CN107709578A - 使用靶向特异性dna探针在生物样品中进行染色体多重分析的方法和系统 - Google Patents

使用靶向特异性dna探针在生物样品中进行染色体多重分析的方法和系统 Download PDF

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Abstract

本发明包括使用靶向特异性DNA探针在生物样品中分析个体染色体的方法和系统。本发明涉及单一或组合(多重)地生成染色体谱。本发明可以涉及使用DNA探针对如来自孕妇或癌症患者的外周血的游离DNA的生物样品生成染色体谱。本发明进一步涉及使用DNA探针对来自孕妇、癌症患者的外周血或用人工生殖技术产生的胚胎的个体完整细胞生成染色体谱。本发明进一步涉及通过由分光滤光器获得的直接荧光或由荧光计获得的荧光强度来检测DNA杂交。可选择地，化学发光系统可以用于通过使用聚HRP作为酶且使用增强的鲁米诺作为底物的酶底物反应来间接检测DNA杂交。

Description

使用靶向特异性DNA探针在生物样品中进行染色体多重分析 的方法和系统
技术领域
本发明涉及在生物样品中使用靶向特异性DNA探针分析个体染色体的方法和系统。具体地，本文公开的方法和系统涉及单一或组合(多重)地生成染色体谱。更具体地，本文公开的方法和系统涉及使用用于各种生物样品的靶向特异性DNA探针来生成染色体谱，所述生物样品例如为来自孕妇或癌症患者的外周血的游离DNA；该方法和系统进一步涉及针对来自孕妇、癌症患者的外周血或来自使用人工生殖技术如体外受精产生的胚胎的个体完整细胞使用靶向特异性DNA探针来生产染色体谱。
背景技术
核型从通过羊膜穿刺术或绒膜绒毛获得的孕妇诊断样品中鉴定胎儿染色体状态。由于这样的有创操作中固有的风险，最近有许多关注已经被放在利用母亲血液中的游离胎儿DNA的无创筛查方法。然而，这些技术不能鉴定核型中的平衡重排。从头平衡重排与胎儿的先天或发育的晚些阶段中的各种畸形的风险增加有关。被称为罗伯逊易位的另一类平衡重排涉及近端着丝粒染色体，其与增加三倍体再生的风险有关。
核型还在许多实体恶性肿瘤(肿瘤)的诊断和预后中起重要作用。然而，由于培养失败率高，从实体肿瘤获得成功的核型通常非常困难。因此，与产前状况类似，许多努力都集中在无创技术上。通过使用游离循环肿瘤DNA，许多研究者已经开发了评价特定基因突变状态的集中策略。然而，在实践中，原发性肿瘤的来源是未知的，因此集中研究产生有限的信息。这在癌症的早期检测中变得非常重要。另外，几种肿瘤具有诊断性的并且仅可以在完整细胞上检测到的特定平衡易位。
在产前和癌症状况下，还在循环完整细胞上进行相似尝试以便获得遗传信息。循环胎儿细胞或肿瘤细胞的数量非常少，通常在几毫升全血中仅有1或2个。因此，从单个细胞或少量细胞分析所有的24条染色体而获得完整核型将会非常有利。
现有的系统不能检测可诊断所有恶性肿瘤的平衡易位。现有的系统也不能检测对孕妇的遗传咨询和风险评估而言关键的罗伯逊易位。
使用游离DNA和完整细胞的当前的系统的主要缺点是：1)TAT较长；2)成本较高；3)异倍体性检测受限制；4)不同染色体的异倍体性检测中灵敏性的变化；和5)基本设施成本高。
本发明是对现有技术的改进方案，因为本发明可以通过使用特别设计的荧光滤色块来捕捉全基因组信息，所述荧光滤色块具有连接于靶向特异性DNA探针的荧光团的不同的激发和发射谱特征。进一步地，使用来自简单的现成程序如Adobe Photoshop的“图层(layers)”，可以“提取出”希望的靶标信息。即使间期细胞中的几个靶标是相互重叠的，通过选择性地“呼叫”(寻找)个体靶标的预定图案，也可以在细胞中追踪完整的染色体。这使得能够识别各种异常。
本发明解决的问题是需要对基因组进行大量并行测序和其他冗长的测试形式，以便通过对个体染色体上的存在于游离DNA中的选定的靶标进行分析来从母亲血液检测胎儿异倍体性和在癌症患者的外周血中检测染色体变化。
因此，存在对新的和改善的以单一或多重模式分析染色体的方法和系统的需求。就这点而言，本发明实质上满足了该需求。在这个方面，根据本发明的方法和系统实质上脱离了现有技术的常规概念和设计，并且通过这样做，提供了主要出于针对各种生物样品使用靶向特异性DNA探针分析染色体的目的而开发的装置。
发明内容
考虑到现有技术中现存的用于检测各种染色体异常的遗传方法的已知类型中固有的上述缺陷，本发明提供了针对各种生物样品通过使用靶向特异性DNA探针分析染色体的改善的方法和系统，并且克服了现有技术的上述缺陷和缺点。同样地，下文将会更详细描述的本发明的一般目的是提供针对各种生物样品通过使用靶向特异性DNA探针分析染色体的新的和改善的方法和系统，所述方法和系统具有前述提及的现有技术的所有优点，以及通过使用靶向特异性DNA探针来分析染色体的方法和系统带来的许多新特征，这些新特征不能由现有技术单独地或以其任意结合来预料、认为显而易见、教导或甚至暗示。
为了达到这一点，一方面，本发明实质上包括使用来自生物样品的游离DNA来分析个体染色体的方法。该方法包括以下步骤：
使用游离DNA血液收集管，例如使用由施特雷克公司(Streck Inc.)提供的收集管来收集和输送10～20ml外周血；
使用THP方案提取血浆DNA；
通过游离DNA片段的平端连接进行全基因组扩增过夜；
用生物素进行5’末端标记；
用乙醇沉淀DNA片段；
在含有或不含BHW缓冲液的96孔板中温育链霉亲和素戴诺磁珠(StrepavidinDynabeads beads)和生物素标记的DNA片段；
施加磁力，洗去未结合的DNA；
解除磁力，针对每条个体染色体进行与具有特定荧光团的靶向特异性DNA探针的杂交；
施加磁力，用或不用BHW缓冲液洗去过量的探针；
用NaOH洗脱，用或不用来自Gills论文的缓冲液洗脱；
施加磁力，将洗脱液转移至新96孔板；
添加带负电的银颗粒和精胺；
在室温下在黑暗中温育10分钟；
使用荧光计针对来自96孔板的每个孔的每个个体染色体获取所有荧光团的读数；
针对每个染色体上的每个特定靶标建立发射曲线；以及将所述值与针对所有染色体上的各自靶标所建立的正常曲线比较。
在另一个方面，该方法进一步涉及对从生物样品分离、重新获得或提取的完整细胞分析染色体。该方法包括以下步骤：
将完整细胞固定于多室载玻片(multi-chambered slides)；
生成靶向特异性DNA探针；
在一次反应中针对所有靶标进行FISH杂交；
一次针对6条染色体上的靶标进行FISH杂交；
根据需要在完整细胞上多次重复杂交；
使用特别设计的滤光块捕捉杂交后靶标的图像；
分析每个靶标和设定其预定数目；以及
基于杂交图案完成染色体分析。
在一些实施方式中，连接于构成靶向特异性DNA探针的DNA序列的荧光染料可以是荧光素12dUTP。
在一些实施方式中，连接于构成靶向特异性DNA探针的DNA序列的荧光染料可以是花青素苷55345dUTP。
在一些实施方式中，连接于构成靶向特异性DNA探针的DNA序列的荧光染料可以是花青素苷65455dUTP。
在一些实施方式中，连接于构成靶向特异性DNA探针的DNA序列的荧光染料可以是594dUTP。
在一些实施方式中，连接于构成靶向特异性DNA探针的DNA序列的荧光染料可以是激发和发射特征为200～1000nm范围的任何荧光团。
在一些实施方式中，连接于构成靶向特异性DNA探针的DNA序列的荧光染料可以是激发和发射特征为200～1000nm范围的任何荧光团的组合。
在一些实施方式中，游离DNA可以来自孕妇的外周血。
在一些实施方式中，游离DNA可以来自癌症患者的外周血。
在一些实施方式中，完整细胞可以来自癌症患者的外周血。
在一些实施方式中，完整细胞可以来自孕妇的外周血。
在一些实施方式中，完整细胞可以来自使用人工生殖技术如体外受精形成的胚胎的滋养外胚层。
在又另一个方面，可以通过将由生物样本产生的所有个体染色体谱集合起来而生成复合核型。
为了可以更好地理解以下的更详细的描述，并且为了可以更好地领会本发明对现有技术的贡献，已经相当宽泛地概述了本发明的较重要的特征。
通过阅读本发明目前描述的但说明性的实施方式的以下详细描述且结合附图，本发明的许多目的、特征和优势将对本领域技术人员显而易见。在该方面，在详细解释本发明的当前实施方式之前，应当理解本发明不限于本申请中的详细构造，并且不限于以下描述中阐述或附图中示出的组件的设置。本发明能够具有其他实施方式并且能够以各种方式实践和实施。而且，应当理解，本文的措辞和术语是出于描述的目的，不应被认为是限制性的。
同样地，本领域技术人员会理解，本公开所基于的概念可以容易地用作设计用于实施本发明的几种目的的其他结构、方法和系统的基础。因此，重要的是，只要不脱离本发明的精神和范围，则权利要求应当包括这些等同构造。
因此，本发明的目的是提供使用靶向特异性DNA探针在生物样品中分析染色体的新的改善的方法和系统，该方法和系统具有现有技术的所有优势而不具有现有技术的缺陷。
本发明的另一个目的是提供使用靶向特异性DNA探针在生物样品中分析染色体的新的改善的方法和系统，该方法和系统可以容易和有效地制造和销售。
本发明的更进一步的目的是提供使用靶向特异性DNA探针在生物样品中分析染色体的新的改善的方法和系统，该方法和系统在材料和劳动力方面都具有低制造成本，因此其能够容许对消费群体的低销售价格，由此使得这样的使用靶向特异性DNA探针在生物样品中分析染色体的方法和系统在经济上对消费群体可用。
本发明的又另一个目的是提供使用靶向特异性DNA探针在生物样品中分析染色体的新的改善的方法和系统，该方法和系统在现有技术的装置和方法中提供了该方法和系统的一些优势，同时克服了一般与其相关的一些缺陷。
与本发明的其他目的一起，连同表征本发明的具有新颖性的各种特征，这些内容在本公开所附的权利要求中被特别指出，并且构成本公开的一部分。为了更好地理解本发明、其操作优势及通过使用其而达到的特定目的，应参考说明本发明的附图和作为例示实施方式的描述性内容。
附图说明
当考虑以下的本发明的详细描述时，将会更好地理解本发明，并且除了上述那些以外的目的将会变得明显。这样的描述参考附图，其中：
图1描绘了展示具有特定荧光团DEAC、FITC、Cy3、CY5、Red(红)的靶向特异性DNA探针可以用于生成染色体谱的示例性实施方式。
图2描绘了正常染色体1的谱，其显示了具有各自的荧光团和相应强度的所有靶标。
图3至图8描绘了展示染色体1的异常谱的示例性实施方式。
图3描绘了示出三倍体的异常染色体1的谱。
图4描绘了示出单倍体的异常染色体1的谱。
图5描绘了示出具有短臂的网状重复的不平衡易位的异常染色体1的谱。
图6描绘了示出末端短臂缺失的异常染色体1的谱。
图7描绘了示出末端长臂缺失的异常染色体1的谱。
图8描绘了示出等臂染色体的长臂具有长臂的网状重复并且短臂缺失的异常染色体1的谱。
图9描绘了基于所有70个靶标的原位杂交信号图案的靶图，其展示了在完整细胞中所有24个染色体的分析，进一步展示了易位。
图10描绘了展示具有特定的荧光团组合的靶向特异性DNA探针可以用于生成染色体谱和检测异常的示例性实施方式，该异常在此例中是染色体12和21之间的易位。
图11描绘了荧光团配色方案a)使用靶向特异性DNA探针对染色体1、Y、13进行多重分析；b)使用靶向特异性DNA探针对染色体X、18、21进行多重分析；c)使用靶向特异性DNA探针对染色体2、6、22进行多重分析；d)使用靶向特异性DNA探针对染色体3、7、20进行多重分析；e)使用靶向特异性DNA探针对染色体4、19、14进行多重分析；f)使用靶向特异性DNA探针对染色体5、8、17进行多重分析；g)使用靶向特异性DNA探针对染色体9、16、12进行多重分析；h)使用靶向特异性DNA探针对染色体10、11、15进行多重分析。
图12A描绘了染色体1、Y、13的多重分析，示出三倍体13和涉及染色体1长臂的平衡易位。
图12B描绘了染色体X、18、21的多重分析，示出单倍体X和染色体18的短臂缺失。
具体实施方式
现在参考附图，特别参考图1至图12，显示了使用本发明的靶向特异性DNA探针在生物样品中分析染色体的方法和系统的实施方式。
如上所述，要求保护的发明解决了为了从母亲血液检测胎儿异倍体性和检测癌症患者的外周血中的其他染色体变化而需要大量的基因组并行测序的问题。
本发明利用发光或荧光检测方法通过从相应的荧光团捕获发射的荧光的总量来沿着染色体的长度检测存在于特定靶标的DNA的量。本发明通过使用会捕捉与特定的荧光DNA探针杂交的DNA片段的银纳米颗粒和精胺来利用信号增强技术。本发明也可以通过使用用于与生物素化BAC DNA探针结合的链霉亲和素聚HRP抗体来利用信号增强技术，所述生物素化BAC DNA探针被设计成靶向于基因组的策略区(strategic regions)如所有染色体的端粒和着丝粒/近着丝粒区。本发明还利用固定化技术来使胺修饰的游离DNA结合于微量滴定板的特别包被的DNA结合表面。
要求保护的发明区别于现有技术。因为所有现有方法依赖于测序，所以均具有显著的方法性失败。本发明区别于现有的基于测序的方法，因为本发明采用产生信号并增强荧光检测的原位杂交平台和信号放大技术。这是对于现有方法的改进方案，并且具有以下优势：1)快速TAT；2)成本较低；3)在几乎所有实验室设置中易于使用而没有显著的基本设施支出；和4)对所有染色体的异倍体性进行综合筛查。
如上所述，核型从通过羊膜穿刺术或绒膜绒毛获得的孕妇诊断样品中鉴定胎儿染色体状态。由于这样的有创操作中固有的风险，最近有许多关注已经被放在利用母亲血液中的游离胎儿DNA的无创筛查方法。然而，这些技术不能鉴定核型中的平衡重排。从头平衡重排与胎儿的先天或发育的晚些阶段的各种畸形的风险增加有关。被称为罗伯逊易位的另一类平衡重排涉及近端着丝粒染色体，其与增加三倍体再生的风险有关。
核型还在许多实体恶性肿瘤(肿瘤)的诊断和预后中起重要作用。然而，由于培养失败率高，从实体肿瘤获得成功的核型通常非常困难。因此，与产前状况类似，许多努力都集中在无创技术上。通过使用游离循环肿瘤DNA，许多研究者已经开发了评价特定基因突变状态的集中策略。然而，在实践中，原发性肿瘤的来源是未知的，因此集中研究产生有限的信息。这在癌症的早期检测中变得非常重要。另外，几种肿瘤具有诊断性的并且仅可以在完整细胞上检测到的特定平衡易位。
在产前和癌症状况下，还在循环完整细胞上进行相似尝试以便获得遗传信息。循环胎儿细胞或肿瘤细胞的数量非常少，通常在几毫升全血中仅有1或2个。因此，从单个细胞或少量细胞分析所有的24条染色体而获得完整核型将会非常有利。本文要求保护的本发明解决了这个问题。
要求保护的发明通过了利用探查全基因组的综合方法来解决上述问题。通过靶向于染色体上的特定标志如端粒和着丝粒、并且使所述特定标志在分子上具有区别(独特)，本发明可以从获得自孕妇或癌症患者的外周血的或获得自胚胎的单个或少量细胞鉴定所有平衡易位以及不平衡改变。
要求保护的发明是改进方案，并且区别于现有技术。本发明利用荧光原位杂交(FISH)技术，并且由于所有染色体上的所有靶标被设计成分子上具有区别，因此本发明是更好的，可以针对来自单个或少量细胞的全基因组，询问平衡以及不平衡的异常。通过识别两个相关近端着丝粒染色体的并列着丝粒标记，本发明甚至检测重排的特殊类型，即罗伯逊易位。例如，这揭示了唐氏综合征的机制-独立三倍体和易位相关三倍体。由于现有系统集中于疾病特异性的检测，因此在全基因组检查中不适合。当可用材料如此受限如单个或少量细胞时，即使提取DNA后扩增全基因组也不能提供综合检测能力。
本发明是对现有技术的改进，因为使用了特别设计的BAC DNA探针，本发明可以通过使用特别设计的具有不同激发和发射谱特征的荧光滤色块来捕获全基因组(核型)信息。进一步地，使用来自简单的现成程序如Adobe Photoshop的“图层”，可以“提取出”希望的靶标信息。即使间期细胞中的几个靶标是相互重叠的，通过选择性地“呼叫”(寻找)个体靶标的预定图案，可以在细胞中追踪完整的染色体。这使得能够识别各种异常。
本发明的实施方式包括但不限于：
1)获得外周血和分离血浆；如果需要，则使用用于将收集的血液转移至测试装置的稳定剂；
2)使用商用试剂盒如Qiagen amp试剂盒或自制方案如曲通(Triton)/加热/苯酚(THP)方案将游离(cf)DNA纯化；
3)通过平端连接方法进行全基因组扩增(WGA)，伴随(BLM-PCR)或不伴随(BL-WGA)对片段大小的富集；
4)用生物素进行5’末端标记；
5)用乙醇沉淀DNA片段；
6)在含有或不含BHW缓冲液的96孔板中温育链霉亲和素戴诺磁珠和生物素标记的DNA片段；
7)施加磁力，洗去未结合的DNA；
8)解除磁力，针对每个个体染色体进行与具有特定荧光团的靶向特异性DNA的杂交；
9)施加磁力，用或不用BHW缓冲液洗去过量的探针；
10)用NaOH洗脱，用或不用来自Gills论文的缓冲液洗脱；
11)施加磁力，将洗脱液转移至新96孔板；
12)添加带负电的银颗粒和精胺；
13)在室温下在黑暗中温育10分钟；
14)用荧光计检测荧光，与针对每个染色体上的每个靶标建立标准曲线比较；以及
15)基于杂交图案完成染色体分析。
本发明的另外的实施方式可以包括但不限于：
16)用生物素标记DNA探针；
17)通过间接酶法如亲和素-聚HRP复合体产生信号；
18)使用增强的鲁米诺(Luminol)作为用于聚HRP酶的底物；以及
19)使用光度计检测信号。
本发明的又另外的实施方式可以包括但不限于：
20)从外周血或来自胚胎的滋养层细胞分离循环胎儿细胞或肿瘤细胞；
21)将完整细胞固定于多室载玻片；
22)生成靶向特异性DNA探针；
23)在一次反应中针对所有靶标进行FISH杂交；
24)一次针对6条染色体上的靶标进行FISH杂交；
25)根据需要在完整细胞上多次重复杂交；
26)使用特别设计的滤光块捕捉杂交后靶标的图像；
27)分析每个靶标的杂交图案；
28)基于杂交图案完成染色体分析。
可以理解，附图可以包括探针标记和信号检测的替代描述，例如但不限于：
图1也可以描绘展示具有荧光团橙、Cy3.5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5的靶向特异性DNA探针可以用于生成染色体谱的示例性实施方式。
图3至图8也可以描绘展示表现出异常的任何24条染色体的异常谱的示例性实施方式。
图11也可以描绘24条人类染色体中的3条的任意组合的多重分析的荧光配色方案。
图12也可以描绘示出任何类型的异常的染色体的任意组合的多重分析。
为了以无创方式通过染色体分析来检测遗传异常，首先将血浆从全血分离，在下一步中，提取游离DNA。在步骤3中扩增纯化的DNA。步骤4是步骤3的不可缺少的一部分，该步骤4中用生物素在末端标记基因组DNA片段的。步骤4是步骤5的先决条件，该步骤5中用乙醇沉淀DNA。在步骤6中，在96孔板中用合适的缓冲液温育链霉亲和素珠和生物素标记的基因组DNA片段。下一步中，在珠的磁力分离后洗去未结合的DNA。这是在步骤8中进行的FISH杂交的先决条件。在从磁场移除珠之后，用特定的荧光团组合标记的靶向特异性DNA探针与基因组片段杂交，该基因组片段通过步骤6中形成的亲和素-生物素复合物与磁珠上的亲和素分子结合。从磁场释放珠后，洗去过量的DNA探针，在合适的缓冲液中用NaOH洗脱杂交的探针。在珠的磁力分离后，将各自的洗脱液转移至新96孔板。在步骤12中，荧光探针被捕获在带负电的银纳米颗粒和帮助形成银聚集体的带正电的精胺之间。这有助于在室温下在黑暗中温育10分钟后的荧光信号放大。下一步中，通过荧光计自动记录各自的荧光读数。最后，将这些将成为染色体谱的一部分的读数与标准正常染色体谱比较以确定遗传异常。
为了以无创方式通过染色体分析检测遗传异常，除了使用血浆DNA之外，也可以使用完整细胞。从外周血分离循环胎儿细胞或肿瘤细胞或从胚胎分离滋养层细胞是下一步的先决条件，下一步会将分离的细胞固定在显微镜载玻片上。下一步中产生的靶向特异性BAC探针会用于下面的步骤中的在一次反应中靶向于所有染色体或一次靶向于6条染色体的FISH杂交。在下面的步骤中，根据完成所有基因组靶标杂交所需要的次数进行重复杂交。下一步中，捕获杂交靶标的图像，这用于下一步中的分析。在最后一步中，使用预定的标准，发现的靶标会被确定为构成正常或异常的情况。
以下是本发明的实施方式如何工作的示例。
可以通过使用熟知的防腐剂来保存血浆中的游离DNA，样本可以运到世界各地的实验室而不会使游离DNA降解。存在多种提取和纯化高分子量DNA的方法。通过最佳地获得样品并制备游离DNA，可以利用许多全基因组扩增技术中的任一种生成足够的量来评价所有染色体的异倍体性和其他异常。换句话说，可以使用游离DNA产生分子核型。为了达到该目的，应该在扩增步骤后用生物素在5'末端标记来修饰DNA。存在几种方法将这些DNA片段捕获到固体表面上。最有效的方式是将链霉亲和素磁珠与生物素化的DNA片段一起孵育。通过标准切口平移方案，可以产生带有特定荧光团的靶向特异性DNA探针。一旦产生了所期望的探针，可以在适当的杂交缓冲液中在微量滴定板中的珠上进行个体染色体的FISH反应。可以将杂交探针洗脱并转移到新的微量滴定板上。多重扩增技术可用于增强荧光。一种这样的方法是将银纳米颗粒与精胺组合使用。可以从每个孔(染色体)记录特定的荧光强度。这种新方法的主要用途是参照针对正常女性或非癌症对照个体中的游离DNA量建立的曲线，检测基因组靶标水平的升高或降低。通过组合上述步骤，可以筛查染色体异倍体性和其他改变如缺失或重复。换句话说，通过使用来自母亲血液和所有癌症患者血液的游离DNA的这种新方法，可以生成分子核型。因此，使用以上方法，用来自癌症患者的外周血的游离DNA也可以检测与实体癌症有关的染色体改变。
存在几种方法从外周血分离和富集胎儿细胞或肿瘤细胞。通过最佳地获得所需的细胞，可以将它们固定在显微镜载玻片的表面上。通过标准切口平移方案，可以产生具有预定颜色组合(图11)的靶向特异性DNA探针。一旦产生了所期望的探针，可以在显微镜载玻片上快速进行与所有基因组靶标的杂交。通过根据需要重复杂交，在少于24小时内可以分析所有的24条染色体。
通过使用特别设计的荧光滤光器组和相机，可以捕获图像。这种数据集可以作为在Photoshop中用图层进行个体靶标分析的基础。通过组合这些上述步骤，可以确定个体染色体状态。一旦鉴定了个体染色体，产生完全核型对本领域技术人员来说是标准程序。
以下是本领域技术人员如何使用本发明的实施方式的示例。
几种离心方法可用于从收集自孕妇的全血中分离血浆成分。类似地，本领域技术人员可以利用多种DNA提取和纯化技术。可以使用可商购的试剂盒进行该步骤，或者自制方法例如THP方案是非常有用的。几种全基因组扩增试剂盒是可商购的。其中，进行或未进行片段大小的富集的平端连接扩增方法最佳地适合于胎儿异倍体性的研究。
为了用生物素进行末端标记，几种试剂盒是可商购的。容易从多个供应商获得链霉亲和素磁珠。
用于产生靶向特异性DNA探针的特定BAC文库和荧光团是可商购的。银纳米颗粒和精胺是容易商购的。在该新方法中使用的几种荧光计是可商购的。
文献中存在分离胎儿细胞的几种策略。其中，分离和富集成核胎儿红细胞提供了几个优势。一个简单的过程是使用涂覆有抗CD71/血型糖蛋白A的单克隆抗体的磁珠。使用磁珠，可以分离和富集这些细胞。在用于分离肿瘤细胞的许多系统中，通过ScreenCell的过滤系统是最简单和最经济的。该系统也可以用于分离胎儿细胞。然后，将它们用于在带有使用标准切口平移和图11概述的方案产生的靶向特异性DNA探针的显微镜载玻片上进行FISH。对每个靶标制造的这样的探针所需的荧光标记是可商购的。如所示的那样，总共搭配使用四种光谱不同的荧光团(图11)。用于本发明的荧光显微镜系统对是可商购的。在激发/发射滤光器组的几个商业来源中，Semrock和Chroma提供了检测所有颜色的最佳滤光器组合。可以使用单个滤光器组或滤光器组的组合来捕获图像。这整个过程也可以使用可商购的系统来自动化。默认的方法一直是手动的，因为这对全世界许多实验室是最经济的方法。一旦捕捉到适当的图像，就可以将其上传到Photoshop进行进一步分析。商业软件程序可用于此类分析；然而和前面的步骤一样，使用诸如Adobe Photoshop等现成程序是非常经济的。然后可以使用手动或自动方案分析个体染色体上的每个在分子上不同的靶标来产生染色体谱。
为了从母亲血液筛查胎儿异倍体性，本领域技术人员会进行以下任务：
从外周血分离血浆；
提取和纯化游离DNA；
连接小片端游离DNA，并使用随机六聚引物(hexaprimer)进行全基因组扩增；
用生物素对片段进行末端标记；
与链霉亲和素磁珠一起温育；
产生具有特定荧光团的靶向特异性DNA探针；
在96孔板中进行FISH；
与银纳米颗粒和精胺一起温育；以及
使用荧光计记录各自的荧光强度。
通过与针对靶向特异性DNA探针所连接的每种荧光团而建立的标准曲线进行比较，可以确定是否存在各染色体的胎儿异倍体性。另外，使用这种增强的荧光方法可以检测末端和间隙的大量缺失和重复(图2至图8)。
为了从原发实体肿瘤检测染色体异常，可以使用来自外周血的游离DNA，并将来自癌症患者的结果与已建立的正常曲线进行比较。
即使是低比率的胎儿DNA样品也可以用这种方法进行处理。即使游离DNA的胎儿部分在总游离DNA中是固定比例的，即约20％，并且染色体的一个拷贝的差异约为10％，由于银纳米颗粒-精胺复合物，该系统中发出的荧光的绝对量实质上也高于该10％的差异。因此，该测定的灵敏性显著好于目前采用的大量并行测序方法。而且，该方法可以产生：1)从母亲血液检测胎儿异倍体性的更快速的方法；和2)可以用于几乎所有实验室而不像现有方法一样仅由少数商业实体提供的更具实用性的方法。
相同的原则也应用于癌症检测。
为了从单个完整循环胎儿细胞、肿瘤细胞或滋养层细胞确定完全核型尤其是为了鉴定平衡易位，本领域技术人员将执行以下任务：
1.分离/提取循环胎儿细胞或肿瘤细胞或滋养层细胞；
2.将细胞固定在显微镜载玻片上；
3.根据图11和表1中的方案生成靶向特异性DNA探针；
4.进行FISH杂交；
a)一次杂交所有染色体；或
b)按照修改的方案一次杂交6条染色体；
5.使用特别设计的滤色块捕捉杂交后靶标的图像；
6.分析每个靶标并按照图11指定其预定的位置；以及
7.鉴定染色体异常和定义核型。
如果可获得另外的细胞，可以对异常建立克隆。进一步地，还可以研究克隆进化和肿瘤异质性。如果不可获得另外的细胞，可以在来自相同患者血浆样品的游离循环DNA上使用基于DNA的方法如PCR以证实易位。
为了检测被称为罗伯逊易位的涉及5条近端着丝粒染色体的特定的平衡易位，如果使用上述步骤3中概述的方法，可以寻找五个着丝粒靶标中任意两个的并列。如果需要，可以使用来自InteGen LLC的可商购的探针集进行重复杂交来检测罗伯逊易位。
另一个用途是使用上述的重复杂交方法，用靶向特异性DNA探针确定与正常细胞相比的癌细胞中的端粒长度和连接情况。
实施例
实施例1
在游离血浆DNA上使用靶向特异性DNA探针通过染色体分析从母亲血液建立胎儿核型
在一种实施方式中，通过研究提取自孕妇血浆、扩增并用生物素标记的游离DNA片段，可以建立胎儿核型。该片段可以通过链霉素-生物素复合物的缀合而结合于链霉亲合素磁珠。通过标记有荧光团的靶向特异性DNA探针，DNA片段可以与其互补序列杂交。可以洗脱杂交探针，并将该杂交探针夹在银纳米颗粒和精胺复合物之间以增强杂交探针的荧光。
每个荧光团的强度可以由荧光计记录，并且可以产生反映DNA量的个体强度曲线。这些曲线可以与已建立的正常曲线对比来确定任何异常的存在和类型。通过进行以上步骤，可以生成个体染色体谱，并且通过组合所有24个染色体谱，可以建立胎儿核型。
实施例2
在游离血浆DNA上使用靶向特异性DNA探针通过染色体分析从患者血液建立实体肿瘤诊断
在另一种实施方式中，通过研究提取自癌症患者血浆、扩增并用生物素标记的游离DNA片段，可以建立肿瘤核型。该片段可以通过链霉素-生物素复合物的缀合而结合于链霉亲合素磁珠。通过标记有荧光团的靶向特异性DNA探针，DNA片段可以与其互补序列杂交。可以洗脱杂交探针，并将该杂交探针夹在银纳米颗粒和精胺复合物之间以增强杂交探针的荧光。每个荧光团的强度可以由荧光计记录，并且可以产生反映DNA量的个体强度曲线。这些曲线可以与已建立的正常曲线对比来确定任何异常的存在和类型。通过进行以上步骤，可以生成个体染色体谱，并且通过组合所有24个染色体谱，可以建立核型。基于该核型的结果，可以建立特定的肿瘤诊断。
实施例3
在完整的循环胎儿细胞上使用靶向特异性DNA探针通过染色体分析从母亲血液建立胎儿核型
在另一种实施方式中，通过使靶向特异性DNA探针与完整的循环胎儿细胞杂交，可以建立胎儿核型。可以通过各种已经建立的技术从母亲血液中分离胎儿细胞。可以在一次反应中对所有染色体靶标完成DNA杂交，或可以在每次反应中评价6条染色体中的靶标。这之后可以在完整细胞上进行需要的次数的重复杂交以完成分析。可以记录个体染色体杂交图案，并将该个体染色体杂交图案与预期的正常图案比较来确定任何异常的存在和类型。通过进行以上步骤，可以建立胎儿核型。
实施例4
在完整的循环肿瘤细胞上使用靶向特异性DNA探针通过染色体分析从患者血液建立实体肿瘤诊断
在另一种实施方式中，通过使靶向特异性DNA探针与完整的循环肿瘤细胞杂交，可以建立特定的肿瘤诊断。可以通过各种已经建立的技术从患者血液中分离肿瘤细胞。可以在一次反应中对所有染色体靶标完成DNA杂交，或可以在每个反应中评价6条染色体中的靶标。这之后可以在完整细胞上进行需要的次数的重复杂交以完成分析。可以记录个体染色体杂交图案，并将该个体染色体杂交图案与预期的正常图案比较来确定任何异常的存在和类型。通过进行以上步骤，可以建立特定的肿瘤诊断。
实施例5
在来自滋养外胚层的完整细胞上使用靶向特异性DNA探针通过染色体分析建立胚胎核型
在另一种实施方式中，通过使靶向特异性DNA探针与完整的胎儿细胞杂交，可以建立胚胎核型。可以通过各种已经建立的技术从胚胎的滋养外胚层分离胎儿细胞。可以在一次反应中对所有染色体靶标完成DNA杂交，或可以在每次反应中评价6条染色体中的靶标。这之后可以在完整细胞上进行需要的次数的重复杂交以完成分析。可以记录个体染色体杂交图案，并将该个体染色体杂交图案与预期的正常图案比较来确定任何异常的存在和类型。通过进行以上步骤，可以对被认为是体外受精的任何胚胎建立核型。
虽然已经在某些实施方式和示例的背景下公开了本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明的实施方式从具体公开的实施方式延伸到其他替代实施方式和/或其用途和修改及其等同物。
在本发明的实施方式中已经公开了许多变型和替代元素。对本领域技术人员来说，更进一步的变型和替代元素将是显而易见的。这些不受限制的变形中，有分析个体染色体的靶向特异性DNA探针中的荧光团的特定数目和/或类型。本发明的各种实施方式可以包括或排除任意的这些变型或元素。
此外，在整个说明书中提到了许多专利和印刷出版物。以上引用的每篇参考文献单独地通过引用而整体并入本文中。
最后，应当理解，这里公开的本发明的实施方式是对本发明原理的例示。可采用的其他修改也落在本发明的范围内。因此，以示例而非限制的方式，可以根据本文的教导利用本发明的替代配置。因此，本发明的实施方式不被精准地限定于如所示和所描述的那样。
尽管已经详细描述了通过使用靶向特异性DNA探针来分析生物样品中的染色体的方法和系统的实施方式，可以明确的是，可以对其进行修改和变化，所有这些都落入本发明的真实精神和范围内。关于上面的描述，应该认识到的是，本发明各部分的最佳尺寸关系，包括尺寸、材料、形状、形式、功能以及操作方式、装配方式和使用方式的变化，对于本领域技术人员而言是明显和显而易见的，并且与附图中所示的和说明书中所述内容的所有等价关系旨在被包括在本发明中。
因此，前述内容仅被认为是对本发明原理的说明。进一步地，由于本领域技术人员可以容易地进行许多修改和变化，不希望将本发明限制在所示和所述的确切的结构和操作上，因此，所有合适的修改和等同物都认为落入本发明的范围内。
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用于染色体分析的方法和装置，美国专利第8,574,836号.
用于染色体分析的方法和装置，美国专利第7,943,304号.

Claims (15)

1.一种使用靶向特异性DNA探针在生物样品中进行染色体多重分析的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使多个特定DNA探针与完整间期细胞内的至少一个特定染色体上的特定靶DNA序列结合；
b)将能够发射不同信号的荧光标记与多个DNA探针的部分连接，使得最终的DNA探针产生1至4种荧光信号，由此创建独特的信号，所述独特的信号的特征在于所述独特的信号的组合与任何给定的染色体上的靶标不同；以及
c)使DNA探针与染色体上的靶标杂交。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特定靶DNA序列在包括DNA片段的至少一条特定染色体上，并且所述完整间期细胞是游离血浆DNA。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述杂交选自由以下组成的组：在完整间期细胞上进行一次或多次原位杂交，以及在多孔板的一个或多个孔中进行悬浮杂交。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述杂交在单次杂交中可以以24条人染色体中至少一条上的靶标中的一个或多个作为目标。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括使用嵌入于荧光显微镜和CCD相机中的特定激发/发射滤色块来记录完整间期细胞内的荧光信号的个体位置的步骤。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，与DNA探针连接的所述荧光标记选自由DEAC dUTP、FITC dUTP、花青素苷3-dUTP、花青素苷5-dUTP、红594 dUTP及其类似物或衍生物组成的组。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，基于每条染色体的预定结构，对至少所述完整间期细胞内不同位置上的DNA探针的个体荧光信号分组和分类成各自的染色体谱。
8.如权利要求1至4中任一项所述的方法，进一步包括将非荧光标记与所述多个DNA探针的部分连接的步骤，使得最终的DNA探针产生化学发光信号，所述化学发光信号的特征在于所述非荧光标记结合于与酶缀合的特定配体，酶-底物反应产生化学发光信号。
9.如权利要求8所述的方法，进一步包括使用荧光计在单个孔中针对来自每个反应的每个靶标记录总荧光强度，或使用光度计在单个孔中针对来自每个反应的每个靶标记录总化学发光强度。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，与DNA探针连接的所述非荧光标记选自由生物素及其类似物或衍生物组成的组。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，与所述非荧光标记生物素连接的配体-酶复合物可以是亲和素-聚HRP酶。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，与所述HRP酶反应的底物可以是鲁米诺。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，针对靶标的所述DNA探针选自由人染色体1至22、X和Y组成的组。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，个体染色体谱被组合以便产生完整核型，所述个体染色体谱用于检测数量或结构上的染色体异常。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物样品的至少一种的来源选自由来自孕妇的外周血、来自癌症患者的外周血以及来自使用人工生殖技术如体外受精产生的胚胎的滋养层细胞组成的组。
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