KR20130121915A - 미생물의 검출 및 정량방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 미생물에 대해 특이적인 적어도 하나의 리간드 및 상기 리간드보다 상기 미생물에 대해 낮은 친화도를 갖는 적어도 하나의 센서의 존재하의 액체 배지에서, 상기 리간드에 대한 화합물의 결합은 제1 측정가능한 신호를 생산하고, 상기 센서에 대한 화합물의 결합은 제2 측정가능한 신호를 생산하는 시료를 배양하는 단계; 적어도 하나의 배양 시간에 대해 제1 및 제2 신호의 값을 결정하는 단계를 포함하며; 여기서 상기 제1 신호 및 제2 신호의 값이 동일한 배양 시간에 대해 다른 경우, 상기 시료가 상기 미생물을 포함하는 것으로 추정하는 시료에서 적어도 하나의 미생물 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

미생물의 검출 및 정량방법 {METHOD FOR DETECTING AND QUANTIFYING MICROORGANISMS}
본 발명은 시료 (sample)에서 미생물을 검출 (detecting) 및 정량 (quantifying)하기 위한 방법에 관한 것이다.
특정 시료에서 살아있는 미생물을 검출하는 것은 특히 의료분야 및 식품-가공 산업에서 매우 중요하다.
검사되는 미생물을 동정 (identify)하기에 충분한 숫자의 미생물을 얻기 위해 종종 수일이 요구되는 미생물 배양에 여전히 표준적인 검출방법이 사용된다. 환자로부터 채취된 시료를 이용하여 검사하는 경우, 이러한 결과 획득에 대한 지연은 종종 환자에게 광범위한 효능을 지닌 예방 항생제 (broad-spectrum preventive antibiotic)를 투여해야 한다는 것을 의미한다. 병원성 (pathogenic) 박테리아의 경우, 항생제-내성 (antibiotic-resistant) 균주 (strains)의 수적 증가는 특정 세균이 아닌 기타 다수의 세균 종들 (bacterial species)을 목표로 하는 이러한 처방 프로토콜 (medication protocol)에 따른 가능한 결과이다.
세균학적 진단 (Bacteriological diagnosis)은 전통적으로 두 단계로 수행된다:
-일반적으로 고체 배지 상에서, 충분한 숫자를 갖고 대상 (suspect) 박테리아를 분리 (isolate)하기 위하여 박테리아를 성장시키는 제1 기 (first phase); 이 단계에서, 고체 배양 배지 상에서, 군집의 형태 연구는 박테리아의 예비적인 동정 (identification)을 가능하게 한다; 또한, 이 단계는 종종 배양 배지 (culture medium)의 산성화 (acidification) 또는 예를 들어 광산란 (light scattering)에 의한 상기 배지의 광학적 특성 (optical properties)의 변이 (variations)에 기초하여, 액체 배지 (liquid medium)에서 배양함으로써 시료 내에 박테리아의 존재가능성에 대한 아이디어를 제공하는 박테리아의 비-특이적인 검출과 결합 된다.
-선택 배지 (selective medium)에서의 성장 (growth)에 의해 박테리아를 동정하고 이어서, 가장 광범위한 특징으로부터 가장 정확한 것에 이르는 범위를 갖는 이분법 키 (dichotomous key)에 따라 특정한 박테리아 종을 결론짓도록 생화학적 및 면역학적 특징을 연구하는 제2 기 (second phase).
의학적 응용 (medical applications)에 있어서, 종종 치료적 처치 (therapeutic treatment) 전에 추가적인 단계가 요구된다; 이는 약전 (pharmacopeia)에 있는 다양한 항생제에 대한 박테리아의 내성 수준 (level of resistance)을 검사하기 위하여 안티바이오그램 (antibiogram)를 수행하는 것이다.
이 방법은 특정 박테리아 종에 있어서, 시각적 동정 전에 적어도 24 시간의 성장 및 최대 수일의 배양이 요구된다. 어느 경우라도, 분석에 요구되는 시간의 길이가 결정적 (crucial)이며, 농축 (enrichment) 및 분석 단계는 매우 길다 (일일 내지 수일).
이러한 지연을 감소시키기 위하여, 박테리아 성장을 검출하기 위한 더 빠른 생체 외 (in vitro) 방법이 개발되었다. 그러나, 이러한 모든 접근은 우선, 시료에 존재하는 박테리아의 수를 증가시키기 위한 배양기 (culture phase) 및 그 후 적어도 하나의 동정 (identification) 및 특징화 (characterization) 단계를 수반하는 다단계 시스템에 기반하고 있다.
최근에 박테리아 성장을 관찰 (monitoring)하기 위한, 예를 들어 Becton-Dickinson사의 Bactec 9000 및 BioMerieux사의 BcaT/Alter와 같은 자동화된 장치가 시장에 소개되었다. 이러한 자동화된 장치는 박테리아 증식 (proliferation) 중에 발산되는 CO2의 분석 (assaying) 에 기초하여 작동한다. 혈액 배양을 위한 이러한 자동화된 장치의 사용은, 특히 혈액을 배양하는 동안 검사 민감도 (test sensitivity)를 증가시키고, 결과적으로 응답 시간 (response times)을 감소시키는 것을 가능하게 하였다 (Lamy et al . (2005) Biotribune 16:37-39; Croizet et al . (2007) Spectra Biologie 160:45-51). 그러나, 이와 같은 자동화된 장치가 박테리아의 속 (genus) 및 종 (species)을 구체적으로 동정 (identify) 가능하게 하는 것은 아니다.
더욱 최근에, Accelr8사는 화학적으로 기능화된 (chemically functionalized) 중합체 (polymer) 표면상으로 박테리아를 비특이적으로 흡착하는 미세유체 농도 장치(microfluidic concentration device)를 출시했다. 이 경우, 미생물 성장의 검출 (detection)이 상기 미생물의 동정 (identification)에 선행된다. 사실, 박테리아는 우선 지지체 (support) 상에서 증산 (multiplied)되고, 면역형광법 (immunofluorescence method) 및 뒤따르는 현미경 분석에 의해 동정 된다. 이러한 방법은 배양 및 그 후의 검출의 두 단계가 연속적으로 수행되므로 여전히 상대적으로 수고스럽다는 점에 특히 주목해야 한다.
관련된 광학 시스템을 이용하여 이들을 검출하기 위한 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 포자 (spores) 농축 (concentrating)용 전기적 펄스 시스템을 수반하는 상당히 유사한 방법이 Zourob 등에 의하여 개발되었다 ((2005) Lab Chip 5:1350-1365). 이러한 방법은 어떠한 배양도 수반하지 않으며 시료에 존재하는 포자를 직접적으로 검출한다. 그러나, 이는 상당히 복잡한 마이크로시스템을 필요로 한다.
전기화학적 검출방법을 이용하는 기술들이 또한 제안되었다. 가장 효율적인 것은 임페디메트릭 원리 (impedimetric principles)에 기초한다 (Yang et al. (2004) Anal . Chem . 76:1107-13; Huang et al. (2010) Biosensors & Bioelectronics 25:1204-11). 이들 방법은 종종 프로브 (probe)로서 산화환원 매개체 (redox mediator)의 사용을 수반한다. 이 경우, 분석 (assaying) 배지는 전형적으로 1 내지 10 mM의 농도로 사용되는 헥사-시아노페레이트 (hexa-cyanoferrate)인 상기 매개체로 보충되어야 한다. 상대적으로 고농도 (mM)인 이러한 유형의 화합물의 검출되어야할 미생물에 대한 영향이 제대로 이해되지 않았고 생물학적 배지 (biological medium)에 대한 장해의 원인 (source of interference)이 될 수도 있기 때문에 이는 중대한 결점을 남긴다.
트레이서가 없는 (Tracer-free) 광학 기술은 이론적으로 외인성 (exogenous) 화합물의 추가를 생략할 수 있고 따라서 더욱 직접적이다. 표면 플라즈몬 공명 (surface plasmon resonance, SPR) 기술이 Taylor 등에 의하여 박테리아 용해물 (bacterial lysates) 검출에 적용되었다 ((2006) Biosensors and Bioelectronics 22:752-758). 이 경우, 검출 전에 박테리아 용해 (bacterial lysis)가 선행되며 그 후, 특이적인 이차 항체 (specific secondary antibody)와의 결합에 의해 신호가 증폭된다. 104 내지 106 박테리아/ml의 검출 한계가 달성되었다. 따라서 이 방법은 이러한 임계치 (thresholds)에 도달하기 위하여 오염이 심한 (highly contaminated) 시료 또는 선행 배양 (prior culturing)을 필요로 한다. 더욱이, 박테리아 용해물 상에서 검출이 수행되는 점을 고려하면, 상기 방법은 살아있는 박테리아를 동정하기에는 적합하지 않다.
마지막으로, 마이크로-캔틸레버 (micro-cantilevers)를 이용하여 아스퍼질러스 니거 (Aspergillus niger) 및 칸디다 알비칸스 (Candida albicans) 포자의 발아 (germination)를 검출 가능하게 하는 기타의 연구들이 보고되었다 (Nugaeva et al. (2007) Microsc . Microanal. 13:13-17; Nugaeva et al. (2005) Biosensors and Bioelectronics 21:849-856). 이러한 유형의 검출은 습한 챔버 (humid chamber)내의 공기 중에서 수행되며, 액체 배지 (liquid medium)에서는 수행될 수 없는 결점을 갖는다. 더욱이, 이는 미리 포획된 (previously captured) 곰팡이 포자 (fungal spores)의 발아를 검출하는 데에만 적용 가능하다.
미생물의 배양 및 리간드에 의한 미생물의 특이적 결합에 의해 생성되는 차등 신호 (differential signal)의 측정을 결합시키는, 즉 상기 배양 및 차등신호의 측정이 동시에 수행되는 본 발명자들에 의한 발견에 기초하는 본 발명은 통상적인 기술과 비교하여, 미생물 검출의 임계치 (threshold)를 낮추고 분석시간을 상당히 감소시키는 것을 가능하게 하였다.
이에 따라, 본 발명은 시료에 존재하는 적어도 하나의 미생물 존재를 검출하는 방법에 관한 것이며, 하기 단계를 포함한다:
-미생물에 대해 특이적인 적어도 하나의 리간드 및 상기 리간드보다 상기 미생물에 대해 낮은 친화도를 갖는 센서의 존재하의 액체 배지에서, 상기 리간드에 대한 화합물의 결합은 제1 측정가능한 신호를 생산하고, 상기 센서에 대한 화합물의 결합은 제2 측정가능한 신호를 생산하는 시료를 배양하는 단계;
-적어도 하나의 배양시간에 대해 제1 및 제2 신호의 값을 결정하는 단계;
여기서 상기 제1 신호 및 제2 신호의 값이 동일한 배양 시간에 대해 다른 경우, 상기 시료가 상기 미생물을 포함하는 것으로 추정된다.
본 발명에 따른 방법의 특정 구현 예에서, 상기 시료가 미생물을 포함하는 경우, 상기 배양 초기에 상기 시료에 존재하는 미생물의 양은 상기 배양 시간의 함수에 따른 제1 신호의 값의 변화로부터 또한 결정된다.
본 발명에 따른 다른 구현 예에서, 상기 시료가 미생물을 포함하는 경우, 적어도 하나의 항균제 (antimicrobial)에 대한 미생물의 민감도 (sensitivity)는 상기 배양 (culture)에 상기 항균제의 도입 이후에 상기 배양 시간의 함수에 따른 제1 신호 값의 변화로부터 결정된다.
본 발명은 또한 액체 배지에서 미생물을 배양하기에 적절한 적어도 하나의 챔버 (chamber)를 포함하며, 상기 챔버는 미생물에 대해 특이적인 적어도 하나의 리간드 및 미생물에 대해 친화도를 갖지 않는 적어도 하나의 센서를 포함하고, 상기 리간드에 대한 화합물의 결합은 제1 측정가능한 신호를 생산하고, 상기 센서에 대한 화합물의 결합은 제2 측정가능한 신호를 생산하며, 상기 리간드 및 상기 센서는 액체 배양 배지와 접촉하도록 지지체 (support)에 부착된 상기 방법을 수행하기에 적절한 장치에 관한 것이다.
본 발명은 통상적인 기술과 비교하여, 미생물 검출의 임계치 (threshold)를 낮추고 분석시간을 상당히 감소시키는 것을 가능하게 하였다.
도 1 내지 3은 3 개의 독자적인 실험으로부터 유래하고, 표면 플라즈몬 공명 영상화로 측정되며 (i) 폐렴연쇄구균 (Streptococcus pneumoniae)에 대한 항-CbpE 항체 (큰 별, 3배), (ii) 플라스미노젠 (Plg) (큰 원, 3배), (iii) S. pneumoniae에 비특이적인 IgG (큰 삼각형, 3배) 및 (iv) 피롤 (pyrrole) 단독 (큰 사각형)을 이용하여 기능화되고, 500㎕ (즉, 각각, 50, 500 및 5000 세균)의 시료 부피 및 102　박테리아/ml (도 1), 103 박테리아/ml (도 2) 및 104 박테리아/ml (도 3)의 초기농도에서 S.　 pneumoniae R6 균주 배양의 존재 하에 놓인 바이오칩의 반사도 (reflectivity) (dR, y-축, %)의 변이 (variation)를 배양 시간 (x-축, 분)의 함수에 따라 나타낸다. 또한, 접종되지 않은 배양 배지의 존재하에 놓인 동일한 바이오칩을 이용하여 얻은 곡선이 대조군으로서 또한 제공되었으며, (c)로 표시되었다.
도 4는 표면 플라즈몬 영상화로 측정된 폐렴연쇄구균 (양성 점) 및 피롤 단독 (음성 점)에 대한 항-CbpE 항체를 이용하여 기능화된 바이오칩의, S. pneumoniae 의 배양의 존재하에, 배양 시간 (x-축, t (분))의 함수에 따른 반사도 (DRSPR, y-축, %)의 변화 및 항-CbpE 항체 (계산된 곡선)를 이용하여 기능화된 점 (spots)의 반사도를 모델링하는 곡선을 나타낸다.
도 5는 폐렴연쇄구균, 플라스미노젠 (Plg), S. pneumoniae 에 비특이적인 IgG, 및 피롤 단독에 대한 항-CbpE 항체를 이용하여 기능화되며, 시간 t = 250분에서, (i) 0.08% (+ ATB) 최종 농도의 에탄올에서 40 mg/ml의 최종 농도를 갖는 에리트로마이신, (ii) 0.08%의 최종 농도의 에탄올 (EtOH)가 동시에 각각 첨가된 2 개의 용기에 있는 104　박테리아/ml의 초기농도에서 S.　 pneumoniae R6 균주 배양의 존재하에 놓인 바이오칩의 반사도 (dR, y-축, %)의 변이를 나타낸다.
본 발명에서 이해되는 바와 같이, 미생물은 바람직하게는 단세포 또는 다세포 원핵 (prokaryotic) 또는 진핵 (eukaryotic) 유기체이다. 그러나, 미생물이 다세포인 경우, 다세포 미생물을 구성하는 세포는 바람직하게는 분화 (differentiation)의 관점에서 동질적 (homogeneous)이며, 즉 미생물이 다른 (different) 특성 (specialization)을 갖는 세포를 포함하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 미생물은 살아있는, 즉 증식 (multiplying)이 가능한 미생물이다. 또한, 본 발명에 따른 미생물은 바람직하게는 단세포 미생물이다. 이 점에 있어서, 본 발명에 따른 미생물은 발달 (development) 또는 번식 (reproduction) 단계에 따라 단세포 형태의 다세포 유기체일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 미생물은 분리된 (isolated) 세포, 또는 후생동물 (metazoan)의 분리된 조직 단편으로 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 미생물은 또한 포유동물 세포, 특히 종양 세포 (tumor cell)나 예를 들어 림프구 (lymphocyte) 또는 말초 혈액 단핵구 세포 (peripheral blood mononuclear cell) 등의 혈액 세포 (blood cell)와 같은 인간 세포일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 미생물은 따라서 특히, 박테리아 (bacterium), 곰팡이 (fungus), 효모 (yeast), 해조 (alga), 원생동물 (protozoan), 및 후생동물 (metazoan)의 분리된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 단세포 미생물이다. 특히 바람직하게는, 본 발명에 따른 미생물은 특히 스트랩토코커스 (Streptococcus) 또는 대장균 (Escherichia) 속 (genus)의 박테리아이다.
본 발명에 따른 시료는 미생물을 포함할 수 있는 한 어떠한 유형도 될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 시료는 생물학적 시료 (biological sample), 식품 시료 (food sample), 물 시료 (water sample), 특히 폐수 (wastewater), 담수 (fresh water), 또는 해수 (sea water) 시료, 토양 시료 (soil sample), 슬러지 시료 (sludge sample) 또는 공기 시료 (air sample)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명에 따른 상기 생물학적 시료는 특히 동물 또는 식물의 살아있는 유기체 또는 살아있었던 유기체로부터 유래한다. 동물, 특히 포유동물로부터 유래하는 시료는 액상 (liquid) 또는 고상 (solid)일 수 있으며, 혈액, 혈장 (plasma), 혈청 (serum), 뇌척수액 (cerebrospinal fluid), 소변 (urine), 대변 (feces), 활액 (synovial fluid), 정액 (sperm), 질 분비물 (vaginal secretions), 경구 분비물 (oral secretions), 특히 폐, 코 또는 목구멍으로부터 유래하는 호흡기 검체 (respiratory specimens), 고름 (pus), 복수액 (ascites fluids), 또는 피부 또는 결막염 (cutaneous or conjunctival serosites)의 검체를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 식품 시료는 특히 날 것이거나 익혔거나 조리된 식품, 식품 성분, 양념 또는 미리 조리된 음식으로부터 유래한다. 또한 바람직하게는, 본 발명에 따른 시료는 본 발명에 따라 배양에 놓이기 전에 정제 또는 농축되지 않는다.
당업자에게 명확히 자명해지는 바와 같이, 본 발명에 따른 액체 배지에서의 배양은 배양에 놓이고 검출되어야 할 시료에 존재가능한 미생물의 증식 (multiplication)을 얻기 위해 수행된다. 미생물 배양을 위한 기술 및 조건은 특히 각각의 미생물에 대하여, 본 발명에 따른 미생물의 증식을 위한 적절한 영양 배지, 최적의 성장 온도, 예를 들어 포유동물에 병원성인 많은 박테리아의 경우 37℃, 및 요구되는 분위기를 알고 있는 당업자에게 잘 알려져 있다. 또한, 약한 선택 배양 배지 (weakly selective culture media), 즉, 서로 다른 유형의 수많은 미생물의 성장이 가능한 배지가 우선적으로 사용될 것이다. 배양시간은 성장 속도 및 세대 시간 (generation time), 즉, 미생물이 2 개의 자손 미생물로 분열되는 데 요구되는 시간에 따라 각각의 미생물에 대하여 달라질 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 배양 시간은 자손 미생물의 적어도 두 연속 세대의 생산에 요구되는 시간 이상이며, 따라서 이는 검출되어야 할 미생물의 4-배 증식인 적어도 하나의 4중 (quadrupling)을 가능하게 한다. 검출되어야 할 미생물이 본 발명에 따른 시료에 부존재 할 수도 있으므로 실제로 미생물의 4배수를 관찰할 필요가 없다는 것을 당업자는 용이하게 이해할 것이다. 그러나 상기 배양 시간은 적어도 실제로 미생물을 함유하며 본 발명의 방법과 동일한 조건 하에서 수행되는 배양에서 미생물의 4배수를 얻기 위한 것과 일치한다. 따라서, 또한 본 발명에 따른 배양 시간은 적어도 검출되어야 할 미생물의 세대 시간 또는 배가 시간 (doubling time)의 2배가 되는 것이 바람직하다. 당업자가 잘 이해할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 세대 또는 배가 시간은 본 발명에 따른 배양 조건에서 얻어질 수 있는 것이다. 일반적으로, 상기 배양 시간은 72　h, 48 h 또는 24 h 미만일 것이다. 또한, 상기 배양은 찾고 있는 정보, 즉 검출, 정량, 또는 항균제에 대한 민감도를 얻을 수 있게 되자마자 중단될 것이다.
바람직하게, 본 발명의 방법은 민감하며, 특히 바이오센서 (biosensor)를 이용하여 통상적으로는 직접적인 검출이 불가능한, 예를 들어, 1 미생물/ml 또는 10, 102 또는 103 미생물/ml 미만과 같이, 낮은 농도의 미생물을 함유하는 시료 내의 미생물의 존재를 검출 가능케 한다. 따라서, 본 발명의 방법은 검출되어야 할 미생물을 106, 105, 104, 103, 102 또는 10 미생물/ml 이하, 또는 1 미생물/ml의 농도로 함유하는 것으로 의심되는 시료에 적용되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 리간드는 하나의 미생물 또는 여러 관련된 미생물에 특이적인 결합을 가능하게 하는 모든 유형의 리간드이다. 이는 특히:
- 다당류 당 또는 복합지질, 즉 특히, 단백질, 탄수화물, 인-함유 또는 질소-함유형의 적어도 하나의 비지질 그룹 (nonlipid group)을 포함하는 지질; 단백질 또는 예를 들어, 스트렙토코커스 (Streptococcus) 속의 몇몇 박테리아 종에 결합하는 플라즈미노젠 (plasminogen)과 같은 당단백질; 선택적으로 불활성화된 전체 박테리오파지 또는 바이러스, 박테리오파지 또는 바이러스 단편 또는 박테리오파지 또는 바이러스 단백질; 과 같은 상기 미생물에 대한 천연 수용체
- 특이적으로 항원을 목표로 하는 가변부 (variable part), 또는 단백질 A를 포함하는 스타필로코커스 (Staphylococcus) 속의 박테리아가 결합하는 불변부 (constant part)를 포함하는 항체 및 이의 단편, 또는 특히 가변부를 포함하는 T-세포 수용체 (T-cell receptor, TCR) 단편;과 같은 면역글로불린
- 합성 화합물, 특히:
● 특히 1 내지 100 탄소원자를 포함하는 소형 유기 분자 (small organic molecules),
● scFvs (단쇄 가변 단편 (single chain variable fragments))과 같은 천연 펩타이드 화합물,
● 앱타머 (aptamers)와 같은 천연 폴리뉴클레오티드 화합물, 또는
● 천연 다당류 화합물;
- 토양 물질 (ground materials), 살아 있는 유기체 또는 조직의 용해물 또는 추출물;
- 미생물-흡착 표면을 갖는 합성 물질; 또는
- 둘 이상의 상기 정의된 리간드를 포함하는 혼합물.
따라서, 본 발명에 따른 리간드는 바람직하게는 항체, 항체 단편, scFv, 앱타머, 단백질 또는 당단백질, 선택적으로 불활성화된 전체 박테리오파지 (whole bacteriophages), 박테리오파지 단편, 및 박테리오파지 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 센서는 음성제어 (negative control)로 작용한다. 결국, 센서는 바람직하게는 리간드와 유사한 특성을 지닌다. 더욱이, 본 발명에 따른 센서는 검출되어야 할 미생물에 대하여 상기 리간드보다 낮은 친화도, 즉, 본 발명에 따라, 미생물에 대한 리간드의 친화도 보다 적어도 10배, 특히 적어도 100배, 1000배, 10 000배, 100 000배 또는 1　000　000배 낮은 친화도를 갖는다. 특히, 미생물에 대한 상기 리간드 및 센서의 친화도는 동일한 실험 조건하에서 스캐차드 방법 (Scatchard method)에 의하여 결정될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 센서는 상기 미생물에 대하여 친화도를 갖지 않는다.
바람직하게, 본 발명에 따라 동일한 배양 시간에 대해 제1 신호 및 제2 신호의 값은 제1 신호 및 제2 신호 간의 값의 차이가 측정된 배경 노이즈 신호의 2배 이상일 때 서로 다른 것으로 여겨진다. 상기 측정된 노이즈 신호는 특히 미생물이 존재하지 않을 때 측정된 제1 신호와 일치한다.
본 발명에서 이해되는 바와 같이, 본 발명에 따른 측정 가능한 신호는 상기 리간드 또는 상기 센서에 대한 화합물, 특히 미생물의 부착 또는 결합에 의하여 직접적으로 생성된다.
특히, 본 발명에 따른 측정 가능한 신호는 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 리간드 또는 센서 이외에 상기 배지에 존재하거나 또는 상기 배지에 첨가된 산화-환원 프로브와 같은 매개체 (mediator), 또는 마커 (marker)로부터 나오지 않는다. 따라서, 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 측정 가능한 신호는 미생물에 특이적인 마커의 이미 리간드 또는 센서에 의해 결합 된 미생물에 대한 추가적인 부착으로부터 나오지 않는다.
상기 신호는 적어도 두 개의 신호를 동시에, 특히 직접적으로 측정하기에 적절한 모든 기술, 특히, 당업자에게 잘 알려진 현미경, 표면 플라즈몬 공명 (surface plasmon resonance), 공진 미러 (resonant mirrors), 임피던스 측정 (impedance measurement), 수정 미소저울 (quartz microbalances) 또는 가요성 빔 (flexible beams)과 같은 마이크로전자기계시스템 (microelectromechanical system, MEMS), 광, 특히 자외선 또는 가시광선 흡수 측정, 또는 기타 특히 미생물이 형광성인 경우 형광 측정에 의하여 측정이 가능할 것이다. 이러한 점에서, 당업자에게 명백하게 자명해지는 바와 같이, 상기 정의된 마커는 본 발명에 따른 미생물을 나타내주지 않는다; 따라서, 본 발명에 따른 신호는 미생물이 리간드 또는 센서에 결합할 때, 미생물로부터 나올 것이다. 표면 플라즈몬 공명이 본 발명에 따라 특히 바람직하다.
바람직하게는, 상기 리간드 및 상기 센서는 지지체 (support)에 부착된다. 더욱 바람직하게는, 특히 상기 신호가 전술된 기술로 측정가능한 경우, 상기 지지체는 리간드 및/또는 센서에 대한 화합물의 결합에 의해 생산된 신호의 변환을 가능하게 한다. 그러한 지지체는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 특히 표면 플라즈몬 공명으로 측정하기에 적절한, 연속 또는 불연속 금속 표면으로 피복된 투명기재를 포함한다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현 예에 있어서, 상기 리간드 및 센서는 동일하거나 서로 다르며 그 자체가 바이오칩 (biochip)의 구성요소인 지지체에 부착된다. 또한, 본 발명에 따른 상기 리간드 및 센서, 또는 지지체(들), 또는 장치는 미생물을 함유할지 모를 액체를 수집하거나, 또는 미생물을 배양하기 위해 의도된 예를 들어, 혈액 배양 플라스크 또는 스터머커 백 (Stomacher bag)과 같은 용기 (container)에 포함될 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 신호는 실시간으로 특히, 상기 신호를 측정하기 위하여 상기 배양의 시료를 채취할 필요 없이 측정된다. 바람직하게는 상기 측정된 신호는 예를 들어 시간에 따른 함수로 상기 측정된 신호의 강도를 나타내 주는 곡선의 형태로 기록된다. 미생물에 의한 상기 리간드 및 센서의 점유 (occupation)의 정도 또는 수준을 결정하기 위하여 본 발명에 따른 리간드 및 센서가 부착되는 상기 지지체의 이미지를 기록하는 것 역시 가능하다.
본 발명의 특정 구현 예에 있어서, 본 발명에 따른 방법은 시료에 존재하는 다양한 미생물의 양, 또는 하나 이상의 항균제에 대한 다양한 미생물의 민감도를 결정하기 위하여 여러 서로 다른 미생물의 존재를 검출하는 것을 가능하게 한다; 다양한 미생물에 개별적으로 특이적인 리간드를 사용할 것이 요구된다. 그러한 방법을 다중화 방법 (multiplex method)이라고 한다.
본 발명에서 이해되는 바와 같이, 용어 "항균제 (antimicrobial)"는 미생물의 성장을 억제하거나 증식 (proliferation)을 감소시키는 모든 살균 화합물 (microbicidal compound) 특히, 모든 항생제, 에리트로마이신 (erythromycin)과 같은 살세균 (bactericidal) 또는 세균억제 (bacterio-static) 화합물을 지칭한다. 또한, 용어 "항균제 (antimicrobial)"는 또한 특히 본 발명에 따른 미생물이 종양 세포인 경우는 미생물을 없애거나 증식을 감소시키는 모든 항암 (anticancer), 특히 화학요법 화합물을 지칭한다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 적어도 하나의 항균제에 대한 상기 미생물의 민감도를 결정할 때, 배양 시간의 함수에 따른 상기 제1 신호 값의 변화 (change)는 부분적으로 또는 전체적으로, 미생물 분열에 요구되는 시간, 즉, 세대 시간 (generation time)의 변화 및 제1 리간드에 결합한 미생물 숫자의 시간에 따른 변이 (variation)로부터 유래한다. 당업자에게 잘 이해되는 바와 같이, 미생물의 세대 시간이 상당히 증가하면, 미생물 숫자의 변화는 항균제가 없을 때 얻어지는 것보다 더 작아질 것이다. 따라서, 바람직하게는 제1 신호 값의 변화는 본 발명에 따른 상기 제1 리간드에 부착된 미생물의 항균제에 의한 제거에 기인하는 것은 아니다.
실시 예
실시 예 1: 시료에서 미생물의 검출
바이오칩의 구축
금으로 피복된 프리즘 (작업 전극으로 사용됨) 상에서 단백질의 전기 중합 (electropolymerization)을 이용하고 Grosjean et al . (2005) Analytical Biochemistry 347:193-200에 기술된 바와 같이, 자유 피롤의 존재하에 단백질-피롤 접합체를 이용하여 단백질 바이오칩을 제조하였다. 간단히, 자유 피롤과 단백질이 피롤-NHS로 결합되는 상기 전기 중합은 상대 전극 (counterelectrode) 역할을 하는 백금 막대를 함유하는 피펫팁 (pipette tip)으로 수행된다; 상기 중합은 특히, Guedon et al . (2000) Anal . Chem . 72:6003-6009에서 기술된 바와 같이 상기 작업 전극과 상대 전극 사이의 100 ms (2.4 V)의 빠른 전기적 펄스를 이용하여 수행된다. 각각의 단백질 개체는 상기 공정의 재현성을 평가하기 위하여 상기 프리즘의 상기 금으로 피복된 표면상에서 3배수로 증착되었다.
사용된 리간드는 다음과 같다:
- 폐렴연쇄구균 (Streptococcus pneumoniae)을 인지하는 리간드
(i) Attali et al . (2008) Infect . Immuno . 76:466-76에 따라 제조된 항-CbpE 항체;
(ii) 인간 플라스미노젠 (Sigma Aldrich).
- 음성 대조군으로 사용된 센서:
(iii) 정제된 토끼 IgG (Sigma Aldrich) 또는 항-보툴리눔 독소 (anti-botulinum toxin) 모노클로날 IgG;
(iv) 피롤 (Tokyo kasei, TCI).
이들 모든 산물은 미생물 배양을 위한 용기의 모양에 따른 적절한 증착계획에 따라 피롤에 결합 되어 점 (spots)의 형태로 상기 금으로 피복된 프리즘 상에 증착되었다. 각각의 용기에는 하나가 대조군인, 서로 다른 두 개의 시료를 함유할 수 있는 2 개의 개별적인 구획이 존재한다.
박테리아 배양 준비
상기 R6-균주 폐렴쌍구균 (pneumococci)이 토드 헤위트 (Todd Hewitt) (Mast Diagnostic사의 TH) 배양 배지에서 배양되었다. 상기 배양은 박테리아의 최적 성장기 동안 즉, 대략 108 박테리아/ml의 박테리아 농도와 상응하는 600 nm에서 측정된 광학 밀도 (OD600)가 0.4일 때 중단되었다. 102 내지 104 박테리아/ml의 농도를 얻기 위하여 TH 배지에서 연속 희석 (Successive dilutions)을 수행했다.
표면 플라즈몬 공명 영상화를 통한 측정 (SPRi):
Genoptics (Orsay, France)의 SPRi-Lab 시스템을 이용하여 SPR 영상화를 통한 측정을 수행했다.
바이오칩을 15분간 1% 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin,BSA)을 포함하는 PBS버퍼로 미리 차단 (preblock)했다. 폐렴쌍구균이 없는 배양 배지는 "대조구" 구획에 위치시키고, 박테리아를 포함하고 있을지 모를 시료 0.5 밀리리터는 "시료" 구획에 두었다. 상기 시스템을 37℃로 가열된 SPRi 장비의 챔버 내에 위치시켰다. 교반 (agitation) 없이 수행된 성장 동안 상기 배양 배지의 증발 (evaporation)을 방지하기 위하여 상기 용기 (vessel)를 막아 두었다.
동시에, 성장 조절을 수행하였다. 103 박테리아/ml에서, 상기 배양 1 ml를 함유하는 여러 튜브를 준비하고, 이를 37℃의 인큐베이터에서 인큐베이팅했다. 시간의 함수에 따른 박테리아 성장의 변화를 관찰하고 이를 SPRi 성장 곡선과 비교하기 위하여 매시간 OD600 를 측정했다. 상기 박테리아는 16 시간 동안 배양되었다.
600nm에서의 광학 밀도 측정에 의한 성장 관찰
배양 시간 OD
1 시간 0.08
2 시간 0.13
3 시간 0.15
4 시간 0.17
5 시간 0.19
6 시간 0.25
7 시간 0.46
선택성 연구 (Study of selectivity)
500 박테리아를 주입한 후, 항-CbpE 항체 및 플라스미노젠에 의해 박테리아의 포획과 연결된, 제1 신호가 약 300분 후에 검출 가능하다는 것이 도 2에서 관찰되었다. 400분 이후에는, 음성 대조군 (비특이적 부착)을 포함하는(bearing) 점 들(spots)에 대하여 신호가 가시화되었다. 박테리아 접종이 없는 대조군 용기에서 얻어진 신호 (c)는 음성으로 유지되었다.
표 1에 기초하여 300에서 400분 사이에 상당한 박테라아 성장이 관찰되었다.
소량의 박테리의 주입 (50 박테리아, 도 1), 및 다량의 박테리아의 주입 (500 박테리아, 도 3) 또한 가시적인 신호의 증가를 생성한다. 시간차이 (time lag)가 약 30분의 세대 시간과 뚜렷하게 일치하는 것으로 관찰되었다.
실시 예 2: 초기 시료에 존재하는 박테리아의 정량
도 4는 항-CbpE 항체로 기능화된 점 (spot) 및 피롤 만을 함유하는 음성 대조군 점 상에서 관찰되고, SPR 영상화 (ΔRSPR)로 측정된 반사도의 변이 (variations)의 시간에 따른 변화를 나타낸다.
신호의 변화가 실험 노이즈로 가려지는 약 400분의 지연기 (lag period) 후에, 반사도가 뚜렷하게 지수적 (exponential)으로 증가함을 알 수 있다.
이러한 점에서, 또한 도 4는 폐렴연쇄구균 (Streptococcus pneumoniae)과 연관된 전형적인 집단 배가 시간 (population doubling time)인 τ에 대하여 30분 값을 이용하여 항-CbpE 항체로 기능화된 점 상에서 관찰되는 ΔRSPR의 변화를 모델링하는 함수 ΔRSPR = Ro 2(t/τ) - Ro로 나타내어지는 곡선을 나타낸다. 증식 요인 Ro 는 시료에 초기에 존재하는 미생물의 숫자에 비례한다. 따라서 이러한 요인의 결정은 시료에 초기에 존재하는 박테리아의 정량적 평가를 가능하게 한다.
550분부터는, 이러한 지수적 시스템에서 벗어난다. 성장률의 이와 같은 감소는 당업자에게 알려진 바와 같이, 특히 박테리아 성장에 중대하게 영향을 미칠 수 있는 특정 성분의 고갈과 같은, 상기 배양 배지의 변화에 의해 생성되는 한계요인 (limitations)에 기인할 수 있다.
음성 대조군 곡선은 600분까지도 0에 가깝게 유지된다. 폐렴연쇄구균과 상기 점의 표면 간의 대조군 비특이적 상호작용에 기인하는ΔRSPR의 증가 개시가 후에 계속 관찰될 수 있다.
실시 예 3: 항생제 첨가에 따른 성장 억제
도 5는 폐렴쌍구균 (pneumococci)을 목표로 하는, 40 mg/ml의 최종농도, 및 0.08% 최종농도의 에탄올 (EtOH)의 항생제 (ABT) (에리트로마이신, Aldrich)를 첨가함에 따른, 250분 배양 후 103　박테리아/ml로 접종된 폐렴연쇄구균 배양의 반사도에 대한 영향을 나타낸다.
항생제의 첨가가 항-CbpE 항체 및 플라스미노젠을 포함하는 점들에 대하여 특별히 표시된 반사도를 나타내는 곡선의 기울기에서 뚜렷한 감소를 야기하는 것이 관찰된다. 따라서, 상기 감소는 박테리아 성장 억제와 연관된다. 또한, 대조군 용액이 동일한 에탄올 농도로 첨가된 경우는 감소가 관찰되지 않았으며, 이는 앞서 관찰된 박테리아 성장의 억제가 항생제의 작용에 직접적으로 기인하는 것이고, 용매 효과에 기인하는 것이 아님을 증명한다.
그 결과, 본 발명의 박테리아 성장을 정량하는 방법은 안티바이오그램 (antibiogram)를 확립하기 위하여 사용된다.

Claims (15)

  1. - 미생물에 대해 특이적인 적어도 하나의 리간드 및 상기 리간드보다 상기 미생물에 대해 낮은 친화도를 갖는 적어도 하나의 센서의 존재하의 액체 배지에서, 상기 리간드에 대한 화합물의 결합은 제1 측정가능한 신호를 생산하고, 상기 센서에 대한 화합물의 결합은 제2 측정가능한 신호를 생산하는 시료를 배양하는 단계;
    - 적어도 하나의 배양 시간에 대해 제1 및 제2 신호의 값을 결정하는 단계를 포함하며;
    여기서 상기 제1 신호 및 제2 신호의 값이 동일한 배양 시간에 대해 다른 경우, 상기 시료가 상기 미생물을 포함하는 것으로 추정하는 시료에서 적어도 하나의 미생물 존재를 검출하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 배양 시간은 상기 미생물의 세대 시간 (generation time)의 적어도 2배인 것을 특징으로 하는 시료에서 적어도 하나의 미생물 존재를 검출하는 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    상기 미생물은 박테리아 (bacterium), 곰팡이 (fungus), 해조 (alga), 원생동물 (protozoan), 및 후생동물 (metazoan)의 분리된 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 시료에서 적어도 하나의 미생물 존재를 검출하는 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리간드는 항체, 항체 단편, scFv, 앱타머 (aptamer) (DNA, RNA), 단백질 또는 당단백질, 선택적으로 불활성화된 전체 박테리오파아지 (whole bacteriophages) 또는 바이러스, 박테리오파아지 또는 바이러스 단편, 및 박테리오파아지 또는 바이러스 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 시료에서 적어도 하나의 미생물 존재를 검출하는 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료는 생물학적 시료, 식품 시료, 물 시료, 토양 시료 및 공기 시료로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 시료에서 적어도 하나의 미생물 존재를 검출하는 방법.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리간드 및/또는 상기 센서는 상기 리간드 및/또는 상기 센서에 화합물의 결합에 의해 생산된 신호의 변환을 위한 지지체에 부착된 것을 특징으로 하는 시료에서 적어도 하나의 미생물 존재를 검출하는 방법.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 신호는 실시간 측정되는 것을 특징으로 하는 시료에서 적어도 하나의 미생물 존재를 검출하는 방법.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 신호는 현미경, 표면 플라즈몬 공명 (surface plasmon resonance), 공진 미러 (resonant mirror), 임피던스 측정 (impedance measurement), 수정 미소저울 (quartz microbalance), 가요성 빔 (flexible beam), 광 흡수의 측정, 또는 형광 미생물의 형광성의 측정에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 시료에서 적어도 하나의 미생물 존재를 검출하는 방법.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 신호는 표면 플라즈몬 공명에 의해 실시간 측정되는 것을 특징으로 하는 시료에서 적어도 하나의 미생물 존재를 검출하는 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 측정가능한 신호는 상기 리간드 또는 센서 이외에, 배지에 존재하거나 또는 배지에 첨가된 매개체 (mediator) 또는 마커 (marker)로부터 나오지 않는 것을 특징으로 하는 시료에서 적어도 하나의 미생물 존재를 검출하는 방법.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료가 미생물을 포함하는 경우, 상기 배양 초기에 상기 시료에 존재하는 미생물의 양은 상기 배양 시간의 함수에 따른 제1 신호의 값의 변화로부터 또한 결정되는 것을 특징으로 하는 시료에서 적어도 하나의 미생물 존재를 검출하는 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료가 미생물을 포함하는 경우, 적어도 하나의 항균제에 대한 미생물의 민감도는 상기 배양에 상기 항균제의 도입 이후에 상기 배양 시간의 함수에 따른 제1 신호의 값의 변화로부터 결정되는 것을 특징으로 하는 시료에서 적어도 하나의 미생물 존재를 검출하는 방법.
  13. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료의 몇 가지의 다른 미생물의 존재 또는 양이 결정되는 것을 특징으로 하는 시료에서 적어도 하나의 미생물 존재를 검출하는 방법.
  14. 액체 배지에서 미생물을 배양하기에 적절한 적어도 하나의 챔버를 포함하며, 상기 챔버는 미생물에 대해 특이적인 적어도 하나의 리간드 및 상기 리간드보다 상기 미생물에 대해 낮은 친화도를 갖는 적어도 하나의 센서를 포함하고, 상기 리간드에 대한 화합물의 결합은 제1 측정가능한 신호를 생산하고 상기 센서에 대한 화합물의 결합은 제2 측정가능한 신호를 생산하며, 상기 리간드 및 상기 센서는 액체 배양 배지와 접촉하도록 지지체에 부착된 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 정의된 방법을 수행하기 위한 장치.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 장치는 미생물을 함유할 수 있는 액체를 수집 및/또는 미생물을 배양하기 위해 의도된 용기에 포함된 것을 특징으로 하는 장치.
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