CN106916213B - 一种蛋白AsT及其编码基因以及在植物耐逆性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛋白AsT及其编码基因以及在植物耐逆性中的应用。本发明提供的蛋白质，命名为AsT蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与增强植物耐受砷酸盐胁迫的由序列1衍生的蛋白质。本发明提供了拟南芥中参与增强植物耐受砷酸盐胁迫的蛋白和基因，对于进一步阐明植物耐受砷酸盐胁迫的分子机理并通过基因工程的技术手段培育耐受砷酸盐胁迫的作物新品种具有重要的理论意义和实践意义。

Description

一种蛋白AsT及其编码基因以及在植物耐逆性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种蛋白AsT及其编码基因以及在植物耐逆性中的应用。

背景技术

砷属于一级致癌性重金属，在自然界广泛存在。地壳砷平均浓度为3mg·kg^-1左右,位于构成地壳元素的第20位。自然界的砷化合物多以砷酸盐的形态存在。砷通过自然原因和人为原因进入大气、水和土壤中。自然原因包括：岩石风化、火山喷发、温泉流出等。人为原因包括：矿物质的开采冶炼、煤的燃烧、含砷杀虫剂除草剂化肥等的使用、以及生产制造玻璃有色金属电子设备等。人类活动使得释放到环境中的砷急剧增加,全球很多地区的土壤以及水资源中的砷浓度都显著超过安全标准。随着工农业现代化的发展，越来越多的砷酸盐流入农田和灌溉用水，长期生长在砷污染的土壤以及使用砷污染的水浇灌农作物使得粮食作物的砷含量增加，砷经由植物进入食物链，污染到粮食，最终被端上餐桌，影响人类健康。由于饮用了受到砷污染的水而导致砷中毒也是世界上许多地区面临的一个严重健康问题。

获得能够增强植物耐受砷酸盐胁迫能力的基因及其编码蛋白，进而通过基因工程、等位变异等方法得到能够耐受砷酸盐胁迫的植物/作物，对于在砷污染高危地区培育可安全食用的农作物具有重要作用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种蛋白AsT及其编码基因。

本发明提供的蛋白质，命名为AsT蛋白，获自拟南芥(Columbia生态型)，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。

为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述蛋白质的DNA分子也属于本发明的保护范围，将其命名为AsT基因。

上述DNA分子是如下1)-3)中任一种的DNA分子：

1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC、0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。

含有上述DNA分子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有AsT基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用AsT基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用AsT基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述重组表达载体具体可为将AsT基因插入载体pCXSN得到的重组质粒，重组表达载体35S:AsT为在载体pCXSN的XcmI酶切位点间插入了序列表的序列2所示的AsT 基因。

扩增上述DNA分子全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。

上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物抗逆性中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述抗逆性为抗砷酸盐，所述砷酸盐具体为砷酸钠；

所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

所述双子叶植物具体为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥。

上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育抗逆性提高转基因植物中的应用也是本发明保护的范围；

所述抗逆性为抗砷酸盐，所述砷酸盐具体为砷酸钠；

所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

所述双子叶植物具体为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥。

本发明另一个目的是提供一种培育抗逆性提高转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为将编码上述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，

所述转基因植物的抗逆性高于所述目的植物。

上述中，所述抗逆性为抗砷酸盐，所述砷酸盐具体为砷酸钠；

所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

所述双子叶植物具体为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥。

本发明的实验证明，本发明发现了拟南芥中增强植物耐受砷酸盐胁迫的蛋白和基因，对于进一步阐明植物耐受砷酸盐胁迫的分子机理并通过基因工程等技术手段培育耐受砷酸盐胁迫的作物或在砷污染高危地区培育可安全食用的农作物具有重要的理论意义和实践意义。

附图说明

图1为砷酸盐胁迫时AsT基因的表达检测。

图2为转AsT拟南芥的分子鉴定。

图3为砷酸盐胁迫条件下转AsT拟南芥的表型鉴定结果。

图4为砷酸盐胁迫条件下转AsT拟南芥的主根长度和鲜重的测定结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

农杆菌菌株GV3101：参考文献：Lee et al.Agrobacterium tumefacienspromotes tumor induction by modulating pathogen defense in Arabidopsisthaliana.Plant Cell 2009,21:2948-2962。

实施例中的野生型拟南芥(WT)为哥伦比亚(Columbia)拟南芥col-0(从NASC订购，货号N28166，NASC:www.arabidopsis.info)。

MS培养基的制备方法：将1650mg NH₄NO₃、1900mg KNO₃、370mg MgSO₄·7H₂O、170mgKH₂PO₄、440mg CaCl₂·2H₂O、22.3mg MnSO₄·4H₂O、0.83mg KI、0.025mg CuSO₄·5H₂O、6.25mgH₃BO₅、0.025mg CoCl·6H₂O、8.65mg ZnSO₄·7H₂O、0.25mg Na₂MoO₄·2H₂O、27.8mg FeSO₄·7H₂O和37.3mg Na₂-EDTA溶于水并定容至1L。固体培养基中，每升加入8g琼脂粉。

1/2MS培养基：MS培养基的盐浓度减少一半，定容至1L。固体培养基中，每升加入8g琼脂粉。

砷酸盐培养基的制备方法：在1/2MS培养基中加入一定浓度的砷酸钠。固体培养基中，每升加入8g琼脂粉。

实施例1、AsT蛋白及其编码基因的发现及获得

一、AsT蛋白及其编码基因的克隆

TRIZOL(Invitrogen)法提取拟南芥(Columbia)col-0幼苗的总RNA(100-200mg)，经甲醛变性RNA琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性。按照SUPERSCRIPT^II的使用说明合成单链cDNA。将合成的单链cDNA稀释10倍并作为模板DNA，采用Primer 1和Primer 2组成的引物对进行PCR反应。

Primer 1：5'-ATGGGGAGAAAACCGTGCTGTG-3'；

Primer 2：5'-TCATAAGAGGAAAAGATTATCAT-3'。

PCR体系(50μL)：10μL 5×Phusion HF Buffer，4μL 2.5mM dNTP mix，2.5μLPrimer 1(10μM)，2.5μL Primer 2(10μM)，1μL模板DNA,1.5μL DMSO,0.5μL Phusion DNAPolymerase(2U/μL)，余量为水。

PCR程序：98℃预变性3min；98℃15s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。

回收约792bp的PCR产物，连接到pMD18-T载体，依次进行酶切和测序鉴定。测序结果表明，PCR产物中具有序列表的序列2所示的开放阅读框，编码序列表的序列1所示的蛋白质。

将序列表的序列1所示蛋白质命名为AsT蛋白。将AsT蛋白的编码基因命名为AsT基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示。

二、砷酸盐胁迫时AsT基因的表达检测

野生型拟南芥col-0种子在1/2MS培养基上萌发生长7天,移至外加200μM砷酸钠的1/2MS培养基上，分别在移苗12、24、36、48和72小时时取样,提取RNA。用qRT-PCR方法检测AsT基因的表达。qRT-PCR方法描述如下：首先以随机引物(Random primer，货号:C1181)合成的单链cDNA稀释10倍并作为qRT-PCR的模板DNA；接着利用ABI公司7500型Real-time PCR仪(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)和ABI POWER SYBR GREEN PCR MASTERMIX试剂盒(货号:4367659),采用Primer 3和Primer 4组成的引物对进行qRT-PCR鉴定。同时以Primer 5和Primer 6组成的ACTIN2/8引物对进行qRT-PCR，作为内标。

Primer 3：5'-GGCTACGCACAAACCGATGA-3'；

Primer 4：5-TTTCGCCACAAGTTCCTCATCAT-3’。

Primer 5：5'-ACGGTAACATTGTGCTCAGTGGTG-3'；

Primer 6：5-CTTGGAGATCCACATCTGCTGGA-3’。

qRT-PCR的反应体系(20μL)：含10μL Kit MIX,1μL 1μM Primer 3和1μL 1μMPrimer 4(或1μL 1μM Primer 5和1μL 1μM Primer 6)，1μL模板DNA，余量为水。

qRT-PCR的反应程序：95℃预变性10min，95℃15s，60℃1min，40个循环；72℃延伸10min。

结果如图1所示：在砷酸盐胁迫条件下,AsT基因表达上调,并且随着砷酸盐处理时间的延长,AsT基因的表达量逐渐升高,说明AsT受砷酸盐胁迫诱导表达。

实施例2、AsT基因的功能鉴定

一、AsT重组表达载体的构建

1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子并作为模板DNA，采用Primer 1和Primer 2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR体系(50μL)：10μL 5×Phusion HF Buffer，4μL 2.5mM dNTP mix，2.5μLPrimer 1(10μM)，2.5μL Primer 2(10μM)，1μL模板DNA,1.5μL DMSO,0.5μL Phusion DNAPolymerase(2U/μL)，余量为水。

PCR程序：98℃预变性3min；98℃15s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。

2、使用Taq酶对步骤1得到的PCR扩增产物的平末端进行补A，使其具有A粘末端。

3、采用限制性内切酶XcmI(NEB公司)酶切载体pCXSN(GenBank:FJ905214.1，提交日：2009年7月6日，参考文献：Chen et al.A versatile zero background T-vectorsystem for gene cloning and functional genomics.Plant Physiol.2009,150:1111-1121.)，使其线性化并具有T粘末端。

4、通过TA克隆方法，将步骤2的产物与步骤3的产物连接，得到重组质粒35S:AsT。经过测序，重组质粒35S:AsT为在载体pCXSN的XcmI酶切位点间插入了序列表的序列2所示的AsT基因。

二、转AsT拟南芥的获得

1、将重组质粒35S:AsT导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌。

2、利用花芽浸泡法(参考文献Clough and Bent,Floral dip:a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant J.1998,16:735-743)，用步骤1得到的重组农杆菌侵染野生型拟南芥(Columbia)clo-0中，收获T₁代种子。T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₃代表示T₂代自交产生的种子及由它所长成的植株。在含50μg/L潮霉素的MS固体培养基平板上筛选T₁代植株并进行T₂代和T₃代的分离比统计，在T₃代得到T₃代转AsT拟南芥单拷贝纯合株系，随机取两个株系并分别命名为OE11和OE26。

三、转AsT拟南芥的分子鉴定

分别将OE11，OE26的T₃代转AsT拟南芥纯合株系和野生型拟南芥植株进行AsT基因的表达鉴定。

提取各植株的总RNA并反转录为cDNA，采用Primer 3和Primer 4组成的引物对进行PCR鉴定。同时以ACTIN2/8作为内标。具体方法见实施例2。

结果见图2。OE11，OE26的T₃代转AsT拟南芥纯合株中AsT基因的表达量显著高于野生型拟南芥，说明OE11和OE26是AsT过量表达株系。

采用同样的方法将空载体pCXSN导入野生型拟南芥中，得到转pCXSN拟南芥。

四、转AsT拟南芥的表型鉴定

一、表型鉴定

将T₃代转AsT拟南芥纯合株(OE11和OE26)、转pCXSN拟南芥和野生型拟南的种子播种于1/2MS固体培养基或外加200μM砷酸钠的1/2MS固体培养基，萌发生长至7天和15天时，照相。培养条件：16h光照(光强80μmol·m^-2·s^-1)/8h黑暗，22℃。

照片见图3。在含有200μM砷酸钠的培养基上萌发生长7天时，OE11和OE26的主根长度明显长于野生型(图3中A)；在含有200μM砷酸钠的培养基上萌发生长15天时，野生型叶片发黄发紫，表现明显的砷酸盐毒害表型，而OE11和OE26较野生型有明显生长优势，叶片仍然保持绿色(图3中B)，说明T₃代转AsT拟南芥纯合株(OE11和OE26)较野生型拟南芥耐受砷酸盐胁迫。

转pCXSN拟南芥和野生型拟南结果无显著差异。

二、主根长度检测

将T₃代转AsT拟南芥纯合株(OE11和OE26)、转pCXSN拟南芥和野生型拟南芥的种子播种于分别外加0、100、200、300和400μM砷酸钠的1/2MS固体培养基，萌发生长7天，测定主根长度，进行统计。每种植物材料在不同浓度砷酸钠处理条件下统计60株苗。

结果见图4中A。在不含有砷酸钠的培养基上萌发生长时，OE11和OE26的主根长度与野生型拟南芥无显著差异。在含有100、200、300和400μM砷酸钠的培养基上萌发生长时，OE11和OE26的主根长度显著长于野生型的主根长。主根长度测定结果说明过量表达AsT(OE11和OE26)能增强植物耐受砷酸盐胁迫的能力。

转pCXSN拟南芥和野生型拟南结果无显著差异。

三、生物量指标检测

将T₃代转AsT拟南芥纯合株(OE11和OE26)、转pCXSN拟南芥和野生型拟南芥的种子播种于分别外加0、100、200、300和400μM砷酸钠的1/2MS固体培养基，萌发生长7天，测定植物整株鲜重，进行统计。每种植物材料在不同浓度砷酸钠处理条件下，20株苗为一组，统计3组。

结果见图4中B。在不含有砷酸钠的1/2MS固体培养基上萌发生长时，OE11和OE26的鲜重略低于野生型拟南芥；在含有100μM砷酸钠的1/2MS固体培养基上萌发生长时，OE11和OE26的鲜重与野生型拟南芥无显著差异；在含有200、300和400μM砷酸钠的1/2MS固体培养基上萌发生长时，OE11和OE26的鲜重显著高于野生型拟南芥。生物量测定结果说明：在砷酸盐胁迫条件下，OE11和OE26较野生型拟南芥有生长优势。

转pCXSN拟南芥和野生型拟南结果无显著差异。

表型鉴定结果说明：AsT基因能显著增强植物耐受砷酸盐胁迫的能力。

Claims (9)

1.蛋白、编码所述蛋白的DNA分子或含有所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高植物抗逆性中的应用；

所述蛋白为序列表中序列1所示的蛋白质；

所述抗逆性为抗砷酸盐；

所述植物为双子叶植物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述砷酸盐为砷酸钠；

所述双子叶植物为十字花科植物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述十字花科植物为拟南芥。

4.蛋白、编码所述蛋白的DNA分子或含有所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育抗逆性提高转基因植物中的应用；

所述蛋白为序列表中序列1所示的蛋白质；

所述抗逆性为抗砷酸盐；

所述植物为双子叶植物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

所述砷酸盐为砷酸钠；

所述双子叶植物为十字花科植物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述十字花科植物为拟南芥。

7.一种培育抗逆性提高转基因植物的方法，为将编码蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，

所述蛋白为序列表中序列1所示的蛋白质；

所述转基因植物的抗逆性高于所述目的植物；

所述抗逆性为抗砷酸盐；

所述植物为双子叶植物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

所述砷酸盐为砷酸钠；

所述双子叶植物为十字花科植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

所述十字花科植物为拟南芥。

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