CN206479535U - 基于核酸适配体的多种致病菌检测试纸条 - Google Patents
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Abstract
本实用新型提供一种基于核酸适配体的多种致病菌检测试纸条，包括样品垫(1)、胶体金结合垫(2)、固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜(3)和吸收垫(4)，所述硝酸纤维素膜(3)上设有4条检测线(5)和1条质控线(6)，所述样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘贴在塑料衬板上。其中，4条检测线分别为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌O157:H7、肠致病大肠杆菌和肠毒素大肠杆菌K88检测线。胶体金结合垫上有胶体金标记的各致病菌特异性核酸适配体，检测线固定有捕获探针，质控线固定有质控探针。本实用新型可以在一个试纸条上实现多种致病菌同时检测，且用适配体替代抗体作为识别元件，实现了致病微生物低成本、高通量的快速检测。
Description
技术领域
本实用新型涉及致病微生物检测技术领域，具体地说，涉及一种基于核酸适配体的多种致病菌检测试纸条。
背景技术
食源性致病微生物引起的食品中毒是全球关注的重要食品安全问题之一，据全国食源性疾病监测信息资料显示，我国每年由于食源性致病微生物引起的食物中毒人数约占各类食源性疾病患者总人数的40-60％。多种致病菌相互混合存在于食品中，它们数量相差很大，难以分离，检测困难。并且由于食品营养成分的不同，适宜生长的致病菌的种类也不同，检测单一的致病菌已经不能保障食品安全，迫切需要多种致病菌的同步检测技术和产品。近年来针对致病微生物的检测方法已经从传统的繁琐耗时长的微生物培养,向利用免疫学、分子生物学和材料等技术的快速检测方法发展。这类方法通过对食品样品简单增菌，即可实现更为灵敏、抗干扰能力强、高通量的检测，适合现场筛查。目前多种致病菌同步检测的方法鲜有报道，繁杂的前处理过程以及数据处理的复杂性是主要的技术瓶颈。
目前，就食源性致病菌快速检测技术应用而言，国内外的主流技术是基于免疫学技术的侧流层析试纸和酶联免疫ELISA试剂盒以及PCR为主的分子生物学方法，虽然目前酶联免疫和分子生物学方法较大型仪器在快检方面有很多优势，但PCR法和ELISA试剂盒需要专业的仪器来实现，而操作简单成本不需要仪器的免疫层析试纸条更符合基层和现场快速检测的要求，被认为是解决食源性微生物快速检测问题的主要途径。但由于免疫技术的核心的抗体，试纸条方法同样存在灵敏度低，无法定量，结果靠主观判断，假阳性高和人为误判等问题，目前仍满足不了高灵敏度，满足现场快速检测的需要。主要原因在于基于抗原抗体免疫原理的快速检测技术，因抗体本身特点的局限性。致病性微生物的抗原抗体免疫活性位点不明，杂交瘤筛选盲目性大，效率低，抗体亲和力低、特异性差；导致现有检测技术灵敏度低、假阳性率高等问题；另外，抗体制备依赖于哺乳动物，制备周期长、成本高，批次差异大。因此，高灵敏度特异性强、成本低、适用范围广的识别元件，结合新型纳米材料增加检测灵敏度和基质适应性是食源性致病微生物快速检测发展的迫切需求。
随着生物技术的快速发展，核酸适配体技术在食品安全检测、环境污染物监测以及临床诊断方面得到了很好的应用。核酸适配体是一类寡核苷酸序列，通过其特定的三维结构可以与靶标高特异性、高亲和力地结合，在真菌毒素的检测方面表现出了良好的应用前景。适配体的以下特点，使其成为毒性小分子检测领域理想的抗体替代物：首先，适用的靶分子范围广，可以是毒素、金属离子、有机染料、抗生素、肽等小分子，解决小分子毒性靶标抗体难以制备的问题；二是合成重复性好，成本低，只有抗体的六分之一，稳定性好；三是具有可逆变性，可体外化学合成，室温储存和运输，由温度引起的变性是可逆的，解决抗体合成时间长、费用高、重复性与再生性差等问题；四是易于功能化，生物化学修饰实现信号产生、亲合捕获、共价交联、纳米载体修饰、界面固定等，解决抗体标记易失活的问题；最重要的是，适配体特异性非常好，能够区分靶分子结构上的细微差别，如茶碱和咖啡因的分子结构上只有氢与甲基的区别，适配体亲合力差别就达10,000倍，因此，适配体可以分离结构相似或交叉反应的物质，解决抗体交叉反应的问题。适配体试纸是一种以核酸适配体结合试纸条技术而研发的快速检测方法，具有操作简单，稳定性较高，适合现场快速检测等优点。
发明内容
本实用新型的目的是提供一种基于核酸适配体的多种致病菌检测试纸条。
本实用新型基于以下构思：通过快速增菌，获得样品，加样到快速检测试纸条上，应用“竞争法”的原理，致病菌靶标和纳米金标记的特异性核酸适配体结合，与预先划膜标记在NC膜检测线T线位置的核酸适配体序列互补的捕获链竞争。如果样品中存在致病菌，则纳米金-适配体复合物与样品中的蛋白结合，无法与T线上的互补链结合，检测线不显色；如样品中没有致病菌，纳米金-适配体复合物与T线上的互补链结合，纳米金颗粒的聚集而显示明显的红线。通过肉眼直接观察是否出现T线，判断样品中是否含有致病微生物。
为了实现本实用新型目的，本实用新型提供的基于核酸适配体的多种致病菌检测试纸条，包括样品垫1、胶体金结合垫2、固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜3和吸收垫4，所述固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜3上设有四条检测线5和一条质控线6，所述样品垫1、胶体金结合垫2、固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜3和吸收垫4依次粘贴在塑料衬板7上。
其中，4条检测线(依次沿着样品流动方向)分别为金黄色葡萄球菌检测线(T1)、大肠埃希菌O157:H7检测线(T2)、肠致病大肠杆菌检测线(T3)和肠毒素大肠杆菌K88检测线(T4)。
所述胶体金结合垫2固定有胶体金标记的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌O157:H7、肠致病大肠杆菌和肠毒素大肠杆菌K88的特异性适配体，各检测线分别固定有相应致病菌的捕获探针，所述质控线6固定有质控探针。
所述金黄色葡萄球菌的特异性适配体的核苷酸序列为：5’-TTTTTTTTTTTTTCCCTACGGCGCTAACCTCCCAACCGCTCCACCCTGCCTCCGCCTCGCCACCGTGCTACAAC-3’。参见董晓琳等，基于适配体的金黄色葡萄球菌流式细胞术检测方法，东北农业大学，2016，41(3)：81-86。
所述大肠埃希菌O157:H7的特异性适配体的核苷酸序列为：5’-TTTTTTTTTTTTGCAATGGTACGGTACTTCCCGCAGTTTGGGAAGGGTGATCGCACTATCAGAGGATTCCGTTCGGCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’。参见许蕊等，基于全菌消减SELEX技术的体外筛选大肠埃希菌O157:H7适配体研究，环境与健康杂志2016年1月第33卷第1期。
所述肠致病大肠杆菌的特异性适配体的核苷酸序列为：5’-TTTTTTTTTTTTCAGCTCAGAAGCTTGATCCTACCAGTAGACTTTCAACTTTACTGCCATCGTGTGCCCTAAGACTCGAAGTCGTGCATCTG-3’。参见段诺等，基于适配体识别-荧光法检测肠致病大肠杆菌，中国食品学报，2015年第15卷第12期。
所述肠毒素大肠杆菌K88的特异性适配体的核苷酸序列为：5’-TTTTTTTTTTTTGGAGACCGTACCATCTGTTCGTGGAAGCGCTTTGCTCGTCCATTAGCCTTGTGCTCGTGCC-3’。参见付梦玉等，肠毒素大肠杆菌K88可视化快速检测方法的建立，现代食品科技，2016年第32卷第10期。
所述金黄色葡萄球菌检测线上固定有金黄色葡萄球菌捕获探针，所述捕获探针为：5’-ATCCGTCACACCTGCTCTACGGCGCTCCCAACAGGCCTCTCCTTACGGCATATTATGGTGTTGGCTCCCGTAT-biotin-3’。即生物素化的金黄色葡萄球菌特异性适配体序列的反向互补序列。
所述大肠埃希菌O157:H7检测线上固定有大肠埃希菌O157:H7捕获探针，所述捕获探针为：5’-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTGCCGAACGGAATCCTCTGATAGTGCGATCACCCTTCCCAAACTGCGGGAAGTACCGTACCATTGC-biotin-3’。即生物素化的大肠埃希菌O157:H7特异性适配体序列的反向互补序列。
所述肠致病大肠杆菌检测线上固定有肠致病大肠杆菌捕获探针，所述捕获探针为：5’-CAGATGCACGACTTCGAGTCTTAGGGCACACGATGGCAGTAAAGTTGAAAGTCTACTGGTAGGATCAAGCTTCTGAGCTG-biotin-3’。即生物素化的肠致病大肠杆菌特异性适配体序列的反向互补序列。
所述肠毒素大肠杆菌K88检测线上固定有肠毒素大肠杆菌K88捕获探针，所述捕获探针为：5’-GGCACGAGCACAAGGCTAATGGACGAGCAAAGCGCTTCCACGAACAGATGGTACGGTCTCC-biotin-3’。即生物素化的肠毒素大肠杆菌K88特异性适配体序列的反向互补序列。
所述质控探针为生物素标记的，与本实用新型各致病菌特异性核酸适配体序列中polyT互补的polyA序列。具体地，所述质控探针为：5’-AAAAAAAAAAAA-biotin-3’。
所述样品垫1、胶体金结合垫2、固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜3和吸收垫4依次以2mm左右的间距交互层叠黏贴到塑料衬板7上，所述试纸条宽度为4mm左右。各条检测线之间间距为5mm左右，检测线T4与质控线之间间距为1cm左右。
优选地，本实用新型所述样品垫的材质为纤维素膜，所述胶体金结合垫的材质为玻璃纤维膜。
本实用新型的胶体金试纸条可按如下方法进行制备，包括以下步骤：
S1、金纳米颗粒的制备；
S2、金纳米颗粒-核酸适配体复合物(AuNPs-aptmer)的制备；
S3、检测线(T线)和质控线(C线)的制备；
S4、胶体金试纸条的组装。
具体地，胶体金试纸条的制备可参见博士论文《基于微流控芯片的蛋白质高灵敏快速检测技术研究》，满燕，北京理工大学，2015年6月。
本发明中，固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜的制备方法如下：将1mg/mL链霉亲和素溶液按1μL/cm2的量用划膜仪喷到硝酸纤维素膜上，通过物理吸附固定在膜上。所述生物标记的捕获探针以及质控探针均由上海生工合成。
通常情况下，样品垫(纤维素膜)，结合垫(玻璃纤维膜)，固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜(NC膜)以及末端的吸水垫以2mm的间距交互层叠黏贴到塑料背板上，并切割成4mm宽度备用。AuNPs-aptmer以5μL每条的量滴加在玻璃纤维素膜上，在室温下风干5分钟，所得到的胶体金试纸条储存于4℃冰箱中。
利用本实用新型的胶体金试纸条进行致病菌检测时，包括样品增菌培养、试纸条检测及结果判读等步骤；具体方法如下：
(1)称取23.5g脑心浸液肉汤(BHI)培养基，加入预热至42±1℃无菌水1L，溶解备用；
(2)无菌操作取25g或25mL样品到均质袋中，并向其中加入225mL预热后的脑心浸液肉汤培养基，放入均质器中均质2min，42℃静置或振荡培养8h；
(3)将(2)所得培养物混匀，取1mL加入到试管中，100℃加热5min，冷却至室温，用滴管滴加3-4滴(约100μL)至试纸条的样品垫上，反应5-8min，判读结果，超过30min显色无效；
(4)结果判读：
阴性反应：质控线、检测线均显色；
阳性反应：质控线显色，检测线有任意一条或多条不显色；
失效反应：若质控线不显色，则检测失败或试纸条失效。
本实用新型提供的多种致病菌检测试纸条，易携带，可满足现场实时检测，提高检测的时效性和方便性，不损坏产品，检测结果为不同颜色及颜色深浅，检测过程简单化，为基层致病微生物筛查和监测提供有力工具。
本实用新型的基于核酸适配体的多种致病菌检测试纸条，可实现样品中目标微生物最短8小时检测，检测灵敏度可达1CFU/25g，可满足日常食品监测的需求，适合食品样品、环境水和鲜活农产品中致病菌的检测。
本实用新型的检测试纸条具有极强的基质适应性，样品的快速增菌培养基可实现致病菌的快速增殖，同时抑制感染菌的生长，可以避免大量其他因素的干扰，利于对样品的快速筛查。
为了达到预期的灵敏度和准确性，本实用新型利用纳米金标记的核酸适配体构建检测体系，所述反应体系中，以致病菌外膜蛋白特异性核酸适配体替代抗体，避免了抗原抗体免疫活性位点不明，杂交瘤筛选盲目性大，效率低，抗体亲和力低、特异性差；导致现有检测技术灵敏度低、假阳性率高的问题；另外，适配体的成本仅为抗体的六分之一，可以体外批量合成，这种识别元件克服了抗体制备周期长、成本高，批次差异大的缺点，增强了试纸条检测的稳定性，降低了成本，并延长了货架期。另外，致病菌外膜蛋白特异性核酸适配体比用整个菌体细胞作为靶标的适配体特异性和稳定性都有优势。因此，本实用新型的试纸条产品采用了灵敏度高、特异性强、成本低、适用范围广的识别元件，并结合新型纳米材料增加检测灵敏度和基质适应性，可满足致病微生物快速检测的需求。
附图说明
图1为本实用新型实施例1基于核酸适配体的多种致病菌检测试纸条的结构示意图。其中，1-样品垫，2-胶体金结合垫，3-硝酸纤维素膜，4-吸收垫，5-检测线，6-质控线，7-衬板，8-金纳米颗粒-核酸适配体复合物，9-捕获探针，10-质控探针，11-亲和素。
图2为本实用新型实施例2中胶体金试纸条检测结果判定图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本实用新型，但不用来限制本实用新型的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本实用新型中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100ml溶液中含有溶质的克数。
实施例1基于核酸适配体的多种致病菌检测试纸条及其制备方法
本实施例提供一种基于核酸适配体的多种致病菌检测试纸条，包括样品垫1、胶体金结合垫2、固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜3和吸收垫4，所述固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜3上设有四条检测线5和一条质控线6，所述样品垫1、胶体金结合垫2、固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜3和吸收垫4依次粘贴在塑料衬板7上。
其中，4条检测线(依次沿着样品流动方向)分别为金黄色葡萄球菌检测线(T1)、大肠埃希菌O157:H7检测线(T2)、肠致病大肠杆菌检测线(T3)和肠毒素大肠杆菌K88检测线(T4)。
所述胶体金结合垫2固定有胶体金标记的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌O157:H7、肠致病大肠杆菌和肠毒素大肠杆菌K88的特异性适配体，各检测线分别固定有相应致病菌的捕获探针，所述质控线6固定有质控探针。
所述金黄色葡萄球菌的特异性适配体的核苷酸序列为：5’-TTTTTTTTTTTTTCCCTACGGCGCTAACCTCCCAACCGCTCCACCCTGCCTCCGCCTCGCCACCGTGCTACAAC-3’。
所述大肠埃希菌O157:H7的特异性适配体的核苷酸序列为：5’-TTTTTTTTTTTTGCAATGGTACGGTACTTCCCGCAGTTTGGGAAGGGTGATCGCACTATCAGAGGATTCCGTTCGGCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’。
所述肠致病大肠杆菌的特异性适配体的核苷酸序列为：5’-TTTTTTTTTTTTCAGCTCAGAAGCTTGATCCTACCAGTAGACTTTCAACTTTACTGCCATCGTGTGCCCTAAGACTCGAAGTCGTGCATCTG-3’。
所述肠毒素大肠杆菌K88的特异性适配体的核苷酸序列为：5’-TTTTTTTTTTTTGGAGACCGTACCATCTGTTCGTGGAAGCGCTTTGCTCGTCCATTAGCCTTGTGCTCGTGCC-3’。
所述金黄色葡萄球菌检测线上固定有金黄色葡萄球菌捕获探针，所述捕获探针为：5’-ATCCGTCACACCTGCTCTACGGCGCTCCCAACAGGCCTCTCCTTACGGCATATTATGGTGTTGGCTCCCGTAT-biotin-3’。
所述大肠埃希菌O157:H7检测线上固定有大肠埃希菌O157:H7捕获探针，所述捕获探针为：5’-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTGCCGAACGGAATCCTCTGATAGTGCGATCACCCTTCCCAAACTGCGGGAAGTACCGTACCATTGC-biotin-3’。
所述肠致病大肠杆菌检测线上固定有肠致病大肠杆菌捕获探针，所述捕获探针为：5’-CAGATGCACGACTTCGAGTCTTAGGGCACACGATGGCAGTAAAGTTGAAAGTCTACTGGTAGGATCAAGCTTCTGAGCTG-biotin-3’。
所述肠毒素大肠杆菌K88检测线上固定有肠毒素大肠杆菌K88捕获探针，所述捕获探针为：5’-GGCACGAGCACAAGGCTAATGGACGAGCAAAGCGCTTCCACGAACAGATGGTACGGTCTCC-biotin-3’。
所述质控探针为生物素标记的，与本实用新型各致病菌特异性核酸适配体序列中polyT互补的polyA序列。具体地，所述质控探针为：5’-AAAAAAAAAAAA-biotin-3’。
所述样品垫1、胶体金结合垫2、固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜3和吸收垫4依次以2mm左右的间距交互层叠黏贴到塑料衬板7上，所述试纸条宽度为4mm左右。各条检测线之间间距为5mm左右，检测线T4与质控线之间间距为1cm左右。
本实用新型所述样品垫的材质为纤维素膜，所述胶体金结合垫的材质为玻璃纤维膜。
本实用新型的胶体金试纸条可按如下方法进行制备，包括以下步骤：
S1、金纳米颗粒的制备；
S2、金纳米颗粒-核酸适配体复合物(AuNPs-aptmer)的制备；
S3、检测线(T线)和质控线(C线)的制备；
S4、胶体金试纸条的组装。
通常情况下，样品垫(纤维素膜)，结合垫(玻璃纤维膜)，固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜(NC膜)以及末端的吸水垫以2mm的间距交互层叠黏贴到塑料背板上，并切割成4mm宽度备用。AuNPs-aptmer以5μL每条的量滴加在玻璃纤维素膜上，在室温下风干5分钟，所得到的胶体金试纸条储存于4℃冰箱中。制得的胶体金试纸条结构如图1所示。
实施例2利用胶体金试纸条检测致病菌的方法
利用实施例1制备的胶体金试纸条检测待测样品中金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌O157:H7、肠致病大肠杆菌和肠毒素大肠杆菌K88的具体方法如下：
1、称取23.5g脑心浸液肉汤(BHI)培养基，加入预热至42±1℃无菌水1L，溶解备用；
2、无菌操作取25g或25mL样品到均质袋中，并向其中加入225mL预热后的脑心浸液肉汤培养基，放入均质器中均质2min，42℃静置或振荡培养8h；
3、将步骤2所得培养物混匀，取1mL加入到试管中，100℃加热5min，冷却至室温，用滴管滴加3-4滴(约100μL)至试纸条的样品垫上，反应5-8min，判读结果，超过30min显色无效；
4、结果判读：见图2。
阴性反应：质控线、检测线均显色；
阳性反应：质控线显色，检测线有任意一条或多条不显色；
失效反应：若质控线不显色，则检测失败或试纸条失效。
本实用新型用致病菌高特异性适配体代替抗体作为侧流层析试纸条的识别元件，克服了依赖抗体的免疫层析试纸条抗体成本高、批次差异大、存在交叉反应，灵敏度不高等缺点，而且可以大大降低检测的成本，实现致病菌高效、简捷、低成本的快速检测。利用本试纸条可实现样品中致病菌最短8小时检测，检测灵敏度1CFU/25g。可满足日常食品监测的需求，适合食品样品、环境水和鲜活农产品中致病菌的检测。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本实用新型作了详尽的描述，但在本实用新型基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本实用新型精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本实用新型要求保护的范围。
Claims (3)
1.一种基于核酸适配体的多种致病菌检测试纸条，其特征在于，包括样品垫(1)、胶体金结合垫(2)、固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜(3)和吸收垫(4)，所述固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜(3)上设有4条检测线(5)和1条质控线(6)，所述样品垫(1)、胶体金结合垫(2)、固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜(3)和吸收垫(4)依次粘贴在塑料衬板(7)上；
其中，4条检测线分别为金黄色葡萄球菌检测线、大肠埃希菌O157:H7检测线、肠致病大肠杆菌检测线和肠毒素大肠杆菌K88检测线；
所述胶体金结合垫(2)固定有胶体金标记的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌O157:H7、肠致病大肠杆菌和肠毒素大肠杆菌K88的特异性适配体，各检测线分别固定有相应致病菌的捕获探针，所述质控线(6)固定有质控探针。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述样品垫(1)、胶体金结合垫(2)、固定有链霉亲和素的硝酸纤维素膜(3)和吸收垫(4)依次以2mm的间距交互层叠黏贴到塑料衬板(7)上，所述试纸条宽度为4mm，各条检测线之间间距为5mm，最后一条检测线与质控线之间间距为1cm。
3.根据权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于，所述样品垫的材质为纤维素膜，所述胶体金结合垫的材质为玻璃纤维膜。
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