KR20220088437A - 폴리뉴클레오티드-연결된 바이오컨쥬게이트 및 제조 및 이용 방법 - Google Patents

폴리뉴클레오티드-연결된 바이오컨쥬게이트 및 제조 및 이용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20220088437A
KR20220088437A KR1020227015133A KR20227015133A KR20220088437A KR 20220088437 A KR20220088437 A KR 20220088437A KR 1020227015133 A KR1020227015133 A KR 1020227015133A KR 20227015133 A KR20227015133 A KR 20227015133A KR 20220088437 A KR20220088437 A KR 20220088437A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
polynucleotide
acid linker
modified
stranded
Prior art date
Application number
KR1020227015133A
Other languages
English (en)
Inventor
크레이그 라보다
마이클 스타드니스키
크리스토퍼 드와이어
Original Assignee
피토넥스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 피토넥스, 인코포레이티드 filed Critical 피토넥스, 인코포레이티드
Publication of KR20220088437A publication Critical patent/KR20220088437A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/548—Carbohydrates, e.g. dextran
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0054—Macromolecular compounds, i.e. oligomers, polymers, dendrimers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/131—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being a member of a cognate binding pair, i.e. extends to antibodies, haptens, avidin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/149—Particles, e.g. beads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/179—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being a nucleic acid
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/10—Oligonucleotides as tagging agents for labelling antibodies

Abstract

본원에서는 핵산 링커를 통해 컨쥬게이트 성분에 연결된 항체 또는 비드와 같은 기질을 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트가 제공된다. 또한, 이러한 바이오컨쥬게이트의 제조 및 이용 방법도 제공된다. 바이오컨쥬게이트를 생성하는 컨쥬게이션 방법은 화학적으로 가혹하지 않고 안정적이며 컨쥬게이션 후 정제가 요구되지 않을 수 있을 만큼 충분히 효율적이다. 또한 본 개시내용은 컨쥬게이션 쌍 당 많은 고유 링커에 대한 필요성을 제거함으로써 제품 라인과 관련된 물류 간접비의 감축을 제공한다.

Description

폴리뉴클레오티드-연결된 바이오컨쥬게이트 및 제조 및 이용 방법
항체와 같은 단백질에 분자를 컨쥬게이션(conjugation)하기 위해 사용되는 현재 화학은 화학적으로 가혹하고 항체 및/또는 항체와 컨쥬게이션되는 분자의 생물학적 활성을 변경하는 데 내재적 위험을 수반한다. 또한, 형광 염료 컨쥬게이션된 항체의 경우, 사용되는 화학은 각 항체에 형광 염료 분자를 분포시킨다. 예를 들어, NHS-에스테르 컨쥬게이션 화학 및 최신 중합체 염료를 이용하면 결국 Poisson 분포에서 각 항체에 컨쥬게이션되게 되는 2-10개의 염료 분자의 분포를 일으킨다. 이는 측정의 기저에 놓인 가변성 (및 그에 따른 노이즈)을 증가시키고, 나아가 이러한 염료-컨쥬게이션된 항체를 이용하여 생물학적 분자를 정량화하는 능력을 손상시킨다. 이들 컨쥬게이션 화학은 또한 비효율적이어서, 비용에 영향을 미칠뿐 아니라 최종 생성물에서 결합되지 않은 유리 염료의 포함 위험을 높히는 과도한 염료를 필요로 하게 된다. 표 1은 분자를 항체에 부착시키는 데 사용된 여러 현재의 기술을 나타낸다.
Figure pct00001
추가로, 현재 사용가능한 염료의 고유한 "끈적거림" 및 수반된 잠재적인 가혹한 화학으로 인해, 컨쥬게이션 후 염료의 정제가 생체 분자 컨쥬게이트의 현재 제작에서 필수적인 단계이다.
핵산 링커를 통해 결합 분자가 컨쥬게이트 성분(conjugate component)에 연결된 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트(bioconjugate)가 본원에서 제공된다.
본원에서는 또한 핵산 링커를 통해 컨쥬게이트 성분에 연결된 비드를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트가 제공된다.
하기를 포함하는, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트 또는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트의 제조 방법이 제공된다: (i) 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된 기질을 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉하는 단계로서, 상기 기질은 결합 분자 또는 비드이고, 기질의 단일-가닥 링커 서열의 적어도 일부는 컨쥬게이트 성분의 단일-가닥 링커 서열의 일부와 상보적이고, 접촉시, 기질의 핵산 링커 및 컨쥬게이트 성분의 핵산 링커는 어닐링하여 기질을 컨쥬게이트 성분과 연결하는 적어도 부분적으로 이중-가닥 링커를 형성하는 단계; (ii) 기질을 컨쥬게이트 성분과 접촉하고(상기 기질은 결합 분자 또는 비드임), 핵산 링커를 기질에 부착하고, 동일 핵산 링커를 컨쥬게이트 성분에 부착하여 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트를 형성하는 단계, (iii) 핵산 링커를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분을 기질과 접촉하고(상기 기질은 결합 분자 또는 비드임), 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분의 핵산 링커를 기질에 부착하여 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 또는 비드 바이오컨쥬게이트를 형성하는 단계, (iv) 핵산 링커를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된 기질을 컨쥬게이트 성분과 접촉하고(상기 기질은 결합 분자 또는 비드임), 폴리뉴클레오티드-변형된 기질의 핵산 링커를 컨쥬게이트 성분에 부착하여 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 또는 비즈 바이오컨쥬게이트를 형성하는 단계; 또는 (v) (i) 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된 기질(상기 기질은 결합 분자 또는 비드임), (ii) 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분, 및 (iii) (i) 또는 (ii)의 핵산 링커가 아닌, 추가 핵산 링커 세그먼트를 접촉하는 단계로서, 상기 기질의 단일-가닥 링커 서열의 적어도 일부는 추가 핵산 링커 세그먼트 (iii)의 단일-가닥 부분과 상보적이고/이거나, 컨쥬게이트 성분의 단일-가닥 링커 서열의 적어도 일부는 추가 핵산 링커 세그먼트 (iii)의 단일-가닥 부분과 상보적이고, 접촉시, 기질의 핵산 링커, 컨쥬게이트 성분의 핵산 링커, 및 추가 핵산 링커 세그먼트는 어닐링하여 기질을 컨쥬게이트 성분에 연결하는 적어도 부분적으로 이중-가닥 링커를 형성하는 단계.
본원에서는, 동일한 결합 분자의 별개의 결합-분자 분자(binding-molecule molecule)가 상이한 컨쥬게이트 성분으로 라벨링되는, 검출을 위한 라벨링된 결합 분자의 고속(high-rate) 제조 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를, 동일 결합 분자의 적어도 2개의 별개의 결합-분자 분자에 부착시켜 복수개의 폴리뉴클레오티드-변형된 결합-분자 분자를 제조하는 단계; 및 (b) 복수개의 적어도 한 폴리뉴클레오티드-변형된 결합-분자 분자를 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 제1의 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉하고, 복수개의 적어도 하나의 상이한 폴리뉴클레오티드-변형된 결합-분자 분자를 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 제2의 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉하는 단계로서, 제1 및 제2의 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분은 검출 라벨을 포함하고, 적어도 이들의 검출 라벨에서 상이하며, 결합-분자 분자의 핵산 링커의 단일-가닥 서열의 적어도 일부는 제1 및/또는 제2의 컨쥬게이트 성분의 핵산 링커의 단일-가닥 서열과 상보적이고, 접촉시, 핵산 링커들이 어닐링하여 결합-분자 분자를 컨쥬게이트 성분과 연결하는 이중-가닥 링커를 형성하는 단계를 포함한다.
본원에서는 상이한 결합 분자가 동일한 컨쥬게이트 성분으로 라벨링되는, 검출을 위한 라벨링된 결합 분자의 고속 제조 방법이 제공되며, 상기 방법은: (a) 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를 적어도 2개의 상이한 결합 분자에 부착시켜 적어도 2개의 상이한 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자를 제조하는 단계; 및 (b) 적어도 2개의 상이한 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자를, 검출 라벨을 포함하고 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉하는 단계로서, 상기 결합 분자의 핵산 링커의 단일-가닥 서열의 적어도 일부는 컨쥬게이트 성분의 핵산 링커의 단일-가닥 서열과 상보적이고, 접촉시 핵산 링커들은 어닐링하여 결합 분자를 컨쥬게이트 성분에 연결하는 이중-가닥 링커를 형성하는 단계를 포함한다.
본원에서, (i)(a) 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 기질(상기 기질은 결합 분자 또는 비드임), 및 (i)(b) 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 컨쥬게이트 성분을 포함하는 조성물로서, 상기 기질의 핵산 링커의 단일-가닥 서열의 적어도 충분한 일부는 컨쥬게이트 성분의 핵산 링커의 단일-가닥 서열의 일부와 상보적이어서 링커들이 어닐링하고 기질을 컨쥬게이트 성분에 연결하는 적어도 부분적으로 이중-가닥 링커를 형성하게 하는 조성물; (ii)(a) 핵산 링커를 포함하는 기질(상기 기질은 결합 분자 또는 비드임), 및 (ii)(b) 기질을 컨쥬게이트 성분에 연결하는 핵산 링커와 부착을 할 수 있는 컨쥬게이트 성분을 포함하는 조성물; (iii)(a) 핵산 링커를 포함하는 컨쥬게이트 성분, (iii)(b) 컨쥬게이트 성분을 기질에 연결하는 핵산 링커와 부착할 수 있는 기질을 포함하는 조성물; (iv)(a) 핵산 링커와 부착할 수 있는 기질(상기 기질은 결합 분자 또는 비드임) 및 핵산 링커와 부착할 수 있는 컨쥬게이트 성분, 및 (iv)(b) 핵산 링커(상기 핵산 링커는 단일-가닥이거나, 이중-가닥 세그먼트를 포함하거나, 핵산 링커는 완전히 이중 가닥임)를 포함하는 조성물; 또는 (v)(a) 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 기질(상기 기질은 결합 분자 또는 비드임), (v)(b) 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 컨쥬게이트 성분; 및 (v)(c) 추가의 핵산 링커 세그먼트를 포함하고, 상기 (v)(a), (v)(b), 및 (v)(c)는 어닐링하여 (v)(a), (v)(b), 및 (v)(c)를 포함하고, (v)(a)를 (v)(b)에 연결하는 적어도 부분적으로 이중-가닥 핵산 링커를 형성할 수 있는 조성물이 제공된다.
본원에서는, 세포, 조직 및/또는 기관을 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트와 접촉하는 단계를 포함하는, 세포, 조직 및/또는 기관의 라벨링 방법으로서, 여기서 상기 바이오컨쥬게이트의 결합 분자 부분은 세포, 조직 및/또는 기관의 항원, 에피토프 및/또는 합텐에 결합하고, 바이오컨쥬게이트의 컨쥬게이트 성분 부분은 검출가능한 라벨을 포함하는 방법이 제공된다.
본원에서는, 라벨링된 세포, 조직 및/또는 기관으로부터 신호를 정량적으로 측정하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 세포, 조직 및/또는 기관을 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트와 접촉하는 단계로서, 여기서 상기 바이오컨쥬게이트의 결합 분자 부분은 세포, 조직 및/또는 기관의 항원, 에피토프 및/또는 합텐에 결합하고, 바이오컨쥬게이트의 컨쥬게이트 성분 부분은 검출가능한 라벨을 포함하는 단계, 및 상기 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트의 존재를 측정하는 단계로서, 여기서 상기 결합 분자의 DoL은 공지되어 있어, 정량적 측정이 가능한 단계를 포함한다.
본 개시내용의 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트를 제조하거나, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트를 제조하거나, 본 개시내용의 조성물을 제조하거나 또는 본 개시내용의 방법 중 임의의 것을 수행하는데 필수적인 하나 이상의 성분을 포함하는 키트가 제공된다.
도 1. 도 1은 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드-변형된 항체 바이오컨쥬게이트의 성분 부분(폴리뉴클레오티드-변형된 항체, 상보적인 핵산 가닥을 가진 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 링커, 및 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분)의 예시적인 예를 나타낸다.
도 2. 도 2는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드-변형된 항체 바이오컨쥬게이트의 성분 부분(폴리뉴클레오티드-변형된 항체, 상보적인 polyA 및 polyT 핵산 가닥을 가진 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 링커, 및 올리고뉴클레오티드-기반 형광 라벨)의 또 다른 예시적인 예를 나타낸다.
도 3. 도 3은 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드-변형된 항체 바이오컨쥬게이트의 제조 방법을 나타낸다.
도 4. 도 4는 상이한 라벨로 라벨링된 동일한 항체, 동일한 라벨로 라벨링된 상이한 항체, 및 상이한 라벨로 라벨링된 상이한 항체의 고속 제조 방법을 나타낸다.
도 5. 도 5는 본 개시내용의 방법과 비교하여 종래의 컨쥬게이션 방법에 의해 수득된 항체 당 라벨의 분포 비교를 나타낸다.
도 6. 도 6은 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트의 성분 부분(폴리뉴클레오티드-변형된 비드, 상보적 polyA 및 polyT 핵산 가닥을 가진 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 링커, 및 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분)의 예시적인 예를 나타낸다.
도 7. 도 7은 비드 및 폴리뉴클레오티드 링커를 통해 비드에 연결된 2개의 올리고뉴클레오티드-기반 형광 라벨을 포함하는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트의 예시적인 예를 나타낸다.
도 8. 도 8은 비드에 부착된 라벨/염료의 개수를 제어함으로써, 정량적 측정을 수행할 수 있는 방법을 나타낸다.
도 9. 도 9는 전통의 대조군 비드(좌측) 및 PHITON 라벨-내장 및/또는 외부 라벨링된 비드를 나타낸다.
도 10. 도 10은 과잉의 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분의 단일-가닥 핵산 링커 부분을 비드에 결합된 상보적 핵산 가닥에 어닐링함으로써 폴리뉴클레오티드-변형된 항체에 연결되지 않은 과잉의 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분을 제거하는 것에 의한 정제 방법을 예시한다.
도 11. 도 11은 본원에 기재된 방법(polyT) 대 고유의 식별 "바코드" 서열로의 컨쥬게이션을 이용하여 항-CD3 항체에 컨쥬게이션된 PHITON 라벨(NovaBlue 610)의 성능 비교(말초 혈액 단핵 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell) 염색)를 나타낸다.
도 12. 도 12는 본원에 기재된 방법(polyT) 대 고유의 식별 "바코드" 서열로의 컨쥬게이션을 이용하여 항-CD4 항체에 컨쥬게이션된 PHITON 라벨(NovaYellow 610)의 성능 비교(말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 염색)를 나타낸다.
도 13. 도 13은 본원에 기재된 방법(polyT) 대 고유의 식별 "바코드" 서열을 통해 컨쥬게이션된 동일 염료를 이용하여 항-CD3 및 항-CD4 각 항체에 컨쥬게이션된 PHITON 라벨(NovaBlue 610 및 NovaYellow610)로의 성능 비교(말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 염색)를 나타낸다.
도 14. 도 14는 본 개시내용의 폴딩된 올리고뉴클레오티드-기반 형광 라벨 구조에 형광단-작용화된 단일-가닥 DNA(ssDNA)의 자가-어셈블리를 나타낸다.
도 15. 도 15는 올리고뉴클레오티드-기반 형광 라벨을 형성하기 위해 DNA 가닥에 커플링된 공진기 네트워크의 개략도를 나타낸다.
도 16. 도 16은 비드 또는 항체 또는 유도체와 같은 기질에 라벨을 컨쥬게이션하는데 사용된 키트의 개략도를 나타낸다.
도 17. 도 17은 기질을 컨쥬게이트 성분에 연결하는 링커에서 추가적인 핵산 분자(박스 내)의 포함의 여러 예시적인 예를 나타내며, 여기서 추가적인 핵산 분자는 기질에 부착된 링커에 부가되고, 그리고 컨쥬게이트 성분에 부착된 링커에 부가된다.
도 18. 도 18은 (상단) 컨쥬게이트 성분에 기질을, 이들 링커들의 각 상보적인 단일-가닥 부분을 하이브리드화함으로써 간접적으로 연결하는 것, (중간) 자유 링커를 컨쥬게이트 성분의 연장부 또는 컨쥬게이트 성분에 부착된 상보적인 링커에 먼저 하이브리드화함으로써 적어도 부분적으로 이중-가닥 링커를 형성한 다음 링커의 적어도 한 가닥을 직접 기질에 부착시킴으로써 컨쥬게이트 성분에 기질을 연결하는 것, 및 (하단) 컨쥬게이트 성분의 연장부 또는 컨쥬게이트 성분에 부착된 링커를 기질에 직접 부착함으로써 컨쥬게이트 성분에 기질을 연결하는 것의 예시적인 예들을 나타낸다.
정의.
단수 형태의 실체(entity)인 용어는 해당 실체 중 하나 이상을 지칭하는 것에 주목해야 하며; 예를 들어 "링커"는 하나 이상의 링커를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "하나" (또는 "한"), "하나 이상", 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환하여 사용될 수 있다.
더욱이, 본원에서 사용되는 "및/또는"은 다른 것과 함께 또는 없이 지정된 특징 또는 성분 각각의 특정 개시로서 간주되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 구절에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독) 및 "B" (단독)을 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 구절에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 하기의 구현예 각각을 포함하도록 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
본원에서 "포함하는" 또는 "포함한다"라는 언어로 기술되는 양태와, 그 밖의 "~로 이루어진", "~로 이루어지다", "~로 본질적으로 이루어진" 및/또는 "~로 본질적으로 이루어지다" 등의 용어로 기술된 유사한 양태 등도 또한 제공된다는 것이 이해된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 관련된 분야의 당업자에 의해 통상 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.
수 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. "및 그 사이의 임의의 범위" 등으로 명시적으로 식별되지 않는 경우에도, 예를 들어 1, 2, 3 또는 4와 같이 값의 목록이 인용되는 경우, 달리 명시되지 않는 한, 본 개시내용은 끝점들을 포함해서 그 값들 사이의 임의의 값, 예를 들어 1 내지 3, 1 내지 4, 2 내지 3, 2 내지 4 등을 구체적으로 포함한다.
본원에서 제공된 표제는 단지 참조 용이성을 위한 것이며, 명세서를 전체적으로 참조함으로써 가질 수 있는 본 개시내용의 양태 또는 다양한 양태에 대한 제한이 아니다.
본원에서 이용된 바, "링커"는 분자의 다른 구성요소들을 함께 연결하는 것을 목적으로 하는 컨쥬게이트된 분자의 구성요소이거나, 컨쥬게이션된 분자의 다른 구성요소가 함께 연결되지 않는 경우, 다른 구성요소에 컨쥬게이션되기 위해 존재하는 구성요소의 일부이나, 그렇지 않으면 반드시 존재하는 것은 아니다. 예를 들면, 항체는 통상 또는 반드시 이것에 부착된 폴리뉴클레오티드를 갖지는 않겠지만, 본 개시내용의 목적을 위해, 폴리뉴클레오티드는 항체에 부착되어 링커를 형성하여 항체를 또 다른 분자에 연결해 폴리뉴클레오티드-변형된 항체 바이오컨쥬게이트를 형성할 수 있다.
본원에서 이용된 바, 용어 "비자연 발생" 물질, 조성물, 실체 및/또는 또 다른 물질, 조성물 또는 실체의 조합 또는 이의 임의의 문법적 변형은, 당해 분야의 숙련자가 "자연 발생"으로 익히 이해하는, 또는 판사 또는 행정 또는 사법 기관에 의해 "자연 발생"으로 결정되거나 해석되는, 또는 언제라도 그러할 수 있는 물질, 조성물, 실체 및/또는 임의의 물질, 조성물 또는 실체의 조합물의 형태인 것을 명시적으로 배제하나, 이것만을 제외하는 조건부 용어이다.
본원에서 이용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 단수의 "폴리펩티드"뿐 아니라 복수의 "폴리펩티드들"을 포함하고, 아미드 결합(또한 펩티드 결합으로도 공지됨)에 의해 선형으로 연결된 단량체(아미노산)로 구성된 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 용어 "폴리펩티드"는 둘 이상의 아미노산의 임의의 사슬 또는 사슬들을 지칭하며, 생성물의 특정 길이를 지칭하지는 않는다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 사슬" 또는 둘 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 지칭하는데 사용된 임의의 기타 용어는 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩티드"는 임의의 이들 용어들 대신에 또는 이들과 상호교환되어 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 또한 글리코실화 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 또는 비표준 아미노산에 의한 변형을 포함하나 이들로 제한되는 것은 아닌 폴리펩티드의 발현후 변형의 생성물을 지칭하는 것으로 의도된다. 폴리펩티드는 자연 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있거나, 재조합 기술에 의해 생성될 수 있으나, 지정된 핵산 서열로부터 반드시 번역되는 것은 아니다. 이것은 화학적 합성에 의한 것을 포함하여 임의의 방식으로 생성될 수 있다.
본원에서 이용되는 바와 같은 "단백질"은 단일의 폴리펩티드, 즉 상기 정의된 바와 같은 단일의 아미노산 사슬을 지칭할 수 있으나, 또한 예를 들어 디술파이드 결합, 수소 결합 또는 소수성 상호작용에 의해 회합되어 다량체 단백질을 생성하는 둘 이상의 폴리펩티드를 지칭할 수도 있다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체는 자연 환경에 있지 않는 폴리펩티드를 의도한다. 특정 수준의 정제가 요구되지 않는다. 예를 들어, 단리된 폴리펩티드는 이것의 천연 또는 자연 환경에서 제거될 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합적으로 생성된 폴리펩티드 및 단백질은 임의의 적합한 기술에 의해 분리되거나, 분획화되거나 부분적으로 또는 실질적으로 정제되어진 재조합 폴리펩티드와 같이 본원에 개시된 바와 같이 단리된 것으로 간주된다.
본원에서 이용된 바, 용어 "비자연 발생" 폴리펩티드 또는 이의 임의의 문법적 변형은, 당해 분야의 숙련자가 "자연 발생"으로 익히 이해하는, 또는 판사 또는 행정 또는 사법 기관에 의해 "자연 발생"으로 결정되거나 해석되는, 또는 언제라도 그러할 수 있는 폴리펩티드의 형태인 것을 명시적으로 배제하나, 이것만을 제외하는 조건부 용어이다.
본원에서 개시된 기타 폴리펩티드는 앞서의 폴리펩티드의 단편, 유도체, 유사체 또는 변이체 또는 이들의 임의 조합물이다. 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 서브유닛 또는 다량체 단백질을 지칭할 때 용어 "단편", "변이체", "유도체" 및 "유사체"는, 완전한 폴리펩티드 또는 단백질의 활성의 적어도 일부를 보유하나, 구조적으로는 상이한 임의의 폴리펩티드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 단편은 예를 들어 단백질분해 단편뿐 아니라 결실 단편을 포함한다. 변이체는 상기 기재된 바와 같은 단편, 및 나아가 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로 인해 변경된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 포함한다. 변이체는 자발적으로 발생되거나 또는 의도적으로 구축될 수 있다. 의도적으로 구축된 변이체는 당업계에 공지된 돌연변이유발 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 유도체는 천연 폴리펩티드 상에서 발견되지 않는 추가적인 특징을 나타내도록 변경되어진 폴리펩티드이다. 예는 융합 단백질을 포함한다. 유도체 폴리펩티드는 또한 본원에서 "폴리펩티드 유사체"로서 지칭될 수도 있다. 본원에서 이용되는 바와 같이 "유도체"는 작용적 측쇄 기의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 아미노산을 가진 대상 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 또한 "유도체"로서 20개의 표준 아미노산의 하나 이상의 표준 또는 합성 아미노산 유도체를 함유하는 펩티드가 포함된다. 예를 들어, 4-히드록시프롤린은 프롤린으로 치환될 수 있고; 5-히드록시리신은 리신으로 치환될 수 있고; 3-메틸히스티딘은 히스티딘으로 치환될 수 있고; 호모세린은 세린으로 치환될 수 있고; 오르니틴은 리신으로 치환될 수 있다.
본원에서 이용된 바, 용어 "결합 분자"는 가장 넓은 의미로 또 다른 표적 분자, 모이어티 또는 항원에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 결합 분자는 항원성 결정인자, 예컨대 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 것 및 나아가 수용체에 결합할 수 있는 분자, 예컨대 수용체 리간드(예를 들어, 가스트린-방출 펩티드(GRP) 및 가스트린-방출 펩티드 수용체(GRPR))를 포함한다. 따라서, 결합 분자의 대표예는 펩티드, 재조합체, 자연 또는 조작된 수용체/리간드 단백질, 압타머, 테트라머(T 세포 수용체 검출에 사용된 펩티드를 가진 폴딩된 MHC 단백질), 비항체 단백질 또는 항체 모방체, 예를 들어 아필린, 아피머, 아피틴, 알파바디, 아비머, 파이노머(fynomer), Kunitz 도메인 펩티드, 나노CLAMP, 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin: Designed Ankyrin Repeat Protein), 모노바디, 나노바디, 안티칼린, 아피바디 및 SOMA머를 포함한다(추가 예는 GBC(Global Bioanalysis Consortium) 및 유럽 의약품청(European Medicines Agency)에서 분석물 특이적 또는 결합 시약, 특히 항체; 펩티드; 조작된 단백질; 항체, 단백질 및 펩티드 컨쥬게이트; 시약 약물; 압타머 및 양성 및 음성 대조군을 포함하는 항-약물 항체(ADA) 시약을 핵심 시약으로 분류하는 것에서 언급됨(King et al. 2014)).
본원에서는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 특정 결합 분자가 개시된다. 자연-발생 항체와 같은 전체-크기의 항체를 구체적으로 언급하지 않는 한, 용어 "결합 분자"는 이중특이적 항체(예, 제1 에피토프에 결합하는 제1 결합 도메인 및 제2 에피토프에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함함)뿐 아니라 이러한 항체의 항원-결합 단편, 변이체, 유사체 또는 유도체를 포함하는 전체 크기의 항체, 예를 들어 자연-발생 항체 또는 면역글로불린 분자 또는 항체 분자와 유사한 방식으로 항원에 결합하는 조작된 항체 분자 또는 단편을 포함한다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본원에서 상호교환되어 사용될 수 있다. 척추동물 시스템에서 기본 면역글로불린 구조는 비교적 잘 이해되어진다. 예를 들어 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]을 참조한다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 이에 제한되는 것은 아니나, 폴리클로날, 모노클로날, 인간, 인간화 또는 키메라 항체, 단일 사슬 항체, 에피토프-결합 단편, 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fv, 단일-사슬 Fv (scFv), 단일-사슬 항체, 디술파이드-연결 Fv(sdFv), VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편을 포함한다. ScFv 분자는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 5,892,019에 기재되어 있다. 본 개시내용에 의해 포함된 면역글로불린 또는 항체 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다.
본원에서 이용되는 바, 용어 "키메라 항체"는 면역반응성 영역 또는 부위가 제1 종으로부터 수득되거나 유래되고, 불변 영역(온전하거나, 부분적이거나 변형될 수 있음)은 제2 종으로부터 수득되는 임의의 항체를 의미하는 것으로 여겨질 것이다. 일부 구현예에서, 표적 결합 영역 또는 부위는 비인간 공급원(예, 마우스 또는 영장류)으로부터 유래되고 불변 영역은 인간으로부터 유래된다.
본원에서 이용된 바와 같은 용어 "이중특이적 항체"는 단일의 항체 분자 내에서 2개의 상이한 항원에 대한 결합 부위를 갖는 항체를 지칭한다. 표준 항체 구조에 부가적으로 다른 분자가 두 결합 특이성을 갖게 구축될 수 있음이 인정될 것이다. 이중특이적 항체에 의한 항원 결합은 동시적이거나 순차적일 수 있음이 추가로 인정될 것이다. 트리오마 및 하이브리드 하이브리도마가 이중특이적 항체를 분비할 수 있는 세포주의 두 예이다. 이중특이적 항체는 또한 재조합 수단에 의해 구축될 수 있다. (Strohlein 및 Heiss, Future Oncol. 6:1387-94 (2010); Mabry 및 Snavely, IDrugs. 13:543-9 (2010)). 이중특이적 항체는 또한 디아바디일 수 있다.
본원에서 이용된 바, 용어 "조작된 항체"는 중쇄 또는 경쇄 또는 양자 모두에서 가변 도메인이 공지된 특이성의 항체로부터 하나 이상의 CDR의 적어도 부분적 대체, 및 부분적 프레임워크 영역 대체 및 서열 변경에 의해 변경된 항체를 지칭한다. CDR이 프레임워크 영역이 유래된 항체와 동일한 클래스 또는 심지어 서브클래스의 항체로부터 유래될 수 있음에도 불구하고, CDR은 상이한 클래스의 항체, 예를 들어 상이한 종으로부터의 항체에서 유래될 것이다. 공지된 특이성의 비인간 항체로부터 하나 이상의 "공여자" CDR이 인간 중쇄 또는 경쇄 프레임워크 영역에 이식된 조작된 항체는 본원에서 "인간화 항체"로서 지칭된다. 일부 경우에서, 한 가변 도메인의 항원 결합 능력을 또 다른 가변 도메인으로 전달하기 위해 모든 CDR이 공여자 가변 영역의 완전 CDR로 대체되는 것은 아니며; 그 대신에, 표적-결합 부위의 활성을 유지하는 최소한의 아미노산이 전달된다. 예를 들어 미국 특허 제5,585,089호, 제5,693,761호, 제5,693,762호, 및 제6,180,370호에 기술된 설명을 고려해 볼 때, 이는 작용적으로 조작되거나 인간화된 항체를 수득하기 위해 일상적인 실험을 수행하거나 시행착오 테스트를 수행함으로써 당업자의 역량 내에 있을 것이다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단수의 핵산뿐 아니라 복수의 핵산들을 포함하도록 의도되며, "핵산"은 예를 들어 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유사체, 예컨대 합성 염기를 포함하는 것을 지칭한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 RNA일 수 있다. 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 통상의 포스포디에스테르 결합 또는 통상적이지 않은 결합(예, 아미드 결합, 예컨대 펩티드 핵산(PNA)에서 발견된 것)을 포함할 수 있다. "단리된"핵산 또는 폴리뉴클레오티드는, 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예컨대 메신져 RNA(mRNA) 또는 플라스미드 DNA(pDNA)와 같이 그의 천연 환경에서 제거되어진 DNA 또는 RNA와 같은 핵산 분자를 의도한다. 예를 들어, 벡터 내에 함유된 폴리펩티드 서브유닛을 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본원에서 개시된 바와 같이 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가 예는 이종 숙주 세포에서 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 RNA 분자는 폴리뉴클레오티드의 생체 내 또는 시험관 내 RNA 전사체를 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성적으로 생성된 그러한 분자들을 추가로 포함한다. 부가적으로, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 조절 요소, 예컨대 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결자일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다.
본원에서 이용된 바, "비자연 발생" 폴리뉴클레오티드 또는 이의 임의의 문법적 변형은, 당해 분야의 숙련자가 "자연 발생"으로 익히 이해하는, 또는 판사 또는 행정 또는 사법 기관에 의해 "자연 발생"으로 결정되거나 해석되는 또는 언제라도 그러할 수 있는 폴리뉴클레오티드의 형태인 것을 명시적으로 배제하나, 이것만을 제외하는 조건부 정의이다.
본원에서 이용된 바와 같이 용어 "치료하다", "치료" 또는 "~의 치료"(예를 들어, 구절 "대상을 치료하는"에서)는 질병 병리의 잠재성을 감소시키는 것, 질병 증상의 발생을 감소시키는 것, 예를 들어 대상체의 생존율을 더 길게 하거나 불편감을 감소시키는 정도로 하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 치료는 대상체에 행해질 때 질병 증상, 징후 또는 원인을 감소시키기 위한 요법의 능력을 지칭할 수 있다. 치료는 또한 적어도 하나의 임상 증상을 완화 또는 감소시키는 것 및/또는 병태의 진행을 억제 또는 지연 및/또는 질병 또는 병의 발생 예방 또는 지연을 지칭한다.
"대상" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후 또는 치료가 필요한 임의의 대상, 특히 포유동물 대상을 의미한다. 포유동물 대상은 예를 들어, 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 낙타, 곰, 등을 비롯한, 인간, 가축 동물, 농장 동물, 스포츠 동물, 및 동물원 동물을 포함한다. 포유동물 대상은 또한 야생의 동물, 예컨대 코끼리, 기린, 사슴, 캥거루, 빅캣(large cat) 등을 포함한다.
용어 "약학적 조성물"은 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태이고 그 조성물이 투여되는 대상에게 허용할 수 없을 독성이 있는 추가적인 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 조성물은 멸균일 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 시약의 "유효량"은 구체적으로 언급된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "유효량"은 명시된 목적과 관련하여 경험적으로 및 일상적인 방식으로 결정될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같은 용어 "바이오컨쥬게이트"는 생물학적 링커(즉, 핵산 링커)의 사용을 불러일으키고, (본원 어느 곳에서나 개시된 바와 같은) 컨쥬게이트 성분에 연결된 핵산을 통해 연결된 기질 분자(예를 들어, 본원 어느 곳에서나 기재된 바와 같은 결합 분자 또는 비드)를 기질 분자 및/또는 컨쥬게이트 성분의 생물학적 또는 합성 기원과 관계 없이 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "비드"는 "폴리스티렌 마이크로스피어"를 지칭하고, 이 용어는 전체적으로 상호교환 가능하게 사용된다. 특정 구현예에서, 라벨(예, PHITON)는 도펀트로 중합체 마이크로스피어를 형성함으로써 비드에 내재화될 수 있다.
본원에서 이용되는 바와 같이, "PHITON"은 Phitonex, Inc., Durham, North Carolina에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드-기반 나노입자이다.
본원에서 이용되는 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, "상보적 염기쌍 형성"은, A/T, A/U 또는 C/G 염기쌍 형성 및 합성 또는 비표준 뉴클레오티드의 상응하는 쌍형성, 예를 들어 이소시토신/이소구나닌(isoC/isoG)를 지칭한다. 티미딘(T)이 핵산에서 염기로서 특정되는 정도로, 본 개시내용의 단순화의 목적을 위해, 달리 명시되지 않는 한 핵산이 RNA인 경우 우라실(U)이 의도되어지는 것이 이해된다.
특정 맥락에서 달리 명시되지 않는 한, 용어 "~에 컨쥬게이션된" 및 "~에 연결된"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 이용되는 바와 같이, 두문자어 "SKU"는 "스톡 키핑 유닛(stock keeping unit)"이다.
본원에서 이용되는 바 "적어도 부분적으로 단일-가닥" 핵산 등은 완전히 단일-가닥일 수 있거나, 단일-가닥 부분과 이중-가닥 부분 모두를 포함할 수 있으나, 완전히 이중-가닥은 아니다. "적어도 부분적으로 이중-가닥"인, "이중-가닥 세그먼트를 포함하는" 등의 핵산은 완전 이중-가닥일 수 있거나, 단일-가닥 부분과 이중-가닥 부분 모두를 포함할 수 있으나, 완전히 단일-가닥은 아니다. 당업자는 요소(예컨대, 기질 또는 컨쥬게이트 성분)의 핵산 링커가 또 다른 요소의 핵산 링커와 하이브리드화되도록 의도되는 경우, 단일-가닥 부분 또는 각각의 링커가 하이브리드화를 허용하기에 길이 및 연속성이 충분하다는 점을 인지할 것이다.
개요.
본원에서는, 안정적이고, 화학적으로 가혹하지 않으며, 특정 구현예에서 정제를 배제하기에 충분히 효율적인 본원 어디에나 기재된 바와 같은 바이오컨쥬게이트의 제조 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 임의의 생물학적으로 양립불가능한 시약, 생리학적 조건 외부의 pH 변화, 고온 또는 높은 염 농도를 포함하지 않는다. 추가로(하기 실시예 2에 나타낸 바와 같이) 특정 구현예에서, 링커의 높은 열역학적 안정성으로 인해 용액에서 종의 교환은 없다. 상기 방법은 또한 제조를 위해 신속하고 확장가능하며(scalable) 다양한 분자를 서로 함께 연결하고 쌍을 형성하는데 사용될 수 있다.
본 개시내용의 한 가지 중요한 양태는 컨쥬게이트-항체 쌍 당 많은 고유 링커에 대한 필요성을 제거함으로써 제품 라인과 관련된 물류 간접비의 감축을 포함한다. 이는 제조 규모에 극적인 영향을 미칠 수 있고(예를 들어, 폴리뉴클레오티드를 가진 염료 당 1 SKU만 가짐으로써), 항체에 이들 염료를 신속하게 컨쥬게이션할 수 있다(상보적 폴리뉴클레오티드를 가진 항체 당 1 SKU). 예를 들어, PHITON-항체 바이오컨쥬게이트의 라이브러리를 제조할 때, 각 PHITON-항체 바이오컨쥬게이트에 대한 고유한 상보적 폴리뉴클레오티드 세트를 필요로 하기 보다는 모든 PHITON이 동일 폴리뉴클레오티드로 변형될 수 있고, 모든 항체는 동일 상보적 폴리뉴클레오티드로 변형될 수 있다.
또한 본원에서는 예를 들어 항체(또는 기타 분자)에 예를 들어 올리고뉴클레오티드-기반 형광 라벨(예를 들어, PHITON)을 컨쥬게이션하기 위한 키트가 제공된다.
특정 구현예는 컨쥬게이트 성분에 핵산 링커를 통해 연결된 기질을 포함하고, 여기서 핵산 링커는 하기에 상세히 기재되는 폴리뉴클레오티드-변형된 기질 바이오컨쥬게이트(또한 폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트로도 지칭됨)에 대한 것이다. 특정 실시형태에서, 기질은 결합 분자이다. 특정 실시형태에서, 기질은 비드(일명 폴리스티렌 마이크로스피어)이다.
"폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자"는 핵산/폴리뉴클레오티드가 부착된 결합 분자를 의미한다. 제한적이지는 않지만, 당업자는 핵산을 다른 분자, 예컨대 단백질/항체에 부착하는데, 즉 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자를 제조하는 데 사용될 수 있는 NHS-에스테르, 말레이미드 및 "클릭"과 같은 다수의 컨쥬게이션 화학에 익숙할 것이다. 따라서, "폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트"는 컨쥬게이트 성분에 연결된 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자이다.
"폴리뉴클레오티드-변형된 비드"는 핵산/폴리뉴클레오티드가 부착된 비드를 의미한다. 제한적이지는 않지만, 당업자는 예를 들어 항체-폴리뉴클레오티드 컨쥬게이션에 대해 기술된 동일한 화학을 이용하여 폴리뉴클레오티드를 추가하기 위해 비드의 표면을 작용화하는 것에 익숙할 것이다. 따라서, "폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트"는 컨쥬게이트 성분에 연결된 폴리뉴클레오티드-변형된 비드이다. 특정 구현예에서, 핵산은 단일-가닥이고, 비드에 5'-말단에서 부착된다. 특정 구현예에서, 핵산은 단일-가닥이고, 비드에 3'-말단에서 부착된다.
당업자는 핵산 분자가 단일-가닥, 이중-가닥일 수 있거나, 단일-가닥 세그먼트 및 이중-가닥 세그먼트 모두를 포함할 수 있다. 추가로, 핵산 분자는 또한 삼중-가닥인 덜 조직화된 형태를 포함할 수도 있다. 특정 구현예에서, 핵산 링커는 단일-가닥 세그먼트를 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구현예에서, 핵산 링커는 이중-가닥 세그먼트를 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구현예에서, 핵산 링커는 단일-가닥 세그먼트 및 이중-가닥 세그먼트 모두를 가진다. 특정 구현예에서, 링커는 RNA 파괴, RNA 시퀀싱, 또는 "바코딩"에 사용되기 위해 당업자에게 공지된 핵산 서열을 포함하지 않는다("바코드" 서열은 예를 들어 특정 유전자 또는 유전자들 유래 짧은 DNA 섹션을 이용하는 종 식별을 위하는, 당업자에게 공지된 용도를 위한 고유의 폴리뉴클레오티드 서열임).
기질로부터의 핵산 링커 가닥 및 컨쥬게이트 성분으로부터의 핵산 링커 가닥의 상보적 염기/세그먼트는 어닐링되어 기질을 컨쥬게이트 성분에 연결할 수 있지만, 특정 실시예에서 기질의 핵산 링커 가닥은 컨쥬게이트 성분에 부착 및/또는 공유 결합되지 않는다. 특정 구현예에서, 컨쥬게이트 성분의 핵산 링커 가닥은 기질에 부착 및/또는 공유 결합되지 않는다. 특정 구현예에서, 기질의 핵산 링커 가닥은 컨쥬게이트 성분에 부착 및/또는 공유 결합되지 않고 컨쥬게이트 성분의 핵산 링커 가닥은 기질에 부착 및/또는 공유 결합되지 않는다. 따라서, 특정 구현예에서, 기질 및 컨쥬게이트 성분은 서로 임의의 연결을 통해 공유 결합되지 않고 그 대신에 핵산 링커의 어닐링된 부분에 의해 함께 붙들어진다. 특정 구현예에서, 핵산은 기질에 5'-말단에서 부착된다. 특정 구현예에서, 핵산은 컨쥬게이트 성분에 5'-말단에서 부착되거나 5'-말단의 연장부이다. 특정 구현예에서, 핵산은 기질에 3'-말단에서 부착된다. 특정 구현예에서, 핵산은 컨쥬게이트 성분에 3'-말단에서 부착되거나 3'-말단의 연장부이다.
핵산 링커는 임의의 길이일 수 있지만 특정한 고려사항들이 고려될 수 있다. 예를 들어, 극도로 짧은 링커는 항체 또는 비드와 컨쥬게이트 성분을 너무 가까이 접촉되게 하여, 입체 장애 또는 다른 간섭을 일으킬 수 있다. 반면에, 매우 긴 링커는 생성하기가 보다 어려울 수 있거나, 염료 또는 라벨의 충분한 거리 내에 항체 또는 비드를 유지하지 못해 염료 또는 라벨의 신호가 부착된 항체 또는 비드에 정확하게 기인하지 못한다. 특정 구현예에서, 핵산 링커는 길이가 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 65, 70, 또는 75개의 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 핵산 링커는 길이가 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 또는 60개의 뉴클레오티드 중 임의의 것 내지 길이가 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 또는 75개의 뉴클레오티드 중 임의의 것이고; 특정 구현예에서, 핵산 링커는 길이가 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50개의 뉴클레오티드 중 임의의 것 내지 길이가 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 또는 75개의 뉴클레오티드 중 임의의 것이다. 특정 구현예에서, 핵산 링커는 길이가 약 15, 20, 25, 30, 또는 35개의 뉴클레오티드 중 임의의 것 내지 약 20, 25, 30, 35, 또는 40개의 뉴클레오티드 중 임의의 것이다. 특정 구현예에서, 컨쥬게이트 성분은 핵산을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구현예에서, 핵산 링커는 컨쥬게이트 성분의 핵산 분자의 연장부일 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, 컨쥬게이트 성분 자체가 하나 이상의 핵산 분자를 포함하거나 완전히 이로 구성되는 경우에서 조차도, 이것은 핵산 링커 서열을 포함할 때 "폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분"으로 간주된다는 것이 이해된다. 예를 들어, 컨쥬게이트 성분이 올리고뉴클레오티드-기반 형광 라벨, 예를 들어 PHITON인 경우, 링커의 길이는 컨쥬게이트 성분의 "엣지"로부터 결정되고, 여기서 엣지는 4개의 뉴클레오티드보다 더 긴 임의의 단일-가닥 세그먼트의 말단으로서 결정된다. 컨쥬게이트 성분이 핵산을 포함하는 특정 구현예에서, 컨쥬게이트 성분의 핵산은 핵산 링커를 포함하지 않는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 7500, 또는 10000개의 뉴클레오티드 또는 그 사이의 임의의 범위의 길이를 가진다. 컨쥬게이트 성분이 핵산을 포함하는 특정 구현예에서, 컨쥬게이트 성분의 핵산은 핵산 링커를 포함하지 않는, 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 175, 200, 300, 또는 400개의 뉴클레오티드, 또는 그 사이의 임의의 범위의 길이를 가진다. 컨쥬게이트 성분이 핵산을 포함하는 특정 구현예에서, 컨쥬게이트 성분의 핵산은 핵산 링커를 포함하지 않는, 적어도 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 또는 120개의 뉴클레오티드, 또는 그 사이의 임의의 범위의 길이를 가진다. 컨쥬게이트 성분이 핵산을 포함하는 특정 구현예에서, 컨쥬게이트 성분의 핵산은 3차 및/또는 4차 구조를 가진다. 언급된 바와 같이, 핵산 링커는 단일-가닥 세그먼트 및 이중-가닥 세그먼트 모두를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 길이가 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 65, 70, 또는 75개의 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 길이가 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 또는 60개의 뉴클레오티드 중 임의의 것 내지 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 또는 75개의 뉴클레오티드 중 임의의 것이다. 당업자는 이중-가닥 핵산이 일반적으로 상보적 염기쌍의 어닐링된 서열로 구성된다고 생각되어지는 반면, 이중-가닥 핵산 세그먼트에서 모든 쌍이 상보적일 필요는 없다는 것을 인식할 것이다. 상보적 염기를 포함하는 핵산의 두 가닥이 어닐링되어 일부 비상보적 염기쌍이 혼입된 이중-가닥 핵산을 형성하는 데 약간의 내성이 있다. 또한, 수많은 염기들과 쌍을 이룰 수 있는 축퇴성(보편적) 염기, 예컨대 데옥시이노신이 존재한다. 특정 구현예에서, 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 완전히 상보적인 염기쌍을 포함하지 않더라도 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 또는 75개의 상보적 염기쌍을 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 완전히 상보적인 염기쌍을 포함하지 않더라도 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 또는 60개의 상보적 염기쌍 중 임의의 것 내지 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 또는 75개의 상보적 염기쌍 중 임의의 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트의 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 98%는 상보적 염기 쌍이다. 특정 구현예에서, 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개 이하의 불일치된 염기쌍을 가진다. 그러나, 특정 구현예에서, 이중-가닥 세그먼트의 100%가 상보적 염기쌍이다. 특정 구현예에서, 이중-가닥 세그먼트는 적어도 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 또는 75개의 연속적인 상보적 염기쌍, 또는 약 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 또는 60개의 연속적인 상보적 염기쌍 중 임의의 것 내지 약 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 또는 75개의 연속적인 상보적 염기쌍 중 임의의 것을 포함한다.
임의의 특정 상보적 서열로 제한되지는 않지만, 특정 구현예에서, 핵산 링커는 상보적 폴리아데노신(polyA) 및 폴리티미딘(polyT) 서열 및/또는 상보적 폴리시토신(polyC) 및 폴리구아니딘(polyG) 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산의 C:G 함량은 이중-가닥 상호작용의 핵심 열역학적 결정요인으로 공지되어 있다. 특정 구현예에서, 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 한 가닥에서는 polyA 서열을 및 다른 가닥에서는 폴리티미딘 polyT 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 한 가닥에서는 polyC 서열을 및 다른 가닥에서는 폴리티미딘 polyG 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 한 가닥에서 polyA 및 polyC 서열 및 다른 가닥에서 polyT 및 polyG 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 한 가닥에서 polyA 및 polyG 서열 및 다른 가닥에서 polyT 및 polyC 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 한 가닥에서 polyA, polyT, polyC, 및/또는 polyG 서열 및 다른 가닥에서 polyT, polyA, polyG, 및/또는 polyC 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 한 가닥에서 폴리아데노신 서열(polyA) 및 다른 가닥에서 폴리티미딘 서열(polyT)로 이루어진다. 특정 구현예에서, 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 한 가닥에서 폴리시토신 서열(polyC) 및 다른 가닥에서 폴리구아니딘 서열(polyG)로 이루어진다. 본 개시내용을 읽는 당업자는 본원에서 임의의 구현예의 임의의 핵산 링커가 상기 조성을 가질 수 있음이 고려된다는 점을 이해할 것이다.
임의의 특정 상보적 서열로 제한되지는 않지만, 특정 구현예에서, 핵산 링커는 고유의 식별 서열을 포함한다. 핵산 링커의 목적을 위해, "고유의 식별 서열"은 하나 또는 다수의 종들 사이를 구별하는데 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드 서열, 예를 들어 상보적 프라이머 서열이 다운스트림 증폭(예, PCR에 의해), 긴-판독 시퀀싱, 또는 차세대 시퀀싱(NGS)을 위해 결합할 수 있는 것, 또는 대안적으로 예를 들어 형광 인 시튜(in situ) 하이브리드화(FISH)를 통해 상보적 서열을 이용하여 프로빙될 수 있는 것이다. 특정 구현예에서, 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 고유의 식별 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 고유의 식별 서열은 PCR에 의한 것과 같은 핵산 증폭에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 고유의 식별 서열은 차세대 시퀀싱(NGS)에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산 링커는 다운스크림 시퀀싱 적용에서 이것을 필터링할 수 있게 하는 서열을 포함한다. 예를 들어, 서열은 고유의 서열, 예를 들어 상보적 프라이머리 서열이 결합할 수 있는 것의 이용을 통해 시퀀싱에서 다른 뉴클레오티드 서열과 구별가능하여, 모든 링커-태깅된 종의 필터링을 가능하게 하여 다운스트림 분석에서 배제될 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산 링커는 제3 생체 분자에 의한 특이적 결합 및/또는 효소 절단(예, CRISPR, 징크-핑거 뉴클레아제, 제한 효소)을 통한 표적화된 유전자 편집을 위한 서열을 포함한다. 예를 들어, 여기서 상기 서열은 CRISPR gRNA를 통한 표적화 및 상기 표적화를 가능하게 하도록 설계되고, CRISPR에 의해 절단된 것이거나, 또는 예를 들어, 여기서, 징크-핑거 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인에 대한 표적 부위, 또는 대안적으로, 제한 효소, 예를 들어 DNA 서열 GAATTC를 절단하는 EcoRI 엔도뉴클레아제에 의한 절단을 위해 특이적으로 표적화된 서열이다. 특정 구현예에서, 핵산 링커는 효소 또는 결합 활성을 가능하게 하는 하나 이상의 고유의 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 효소 또는 결합 활성을 가능하게 하는 고유의 서열은 이중-가닥 세그먼트에 존재한다.
특정 구현예에서, 핵산 링커는 기질 또는 컨쥬게이트 성분에 부착되지 않은 하나 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가적인 핵산 분자는 "다리"로 작용하여, 기질에 부착된 핵산 링커 및 컨쥬게이트 성분의 연장부 또는 컨쥬게이트 성분에 부착된 핵산 링커를 화합하게 할 수 있다. 특정 구현예에서, 추가적인 핵산은 컨쥬게이트 성분 또는 기질에 대한 제2 부착점일 수 있다. 추가적인 핵산 분자는 또한 추가적인 기질 또는 추가 컨쥬게이트 성분과 같은 추가적인 성분에 부착하여, 제1 기질 및 제1 컨쥬게이트 성분을 제2 기질 또는 추가 기질 및/또는 제2 컨쥬게이트 성분 또는 추가 컨쥬게이트 성분과 함께 연결시킬 수 있다(도 17). 특정 구현예에서, 핵산 링커는 (i) 기질에 부착된 부분, (ii) 컨쥬게이트 성분의 연장부 또는 이에 부착된 부분, 및 (iii) (i) 또는 (ii)이 아닌 적어도 하나의 추가적인 부분을 포함한다. 특정 구현예에서, (iii)은 컨쥬게이트 성분의 연장부 또는 이에 부착된, 또는 추가적인 컨쥬게이트 성분의 연장부 또는 이에 부착된 제2 부분이다. 특정 구현예에서, (iii)은 기질 또는 추가적인 기질에 부착된 제2 부분이다.
본 개시내용에 사용된 바와 같은 용어 "컨쥬게이트 성분"은 특정 문맥에서 달리 명시되지 않는 한 바이오컨쥬게이트를 형성하도록 본원에 개시된 바와 같은 핵산 링커를 통해 기질(예, 결합 분자 또는 비드)에 연결된 임의의 성분을 지칭한다. 컨쥬게이트 성분의 대표예는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체, 핵산, 압타머, 단백질, 염료 또는 라벨, 소분자, 치료적 펩티드, 수용체 리간드, 약학적 활성제, 또는 올리고뉴클레오티드-기반 형광 라벨을 포함한다. 특정 구현예에서, 예를 들어 컨쥬게이트 성분은 또 다른 항체에 연결된 항체인 경우, 어느 항체가 컨쥬게이트 성분인지를 구별하는 것이 둘이 핵산 링커에 의해 연결되는 경우를 제한하는 것은 아니다. 특정 구현예에서, 컨쥬게이트 성분은 올리고뉴클레오티드-기반 형광 라벨이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 컨쥬게이트 성분은 본원 다른 곳에서 정의된 바와 같은 PHITON이다. 특정 구현예에서와 같이, 컨쥬게이트 성분은 핵산을 포함하거나, 핵산이고, 링커는 핵산이고, 특정 구현예에서, 링커는, 예를 들어 핵산 링커가 항체 또는 비드에 부착되는 것과 같이 컨쥬게이트 성분에 "부착"되기 보다는 컨쥬게이트 성분의 핵산 가닥의 연장부이다.
특정 구현예에서, 결합 분자 또는 비드의 라벨링-의-정도(DoL: degree-of-labeling)(또한, 당업계에서 염료 대 단백질(D:P) 또는 형광단 대 단백질(F:P)로 지칭됨)는 화학양론적으로 제어된다. 이는 예를 들어 부착될 핵산의 이용가능성을 통해 달성될 수 있다. 특정 구현예에서, 결합 분자의 DoL은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 중 임의의 것과 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11 중 임의의 것 사이이다. 특정 구현예에서, 결합 분자 또는 비드의 DoL은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20이다. 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 상 핵산의 DoL은 컨쥬게이트 성분의 DoL과 무관할 수 있고, 특정 구현예에서는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11, 또는 끝점들을 포함해 그 사이의 임의의 범위이다. 특정 구현예에서, 비드의 DoL은 약 100, 1,000, 10,000, 또는 100,000 중 임의의 것 내지 약 1,000, 10,000, 100,000, 또는 1,000,000 중 임의의 것이다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 상 핵산의 라벨링-의-정도(DoL)는 컨쥬게이트 성분의 DoL과 무관하다.
본 개시내용의 폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트는 수많은 적용에서 사용을 위해 고려된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 바이오컨쥬게이트는 유세포분석, 항체 스크리닝, ELISA 또는 기타 샌드위치 어세이, 면역 모니터링, 바이오마커 어세이, 측방 유동(lateral flow), 현장진료(point-of-care)/신속 진단, 이미징, 현미경, 분자 진단, 차세대 시퀀싱, 긴 판독 시퀀싱, 인 시튜 시퀀싱, 폴리머라아제 연쇄 반응, 마이크로어레이, 핵산 시퀀싱, 아미노산 시퀀싱, 디지털 병리학, 써던 블롯팅, 노던 블롯팅, 웨스턴 블롯팅, 대조군과 같은 기준 샘플로서, 또는 기기, 어세이, 또는 시스템의 보정을 위해, 또는 예방 및/또는 치료 목적 중 하나 이상을 위해, 세포, 조직 및/또는 기관을 특이적으로 라벨링하는데 사용될 수 있다.
본원에서는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트 및 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트와 같은 폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트의 제조 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 방법은 적어도 부분적으로 또는 완전히 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된 기질을 적어도 부분적으로 또는 완전히 단일-가닥 핵산 링커를 가진 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉시키는 단계를 포함한다(도 18, 상단). 특정 실시형태에서, 기질은 결합 분자이다. 특정 실시형태에서, 기질은 비드이다. 특정 구현예에서, 이중-가닥 핵산 링커를 형성하기 위해, 기질의 단일-가닥 링커 서열의 적어도 일부는 컨쥬게이트 성분의 단일-가닥 링커 서열의 일부와 상보적이다. 접촉시, 기질의 핵산 링커 및 컨쥬게이트 성분의 핵산 링커는 어닐링되어 기질을 컨쥬게이트 성분에 연결하는 적어도 부분적으로 이중-가닥 링커를 형성할 수 있다. 많은 가능한 기질, 예컨대 결합 분자(예, 항체) 또는 비드는 핵산 링커가 화학적으로 부착되어야 할 것을 요구할 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드-변형된 기질 및 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분을 접촉시키기 이전에, 방법은 핵산 링커를 기질에 부착하여 폴리뉴클레오티드-변형된 기질을 형성하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드-변형된 기질 및 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분을 접촉시키기 이전에, 방법은 핵산 링커를 컨쥬게이트 성분에 부착하여 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분을 형성하는 단계를 포함한다.
폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트를 제조하는 특정 구현예에서, 방법은 기질을 컨쥬게이트와 접촉시키고(여기서 기질은 결합 분자 또는 비드임), 핵산 링커를 기질에 부착하고, 동일 핵산 링커를 컨쥬게이트 성분에 부착하여 폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트를 형성하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 링커는 단일-가닥이거나, 이중-가닥 세그먼트를 포함하거나, 핵산 링커는 완전히 이중 가닥이다. 특정 구현예에서, 핵산 링커는 이중 가닥 세그먼트를 포함하거나 핵산 링커는 완전히 이중 가닥이고 방법은 기질에 및 컨쥬게이트 성분에 부착하기 전에 핵산 가닥들을 하이브리드화하여 적어도 부분적으로 이중 가닥 핵산 링커를 형성하는 단계를 포함한다.
폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트를 제조하는 특정 구현예에서, 방법은 핵산 링커를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분을 기질과 접촉시키고(여기서, 기질은 결합 분자 또는 비드임), 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분의 핵산 링커를 기질에 부착하여 폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트를 형성하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 링커는 단일-가닥이거나, 이중-가닥 세그먼트를 포함하거나, 핵산 링커는 완전히 이중 가닥이다. 특정 구현예에서, 핵산 링커는 단일 가닥이다(도 18, 하단). 특정 구현예에서, 핵산 링커는 이중 가닥 세그먼트를 포함하거나 핵산 링커는 완전히 이중 가닥이고, 방법은 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트의 핵산 링커를 기질에 부착하여 폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트를 형성하기 이전에, 핵산 가닥들을 하이브리드화하여 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분 상 적어도 부분적으로 이중-가닥 핵산 링커를 형성하는 단계를 포함한다(도 18, 가운데).
폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트를 제조하는 특정 구현예에서, 방법은 핵산 링커를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된 기질을 컨쥬게이트 성분과 접촉시키고(여기서, 기질은 결합 분자 또는 비드임), 폴리뉴클레오티드-변형된 기질의 핵산 링커를 컨쥬게이트 성분에 부착하여 폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트를 형성하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 링커는 단일-가닥이거나, 이중-가닥 세그먼트를 포함하거나, 핵산 링커는 완전히 이중 가닥이다. 특정 구현예에서, 핵산 링커는 단일 가닥이다. 특정 구현예에서, 핵산 링커는 이중 가닥 세그먼트를 포함하거나 핵산 링커는 완전히 이중 가닥이고, 방법은 폴리뉴클레오티드-변형된 기질의 핵산 링커를 컨쥬게이트 성분에 부착하여 폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트를 형성하기 이전에, 핵산 가닥들을 하이브리드화하여 폴리뉴클레오티드-변형된 기질 상 적어도 부분적으로 이중-가닥 핵산 링커를 형성하는 단계를 포함한다.
폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트의 제조를 위한 특정 구현예에서, 방법은 (i) 적어도 부분적으로 또는 완전히 단일 가닥 핵산 링커를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된 기질(여기서, 기질은 결합 분자 또는 비드임), (ii) 적어도 부분적으로 또는 완전히 단일 가닥 핵산 링커를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분, 및 (iii) (i) 또는 (ii)의 핵산 링커가 아닌 추가의 적어도 부분적으로 단일 가닥 핵산 링커 세그먼트를 접촉시키는 단계를 포함한다. 기질의 단일 가닥 링커 서열의 적어도 일부는 추가의 핵산 링커 세그먼트의 단일 가닥 부분 (iii)과 상보적이고/이거나, 컨쥬게이트 성분의 단일 가닥 링커 서열의 적어도 일부는 추가의 핵산 링커 세그먼트의 단일 가닥 부분 (iii)과 상보적이고, 따라서 접촉시, 기질의 핵산 링커, 컨쥬게이트의 핵산 링커 및 추가의 핵산 링커 세그먼트는 어닐링되어, 기질을 컨쥬게이트 성분에 연결하는 적어도 부분적으로 이중 가닥 링커를 형성한다. 특정 구현예에서, (i), (ii) 및 (iii)을 접촉하기 전에, 방법은 적어도 부분적으로 또는 완전히 단일 가닥 핵산 링커를 기질에 부착하여 폴리뉴클레오티드-변형된 기질을 형성하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, (i), (ii) 및 (iii)을 접촉하기 전에, 방법은 적어도 부분적으로 또는 완전히 단일 가닥 핵산 링커를 컨쥬게이트 성분에 부착하여 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분을 형성하는 단계를 포함한다.
상기 중 임의의 것에 있어서, 폴리뉴클레오티드를 단백질 또는 항체와 같은 분자에 부착하는 방법이 공지되어 있으며, 여기에는 NHS-에스테르, 말레이미드 및 "클릭"과 같은 컨쥬게이션 화학을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 폴리뉴클레오티드를 비드에 부착하는 방법은 공지되어 있으며, 예를 들어 단백질-폴리뉴클레오티드 컨쥬게이션에 대해 기재된 동일 화학을 이용하여 폴리뉴클레오티드를 추가하기 위해 비드의 표면을 작용화하는 것을 포함한다. 본원 다른 곳에서 기재된 바와 같이, 결합 분자 또는 비드의 DoL은 화학양론적으로 제어되어 부착된 폴리뉴클레오티드의 수를 제어할 수 있다. 본원 다른 곳에서 상세히 또한 기재된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드-변형된 기질의 핵산 링커 서열은 polyA, polyT, polyC, 및/또는 polyG 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있으며, 변형된 컨쥬게이트 성분의 핵산 링커 서열은 polyA, polyT, polyC, 및/또는 polyG 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 또한 본원 다른 곳에서 기재된 바와 같이, 핵산 링커는 고유의 식별 서열을 포함할 수 있다.
또한 본원에서는 검출을 위한 라벨링된 기질을 제조하는 방법이 제공된다. 예시적 목적을 위해, 기질은 하기에서 결합 분자로 지칭되나, 결합 분자로 제한되는 것은 아니다. 특정 구현예에서, 방법은 고속(high-rate) 방법이다. 특정 구현예에서, 동일 결합 분자의 별개의 결합-분자 분자들은 상이한 컨쥬게이트 성분들로 라벨링된다. 이러한 방법 (및 하기의 방법)의 설명의 목적을 위해, "결합 분자"란 한 유형의 결합 분자, 예를 들어 항-CD4 항체 또는 항-베타 아밀로이드 항체를 지칭하고, "결합-분자 분자"는 해당 유형의 결합 분자의 개개의 분자들이다. 예를 들어, 도 4에서, "Ab1", "Ab2", 및 "Abn"는 상이한 유형의 결합 분자들이고, "Ab1-N1", "Ab1-N2", 및 "Ab1-Nm"는 (상이한 라벨 "N1", "N2", 및 "Nm"를 가진) Ab1 결합 분자의 상이한 결합-분자 분자들이다. 마찬가지로, "Ab2-N1", "Ab2-N2", 및 "Ab2-Nm"는 상이한 라벨을 가진 Ab2 결합 분자의 상이한 결합-분자 분자들이다. 특정 구현예에서, 방법은 (a) 적어도 부분적으로 또는 완전히 단일-가닥 핵산 링커를, 동일 결합 분자의 적어도 2개의 별개의 결합-분자 분자에 부착시켜, 복수개의 폴리뉴클레오티드-변형된 결합-분자 분자를 제조하는 단계; 및 이어서 (b) 복수개의 적어도 한 폴리뉴클레오티드-변형된 결합-분자 분자를, 적어도 부분적으로 또는 완전히 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 제1의 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉하고, 복수개의 적어도 한 상이한 폴리뉴클레오티드-변형된 결합-분자 분자를, 적어도 부분적으로 또는 완전히 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 제2의 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉하는 단계로서, 제1 및 제2의 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분은 검출 라벨을 포함하고, 적어도 이들의 검출 라벨은 상이한 단계를 포함한다. 당업자는 당사자의 수행 단계 (a)가 당사자의 수행 단계 (b)와 분리될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 특정 구현예에서, 방법은 복수개의 적어도 한 폴리뉴클레오티드-변형된 결합-분자 분자를 적어도 부분적으로 또는 완전히 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 제1의 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉하고, 복수개의 적어도 한 상이한 폴리뉴클레오티드-변형된 결합-분자 분자를 적어도 부분적으로 또는 완전히 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 제2의 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉하는 단계로서, 여기서 제1 및 제2의 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분은 검출 라벨을 포함하고, 적어도 이들의 검출 라벨은 상이한 단계를 포함하는데, 여기서 복수개의 폴리뉴클레오티드-변형된 결합-분자 분자는 이미 제조되어져 있다. 본 개시내용의 양태와 일관되게, 결합-분자 분자의 단일-가닥 핵산 링커 서열의 적어도 일부는 제1 및/또는 제2 컨쥬게이트 성분의 단일-가닥 핵산 링커 서열의 일부와 상보적이고, 접촉시, 결합-분자 분자의 단일-가닥 핵산 링커 서열 및 컨쥬게이트 성분의 단일-가닥 핵산 링커 서열은 어닐링하여 결합-분자 분자를 컨쥬게이트 성분에 연결하는 이중-가닥 링커를 형성한다. 특정 구현예에서, 복수개의 하나 이상의 추가적인 폴리뉴클레오티드-변형된 결합-분자 분자가 상이한 검출 라벨을 가진 하나 이상의 추가적인 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉된다(예, 도 4에서, "Ab1-N1", "Ab1-N2", 및 "Ab1-Nm"). 특정 구현예에서, 복수개의 폴리뉴클레오티드-변형된 결합-분자 분자 중 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10종이 각각 다른 것들과 상이한 검출 라벨을 가진 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉된다. 특정 구현예에서, 결합 분자는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체이다.
당업자는 기질 및 컨쥬게이트 성분이 이들의 각 링커들의 하이브리드화를 통해 "간접적으로" 연결되는 상기 예시적인 고속 방법에 덧붙여서, 동일 결합 분자의 별개의 결합-분자 분자들을 상이한 컨쥬게이트 성분들로 라벨링되도록 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트를 생성하는 임의의 다양한 다른 방법을 통합함으로써 유사한 고속 라벨링이 달성될 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 동일 결합 분자의 별개의 결합-분자 분자가 상이한 컨쥬게이트 성분들로 라벨링되는, 검출을 위한 라벨링된 결합 분자의 고속 제조 방법은 하기를 포함한다: (a) 복수개의 동일 결합 분자의 결합-분자 분자를 수득하는 단계; 및 (b) 제1 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분의 핵산 링커를 복수개의 적어도 한 결합-분자 분자에 부착시키고, 제2 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분의 핵산 링커를 복수개의 적어도 하나의 상이한 결합-분자 분자에 결합시키는 단계로서, 여기서 동일 결합 분자의 별개의 결합-분자 분자들이 상이한 컨쥬게이트 성분들로 라벨링되도록, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분들은 검출 라벨을 포함하고, 이들의 검출 라벨이 적어도 상이한 단계. 핵산 링커는 단일-가닥일 수 있거나, 이중-가닥 세그먼트를 포함하거나, 완전히 이중 가닥이다. 특정 구현예에서, 핵산 링커는 이중 가닥 세그먼트를 포함하거나 핵산 링커는 완전히 이중 가닥이고, 방법은 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분의 핵산 링커를 결합-분자 분자에 부착하여 폴리뉴클레오티드-변형된 결합-분자 바이오컨쥬게이트를 형성하기 이전에, 핵산 가닥들을 하이브리드화하여 적어도 부분적으로 이중-가닥 핵산 링커를 하이브리드화하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 복수개의 하나 이상의 추가적인 결합-분자 분자는 상이한 검출 라벨을 가진 하나 이상의 추가적인 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분에 부착된다. 특정 구현예에서, 복수개의 결합-분자 분자들 중 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10종이 각각 다른 것과 상이한 검출 라벨을 가진 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉된다. 그리고, 특정 구현예에서, 결합 분자는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체이다.
별개의 라벨링을 달성하기 위해, 특정 구현예는 각 구획 내 고유하게 라벨링된 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉시키기 위해, 개별 구획 내로 복수개의 결합-분자 분자 또는 폴리뉴클레오티드-변형된 결합-분자 분자를 분배, 분취 등을 하여, 동일 결합 분자의 상이하게-라벨링된 결합-분자 분자를 제조하는 것을 포함한다. 당업자는 시약을 별도의 튜브에 피펫팅하는 것과 같이 수동으로, 또는 고속으로 다수의 보틀, 또는 조직-배양 유형 플레이트의 별개의 웰, 또는 기타 용기에 시약을 분취할 수 있는 자동화 유체 처리기와 같은 시스템에 의해 분배/분취가 수행될 수 있음을 이해할 것이다.
이러한 방법의 한 가지 유의미한 장점은 이것이 다중 링커 분자의 설계, 생산, 조직화, 저장 등에 대한 요구사항을 감소시킬 수 있다는 것이다. 특정 구현예에서, 복수개의 결합-분자 분자의 적어도 부분적으로 또는 완전히 단일-가닥 핵산 링커는 폴리뉴클레오티드-변형된 결합-분자 분자 모두에 대해서 동일하고, 따라서 컨쥬게이트 성분의 적어도 부분적으로 또는 완전히 단일-가닥 핵산 링커가 또한 모든 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트-성분에 대해서 동일할 수 있다.
유사하게, 본원에서는 검출을 위한 라벨링된 결합 분자의 제조 방법이 제공되지만, 여기서 상이한 결합 분자는 동일한 컨쥬게이트 성분(그러나 동일한 컨쥬게이트-성분 분자는 아님)으로 라벨링된다. 이것은 도 4에서 예시되고, 예를 들어 "Ab1-N1", "Ab2-N1", 및 "Abn-N1"은 동일 라벨("N1")로 라벨링된 상이한 결합 분자("Ab1", "Ab2", 및 "Abn")이다. 특정 구현예에서, 방법은 고속 방법이다. 특정 구현예에서, 방법은 하기를 포함한다: (a) 적어도 2개의 상이한 결합 분자에 적어도 부분적으로 또는 완전히 단일-가닥 핵산 링커를 부착해 적어도 2개의 상이한 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자를 제조하는 단계 및 (b) 적어도 2개의 상이한 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자를, 검출 라벨을 포함하고 적어도 부분적으로 또는 완전히 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉시키는 단계. 상기에서 주목되는 바와 같이, 당업자는 해당 수행 단계 (a)가 해당 수행 단계 (b)와 분리될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 특정 구현예에서, 방법은 적어도 2개의 상이한 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자를, 검출 라벨을 포함하고 적어도 부분적으로 또는 완전히 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 개시내용의 양태와 일관되게, 결합 분자의 단일-가닥 핵산 링커 서열의 적어도 일부는 컨쥬게이트 성분의 단일-가닥 핵산 링커 서열의 일부와 상보적이고, 접촉시, 링커들은 어닐링하여 결합 분자를 컨쥬게이트 성분에 연결하는 이중-가닥 링커를 형성한다. 특정 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상의 추가적인 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자는 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉된다. 특정 구현예에서, 결합 분자 중 하나 이상은 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체이다.
당업자는 기질 및 컨쥬게이트 성분이 이들의 각 링커들의 하이브리드화를 통해 "간접적으로" 연결되는 상기 예시적인 고속 방법에 덧붙여서, 상이한 결합 분자들이 동일 컨쥬게이트 성분으로 라벨링되도록 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트를 제조하는 임의의 다양한 다른 방법을 통합함으로써 유사한 고속 라벨링이 달성될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 상이한 결합 분자들이 동일 컨쥬게이트 성분으로 라벨링되는 검출을 위한 라벨링된 결합 분자의 고속 제조 방법은 (a) 적어도 2개의 상이한 결합 분자를 수득하는 단계 및 (b) 상이한 결합 분자들이 동일 컨쥬게이트 성분으로 라벨링되도록 검출 라벨을 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분의 핵산 링커에 적어도 2개의 상이한 결합 분자를 부착시키는 단계를 포함한다. 핵산 링커는 단일-가닥일 수 있거나, 이중-가닥 세그먼트를 포함하거나, 완전히 이중 가닥이다. 특정 구현예에서, 핵산 링커는 이중 가닥 세그먼트를 포함하거나 핵산 링커는 완전히 이중 가닥이고, 방법은 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분의 핵산 링커를 결합-분자에 부착하여 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트를 형성하기 이전에, 핵산 가닥들을 하이브리드화하여 적어도 부분적으로 이중-가닥 핵산 링커를 하이브리드화하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상의 추가적인 결합 분자는 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분에 부착된다. 그리고, 특정 구현예에서, 결합 분자 중 하나 이상은 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체이다.
특정 구현예는 각 구획 내 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉하기 위해 상이한 결합 분자 또는 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자를 각 유형의 결합 분자를 위한 개별 구획으로 (본원 다른 곳에서 기재된 것처럼) 분포, 분취 등을 행하여, 동일 컨쥬게이트 성분 라벨로 라벨링된 상이한 결합 분자들을 제조하는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 상이한 결합 분자들의 적어도 부분적으로 또는 완전히 단일-가닥 핵산 링커는 모든 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자에 대해 동일하고, 적어도 부분적으로 또는 완전히 단일-가닥 핵산 서열은 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분의 핵산 링커로서 이용될 수 있다.
추가로, 상기 기재된 방법들은 수많은 상이한 조합으로 검출을 위한 라벨링된 결합 분자 또는 결합 분자들을 제조하는 방법에서 조합될 수 있다. 특정 구현예에서, 상이한 조합을 생성하는 방법은 하나 또는 단지 몇 가지의 핵산 링커 서열을 이용한다. 특정 구현예에서, 방법은 고속 방법이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 상이한 컨쥬게이트 성분 라벨은 생성을 위한 고속 방법으로, 결합 분자 (또는 기타 본원에서 개시된 기질) 상으로 "프린트"될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트의 제조 방법은 본원 다른 곳에서 기재된 바와 같이 단일-가닥 성분 링커의 상보적 부분이 어닐링하여 성분을 바이오컨쥬게이트에 연결하는 적어도 부분적으로 이중-가닥 링커를 형성하도록 성분들을 함께 접촉하는 것을 수반한다. 성분들은 각 조성물에서 서로 접촉될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시예에서, 조성물은 용액일 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 (a) 적어도 부분적으로 또는 완전히 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 기질 및 (b) 적어도 부분적으로 또는 완전히 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 컨쥬게이트 성분을 포함한다. 특정 실시형태에서, 기질은 결합 분자 또는 비드이다. 이전에 언급된 바와 같이, 특정 구현예에서, 기질의 단일-가닥 핵산 링커 서열의 적어도 충분한 서열 부분이 컨쥬게이트 성분의 단일-가닥 핵산 링커 서열의 부분과 상보적이어서 핵산 링커들이 어닐링하고 기질을 컨쥬게이트 성분에 연결하는 이중-가닥 핵산 링커를 형성시키게 한다. 특정 구현예에서, 조성물은 (a) 핵산 링커를 포함하는, 결합 분자 또는 비드인 기질 및 (b) 기질을 컨쥬게이트 성분에 연결하도록 핵산 링커를 부착할 수 있는 컨쥬게이트 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 링커는 단일-가닥이거나, 이중-가닥 세그먼트를 포함하거나, 핵산 링커는 완전히 이중 가닥이다. 특정 구현예에서, 조성물은 (a) 핵산 링커를 포함하는 컨쥬게이트 성분 및 (b) 컨쥬게이트 성분을 기질에 연결하도록 핵산 링커에 부착할 수 있는 기질을 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 링커는 단일-가닥이거나, 이중-가닥 세그먼트를 포함하거나, 핵산 링커는 완전히 이중 가닥이다. 특정 구현예에서, 조성물은 (a) 핵산 링커에 부착할 수 있는, 결합 분자 또는 비드인 기질 및 핵산 링커에 부착할 수 있는 컨쥬게이트 성분 및 (b) 핵산 링커를 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 링커는 단일-가닥이거나, 이중-가닥 세그먼트를 포함하거나, 핵산 링커는 완전히 이중 가닥이다. 특정 구현예에서, 조성물은 (a) 적어도 부분적으로 또는 완전히 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는, 결합 분자 또는 비드인 기질, (b) 적어도 부분적으로 또는 완전 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 컨쥬게이트 성분; 및 (c) 추가의 핵산 링커 세그먼트를 포함하며, 여기서 (v)(a), (v)(b), 및 (v)(c)는 어닐링하여 (v)(a), (v)(b), 및 (v)(c)를 포함하고, (v)(a)를 (v)(b)에 연결하는 적어도 부분적으로 이중-가닥 핵산 링커를 형성할 수 있다.
상기 중 임의의 것의 특정 구현예에서, 조성물은 본원에 다른 곳에 개시된 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트 또는 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트를 생성할 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 세포, 조직 및/또는 기관의 라벨링 방법이다. 특정 구현예에서, 세포, 조직 및/또는 기관은 정상이거나 건강하다. 특정 구현예에서, 세포, 조직 및/또는 기관은 예를 들어 비정상이거나, 질병에 걸려있거나, 손상되어 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 세포 및/또는 조직은 암 세포 또는 종양이다. 특정 구현예에서, 방법은 세포, 조직 및/또는 기관을 본원에서 개시된 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트와 접촉하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 바이오컨쥬게이트의 결합 분자 부분은 세포, 조직 및/또는 기관의 항원, 에피토프 및/또는 합텐에 결합하고, 컨쥬게이트 성분 부분은 검출가능한 라벨, 예컨대 염료를 포함한다. 특정 구현예에서, 바이오컨쥬게이트의 결합 분자 부분은 세포, 조직 및/또는 기관의 항원, 에피토프 및/또는 합텐을 특이적으로 인식하고 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 방법은 세포, 조직 및/또는 기관을 본원에서 개시된 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트와 접촉하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 바이오컨쥬게이트의 결합 분자 부분은 세포, 조직 및/또는 기관 상의 수용체 또는 상기에서 결합하고 컨쥬게이트 성분 부분은 검출가능한 라벨, 예컨대 염료를 포함한다. 특정 구현예에서, 바이오컨쥬게이트의 결합 분자 부분은 세포, 조직 및/또는 기관 상의 수용체 또는 상기에서 특이적으로 인식하고 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 라벨은 시각적 검출을 위한 라벨이다. 특정 구현예에서, 라벨은 PHITON과 같은 올리고뉴클레오티드-기반 형광 라벨이다. 이러한 라벨은 수많은 적용에 이용될 수 있다. 대표예는 라벨링된 세포가 유세포분석, 항체 스크리닝, ELISA 또는 기타 샌드위치 어세이, 면역 모니터링, 바이오마커 어세이, 측방 유동, 현장진료/신속 진단, 이미징, 현미경, 분자 진단, 차세대 시퀀싱, 긴 판독 시퀀싱, 인 시튜 시퀀싱, 폴리머라아제 연쇄 반응, 마이크로어레이, 핵산 시퀀싱, 아미노산 시퀀싱, 디지털 병리학, 써던 블롯팅, 노던 블롯팅, 웨스턴 블롯팅 또는 예방 및/또는 치료적 목적 중 하나 이상을 위해 사용될 수 있는 것을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 라벨링된 세포는 유세포분석에 이용된다. 추가로, 특정 구현예에서, 라벨은 세포막에 대한 라벨이며, 예를 들어 친유성 모이어티가 라벨에 부착되어 세포막을 염색할 수 있게 하거나, 대안적으로는 미리스토일화/팔미토일화 서열을 라벨에 혼입하거나 라벨에 부착하거나, 대안적으로는 렉틴, 예를 들어 밀 배아 응집소(WGA)에 대한 컨쥬게이션에 의해 세포막 상 글리코컨쥬게이트를 검출할 수 있다. 특정 구현예에서, 라벨은 예를 들어 이중-가닥 DNA에 대한 특이적인 프로브에 대한 컨쥬게이션에 의해(DNA 결합, 죽은 세포에서 DNA가 접근가능하므로), 또는 대안적으로 라벨을 (죽은 세포의 다수의 세포내 단백질과 반응하고 이들의 동정 또는 분석 배제를 가능하게 하는) 아민-반응성 모이어티에 부착시키는 것에 의한 세포 생존력에 대한 라벨이다. 특정 구현예에서, 라벨은 염색 및 세포내 라벨의 딸 세포로의 통과를 가능하게 하는 효소 활성화된 모이어티에 부착된다. 특정 구현예에서, 라벨은 예를 들어, (예, FISH 또는 기타 이미징 또는 형광 측정 양식을 통해) 고유의 서열 RNA 또는 DNA에 결합할 수 있게 하는 서열을 결합하거나, 대안적으로 함유하는 게놈 물질을 표적화하는 특이적 라벨이다.
또한, 라벨링된 세포, 조직 및/또는 기관으로부터 신호를 정량적으로 측정하기 위한 방법 및 시약이 제공된다. 특정 구현예에서, 방법은 세포, 조직 및/또는 기관을 본원에서 개시된 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트와 접촉하는 단계로서, 여기서 상기 바이오컨쥬게이트의 결합 분자 부분은 세포, 조직 및/또는 기관의 항원, 에피토프, 막, 게놈 물질 및/또는 합텐에 결합하고, 컨쥬게이트 성분 부분은 검출가능한 라벨을 포함하는 단계, 및 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트의 존재를 측정하는 단계로서, 여기서 DoL이 공지되어 정량적 측정이 가능한 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 방법은 세포, 조직 및/또는 기관을 본원에서 개시된 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트와 접촉하는 단계로서, 여기서 상기 바이오컨쥬게이트의 결합 분자 부분은 세포, 조직 및/또는 기관 상의 수용체 또는 상기에서 결합하고, 컨쥬게이트 성분 부분은 검출가능한 라벨을 포함하는 단계, 및 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트의 존재를 측정하는 단계로서, 여기서 DoL이 공지되어 정량적 측정이 가능한 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 라벨은 시각적 검출을 위한 라벨이다. 특정 구현예에서, 라벨은 PHITON과 같은 올리고뉴클레오티드-기반 형광 라벨이다. 특정 구현예에서, 결합 분자의 라벨링-의-정도(DoL)는 핵산의 이용가능성을 통해 화학양론적으로 제어된다. 특정 구현예에서, 결합 분자의 DoL은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10, 또는 끝점들을 포함하는 그 사이의 임의의 범위이다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 상 핵산의 라벨링-의-정도(DoL)는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11, 또는 끝점들을 포함해 그 사이의 임의의 범위이고, 컨쥬게이트 성분의 DoL과 무관하다. 그리고 특정 구현예에서, 공지된 DoL을 이용하는 것과 같이 폴리뉴클레오티드-변형된 비드를 포함하는 제어는 정량화를 돕기 위해 이용될 수 있다.
또한, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트를 제조하고/하거나 이용하는 키트가 본원에서 제공된다. 특정 구현예에서, 키트는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트를 제조하는데 필수적인 하나 이상의 성분들을 포함한다. 특정 구현예에서, 키트는 본 개시내용의 조성물을 제조하는데 필수적인 하나 이상의 성분들을 포함한다. 특정 구현예에서, 키트는 본 개시내용의 고속 방법에서 기질을 라벨하고/하거나 세포, 조직 및/또는 기관을 라벨하고/하거나 본원에서 제공된 바와 같은 정량적 분석을 수행하는데 필수적인 하나 이상의 성분을 포함한다. 예를 들어, 특징 구현예에서, 키트는 결합 분자 (예, 항체 및 유도체) 또는 비드, 컨쥬게이트 성분, 단일-가닥, 부분 단일-가닥/부분 이중-가닥 또는 완전히 이중-가닥 핵산 링커, 폴리뉴클레오티드-변형된 기질, 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분 및/또는 폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트 중 하나 이상을 포함한다. 특정 구현예에서, 키트는 프린트된 및/또는 전자 저장 매체 상에 본원에 개시된 임의의 방법을 수행하기 위한 지침서, 버퍼 및/또는 추가 시약 및/또는 포장 재료를 추가로 포함한다.
비드.
당업자는 많은 유형의 폴리스티렌 마이크로스피어에 익숙할 것이다. 폴리스티렌 마이크로스피어는 크기와 형광 강도 모두에 대해 고도로 균일하다. 이것들은 생물학적 샘플의 크기, 방출 파장, 및 강도를 대략적으로 복제하도록 설계된다. 특정 경우에서, 염료는 표면 대신 마이크로스피어의 매트릭스 내부에 함유될 수 있기 때문에, 비드는 우수한 광화학 및 물리적 안정성을 지녀, 유세포분석기(예, AlignFlow, ThermoFisher)를 정렬, 포커싱 및 보정하기 위한 신뢰할 수 있는 참조 신호를 제공한다. 이러한 형광 염료는 2.5 μm-직경 및 6.0 μm-직경 범위에서와 같이 유세포분석에서 통상 이용되는 레이저 공급원에 의해 최적의 여기(excitation)를 위해 선택된다. 또 다른 예(BD Cytometry Setup and Tracking (CS&T) Beads)에서, 동일 농도의 세 폴리스티렌 비드는 상대적인 강도: 희미함(dim), 중간범위(midrange) 및 밝음(bright)에서 상이하다. 세 비드 모두 낮은 고유 CV를 갖고 많은 유세포분석 적용에서 사용되는 광범위한 여기 및 방출 파장에 걸친 염료를 함유한다. 비드의 일부 다른 예는 항체 포획 비드이다: 이들 비드는 항체를 포획하고 형광 보상을 위한 컨트롤 역할을 할 수 있다(예, OneComp 및 UltraComp eBeads: 폴리스티렌 마이크로스피어; AbC Total Antibody 및 ArC Amine-Reactive Compensation Bead: 폴리스티렌 마이크로스피어). 비드의 다른 예는 하기를 포함한다: 카운팅 비드; 멸균 기술 비드 (예, "GloGerm bead"); Polyscience Yellow-Green (YG) 비드 (고 형광 및 0.5 μm 내지 10 μm의 이용가능한 균일한 입자; 및 정량화 비드). 또 다른 예는 잘 특성화된 비드인 Quantum MESF 비드(PE 라벨링된 항체)이다. PE에 대한 F/P 비율은 입체 제약으로 인해 일반적으로 1:1이다.
정량화.
현재, 유세포분석 측정 및 기타 형광-기반 측정 및 진단 양식은 상대적이다. 즉, 유세포 분석에서와 같이 세포 당 기준으로 분자(예, 단백질)의 실제 수를 얻는 것이 아니라 컨트롤에 비해 측정이 행해진다. 유세포 분석에 대한 정량적 표준을 만들기 위해 노력을 해왔지만, 본원에서 기재된 바와 같은 항체의 라벨 가변성으로 인해 단일 염료(피코에리트린)로 제한한다.
항체와 같은 결합 분자 상 염료의 로딩-의-정도(DoL)(즉, 항체 당 염료 수)는 라벨의 밝기를 바꾼다. 전형적인 컨쥬게이션 전략의 변동으로 인해, DoL은 모든 결합 분자에 걸쳐 분포를 갖고 따라서 밝기도 마찬가지이다. DoL의 이러한 변화를 완화하는 유일한 방법은 염료의 농도를 감소시켜 1:1 라벨링을 달성하는 것이다. 그러나, 상기 낮은 농도에서 반응은 낮은 수율을 겪고 염료 없는 많은 항체 및 하나의 염료를 가진 소수의 항체를 생성한다. 이는 유용할 만큼 충분히 밝은 정량적, 라벨링된 항체를 제조하는 것을 비실용적으로 만든다. 또한, 전통적인 컨쥬게이션 전략은 부산물, 비활성화된 염료 및 라벨링되지 않은 항체를 제거하는데 광범위한 반응 후 청소(cleanup)가 요구된다.
본 개시내용의 핵산 링커 시스템은 1:1 DoL 활용에 의한 라벨링된 바이오컨쥬게이트의 정량적 분석을 가능하게 한다. 도 5는 전통적인 컨쥬게이션 전략과 본원에서 기재된 핵산/폴리뉴클레오티드 링커 사이의 차이를 설명한다. 도 5는 항체 당 라벨에 대한 라벨링된 항체의 개수를 나타낸다. 곡선은 전형적으로 전통 컨쥬게이션 방법에서 맞닥뜨러지는 분포를 나타내고, 가운데의 '델타' 함수는 폴리뉴클레오티드 링커가 생성할 수 있는 것을 나타낸다.
DoL의 제어는 "m" 폴리뉴클레오티드(예를 들어 polyA)가 로딩된 일련의 특수 마이크로스피어/비드를 분석함으로써 생성된 작동 곡선과 관찰된 형광을 비교함으로써 세포 표면 상의 단백질의 개수를 직접적으로 측정할 수 있게 한다. 도 6은 비드의 polyA 링커 세그먼트에 어닐링함으로써 포획된 polyT 링커 세그먼트를 가진 PHOITON(올리고뉴클레오티드-기반 형광 라벨)의 개념을 예시한다. 그런 다음 비드는 세정 및 원심분리에 의해 정제되어 비드 직경의 가변성 내에서 일정한 DoL을 가진 비드 집단을 생성할 수 있다.
도 7은 비드 상 링커의 개수("m")가 어떻게 변하고 1:1 방식으로 동일한 개수의 PHITON을 포획할 수 있는지 예시한다.
도 8은 표면 상 다양한 개수의 폴리뉴클레오티드(예, polyT)가 있고("m") 부착된 PHITON("n")의 밝기를 가진 비드가 이들의 형광을 선형으로 변화시키는 방법을 예시한다. 예를 들어, 도 8은 2개의 PHITON(n=1 클러스터 및 n=2 클러스터)을 나타내는 두 선을 나타낸다. 이들의 기울기는 상이한데 그 이유는 비드 당 링커 카운트("m")의 각 근소한 증가에 있어서, n=1 클러스터 PHITON보다 n=2 클러스터 PHITON이 2X 더 많이 형광을 내므로 형광이 더 많은 양으로 증가하기 때문이다.
(m,n)에 대한 충분한 수의 값으로, 선형 회귀를 이용하여, 형광 신호를 기반으로 하는 표면(예, 비드, 세포 등)에 연결된 염료 분자의 수를 결정할 수 있다. 나아가, 이러한 염료-라벨링된 비드를 사용한 정량화는 시스템의 검출 한계, 즉 얼마나 작은 신호를 검출할 수 있는지에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있다. 이는 또한 polyA 꼬리에 의존하는 임의의 3' 기반 RNA 검출 양식의 감도를 결정하는데 사용될 수도 있다.
따라서, 본원에서 제공된 컨쥬게이션 프로세스는 다른 기술들과 연관된 가변성을 감소시키고, 염료 분자(예, 올리고-기반 염료) 또는 결합 분자에 컨쥬게이션되는 임의의 다른 분자의 개수를 미세하게 조정되는 제어를 가능하게 한다. 공지된 양의 염료 및 이들 염료 각각으로부터 공지된 잘-특성화된 형광으로, 진정한 정량적 시스템이 개시된다. 결정적으로, 이 잘-제어된 시스템에서 표준 곡선을 설정할 때(도 8 참조), 예를 들어 유세포분석에서 세포의 표면 상 바이오컨쥬게이트의 개수가 정량적으로 결정될 수 있다. 이는 단일 세포 상에서 동시에 수행될 수 있어, 유세포분석에서 첫 번째 진정한 정량화뿐만 아니라 단일-세포 기반으로 다수의 바이오컨쥬게이트에 걸쳐 동시에 행할 수 있는 능력을 가능하게 한다.
보상(compensation).
상이한 형광단 사이에서 방출 스펙트럼 간 중첩으로 인해, 보상(또한 다른 연구 분야에서는 언믹싱(unmixing)으로 불리워짐)이 사용된다. 보상의 목표는 "잘못된" 채널로부터 특정 프로브의 과잉 형광을 제거하는 것이다. 예를 들어, 플루오레세인 형광은 주로 FL1(FITC) 채널에서 측정되는 녹색이다. 그러나, 플루오레세인은 또한 FL2(PE) 채널에 나타나는 형광에 대한 유의미한 황색 성분도 가진다. 현재 실습에서, 세포는 항-항체 비드 또는 실험적으로 사용되는 동일한 염료를 가진 항체로 염색된다. 단일 염색 컨트롤이 오프-채널 형광을 결정하는데 수행되며, 보상 매트릭스는 이를 설명하기 위해 생성된다. 이는 과잉결정된 시스템(즉 형광단보다 더 많은 검출기)인 스펙트럼 보상으로 최근에 확장되었지만, 근본 접근법은 유사하다.
탠덤 염료(즉, PE-Cy7 또는 APC-Cy7과 같은 2개의 형광단으로 구성되고 형광에 대해 FRET에 의존할 수 있는 것)는 보상에서 필수요건을 증가시킨다. 이들 탠덤 염료의 사용은 상이한 항체들에 결합될 때 이들 염료의 FRET 상호작용이 변하므로 연구원에게 부담이 된다. 이는 단일 염색 보상 컨트롤에서 실험적으로 사용된 FRET 쌍으로 정확한 항체를 실행해야 하고, 이들 탠덤 중 하나를 함유하는 패널 당 하나의 보상 매트릭스로 이어진다. 예를 들어, 표 2는 4가지의 4색차 패널을 나타낸다.
Figure pct00002
형광 특성이 CD4-PE-Cy7, CD5-PE-Cy7, CD6-PE-Cy7, 및 CD7-PE-Cy7 사이에서 상이하므로, 이 실험에서 4개의 상이한 보상 매트릭스 (패널 당 하나) 및 7가지 상이한 보상 실행을 필요하게 만든다(표 3).
Figure pct00003
그러나, 본 개시내용의 특정 구현예에서, 보다 부드러운 컨쥬게이션 프로토콜 및 단일 종 및 다수의 종 (FRET) 염료 모두를 안정화시키는 DNA-기반 플랫폼 컨쥬게이션의 특징, 염료-컨쥬게이션된 항체(예, PHITON-컨쥬게이션된 항체)의 광학 특성은 변하지 않는다. 이는 하나의 보상 매트릭스 및 네 가지 보상 컨트롤로 동일 실험을 실행할 수 있게 한다. 예를 들어, PHITON-컨쥬게이션된 항체를 이용할 때 실험은 하기와 같다:
Figure pct00004
네 가지 패널 모두 하나의 보상 매트릭스를 공유할 것이고 (유효하게 공유할 수 있으며), 오로지 네 가지 보상 컨트롤의 실행을 요구하므로, 실험 설계를 크게 단순화시킨다.
이러한 시스템을 이용하여, 당업자는 항체를 필요로 하지 않고, 상응하는 (상보적) 서열이 있는 핵산 링커를 가진 폴리뉴클레오티드-변형된 염료에 핵산 링커를 통해 컨쥬게이션된 폴리뉴클레오티드-변형된 비드를 이용할 수 있다(도 9). 이들 보상 컨트롤은 단일 염색 컨트롤을 실행하기 위한 일관된 방법이다. 또한, 이것들은 항체 상 염료 분자의 분포에 적용되지 않기 때문에(즉, 이것들은 단지 모두 정량화될 수 있는 비드 상 순수 염료임), 단일 염색 컨트롤 자체의 고유의 측정 노이즈가 최소화된다.
따라서, 상기에서 논의된 바와 같이, 본 개시내용의 컨쥬게이션 방법은 비드 상으로 직접 염료의 배치를 가능하게 하여, 보상 컨트롤을 위한 염료-컨쥬게이션 항체를 이용하는 것과 관련된 비용을 피한다. 이러한 방법은 또한 발생하는 가변성 및 보상 매트릭스의 증식을 피한다(각 탠덤-컨쥬게이트된 항체는 상이하게 행동하고 이는 이것 자체 보상 컨트롤을 필요로 함). 특정 구현예는 사용자가 하나의 일관적인 멀티컬러 컨트롤 세트를 실행하게 할 수 있다(예, 비드에 직접 컨쥬게이션된 올리고-기반 염료).
정제.
본원 다른 곳에서 논의된 이유로, 정제가 필요하지 않을 수 있지만, 본 개시내용의 바이오컨쥬게이트의 제조 방법은 예를 들어 고순도 바이오컨쥬게이트가 요구조건인 경우에서 자유 염료 또는 다른 컨쥬게이트 성분의 정제를 허용한다(예, 도 3 및 도 10 참조). 예를 들어, 컨쥬게이션을 약물-항체 바이오컨쥬게이트를 제조하는데 사용한다면, 방법은 또한 GMP 제작 프로세스에서 비결합된 항체 및 약물 모두의 정제를 가능하게 한다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드-변형된 기질, 예컨대 결합 분자, 및/또는 컨쥬게이트 성분, 예컨대 폴리뉴클레오티드-기반 라벨은, 적어도 부분적으로 상보적 서열을 가진 핵산 가닥으로 폴리뉴클레오티드-변형된 기질 및/또는 폴리뉴클레오티드 변형된 컨쥬게이트 성분의 단일-가닥 링커 영역을 어닐링함으로써, 어닐링된 이중-가닥 링커를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트를 포함하는 조성물로부터 포획될 수 있다. 특정 구현예에서, 상보적 서열을 가진 핵산 가닥은 정제를 위한 표면에 또는 비드에 부착된다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드-변형된 기질 및/또는 폴리뉴클레오티드 변형된 컨쥬게이트 성분의 단일-가닥 링커 영역이 비드에 연결된 후, 비드는 원심분리에 의한 제거에 의한 것과 같이, 폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트로부터 분리된다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트는 상보적 서열을 가진 고정된 핵산으로 성분을 통과시킴으로써 분리된다. 특정 구현예에서, 비드는 크로마토그래피에 자리한 비드와 같이 비드와 고정된 표면 모두의 역할을 할 수 있다.
특정 구현예에서, 방법은 컨쥬게이트와의 연결을 변위시킴으로써 재활용될 수 있는 폐기물(예, 비결합된, 제거된 컨쥬게이트)를 생성한다.
올리고뉴클레오티드-기반 형광 라벨.
올리고뉴클레오티드-기반 형광 라벨은 본원에서 그 전체가 참조로 통합된 WO/2018/231805에 상세히 기재되어 있다. 라벨로서 이용될 수 있는 올리고뉴클레오티드-기반 형광 라벨은 다양한 기술을 통해 제조될 수 있다. 일부 예에서, DNA 자가-어셈블리는 원하는 라벨 내 공진기의 상대적 위치가 원하는 시간 감쇠 프로파일(temporal decay profile)에 따라 지정된 위치에 상응하는지 보장하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 네트워크의 각 공진기는 각 지정된 DNA 가닥에 커플링될 수 있다(도 14). DNA 가닥이 지정된 상대적 위치에서 공진기를 유지하는 나노구조로 자가-어셈블링되도록 하나 이상의 다른 DNA 가닥을 보완하는 하나 이상의 부분을 각 DNA가 포함할 수 있다.
DNA 자가-어셈블리 및 기타 신흥 나노-스케일 제조 기술은 나노-규모로 정밀한 특정 구조의 많은 인스턴스(instance)의 제작을 허용한다. 예를 들어, WO/2018/231805에 기재된 바와 같이, PHITON은 화학적 방법에 의해 생성된 맞춤 합성 DNA를 어닐링함으로써 제조된다. 다중 가닥들은 혼합 및 어닐링되기 전에 형광단, 펩티드, 소분자 등에 사전-컨쥬게이션된다. 가장 낮은 에너지의 단일의 한정된 어셈블리가 존재하고, 용액, 건조 또는 동결 상태에서 안정적이고 임의의 컨쥬게이션된 물질의 상대적 위치를 보존하도록 서열은 설계된다. 이러한 정밀도는 다양한 광학 공진기 네트워크를 생성하기 위해 형광단, 양자 점, 염료 분자, 플라즈몬 나노막대, 또는 기타 광학 공진기가 서로에 대해 정확한 위치 및/또는 방향에 위치하게 할 수 있다. 이러한 공진기 네트워크는 다양한 상이한 적용을 용이하게 하도록 지정될 수 있다. 일부 예에서, 공진기 네트워크는 이것들이 광학 여기(예, 조명 펄스에 의함)와 재방출 사이의 사전에 지정된 시간적 관계를 보이도록 설계될 수 있다; 이는 단일 여기 파장 및 단일 검출 파장을 이용하여 검출될 수 있는 일시적으로-다중화된 라벨 및 타간트를 가능하게 할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 이들 공진기 네트워크에 의해 여기와 관련해서 광학 재방출의 타이밍의 확률적 특성은 무작위 변수의 샘플을 생성하기 위해 활용될 수 있다. 이들 공진기 네트워크는 어두운 상태를 나타내는 하나 이상의 "입력 공진기"를 포함할 수 있고; 이러한 입력 공진기를 포함하는 공진기 네트워크는 공진기 네트워크를 통해 여기자 또는 기타 에너지의 흐름을 제어하도록 논리 게이트 또는 기타 구조를 구현하도록 설정될 수 있다. 이어서 그러한 구조가 예를 들어 단일 공진기 네트워크에 의해 각종 상이한 분석물의 검출을 허용하거나, 공진기 네트워크를 이용하여 생성된 무작위 변수의 분포를 제어하거나, 생물학적 샘플을 이미지화하는데 사용된 라벨 세트를 추가로 다중화하거나 일부 기타 적용을 용이하는데 사용될 수 있다.
이들 공진기 네트워크는 형광단, 양자점, 염료, 라만(Raman) 염료, 전도성 나노막대, 발색단 또는 기타 광학적 공진기 구조의 네트워크를 포함한다. 네트워크는 항체, 압타머, 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 가닥, 또는 관심 분석물(예를 들어, 표면 단백질, 분자 에피토프, 특징적 뉴클레오티드 서열, 또는 기타 분석물의 기타 특징적인 특징)에 대한 선택적 결합을 허용하도록 구성된 기타 수용체를 추가적으로 포함할 수 있다. 라벨은 샘플을 관찰하거나, 샘플의 내용물을 식별하거나(예를 들어, 샘플 내의 세포, 단백질 또는 기타 입자 또는 물질들의 아이덴티티), 이들의 식별을 기반으로 이러한 내용물을 분류하거나(예를 들어, 식별된 세일(ceil) 타입 또는 기타 특징에 따른 유세포분석 내 세일을 분류), 일부 기타 적용을 용이하게 하도록 사용될 수 있다. 본원에 개시된 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 링커를 통해 항체 또는 비드와 같은 기질에 라벨이 연결된다.
예시 적용에서, 이러한 공진기 네트워크는 적용되어(예를 들어, 공진기 네트워크를 항체, 압타머, 또는 기타 분석물-특이적 수용체와 커플링함으로써) 생물학적 또는 물질적 샘플 또는 관심의 기타 환경에서 다수의 상이한 라벨의 존재를 검출하거나, 이들 사이를 구별하거나, 그렇지 않다면 관찰할 수 있다. 이러한 라벨은 샘플에서(예, 유세포분석 장치의 채널에서) 하나 이상의 관심 분석물의 존재, 양, 또는 위치의 검출을 허용할 수 있다. 구별가능한 라벨의 대규모 라이브러리에 대한 접근은 다수의 상이한 분석물의 동시 검출을 허용할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 구별가능한 라벨의 큰 라이브러리에 대한 접근은, 예를 들어, 상이한 에피토프, 표면 단백질 또는 분석물의 기타 특징에 대한 것과 같이, 동일 분석물과의 결합하는 다중 라벨들을 이용함으로써 특정 분석물(예, 세포 유형 또는 관심 하위 유형)의 보다 정확한 검출을 허용할 수 있다. 보다 추가로, 이러한 라벨의 큰 라이브러리에 대한 접근은 해당하는 관심 분석물의 가능한 밀도 또는 개수에 따라 라벨의 선택을 허용할 수 있어, 예를 들어 샘플에서 상이한 농도를 가진 분석물에 상응하는 상이한 라벨의 효과적인 밝기가 그러한 샘플을 광학적으로 조사할 때 대략적으로 동일하다는 점을 보장한다.
이러한 라벨은 여기 스펙트럼, 방출 스펙트럼, 형광 수명, 형광 강도, 광표백에 대한 민감성, 분석물에 대한 결합 또는 일부 기타 환경적 인자에 대한 형광 의존도, 재방출된 빛의 편광, 또는 일부 기타 광학적 특성과 관련하여 상이함으로써 구별가능하다. 그러나, 이용가능한 형광단 또는 기타 광학적으로 구별가능한 물질에 대한 제한, 및 파장 투명도/관심 있는 공통 샘플 재료의 호환성에 대한 제한으로 인해 방출 또는 여기 스펙트럼에 대한 차이를 의존할 때 구별가능한 라벨의 라벨 라이브러리를 제조하는 것은 곤란할 수 있다.
WO/2018/231805는 시간 감쇠 프로파일 및/또는 여기 및 방출 스펙트럼과 관련하여 상이한 광학 라벨들을 지정, 제작, 검출 및 식별하는 방법을 기술한다. 추가적으로, 제공된 라벨은 기존의 라벨(예, 형광단-기반 라벨)에 비해 증강된 밝기를 가질 수 있고, 패널 디자인을 용이하게 하거나 일부 다른 고려사항들을 용이하게 하기 위해 상이한 라벨들의 상대적 밝기를 허용하도록 구성가능한 밝기를 가질 수 있다. 이러한 라벨은 라벨의 여기(예, 초고속 레이저 펄스에 의해) 다음에 라벨에 의한 빛의 재방출의 시간-의존적 가능성에 있어서 상이할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 이러한 라벨은 (예를 들어, 직접적인 에너지-전달이 불리한 입력 공진기와 출력 공진기 사이에 여기자가 전송될 수 있도록 입력 공진기와 출력 공진기 사이에 다수의 중개 공진기를 삽입함으로써) 라벨의 여기 파장과 라벨의 방출 파장 간 차이를 증가시키도록 공진기의 네트워크를 포함할 수 있다. 또한 추가로, 이러한 라벨은 라벨을 검출 및 식별할 때 추가의 다중화를 허용하도록 논리 게이트 또는 기타 광학적-제어가능한 구조를 포함할 수 있다.
WO/2018/231805에 기술된 바와 같이 공진기 네트워크(예를 들어, 라벨의 일부로서 포함된 공진기 네트워크)는, 하나 이상의 입력 및/또는 리드아웃 공진기, 출력 공진기, 암흑-상태-표시 "논리 입력" 공진기 및/또는 중개 공진기가 지정된 공진기 네트워크에 따라 배열되도록, 나아가 네트워크의 시간 감쇠 프로파일, 네트워크의 밝기, 여기 스펙트럼, 방출 스펙트럼, 스토크 시프트(Stokes shift), 또는 네트워크의 일부 기타의 광학 특성, 또는 네트워크의 관심 있는 일부 기타 검출가능한 특성(예를 들어, 관심 있는 분석물에 대한 결합 상태)이 이의 사양(예를 들어, 지정된 시간 감쇠 프로파일, 조명에 대한 방출 가능성)에 해당하도록 다양한 방식으로 제작될 수 있다. 이러한 배열은 공진기 사이(예를 들어, 공진기 쌍 사이)에서 상대적 위치, 거리, 방향 또는 기타 관계가 공진기들 간 지정된 위치, 거리, 방향 또는 기타 관계에 해당하는 것을 확보하는 것을 포함할 수 있다.
이는 DNA 자가-어셈블리를 사용하여 하나 이상의 공진기 네트워크의 복수개의 인스턴스를 제작하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 여러 상이한 DNA 가닥은 공진기 네트워크의 각 공진기(예를 들어, 입력 공진기, 출력 공진기 및/또는 중개자 공진기)에 커플링될 수 있다(예를 들어, N-히드록시숙신이미드(NHS) 에스테르-변형된 염료 분자를 부착하기 위해 티미딘 상 일차 아미노 변형기를 통해). DNA 가닥 쌍은 적어도 부분적으로 상보적인 부분을 가질 수 있어, DNA 가닥들이 혼합되고 지정된 조건에 노출될 때(예, 지정된 pH, 또는 지정된 온도 프로파일), DNA 가닥의 상보적 부분이 함께 정렬되고 결합하여 공진기 네트워크의 공진기의 상대적 위치 및/또는 방향을 유지하는 반-강성 나노구조를 형성할 수 있다.
도 15는 그러한 공진기 네트워크의 개략도를 나타낸다. 입력 공진기, 출력 공진기 및 2개의 중개 공진기는 각 DNA 가닥에 커플링된다. 추가의 DNA 가닥과 함께 커플링된 DNA 가닥은 이어서 입력 공진기, 중개 공진기 및 출력 공진기가 공진기 와이어를 형성하도록 예시된 나노구조로 자가-어셈블링된다. 일부 예에서, 복수개의 분리된 상동 또는 상이한 네트워크는 그러한 방법 또는 다른 기술을 통해 공진기 네트워크의 단일 인스턴스의 일부로서 (예를 들어, 공진기 네트워크의 밝기를 증가시키기 위해) 형성될 수 있다.
그러한 공진기 네트워크의 공진기들 사이의 거리는, 공진기 네트워크가 하나 이상의 원하는 거동을 보이도록 지정될 수 있다(예를 들어, 특정 여기 파장에서 빛에 의해 여기되고, 반응하여 지정된 시간 감쇠 프로파일에 따라 방출 파장에서 재방출된다). 이는 서로 간에 에너지를 전송할 수 있도록(예를 들어, 양방향 또는 단방향으로), 및 추가로 공진기들이 서로를 켄칭시키거나 그렇지 않으면 서로의 광학적 특성을 간섭하지 않도록 이웃하는 공진기들 사이의 거리를 지정하는 것을 포함할 수 있다. 공진기가 백본에 링커를 통해 결합하는 예에서(예를 들어, DNA 백본에, 아미드 결합(예를 들어, N-히드록시숙신이미드(NHS) 에스테르 분자에 의해 생성됨) 또는 기타 결합 구조를 통해), 링커는 이러한 고려 사항뿐 아니라 링커의 길이(들)를 염두하여 지정된 백그라운드 위치에 연결될 수 있다. 예를 들어, 커플링 위치는 링커 길이의 두 배 초과인 거리만큼 분리될 수 있다(예를 들어, 공진기가 서로 접촉하여 그에 따라 서로를 켄칭하거나 그렇지 않으면 서로의 광학적 특성을 방해하는 것을 막기 위해). 추가적으로 또는 대안적으로, 커플링 위치는 공진기가 서로 간 에너지를 전송할 수 있는 최대의 거리보다 더 작은 거리만큼 분리될 수 있다. 예를 들어, 공진기는 형광단 또는 Forster 공진 에너지 전달을 통해 에너지를 전송할 때 Forster 반경을 특징으로 하는 일부 기타 광학 공진기일 수 있고, 커플링 위치는 Forster 반경보다 작은 거리로 분리될 수 있다.
샘플에서 라벨을 식별하기 위한 예의 시스템 및 방법.
샘플에서 또는 기타 관심 환경에서 존재할 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 라벨의 존재, 아이덴티티, 절대 또는 상대적인 양, 또는 기타 특성을 검출하기 위해, 샘플 (예를 들어, 생물학적 샘플 또는 유세포 분석기에서 세포의 스트림) 또는 일부 기타 관심 환경을 조사하는 것은 다양한 적용에 있어서 유익할 수 있다. 이러한 조사는 샘플의 이미징을 용이할 수 있게 하여, 예를 들어 샘플 내에 존재하고 하나 이상의 다양한 라벨이 결합되도록 구성된 하나 이상의 분석물에 대한 위치, 농도, 또는 기타 정보를 결정할 수 있게 한다. 이러한 조사는 세포, 단백질, RNA 가닥 또는 샘플의 기타 내용물의 식별을 용이하게 하여 그러한 내용물을 분류하거나 일부 기타 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 유세포분석 장치는 세포 (또는 기타 관심 입자)가 흐르는 유동 채널을 포함할 수 있다. 그러한 유동 채널은 본원에서 기재된 바와 같이 조사되어, 채널에서 하나 이상의 라벨을 식별하고/하거나 세포의 유형 또는 하위 유형을 식별하거나, 세포의 특성을 결정하거나, 식별된 라벨을 기반으로 한 일부 다른 정보를 결정할 수 있다. 이어서 이러한 정보는 예를 들어 세포 유형에 따라 세포를 분류하는데 사용될 수 있다.
관심 환경에서 라벨을 검출하고/하거나 식별하는 이러한 방법은, 관심 환경에 (예를 들어, 조명의 하나 이상의 초단파 펄스의 형태로) 조명을 제공하고, 조명에 반응하여 환경으로부터 방출된 광자의 하나 이상의 특성(예를 들어, 이러한 광자의 파장 또는 스펙트럼, 조명의, 예를 들어 조명의 하나 이상의 펄스의 타이밍에 대한 이러한 광자의 방출 타이밍)을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 이는 조명의 단일 펄스를 제공하고 환경에서 하나 이상의 라벨의 복수개의 인스턴스로부터 응답해서 방출된 광자를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 하나 이상의 라벨의 하나 이상의 인스턴스는 복수의 조명 펄스에 의한 복수 횟수 조명될 수 있고, 조명 펄스에 상대적인, 응답해서 방출된 광자의 타이밍이 검출될 수 있다. 응답적으로 방출된 광자의 타이밍에 대한 정보는 이때 환경에 존재하는 하나 이상의 라벨을 동정하거나, 그러한 라벨의 결합 상태 또는 다른 특성을 결정하거나, 환경에서 라벨(들)의 절대 또는 상대적 양을 결정하거나, 환경에 존재하는 본원에서 기재된 바와 같은 하나 이상의 라벨에 대한 일부 기타 정보를 결정하는 데 사용될 수 있다.
조명은 조명의 하나 이상의 펄스로서 환경에 제공될 수 있다. 제공된 조명은 지정된 파장, 예를 들어 하나 이상의 라벨의 입력 공진기의 여기 파장을 가질 수 있다. 이러한 여기 파장은 예를 들어 이들의 입력 공진기(들)와 동일한 형광단, 양자점, 염료 또는 기타 광학 물질 또는 구조를 포함하는 라벨 일부 또는 전부로 인해 관심 환경에 존재하는 라벨의 일부 또는 전부에 걸쳐 공통적일 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 다수의 상이한 빛 파장은 예를 들어 다수의 상이한 라벨의 다수의 상이한 입력 공진기를 여기시키기 위해 제공될 수 있다. 일부 예에서, 빛의 이러한 상이한 파장은 다수의 상이한 라벨 및/또는 다수의 상이한 라벨 세트의 스펙트럼-다중화 검출을 용이하게 하기 위해 (예를 들어, 조명의 상이한 펄스의 일부로서) 상이한 시점에서 제공될 수 있다. 일부 예에서, 단일의 라벨은 다수의 상이한 입력 공진기를 포함할 수 있고, 상이한 입력 공진기는 각 상이한 파장에서 빛에 의해, 예를 들어 조명의 각 상이한 펄스의 일부로서 여기될 수 있다.
환경에서 라벨의 동정을 개선하기 위해, 환경을 조사하는 데 사용된 조명의 펄스는 초단파 펄스(예를 들어, 아토초 내지 나노초 정도의 지속 기간을 가진 펄스)일 수 있다. 이러한 초단파 펄스는 모드-고정 진동자로부터 방출된 광대역(broadband) 펄스로서 제공될 수 있다. 라벨이 긴 수명 상태를 가진 공진기를 포함하는 예에서 (예를 들어, 란타나이드 원자 또는 기타 란타나이드 화합물 또는 착물), 조명의 펄스는 예를 들어 마이크로초 정도로 더 긴 지속기간을 가질 수 있다.
조명의 펄스에 응답하여 환경으로부터의 광자의 방출의, 이러한 조명의 펄스에 대한 타이밍은 다양한 방식으로 검출될 수 있다. 일부 예에서, 개별 광자의 타이밍은 예를 들어 하나 이상의 단일-광자 애벌란시 다이오드, 광전자증배관 또는 기타 단일-광자 검출기를 이용하여 검출될 수 있다. 이러한 검출기의 출력은 시간-상관된 단일 광자 계수기의 일부로서 이용되어, 조명의 펄스가 환경에 제공된 후 시간의 함수로서 결정된 광자의 카운트를 결정할 수 있다. 이러한 검출된 광자의 타이밍이 사용되어 샘플의 조명에 응답하여 샘플로부터의 광자의 방출의 타이밍에 대한 확률 밀도 함수를 결정할 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 환경으로부터의 광자이 방출의 타이밍을 검출하는 것은 방출된 광자의 속도 또는 강도에서 하나 이상의 피크 타이밍을 검출하거나, (예를 들어, 공지된 시간 감쇠 프로파일의 상응하는 피크의 지연과 일치될 수 있는 광자 방출 속도의 피크의 지연 타이밍을 결정하기 위해) 방출된 광자의 타이밍의 일부 다른 응집 특성을 검출하는 것을 포함한다. 이러한 검출은 피크 검출기, 미분기(differentiator), 정합 필터 또는 일부 기타 아날로그 또는 디지털 시그널 프로세싱 기술을 단일-광자 애벌란시 다이오드 또는 관심 환경으로부터 방출된 광자를 수신하도록 구성된 기타 광검출기 요소에 적용하는 것을 포함할 수 있다.
하나 이상의 공지된 라벨은 관심있는 환경에 존재할 수 있고, 이러한 라벨의 아이덴티티를 결정하고/하거나 환경에서 라벨에 대한 일부 기타 정보를 결정하는 데 유익할 수 있다. 상기에 기재된 바와 같이, 이러한 라벨은 이들의 시간 감쇠 프로파일에 따라 구별될 수 있다; 즉, 각각의 공지된 라벨은 각각의 상이한 시간 감쇠 프로파일을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 환경에 존재하는 하나 이상의 라벨의 아이덴티티는, 환경으로부터의 광자 방출의 검출된 타이밍을 시간 감쇠 프로파일의 사전과 비교함으로써 결정될 수 있고, 여기서 사전에서의 각 시간 감쇠 프로파일은 환경에 존재할 수 있는 각 공지된 라벨에 해당한다.
환경을 조사하는 것은 다수의 상이한 파장 범위 내에서 광자 방출 타이밍을 검출하는 것을 포함한다. 이것은 라벨의 두 상이한 출력 공진기로부터 광자의 방출 타이밍을 검출할 수 있도록 수행될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 이것은 라벨의 출력 공진기, 하나 이상의 중개 공진기, 및/또는 입력 공진기로부터 광자의 방출 타이밍을 검출하는 데 수행될 수 있다.
또한 추가로, 환경에 존재하는 하나 이상의 라벨은 라벨의 시간 감쇠 프로파일이 어두운 상태를 나타내는 공진기가 이들의 각각의 어두운 상태에 있는지 여부에 좌우되도록 어두운-상태를 나타내는 공진기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 라벨은 제1의 어두운 상태를 나타내는 공진기를 포함할 수 있고, 상기 제1의 어두운 상태를 나타내는 공진기가 어두운 상태에 있을 때 제1의 시간 감쇠 프로파일을 나타낼 수 있고, 라벨은 상기 제1의 어두운 상태를 나타내는 공진기가 어두운 상태에 있지 않을 때에는 제2의 시간 감쇠 프로파일을 나타낼 수 있다. 이러한 예에서, 라벨의 검출 및/또는 식별은 어두운 상태를 나타내는 공진기(들)가 어두운 상태에 있지 않는 시간 기간 동안 광학 여기 및 재방출의 타이밍을 검출하는 것, 및 상이한 시간 동안, (예를 들어, 어두운 상태를 나타내는 공진기(들)의 여기 파장에서 조명을 제공함으로써) 어두운 상태를 나타내는 공진기(들)를 유도해 어두운 상태로 진입하는 것 및 다시 라벨의 광학적 여기 및 재방출 타이밍을 검출하는 것을 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1.
고유의, 매우 다양한 서열이라기 보다는 폴리뉴클레오티드 서열을 이용하는 것이 다운스트림 적용에서 컨쥬게이션 수율 및/또는 컨쥬게이트의 성능에 유의미하게 영향을 미칠 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 도 11 및 도 12가 고도로 다양한 서열들뿐 아니라 폴리뉴클레오티드 서열들 모두를 이용해 컨쥬게이션된 PHITON-라벨링된 항체의 성능을 비교하는 말초 단핵 혈액 세포(PBMC) 염색 데이터를 이용하여 상기를 설명한다. 이들 두 데이터세트의 오버레이는 두 컨쥬게이션 방법이 거의 동일한 염색 패턴을 보이고 따라서 컨쥬게이션 수율 또는 염색 결과를 유의미하게 변경하지 않는다는 것을 보여준다.
실시예 2.
동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 이용하는 컨쥬게이트들은 또한 컨쥬게이션 후 함께 혼합될 수 있고, 유의미한 교환을 나타내지 않으면서, 즉 한 컨쥬게이트의 변성 및 혼합물 내 다른 종과의 부산물의 재-하이브리드화 없이, 용액 중에서 안정적으로 유지될 수 있다. 도 13이 두 컨쥬게이트에 대해 동일 폴리뉴클레오티드 서열 및 고도로 다양한 및 고유의 서열들 모두를 이용하여 Nova-Blue 610 - CD3 및 NovaYellow 610 - CD4의 혼합물로 염색되어진 PBMC로 상기를 설명한다. 도 13에서 오버레이는, 고유의 서열들을 이용하는지 또는 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 이용하는지와 관계없이 결과가 거의 동일하다는 점을 보여준다.
실시예 3.
하나 이상의 (일반적으로 복수개) 단일-가닥 핵산 링커(예, polyA)가 부착되어 있는 비드는, 비드의 표면에 결합하는 비결합 링커(예, polyT)의 친화도를 이용하여 폴리뉴클레오티드-변형된 항체와 어닐링 후 비컨쥬게이션된 폴리뉴클레오티드-변형된 염료를 정제하는데 사용될 수 있다. 도 10은 결합 및 비결합 염료의 혼합물이 polyA 비드와 반응되고, 세척되고, 원심분리(제거)되어, 정제된 상청액을 생성하는 상기 프로세스를 예시한다.
이러한 정제는 10-20개의 뉴클레오티드의 더 긴 자유 polyT 가닥을 이용하여 염료와 polyA 비드 간 연결을 대체함으로써 재활용될 수 있는 폐기물(예, 제거된, 비결합된 염료)을 생성하는데, 여기서 상기 염료 연결은 전체 polyA 가닥에 대한 것이 아니라 1-10개 뉴클레오티드만큼 적다. 이 프로세스는 염료를 자유 polyT 가닥으로 교환하고, 세척 및 원심분리 후, 항체에 대한 재-컨쥬게이션에 적합한 상청액에서 정제된 결합되지 않은 염료를 남길 것이다.
실시예 4.
화학양론을 변경함으로써 광학 특성을 유지하면서 컨쥬게이트의 밝기는 증가될 수 있다. 예를 들어, 2-코어 염료의 경우 염료:단백질(D:P) 비율을 2로 변경하면, 이는 주어진 염료의 밝기의 4배 증폭을 제공할 것이다. 또 다른 예로서, 4의 D:P 비율 및 완전히 로딩된 단일 염료 라벨(예를 들어, PHITON 상 16개의 개별 염료)으로, 우리는 4x16 = 64X 밝기에 도달할 수 있고, 이는 개별 세포 상 매우, 매우 적은 (그리고 현재 검출할 수 없는) 개수의 분자를 검출하는 (여전히 정량적인) 방식을 제공할 수 있게 한다.
*****
따라서, 본 개시내용의 폭 및 범위는 상술한 예시적인 구체예들 중 어느 것에 의해서도 제한되어서는 안되며, 다음의 청구 범위 및 그 등가물에 따라서만 정의되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> PHITONEX, INC. <120> POLYNUCLEOTIDE-LINKED BIOCONJUGATES AND METHODS OF MAKING AND USING <130> 67440-200734 <140> PCT/US2020/057247 <141> 2020-10-24 <150> 62/926,037 <151> 2019-10-25 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 tttttttttc cccccccc 18 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 tttttttttc ccccccc 17 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 aaaaaaaaaa aaaaaaa 17 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 tttttttccc ccccc 15

Claims (44)

  1. 핵산 링커를 통해 컨쥬게이트 성분(conjugate component)에 연결된 결합 분자를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트(bioconjugate)로서;
    선택적으로는, 상기 핵산 링커는 이중-가닥 세그먼트를 포함하는;
    선택적으로는, 상기 핵산 링커는 완전히 이중-가닥인, 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 컨쥬게이트 성분은 핵산을 포함하고, 핵산 링커는 컨쥬게이트 성분의 핵산 가닥의 연장부를 포함하는;
    선택적으로는, 상기 컨쥬게이트 성분의 핵산은 길이가 핵산 링커를 포함하지 않고, 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 175, 200, 300, 또는 400개의 뉴클레오티드, 또는 그 사이의 임의의 범위인;
    선택적으로는, 상기 컨쥬게이트 성분의 핵산은 3차 및/또는 4차 구조를 갖는, 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 결합 분자는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체, 펩티드, 재조합체, 천연 또는 조작된 수용체/리간드 단백질, 압타머, 테트라머(T 세포 수용체 검출에 사용된 펩티드를 가진 폴딩된 MHC 단백질), 비항체 단백질 또는 항체 모방체, 예를 들어 아필린, 아피머, 아피틴, 알파바디, 아비머, 파이노머(fynomer), Kunitz 도메인 펩티드, 나노CLAMP, 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin: Designed Ankyrin Repeat Protein), 모노바디, 나노바디, 안티칼린, 아피바디 및 SOMA머인;
    선택적으로는, 상기 결합 분자는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체인;
    선택적으로는, 상기 결합 분자는 수용체 리간드인, 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 링커는 길이가 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50개의 뉴클레오티드 중 임의의 것 내지 길이가 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 또는 75개의 뉴클레오티드 중 임의의 것인;
    선택적으로는, 상기 컨쥬게이트 성분은 핵산을 포함하고, 핵산 링커의 길이는 컨쥬게이트 성분의 엣지로부터 결정되고, 컨쥬게이트 성분의 엣지는 4개의 뉴클레오티드보다 더 긴 임의의 단일-가닥 세그먼트의 말단인, 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 길이가 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50개의 뉴클레오티드 중 임의의 것 내지 길이가 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 또는 75개의 뉴클레오티드 중 임의의 것인, 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 이중-가닥 세그먼트는 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50개의 상보적 염기쌍 중 임의의 것 내지 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 또는 75개의 상보적 염기쌍 중 임의의 것을 포함하는;
    선택적으로는, 상기 이중-가닥 세그먼트의 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 98%는 상보적 염기쌍이거나, 이중-가닥 세그먼트는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개 이하의 불일치된 염기쌍을 갖는;
    선택적으로는, 상기 이중-가닥 세그먼트는 적어도 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적인 상보적 염기쌍, 또는 약 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50개의 연속적인 상보적 염기쌍 중 임의의 것 내지 약 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 또는 75개의 연속적인 상보적 염기쌍 중 임의의 것을 포함하는;
    선택적으로는, 상기 이중-가닥 세그먼트의 100%는 상보적 염기쌍인, 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 한 가닥에서 폴리아데노신 서열(polyA) 및 다른 가닥에서 폴리티미딘 서열(polyT)을 포함하거나;
    상기 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 한 가닥에서 폴리시토신 서열(polyC) 및 다른 가닥에서 폴리구아니딘 서열(polyG)을 포함하거나;
    상기 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 한 가닥에서 polyA 및 polyC 서열 및 다른 가닥에서 polyT 및 polyG 서열을 포함하거나;
    상기 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 한 가닥에서 polyA 및 polyG 서열 및 다른 가닥에서 polyT 및 polyC 서열을 포함하는;
    선택적으로는, 상기 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 한 가닥에서 폴리아데노신 서열(polyA) 및 다른 가닥에서 폴리티미딘 서열(polyT)로 이루어지거나;
    선택적으로는, 상기 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 한 가닥에서 폴리시토신 서열(polyC) 및 다른 가닥에서 폴리구아니딘 서열(polyG)로 이루어진, 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨쥬게이트 성분은 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체, 핵산, 압타머, 단백질, 염료 또는 라벨, 소분자, 치료적 펩티드, 수용체 리간드, 약학적 활성제, 또는 올리고뉴클레오티드-기반 형광 라벨인, 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨쥬게이트 성분은 올리고뉴클레오티드-기반 형광 라벨인, 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 분자의 라벨링-의-정도(DoL: degree-of-labeling)는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11, 또는 끝점들을 포함해 그 사이의 임의의 범위이고/이거나;
    상기 결합 분자의 라벨링-의-정도(DoL)는 핵산의 이용가능성을 통해 화학양론적으로 제어되고/되거나;
    상기 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 상 핵산의 라벨링-의-정도(DoL)는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11, 또는 끝점들을 포함해 그 사이의 임의의 범위이고, 컨쥬게이트 성분의 DoL과 무관한, 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오컨쥬게이트는 유세포분석, 항체 스크리닝, ELISA 또는 기타 샌드위치 어세이, 면역 모니터링, 바이오마커 어세이, 측방 유동(lateral flow), 현장진료(point-of-care)/신속 진단, 이미징, 현미경, 분자 진단, 차세대 시퀀싱, 긴 판독 시퀀싱, 인 시튜(in situ) 시퀀싱, 폴리머라아제 연쇄 반응, 마이크로어레이, 핵산 시퀀싱, 아미노산 시퀀싱, 디지털 병리학, 써던 블롯팅, 노던 블롯팅, 웨스턴 블롯팅 또는 예방 및/또는 치료적 목적 중 하나 이상을 위해 세포, 조직 및/또는 기관을 특이적으로 라벨링하는데 사용될 수 있는, 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 링커는 고유의 식별 서열을 포함하는;
    선택적으로는, 상기 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 고유의 식별 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트.
  13. 제12항에 있어서, 상기 고유의 식별 서열은 핵산 증폭 및/또는 차세대 시퀀싱에 사용될 수 있는, 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 링커는 다운스트림 시퀀싱 적용에서 이것이 필터링되게 할 수 있게 하는 서열을 포함하고/하거나;
    상기 핵산 링커는 제3 생체 분자에 의한 특이적 결합 및/또는 효소적 절단(예를 들어, CRISPR, 징크-핑거 뉴클레아제, 제한 효소)을 통한 표적화된 유전자 편집을 위한 서열을 포함하고/하거나;
    상기 핵산 링커는 효소 또는 결합 활성을 가능하게 하는 2개 이상의 고유의 서열을 포함하고/하거나;
    상기 효소 또는 결합 활성을 가능하게 하는 고유의 서열은 이중-가닥 세그먼트에 존재하는, 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 링커는 (i) 결합 분자에 부착된 부분, (ii) 컨쥬게이트 성분의 연장부 또는 이에 부착된 부분, 및 (iii) (i) 또는 (ii)가 아닌 적어도 하나의 추가적인 부분을 포함하는;
    선택적으로는, (iii)은 컨쥬게이트 성분의 연장부 또는 이에 부착된, 또는 추가적인 컨쥬게이트 성분의 연장부 또는 이에 부착된 제2 부분일 수도 있는, 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트.
  16. 핵산 링커를 통해 컨쥬게이트 성분에 연결된 비드를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트로서;
    선택적으로는, 상기 핵산 링커는 이중-가닥 세그먼트를 포함하는;
    선택적으로는, 상기 핵산 링커는 완전히 이중-가닥인, 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트.
  17. 제16항에 있어서, 상기 컨쥬게이트 성분은 핵산을 포함하고, 핵산 링커는 컨쥬게이트 성분의 핵산 가닥의 연장부를 포함하는;
    선택적으로는, 상기 컨쥬게이트 성분의 핵산은 길이가 핵산 링커를 포함하지 않고, 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 175, 200, 300, 또는 400개의 뉴클레오티드, 또는 그 사이의 임의의 범위인;
    선택적으로는, 상기 컨쥬게이트 성분의 핵산은 3차 및/또는 4차 구조를 갖는, 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 핵산 링커는 길이가 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50개의 뉴클레오티드 중 임의의 것 내지 길이가 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 또는 75개의 뉴클레오티드 중 임의의 것인;
    선택적으로는, 상기 컨쥬게이트 성분은 핵산을 포함하고, 핵산 링커의 길이는 컨쥬게이트 성분의 엣지로부터 결정되고, 컨쥬게이트 성분의 엣지는 4개의 뉴클레오티드보다 더 긴 임의의 단일-가닥 세그먼트의 말단인, 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트.
  19. 제18항에 있어서, 상기 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 길이가 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50개의 뉴클레오티드 중 임의의 것 내지 길이가 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 또는 75개의 뉴클레오티드 중 임의의 것인, 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트.
  20. 제19항에 있어서, 상기 이중-가닥 세그먼트는 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50개의 상보적 염기쌍 중 임의의 것 내지 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 또는 75개의 상보적 염기쌍 중 임의의 것을 포함하는;
    선택적으로는, 상기 이중-가닥 세그먼트의 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 98%는 상보적 염기쌍이거나, 이중-가닥 세그먼트는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개 이하의 불일치된 염기쌍을 갖는;
    선택적으로는, 상기 이중-가닥 세그먼트는 적어도 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속적인 상보적 염기쌍, 또는 약 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50개의 연속적인 상보적 염기쌍 중 임의의 것 내지 약 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 또는 75개의 연속적인 상보적 염기쌍 중 임의의 것을 포함하는;
    선택적으로는, 상기 이중-가닥 세그먼트의 100%는 상보적 염기쌍인, 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 한 가닥에서 폴리아데노신 서열(polyA) 및 다른 가닥에서 폴리티미딘 서열(polyT)을 포함하거나;
    상기 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 한 가닥에서 폴리시토신 서열(polyC) 및 다른 가닥에서 폴리구아니딘 서열(polyG)을 포함하거나;
    상기 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 한 가닥에서 polyA 및 polyC 서열 및 다른 가닥에서 polyT 및 polyG 서열을 포함하거나;
    상기 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 한 가닥에서 polyA 및 polyG 서열 및 다른 가닥에서 polyT 및 polyC 서열을 포함하는;
    선택적으로는, 상기 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 한 가닥에서 폴리아데노신 서열(polyA) 및 다른 가닥에서 폴리티미딘 서열(polyT)로 이루어지거나;
    선택적으로는, 상기 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 한 가닥에서 폴리시토신 서열(polyC) 및 다른 가닥에서 폴리구아니딘 서열(polyG)로 이루어진, 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트.
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨쥬게이트 성분은 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체, 핵산, 압타머, 단백질, 염료 또는 라벨, 소분자, 치료적 펩티드, 수용체 리간드, 약학적 활성제, 또는 올리고뉴클레오티드-기반 형광 라벨인, 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트.
  23. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨쥬게이트 성분은 올리고뉴클레오티드-기반 형광 라벨인, 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비드의 DoL은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11, 또는 끝점들을 포함해 그 사이의 임의의 범위이고/이거나;
    상기 비드의 DoL은 100, 1,000, 10,000, 100,000, 또는 1,000,000, 또는 끝점들을 포함해 그 사이의 임의의 범위이고/이거나;
    상기 비드의 라벨링-의-정도(DoL)는 핵산의 이용가능성을 통해 화학양론적으로 제어되고/되거나,
    상기 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 상 핵산의 라벨링-의-정도(DoL)는 컨쥬게이트 성분의 DoL과 무관한, 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오컨쥬게이트는 유세포분석, 항체 스크리닝, ELISA 또는 기타 샌드위치 어세이, 면역 모니터링, 바이오마커 어세이, 측방 유동, 현장진료/신속 진단, 이미징, 현미경, 분자 진단, 차세대 시퀀싱, 긴 판독 시퀀싱, 인 시튜 시퀀싱, 폴리머라아제 연쇄 반응, 마이크로어레이, 핵산 시퀀싱, 아미노산 시퀀싱, 디지털 병리학, 써던 블롯팅, 노던 블롯팅, 웨스턴 블롯팅, 대조군과 같은 기준 샘플로서, 또는 기기, 어세이, 또는 시스템의 보정을 위해, 또는 예방 및/또는 치료 목적 중 하나 이상을 위해, 세포, 조직 및/또는 기관을 라벨링하는데 사용될 수 있는, 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트.
  26. 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 링커는 고유의 식별 서열을 포함하는;
    선택적으로는, 상기 핵산 링커의 이중-가닥 세그먼트는 고유의 식별 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트.
  27. 제26항에 있어서, 상기 고유의 식별 서열은 핵산 증폭 및/또는 차세대 시퀀싱에 사용될 수 있는, 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트.
  28. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 링커는 다운스트림 시퀀싱 적용에서 이것이 필터링되게 할 수 있게 하는 서열을 포함하고/하거나;
    상기 핵산 링커는 제3 생체 분자에 의한 특이적 결합 및/또는 효소적 절단(예를 들어, CRISPR, 징크-핑거 뉴클레아제, 제한 효소)을 통한 표적화된 유전자 편집을 위한 서열을 포함하고/하거나;
    상기 핵산 링커는 효소 또는 결합 활성을 가능하게 하는 2개 이상의 고유의 서열을 포함하고/하거나;
    상기 효소 또는 결합 활성을 가능하게 하는 고유의 서열은 이중-가닥 세그먼트에 존재하는, 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트.
  29. 제16항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 링커는 (i) 비드에 부착된 부분, (ii) 컨쥬게이트 성분의 연장부 또는 이에 부착된 부분, 및 (iii) (i) 또는 (ii)이 아닌 적어도 하나의 추가적인 부분을 포함하는;
    선택적으로는, (iii)은 컨쥬게이트 성분의 연장부 또는 이에 부착된, 또는 추가적인 컨쥬게이트 성분의 연장부 또는 이에 부착된 제2 부분일 수도 있는, 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트.
  30. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트 또는 제16항 내지 제29항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
    (i) 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된, 결합 분자 또는 비드인 기질을, 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉시키는 단계를 포함하고,
    상기 기질의 단일 가닥 링커 서열의 적어도 일부는 컨쥬게이트 성분의 단일-가닥 링커 서열의 일부와 상보적이고, 접촉시, 기질의 핵산 링커 및 컨쥬게이트 성분의 핵산 링커는 어닐링하여 기질을 컨쥬게이트 성분에 연결하는 적어도 부분적으로 이중-가닥 링커를 형성하는;
    선택적으로는, 상기 폴리뉴클레오티드-변형된 기질 및 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분을 접촉시키기 이전에, 상기 방법은 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를 기질에 부착하여 폴리뉴클레오티드-변형된 기질을 형성하는 단계를 포함하고/하거나;
    선택적으로는, 상기 폴리뉴클레오티드-변형된 기질 및 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분을 접촉시키기 이전에, 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를 컨쥬게이트 성분에 부착하여 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분을 형성하거나;
    (ii) 결합 분자 또는 비드인 기질을 컨쥬게이트 성분과 접촉시키고, 기질에 핵산 링커를 부착하고, 동일 핵산 링커를 컨쥬게이트 성분에 부착하여 폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트를 형성하는 단계를 포함하고,
    선택적으로는, 상기 핵산 링커는 이중 가닥 세그먼트를 포함하거나 핵산 링커는 완전히 이중 가닥이고, 상기 방법은 기질에 및 컨쥬게이트 성분에 부착하기 전에 핵산 가닥들을 하이브리드화하여 적어도 부분적으로 이중 가닥 핵산 링커를 형성하는 단계를 포함하거나;
    (iii) 핵산 링커를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분을, 결합 분자 또는 비드인 기질과 접촉시키고, 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분의 핵산 링커를 기질에 부착하여 폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트를 형성하는 단계를 포함하고,
    선택적으로는, 상기 핵산 링커는 이중 가닥 세그먼트를 포함하거나 핵산 링커는 완전히 이중 가닥이고, 상기 방법은 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트의 핵산 링커를 기질에 부착하여 폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트를 형성하기 이전에, 핵산 가닥들을 하이브리드화하여 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분 상 적어도 부분적으로 이중-가닥 핵산 링커를 형성하는 단계를 포함하거나;
    (iv) 핵산 링커를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된, 결합 분자 또는 비드인 기질을, 컨쥬게이트 성분과 접촉시키고, 폴리뉴클레오티드-변형된 기질의 핵산 링커를 컨쥬게이트 성분에 부착하여 폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트를 형성하는 단계를 포함하고,
    선택적으로는, 상기 핵산 링커는 이중 가닥 세그먼트를 포함하거나 핵산 링커는 완전히 이중 가닥이고, 상기 방법은 폴리뉴클레오티드-변형된 기질의 핵산 링커를 컨쥬게이트 성분에 부착하여 폴리뉴클레오티드-변형된 바이오컨쥬게이트를 형성하기 이전에, 핵산 가닥들을 하이브리드화하여 폴리뉴클레오티드-변형된 기질 상 적어도 부분적으로 이중-가닥 핵산 링커를 형성하는 단계를 포함하거나; 또는
    (v) (i) 적어도 부분적으로 단일 가닥 핵산 링커를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된, 결합 분자 또는 비드인 기질, (ii) 적어도 부분적으로 단일 가닥 핵산 링커를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분, 및 (iii) (i) 또는 (ii)의 핵산 링커가 아닌 추가의 적어도 부분적으로 단일 가닥 핵산 링커 세그먼트를 접촉시키고,
    상기 기질의 단일 가닥 링커 서열의 적어도 일부는 추가의 핵산 링커 세그먼트의 단일 가닥 부분 (iii)과 상보적이고/이거나, 컨쥬게이트 성분의 단일 가닥 링커 서열의 적어도 일부는 추가의 핵산 링커 세그먼트의 단일 가닥 부분 (iii)과 상보적이고, 접촉시, 기질의 핵산 링커, 컨쥬게이트의 핵산 링커 및 추가의 핵산 링커 세그먼트는 어닐링되어, 기질을 컨쥬게이트 성분에 연결하는 적어도 부분적으로 이중 가닥 링커를 형성하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드-변형된 기질의 단일-가닥 핵산 링커는 polyA 서열을 포함하고, 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분의 단일-가닥 핵산 링커는 polyT 서열을 포함하거나;
    상기 폴리뉴클레오티드-변형된 기질의 단일-가닥 핵산 링커는 polyT 서열을 포함하고, 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분의 단일-가닥 핵산 링커는 polyA 서열을 포함하거나;
    상기 폴리뉴클레오티드-변형된 기질의 단일-가닥 핵산 링커는 polyC 서열을 포함하고, 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분의 단일-가닥 핵산 링커는 polyG 서열을 포함하거나;
    상기 폴리뉴클레오티드-변형된 기질의 단일-가닥 핵산 링커는 polyG 서열을 포함하고, 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분의 단일-가닥 핵산 링커는 polyC 서열을 포함하거나;
    상기 폴리뉴클레오티드-변형된 기질의 단일-가닥 핵산 링커는 polyC 서열 및 polyA 및/또는 polyT 서열을 포함하고, 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분의 단일-가닥 핵산 링커는 polyG 서열 및 polyA 및/또는 polyT 서열을 포함하거나;
    상기 폴리뉴클레오티드-변형된 기질의 단일-가닥 핵산 링커는 polyG 서열 및 polyA 및/또는 polyT 서열을 포함하고, 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분의 단일-가닥 핵산 링커는 polyC 서열 및 polyA 및/또는 polyT 서열을 포함하는, 방법.
  32. 동일 결합 분자의 별개의 결합-분자 분자들은 상이한 컨쥬게이트 성분으로 라벨링되는, 검출을 위한 라벨링된 결합 분자의 고속(high-rate) 제조 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를, 동일 결합 분자의 적어도 2개의 별개의 결합-분자 분자에 부착시켜 복수개의 폴리뉴클레오티드-변형된 결합-분자 분자를 제조하는 단계; 및
    (b) 복수개의 적어도 한 폴리뉴클레오티드-변형된 결합-분자 분자를 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 제1의 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉하고, 복수개의 적어도 하나의 상이한 폴리뉴클레오티드-변형된 결합-분자 분자를 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 제2의 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉하는 단계로서, 제1 및 제2의 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분은 검출 라벨을 포함하고, 적어도 이들의 검출 라벨에서 상이한 단계를 포함하고,
    상기 결합-분자 분자의 핵산 링커의 단일-가닥 서열의 적어도 일부는 제1 및/또는 제2 컨쥬게이트 성분의 핵산 링커의 단일-가닥 서열과 상보적이고, 접촉시, 핵산 링커들은 어닐링하여 결합-분자 분자를 컨쥬게이트 성분에 연결하는 이중-가닥 링커를 형성하는;
    선택적으로는, 복수개의 하나 이상의 추가적인 폴리뉴클레오티드-변형된 결합-분자 분자는 상이한 검출 라벨을 가진 하나 이상의 추가적인 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉되는;
    선택적으로는, 복수개의 폴리뉴클레오티드-변형된 결합-분자 중 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10종이 각각 다른 것들과 상이한 검출 라벨을 가진 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉되는;
    선택적으로는, 결합 분자는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체이거나; 또는
    검출을 위한 라벨링된 결합 분자의 고속 제조 방법이 핵산 링커를 제30항에서와 같이 결합 분자, 컨쥬게이트 성분 또는 결합 분자와 컨쥬게이트 성분 모두에 직접적으로 부착함으로써 수행되고/되거나, 검출을 위한 라벨링된 결합 분자의 고속 제조가 제30항에서와 같이 추가적인 핵산 링커 세그먼트를 이용하여 수행되고,
    상기 동일 결합 분자의 별개의 결합-분자 분자들은 상이한 컨쥬게이트 성분들로 라벨링되는;
    선택적으로는, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10종의 별개의 결합-분자 분자들은 각각 다른 것들과 상이한 검출 라벨을 가진 컨쥬게이트 성분으로 라벨링되는;
    선택적으로는, 결합 분자는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 각 구획 내 고유하게 라벨링된 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉시키기 위해, 개별 구획 내로 복수개의 폴리뉴클레오티드-변형된 결합-분자 분자를 분취하여, 동일 결합 분자의 상이하게-라벨링된 결합-분자 분자를 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 복수개의 결합-분자 분자의 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커는 폴리뉴클레오티드-변형된 결합-분자 분자 모두에 대해서 동일하고, 컨쥬게이트 성분의 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커는 모든 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트-성분에 대해서 동일한, 방법.
  35. 상이한 결합 분자들이 동일한 컨쥬게이트 성분으로 라벨링되는, 검출을 위한 라벨링된 결합 분자의 고속 제조 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를 적어도 2개의 상이한 결합 분자에 부착하여 적어도 2개의 상이한 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자를 생성하는 단계; 및
    (b) 적어도 2개의 상이한 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자를 검출 라벨을 포함하고 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉시키는 단계를 포함하고,
    상기 결합 분자의 핵산 링커의 단일-가닥 서열의 적어도 일부는 컨쥬게이트 성분의 핵산 링커의 단일-가닥 서열과 상보적이고, 접촉시, 핵산 링커들은 어닐링하여 결합 분자를 컨쥬게이트 성분에 연결하는 이중-가닥 링커를 형성하는;
    선택적으로는, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상의 추가적인 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자는 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉되는;
    선택적으로는, 결합 분자의 하나 이상은 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체이거나; 또는
    검출을 위한 라벨링된 결합 분자의 고속 제조 방법은 핵산 링커를 제30항에서와 같이 결합 분자, 컨쥬게이트 성분 또는 결합 분자와 컨쥬게이트 성분 모두에 직접적으로 부착함으로써 수행되고/되거나, 검출을 위한 라벨링된 결합 분자의 고속 제조는 제30항에서와 같이 추가적인 핵산 링커 세그먼트를 통합하여 수행되는;
    선택적으로는, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상의 추가적인 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자는 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉되는;
    선택적으로는, 결합 분자는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 각 구획 내 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분과 접촉하기 위해 상이한 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자를 각 유형의 결합 분자를 위한 별개의 구획으로 분취하여, 동일 라벨로 라벨링된 상이한 결합 분자를 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 상이한 결합 분자의 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커는 모든 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자에 대해 동일하고, 단일의 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 서열은 폴리뉴클레오티드-변형된 컨쥬게이트 성분의 핵산 링커로서 이용되는, 방법.
  38. 검출을 위한 라벨링된 결합 분자 또는 결한 분자들의 고속 제조 방법으로서, 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항의 방법 및 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항의 방법을 조합하는 단계를 포함하는, 방법.
  39. 조성물로서,
    (i)(a) 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는, 결합 분자 또는 비드인 기질, 및
    (i)(b) 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 컨쥬게이트 성분을 포함하며,
    여기서, 상기 기질의 핵산 링커의 단일-가닥 서열의 적어도 충분한 부분이 컨쥬게이트 성분의 핵산 링커의 단일-가닥 서열의 일부와 상보적이어서, 링커들이 어닐링하고 기질을 컨쥬게이트 성분에 연결하는 적어도 부분적으로 이중-가닥 링커를 형성하게 되거나;
    (ii)(a) 핵산 링커를 포함하는, 결합 분자 또는 비드인, 기질, 및
    (ii)(b) 기질을 컨쥬게이트 성분에 연결하도록 핵산 링커에 부착할 수 있는 컨쥬게이트 성분을 포함하거나;
    (iii)(a) 핵산 링커를 포함하는 컨쥬게이트 성분,
    (iii)(b) 컨쥬게이트 성분을 기질에 연결하도록 핵산 링커와 부착할 수 있는 기질을 포함하거나;
    (iv)(a) 핵산 링커와 부착할 수 있는, 결합 분자 또는 비드인, 기질, 및 핵산 링커와 부착할 수 있는 컨쥬게이트 성분, 및
    (iv)(b)단일 가닥인, 이중-가닥 세그먼트를 포함하는 핵산 링커, 또는 완전히 이중 가닥인 핵산 링커를 포함하거나;
    (v)(a) 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는, 결합 분자 또는 비드인, 기질,
    (v)(b) 적어도 부분적으로 단일-가닥 핵산 링커를 포함하는 컨쥬게이트 성분; 및
    (v)(c) 추가의 핵산 링커 세그먼트를 포함하고,
    여기서, (v)(a), (v)(b), 및 (v)(c)는 어닐링하여 (v)(a), (v)(b), 및 (v)(c)를 포함하고, (v)(a)를 (v)(b)에 연결하는 적어도 부분적으로 이중-가닥 핵산 링커를 형성할 수 있는, 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트 또는 제16항 내지 제29항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트를 생성할 수 있는, 조성물.
  41. 세포, 조직 및/또는 기관을 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트와 접촉하는 단계를 포함하는, 세포, 조직 및/또는 기관의 라벨링 방법으로서, 상기 바이오컨쥬게이트의 결합 분자 부분은 세포, 조직 및/또는 기관의 항원, 에피토프 및/또는 합텐에 결합하고, 바이오컨쥬게이트의 컨쥬게이트 성분 부분은 검출가능한 라벨을 포함하는;
    선택적으로는, 상기 바이오컨쥬게이트의 결합 분자 부분은 세포, 조직 및/또는 기관의 항원, 에피토프 및/또는 합텐을 특이적으로 인식하고 특이적으로 결합하거나;
    선택적으로는, 상기 라벨은 시각적 검출을 위한 라벨이거나,
    선택적으로는, 상기 라벨링된 세포는 유세포분석, 항체 스크리닝, ELISA 또는 기타 샌드위치 어세이, 면역 모니터링, 바이오마커 어세이, 측방 유동, 현장진료/신속 진단, 이미징, 현미경, 분자 진단, 차세대 시퀀싱, 긴 판독 시퀀싱, 인 시튜 시퀀싱, 폴리머라아제 연쇄 반응, 마이크로어레이, 핵산 시퀀싱, 아미노산 시퀀싱, 디지털 병리학, 써던 블롯팅, 노던 블롯팅, 웨스턴 블롯팅, 대조군과 같은 기준 샘플로서, 또는 기기, 어세이, 또는 시스템의 보정을 위해, 또는 예방 및/또는 치료 목적 중 하나 이상을 위해 사용될 수 있거나;
    선택적으로는, 상기 라벨은 세포막을 위한 라벨이거나,
    선택적으로는, 상기 라벨은 세포 생명력에 대한 라벨이거나,
    선택적으로는, 상기 라벨은 게놈 물질을 표적으로 하는 특이적 라벨인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 라벨링된 세포는 유세포분석에 사용되는, 방법.
  43. 라벨링된 세포, 조직 및/또는 기관으로부터 신호를 정량적으로 측정하는 방법으로서, 상기 방법은,
    (a) 세포, 조직 및/또는 기관을 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트와 접촉하는 단계로서, 여기서 상기 바이오컨쥬게이트의 결합 분자 부분은 세포, 조직 및/또는 기관의 항원, 에피토프, 막, 게놈 물질 및/또는 합텐에 결합하고, 바이오컨쥬게이트의 컨쥬게이트 성분 부분은 검출가능한 라벨을 포함하는 단계; 및
    (b) 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트의 존재를 측정하고, 여기서 결합 분자의 DoL은 공지되어 있어, 정량적 측정이 가능한 단계를 포함하는;
    선택적으로는, 결합 분자의 라벨링-의-정도(DoL)는 핵산의 이용가능성을 통해 화학양론적으로 제어되고/되거나;
    선택적으로는, 결합 분자의 DoL은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11, 또는 끝점들을 포함해 그 사이의 임의의 범위이고/이거나;
    선택적으로는, 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 상 핵산의 라벨링-의-정도(DoL)는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11, 또는 끝점들을 포함해 그 사이의 임의의 범위이고, 컨쥬게이트 성분의 DoL과 무관하고/하거나;
    선택적으로는, 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 상 핵산의 라벨링-의-정도(DoL)는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11, 또는 끝점들을 포함해 그 사이의 임의의 범위이고, 컨쥬게이트 성분의 DoL과 무관한, 방법.
  44. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드-변형된 결합 분자 바이오컨쥬게이트를 제조하거나, 제16항 내지 제29항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드-변형된 비드 바이오컨쥬게이트를 제조하거나, 제39항 또는 제40항의 조성물을 제조하거나, 선행 청구항의 임의의 방법을 수행하는데 필수적인 하나 이상의 성분들을 포함하는 키트로서;
    선택적으로는, 상기 키트는 프린트되고/거나 전자 저장 매체 상의 지침서, 버퍼 및/또는 추가 시약, 및/또는 포장 재료를 추가로 포함하는, 키트.
KR1020227015133A 2019-10-25 2020-10-24 폴리뉴클레오티드-연결된 바이오컨쥬게이트 및 제조 및 이용 방법 KR20220088437A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962926037P 2019-10-25 2019-10-25
US62/926,037 2019-10-25
PCT/US2020/057247 WO2021081466A1 (en) 2019-10-25 2020-10-24 Polynucleotide-linked bioconjugates and methods of making and using

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220088437A true KR20220088437A (ko) 2022-06-27

Family

ID=75620294

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227015133A KR20220088437A (ko) 2019-10-25 2020-10-24 폴리뉴클레오티드-연결된 바이오컨쥬게이트 및 제조 및 이용 방법

Country Status (7)

Country Link
US (2) US20220218841A1 (ko)
EP (1) EP4048313A4 (ko)
JP (1) JP2022553737A (ko)
KR (1) KR20220088437A (ko)
CN (1) CN114555125A (ko)
AU (1) AU2020370590A1 (ko)
WO (1) WO2021081466A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023101352A1 (ko) 2021-12-01 2023-06-08 주식회사 엘지에너지솔루션 원통형 배터리 및 이에 적용되는 집전체, 그리고 이러한 원통형 배터리를 포함하는 배터리 팩 및 자동차

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1816192B1 (en) * 2004-10-15 2012-12-12 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology LINKER FOR CONSTRUCTING mRNA-PUROMYCIN-PROTEIN CONJUGATE
US7494776B2 (en) * 2005-07-07 2009-02-24 Beckman Coulter, Inc. Labeled complementary oligonucleotides to detect oligonucleotide-linked ligands
JP2007275006A (ja) * 2006-04-10 2007-10-25 Hitachi High-Technologies Corp 核酸検出用プローブ作製法
US8946289B2 (en) * 2008-11-19 2015-02-03 Duke University Manassatin compounds and methods of making and using the same
CN102947703A (zh) * 2010-06-17 2013-02-27 皇家飞利浦电子股份有限公司 多表位测定
US8946389B2 (en) * 2011-04-25 2015-02-03 University Of Washington Compositions and methods for multiplex biomarker profiling
WO2013177046A1 (en) * 2012-05-21 2013-11-28 Solulink, Inc. Methods and/or use of oligonucleotide conjugates for suppressing background due to cross-hybridization
WO2013188756A1 (en) * 2012-06-15 2013-12-19 The University Of Chicago Oligonucleotide-mediated quantitative multiplexed immunoassays
WO2016100401A1 (en) * 2014-12-15 2016-06-23 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Ligand-modified double-stranded nucleic acids
CN108291257B (zh) * 2015-09-24 2023-12-29 阿布维特罗有限责任公司 亲和-寡核苷酸缀合物及其用途
EP3490616B1 (en) * 2016-07-27 2022-09-28 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Highly-multiplexed fluorescent imaging
EP3642629A1 (en) * 2017-06-21 2020-04-29 Dynamic Biosensors GmbH Method for detecting and/or characterizing the interaction between proteins and small molecules

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023101352A1 (ko) 2021-12-01 2023-06-08 주식회사 엘지에너지솔루션 원통형 배터리 및 이에 적용되는 집전체, 그리고 이러한 원통형 배터리를 포함하는 배터리 팩 및 자동차

Also Published As

Publication number Publication date
EP4048313A1 (en) 2022-08-31
EP4048313A4 (en) 2023-05-31
JP2022553737A (ja) 2022-12-26
WO2021081466A1 (en) 2021-04-29
US20220168441A1 (en) 2022-06-02
AU2020370590A1 (en) 2022-04-14
CN114555125A (zh) 2022-05-27
US20220218841A1 (en) 2022-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102608653B1 (ko) 절편화된 조직의 사용자-한정된 영역에서의 유전자 발현의 동시적인 정량화
JP6920997B2 (ja) マイクロスクリーニング装置、プロセス、及び生成物
JP5860922B2 (ja) ビーズまたは他の捕捉物を用いた分子または粒子の超高感度検出
Wang et al. Recent advances in single extracellular vesicle detection methods
JP4511363B2 (ja) 相互作用する分子を検出するためのｆｒｅｔプローブおよび方法
JP2009540326A (ja) 結合及び非結合ラベルの測定による検体検出の増加した特異性
CN101346626A (zh) 用于测定具有生物来源和复杂组成的样品中一种或多种分析物的方法及其用途
CN103534359A (zh) 分析染色体易位的方法及其系统
CN101443461A (zh) Se(r)rs置换检测
JP2021523388A (ja) ターゲット物質の検出方法及びキット
KR20190108023A (ko) 초고감도 바이오마커 다중 검출 방법
US20220218841A1 (en) Polynucleotide-linked bioconjugates and methods of making and using
JP4594733B2 (ja) 腫瘍特異的融合蛋白質の検出のための方法およびプローブ
US20210230676A1 (en) Sequential Staining for Multiplex Analyses of Tissues and Cells
JP2018537071A (ja) 固定化された核酸を使用して分子相互作用を検出するための方法
KR101270094B1 (ko) Ｃｍｏｓ 기반 세포 이미징 분석 시스템
WO2021070884A1 (ja) 試料中の被検出物質を検出する方法
AU2539000A (en) Test system for detecting different markers, and production and use thereof
US20240002911A1 (en) Methods Of Signal Amplification
CN116457471A (zh) 信号放大方法
US20220155311A1 (en) Multiplexed Imaging with Nanobody Probes
EP4259821A1 (en) Method and composition for multiplexed and multimodal single cell analysis
CN116829728A (zh) 用于多重和多模式单细胞分析的方法和组合物
JP2022094219A (ja) 試料中の被検出物質を検出する方法
EP4323771A1 (en) Nucleic acid origami platforms and their uses