２２９号に開示されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書にさらに記載されるように、シーケンシングのためのゲノム材料の調製に使用するために、一部を均質化されたサンプルから取り出すことができる。

腫瘍、リンパ節、および／または他の組織サンプルを分離するのに十分な機械的剪断の後、元々のサンプル内で空間的に隔離されていた腫瘍細胞のすべての亜集団が、新たに均質化されたサンプル全体に分布する。すなわち、腫瘍、１以上のリンパ節、血液、またはそれらの任意の組み合わせを均質化した結果として、腫瘍内の細胞の任意の不均一性は、得られた均質物またはその一部もしくは一部内に実質的に均質に（均一に）分布し、その結果、均質物（またはその任意の一部）は、投入された腫瘍および／またはリンパ節サンプルの不均一性を実質的に均質に発現する。腫瘍および／またはリンパ節を均質化して、その全体が腫瘍を表すサンプル（またはホモジネート）を生成することによって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、均質化されたサンプル内に存在する遺伝的バリアントをシーケンシングすることなどによって、腫瘍のランドスケープ（不均一性など）を特徴付けることが可能である。

いくつかの実施形態では、インプットサンプルは、例えば複数の組織学的切片および／または複数の生検サンプルから得られる、十分な量の組織学的切片および／または生検サンプルに由来する。いくつかの実施形態では、組織学的切片および／または生検サンプルに由来するインプットサンプルは、少なくとも０．２マイクログラムのゲノム材料を含む。いくつかの実施形態では、組織学的切片および／または生検サンプルに由来するインプットサンプルは、少なくとも０．３マイクログラムのゲノム材料を含む。いくつかの実施形態では、組織学的切片および／または生検サンプルに由来するインプットサンプルは、少なくとも０．４マイクログラムのゲノム材料を含む。いくつかの実施形態では、組織学的切片および／または生検サンプルに由来するインプットサンプルは、少なくとも０．５マイクログラムのゲノム材料を含む。他の実施形態では、組織学的切片および／または生検サンプルに由来するインプットサンプルは、少なくとも１マイクログラムのゲノム材料を含む。他の実施形態では、組織学的切片および／または生検サンプルに由来するインプットサンプルは、少なくとも５マイクログラムのゲノム材料を含む。他の実施形態では、組織学的切片および／または生検サンプルに由来するインプットサンプルは、少なくとも１０マイクログラムのゲノム材料を含む。

いくつかの実施形態では、開示される方法とともに使用するためのインプットサンプル内のゲノム材料の量は、従来の配列捕捉方法とともに使用するためのインプットサンプル内の材料の量よりも少なくとも１０倍多い。いくつかの実施形態では、開示される方法とともに使用するためのインプットサンプル内のゲノム材料の量は、従来の配列捕捉方法とともに使用するためのインプットサンプル内の材料の量よりも少なくとも５０倍多い。いくつかの実施形態では、開示される方法とともに使用するためのインプットサンプル内のゲノム材料の量は、従来の配列捕捉方法とともに使用するためのインプットサンプル内の材料の量よりも少なくとも１００倍多い。いくつかの実施形態では、開示される方法とともに使用するためのインプットサンプル内のゲノム材料の量は、従来の配列捕捉方法とともに使用するためのインプットサンプル内の材料の量よりも少なくとも２５０倍多い。いくつかの実施形態では、開示される方法とともに使用するためのインプットサンプル内のゲノム材料の量は、従来の配列捕捉方法とともに使用するためのインプットサンプル内の材料の量よりも少なくとも５００倍多い。いくつかの実施形態では、開示される方法とともに使用するためのインプットサンプル内のゲノム材料の量は、従来の配列捕捉方法とともに使用するためのインプットサンプル内の材料の量よりも少なくとも１０００倍多い。いくつかの実施形態では、開示される方法とともに使用するためのインプットサンプル内のゲノム材料の量は、従来の配列捕捉方法とともに使用するためのインプットサンプル内の材料の量よりも約１０００倍多い。

均質化されたサンプルのその後の処理

いくつかの実施形態では、均質化されたサンプルは、下流分析の前にさらに処理される。例えば、細胞および／またはゲノム材料は、ホモジネートをフィルタにかけることなどによって、均質化されたサンプルから分離することができる。いくつかの実施形態では、ホモジネートは、異なるサイズ（例えば、約２０ｕｍ、約１０ｕｍなど）のセルストレーナーのセットでフィルタにかけられる。いくつかの実施形態では、セルストレーナーでフィルタにかける前に、金属メッシュを使用して大きな組織断片を除去する。いくつかの実施形態では、得られたフィルタにかけられたサンプルは、所望のマーカーで染色することができる単一細胞（ダブレットなどの凝集したいくつかの小細胞）で主に構成される。

いくつかの実施形態では、均質化されたサンプルまたはフィルタにかけられ均質化されたサンプル内の細胞を溶解して細胞成分を放出する。例えば、細胞は、フレンチプレスまたは同様のタイプの溶解装置、マイクロフルイダイザー、破砕、粉砕、化学的または酵素的溶解を使用して、および／または当技術分野で公知の他の技術を使用して溶解することができる。いくつかの実施形態では、膜脂質およびタンパク質（ヒストンを含む）は、細胞成分（例えば、界面活性剤または酵素（プロテアーゼ）を添加することによって）を含有するサンプルから除去される。さらに、細胞成分を含有するサンプルから（例えば、ＲＮａｓｅなどの酵素を用いて）ＲＮＡを除去することができる。

均質化されたサンプル（またはフィルタにかけられた均質化されたサンプル）をさらに解離および／または処理して、解離した細胞、核および／または小さな組織凝集体を提供することができる。一般に、酵素的解離、化学的解離および機械的解離またはそれらの任意の組み合わせを含む組織解離のための３つの主要な方法がある。解離のための方法の選択は、通常、組織のタイプおよび組織の起源に基づいて行われる。

酵素的解離は、酵素を使用して組織片を消化し、それによって組織から細胞を放出するプロセスである。多くの異なるタイプの酵素をこのプロセスで使用することができ、当業者が理解するように、特定の酵素は特定の組織タイプでより効果的である。当業者はまた、任意の酵素解離プロセスが、１種以上の酵素を互いに組み合わせて使用してもよく、または１種以上の酵素を他の化学的および／または機械的解離方法と組み合わせて使用してもよいことを理解するであろう。好適な酵素の例としては、コラゲナーゼ、トリプシン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、パパイン、ＤＮａｓｅＩ、中性プロテアーゼおよびトリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。

コラゲナーゼは、タンパク質を消化するために使用されるタンパク質分解酵素であり、細胞外マトリックス中に見出される。酵素プロテアーゼに特有のことであるが、コラゲナーゼは、結合組織に一般的に見られる三重らせん天然コラーゲン原線維を攻撃し、分解することができる。４種の型の塩基性コラゲナーゼが存在する。すなわち、上皮、肝臓、肺、脂肪および副腎組織細胞標本での使用に適している１型；その高いタンパク質分解活性を考慮して、心臓、骨、筋肉、甲状腺および軟骨腫瘍起源組織における使用に適している２型；その低いタンパク質分解活性を考慮して、乳腺細胞における使用に適している３型；およびそのトリプシン活性を考慮して、受容体の完全性が重要である膵島および他の研究プロトコルに適している４型が存在する。

トリプシンは、アルギニンおよびリジンアミノ酸のカルボキシル基を含むペプチド結合に対する特異性を有する膵臓セリン（アミノ酸）プロテアーゼとして記載されている。これは、最も高度に特異的なプロテアーゼの１種と考えられている。トリプシン単独では、細胞外タンパク質に対する選択性が最小限であるため、通常は組織解離に有効ではない。通常は、コラゲナーゼまたはエラスターゼなどの他の酵素と併用される。

エラスターゼは別の膵臓セリンプロテアーゼであり、中性アミノ酸の隣にあるペプチド結合に対する特異性を有する。エステラーゼは、天然エラスチンを加水分解するその能力においてプロテアーゼの中で独特である。エラスターゼは、血液成分および細菌中にも見出すことができる。いくつかの実施形態では、エステラーゼは肺組織からＩＩ型細胞を単離するのに適している。

ヒアルロニダーゼは多糖類であり、この酵素は、典型的にはコラゲナーゼなどのより粗プロテアーゼと併用した場合、組織の解離に使用されることが多い。ヒアルロニダーゼは、ほぼすべての結合組織に見られる結合に対して親和性を有する。

パパインはスルフヒドリルプロテアーゼであり、広い特異性を有し、したがって膵臓プロテアーゼ、すなわちトリプシンまたはエラスターゼよりも完全にほとんどのタンパク質基質を分解することができる。パパインは、組織からニューロン材料を単離するために頻繁に使用される。

デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ）は、解離媒体に漏出し、粘度および回収の問題を増加させる可能性がある核酸を消化するための酵素細胞単離手順に頻繁に含まれる。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、ＤＮａｓｅＩは無傷の細胞を損傷しないと考えられる。

中性プロテアーゼ、例えばディスパーゼ（登録商標）（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌから入手可能）は、穏やかなタンパク質分解活性を有する細菌酵素であり、ディスパーゼ（登録商標）は、細胞膜の完全性を維持する能力のため、初代細胞培養物および二次細胞培養物を単離するのに有用である。上皮様細胞と比較して、線維芽細胞様細胞をより効率的に解離させることがわかっている。これはＥＤＴＡによって阻害される。

トリプシン阻害剤は主に大豆に由来し、トリプシンを不活性化するため、特定の細胞単離プロトコルに使用されることがある。

化学的解離は、陽イオンが細胞内結合および細胞内マトリックスの維持に関与するという事実を利用する。これらのカチオンに結合するＥＤＴＡまたはＥＧＴＡを導入することによって、細胞間結合が破壊され、それによって組織構造の解離が可能になる。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、当業者に知られている手段により、単離、抽出、または生成することができる。例えば、エタノール沈殿またはフェノール－クロロホルム抽出、続いて遠心分離を介してＤＮＡを抽出してペレットを形成することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、固相カラムで単離または抽出することができる。いくつかの実施形態では、核酸結合ビーズを使用してＤＮＡを単離または抽出することができる。いくつかの実施形態では、物理的、化学的、または電気的特性に基づいて多孔質マトリックスを選択的に通過させることによって、ＤＮＡを単離または抽出することができる。

抽出されたＤＮＡ（ゲノム材料）は、緩衝液、例えばアルカリ緩衝液に溶解され、本明細書でさらに説明するように、シーケンシングのためのインプットサンプルとして導入することができる。

均質化されたサンプル内の細胞の任意選別

いくつかの実施形態では、工程１００から均質化されたサンプルは、下流処理（工程１１０）の前にさらに選別される。いくつかの実施形態では、選別は、細胞上に存在する１種以上のバイオマーカーを使用して行われる。いくつかの実施形態では、解離した細胞および／または核は、種々の細胞型を識別できるように、フローサイトメトリーによって均質化されたサンプルを評価する前に標識または染色される。標識または染色は、フローサイトメトリーによって種々の細胞型を同定することができる任意の検出可能な標識またはレポーター部分、例えば蛍光標識であり得る。例えば、均質化されたサンプルが、１種以上のバイオマーカーの存在について最初に染色される場合があり、次いで、細胞が染色されているかまたは染色されていないかに基づいて細胞を選別するために、フローサイトメトリーを利用することができる。いくつかの実施形態では、均質化されたサンプルを１以上の検出プローブと接触させ、これを１種以上の検出試薬（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０１７／０８５３０７を参照されたい。その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。）を適用することによって可視化することができる。例えば、いくつかの実施形態では、利用される検出プローブは、免疫細胞マーカーに特異的である。さらなる例として、細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１６３、ＣＤ４５ＬＣＡ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＣＤ２８、ＣＤ５７、ＦＯＸＰ３、ＥＰＣＡＭ、およびＣＫ８／１８から選択される１種以上のバイオマーカーの存在により染色することができる。

いくつかの実施形態では、選別は、サイズに基づく選別手順を用いて達成される。いくつかの実施形態では、サイズに基づく選別工程は、解離した細胞粒子を第１の細胞粒子集団と第２の細胞粒子集団とに選別し、第１の細胞粒子集団は腫瘍細胞で濃縮され、第２の細胞粒子集団は正常細胞で濃縮される。いくつかの実施形態では、細胞粒子は細胞であり、正常細胞は１２μｍ未満の平均直径を有し、腫瘍細胞は１２μｍを超える平均直径を有する。いくつかの実施形態では、サイズに基づく選別工程は、解離した細胞粒子を第１の核集団と第２の核集団とに選別し、第１の核集団は腫瘍で濃縮され、第２の核集団は正常核で濃縮される。いくつかの実施形態では、正常核は８．５μｍ未満の平均直径を有し、腫瘍核は８．５μｍ超の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、細胞粒子の選別は、マイクロ流体デバイスを用いて達成される。いくつかの実施形態では、サイズに基づく染色は、染色工程を必要としない。他のサイズに基づく選別は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０１８／１８９０４０に記載されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

シーケンシングのためのゲノム材料の調製

ゲノム材料の任意の選別に続いて、シーケンシングのためにゲノム材料を調製する（工程１２０）。シーケンシングのためのゲノム材料を調製する方法は、米国特許出願公開第２０１８／０３２０２２９号に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ゲノム材料を断片化して、断片化ゲノムサンプルを提供する。いくつかの実施形態では、ゲノム材料の断片化の後に、断片化されたゲノム材料の末端が修復または「ポリシング」される。いくつかの実施形態では、断片化された核酸サンプル（例えば、断片化ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなど）は、５’末端および３’末端の一方または両方のアダプターへのライゲーションによって修飾される。次いで、ゲノム材料を変性させて、当業者に公知の手順に従って相補的ＤＮＡ鎖を分離する。

次いで、変性したゲノム材料をハイブリダイゼーション反応に供する。ハイブリダイゼーション反応混合物は、例えば、ゲノム材料内の標的に対して核酸配列が相補的なＤＮＡ捕捉プローブ、（非特異的ハイブリダイゼーションをブロックするための）ＤＮＡをブロッキングするＣｏｔ１画分およびブロッキングオリゴヌクレオチドを含む（工程２００）。ＤＮＡ捕捉プローブは、ストレプトアビジン被覆ビーズまたは表面を使用したその後の固定化のためにビオチン化されてもよく、またはマイクロアレイなどの固体支持体に直接固定することができる。ハイブリダイゼーション後、非標的核酸および非結合核酸を固体支持体から洗い流し、結合した標的核酸を、当技術分野で公知のプロトコルに従ってマイクロアレイまたは捕捉ビーズまたは捕捉表面から溶出する。いくつかの実施形態では、ゲノム材料とビオチン化ＤＮＡ捕捉プローブとのハイブリダイゼーション後、ストレプトアビジン被覆ビーズをハイブリダイズしたゲノム材料とインキュベートして、ハイブリダイズしたゲノム材料をストレプトアビジン－ビオチン結合を介して固定化し、任意の非標的ゲノム材料を洗浄（ビーズ捕捉）によって除去する（工程２１０）。次いで、捕捉されたゲノム材料を溶出し、シーケンシングのために提供するか、または捕捉されたゲノム材料をシーケンシングの前に最初に増幅する。

調製されたゲノム材料のシーケンシング

シーケンシングは、当業者に公知の任意の方法に従って行うことができる（工程２２０）。いくつかの実施形態では、シーケンシング方法としては、サンガーシーケンシングおよび色素ターミネーターシーケンシング、ならびにパイロシーケンシング、ナノポアシーケンシング、マイクロポールシーケンシング、ナノボールシーケンシング、ＭＰＳＳ、ＳＯＬｉＤ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｓｔａｒｌｉｔｅ、ＳＭＲＴ、ｔＳＭＳ、合成によるシーケンシング、核酸連結によるシーケンシング、質量分析シーケンシング、ポリメラーゼシーケンシング、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）シーケンシング、顕微鏡ベースのシーケンシング、マイクロ流体サンガーシーケンシング、顕微鏡ベースのシーケンシング、ＲＮＡＰシーケンシング、トンネル電流ＤＮＡシーケンシング、およびインビトロウイルスシーケンシングなどの次世代シーケンシング技術が挙げられる。ＷＯ２０１４１４４４７８、ＷＯ２０１５０５８０９３、ＷＯ２０１４１０６０７６およびＷＯ２０１３０６８５２８を参照されたい。これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、シーケンシングは、合成技術によるシーケンシングを使用するなど、いくつかの異なる方法によって行うことができる。先行技術による合成によるシーケンシングは、シーケンシング反応（Ｈｙｍａｎ，１９８８，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７４：４２３－４３６；Ｒｈｏｎａｇｈｉら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：３６３－３６５）中に特定のデオキシヌクレオシド三リン酸が取り込まれたときに副生成物の生成を監視する任意のシーケンシング方法として定義される。合成反応によるシーケンシングの１つの顕著な実施形態は、ピロリン酸シーケンシング法である。この場合、ヌクレオチド取り込み中のピロリン酸の生成は、化学発光シグナルの生成をもたらす酵素カスケードによって監視される。合成による配列の一例である４５４ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号０４ ７６０ ０８５ ００１）は、ピロリン酸シーケンシング技術に基づく。４５４ ＧＳ２０または４５４ ＦＬＸ装置でシーケンシングする場合、平均ゲノムＤＮＡ断片サイズは、製品文献に記載されているように、それぞれ２００または６００ ｂｐの範囲内である。

いくつかの実施形態では、合成反応によるシーケンシングは、代替的に、ターミネーター色素タイプのシーケンシング反応をベースとすることができる。この場合、組み込まれた色素デオキシヌクレオトリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）構成要素は、検出可能な標識を含み、これは、好ましくは新生ＤＮＡ鎖のさらなる伸長を防止する蛍光標識である。次いで、標識を除去し、例えば３’－５’エキソヌクレアーゼまたはプルーフリーディング活性を含むＤＮＡポリメラーゼを使用することによって、ｄｄＮＴＰ構成要素が鋳型／プライマー伸長ハイブリッドに組み込まれると検出される。

いくつかの実施形態では、シーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．によって提供されるものなどの次世代シーケンシング法「発光シーケンシング方法」を使用して行われる。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａの次世代シーケンシング技術は、クローナル増幅および合成によるシーケンシング（ＳＢＳ）化学を使用して、迅速で正確なシーケンシングが可能になる。このプロセスは、ＤＮＡ塩基を核酸鎖に組み込みながら同時にＤＮＡ塩基を同定する。各塩基は、ＤＮＡ配列の順序を決定するために使用される、成長中の鎖に付加されると固有の蛍光シグナルを放出する。

シーケンシングデータセット

シーケンシング（工程２２０）の後、シーケンシングデータは、複数の遺伝的バリアントを同定し得るように、すなわち、均質化されたサンプルのシーケンシングから得られたシーケンシングデータ内で遺伝的バリアントを同定し得るように解析することができる。いくつかの実施形態では、同定された遺伝的バリアントは、クローナルまたはサブクローナルであり得る。いくつかの実施形態において、Ｍｕｔｅｃｔは、シーケンシングデータ（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ｃｇａ／ｍｕｔｅｃｔを参照されたい。また、米国特許出願公開第２０１５／０１７８４４５号も参照されたい。その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。）内のバリアントを検出するために使用される。

いくつかの実施形態では、ネオ抗原は、同定された遺伝的バリアントに由来する（工程３００）。いくつかの実施形態では、ネオ抗原の誘導により、創薬、ワクチン生成、および／またはＣＡＲ－Ｔ細胞工学が可能になる（工程３０１）。例えば、Ｏｔｔら、「メラノーマ患者のための免疫原性パーソナル新抗原ワクチン、」 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．０００，００ Ｍｏｎｔｈ ２０１７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２２９９１（その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）には、ネオ抗原を標的とするワクチンを生成するプロセスが開示されている。同様に、Ｓａｈｉｎら、「個別化ＲＮＡミュータノームワクチンは、がんに対するポリ特異的治療免疫を動員する」 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．０００，００ Ｍｏｎｔｈ ２０１７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２３００３（その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）には、ヒトにおけるがん変異のスペクトルに対する免疫を動員するためのＲＮＡベースのポリネオエピトープアプローチが開示されている。したがって、いくつかの実施形態では、ワクチンは、本明細書に記載のプロセスに従って、均質化された腫瘍サンプルをシーケンシングした後に由来する１種以上のネオ抗原をベースとして生成することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、有効量のワクチンを対象に投与することをさらに含む。

他の実施形態では、ｃｔＤＮＡ監視パネルは、同定された遺伝的バリアントに基づいて開発することができる（工程３１０）。いくつかの実施形態では、ｃｔＤＮＡパネルを使用して遺伝的バリアントを監視することができ、遠隔メタセシスをもたらすことができる（工程３１１）。

さらに他の実施形態では、同定された遺伝的バリアントに基づいてクローナル構造を計算することができる（工程３２０）。いくつかの実施形態では、計算されたクローナル構造を使用して、体幹バリアントとサブクローナルバリアントとの間の分離を評価することができる（工程３２１）。

現在の腫瘍シーケンシングは、物理的なサンプリングの偏りによって妨げられ、インプット組織は狭い空間フレームのみから引き出され、他の遠隔位置でのサブクローンの増殖が見逃されてしまう。これは、過剰なシーケンシング深度では解決できない問題である。この問題の程度を調べるために、本発明者らががんゲノムアトラスからの全がんシーケンシンググデータの分析を行ったところ、現在のプロトコルサンプルは平均して腫瘍塊の２．３％のみ（全病期の中央値、ｎ＝１，６６７サンプル）であり、ステージＩＶ腫瘍（中央値、ｎ＝１８１）については０．５％に減少することが明らかになった（図４Ａ）。本発明者らは、主要ながん治療センター内の標準治療の一部として分子プロファイリングを受けているランダムに選択された事例の監査を通して、日常的な臨床状況内でこのパターンをさらに調査した（方法を参照）。これにより、腫瘍サンプリング割合の中央値はわずか０．０００５％（ｎ＝７６事例）（図４Ｂ）であり、標準的な病理腫瘍スライドから入手可能な最小限のインプット材料を反映していることが明らかになった。残りの９９．９％＋の腫瘍組織は、分子プロファイリング目的のためにサンプリングされないままであり、不十分なサンプリングの度合いが高くなる。非代表的なサンプリング方法を利用することの落とし穴は、Ｐｉｅｒｒｅ Ｇｙ^１によって開発された「サンプリング理論（Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｓａｍｐｌｉｎｇ）」において十分に失笑されており、食品汚染から選挙投票および鉱業^２－４までの複数の分野にわたって実際に実証されている。腫瘍シーケンシングの場合、この偏りは、標的化治療または免疫療法治療^８について患者を層別化するためのツールとしての分子プロファイリングの有用性の増加と相まって、がんの十分に実証された特徴^５－７としての腫瘍内不均一性という状況において生じる。この問題に対処できないと、免疫療法のための予後マーカーまたはネオ抗原標的を検出するための感度の低下、生検間のシーケンシング結果の再現性の欠如、および偏ったバリアント対立遺伝子頻度値に起因するクローナルとしてのサブクローナルバリアントの割り当てが誤ることを介して、がんにおけるゲノム医薬の臨床的有用性が損なわれるリスクがある。しばしば提案される解決策は、複数領域サンプリングを行うことであり、これは、研究環境^５では可能であるが、大規模臨床診療にとっては費用がかかりすぎ、労働集約的である可能性が高い。さらに、「何回の生検を行うべきか」という繰り返される疑問には、患者間の腫瘍不均一性の高い変動性のために答えることができない。本発明者らは、残留外科材料を利用してより広いより代表的なサンプリング枠を作成することにより、これらの制限を回避するために新しいサンプリング方法を実施することができ、シーケンシング深度を増加させる必要なく、または腫瘍ごとに複数のサンプルをプロファイリングする必要なく結果が改善されると仮定した。

この仮説を最初に調べるために、本発明者らは、ｎ＝１，１８４の原発性固形腫瘍からのｎ＝７９の複数領域生検から抽出されたＤＮＡをプールすることによってサンプリング枠を広げて、腫瘍当たり「カクテル」溶液を作成するパイロット実験を行った（図４Ｃ）。プールされたカクテルサンプルを次世代シーケンシングに供し（深さの中央値＝６７４Ｘ）、突然変異コールを以前に生成された単回生検（現在の臨床診療を反映して、深度の中央値＝６０８Ｘ）および複数領域生検（真のセット）データと比較した（深さの中央値＝６１２Ｘ）。すべてのサンプルを同一のプロトコルで処理した（方法を参照）。単一の生検がわずか７３％［１５％～１００％］の中央値発見率を示したのと比較して、７９個すべての腫瘍にわたって、カクテルサンプルは真のセット変異の中央値が１００％（範囲［３０％～１００％］）であることがわかり、より広いサンプリング枠によりバリアントを検出するための感度が改善されるという仮説を裏付けた（ｐ＝６．６×１０^－１１、対ウィルコクソン検定、図４Ｅおよび図４Ｆ）。さらに、カクテルサンプルに由来するバリアント対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）は、複数領域シーケンシングからの真のＶＡＦ値との強い相関（ｒ＝０．９７）、単回生検サンプルによって達成されるものと比較して優れた相関（ｒ＝０．６９）を示した（図４Ｄ）。これは、より広いサンプリング枠により、腫瘍塊全体にわたる真の細胞突然変異の有病率をより正確に推定でき、予後バイオマーカーおよび予測バイオマーカーの両方にとって重要な考慮事項であることを示唆する。

これらのパイロット結果に基づいて、本発明者らは次に、可能な限り広いサンプリング枠からシーケンシングインプット材料を引き出すことを可能にする新規な腫瘍サンプリング方法を開発しようとした。本明細書で、本発明者らは、次世代シーケンシング（図５Ａ）と組み合わせて、固形腫瘍塊を十分に混合された溶液に均質化することを含む、「代表的なシーケンシング」（Ｒｅｐ－Ｓｅｑ）と呼ばれる新しい方法を実証する。腫瘍塊は、手術後の病理学的評価のために使用されなかった残留腫瘍材料全体として供給された。そうでなければ臨床的廃棄物として処理され、破壊された材料である。残留サンプルは総腫瘍容積の平均５４．８％に相当し、腫瘍当たり平均２２３．５ｇの組織を供給した（本発明者らの事例のパイロットコホートに基づいて、表Ｓ１を参照のこと）。これらの値は、サンプリングされた平均０．０００６％、および現在標準的な分子プロファイリングアプローチのサンプリング枠として使用されている０．０００１ｇの腫瘍組織に対して大幅に増加している。ホルマリン固定された残留腫瘍組織を周囲の正常組織から剥離した後、残留腫瘍塊を代表的な溶液に均質化する。

この十分に混合された溶液から、ＤＮＡ抽出、ライブラリー調製およびシーケンシングのためのサンプルを採取する（図５Ａ）。Ｒｅｐ－Ｓｅｑを、４つの異なるがんタイプからの１１個の腫瘍において概念実証ベースで実施した（表Ｓ１）。処理された最初の腫瘍は、交差検証目的のための広範なサンプリングを可能にするように選択された、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１、大型淡明細胞型腎細胞がん（ｃｃＲＣＣ）腫瘍（最大寸法１７ｃｍ）であった。合計で６８個の新鮮凍結個体生検を原発腫瘍から採取し、残りのホルマリン固定残留塊（１２５８グラムの組織）をＲｅｐ－Ｓｅｑプロトコル下で均質化した。この腫瘍におけるバリアントランドスケープを定義するために、全エクソームシーケンシング（ＷＥＳ）を最初に、７つの空間的に異なる原発生検の選択およびＲｅｐ－Ｓｅｑサンプルの一部（中央値１６２×深さ）で行い、合計７６の非同義変異（ＳＮＶおよび小規模挿入／欠失）の発見をもたらした。

続いて、これらの７６個の変異を標的化されたカスタムパネルで捕捉し、６８個の原発生検、２つのリンパ節転移から採取した１１個の生検、４つの生物学的Ｒｅｐ－Ｓｅｑ複製物（原発性腫瘍）、異なる時点で収集した６つの循環腫瘍（ｃｔ）ＤＮＡサンプル、および３つの均質化リンパ節Ｒｅｐ－Ｓｅｑサンプル（１つのリンパ節は生検サンプルではなかった）（図５Ｂ）において、深い深度（中央値１５，４０２×深度）にシーケンシングした。これらのおよび他の方法は、米国特許出願公開第２００９／０２４６７８８号に開示され、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。この統合されたデータセットを使用して、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ方法を包括的に評価した（図５Ｃ）。最初に、本発明者らは、原発性腫瘍生検のペアワイズ組み合わせと、Ｒｅｐ－Ｓｅｑのペアワイズ生物学的複製物およびｃｔＤＮＡ時点のペアワイズ組み合わせとの間のジャッカード類似性指数を比較して、各方法の再現性を評価した。生検間のペアワイズ類似性の中央値は０．７７であり、個々の生検で発見された突然変異の約４分の１がその後の生検サンプルで再現できないことを示唆している。対照的に、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ複製物間の類似性の中央値は、０．９５で有意に高かった（ｐ＝９．９×１０^－７、図５Ｄ、各複製物によって発見されたほぼ同一の突然変異リスト（図２ｃ）。血漿ｃｔＤＮＡサンプル間のペアワイズ類似性は低く（全体的な類似性指数の中央値＝０．２４、図５Ｃ～図５Ｄ）、ｃｔＤＮＡプロファイリングにおける技術的課題を反映していた。

加えて、ｃｔＤＮＡ時点にわたる腫瘍の進行中の時間的進化も認識されるべきであるが、本発明者らは、近い時点間でさえ実質的な差があることに注目し、例えば、Ｐ１６とＰ２０とは２１日間しか離れていなかったが、共通の突然変異を共有していなかった。Ｒｅｐ－Ｓｅｑによって検出された突然変異は、主にクローナルであり（すべてのがん細胞において）、または主要サブクローンにおける事象であったが、生検シーケンシングは、低頻度の軽微なサブクローナル変化を高頻度に検出し、腫瘍細胞のごく一部にしか存在しなかった。軽微なサブクローナル変異は十分に実証されており、研究環境（参考文献）において頻繁に関心を集めているが、臨床的有用性のためには、真にクローナルな変化を明確に特定すること、および高レベルで再現することは、より重要な目標であることが多い。さらに、クローナル変異および主要なサブクローナル変異を検出する、サンプリング枠を広くする利点は、（後者は空間的に離れた腫瘍領域に存在するサブクローナル変異を見逃すので）単一の生検プロファイリングと比較してより高い割合の全バリアント検出をもたらすことである。より高い突然変異検出率は、個別化養子細胞療法またはワクチン免疫療法の設計において特に重要である可能性があり、本発明者らは、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ法を使用して発見されたネオ抗原の平均数が有意に高かった（＋１９％）ことに注目する（Ｒｅｐ－Ｓｅｑ生物学的複製物全体の平均ネオ抗原＝１８５、シーケンシングされた単一生検全体の平均＝１５５、ｐ＝０．０１１、図７）。

次に、クローナル多様性の測定値が予後と関連することが示されていることを考慮して、クローナル構造の決定におけるＲｅｐ－Ｓｅｑの有用性を調べた^９，１０。がん細胞画分（ＣＣＦ）推定値を、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１原発腫瘍生検セット内のすべての突然変異（ｎ＝７６）について最初に計算し（クローナル品質管理を通過するｎ＝５２生検）、突然変異クラスターに一緒にグループ化し、真のベンチマーククローナル構造を推測した（方法を参照）。４つの異なる腫瘍クローン：クローンＡ（体幹クローン、あらゆるがん細胞ＣＣＦにおける変異＝１００．０％、ｎ＝４１変異）、ならびに（サブ）クローンＢ（ＣＣＦ＝４５．６％、ｎ＝６変異）、Ｃ（ＣＣＦ＝５２．８％、ｎ＝３変異）およびＤ（ＣＣＦ＝１７．１％、ｎ＝２変異）（図６Ａ）が検出された。クラスター化プロセスを、Ｒｅｐ－Ｓｅｑサンプルについてのみ繰り返し（ｎ＝１）、次いで、クローナル溶液を方法間で比較した（図６Ａ）。Ｒｅｐ－Ｓｅｑは、４１個すべてのクローナル変異を一緒に体幹クローンＡ（ＣＣＦ＝１００．０％）に正しくクラスター化し、主要（サブ）クローンＢ（ＣＣＦ＝４０．６％）およびＣ（ＣＣＦ＝３３．３％）を同定した（図６Ａ）。最も低い頻度のサブクローン（クローンＤ、ＣＣＦ＝１７．１％）は、Ｒｅｐ－Ｓｅｑサンプルにおいて明確なクラスターとして検出されず、より低い頻度の突然変異を正確にグループ化する際の課題を反映している。両方の方法からのがん細胞画分推定値を、空間的生検部位および突然変異の存在の物理的マッピングに対して検証し、腫瘍切片の画像に戻した：（サブ）クローンＢは５２個の原発生検のうち２０個（３８．４％）で見出され、（サブ）クローンＣは５２個のうち３２個（６１．５％）で見出された（図６Ｂ）。これにより、２つの主要な空間的に異なるサブクローンの存在が確認された。興味深いことに、リンパ節転移ＬＮ１およびＬＮ２はクローンＢによって排他的に播種されたが、空間的に近位の腎周囲リンパ節サンプルＬＮ（ＰＲ）はポリクローナルであり、クローンＢおよびＣが存在した。

次に、各サンプル内の個々の変異ＣＣＦを考慮して、サブクローナル変異（クローンＢおよびＣ）からの体幹細胞事象（すなわち、クローナルであるか、またはすべてのがん細胞に存在する変異であるか）（クローンＡ）の分離の程度を評価した。Ｒｅｐ－Ｓｅｑサンプル内で、クローナル事象（クローンＡ）についてのＣＣＦ推定値は、（サブ）クローンＢおよびＣから明確に分離され、Ｒｅｐ－ＳｅｑにおけるＣＣＦ推定値の真の値へ迅速に収束することが反映された（図６Ｃ）。対照的に、単一のサンプル生検におけるＣＣＦ分布はクローンＡ、ＢおよびＣの間で重複しており、サブ（クローン）ＢおよびＣは、ＣＣＦ＝約１００％の個々の生検においてクローナルとして頻繁に（誤って）現れる（「クローン性の錯視」。５２回の原発生検にわたって平均して１７％（範囲［６％～３５％］）のクローナルバリアントが、単一領域（図６Ｄ）とみなされるとクローン性の錯視をかかえている（含まれる７６個すべての変異、方法を参照のこと。）。

クローン性の錯視は、複数領域生検サンプリングでも持続した；シミュレーションにより、２回のランダムな生検が９％［０％～２５％］、３回＝６％［０％～２５％］、４回＝４％［０％～１５％］および５回＝３％［０％～１５％］のクローン性率の錯視をもたらしたことが示された（図６Ｄ）。さらに、これらの結果は、３次元サンプリングがｚ軸に沿って行われたため、クローン性率の真の錯視が控えめな過小評価で表わされている可能性が高い。本発明者らは、正常な２次元腫瘍薄片サンプリングが、Ｃについてモノクローナルであった薄片４のみで行われたならば、何回もの生検がクローン錯視を防止しなかったであろうこと（図６Ｂ）、および、懸念すべきことに、クローンＢ（リンパ節に転移した）が完全に見逃されていたであろうことに注目する。

液体生検の広範な適用性、およびクローナル変異とサブクローナル変異の両方を同定できることを実証する以前の研究を考えると^１１、血漿由来のｃｔＤＮＡサンプルが、原発性腫瘍の代表的なサンプルと比較して真のクローナル多様性をどの程度表すかが適切な問題となる。十分に特徴付けられた原発性腫瘍および６つの長軸方向ｃｔＤＮＡ時点を有する機会を得て、本発明者らはこの問題を調査した。手術前の時点（Ｐ１およびＰ１０）で、クローンＡ、ＢおよびＣ由来のバリアントはすべて、ＶＡＦ ０．１％～１．０％で検出可能であったが、いくつかのクローンＡの体幹細胞事象を含む多くのバリアントが見落とされ、ｃｔＤＮＡをプロファイリングする技術的課題を反映していた。クローンＡ内の平均ＶＡＦは、（サブ）クローンＢおよびＣよりも全体的に高かったが、個々のバリアントに関し、また時点にわたって大きな不一致が観察された（図６Ｅ）。手術後の時点Ｐ１６において、最も高いＶＡＦバリアントは、実際にはクローンＣに由来し、同様に、時点Ｐ２０において、クローンＢ変異が最も高く、両方とも、任意のクローンＡ体幹細胞変異を上回った（図６Ｅ）。しかしながら、後期の時点（剖検時）では、すべてのクローナル突然変異が検出され、ＶＡＦ頻度は非常に一貫していた（図６Ｅ）。

突然変異が存在した生検の数のカウントと比較したｃｔＤＮＡからのＶＡＦの相関係数は、ｒ＝－０．１７（時点Ｐ１６）～ｒ＝０．７８（剖検胸水）の範囲であった。Ｒｅｐ－Ｓｅｑ ＣＣＦは生検カウントデータと最も高い相関を有し、ｒ＝０．９０であった。これは、ｃｔＤＮＡ単独からのデノボクローナル構造を推測することが依然として困難であることを示唆しているが、腫瘍組織から以前に同定されたクローナルマーカーの追跡は依然として非常に有益である（例えば、最小限の残存疾患追跡（ＭＲＤ）のため）。本発明者らは、ＭＲＤ追跡の関連において、バリアントのパネルが大きいほど、より早い時点で再発を検出するための感度が増大する可能性があり、例えば、時点ｐ１６でのＲｅｐ－Ｓｅｑ１データにおいて、単一生検から設計されたＭＲＤパネルは、Ｒｅｐ－Ｓｅｑサンプルを使用した０％のミス率と比較して、５３％の時間で疾患再発を見逃していたであろう（表Ｓ２）。Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１のクローナル動態に関して、興味深いパターンが観察され、クローンＣはその後のｃｔＤＮＡ時点で死滅し、検出不能になった（図６Ｅ）。これは、生検およびＲｅｐ－Ｓｅｑプロファイリングによって決定される予測される転移性播種パターン、すなわち、クローンＢは遠位転移性播種を達成したが、クローンＣは（周辺）腎領域内に含まれていたことを裏付けている（図６Ｂ）。追加の検証として、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１剖検時に存在する転移性疾患の２０の異なる解剖学的部位からサンプリングされた４３のさらなる生検についてコピー数分析を行った。すべての部位に１４ｑの喪失が含まれており、ドライバー事象が原発性腫瘍のクローンＢにおいてのみ見出された（図８）。本発明者らは、単領域生検シーケンシングについて、転移クローンＢは、５２回中３２回目的を果たさない（６１．５％）ことに注目する。

Ｒｅｐ－Ｓｅｑ法は、技術的実現可能性の実験として、さらに１０の事例について追加的に実施した。事例Ｒｅｐ－Ｓｅｑ２およびＲｅｐ－Ｓｅｑ３は追加のｃｃＲＣＣ腫瘍であり、主にモノクローナル構造を有するように思われた（図６Ｆ）。事例Ｒｅｐ－Ｓｅｑ４～Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１０は、乳房、結腸直腸および肺の原発部位の腫瘍であり、腫瘍特異的ドライバー変異はすべての検体で首尾よく検出された。最も高い変異負荷は、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ７（結腸）で観察され、９８０／２５１の非同義的ＳＮＶ／インデルを有し、ミスマッチ修復不全（図６Ｇ）に関連する非常に大きい変異シグネチャー６および１５の存在があり、これは、ＭＨＬ１の喪失を示すＩＨＣによって確認された。３種の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）腫瘍（Ｒｅｐ－Ｓｅｑ８、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ９、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１０）のシグネチャー解析により、これらの３種の腫瘍のみにおいて独自にシグネチャー４（喫煙関連）の証拠が示された（図６Ｇ）。したがって、Ｒｅｐ－Ｓｅｑに由来する変異シグネチャーは、予想されるパターンと一致していた。最後に、組織均質化のさらなる利点は、細胞選別工程を追加して、腫瘍純度を高めるように濃縮できることである。

原理証明として、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１１（結腸直腸腫瘍）に対してフローソーティングを行い、サイトケラチン８および１８の存在に基づいて腫瘍細胞を優先的に選択した。最初にＲｅｐ－Ｓｅｑプロトコル（ソートされていない、深さ２２１Ｘ）からの標準サンプルで全エクソームシーケンシングを行い、０．４４の腫瘍純度を示した。フロー選別されたＲｅｐ－Ｓｅｑサンプル（深さ２１５Ｘ）において、０．８９の純度で有意な濃縮が観察され、これにより、同じ全体的なバルクサンプルシーケンシングで、深さおよびコスト（図６Ｈ）について、有効な腫瘍細胞シーケンシング範囲のおおよその倍増（９０Ｘから１８４Ｘ）がもたらされた。バリアント発見に関して、３６５個の非同義的ＳＮＶが標準的な選別サンプルとフロー選別サンプルの両方で共通して観察され、次いで追加の６８個の変異（＋１９％の増加）がフロー選別サンプルで一意に見出され、これはおそらくより高い有効腫瘍深さ（図６Ｈ）からの感度の増加によるものである。反対のパターン、すなわち標準サンプルでは５つのみの突然変異（合計の１．４％）が見られたが、選別されたフローでは欠落しており、フロー選別は特定の腫瘍サブクローンが排除されるような系統的偏りを生じないことを示唆している。

結論として、Ｒｅｐ－Ｓｅｑは、偏りのない腫瘍サンプリング手法を効果的に実施し、すべての残留外科腫瘍材料の十分に混合された均質化溶液からＤＮＡ分子を引き抜き、したがって現在の単一領域および複数領域生検手法において、固有の空間的な偏りが取り除かれる。本発明者らは、より広いサンプリング枠により、突然変異を検出するための感度が全体的に増加し、小さな（サブ）クローンを検出するための分解能を失うという矛盾を伴うが、すべての主要なサブクローンを包括的にマッピングする能力が増加することを示す。この矛盾は、より低い頻度の突然変異が、広く拡大されたクローナルまたは主要なサブクローナルドライバー事象ほど直接的には実施可能でない場合がある臨床的状況において許容され得る。Ｒｅｐ－Ｓｅｑにおける結果の再現性は、現在の単一生検シーケンシングアプローチよりも有意に高く（同じ同等のシーケンシング深度で）、サブクローナルバリアントからのクローナルの決定においてもより高い精度が達成された。

材料および方法

試験コホート

事例Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ２およびＲｅｐ－Ｓｅｑ３は腎細胞がん腫と診断され、以前に記載されたように、ＴＲＡＣＥＲｘ Ｒｅｎａｌ ｓｔｕｄｙ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ承認１１／ＬＯ／１９９６）の下での研究に同意された^５。事例Ｒｅｐ－Ｓｅｑ４、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ５、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ６、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ７、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ８、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ９、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１０およびＲｅｐ－Ｓｅｑ１１の残存外科材料は、ＩＲＢ承認の下で、米国の病院からの研究検体（ＧＬＡＳ Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ，Ｗｉｎｓｔｏｎ－Ｓａｌｅｍ，ＮＣ（ＩＲＢ＃：１２０１６０６８５）およびＴｈｅ ＭＴ Ｇｒｏｕｐ，Ｖａｎ Ｎｕｙｓ，ＣＡ（ＭＴＧ－０１５））の商業的提供者から入手した。

現在の分子プロファイリング実施の臨床監査

外科手術および分子プロファイリングの両方が英国ロンドンのＲｏｙａｌ Ｍａｒｓｄｅｎ ＮＨＳ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎトラストで行われた、切除された結腸直腸腫瘍、黒色腫腫瘍および肉腫腫瘍における治療の診断基準として日常的にプロファイリングされた腫瘍容積を定量化するためのサービス評価のために、施設内審査委員会の承認が得られた（ＳＥ７２５）。各腫瘍タイプについて２０１６年５月から２０１８年５月までの事例のリストを取得し、再調査した。組織病理報告に２を超える肉眼的腫瘍寸法が記録されている場合、また分子プロファイリングに使用したスライドの数および厚さに関する情報が利用可能である場合には、事例を含めた。

領域生検およびカクテルサンプル調製

外科的に切除された腫瘍組織の複数領域および単領域生検サンプリングを、前述と同じ方法を用いて行った^５。各腫瘍について採取したすべての単一領域から採取した抽出ＤＮＡを等モル比でプールすることによって、各腫瘍についてカクテルサンプル（図４Ａ～図４Ｆに示す）を調製した。中央値９個の単一領域サンプルをカクテルごとにプールした。

Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１組織の肉眼検査および均質化

診断的組織学的サンプリングおよび新鮮な生検の除去に続いて、１）原発性腫瘍、２）傍大動脈リンパ節クラスター、および３）腎肺門リンパ節を含む腎根治的腎摘出術（Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１）からの３つの異なる臨床外科廃棄物組織を、標準的な臨床ワークフローを模倣するために、１０％中性緩衝ホルマリンで２４時間固定した。固定後、サンプルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に２４時間交換し、次いで、解剖するまでエタノール中で保存した。腫瘍組織は、病理学者が肉眼的評価および物理的触診によって同定し、同定可能なすべての腫瘍を周囲組織から切除した。正常組織の領域（腫瘍から少なくとも５ｃｍ）も病理学者が解剖し、保持した。Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１検体の肉眼的検査中に検出されたリンパ節には、肺門および腎周囲のリンパ節も独立した組織サンプルとして解剖された。解剖したすべての組織を秤量してから均質化した。

残存原発性腫瘍組織を６２５ｇ部分２個に分割した；各部分を６００ｍｌのａｕｔｏＭＡＣＳランニングバッファー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．，１３０－０９１－２２１）と合わせ、最大設定で３分間、液体化装置中で均質化した。原発性腫瘍ホモジネート（合計２．５リットル）を手動で合わせ、プラスチック容器で混合し、分けて戻し、さらなる均質化および混合のために再液化し、大きなプラスチック容器に一緒にプールした。腎肺門リンパ節、腎周囲リンパ節、正常腎臓組織、および大動脈傍リンパ節の分離組織を、それぞれ独立して、ＩＫＡ Ｔｕｂｅ Ｍｉｌｌ（ＩＫＡ Ｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ．Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ、０００４１８０００１）を用いたａｕｔｏＭＡＣＳ泳動緩衝液（１：１、質量：容積）中で、使い捨てブレンド容器を使用して１５，０００ｒｐｍで２分間均質化した。組織質量が個々のブレンダー容器の容量を超えたとき、同じサンプルのホモジネートを上記のように混合することによってプールした。各組織ホモジネートのサンプルを４℃のメタノール（１：１、ｖ：ｖ）中で保存した。事例Ｒｅｐ－Ｓｅｑ２およびＲｅｐ－Ｓｅｑ３は原発性腎腫瘍のみであり、同じプロトコルで処理した。

残留組織（ＳＭＲＴ）処理のための標準的な方法

Ｒｅｐ－Ｓｅｑ４～Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１１の事例では、ホルマリン固定された残存腫瘍組織を、ＩＲＢ承認の下で米国の病院からの研究検体の商業的提供者（ＧＬＡＳ Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ，Ｗｉｎｓｔｏｎ－Ｓａｌｅｍ，ＮＣ．ａｎｄ ｔｈｅ ＭＴ Ｇｒｏｕｐ，Ｖａｎ Ｎｕｙｓ，ＣＡ）から得た。各検体は、診断および病期分類の目的で標準的なサンプリングに供された。これらの事例は外科廃棄物とみなされ、焼却予定であったため、ホルマリン中で４～６週間保存した。到着したら、組織をＰＢＳに１２～２４時間移した。腫瘍組織は、病理学者が肉眼的評価および物理的触診によって同定し、同定可能なすべての腫瘍を周囲組織から切除した。正常組織の領域（腫瘍から少なくとも５ｃｍ離れた）も病理学者が解剖し、保持した。解剖したすべての組織を秤量してから均質化した。解剖された腫瘍および正常組織を、単回使用ブレンダー容器（ＩＫＡ Ｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ．Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ、０００４１８０００１）または単回使用消費者グレードのブレンダー（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｂｅａｃｈ，５１１０２，Ｇｌｅｎ Ａｌｌｅｎ，ＶＡ）中、ａｕｔｏＭＡＣＳ緩衝液（１：１、ｍ：ｖ）中、１５，０００ｒｐｍで２分間、別々に均質化した。フィルタはＰｌｕｒｉｓｅｌｅｃｔ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製であった。使用した緩衝液は、以下の会社からのものであった：ＣＣ１（９５０－１２４；Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）、抗体希釈剤（２５１－０１８，Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ａｕｔｏＭＡＣＳ緩衝液（１３０－０９１－２２１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｔｅｔｅｒｏｗ、ドイツ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，１４１９０，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）。Ｔｗｅｅｎ ２０は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ（ＡＣ２３３３６２５００）から購入した。ＤＡＰＩ（Ｄ９５４２）およびペプシン（Ｐ７０１２）は、Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡから購入した。プロテイナーゼＫ（０７０６）は、ＶＷＲ（米国）製であった。マウス抗サイトケラチン８／１８抗体（７６０－４３４４）は、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ａ－１１００１）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ａ－２１２３６）とコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。得られたホモジネートをさらに処理するまで４℃で保存した。

組織およびｃｆＤＮＡからのゲノムＤＮＡ精製

各組織ホモジネートの一部（１２００マイクロリットル）を、５０００ｒｃｆで２分間の遠心分離によって収集し、ＴＥ緩衝液ｐＨ８．０（ＶＷＲ、ＡＡＪ６２７４５－ＥＱＥ）で２回すすぎ、５ｍｌのプロテアーゼ消化緩衝液［水溶液（Ａｍｒｅｓｃｏ、０８３７）中の９．７５ｍｌのＴＥ緩衝液ｐＨ８．０、６０ｍｇのプロテイナーゼＫ（ＶＷＲ、０７０６）および０．２５ｍｌの２０％ＳＤＳ］中、５６℃で２～１６時間インキュベートした。消化した組織（１００マイクロリットル）を、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｇｅｒｍａｎｙ，１１ ７３２ ６６８ ００１）によるゲノムＤＮＡ精製のために製造業者のプロトコルに従って使用した。精製したゲノムＤＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐ ８０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量し、－２０℃で保存した。ｃｏｂａｓ ｃｆＤＮＡサンプル調製キット（Ｒｏｃｈｅ、０７２４７７３７１９０）を使用して血漿からｃｆＤＮＡを単離した。

標的濃縮ＮＧＳライブラリーの構築およびシーケンシング

Ｉｌｌｕｍｉｎａ適合性のインデックス付きＮＧＳライブラリーを、ＳｅｑＣａｐ ＥＺ ＨｙｐｅｒＣａｐ Ｗｏｒｋｆｌｏｗ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，ｖ１．０（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を使用して組織由来のゲノムＤＮＡから構築し、注目すべきパラメータを以下に指定した。簡潔に説明すると、１ｇの精製ゲノムＤＮＡを３７℃で３３～４０分間酵素的に断片化し、ＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｌｕｓライブラリーｐｒｅｐキットを製造者の説明書（Ｒｏｃｈｅシーケンシングソリューション、ＫＫ８５１４）に従って使用してアダプターライゲーションのために調製した。ＳｅｑＣａｐシーケンシングアダプターの最終反応濃度は２Ｍであり、アダプターライゲーション反応時間を１６℃で１４～１８時間に延長した。ライゲーション反応精製後に捕捉前ＰＣＲを使用しなかった。ＭｅｄＥｘｏｍｅ（０７６８１３３０００１）、Ｏｎｃｏ＿ＥＺ（０８３３３０７６００１）、またはカスタムＲｅｐ－Ｓｅｑ１特異的（設計基準については以下のデータ分析セクションを参照）標的濃縮パネル（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）および２ｎＭブロッキングオリゴ（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）のいずれかのＳｅｑＣａｐ ＥＺライブラリープローブベイトを、製造業者の指示に従って４７℃で１８～２２時間インキュベートした。捕捉後ＰＣＲを、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘおよびＬＭ－ＰＣＲオリゴを使用して１４サイクル行った。捕捉後の精製ライブラリー濃度をＱｕｂｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって測定し、フラグメントのサイズ分布をＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって分析した。増幅した濃縮ライブラリーをそれぞれ２ｎＭに希釈し、シーケンシングのためにプールする前に－２０℃で保存した。プールされたライブラリーを、ＭｉＳｅｑおよびＨｉＳｅｑ装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、１０１塩基のペアエンドリードによる（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）ランを使用したペアエンドシーケンシングについての製造業者の推奨に従って、シーケンシングを行った。ＡＶＥＮＩＯ ｃｔＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｋｉｔｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｗｏｒｋｆｌｏｗ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ ｖ１．０．０に従って、ＡＶＥＮＩＯ ｃｔＤＮＡ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、０８０６１０７６００１）を使用してｃｆＤＮＡシーケンシングライブラリーを構築した。増幅し、アダプターにライゲーションしたサンプルを、Ｖａｃｕｆｕｇｅ ｐｌｕｓ装置（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用してＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔと共に濃縮した。各サンプルを、適切なエンハンサーオリゴ、カスタムＲｅｐ－Ｓｅｑ１特異的パネル、およびハイブリダイゼーションマスターミックスに再懸濁した。濃縮、ハイブリダイゼーションのクリーンアップおよび増幅を製造者の説明書に従って実施した。サンプル（等しい質量）をプールし、１５１塩基対末端リードを有するＨｉｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して説明書に従ってシーケンシングした。図１に示す７９個の腎細胞がん腫からの複数領域、カクテルおよび単一領域サンプルを、前述の方法を使用して腎ドライバーパネル＿ｖ６ライブラリーの調製およびシーケンシングに供した^５。Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１のための複数領域全エクソームライブラリーの調製およびシーケンシングを、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｈｕｍａｎ Ａｌｌ Ｅｘｏｎ ｖ５キットを使用して外部の研究室（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって行った。

腫瘍純度を増大させるためのフローソーティング法

Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１１からのホルマリン固定残留腫瘍組織からの代表的なサンプルを、ａｕｔｏＭＡＣＳ緩衝液（１：１質量対容積）中でＩＫＡブレンダーにより均質化を行って生成した。ホモジネートの一部（１ｇ）を、前述の方法を適合させることによって個々の核にさらに解離させた^１２。簡潔に説明すると、組織を遠心分離によって回収し、ＣＣ１緩衝液（容積に対して５：１質量）に再懸濁し、８０℃で３０分間加熱した。組織をＰＢＳで１回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（容積に対して１：１質量）を含有するＰＢＳに再懸濁し、５０℃で１０分間インキュベートした。サンプルを１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１．５中の５ｍｇ／ｍｌペプシンに交換し、３７℃で３０分間インキュベートした。サンプルを５Ｍ ＮａＯＨでｐＨ８に調整し、ＰＢＳ、０．５％ ＢＳＡおよび０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０に交換した後、２０マイクロモーラーフィルタで濾過して核を回収した。

次いで、４００×ｇでの遠心分離によって核を回収し、２０℃で３０分間抗体希釈液に交換した。サンプルを、ディスペンサーから直接マウス抗サイトケラチン８／１８一次抗体に４℃で１時間交換し、ＰＢＳ ０．５ｍｌ、０．１％ ＢＳＡおよび０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（２マイクログラム／ｍｌ）およびＤＡＰＩ（３Ｍ）にコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体中、４℃で３０分間インキュベートした。染色したサンプルを洗浄し、分析および選別の前に、ＤＡＰＩ用の３５５ｎｍ、６０ｍＷレーザーおよび４５０／５０ ｎｍフィルタを装備したＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（６５６７００，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）を用いてフィルタ：すなわちＡＦ ４８８用の４８８ｎｍ、６０ｍＷレーザーおよび５３０／３０ｎｍフィルタ；ＡＦ ６４７用の６３３ｎｍ、１００ｍＷレーザーおよび６７０／３０ｎｍフィルタにかけた。補償は使用されなかった。ＤＡＰＩをダブレット識別に使用した。Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１１腫瘍核を、ゲーティング後に、サイトケラチン陽性（ＣＫ＋）、高側方散乱（ＳＳＣ）核を含み、サイトケラチン陰性（ＣＫ－）、低ＳＳＣ核を除外するようにＦＡＣＳによって濃縮した。

データおよび統計分析

腫瘍容積サンプリング分析
臨床監査データについては、すべてのサンプルが利用可能な幅（Ｗ）および長さ（Ｌ）寸法に関するデータを有し、腫瘍容積（Ｔ＿Ｖ）を以下の式を使用して推定した：

Ｔ＿Ｖ＝（Ｗ^２×Ｌ）／２

（最も正確な腫瘍容積測定アプローチとして文献から得られた^１３）。

生検容積（Ｂ＿Ｖ）は、８枚の典型的なスライドの２Ｄ表面積分析に基づいて計算し、各スライドは４０倍でＡｐｅｒｉｏ ＡＴ２全スライドスキャナを使用してスキャンした。各画像に手で注釈を付け、組織の周囲を追跡し、Ａｐｅｒｉｏ ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウェアを使用して表面積を計算した。平均表面積は３．３７ｃｍ^２であり、この値にスライド厚さ（１０μｍ）および使用したスライドの総数を掛けて、腫瘍当たりのＢ＿Ｖ推定値を得た。本発明者らは、複数のスライドを分子プロファイリングに使用した場合（最大５枚を使用した）、各スライドを同じブロックから（すなわち、すべてが１つの固定空間位置から）採取したことに注目する。次いで、各場合にサンプリングされた総腫瘍容積の割合をＢ＿Ｖ／Ｔ＿Ｖとして単純に計算する。がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）データセット解析のために、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＴＣＧＡ ＧＤＡＣ Ｆｉｒｅｈｏｓｅリポジトリから各固形腫瘍コホートの概要臨床アノテーションファイルを抽出した。腫瘍寸法データは、６つの腫瘍タイプ：ＡＣＣ、ＫＩＣＨ、ＫＩＲＣ、ＫＩＲＰ、ＰＡＡＤおよびＴＨＣＡにわたってｎ＝１６６７サンプルについて利用可能であった：。腫瘍容積（Ｔ＿Ｖ）を、式：Ｔ＿Ｖ＝（Ｗ^２×Ｌ）／２を使用して、上記のようにして計算した。一次元のみが与えられた場合（すなわち、最大寸法）、これが腫瘍長さであると仮定し、腫瘍幅は、１：０．８のＬ：Ｗ比を使用して推定し、０．８標準値は、利用可能な長さおよび幅データを有するすべての事例にわたって観察された中央比の値として推定した。生検サンプルの容積は、臨床アノテーションファイルに示されているように、正確な長さ（Ｌ）、幅（Ｗ）および深さ（Ｄ）の寸法から計算され、生検形状は直方体であると仮定され、生検容積（Ｂ＿Ｖ）は、Ｂ＿Ｖ＝Ｌ×Ｗ×Ｄとして計算された。生検寸法が臨床アノテーションファイルに欠けている場合、データが利用可能な他のすべてのベースからの中央値に基づいて、標準生検容積（Ｂ＿Ｖ）０．４８ｃｍ^３と仮定した。次いで、各場合にサンプリングされた総腫瘍容積の割合をＢ＿Ｖ／Ｔ＿Ｖとして単純に計算する。

シーケンシングデータの処理

Ｈｉｓｅｑによりシーケンシングされた、ＦａｓｔＱフォーマットのペアエンドリードをＢｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）ｖ０．７．１５を用いて、シード再帰（－ｃフラグ）を１０，０００に設定し、参照ヒトゲノム（ビルドｈｇ１９）にアラインメントした^１４。Ｓａｍｔｏｏｌｓ ｖ１．３．１を使用してＳａｍファイルの中間処理を実行し、Ｐｉｃａｒｄ １．８１（ｈｔｔｐ：／／ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｐｉｃａｒｄ／）を使用して重複するデータを排除した。全エクソームおよび腎臓ドライバーパネル＿ｖ６シーケンシングデータセットの場合、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）呼び出しを、Ｍｕｔｅｃｔ ｖ１．１．７を使用して行い、小規模挿入／欠失（ＩＮＤＥＬ）は、最小バリアント頻度（－ｍｉｎ－ｖａｒ－ｆｒｅｑ）が０．００５、腫瘍純度推定値（－腫瘍純度）が０．７５の体細胞モードでのランニングＶａｒＳｃａｎ ｖ２．４．１を呼び出し、次いで、Ｓｃａｌｐｅｌ ｖ０．５．３（体細胞モードでのメス発見）（２つの呼び出し者間の交差）を使用して検証した^{１５－１７}。Ｍｕｔｅｃｔによって呼び出されるＳＮＶを、以下の基準：すなわち、ｉ）対応する生殖系列サンプル中のバリアント対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）≦１％、ｉｉ）ミトコンドリア染色体、ハプロタイプ染色体、ＨＬＡ遺伝子または任意の遺伝子間領域に入るバリアントを考慮しなかった、ｉｉｉ）バリアントを支持するフォワード鎖リードとリバース鎖リードの両方の存在を使用してさらにフィルタリングしたカスタムＲｅｐ－Ｓｅｑ１パネルシーケンシングデータについて、固有の分子バーコード（ＵＭＩ）指数を使用して高深度でシーケンシングを行い、ＵＭＩツール^１８を使用してＰＣＲ重複をグループ分けし、重複読み取りを削除して、グループごとに１つの読み取りを得た。次いで、Ｍｕｔｅｃｔはより高いシーケンシング深度レベルについて較正されないことが知られているので、ディープＳＮＶ^１９を使用してＳＮＶを呼び出した。ＶａｒｓｃａｎおよびＳｃａｌｐｅｌを使用して、上述のようにＲｅｐ－Ｓｅｑ１カスタムパネルＩＮＤＥＬを呼び出した。すべてのバリアントについて、Ａｎｎｏｖａｒ^２０を使用して注釈を付けた。体細胞コピー数の変化を推定するために、対になった腫瘍－正常シーケンシングデータ^２１に対してデフォルトパラメータを用いてＣＮＶｋｉｔ ｖ０．７．３を実施した。ＣＮＶｋｉｔから得られたｌｏｇ２比（ｌｏｇＲ）コールの外れ値を検出し、一定のｌｏｇＲ^２２のゲノムセグメントを同定するために、事例特異的関節セグメント化の前に絶対偏差中央値Ｗｉｎｓｏｒｉｚａｔｉｏｎを使用して修正した。腫瘍サンプルの純度、倍数性およびセグメントあたりの絶対コピー数を、ＡＢＳＯＬＵＴＥ ｖ１．０．６^２３を用いて推定した。ネオ抗原予測は、最初にＰＯＬＹＳＯＬＶＥＲ^２４を使用して、クラスＩ ＨＬＡ遺伝子の突然変異と共に、各患者の４桁ＨＬＡ型を決定することによって導出された。次に、各サンプル中で検出された体細胞非同義ＳＮＶ変異およびＩＮＤＥＬ変異に基づいて、すべての可能な９量体、１０量体および１１量体変異ペプチドを計算した。対応するＰＯＬＹＳＯＬＶＥＲ－ｉｎｆｅｒｒｅｄ ＨＬＡ対立遺伝子に関連する変異体および対応する野生型ペプチドの結合親和性を、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ（ｖ３．０）およびＮｅｔＭＨＣ（ｖ４．０）^２５を用いて予測した。ネオ抗原結合剤は、ＩＣ５０＜５０ｎＭまたはランク＜２．０と定義した。シグネチャー分析を、ｐａｃｋａｇｅ ｄｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔＳｉｇｓ^２６を使用してすべての非同義変異に対して行った。プロトコルがホルマリン曝露材料を含むことを考慮して、Ｒｅｐ－Ｓｅｑデータにおけるホルマリン誘導加工品バリアントの証拠をさらに確認した。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルは、典型的にはウラシルを形成するためのシトシンの加水分解的脱アミノ化、またはシトシンがメチル化されている場合はチミンに起因するアーチファクトを含有し得る。そのようなアーチファクトは、通常、より低いバリアント対立遺伝子頻度での過剰なＣ＞Ｔ／Ｇ＞Ａ変異として明らかである^２７。Ｒｅｐ－Ｓｅｑ事例からの全エクソームシーケンシングデータにおける分析により、過剰な低頻度ホルマリン誘導アーチファクトの証拠は示されず、低頻度（５％未満のＶＡＦ）Ｃ＞Ｔ変異の割合は３４．０％であり、全塩基変化にわたる平均（３３．３％）とほぼ同等であった（図９）。

プールされたカクテルシーケンシングデータの分析

カクテルサンプルの最終セットには、複数領域シーケンシングからの一致した処理済み基準データセットを有する７９個の腫瘍が含まれていた。カクテルサンプルあたりの生検の数は２～７５の範囲であり、腫瘍あたりの生検数の中央値は８であり、個々の生検の総数は１，１８４であった。真のバリアントの基準データセットとして、本発明者らは、各腫瘍で検出されたすべてのバリアントの合計を表す、同じ事例からの以前に公開された^５複数領域シーケンシングバリアントの呼び出しを使用した。本発明者らの分析では、既知の真のセットから体細胞変異を検出する際の単一領域およびカクテルシーケンシングの全体的な性能を比較した。単一領域サンプルを、全体的な複数領域データセットから、腫瘍ごとに１つのランダムな単一領域生検として選択した。本発明者らは、腫瘍ごとに検出された体細胞バリアントの数を各アプローチと比較することによって、複数領域および単一領域シーケンシングと比較したカクテルシーケンシングアプローチの性能を最初に評価した。単一領域生検の平均性能を反映するために、本発明者らは、腫瘍当たりの単一領域シーケンシングによって検出されたバリアントの平均数を計算した。次に、本発明者らは、複数領域シーケンシングデータを参照として使用して、カクテルおよび単一領域サンプル中の真のバリアントの検出率を算出した。有意性は、対応のあるウィルコクソン検定で評価した。最後に、カクテルシーケンシングアプローチの精度を確立するために、本発明者らは次に、複数領域シーケンシングによって検出されたすべての体細胞変異の変異対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）とカクテルサンプルからのＶＡＦとの間の相関、ならびに腫瘍ごとのランダムな単一領域生検を判定した。複数領域ＶＡＦを、カクテルに含まれるすべての領域にわたる平均ＶＡＦとして計算した。相関は、スピアマンの順位相関検定を用いて計算した。

カスタムパネル設計

代表的なシーケンシング方法の詳細な検証を行うために、カスタムパネルを使用して、事例Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１で適用範囲の広いプロファイリングを行った。パネル設計は、ｉ）Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１原発性腫瘍から採取した７回の生検（均質化前）およびｉｉ）Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１均質化溶液の一部からの全エクソームシーケンシング結果をベースとした。上記のように８つのサンプルにわたってＳＮＶ変異およびＩＮＤＥＬ変異を呼び出し、合計７６個の非同義変異を検出した。これらの７６個の変異は、標的化されたカスタムパネルにおいて首尾よく捕捉され、６８個の原発生検、２つのリンパ節転移から採取された１１個の生検、４つの生物学的原発Ｒｅｐ－Ｓｅｑ複製物、異なる時点で収集された６つの循環腫瘍（ｃｔ）ＤＮＡサンプル、および３つの均質化されたリンパ節Ｒｅｐ－Ｓｅｑサンプルにおいて、深い深度（中央値１５，４０２倍）までシーケンシングされた。

ジャッカード再現性分析

Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１原発性腫瘍生検（ｎ＝６８）、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ生物学的複製（ｎ＝４）およびｃｔＤＮＡサンプル（ｎ＝６）の間のバリアント発見の再現性を、Ｊａｃｃａｒｄ類似度係数を用いて評価した。サンプル間の各ペアワイズの組み合わせ（各群内）、例えば、生検２（Ｂ）に対して生検１（Ａ）、生検３（Ｂ）に対して生検１（Ａ）などを考慮した。標準式（Ｊ）を用いてジャッカード（Ｊａｃｃａｒｄ）係数を計算した。

Ｊ＝Ｍ_１１ ／（Ｍ_０１＋Ｍ_１０＋Ｍ_１１）

式中、Ｍ_１１はサンプルＡおよびＢの両方に存在するバリアントの総数を表し、Ｍ_１０はＡに存在するがＢには存在しないバリアントの総数を表し、Ｍ_０１はＢに存在するがＡには存在しないバリアントの総数を表す。

クラスタリングおよび系統発生分析

ＰｙＣｌｏｎｅ Ｄｉｒｉｃｈｌｅｔプロセスクラスタリング^２８を使用して、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１カスタムパネルデータに対してクラスタリング分析を実行した。各突然変異について、観察された代替対立遺伝子数、参照数および総局所腫瘍コピー数を、各サンプルの純度と共に入力として使用した。ＰｙＣｌｏｎｅは、１０，０００回の反復および１，０００回のバーンインで実行され、デフォルトパラメータは、－ｖａｒ＿ｐｒｉｏｒ ｔｏｔａｌ＿ｃｏｐｙ＿ｎｕｍｂｅｒであった。２回の別々のＰｙＣｌｏｎｅを実行し、最初は原発複数領域生検データセットについて行った。シーケンシングされた全ｎ＝６８の原発生検のうち、ｎ＝５２はクラスタリング分析のための品質管理に合格し、ｎ＝１６の生検は純度が低いため除外された（既知のクローナル３ｐコピー数喪失事象を正しく呼ぶには純度が低すぎることに基づいて測定）。第２のＰｙＣｌｏｎｅクラスタリングの実行は、同じパラメータを使用して、Ｒｅｐ－Ｓｅｑホモジネートサンプルのみ（ｎ＝１）について行った。

クローン性シミュレーションの錯視

クローン性の錯視のリスクを評価するために、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１データセットを使用して、１回から２０回までの生検が行われるように生検サンプリング手法をシミュレートした。各生検番号（ｎ＝１～２０）について、Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１についてプロファイリングされた６８個の原発生検の全セットから、サイズｎの生検のサンプルをランダムに採取した。ランダムにサンプリングしたセット内で、（サンプリングしたセット内のすべての生検に遍在的に存在することに基づいて）クローナルであると思われる突然変異の数を計算した。次いで、このリストを真のクローナル突然変異の既知のリスト（全６８セットから）と比較し、クローナルとして誤って分類されたバリアントの割合を記録した。このプロセスを各ｎについて１００回反復して分布を得、その分布から平均および標準偏差値を計算した。

純度濃縮データの分析

Ｒｅｐ－Ｓｅｑ１１については、標準的なＲｅｐ－Ｓｅｑプロトコルを使用して実施された全エクソームシーケンシングの事例は、フロー選別された純度濃縮の追加の工程で繰り返された。バリアントの呼び出しが完了し、前記に詳述したのと同じように、両方のサンプルで純度推定値が計算された。各サンプルで見出されたバリアントの数、次いでサンプル間で共通のバリアントの数を計算し、図６にプロットした。

表の説明

表Ｓ１－様々なタイプの腫瘍からの１１個の代表的なサンプルの特徴。腫瘍容積は、臨床病理報告から得られた寸法を使用して計算した。腫瘍ホモジネートは、初期腫瘍容積の平均５４．８％を含有していた。

表Ｓ２－Ｒｅｐ－Ｓｅｑに対する最小残存疾患ｃｔＤＮＡ追跡パネル、生検の比較。

本開示は、代表的なサンプルなどの、サンプル中の遺伝的バリアントを同定する方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、代表サンプルなどのサンプル中で同定された複数の遺伝的バリアントに基づくｃｔＤＮＡ監視パネルの生成に関する。

参考文献

１．Ｇｙ，Ｐ．Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｅ，Ｅｃｈａｎｔｉｌｌｏｎｎａｇｅ，Ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｓａｔｉｏｎ（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ，Ｓａｍｐｌｉｎｇ，Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｉｎｇ）．ｘｉｖ＋６０７ ｐ（Ｍａｓｓｏｎ：Ｐａｒｉｓ）（１９８８）．

２．Ｒｏｈｄｅ，Ａ．Ｓａｍｐｌｉｎｇ ａｎｄ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ Ｍｅａｔ．ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（２０１５）．

３．Ｃｒｅｓｐｉ，Ｉ．Ｐｒｅ－Ｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｐｏｌｌｉｎｇ：Ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ Ａｃｃｕｒａｃｙ ａｎｄ Ｅｒｒｏｒ．（１９８８）．

４．Ｄａｖｉｄ，Ｍ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｅｏｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｏｒｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８８）．

５．Ｔｕｒａｊｌｉｃ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｓｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｔｒａｊｅｃｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ：ＴＲＡＣＥＲｘ Ｒｅｎａｌ．Ｃｅｌｌ １７３，５９５－６１０ ｅ５１１（２０１８）．

６．Ｊａｍａｌ－Ｈａｎｊａｎｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎ－Ｓｍａｌｌ－Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３７６，２１０９－２１２１（２０１７）．

７．Ｗａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ Ｂｌａｄｄｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ｂｙ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｕｂｔｙｐｅｓ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ Ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｕｒｏｌｏｇｙ（２０１８）．

８．Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ａ．Ｐ．Ｇ．ＡＡＣＲ Ｐｒｏｊｅｃｔ ＧＥＮＩＥ：Ｐｏｗｅｒｉｎｇ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．Ｃａｎｃｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２０１７）．

９．Ｍｉａｏ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ－ｓｔａｂｌｅ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５０，１２７１－１２８１（２０１８）．

１０．ＭｃＧｒａｎａｈａｎ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｃｌｏｎａｌ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｅｌｉｃｉｔ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１，１４６３－１４６９（２０１６）．

１１．Ａｂｂｏｓｈ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｃｔＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄｅｐｉｃｔｓ ｅａｒｌｙ－ｓｔａｇｅ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ５４５，４４６－４５１（２０１７）．

１２．Ｈｅｄｌｅｙ，Ｄ．Ｗ．，Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｉ．Ｗ．，Ｒｕｇｇ，Ｃ．Ａ．＆Ｍｕｓｇｒｏｖｅ，Ｅ．Ａ．Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ＤＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐａｒａｆｆｉｎ－ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ ｕｓｉｎｇ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ ３１，１３３３－１３３５（１９８３）．

１３．Ｆａｕｓｔｉｎｏ－Ｒｏｃｈａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ ｕｓｉｎｇ ｃａｌｉｐｅｒ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｏｇｒａｐｈｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ．Ｌａｂ ａｎｉｍａｌ ４２，２１７－２２４（２０１３）．

１４．Ｌｉ，Ｈ．＆Ｄｕｒｂｉｎ，Ｒ．Ｆａｓｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５，１７５４－１７６０（２００９）．

１５．Ｃｉｂｕｌｓｋｉｓ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｉｍｐｕｒｅ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｃａｎｃｅｒ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，２１３－２１９（２０１３）．

１６．Ｆａｎｇ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｄｅｌ ｖａｒｉａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｈｏｒｔ－ｒｅａｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ ｗｉｔｈ Ｓｃａｌｐｅｌ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １１，２５２９－２５４８（２０１６）．

１７．Ｋｏｂｏｌｄｔ，Ｄ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．ＶａｒＳｃａｎ：ｖａｒｉａｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ａｎｄ ｐｏｏｌｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５，２２８３－２２８５（２００９）．

１８．Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．，Ｈｅｇｅｒ，Ａ．＆Ｓｕｄｂｅｒｙ，Ｉ．ＵＭＩ－ｔｏｏｌｓ：ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｅｒｒｏｒｓ ｉｎ Ｕｎｉｑｕｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｃｃｕｒａｃｙ．Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７，４９１－４９９（２０１７）．

１９．Ｇｅｒｓｔｕｎｇ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｌｉａｂｌｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂｃｌｏｎａｌ ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３，８１１（２０１２）．

２０．Ｗａｎｇ，Ｋ．，Ｌｉ，Ｍ．Ｙ．＆Ｈａｋｏｎａｒｓｏｎ，Ｈ．ＡＮＮＯＶＡＲ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３８（２０１０）．

２１．Ｔａｌｅｖｉｃｈ，Ｅ．，Ｓｈａｉｎ，Ａ．Ｈ．，Ｂｏｔｔｏｎ，Ｔ．＆Ｂａｓｔｉａｎ，Ｂ．Ｃ．ＣＮＶｋｉｔ：Ｇｅｎｏｍｅ－Ｗｉｄｅ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｔａｒｇｅｔｅｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｐｌｏｓ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ １２（２０１６）．

２２．Ｎｉｌｓｅｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒ：Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ－ａｎｄ ｍｕｌｔｉ－ｔｒａｃｋ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｍｃ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３（２０１２）．

２３．Ｃａｒｔｅｒ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ＤＮＡ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３０，４１３－４２１（２０１２）．

２４．Ｓｈｕｋｌａ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｌａｓｓ Ｉ ＨＬＡ ｇｅｎｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３，１１５２－１１５８（２０１５）．

２５．Ａｎｄｒｅａｔｔａ，Ｍ．＆Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｇａｐｐｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３２，５１１－５１７（２０１６）．

２６．Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｒ．，ＭｃＧｒａｎａｈａｎ，Ｎ．，Ｈｅｒｒｅｒｏ，Ｊ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｂ．Ｓ．＆Ｓｗａｎｔｏｎ，Ｃ．ＤｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔＳｉｇｓ：ｄｅｌｉｎｅａｔｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｔｕｍｏｒｓ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ ａｎｄ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｅ ｂｉｏｌｏｇｙ １７，３１（２０１６）．

２７．Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｒｔｅｆａｃｔｓ ｉｎ ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｆｏｒｍａｌｉｎ－ｆｉｘｅｄ ｔｕｍｏｒｓ ｔｅｓｔｅｄ ｆｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｏｔｓｐｏｔ ｒｅｇｉｏｎｓ ｂｙ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＢＭＣ ｍｅｄｉｃａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ７，２３（２０１４）．

２８．Ｒｏｔｈ，Ａ．ｅｔ ａｌ．ＰｙＣｌｏｎｅ：ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｃｌｏｎａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１，３９６－３９８（２０１４）．

本開示は、いくつかの例示的な実施形態を参照して説明されてきたが、本開示の原理の精神および範囲内に含まれるであろう多くの他の変更および実施形態が当業者によって考案されることができることを理解されたい。より具体的には、合理的な変形および変更は、本開示の精神から逸脱することなく、前述の開示、図面、および添付の特許請求の範囲内の主題の組み合わせ構成の構成部品および／または配置において可能である。構成部品および／または配置の変形および変更に加えて、代替の使用法も当業者にとって明らかであろう。
［表１］
補足表１－代表的なシーケンシング症例のリスト

［表２］
補足表２
腫瘍組織のＲｅｐ－Ｓｅｑまたは生検シーケンシングのいずれかに基づいて設計された最小残存疾患ｃｔＤＮＡ追跡パネルの比較。すべてのＲｅｐ－Ｓｅｑおよび生検複製物からの１時点当たりに検出された突然変異の全体的な中央数が示されており、以下はすべての個々のサンプルからの完全なデータセットである。検出された突然変異数の差％を示す。ＭＲＤが見逃される時間の割合（％）も示されており（％＿ＭＲＤ＿ミス）、これは、疾患再発を確実に確認するためにｃｔＤＮＡで最低３個以上の固有の腫瘍変異を検出する必要があると仮定する。

Claims (17)

1. サンプル中の複数の遺伝的バリアントを特定する方法であって、
   （ａ）１種以上の腫瘍サンプルを、当該１種以上の腫瘍サンプル中の細胞の少なくとも５０％を破裂または溶解することなく均質化して、均質化されたサンプルを供給することと、
   （ｂ）シーケンシングのために、前記均質化されたサンプルから単離されたゲノム材料を調製することと、
   （ｃ）調製された前記ゲノム材料をシーケンシングした後に、得られたシーケンシングデータ内の前記複数の遺伝的バリアントを特定することとを含み、
   特定された前記複数の遺伝的バリアントがクローナルであるかサブクローナルであるかを判定することをさらに含み、かつ
   前記ゲノム材料の調製の前に、前記均質化されたサンプル内の細胞粒子を選別することをさらに含む、
   方法。
2. １種以上のネオ抗原が、判定されたサブクローナル変異に由来する、請求項１に記載の方法。
3. サンプル中の複数の遺伝的バリアントを特定する方法であって、
   （ａ）１種以上の腫瘍サンプルを、当該１種以上の腫瘍サンプル中の細胞の少なくとも５０％を破裂または溶解することなく均質化して、均質化されたサンプルを供給することと、
   （ｂ）シーケンシングのために、前記均質化されたサンプルから単離されたゲノム材料を調製することと、
   （ｃ）調製された前記ゲノム材料をシーケンシングした後に、得られたシーケンシングデータ内の前記複数の遺伝的バリアントを特定することとを含み、
   特定された前記複数の遺伝的バリアントに基づいてｃｔＤＮＡ監視パネルを生成することをさらに含み、かつ
   前記ゲノム材料の調製の前に、前記均質化されたサンプル内の細胞粒子を選別することをさらに含む、
   方法。
4. 生成された前記ｃｔＤＮＡ監視パネルが、治療に対する応答を判定することを補助するために使用される、請求項３に記載の方法。
5. 生成された前記ｃｔＤＮＡ監視パネルが、がんの進化軌跡を判定することを補助するために使用される、請求項３に記載の方法。
6. 生成された前記ｃｔＤＮＡ監視パネルが、将来の治療戦略に対する応答を予測することを補助するために使用される、請求項３に記載の方法。
7. 生成された前記ｃｔＤＮＡ監視パネルが、治療中または治療後の患者におけるがんの有無を確認することを補助するために使用される、請求項３に記載の方法。
8. 生成された前記ｃｔＤＮＡ監視パネルが、疾患寛解後、治療に対する完全奏効後、または検出不能な疾患の診断後の患者におけるがんの存在を確認することを補助するために使用される、請求項３に記載の方法。
9. 生成された前記ｃｔＤＮＡ監視パネルが、原発性腫瘍の外科的除去後の最小残存疾患を検出することを補助するために使用される、請求項３に記載の方法。
10. 生成された前記ｃｔＤＮＡ監視パネルが、転移性腫瘍の外科的除去後の最小残存疾患を検出することを補助するために使用される、請求項３に記載の方法。
11. 原発性および転移性腫瘍が同じ手術中に除去され、ｃｔＤＮＡ監視パネルが、単一の患者由来の複数の腫瘍におけるバリアントを検出するために使用される、請求項９又は１０に記載の方法。
12. サンプル中の複数の遺伝的バリアントを特定する方法であって、
    （ａ）１種以上の腫瘍サンプルを、当該１種以上の腫瘍サンプル中の細胞の少なくとも５０％を破裂または溶解することなく均質化して、均質化されたサンプルを供給することと、
    （ｂ）シーケンシングのために、前記均質化されたサンプルから単離されたゲノム材料を調製することと、
    （ｃ）調製された前記ゲノム材料をシーケンシングした後に、得られたシーケンシングデータ内の前記複数の遺伝的バリアントを特定することとを含み、
    特定された前記複数の遺伝的バリアントに基づいてクローナル構造をコンピュータで計算することをさらに含み、
    前記ゲノム材料の調製の前に、前記均質化されたサンプル内の細胞粒子を選別することをさらに含む、
    方法。
13. 個々の特定された遺伝的バリアントの分離を評価することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記細胞粒子の選別がサイズに基づく、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記細胞粒子の選別が、１種以上のバイオマーカーの存在に基づく、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記複数の遺伝的バリアントが、全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）、全エクソームシーケンシング（ＷＥＳ）、一塩基多型（ＳＮＰ）分析、ディープシーケンシング、標的遺伝子シーケンシング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはそれらの任意の組み合わせを使用して特定される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. サンプル中の複数の遺伝的バリアントを特定する方法であって、
    （ａ）ホルマリン固定された１種以上の腫瘍サンプルを、当該１種以上の腫瘍サンプル中の細胞の少なくとも５０％を破裂または溶解することなく均質化して、均質化されたサンプルを供給することと、
    （ｂ）シーケンシングのために、前記均質化されたサンプルから単離されたゲノム材料を調製することと、
    （ｃ）調製された前記ゲノム材料を、次世代シーケンシングを用いてシーケンシングした後に、得られたシーケンシングデータ内の前記複数の遺伝的バリアントを特定することとを含み、
    特定された前記複数の遺伝的バリアントがクローナルであるかサブクローナルであるかを判定することをさらに含む、
    方法。

Images