CN101978076A - 使用FISH技术检测循环肿瘤细胞中的IGF1R/Chr15的方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了方法和探针组合物，所述方法和所述探针组合物用于对含有表达所述IGF-1R基因的循环肿瘤细胞的血样进行自动FISH检测分析。所述检测分析提供可疑循环肿瘤细胞的遗传分析，所述可疑循环肿瘤细胞已经在免疫磁性选择和荧光标记后被鉴定。使用IGF-1R基因座的单一、无重复序列探针和15号染色体对照探针检测表达异常数目的IGF-1R和Chr 15信号的细胞系，包括具有低水平IGF-1R扩增的细胞系。在循环肿瘤细胞上直接检测IGF-1R的基因谱的能力可以提供一种用于评估疾病和患者对治疗的反应的自动方法。

Description

使用FISH技术检测循环肿瘤细胞中的IGF1R/Chr15的方法

相关专利申请的交叉引用

本专利申请为非临时申请，并要求于2005年9月20日提交的美国临时申请60/718,676和2008年3月25日提交的美国临时申请61/039,162的优先权。

发明背景

技术领域

本发明总体涉及肿瘤学和诊断影像学领域。更具体地讲，本发明涉及检测癌症和评估患者的治疗方案的方法。

背景技术

尽管对癌症患者的治疗和管理的改善已作了很多努力，但是在过去的二十年里，对于许多癌症类型，癌症患者的存活并没有改善。因此，大多数癌症患者并非死于原发性肿瘤，而死于转移性肿瘤：即，由恶性细胞建立的多个广泛分布的肿瘤集落，所述恶性细胞自身从原发部位肿瘤脱离并在体内移动，通常到达远端。最成功的癌症治疗策略是在肿瘤仍限于某一器官时进行早期诊断并通过手术切除肿瘤。事实证明，对于某些癌症来说，尤其是存在合适的诊断性试验(例如用于子宫颈癌的PAP涂片、用于乳腺癌的乳房X线照相术和用于前列腺癌的血清前列腺特异性抗原(PSA))时，癌症早期诊断是可行的。然而，早期诊断出的许多癌症在通过外科手术切除之前就已出现微转移。因此，及时准确地确定肿瘤的恶性可能性对于选择正确疗法十分重要。

优化疗法将基于诊断和预后信息的组合。需要准确和可重复的诊断测试，以提供关于特定癌症的转移性质的具体信息，同时需要进行预后评估，预后评估将提供关于存活的具体信息。

正确设计的预后测试会为医生提供关于存活风险和可能性的信息，此信息继而使患者不必忍受无用治疗而受益。根据预后测试而选择的治疗将是有效的，患者基于这样的认识，情绪也会受到鼓舞。与这种测试相关的成本节省将是明显的，因为可为医生提供替代无效疗法的理论基础。在关注存活的转移性癌症的治疗和检测中，正确开发的诊断和预后数据库明显将为医学提供极大益处(US 6,063,586)。

如果足够早地检测出原发肿瘤，往往可以提供外科手术、放疗或化疗或这些疗法的某种组合来去除肿瘤。遗憾的是，很难检测和移除转移集落，并且通常不可能成功治疗所有这些转移集落。因此，从临床角度来看，转移可视作癌症自然进展中的决定性事件。此外，转移能力是唯一表征恶性肿瘤的属性。

对血液中完整肿瘤细胞的检测直接关联到接受过原发肿瘤切除术的癌症患者的复发转移性疾病。遗憾的是，同样的恶性细胞扩散仍然被传统的肿瘤分期程序错过。最近的研究表明，癌症患者骨髓内单一恶性肿瘤细胞的存在是转移复发的独立预后因素(Diel IJ，Kaufman M，Goerner R，CostaSD，Kaul S，Bastert G.Detection of tumor cells in bone marrow ofpatients with primary breast cancer：a prognostic factor fordistant metastasis.J Clin Oncol，10：1534-1539，1992(Diel IJ、Kaufman M、Goerner R、Costa SD、Kaul S、Bastert G.，对原发性乳癌患者骨髓内的肿瘤细胞的检测：远程转移的预后因素，《临床肿瘤学杂志》，第10卷第1534-1539页，1992年))。但与血液中散布的上皮肿瘤细胞的检测相比较，这些侵入式技术被认为对于常规或多重临床检测分析法是不可取或不可接受的。

以前已描述了来自生物样品的肿瘤细胞、稀少细胞或其他生物实体的鉴定方法(US 6,365,362)。此两步法要求有效富集以确保在分析之前获取靶细胞，同时去除大量碎片和其他干扰物质，使得可通过成像技术进行细胞检验。此方法以独特的自动方式将免疫磁性富集元件与多参数流式细胞术、显微镜术和免疫细胞化学分析组合起来。此组合方法用于富集和计数血样中的上皮细胞，因此提供了一种量度癌症的工具。

此两步法可应用于转移性癌症患者的癌症预后和存活分析(WO04076643)。基于在血液中形态完整的循环癌细胞的存在性，此方法能够将转移性乳腺癌患者的循环癌细胞的存在性与疾病进展和存活的时间联系起来。更具体地讲，每7.5毫升存在五(5)个或更多个循环肿瘤细胞提供了在第一次随访时的预测值，因此提供了患者存活的早期预后指标。

上述检测分析法的特异性随着受检细胞的数目增多而增加，而在只有少量细胞(通常少于5个循环肿瘤细胞)被检测到的情况下特异性是不足够的。此问题的一种解决方法是提供关于可疑癌细胞的详细遗传学信息。因此，一种将血样富集与对单个可疑癌细胞的多参数图像细胞计量术和多参数遗传分析整合起来的方法将提供完整的谱图和确认机制，可显著改善目前用于患者筛选、评估疾病复发或总体存活的程序。

荧光原位杂交(FISH)已被描述为富集之后在稀少细胞检测中的单模式分析，如在WO 00/60119；Meng et al.PNAS 101(25)：9393-9398(2004)(Meng等人，《美国国家科学院院刊》，第101卷第25期第9393-9398页，2004年)；Fehm et al.Clin Can Res 8：2073-2084(2002)(Fehm等人，《临床癌症研究》，第8卷第2073-2084页，2002年)中所描述，所述文献以引用方式并入本文。上皮细胞富集后，通过已知的杂交方法筛选捕获的细胞并在显微镜载片上成像。由于内在技术误差和缺少满意的遗传学信息的确认，杂交图谱独自不提供临床置信度水平，该临床置信度水平对于敏感性分析将是必需的，如在评估具有少于5个靶细胞的样品情况下。此外，此方法用于FISH分析时难以自动化。

此前已描述在单个细胞分析中结合使用基于杂交的方法和免疫细胞化学术(US 6,524,798)。对单个细胞同时进行的表型和基因型评估要求在原位杂交准备步骤后表型特性保持稳定，并且表型特性在可检测标签的选择方面是有限的。通常，常规的原位杂交检测分析法需进行以下步骤：(1)用热或碱变性；(2)降低非特异性结合的可选步骤；(3)将一种或多种核酸探针杂交到靶核酸序列；(4)移除未结合的核酸片段；以及(5)检测杂交探针。用于完成一个或多个这些步骤(即甲醇洗涤)的试剂将改变在后续免疫细胞化学术中的抗原识别，造成靶细胞位置的微小变化或靶细胞的完全移除，由此有可能错误鉴定出可疑细胞。

通过对单个分离的靶细胞结合进行的表型和基因型多参数分析来分析稀少循环细胞的能力可确保临床医师获得任何定量信息。当使用极少数量的(1、2、3、或4个)循环肿瘤细胞(CTC)评估疾病状态，并提供早期疾病检测的确认时，该方法尤其适用。

已在肺癌中描述了用于多参数FISH分析的探针组和方法(US20030087248)。也已描述了在检测患者膀胱癌时产生95％敏感性的3探针组合，参见US 6,376,188、US 6,174,681。这些方法在评估小数量靶细胞时特异性和敏感性不高，因此无法对疾病状态的早期检测进行确认性评估。这些方法也无法提供方便的自动化的方式。

最近描述的探针去除了DNA的重复序列以提供无重复的序列。无重复的序列起到杂交探针的作用，而不用封闭DNA或不需要封闭不想要的DNA序列(WO07/053245)。

与具有低IGF-1水平的个体相比，高水平的IGF-1表达与癌症，例如肺癌、乳腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌的风险增加相关。此外，有相当多的证据表明了IGF-1和/或IGF-1R在体外或体内保持肿瘤细胞的作用。IGF-1R水平在以下肿瘤中升高：肺肿瘤(Kaiser et al.，J.Cancer Res.Clin.Oncol.119：665-668，1993(Kaiser等人，《癌症研究和临床肿瘤学杂志》，第119卷第665-668页，1993年)；Moody et al.，Life Sciences52：1161-1173，1993(Moody等人，《生命科学》，第52卷第1161-1173页，1993年)；Macauley et al.，Cancer Res.，50：2511-2517，1990(Macauley等人，《癌症研究》，第50卷第2511-2517页，1990年))、乳腺肿瘤(Pollak et al.，Cancer Lett.38：223-230，1987(Pollak等人，《癌症通讯》，第38卷第223-230页，1987年)；Foekens et al.，Cancer Res.49：7002-7009，1989(Foekens等人，《癌症研究》，第49卷第7002-7009页，1989年)；Arteaqa et al.，J.Clin.Invest.84：1418-1423，1989(Arteaqa等人，《临床研究杂志》，第84卷第1418-1423页，1989年))、前列腺肿瘤和结肠肿瘤(Remaole-Bennet et al.，J.Clin.Endocrinol.Metab.75：609-616，1992(Remaole-Bennet等人，《临床内分泌代谢杂志》，第75卷第609-616页，1992年)；Guo etal.，Gastroenterol.102：1101-1108，1992(Guo等人，《胃肠病学》，第102卷第1101-1108页，1992年))。IGF-1在前列腺上皮的去调控表达导致转基因小鼠的瘤变(DiGiovanni et al.，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 97：3455-3460，2000(DiGiovanni等人，《美国国家科学院院刊》，第97卷第3455-3460页，2000年))。另外，IGF-1似乎是人神经胶质瘤的自分泌刺激物(Sandberg-Nordqvist et al.，Cancer Res.53(11)：2475-78，1993(Sandberg-Nordqvist等人，《癌症研究》，第53卷第11期第2475-2478页，1993年))，而已显示IGF-1刺激过表达IGF-1R的纤维肉瘤的生长(Butler et al.，Cancer Res.58：3021-3027，1998(Butler等人，《癌症研究》，第58卷第3021-3027页，1998年))。如需查阅关于IGF-1/IGF-1R相互作用在多种人肿瘤生长中所起的作用，参见Macaulay，Br.J.Cancer，65：311-20，1992(Macaulay等人，《英国癌症杂志》，第65卷第311-320页，1992年)。

使用IGF-1R RNA的反义表达载体或反义寡核苷酸时显示，IGF-1R的干扰导致IGF-1介导的细胞生长的抑制(参见，例如Wraight et al.，Nat.Biotech.18：521-526，2000(Wraight等人，《自然-生物技术》，第18卷第521-526页，2000年))。使用IGF-1的肽类似物(Pietrzkowski etal.，Cell Growth & Diff.3：199-205，1992(Pietrzkowski等人，《细胞生长和分化》，第3卷第199-205页，1992年)；Pietrzkowski et al.，Mol.Cell.Biol.12：3883-3889，1992(Pietrzkowski等人，《分子细胞生物学》，第12卷第3883-3889页，1992年))、或表达IGF-1 RNA的反义RNA的载体(Trojan et al.，Science 259：94-97，1992(Trojan等人，《科学》，第259卷第94-97页，1992年))也能抑制细胞生长。另外，IGF-1R的抗体(Arteaga et al.，Breast Canc.Res.Treatm.22：101-106，1992(Arteaga等人，《乳腺癌研究和治疗》，第22卷第101-106页，1992年)和Kalebic et al.，Cancer Res.54：5531-34，1994(Kalebic等人，《癌症研究》，第54卷第5531-5534页，1994年))和IGF-1R的显性失活突变体(Prager et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA91：2181-85，1994(Prager等人，《美国国家科学院院刊》，第91卷第2181-2185页，1994年)；Li et al.，J.Biol.Chem.269：32558-2564，1994(Li等人，《生物化学杂志》，第269卷第32558-32564页，1994年)；Jiang et al.，Oncogene 18：6071-6077，1999(Jiang等人，《癌基因》，第18卷，第6071-6077页，1999年))可以逆转转化表型、抑制肿瘤发生和诱导转移表型的缺失。

IGF-1在凋亡的调控中也很重要。凋亡，即程序性细胞死亡，参与多种发育过程，包括免疫和神经系统成熟。除了其在发育中的作用，也有研究表明凋亡在抗肿瘤发生的细胞防卫中的重要作用(Williams，Cell 65：1097-1098，1991(Williams，《细胞》，第65卷第1097-1098页，1991年)；Lane，Nature 362：786-787，1993(Lane，《自然》，第362卷第786-787页，1993年))。凋亡程序的抑制可促进恶性肿瘤的发展和进展。

一些研究表明IGF-1R的表达水平与临床效果相关。在肿瘤模型中，IGF-1R调节细胞增殖、存活和转移，并诱导对靶向疗法的抗性。IGF-1R的抑制显著增加了细胞毒素剂的活性(Cohen，B.e al.，Clin.Cancer Res.11(5)：2063-73(Cohen，B.等人，《临床癌症研究》，第11卷第5期第2063-2073页))。因此IGF-1R信号的抑制对于新型癌症疗法的开发似乎是一种很有前景的策略。

已经将在CTC表面上的IGF-1R表达的检测与对癌症患者的IGF-1R拮抗剂疗法的功效预测相关联(WO07/141626)。然而，此方法不能直接检测单个肿瘤细胞的染色体排列。对IGF-1R基因的分析将提供关于表达IGF-1R的单个肿瘤细胞的凋亡或增殖状态的信息，因此导致对肿瘤发生的更特异的评估。

此外，与检测IGF-1R的表面表达的能力相结合的、能够评估IGF-1R的存在和任何染色体畸变的方法，将产生表达IGF-1R的循环肿瘤细胞中的非整倍性的更直接指标。这继而允许对疾病进展进行更特异和更灵敏的诊断和评估。

发明内容

本发明提供一种用于在IGF-1R循环肿瘤细胞中评估染色体排列的直接方法。更直接的分析方法将辅助临床医生预测IGF-1R疗法对癌症患者的益处，并为这些患者提供更特异的诊断。该方法包括：a)从患者获得血样，所述样品包含怀疑含有循环肿瘤细胞的混合细胞群；b)通过免疫磁性富集来分离上皮细胞的亚群；c)鉴别具有IGF-1R遗传畸变的循环肿瘤细胞；以及e)将提供关于测试受试者的诊断、预后或治疗信息的循环肿瘤细胞相关联。

本发明还提供一种试剂盒，用于筛选存在表达IGF-1R的循环肿瘤细胞的患者样品，此试剂盒包括：a)具有涂层的磁性纳米颗粒，其包括磁芯材料、蛋白基底涂层材料、和特异结合于来源于上皮细胞的肿瘤细胞的抗体，此抗体直接或间接偶联到所述基底涂层材料；b)用于将除待分析肿瘤细胞以外的样品组分排除的细胞染料；c)用于染色体计数和非整倍性检测的卫星计数探针；以及d)一种能够限定IGF-1R基因座的无重复序列探针。

附图说明

图1：描述从起始BAC DNA去除重复序列的DNA探针的生成的示意图。将片段化的全基因组扩增文库变性并允许在过量Cot DNA存在下重新退火。双链DNA的DSN消化产生单链的单一序列的混合物，可用于生成探针的模板。

图2：显示用于鉴定IGF-1R基因的两个克隆的位置的图表。通过选择含有IGF-1R基因座旁侧序列的BAC克隆来设计IGF-1R探针。

图3：描述了无重复序列的IGF-1R DNA克隆的染色体定位。将IGF-1R克隆(红色)与染色体17α卫星对照探针(绿色)一起杂交到正常人中期染色体。

图4：15号染色体的α卫星探针(SE-15)的图像显示于IGF-1R基因座。将无重复序列的IGF1R克隆(红色)与SE-15探针(绿色)一起混合并杂交到正常中期染色体涂片。

图5：在LNCAP细胞(右)和BT474细胞(左)上的IGF-1R探针配置(probe configuration)的杂交。

图6：显示组合使用的探针的相对位置的图表。这两个克隆是无重复序列的，并通过荧光标记(红色)的探针，使用IGF-1R探针(蓝色)作为对照对其进行染色体定位。

图7：显示了在检测分析中使用的荧光染料的光谱。ULS DY415用于标记IGF-1R。

图8：用IGF-1R探针评估的7个细胞系的图像，表明此探针能够检测染色体畸变。

图9：图中显示了对CellTracks仪器所采集的图像进行评分的能力。将CellTracks仪器所采集的图像与标准荧光显微镜所采集的图像进行比较。

图10：用于对FISH结果评分的FISH软件的截图形式的图像。顶行显示来自于CTC扫描的原始图像：CK+、DAPI+/CD45-和CTC。底行显示具有异常数目IGF-1R的CTC和15号染色体探针。

具体实施方式

本发明通过将免疫磁性富集和图像分析与荧光原位杂交(FISH)相结合而将循环肿瘤细胞的分离和鉴定整合在一起，以便检测具有异常基因谱的肿瘤细胞中的IGF-1R。

为此，CellTracks系统利用免疫磁性选择和分离来高度富集和浓缩全血样品中存在的任何上皮细胞。将所捕获的细胞可检测地标以白细胞特异性标记物和一种或多种肿瘤细胞特异性荧光单克隆抗体，以使得能对所捕获的CTC进行鉴别和计数以及与污染性非靶细胞明确地在仪器上或视觉上做区分。由于具有在每7.5-30mL血液中可检测到1或2个上皮细胞的极强敏感性，此检测分析法使得即使在出现小肿瘤块的早期阶段也能检测到肿瘤细胞。本发明的实施例并不限于CellTracks系统，而是包括敏感性和特异性相当的任何分离和成像方案。

DNA包含单一序列和重复序列。重复序列存在于整个染色体上，并具有干扰杂交反应的潜在作用，例如，干扰靶向这些重复序列之外的特定区域或单一序列的原位杂交。为了鉴定在染色体、基因或DNA序列上特定序列的存在、数量和位置，将杂交探针只杂交于所关注的位置是重要的。重复序列在杂交探针混合物中的存在降低了结合特异性，因此需要从探针上移除重复序列或防止探针杂交到靶标上的重复序列的方法。例如，经常在杂交期间添加Cot-1 DNA以防止探针结合到重复序列(US 5,447,841和US6,596,479)。

在图1中描述了生成去除了重复序列的DNA探针的总体图表。与单链DNA相比，优先切割脱氧核糖核酸分子的双链特异性核酸酶(DSN)(以引用方式并入本文的US 2005/0164216和US 6,541,204)优先切割核酸双链多核苷酸，从而提供了一种从样品混合物中移除非靶标双链DNA的方法。这些核酸酶优先消化双链形式的多核苷酸的能力提供了在生产单一的靶向特异性探针方面的潜在应用，从而消除了封闭DNA的干扰作用，并提供了一种用于快速、有效和高性价比生产的方法。

起始DNA通常是含有多种DNA片段的一种或多种DNA序列的形式。已在直接标记探针的生产中描述了探针组合物生产中的单个起始材料的初始来源(US 6,569,626)。优选从组织纯化起始寡核苷酸来源，并使用任何已知的技术，例如，酶处理(限制性酶)、聚合酶、DNA酶I有限消化、绿豆核酸酶有限消化、超声降解、DNA剪切等将其片段化成150kb到200kb的片段。这些片段化的片段中的一些将互补于特定的单一靶序列中的一种或多种DNA片段的至少一部分。

通过通常所知的方法(例如克隆进质粒构造再转染进细菌)扩增单个DNA片段。

克隆片段扩增后，鉴定代表分离片段的单个菌落是否含有所关注序列的至少一部分。通过已知的技术，例如杂交、PCR、或搜索可商购获得的文库中的已建立的数据库来完成鉴定。培养每个挑选的菌落，以获得具有单一片段的分离的质粒构造，该单一片段至少部分地互补于染色体上的靶序列的一个片段(即BAC克隆)。

一旦扩增和分离了所关注的克隆片段，它们的多核苷酸重复序列即被去除。使用全基因扩增(WGA)，从分离的质粒构造将这些片段扩增成200到500bp片段。扩增后，通过如下方式将Cot-1 DNA与WGA文库组合(librarypool)相结合：首先加热到95℃，将双链多核苷酸变性成单链状态；然后冷却到65℃，以允许对重复序列的选择性再退火。然后在双链特异核酸酶(DSN)的最适条件下添加DSN，以优先切割含有完全配对的核酸双链的脱氧核糖核酸分子，而不影响任何剩余的单链片段。通过酶消化DNA-DNA双链和DNA-RNA双链来完成双链核酸的选择性切割。从勘察加半岛蟹(US10/845,366)或虾(US 6,541,204)分离的DSN可移去双链结构。使用内切酶特异性核酸酶水解双链DNA主链中的磷酸二酯键，其优点在于不具有核苷酸序列特异性，因此适用于大多数所关注的靶标。采用DSN消化的目的是移除大量核酸双链，以便对剩余的单链多核苷酸进行后续扩增。所得的消化产物含有单链DNA(其对应于染色体上单一靶序列的部分)、一定量的未消化的双链DNA和消化的碱基对。通过离心(即离心柱色谱法)将未消化的DNA与消化的DNA和DSN分离。在将纯化的组合物扩增以进行后续的应用(例如标记或原位杂交)之前或之后，立即使用该混合物或将其保存于80℃。扩增后，使用PCR扩增所得的靶探针序列，产生90％到99％纯度的靶探针序列，并将其指定为去除了重复序列的DNA。

将所得的探针并入体现于本发明的方法中。如本发明所述，去除了重复序列的DNA用于包括FISH的原位杂交，如杂交到可疑CTC的IGF-1R基因。使用本发明所述的去除了重复序列的探针，消除了对竞争性结合的要求，导致反应特异性增加，并减少了结合所需的探针的量。

重新分析免疫磁性标记的细胞

染色体非整倍性与遗传疾病(尤其是癌症)有关。用于检测这些染色体异常的诊断方法、尤其是使用原位杂交(ISH)来检测这些染色体异常的诊断方法是可获得的。已经很好地建立了ISH和免疫细胞化学(ICC)在组织或细胞样品上的应用，但是明显需要建立有效的诊断方法，以便在单个细胞上同时进行ISH和ICC分析。因为这些染色体异常与癌症细胞上的IGF-1R基因座相关，因此，本发明采用高性价比和高特异性方法在单细胞上检测这些染色体异常。

本发明的一个方面涉及在富集和免疫细胞化学(ICC)分析后对稀少细胞的进一步处理。例如，将诸如上皮细胞的循环稀少细胞鉴定为可疑癌细胞(以引用方式并入本文的US 6,365,362、US 6,645,731和US11/202,875)。通过特定的细胞抗原和核酸标记鉴定可疑细胞。然后通过限定染色体和/或基因的特定的单一靶序列的表达确定这些可疑细胞的IGF-1R确认，用于评估在鉴定的可疑细胞内的染色体改变(即非整倍性)。因此，本发明的一个实施例包括ICC染色和后续确认的组合，其中后续确认通过使用能够结合到一个基因或一组基因的卫星计数探针(SE)和单一序列探针的荧光原位杂交(FISH)进行。

在对循环肿瘤细胞的免疫磁性富集和荧光成像后，此方法提供了增加的特异性，循环肿瘤细胞由

和

分析仪II系统(Analyzer II System)(Veridex，LLC)提供，并在US6,365,362中进一步描述。一种方法允许指定一种或多种CTC为IGF-1R阳性癌细胞，而不考虑疾病阶段，因此降低了指定样品为CTC阳性的阈值。本发明的一个实施例是检测作为治疗靶标的IGF-1R存在与否，因此提供了一种正确选择治疗的方法。

因此，一种用于血样处理的自动化和标准化方法提供了通过ICC实现对循环上皮细胞的鉴定。将从分离血样中吸出的血浆与连接到靶细胞群(即EpCAM阳性)特异性抗体的铁磁流体试剂混合。通过施加外部磁场以免疫磁性方式收集这些细胞，而允许分离和移除未标记细胞。

分离靶细胞后，将细胞分配到一次性柱体(cartridge)中，以使用图像呈现装置进行图像分析(US 6,790,366和US 6,890,426)。此装置用于施加磁场将标记细胞沿着小室的光学透明表面定位，以进行后续的ICC成像。

ICC成像后，使用合适算法鉴定可疑细胞。将可疑细胞的图像递交给用户，其对呈现的可疑细胞的身份做出最终决定。记录并归档可疑细胞的图像及其沿着小室的光学透明观测表面的相对位置，以方便后续使用。

因为单独的ICC成像对于评估少于5个CTC的血样的临床重要性的特异性不高、或对于提供关于可疑癌细胞的详细遗传学信息的特异性不高，需要对单个可疑细胞的后续分析，以提供完整的谱图和建立确认方法，确认所选可疑肿瘤细胞可以用于诊断分析，包括筛选、评估疾病复发和总体存活率。

FISH要求高于DNA的熔解温度的温度以及与ICC标记不相容的试剂。大部分ICC和DNA标签经不住FISH过程，在处理过程中会丢失所有信号。因此，鉴定为用于FISH分析的所关注细胞不能在其位置被回溯。因此，需要一种检测方法，即一旦获得ICC图像，便保持沿着光学透明观测表面的细胞位置，以进行后续的遗传分析(FISH)或其他类型的分析(其中丢失了ICC标签)。这部分地通过在获得ICC图像后在不丢失细胞或任何沿着表面的基本运动的情况下将细胞固定在光学透明表面上实现。

因此，添加FISH试剂后，将柱体置于热板上，使固定细胞的表面与热板接触。根据检测分析的类型对热板以运行于2至48小时的不同温度循环进行程控。完成温度循环后，从柱体中移去过量的FISH试剂。用含有DNA标签的缓冲液填充柱体以显现固定细胞的细胞核。根据所用的DNA标签，将标签保留在柱体中或在染色后将其从柱体洗脱。

接下来，将柱体放回

分析仪II系统以进行第二次扫描。因为在第一次ICC图像分析期间呈现于上表面的细胞被固定，相同的细胞仍然位于柱体内相同的相对位置。为了评估柱体相对于成像系统(

分析仪II系统)的位移，将第二次扫描的图像中的细胞核位置与第一次ICC扫描的图像中的细胞核位置进行比较。使用卷积算法确定这些图像相对于彼此之间的位移。确定了这些位移后，根据所关注的特定细胞的ICC图像，可以在第二次扫描中的FISH后从列表中选择所关注的特定细胞，并将其重新定位于柱体表面。采集所选FISH探针的下一个荧光图像。

实例1-用于IGF-1R/Chr 15 FISH检测分析的探针组的建立。

对于此检测分析，需要两类探针。一类是卫星计数(SE)探针。这些探针结合染色体着丝粒附近的卫星(重复)序列，并用于染色体计数和非整倍性检测。第二类探针是单一序列探针。如其名称所指，这些探针结合单一序列，如基因。使用生物信息学，可以针对基因组中的任何位置设计单一序列探针。单一序列探针通常包含重复元件，如Alu或Kpn重复序列，这些重复序列可以导致探针的非特异性结合。通常通过在杂交中掺入未标记的封闭DNA来进行非特异性结合的抑制。研究显示封闭DNA干扰单一序列与卫星探针之间的杂交。本发明方法通过使用无重复探针去除了该步骤，这些无重复探针允许更快、信号更亮的探针杂交，同时没有使用封闭DNA的缺点。

使用生物信息学，通过选择含有IGF-1R基因座旁侧序列的细菌人工染色体(BAC)克隆设计IGF1R探针。图2中的图表显示这两个克隆相对于IGF1R基因的位置。使用Qiagen大构造试剂盒(Qiagen Large ConstructKit)扩增和分离BAC DNA。将克隆进行FISH染色体定位以检测特异性，然后根据所描述的方案使之无重复序列。在图2中，红色的“A”和“B”代表IGF-1R基因座旁侧的两个克隆。绿色区代表15号染色体上的卫星计数探针(SE-15)。

将IGF1R克隆进行染色体定位以确认它们的功能。将这两个克隆的扩增的无重复序列DNA进行超声降解并用ULS-PlatinumBright 550(Kreatech Diagnostics)标记。如图3所示，将IGF1R克隆(红色)与染色体17α卫星对照探针(绿色)一起杂交到正常人中期染色体上。这两个克隆都在大小合适的近端着丝粒染色体的长臂末端产生明亮的信号。未在其他染色体上观察到无重复序列的克隆的交叉杂交。

对15号染色体的α卫星探针(SE-15)进行评估以用作IGF-1R基因座的对照探针。如图4所示，将无重复序列的IGF-1R克隆A和B(红色)与SE-15着丝粒探针(绿色)一起混合，并杂交到正常中期染色体涂片。下面的图像清晰地表明，IGF1R和SE-15探针定位到正确的染色体并发出强信号。

实例2-对IGF-1R/SE-15探针配置的细胞系评估。

测试15号染色体的α卫星探针和IGF-1R克隆A和B的组合(IGF-1R/SE-15)以评估遗传畸变。将IGF1R/SE-15探针配置在数个细胞系上使用以查看探针是否可以检测非整倍性或基因扩增/缺失。用此配置测试了A549(肺)、BT474(乳腺)、PC3(前列腺)、LNCAP(前列腺)、H1299(肺)和MCF7(乳腺)细胞系。图5中的图像显示LNCAP有四个拷贝的SE-15和四个拷贝的IGF1R，表明具有非整倍性但无基因扩增。测试的剩余5个细胞系显示了SE-15探针与其他染色体的交叉杂交。BT 474细胞含有2-3个拷贝的IGF1R和多个指示交叉杂交的SE-15信号。其他细胞系具有不同数量的SE-15探针的交叉杂交。由于交叉杂交程度在细胞系和所测试的正常供体之间不同，可能此交叉杂交是由于供体之间的变异。

为了解决SE-15的交叉杂交问题，用靶向15号染色体上其他基因座的单一序列探针重新配置IGF-1R/SE-15探针。因为该探针是单一序列探针，所以应可以结合到15号染色体的特定区域，而没有因使用α卫星探针(如SE-15)而产生的交叉杂交问题。在15号染色体的q1区，即与IGF1R位于15号染色体的相同臂上的近着丝粒区选择两个相邻的克隆。图6中的图表显示以该配置使用的探针的相对位置。根据无重复序列方案生成这两个克隆并进行荧光标记(红色)。IGF-1R探针(蓝色)用作染色体定位的对照。如图所示，克隆Chr 15 A定位到不正确的染色体。克隆Chr 15 B正确地定位到15号染色体，并被进一步评估为IGF-1R的对照探针。

图7显示了用作探针标签的荧光染料的光谱。为Chr 15探针选择ULS-550染料(Kreatech Diagnostics)，而ULS DY415用于IGF-1R。

配置中的每个探针的最佳浓度是基于具有最优信噪比量度的最亮信号。杂交混合物由50％的甲酰胺、1×SSC、10％的硫酸葡聚糖、10％的Kreaboost和不同浓度的探针组成。将固定在CellTracks柱体内的白细胞过夜进行FISH，并使用24％的甲酰胺和0.1×SSC进行严格的洗脱。通过采集10个细胞的荧光图像并通过将细胞核中最亮像素(信号)的强度除以细胞核中一些随机像素(噪音)的平均强度，从而测量信号和背景强度。表I列出了测得的浓度和相关信噪比(SNR)。将IGF1R和Chr 15两者的最佳浓度都确定为4ng/μl。

表I

实例3-对来自供体样品的探针配置的评估。

在获得检测分析的最佳条件(包括在反应中每个探针的使用浓度为4ng/μl)后，在得自3个不同供体的总共350个CD45/CK细胞(白细胞)上评估探针配置，并使用CellTracks-FISH系统分析。下表列出了所评分的每个靶标的拷贝数和结果。能够在大于95％的由CellTracks-FISH系统重新定位的细胞中评分FISH信号。

表II显示了来自三个供体的结果。期望的IGF1R的2个拷贝出现在从3个供体测得的87％、81％和93％的WBC中。期望≥75％的WBC应该显示期望的结果，即对于IGF1R而言，每个WBC有2个斑点，并且应可以对＞85％的评估的WBC进行评分。这三个供体显示了期望的91％、97％和93％的所检测WBC中的Chr 15的2个拷贝。为此，我们设定了QC标准，即≥80％的WBC应该显示期望的2个斑点的结果，并且应可以对＞85％的评估的WBC进行评分。此数据与使用其他选择的探针以相似的方式收集的数据一致。

表II

实例4-染色体畸变的检测。

用优化的IGF-1R探针检测分析7个细胞系，以证明探针能够检测染色体畸变。如图8所示，显微镜图像描述了IGF-1R信号(蓝色)和Chr 15信号(红色)，同时当观察多个细胞时可见典型计数。所有检测的细胞系都包含IGF-1R和Chr 15探针的额外拷贝。大部分拷贝数的增加为这两个探针的平衡增加，表明是非整倍性的而不是基因扩增的。与此例外的是MCF7细胞系，其相对于Chr 15探针始终有1-2个额外拷贝的IGF-1R，表明有低水平的基因扩增。所测的细胞系没有显示高水平的IGF-1R基因扩增。

实例5-自动CellTracks仪器与标准荧光显微镜之间的比较。

为了验证CellTracks仪器能够采集用于自动分析的图像，用CellTracks-FISH仪器和标准荧光显微镜采集来自相同柱体的细胞的图像。图9显示了代表性的PC3-9细胞和白细胞对照的图像。此图表明由CellTracks仪器采集的图像至少与由显微镜采集的图像一样好。由显微镜采集的PC3-9细胞的Chr 15图像显示了有一些失焦的两个斑点(白色箭头)。相反地，CellTracks仪器在多个焦平面采集图像，并生成复合图像，其中所有斑点都对准焦点，从而使得解释更为容易。典型的PC3-9细胞显示4-6个拷贝的Chr 15和3-5个拷贝的IGF-1R。

CellTracks-FISH系统是用于流体样品的自动IGF-1R分析的理想平台。图10显示所选细胞在富集和固定于柱体后的典型截图图像。顶行图像显示来自CTC扫描的原始图像，这些原始图像显示此细胞是CK⁺DAPI⁺/CD45^-，因此是可疑的CTC。底行图像由FISH仪器采集，其显示CTC有异常数目的IGF1R和Chr 15探针。FISH软件为结果评分并为诊断性解释提供信息。这表明使用CellTracks系统，可以使来自患者样品的CTC从血液中富集、固定于柱体中并可通过FISH技术分析。

上文提供了对杂志文献、美国专利和美国专利申请的一些引用。每个上述引用的主题以引用方式并入本说明书，并如同以全文在此阐述。

尽管上文已经描述和具体例证了本发明的某些优选实施例，但并不意味着本发明将局限于这些实施例。在不脱离本发明精神的情况下可以对这些实施例进行各种修改，以下权利要求书涵盖了其全部范围。

Claims (12)

1.一种用于评估来自患者样品的循环肿瘤细胞中的IGF-1R基因异常的方法，包括：

a.从患者获得血样，所述血样包含怀疑含有循环肿瘤细胞的混合细胞群；

b.通过免疫磁性富集来分离上皮细胞的亚群；

c.鉴定可疑循环肿瘤细胞；以及

d.将所述可疑循环肿瘤细胞与能够检测染色体畸变的IGF-1R无重复序列的探针配置杂交。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫磁性富集包括：

a.将所述样品与偶联于配体的胶质免疫磁性颗粒混合，所述配体特异性结合于可疑循环肿瘤细胞，从而基本上排除其他群体；和

b.使所述样品-免疫磁性颗粒混合物经受高梯度磁场，以产生富含免疫磁性颗粒结合的肿瘤细胞的分离的细胞组分。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述表型谱由选自下列的方法确定：多参数流式细胞术、免疫荧光显微术、激光扫描细胞计量术、明视野基准图像分析、毛细管容量分析、光谱成像分析、人工细胞分析、自动细胞分析以及它们的组合。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述表型谱由自动免疫荧光细胞分析确定。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针配置由IGF-1R基因座旁侧的克隆序列和缺少交叉杂交的α卫星探针组成。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述克隆序列选自细菌人工染色体克隆。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述α卫星探针选自SE-17、SE-15以及它们的组合。

8.根据权利要求5所述的方法，其中所述α卫星探针是对15号染色体的q1区特异的。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述杂交可疑的靶细胞提供所述患者的诊断、预后或治疗信息。

10.一种用于确定来自患者样品的循环肿瘤细胞中的IGF-1R基因异常的试剂盒，包括：

a.IGF-1R基因座旁侧的多核苷酸探针序列，其中所述探针的重复序列被去除；

b.缺少交叉杂交的α卫星探针；和

c.连接到所述(a)和(b)的标记部分。

11.根据权利要求10所述的试剂盒，其中通过用双链特异性核酸酶消化来去除所述多核苷酸探针序列的所述重复序列。

12.根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述标记部分是由基于铂的配位键连接的荧光团。

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